LU505730B1 - Eine zellelektrofusionschipvorrichtung und präparationsverfahren basierend auf einer anordnung von gepaarten strukturen mit bilateralen flussfeldern - Google Patents

Abstract

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf das Gebiet der Zellelektrofusionschips und offenbart eine Zellelektrofusionschip-Vorrichtung und ein Herstellungsverfahren, das auf einem bilateralen, feldgepaarten Strukturarray basiert, wobei die Zellelektrofusionschip-Vorrichtung eine strukturierte ITO-Gabelfingerelektrodenschicht und ein Flusspfad-Steuermodul umfasst. Die strukturierte ITO-Gabelfingerelektrodenschicht ist mit einer äußeren Zellelektrofusionsvorrichtung verbunden, und die strukturierte ITO-Gabelfingerelektrodenschicht umfasst eine Substratschicht, eine ITO-Elektrodenschicht und eine PDMS-Schicht mit bilateralen gepaarten Strömungsfeldstrukturen, die in Folge angeordnet sind, und die PDMS-Schicht mit bilateralen gepaarten Strömungsfeldstrukturen umfasst bilaterale gepaarte Strömungsfeldstrukturen und Kanäle, und die bilateralen gepaarten Strömungsfeldstrukturen und Kanäle sind symmetrisch angeordnet. Mit der vorliegenden Erfindung kann eine effiziente Elektrofusion von Zellen realisiert werden.

Description

Eine Zellelektrofusionschipvorrichtung und Präparationsverfahren basierend auf einer LUS05750

Anordnung von gepaarten Strukturen mit bilateralen Flussfeldern

Technischer Bereich

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf das Gebiet der Zellelektrofusionschips und insbesondere auf eine Zellelektrofusionschip-Vorrichtung und ein Präparationsverfahren, das auf einem Array gepaarter Strukturen mit bilateralem Flussfeld basiert.

Technologie im Hintergrund

Die Elektrofusion ist eine neue Pro-Fusions-Technik, die in den 1980er Jahren entwickelt wurde. Wenn eine Zelle in ein sehr starkes elektrisches Feld gebracht wird, wird die Zellmembran durchlässig und lässt Moleküle von außen in die Zelle diffundieren, ein Phänomen, das als

Elektrofusion, auch Elektroporation genannt, bekannt ist. Mit dieser Technik können viele

Substanzen, darunter DNA, RNA, Proteine, Medikamente, Antikörper und fluoreszierende Sonden, in Zellen eingebracht werden. Im Vergleich zu anderen gängigen Methoden zum Einbringen exogener Substanzen hat die Elektrofusion viele Vorteile: 1. Die Elektrofusion erfordert keine

Glasnadeln wie bei der Mikroinjektion, keine technische Ausbildung und keine teure Ausrüstung, und sie kann mit Millionen von Zellen gleichzeitig durchgeführt werden. 2. Die Elektrofusion hat weniger biologische oder chemische Nebenwirkungen als chemische Substanzen; 3. Die

Elektrofusion als physikalische Methode ist weniger abhängig vom Zelltyp und hat daher ein breites Anwendungsspektrum.

Trotz der erfolgreichen Anwendung der Zellelektrofusionstechnologie in der Züchtung, bei

Hybridisierungsstudien und beim Zellklonen gibt es noch einige Probleme. Die herkömmliche

Zellfusionstechnologie beruht auf dem zufälligen Kontakt der zu fusionierenden Zellen, was zu dem Phänomen der Selbstfusion homologer Zellen führt, was die Effizienz der Fusion stark verringert und die Verschwendung wertvoller Zellressourcen zur Folge hat; Wenn die zu fusionierenden Zellen einen großen Größenunterschied aufweisen, führt der enorme Unterschied im Transmembranpotential dazu, dass die Fusionseffizienz extrem niedrig ist. Diese technische

Lösung konzentriert sich hauptsächlich auf das Problem der Verbesserung der Paarungseffizienz heterologer Zellen bei der Elektrofusion von Zellen.

Inhalt der Erfindung

Die vorliegende Erfindung zielt darauf ab, eine Zellelektrofusions-Chip-Vorrichtung und ein

Präparationsverfahren auf der Grundlage einer beidseitig fließenden Feldpaarungsstruktur bereitzustellen, um das Problem der geringen Paarungseffizienz aufgrund des zufälligen Kontakts während der Zellfusion in der bisherigen Technik zu lösen.

Um den oben genannten Zweck zu erreichen, nimmt die vorliegende Erfindung die folgende technische Lösung an: eine Zellelektrofusions-Chipvorrichtung, die auf einem Array von bilateral fließenden Feldpaarungsstrukturen basiert, umfassend eine gemusterte ITO-

Gabelfingerelektrodenschicht und ein Flusspfad-Steuermodul, und die gemusterte ITO-

Gabelfingerelektrodenschicht ist mit einer äußeren Zellelektrofusionsvorrichtung verbunden. Die strukturierte ITO-Gabelfingerelektrodenschicht enthält eine Substratschicht, eine ITO-

Elektrodenschicht und eine PDMS-Strukturschicht mit bilateraler Strömungsfeldpaarung, die nacheinander angeordnet sind, und die PDMS-Strukturschicht mit bilateraler

Strömungsfeldpaarung enthält bilaterale Strömungsfeldpaarungsstrukturen und -kanäle, und die bilateralen Strömungsfeldpaarungsstrukturen und -kanäle sind auf mehrere Weisen und in bilateraler symmetrischer Weise angeordnet.

Andererseits hat die vorliegende technische Lösung auch ein Verfahren zur Herstellung eink}/505730 zellularen Elektrofusions-Chip-Vorrichtung auf der Grundlage einer Anordnung von gepaarten

Strukturen mit bi-lateralem Stromungsfeld bereitgestellt, das die folgenden Schritte umfasst:

Schritt 1. Bearbeitung einer strukturierten ITO-Gabelfingerelektrodenschicht unter

Verwendung eines Nassätzverfahrens;

Schritt 2. Aufbau einer PDMS-gepaarten bi-lateralen Strömungsfeldstruktur unter

Verwendung von PDMS-Polymeren, die durch einen weichen Lithographieprozess und eine umgekehrte Form aufgebaut werden;

Schritt 3. Herstellung eines PDMS-Fusionsstrukturchips, der durch einen Softlithographie-

Prozess und eine umgekehrte Form hergestellt wird;

Schritt 4. Plasmareinigung;

Schritt 5. Kleben.

Das Prinzip und die Vorteile des vorliegenden Konzepts sind: In der praktischen Anwendung konzentriert sich der Erfinder aufgrund der geringen Fusionseffizienz der Zellfusion (insbesondere der Fusion heterologer Zellen) im Stand der Technik, die auf den Unterschied zwischen zufälligem

Kontakt und Membranpotential zurückzuführen ist, auf die Verbesserung der Paarungseffizienz heterologer Zellen bei der Elektrofusion von Zellen und entwickelt die Struktur des Fusionschips (insbesondere die Paarungsstruktur). Die mikrofluidische Chiptechnologie wird eingesetzt, um eine präzise Steuerung der Zellbewegung durch mikroskalige Strömungshohlräume sowie die

Steuerung der Strömung und des elektrischen Feldes zu erreichen; gleichzeitig wird sie mit mikrofluidischer Steuerung, dielektrischer Elektrophorese und anderen Mitteln kombiniert, um die präzise Paarung homologer oder heterologer Zellen mit Hilfe von Mikrostrukturen,

Mikroelektroden und anderen Mitteln wirksam zu steuern. Bei der Chipstruktur dieser Lösung wird, nachdem die zu fusionierenden Zellen in die Einfangstruktur entlang der Kanäle auf beiden

Seiten eingetreten sind, die gemusterte ITO-Gabel-Finger-Elektrodenschicht eine Verbindung mit der äußeren Zellelektrofusionsvorrichtung herstellen, indem eine Verbindung mit der äußeren

Zellelektrofusionsvorrichtung hergestellt wird, das externe elektrische Signal in die ITO-Gabel-

Finger-Elektrode eingeleitet wird und ein elektrisches Feld von ausreichender Stärke zwischen den benachbarten Mikroelektroden gebildet wird, um die hocheffiziente Elektrofusion der Zellen innerhalb des Chips zu erreichen. Zelleinlass, Einfangpaarung und -auslass können über das

Flusskontrollmodul realisiert werden.

Als Verbesserung wird vorzugsweise ein Gabelfingerelektroden-Array auf der ITO-

Elektrodenschicht bereitgestellt, wobei das Gabelfingerelektroden-Array als Ganzes eine Kamm-

Zahn-Struktur ist und das Gabelfingerelektroden-Array eine Anzahl von Gabelfingerelektroden umfasst.

Bei der vorliegenden technischen Lösung wird durch die Anordnung der

Gabelfingerelektroden als Kamm-Zahn-Struktur des Arrays, nachdem ein externes elektrisches

Signal in die ITO-Gabelfingerelektroden eingeleitet wird, ein elektrisches Feld von ausreichender

Stärke zwischen benachbarten Mikroelektroden gebildet, um eine hocheffiziente Elektrofusion der

Zellen im Inneren des Chips zu erreichen.

Als Verbesserung haben die Gabelfingerelektroden vorzugsweise alle eine Breite von 150 bis 200um, und der Abstand zwischen zwei benachbarten Gabelfingerelektroden beträgt 60 bis 80um.

Bei dieser technischen Lösung wird die Breite der Gabelfingerelektroden so optimiert, dass sie sowohl die für die Zellperforation erforderliche elektrische Feldstärke unter experimentell gegebenen Niederspannungsbedingungen als auch die im Labor erreichbaren Bedingungen des

Herstellungsprozesses erfüllen; Die oben genannten Breitenbereiche haben sich experimentell at4/505730 vorteilhaft erwiesen; ein zu großer Abstand zwischen zwei benachbarten Gabelfingerelektroden führt zu einer höheren angelegten Spannung, die erforderlich ist, um eine Zellperforation zu erreichen, und zu höheren externen elektrischen Anforderungen; Wenn der Abstand zwischen zwei benachbarten Gabelfingerelektroden zu gering ist, können die Elektroden unter den gegebenen

Prozessbedingungen nicht herausgeätzt werden, und die Zellen können durch Anlegen einer geringen Spannung elektrisch zerstört werden, was die Erforschung der geeigneten

Versuchsparameter erschwert.

Als Verbesserung ist der Kanal vorzugsweise in einer Serpentinenstruktur ausgeführt, und der

Serpentinen-Kanal hat eine Länge von 300 bis 400um, eine Breite von 40 bis 50um und eine Höhe von 20 bis 30um.

Bei dieser technischen Lösung kann durch die Anordnung des Kanals in einer

Serpentinenstruktur die Raumnutzungsrate verbessert und eine größere Länge bei begrenztem

Platzangebot erreicht werden; der Serpentinen-Kanal erleichtert die Integration mehrerer

Erfassungseinheiten und verbessert den Durchsatz; die Länge des Serpentinen-Kanals sowie die

Breite und die Höhe werden auf der Grundlage der experimentellen Auswahl der Zellen angepasst und können die Anforderungen an eine effiziente Paarung erfüllen.

Vorzugsweise wird als eine Verbesserung eine Anzahl von Wiederholungseinfangeinheiten in dem Kanal bereitgestellt, und die Wiederholungseinfangeinheiten umfassen alle ein serpentinenformiges Kanalsegment, eine Einfangstellenstruktur und einen Mikrokanal zur

Regulierung des Durchflusswiderstands, und die Einfangstellenstruktur ist eine kreisförmige

Struktur mit einem Durchmesser von 9 bis 11um, und der Abstand zwischen zwei benachbarten

Einfangstellen beträgt 75 bis 150um; Die Mikrokanäle zur Regulierung des Durchflusswiderstands haben eine Länge von 4 bis 6um, eine Breite von 4 bis 6um und eine Höhe von 20 bis 30um; jede der Einfangstellenstrukturen ist mit einer Öffnung von 7um versehen, um die Verbindung der bilateralen Kanäle zu realisieren, die ein Paar gepaarter Strukturen bilden.

Bei dieser technischen Lösung ist der Kanal als Ganzes eine Serpentinenstruktur, und jede sich wiederholende rotierende Struktureinheit in der Serpentinenstruktur ist ein Serpentinen-

Kanalsegment. Bei dieser Lösung sind in jedem Serpentinen-Kanalsegment Einfangstellen und

Kanäle zur Einstellung des Strömungswiderstandes vorgesehen, wodurch ein hoher Durchsatz des

Chips erreicht werden kann, und durch das Anbringen von Öffnungen an den Einfangstellen kann die Konnektivität der beiden Seiten des Kanals erreicht werden, so dass die Paarung und Fusion von heterologen Zellen möglich ist.

Vorzugsweise umfasst das Flusspfad-Steuermodul als Verbesserung einen PDMS-

Fusionsstruktur-Chip und einen Katheter, und der PDMS-Fusionsstruktur-Chip ist mit zwei

Einlassöffnungen, zwei Auslassöffnungen, einem Mikrokanal und vier Probenspeicherzellen versehen, und der strukturelle Teil des Mikrokanals und die Probenspeicherzellen sind beide am

Boden des PDMS-Fusionsstruktur-Chips vorgesehen. Die Finlassoffnungen und die

Auslassöffnungen sind jeweils direkt über der Vertikalen der entsprechenden Probenbehälter angeordnet, und der strukturelle Teil des Mikrokanals ist zwischen den vier Probenbehältern angeordnet.

Bei dieser technischen Lösung bietet die Probenaufbewahrungszelle Platz für die

Aufbewahrung der zu verschmelzenden Zellen, und die zu verschmelzenden Zellen werden entlang des Probeneinlasses durch den Mikrokanal in das Innere des Chips geleitet, um die

Aufnahme und Verschmelzung zu erreichen, und die Struktur ist vernünftig gestaltet.

Vorzugsweise beträgt der Durchmesser der Einlass- und Auslassöffnungen 2 bis 5 mm, wi$/505730 eine Verbesserung darstellt.

Bei dieser technischen Lösung ist die Größe der Einlass- und Auslassoffnungen hauptsächlich auf die fur das Experiment erforderliche externe Druckpumpenleitung abgestimmt.

Vorzugsweise umfassen das Softlithografie-verfahren und das Verfahren der umgekehrten

Form in den Schritten 2 und 3 insbesondere die folgenden Schritte: (1) Bearbeiten einer Form mit einer Dicke von 20 bis 35um mit dem Softlithographie-

Verfahren; (2) Fixieren der Form auf einer Acrylform; (3) Einfüllen der PDMS-Klebstoffmischung und Vakuumieren nach dem Ruhen; (4) Einlegen in einen Plus-Ofen bei 60~80°C Heizungshärtung; (5) Umdrehen der Form.

Als Verbesserung wird in Schritt 4 die Plasmareinigung mit einer Reinigungszeit von 10 bis

Sekunden durchgeführt; in Schritt 5 erfolgt das Bonden durch thermisches Bonden, und die 15 Bondtemperatur beträgt 100 bis 150°C.

Bei dieser technischen Lösung wirkt sich die Plasmareinigungszeit hauptsächlich auf die

Bindungswirkung des Chips und der ITO-Elektrode aus, und eine zu lange Reinigungszeit führt dazu, dass die Bindung zu fest ist und die Zellflüssigkeit nicht leicht in die Struktur eindringen kann, und eine zu kurze Reinigungszeit führt dazu, dass die Bindung nicht dicht ist und leicht

Flüssigkeit austritt. Darüber hinaus hat sich gezeigt, dass die oben genannte Bondtemperatur eine geeignetere Temperatur ist, die sicherstellt, dass die Bondwirkung den erwarteten Anforderungen entspricht.

Beschreibung der beigefügten Zeichnungen

Bild 1 ist eine schematische Darstellung der Struktur des gesamten Chips in einer

Ausführungsform der vorliegenden Erfindung.

Bild 2 ist ein vergrößertes schematisches Diagramm eines Paares von gepaarten Strukturen in FIG. 1.

Bild 3 ist ein schematisches Diagramm einer Gabelfingerelektrodenebene in einer

Ausführungsform der vorliegenden Erfindung.

Bild 4 ist ein Diagramm einer einzelnen Zelle, die weißes Licht in einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung einfängt.

Bild 5 ist ein Diagramm der Erfassung von Fluoreszenz durch eine einzelne Zelle in einer

Ausführungsform der vorliegenden Erfindung.

Bild 6 ist ein Weißlichtdiagramm der Zellpaarung in einer Ausführungsform der vorliegenden

Erfindung.

Bild 7 zeigt ein Diagramm der Fluoreszenzüberlagerung von Zellpaaren in einer

Ausführungsform der vorliegenden Erfindung.

Bild 8 zeigt ein Weißlicht- und Fluoreszenzdiagramm vor und nach der Zellfusion in einer

Ausführungsform der vorliegenden Erfindung.

Detaillierte Beschreibung

Die folgenden Ausführungsformen werden anhand spezifischer Ausführungsbeispiele näher beschrieben, doch sind die Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung nicht darauf beschränkt. Wenn nicht ausdrücklich angegeben, sind die in den folgenden Ausführungsformen verwendeten technischen Mittel konventionelle Mittel, die dem Fachmann bekannt sind; die verwendeten experimentellen Methoden sind konventionell; und die verwendeten Materialien,

Reagenzien usw. sind im Handel erhältlich. LU505730

Die in den beigefügten Zeichnungen der Spezifikation dargestellten

Anbringungsmarkierungen umfassen: zweiseitige Strömungsfeldpaarungsstruktur 1, Kanal 2,

Einfangstellenstruktur 3, Einlassreservoir 14, Einlassreservoir IIS, Mikrokanalstrukturteil ©, 5 Auslassreservoir 17, Auslassreservoir II8, ITO-Gabelfingerelektrode 9.

Die Ausführungsform ist im Wesentlichen wie in den beigefügten Bildern 1-3 dargestellt: eine

Zellelektrofusions-Mikroarray- Vorrichtung, die auf einer bilateralen gepaarten Flussfeld-

Strukturanordnung basiert und eine gemusterte ITO-Gabelfingerelektrodenschicht und ein

Flusspfad-Steuermodul umfasst. Die strukturierte ITO-Gabelfingerelektrodenschicht bildet eine

Verbindung mit der externen Zellelektrofusionsvorrichtung durch ein leitfähiges Klebeband, und externe elektrische Signale werden in die ITO-Gabelfingerelektroden 9 eingeführt, und ein elektrisches Feld von ausreichender Stärke wird zwischen benachbarten Mikroelektroden gebildet, um eine hocheffiziente Elektrofusion von Zellen innerhalb des Chips zu erreichen. Die

Hauptfunktion des Flusspfad-Kontrollmoduls besteht darin, den Einlass, die Einfangpaarung und den Auslass des Zellpuffers in der oben genannten Struktur zu realisieren, und das Flusspfad-

Kontrollmodul umfasst den PDMS-Fusionsstruktur-Chip und den Katheter.

Die Zellelektrofusions-Chipvorrichtung, die auf einer bilateralen gepaarten

Flussfeldstrukturanordnung basiert, hat, in der Reihenfolge von unten nach oben, eine ITO-

Elektrodenschicht und eine bilaterale gepaarte Flussfeldstrukturschicht aus PDMS.

Fur die ITO-Elektrodenschicht wird ITO-Glas als Substrat verwendet, und eine strukturierte

Gabelfinger-Elektrodenanordnung wird mit einem Nassätzverfahren auf das ITO-Glas geätzt. Der

Kammabstand des Gabelfingerelektroden-Arrays wird im Bereich von 60-80um gesteuert, um eine gute Leitfähigkeit und Zuverlässigkeit zu gewährleisten; die Breite des Kammes liegt im

Bereich von 150-200um, die entsprechend der Dichte des Mikroelektroden-Arrays im tatsächlichen Gebrauch bestimmt werden kann.

Wie in Bild 2 gezeigt, umfasst die PDMS-Schicht mit bilateraler Strömungsfeld-

Paarungsstruktur eine bilaterale Strömungsfeld-Paarungsstruktur 1 und einen Kanal 2, der unter

Verwendung eines PDMS-Polymers aufgebaut ist, und die bilaterale Strömungsfeld-

Paarungsstruktur 1 ist oben und unten symmetrisch angeordnet, und die Konnektivität und der

Kontakt der Paarungszellen werden durch die Öffnung mit einer Länge von 7um und einer Breite von 1 um in der Mitte erreicht. Die Höhe des Kanals 2 innerhalb der PDMS-Schicht mit bilateraler

Strömungsfeld-Paarungsstruktur beträgt 25-30um, der Kanal 2 ist in einer Serpentinenstruktur angeordnet, und die Gesamtlänge des Kanals 2 beträgt 300-400um, die Breite 40-50um und die

Höhe 20-30um. In dem einseitigen Kanal 2 ist eine Anzahl von sich wiederholenden

Erfassungseinheiten vorgesehen, und die sich wiederholenden Erfassungseinheiten umfassen alle ein Serpentinen-Kanalsegment (d.h. eine Schwenkeinheit des Serpentinen-Kanals), eine

Erfassungsstellenstruktur 3 und einen Mikrokanal zur Einstellung des Strömungswiderstands (ein schmaler Kanal, der die Einstellung des Strömungswiderstands ermöglicht), und die

Erfassungsstellenstruktur 3 ist eine kreisförmige Struktur mit einem Durchmesser von 9 bis 11 um, und der Abstand zwischen zwei benachbarten Einheiten der Erfassungsstellenstruktur 3 beträgt 75 bis 150um; Die den Strömungswiderstand regulierenden Mikrokanäle haben eine Länge von 4 bis 6um, eine Breite von 4 bis 6um und eine Höhe von 20 bis 30um; die Einfangstellenstrukturen 3 sind jeweils mit einer Öffnung von 7um und einer Breite von 1um versehen, um die Verbindung der Kanäle auf beiden Seiten zu realisieren, wobei sie ein Paar von gepaarten Strukturen bilden.

Die symmetrischen Kanäle auf beiden Seiten sind durch die 7-um-Öffnungen der Einfangstellen verbunden und bilden ein Paar gepaarter Strukturen, d.h. die doppelten Einfangeinheiten atıt 505730 beiden Seiten sind zu einer gepaarten Einheit verbunden.

Der PDMS-Fusionsstruktur-Chip ist mit zwei Einlassöffnungen, zwei Auslassöffnungen, einer Mikrokanalstruktur und einem Probenreservoir ausgestattet. Die Durchmesser der Einlass- und Auslassöffnungen betragen jeweils 3 mm und können je nach den tatsächlichen Bedürfnissen spezifischer Anwendungen ausgewählt werden. Die beiden Einlassôffnungen sind die

Einlassöffnung I und die Einlassöffnung II, die Einlassöffnung I und die Einlassöffnung II verlaufen vertikal durch den PDMS-Fusionschip, und das Einlassprobenreservoir 14 bzw. das

Einlassprobenreservoir IIS sind am Boden vorgesehen. Die beiden Probenauslassöffnungen umfassen einen Probenauslass I und einen Probenauslass II, der Probenauslass I und der

Probenauslass II durchdringen beide vertikal den PDMS-Fusionschip, und ein Auslassreservoir 17 und ein Auslassreservoir II8 sind jeweils an der Unterseite vorgesehen. das Finlassreservoir 14 und das Einlassreservoir IIS, das Auslassreservoir I7 und das Auslassreservoir II8 und der

Mikrokanalstrukturabschnitt 6 sind alle an der Unterseite des PDMS-Fusionsstrukturchips vorgesehen, und Von links nach rechts sind das Einlassreservoir 14, das Auslassreservoir II8, der

Mikrokanal-Strukturabschnitt 6, das Einlassreservoir IIS und das Auslassreservoir I7 an der

Unterseite des PDMS-Fusionsstrukturchips angeordnet, und die Mikrokanäle sind in einer

Vielzahl von Reihenfolgen angeordnet und jeweils zwischen der Einlassöffnung/Auslassöffnung und dem Probenreservoir verbunden. Die integrierten Einlass-/Auslassöffnungen und -reservoire auf dem PDMS-Fusionsstrukturchip ermöglichen in Verbindung mit den angeschlossenen

Mikrokanälen den Einlass der Zellsuspension, die Kontrolle des Zellflusses innerhalb des Chips und den Auslass der fusionierten Zellsuspension.

Ein Verfahren zur Herstellung einer zellulären Elektrofusions-Chip-Vorrichtung, die auf einer

Anordnung von gepaarten Strukturen mit bi-lateralem Strömungsfeld basiert, mit den folgenden

Schritten:

Schritt 1, Verarbeitung des ITO-Elektrodenarrays: realisiert unter Verwendung eines

Nassätzverfahrens, insbesondere umfassend:

S1, Auswahl von ITO-Glas als Substrat für die Bearbeitung des Chips;

S2, Aufbringen einer 5 um dicken SU-8 3005-Fotoresistschicht auf das ITO-Glas;

S3, Atzen einer Gabelfinger-Mikroarray-Struktur auf der ITO-Schicht durch Fotolithografie und Nassätzen.

Schritt 2, Herstellen einer PDMS-Struktur mit zweiseitiger Stromungsfeldpaarung:

Herstellen einer Struktur mit zweiseitiger Stromungsfeldpaarung und einer Kanalstruktur unter

Verwendung eines PDMS-Polymers, insbesondere umfassend: (1) Bearbeiten einer Form mit einer Strukturhôhendicke von 30 um unter Verwendung eines

Softlithographie-Verfahrens, wobei die Formstruktur ein Zellsuspensionsreservoir und eine

Mikrokanal-Array-Struktur ist; (2) Fixieren der Form auf einer Acrylform; (3) Die gemischte PDMS-Klebstoffmischung einfüllen, ruhen lassen und vakuumieren; (4) Zum Aushärten in einen Plus-Ofen bei 65°C stellen; (5) Freilegen der gehärteten PDMS, nach der ITO-Gabel Finger Elektrodenform angepasst zu schneiden, und von der Probe Speicherbecken senkrecht über den Hit durch die PDMS-Einlass und Auslass sein kann.

Schritt 4, Plasmareinigung, Reinigungszeit 10~15 Sekunden;

Schritt 5, Bindung, die PDMS Dual-Side-Flow-Feld gepaart Struktur PDMS-Chip umgekehrte Schnalle auf der ITO-Elektrode platziert, die Verwendung von thermischen Bindurtg!505730

Prozess, und der Chip zu einem versiegelten Hohlraum bilden, nur durch den Einlass und Auslass fiir den Einlass und Auslass der Zellsuspension in und aus der Probe, die Bindung Temperatur von 100~150°C.

Ein Fluoreszenzmikroskop wurde verwendet, um Bilder des weißen Lichts und der

Fluoreszenz der gepaarten Zellen zu nehmen, die mit dem Chip aufgenommen wurden, und dann wurden die Zellen mit einem Zellelektrofusionsgerät aufgeladen, und die Bilder der Zellen unter weißem Licht und Fluoreszenz wurden nach dem Aufladen wieder aufgenommen, und das weiße

Licht und Fluoreszenzbilder der Zellen vor und nach dem Aufladen wurden verglichen. Die Bilder 4 bis 8 zeigen die Fluoreszenzbilder der Zellen vor und nach der Paarung und Fusion mit der vorliegenden technischen Lösung. Die Chipstruktur der vorliegenden technischen Lösung kann eine effiziente Paarung und Fusion von heterologen Zellen erreichen.

Das oben Beschriebene ist nur eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, und die spezifischen technischen Lösungen und/oder Merkmale und andere allgemein bekannte

Eigenschaften des Programms werden hier nicht übermäßig detailliert beschrieben. Es sollte beachtet werden, dass für das technische Personal auf dem Gebiet, unter der Prämisse, nicht von dem technischen Schema der vorliegenden Erfindung abzuweichen, eine Reihe von Verformungen und Verbesserungen vorgenommen werden können, die auch als der Schutzbereich der vorliegenden Erfindung betrachtet werden sollten, und alle diese werden die Wirkung der

Umsetzung der vorliegenden Erfindung und die Durchführbarkeit des Patents nicht beeinflussen.

Der in dieser Anmeldung beanspruchte Schutzbereich unterliegt dem Inhalt der Ansprüche, und die spezifischen Ausführungsformen und sonstigen Aufzeichnungen in der Beschreibung können zur Erläuterung des Inhalts der Ansprüche herangezogen werden.

Claims (10)

Ansprüche LU505730

1. Eine zelluläre Elektrofusions-Chip-Vorrichtung auf der Grundlage einer bilateralen gepaarten Flussfeld-Strukturanordnung, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine gemusterte ITO- Gabelfingerelektrodenschicht und ein Flusspfad-Steuermodul umfasst. Die gemusterte ITO- Gabelfingerelektrodenschicht ist mit einer externen Zellelektrofusionsvorrichtung verbunden, und die gemusterte ITO-Gabelfingerelektrodenschicht enthält eine Substratschicht, eine ITO- Elektrodenschicht und eine PDMS-Schicht mit bilateraler Strömungsfeld-Paarungsstruktur, die nacheinander angeordnet sind, und die PDMS-Schicht mit bilateraler Strömungsfeld- Paarungsstruktur enthält bilaterale Strömungsfeld-Paarungsstrukturen und -kanäle, und die bilateralen Strömungsfeld-Paarungsstrukturen und -kanäle sind auf mehrere Arten angeordnet und symmetrisch in einer bilateralen symmetrischen Weise angeordnet.

2. Eine zelluläre Elektrofusions-Chip-Vorrichtung auf der Grundlage einer bilateralen gepaarten Flussfeld-Strukturanordnung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass: die ITO- Elektrodenschicht mit einem Gabelfingerelektroden-Array versehen ist, das Gabelfingerelektroden-Array insgesamt eine —Kammzahnstruktur ist und das Gabelfingerelektroden-Array eine Anzahl von Gabelfingerelektroden umfasst.

3. Eine zelluläre Elektrofusions-Chip-Vorrichtung auf der Grundlage einer bilateralen gepaarten Flussfeld-Strukturanordnung gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass: die Breiten der Gabelfingerelektroden alle 150-200um betragen und der Abstand zwischen zwei benachbarten Gabelfingerelektroden 60-80um beträgt.

4. Eine zelluläre Elektrofusions-Chip-Vorrichtung auf der Grundlage einer bilateralen gepaarten Flussfeld-Strukturanordnung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass der Kanal die Form einer Serpentinenstruktur aufweist und der serpentinenförmige Kanal eine Länge von 300 bis 400um, eine Breite von 40 bis 50um und eine Höhe von 20 bis 30 um hat.

5. Eine zelluläre Elektrofusions-Chip-Vorrichtung auf der Grundlage einer bilateralen gepaarten Flussfeld-Strukturanordnung nach Anspruch 4 basiert, dadurch gekennzeichnet, dass: eine Anzahl von sich wiederholenden Einfangeinheiten in dem Kanal vorgesehen ist und die sich wiederholenden Einfangeinheiten alle ein serpentinenfôrmiges Kanalsegment, eine Einfangstellenstruktur und einen den Strömungswiderstand regulierenden Mikrokanal umfassen. Die Einfangstellenstruktur ist eine kreisförmige Struktur mit einem Durchmesser von 9-11um, und der Abstand zwischen zwei benachbarten Einfangstellen beträgt 75-150um; die den Durchflusswiderstand regulierenden Mikrokanäle haben eine Länge von 4-6um, eine Breite von 4-6um und eine Höhe von 20-30um; und jede der Einfangstellenstrukturen ist mit einer 7 um großen Öffnung versehen, um die Verbindung der bilateralen Kanäle zu realisieren, die ein Paar von gepaarten Strukturen bilden.

6. Eine zelluläre Elektrofusions-Chip-Vorrichtung auf der Grundlage einer bilateralen gepaarten Flussfeld-Strukturanordnung gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass: das Strömungsweg-Steuermodul einen PDMS-Fusionsstruktur-Chip und eine Leitung umfasst, und der PDMS-Fusionsstruktur-Chip mit zwei Einlassoffnungen, zwei Auslassöffnungen, Mikrokanälen und vier Speicherzellen versehen ist. Der Strukturabschnitt des Mikrokanals und die Probenspeicherzellen sind beide am Boden des PDMS-Schmelzstrukturchips vorgesehen, die Einlass- und Auslassöffnungen sind jeweils direkt über der Vertikalen der entsprechenden Probenspeicherzellen vorgesehen, und der Strukturabschnitt des Mikrokanals ist zwischen den vier Probenspeicherzellen vorgesehen.

7. Eine zelluläre Elektrofusions-Chip-Vorrichtung auf der Grundlage einer bilateralen / 905730 gepaarten Flussfeld-Strukturanordnung gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Durchmesser der Einlass- und Auslassöffnungen beide 2 bis Smm betragen.

8. Ein Verfahren zur Herstellung einer Zellelektrofusions-Chip-Vorrichtung auf der Grundlage eines bilateral fließenden, feldgepaarten Strukturarrays nach einem der Ansprüche 1-7, dadurch gekennzeichnet, dass es die folgenden Schritte umfasst: Schritt 1. Bearbeitung einer strukturierten ITO-Gabelfingerelektrodenschicht unter Verwendung eines Nassätzverfahrens; Schritt 2. Herstellung von gepaarten PDMS-Strukturen mit zweiseitigem Strömungsfeld unter Verwendung von PDMS-Polymeren, die durch ein Softlithographie-Verfahren und Inversionsformen hergestellt werden; Schritt 3. Herstellung eines PDMS-Fusionsstrukturchips, der durch einen Softlithographie- Prozess und Inversionsformung hergestellt wird; Schritt 4. Plasmareinigung; Schritt 5. Kleben.

9. Eine Verfahren zur Herstellung einer Zellelektrofusionschip-Vorrichtung auf der Grundlage eines bilateral fließenden, gepaarten Strukturarrays nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass: in den Schritten 2 und 3 das Softlithographie-Verfahren und das umgekehrte Formverfahren insbesondere die folgenden Schritte umfassen: (1) Bearbeiten einer Form mit einer Strukturhöhe von 20 bis 35 um mit dem Softlithographie- Verfahren; (2) Fixieren der Form auf einer Acrylform; (3) Eingießen der PDMS-Klebstoffmischung und Vakuumieren nach dem Ruhen; (4) Einlegen in einen Plus-Ofen bei 60 ~ 80 °C Heizungshärtung; (5) Umdrehen der Form.

10. Ein Verfahren zur Herstellung einer Zellelektrofusions-Chipvorrichtung auf der Grundlage einer beidseitig durchströmten Feldpaarstrukturanordnung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass: in Schritt 4 die Plasmareinigung unter der Bedingung durchgeführt wird, dass die Reinigungszeit 10 bis 15 Sekunden beträgt; in Schritt 5 der Bondprozess ein thermisches Bonden ist und die Bondtemperatur 100 bis 150°C beträgt.