LU603280B1 - Spezialisierte Primer und Sonden für den multiplexen fluoreszierenden PCR-Nachweis von bovinen Durchfallerregern BVDV, BRV, E. coli, Salmonella, E. bovis und C. parvum und deren Anwendung - Google Patents

Abstract

Die vorliegende Erfindung offenbart spezielle Primer und Sonden für den multiplexen fluoreszierenden PCR-Nachweis der Viren BVDV, BRV, E. coli, Salmonella, E. bovis und C. 5 parvum sowie deren Anwendung im Bereich der molekularbiologischen Nachweistechnologie. Für die oben genannten speziellen Primer wurden optimale Multiplex-Fluoreszenz-PCR-Reaktionsbedingungen entwickelt. Die Primer und Reaktionsbedingungen erreichten minimale Nachweisgrenzen von 1,19×10² Kopien/μl, 3,89×10¹ Kopien/μl und 3,74×10¹ Kopien/μl für BVDV-, BRV- und BCV-Plasmidstandards. Die Empfindlichkeit ist mindestens 100-mal höher als die der herkömmlichen PCR, was eine hohe Sensitivität belegt. Diese Methode amplifiziert spezifisch nur BVDV, BRV und BCV und zeigt keine Kreuzreaktivität mit Escherichia coli, Salmonella oder dem bovinen infektiösen Rhinotracheitis-Virus, was auf eine starke Spezifität hinweist. Der Variationskoeffizient innerhalb der Gruppen beträgt weniger als 1 % und der Variationskoeffizient zwischen den Gruppen ebenfalls weniger als 1 %, was eine ausgezeichnete Reproduzierbarkeit belegt.

Description

Spezialisierte Primer und Sonden für den multiplexen fluoreszierenden LU603280

PCR-Nachweis von bovinen Durchfallerregern BVDV, BRV, E. coli, Salmonella, E. bovis und C. parvum und deren Anwendung

Technischer Bereich

Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der molekularbiologischen

Nachweistechnologie, insbesondere spezielle Primer für den

Multiplex-Fluoreszenz-PCR-Nachweis von bovinen Durchfallerregern BVDV, BRV, E. coli,

Salmonella, E. bovis und C. parvum und deren Anwendung.

Technologie im Hintergrund

In den letzten Jahren hat die Häufigkeit von Durchfallerkrankungen bei Kälbern mit der

Ausweitung der Milchviehhaltung einen jährlichen Aufwärtstrend verzeichnet. Diese

Erkrankung beeinträchtigt das frühe Wachstum und die Entwicklung von Kälbern erheblich, untergräbt die Stabilität ihrer späteren Produktionsleistung und führt zu einer Sterblichkeitsrate von bis zu 90 %. Folglich behindert sie die Herdenvergrößerung und die nachhaltige

Entwicklung der Milchwirtschaft erheblich. Die Faktoren, die zur Kälberdurchfallerkrankung beitragen, sind komplex und vielfältig, wobei die infektiöse Virusdurchfallerkrankung die schwerste Form darstellt und häufig als Mischinfektion auftritt. Zu den häufigsten Erregern gehören das Bovine Virusdiarrhoe-Virus (BVDV), das Bovine Rotavirus (BRV), Escherichia coli (E. coli), Salmonellen, Eimeria bovis und Cryptosporidium parvum. Bei der klinischen

Diagnose zeigen diese Erreger relativ ähnliche klinische Symptome und infizieren häufig gemeinsam, was die definitive Identifizierung der Erreger erheblich erschwert. Ihre schnelle

Übertragung, die schwerwiegenden Folgen und das Fehlen spezifischer therapeutischer

Behandlungen führen zu erheblichen wirtschaftlichen Verlusten für die Milchwirtschaft.

Zu den derzeitigen klinischen Diagnosemethoden gehören in erster Linie die Isolierung von Pathogenzellen, Elektronenmikroskopie, Single-Target-PCR, Multiplex-PCR, ELISA,

Microarray-Analyse und loop-vermittelte isotherme Amplifikation. Jeder dieser Ansätze weist jedoch erhebliche Einschränkungen auf. Die quantitative Echtzeit-Fluoreszenz-PCR bietet

Vorteile wie einfache Handhabung, hohe Empfindlichkeit, ausgezeichnete Reproduzierbarkeit und verkürzte Durchlaufzeiten, was zu ihrer weit verbreiteten Anwendung in Labortests geführt hat. Die quantitative Echtzeit-PCR verwendet entweder fluoreszenzfarbstoffbasierte oder

TaqMan-Sonden-basierte Methoden, wobei erstere am weitesten verbreitet sind. Dieser Ansatz ermöglicht den Multiplex-Gennachweis und erfüllt die Anforderung der gleichzeitigen Analyse mehrerer Nukleinsäuresequenzen in einem einzigen Reaktionsröhrchen bei gleichzeitiger

Verkürzung der Gesamtzeit. Darüber hinaus überwindet die quantitative PCR die

Einschränkungen der konventionellen PCR in Bezug auf Empfindlichkeit, Effizienz und

Quantifizierung der Pathogenlast. Daher besteht ein dringender Bedarf an der Etablierung einer multiplexen quantitativen Fluoreszenz-PCR-Methode, mit der mehrere Pathogene gleichzeitig nachgewiesen werden können, um so einen wertvollen Beitrag zur Prävention und Bekämpfung von Krankheiten zu leisten.

Inhalt der Erfindung

Um die oben genannten technischen Herausforderungen zu bewältigen, bietet die vorliegende Erfindung spezielle Primer und Sonden für den multiplexen fluoreszierenden

PCR-Nachweis der bovinen Durchfallerregern BVDV, BRV, E. coli, Salmonella, E. bovis und C. parvum.

Die vorliegende Erfindung hat die folgenden spezifischen Primer und Sonden unter

Bezugnahme auf die hochkonservierten Sequenzen von BVDV S'UTR, BRV VP6, E. coli phoALU603280

Salmonella invA, E. bovis 18S rRNA und E. bovis SSU rRNA aus GenBank entwickelt:

BVDV-Upstream-Primer SEQ ID NO.1: 5°’- TGGGTGGTTGAAGCCCTGAG -3’;

BVDV-Downstream-Primer SEQ ID NO.2: 5’- CGCTCAGGTTAAGATGTGTTGT -3°;

BVDV-Sonde SEQ ID NO .3: 5’- ROX/AGTCGTCAGTGGTTCGA/MGB -3’;

BRV-Upstream-Primer SEQ ID NO.4: 5’- AGTTGATGAGACCACCAAACAT -3’;

BRV-Downstream-Primer SEQ ID NO.5: 5’- GCAGATTCAATCCTAAGTGTCAGT -3’;

BRV-Sonde SEQ ID NO.6: 5’- FAM/CAGCAGTAGCAGCACT /MGB -3’;

E. coli-Upstream-Primer SEQ ID NO.7: 5’- TACGGGAACTCCGAAGAGGATT -3°;

E. coli Downstream-Primer SEQ ID NO.8: 5’- TCTGGTCGGTCAGTCCAACAACAT 37

E. coli-Sonde SEQ ID NO.9: 5’- FAM/CATACCGGCAGTCAGTT/MGB -3’;

Salmonella Upstream-Primer SEQ ID NO.10: 5’- GGCGCGCAACGTCAATGAAT -3’;

Salmonella-Downstream-Primer SEQ ID NO.11: 5°- TACCGTGGCATGTCTGAGCACT -3°.

Salmonella-Sonde SEQ ID NO.12: 5’- VIC/CGGTATTCAGGAAACAA/MGB -3’;

E. bovis-Upstream-Primer SEQ ID NO.13: 5’- CGTGTCTAACGCAAGGAAGT -3’;

E. bovis-Downstream-Primer SEQ ID NO.14: 5’- ACTCGTTGCATGCATCAGTGT -3°;

E. bovis-Sonde SEQ ID NO.15: 5’- VIC/ACAGGTCTGTGATGCC/MGB -3°;

C. parvum-Upstream-Primer SEQ ID NO.16: 5’- TGCTTAAAGCAGGCTTCTGCC -3°;

C. parvum-Downstream-Primer SEQ ID NO.17: 5’-ATGCTTTCGCAGTAGTTCGT-3’;

C. parvum-Sonde SEQ ID NO.18: 5’-FAM/CCAGCATGGAATAATA/MGB-3’.

Das Reaktionssystem für die Multiplex-Fluoreszenz-PCR unter Verwendung der oben genannten Primer umfasst zwei Szenarien: Verwendung des TransScript® Probe One-Step qRT-PCR SuperMix Kits zur Durchführung einer Echtzeit-Fluoreszenz-PCR-Amplifikation von viraler RNA in Proben oder in vitro transkribierten RNA-Standards. Das Reaktionssystem besteht aus 12,5 ul 2xPerfectStart™ Probe One-Step qPCR SuperMix, 0,5 ul TransScript®

Probe One-Step RT/RI Enzyme Mix, jeweils 0,5 ul Vorwärts- und Rückwärtsprimer und Sonde (Primer- und Sondekonzentration 10 pmol/l), 1 ul Standard oder 3 ul genomische RNA aus der

Probe, ergänzt mit ddHzO auf 25 ul; Amplifizieren Sie virale, bakterielle oder parasitäre DNA oder DNA-Standards in Proben mit dem GoTaq® Probe qPCR Master Mix Kit.

Reaktionssystem: 12,5 ul 2xGoTaq® Probe qPCR Master Mix, je 1 ul Vorwärts- und

Rückwärtsprimer und Sonde (Primer- und Sondekonzentration 10 umol/l), 1 ul Standard oder 3 ul genomische DNA der Probe, ergänzt mit ddH2O auf 25 ul.

Darüber hinaus umfasst das Multiplex-Fluoreszenz-PCR-Reaktionsprogramm: 5 Minuten bei 95 °C; 5 Sekunden bei 95 °C, 34 Sekunden bei 60 °C, wiederholt für 40 Zyklen, wobei die

Fluoreszenz bei 60 °C erfasst wird.

Außerdem wird während der Multiplex-Fluoreszenz-PCR steriles Wasser als

Negativkontrolle verwendet.

Die vorliegende Erfindung sieht ferner die Anwendung der oben genannten speziellen

Primer und Sonden bei der Herstellung von Produkten zum Nachweis der bovinen

Durchfallerregern BVDV, BRV, E. coli, Salmonella, E. bovis und C. parvum vor.

Im Vergleich zu bestehenden Techniken bietet die vorliegende Erfindung die folgenden vorteilhaften Wirkungen:

Die Erfindung stellt spezielle Primer und Sonden zusammen mit entsprechenden optimalen

Reaktionsbedingungen bereit und erreicht eine minimale Nachweisgrenze von 1,0x10-V603280

Kopien/Reaktion für BVDV-, BRV-, E. coli-, Salmonella-, E. bovis- und C. parvum-Standards.

Ihre Empfindlichkeit ist mindestens 100-mal höher als bei herkömmlicher PCR und weist somit eine außergewöhnliche Empfindlichkeit auf. Dieses Verfahren amplifiziert spezifisch nur

BVDV, BRY, E. coli, Salmonella, E. bovis und C. parvum, zeigt keine Kreuzreaktivität mit anderen Pathogenen und weist somit eine hohe Spezifität auf, der Variationskoeffizient zwischen den sechs Pathogengruppen liegt zwischen 0,6 und 2,4 %, was auf eine ausgezeichnete ~~ Reproduzierbarkeit hinweist. Die hier etablierte = quantitative

Multiplex-Fluoreszenz-PCR-Detektionsmethode bietet einen schnellen, sensitiven und spezifischen technischen Ansatz für den klinischen Nachweis und die epidemiologische

Untersuchung von BVDV, BRV, E. coli, Salmonella, E. bovis und C. parvum.

Beschreibung der beigefiigten Zeichnungen

Bild 1 zeigt die qPCR-Amplifikationsergebnisse für den BVDV-Gradientenstandard.

Bild 2 zeigt die qPCR-Amplifikationsergebnisse für den BRV-Gradientenstandard.

Bild 3 zeigt die qPCR-Amplifikationsergebnisse für den E. coli-Gradientenstandard.

Bild 4 zeigt die qPCR-Amplifikationsergebnisse für den Salmonella-Gradientenstandard.

Bild 5 zeigt die qPCR-Amplifikationsergebnisse für den E. bovis-Gradientenstandard.

Bild 6 zeigt die qPCR-Amplifikationsergebnisse für den C. parvum-Gradientenstandard.

Bild 7 zeigt die Schmelzkurve für den Nachweis einer Mischinfektion mit BVDV + E. coli + Salmonella.

Bild 8 zeigt die Schmelzkurve für den Nachweis einer Mischinfektion mit BRV + E. bovis + C. parvum.

Detaillierte Beschreibung

Die in den folgenden Beispielen verwendeten Hauptreagenzien sind wie folgt:

Virus-DNA/RNA-Extraktionskit, bezogen von Xi'an Tianlong Technology Co., Ltd.; Kit zur

Extraktion genomischer DNA aus Fäkalien, Kit zur Extraktion genomischer DNA aus Bakterien,

Plasmid-Mini-Prep-Kit (Zentrifugationssäulentyp), Kit zur Reinigung und Gewinnung von

RNA sowie kompetente E. coli DH5a-Zellen, bezogen von Beijing Tiangen Biochemical

Technology Co., Ltd.; TransScript® Probe One-Step qRT-PCR SuperMix Kit und Marker II, bezogen von Beijing Quanshijin Biotechnology Co., Ltd.; GoTaq® Probe qPCR Master Mix

Kit und 2x GoTaq® Green Master Mix.

Ausführungsform 1

Basierend auf den in GenBank veröffentlichten Referenzsequenzen für BVDV (AM709624.1), BRV (AB573082.1), E. coli (M29665.1), Salmonella spp. (OL581597.1), E. bovis (KU351727.1) und C. parvum (EU162754.1) wurden die Nukleotidsequenzen für das

S'-UTR von BVDV, das VP6-Gen von BRV, das phoA-Gen von E. coli, das invA-Gen von

Salmonella, das 18S-rRNA-Gen von Eimeria und das SSU-rRNA-Gen von Cryptosporidium aus GenBank heruntergeladen. Nach der Sequenzalignment-Analyse wurden hochkonservierte

Regionen ausgewählt. Primer für die Echtzeit-Fluoreszenz-PCR und TagMan-Sonden wurden mit der Software Primer Express 3.0 entwickelt. Alle Primer und Sonden wurden von Sangon

Biotech (Shanghai) Co., Ltd. synthetisiert (siehe Tabelle 1).

Tabelle 1 PCR-Primer- und Sondensequenzen

Pathogen Zielgen Primer-/Sondensequenz 5'-3' ' Prodi ines

F: TGGGTGGTTGAAGCCCTGAG LU603280

BVDV S'UTR R: CGCTCAGGTTAAGATGTGTTGT 115

P: ROX/AGTCGTCAGTGGTTCGA/MGB

F: AGTTGATGAGACCACCAAACAT

BRVA VP6 R: GCAGATTCAATCCTAAGTGTCAGT 109

P: FAM/CAGCAGTAGCAGCACT /MGB

F: TACGGGAACTCCGAAGAGGATT

E. coli phoA = R: TCTGGTCGGTCAGTCCAACAACAT 103

P: FAM/CATACCGGCAGTCAGTT/MGB

Satmonell F: GGCGCGCAACGTCAATGAAT a invA R: TACCGTGGCATGTCTGAGCACT 112

P: VIC/CGGTATTCAGGAAACAA/MGB

F: CGTGTCTAACGCAAGGAAGT

E bovis 18SrRNA R: ACTCGTTGCATGCATCAGTGT 96

P : VIC/ACAGGTCTGTGATGCC/MGB

F: TGCTTAAAGCAGGCTTCTGCC parm SSURm PE FAMICCAGCATOGAATAATAMGB 179

Ausführungsform 2

Die Referenzstandards für BVDV, BRVA, C. parvum, E. bovis, E. coli und Salmonella werden im Labor des Zentrums für Tierkrankheitsprävention und -bekämpfung in Tangshan aufbewahrt. Die Standards wurden in 10-fachen Intervallen seriell verdünnt, wobei die

Konzentrationen zwischen 107 und 100 Kopien/ul lagen. An jeder Verdünnung wurde eine fluoreszierende quantitative PCR-Amplifikation durchgeführt, deren Ergebnisse in den Bildern 1 bis 6 dargestellt sind. Die minimalen Nachweisgrenzen für BVDV, BRVA, E. coli, Salmonella spp., E. bovis und C. parvum lagen bei 1,0x10! Kopien/Reaktion. Die automatische

Analysesoftware des Systems erstellte Standardkurven für die quantitative Echtzeit-PCR, wobei die Logarithmen der Kopienzahlen auf der y-Achse gegen die Ct-Werte auf der x-Achse aufgetragen wurden. Alle Standards wiesen Amplifikationseffizienzen von über 90 % und

Korrelationskoeffizienten (R?) von über 0,99 auf, was auf eine ausgezeichnete lineare

Beziehung zwischen den anfänglichen Template-Mengen und den Ct-Werten für jeden Standard hinweist. Der Variationskoeffizient (CV) zwischen den Pathogengruppen wurde auf der

Grundlage der Ct-Werte der niedrigsten nachweisbaren Konzentration in drei Replikaten berechnet. Die CVs für die sechs Pathogengruppen lagen zwischen 0,6 % und 2,4 % (siehe

Tabelle 2). Diese Ergebnisse bestätigen, dass das etablierte

Echtzeit-Fluoreszenz-PCR-Nachweissystem eine ausgezeichnete Empfindlichkeit und

Reproduzierbarkeit aufweist.

Tabelle 2: Ergebnisse der Sensitivitätsanalyse des Echtzeit-Fluoreszenz-PCR-Nachweissystems für

Erreger der Rinderdiarrhoe

Referenzmaterialtyp Erreger LOD/Reaktion CV (%)

BVDV 1.0x10! 1.1

Rekombinantes BRVA 1.0x10! 0.9

Plasmid E. coli 1.0x10! 1.3 (Kopienzahl) Salmonella spp. 1.0x10! 1.4

E. bovis 1.0x10! 1.4

C. parvum 1.0x10! 0.6

Anmerkung: LOD: Nachweisgrenze; CV: Variationskoeffizient

Ausführungsform 3 LU603280

Unter Verwendung von BVDV-, BRVA-, C. parvum-, E. bovis-, E. coli- und S.

Typhimurium-Standards als Positivkontrollen und unter Verwendung der verbleibenden gemischten pathogenen genomischen DNA und Wasser als Templates wurde eine quantitative 5 Echtzeit-PCR-Amplifikation unter festgelegten Reaktionsbedingungen durchgeführt. Die

Ergebnisse sind in Bild 7 dargestellt, wobei Gelbe Kurve: Salmonella; Grüne Kurve: BVDV;

Andere Kurven: Gemischte pathogene genomische DNA und Wasser. Die Ergebnisse sind in

Bild 8 dargestellt, wobei die rote Kurve BRVA, die gelbe Kurve E. bovis, die grüne Kurve C. parvum und die anderen Kurven die gemischte pathogene genomische DNA und Wasser darstellen. Die Ergebnisse beider Experimente zeigten, dass die drei Standardproben deutliche

Amplifikationskurven erzeugten, während für andere Pathogene oder die Negativkontrolle keine Amplifikationskurven beobachtet wurden. Dies zeigt, dass die Methode eine ausgezeichnete Spezifität aufweist.

Ausführungsform 4

Unter Verwendung der etablierten Methode wurden 198 klinische Stuhlproben getestet, deren Ergebnisse in Tabelle 3 aufgeführt sind. In 172 Proben wurden Erreger der

Rinderdiarrhoe nachgewiesen, was einer positiven Nachweisrate von 86,9 % (172/198) entspricht. Alle sechs häufigen Erreger der Rinderdiarrhoe wurden nachgewiesen, wobei die

Prävalenzraten zwischen 5,8 % und 30,7 % lagen (siehe Tabelle 3). Die Analyse der

Nachweisraten in klinischen Proben ergab, dass die drei häufigsten Erreger E. coli, BRVA und

C. parvum mit 31,8 % (63/198), 24,2 % (48/198) bzw. 19,7 % (39/198) waren. Salmonella spp. wiesen mit 6,1 % (12/198) die niedrigste positive Nachweisrate auf. Dies zeigt, dass die in dieser Studie etablierte Nachweismethode fiir die klinische Anwendung ausreichend sensitiv ist.

Tabelle 3: Testergebnisse fiir klinische Durchfallproben

Pathogentyp

Erreger-Typ Erreger-Name Pathos Falls n(Prozentanteil / %)

Viren BVDV 26 (12.6%) (35.9%, 74/206) BRVA 48 (23.3%)

Bakterien E. coli 63 (30.7%) (36.5%, 75/206) Salmonella spp. 12 (5.8%)

Parasiten E. bovis 18 (8.7%) (27.6%, 57/206) C. parvum 39 (18.9%) — Gesamt 296

Die oben beschriebenen Ausführungsformen veranschaulichen lediglich bevorzugte

Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung und sollen deren Umfang nicht einschränken.

Alle Modifikationen oder Verbesserungen, die von Fachleuten an den technischen Lösungen der vorliegenden Erfindung vorgenommen werden, fallen in den durch die beigefügten Ansprüche definierten Schutzumfang, sofern sie nicht vom Geist der Erfindung abweichen.

Claims (5)

Ansprüche LU603280

1. Spezifische Primer und Sonden für den multiplexen fluoreszierenden PCR-Nachweis von bovinen Durchfallerregern BVDV, BRV, E. coli, Salmonella, E. bovis und C. parvum, dadurch gekennzeichnet, dass die Sequenzen der spezifischen Primer und Sonden wie in SEQ ID NO. 1-12 gezeigt sind, wobei: BVDV-Upstream-Primer SEQ ID NO.1: 5°’- TGGGTGGTTGAAGCCCTGAG -3’; BVDV-Downstream-Primer SEQ ID NO.2: 5’- CGCTCAGGTTAAGATGTGTTGT -3°; BVDV-Sonde SEQ ID NO .3: 5’- ROX/AGTCGTCAGTGGTTCGA/MGB -3’; BRV-Upstream-Primer SEQ ID NO.4: 5’- AGTTGATGAGACCACCAAACAT -3’; BRV-Downstream-Primer SEQ ID NO.5: 5’- GCAGATTCAATCCTAAGTGTCAGT -3’; BRV-Sonde SEQ ID NO.6: 5’- FAM/CAGCAGTAGCAGCACT /MGB -3’;

E. coli-Upstream-Primer SEQ ID NO.7: 5’- TACGGGAACTCCGAAGAGGATT -3°;

E. coli Downstream-Primer SEQ ID NO.8: 5’- TCTGGTCGGTCAGTCCAACAACAT 15-37

E. coli-Sonde SEQ ID NO.9: 5’- FAM/CATACCGGCAGTCAGTT/MGB -3’; Salmonella Upstream-Primer SEQ ID NO.10: 5’- GGCGCGCAACGTCAATGAAT -3’; Salmonella-Downstream-Primer SEQ ID NO.11: 5°- TACCGTGGCATGTCTGAGCACT

-3°. Salmonella-Sonde SEQ ID NO.12: 5’- VIC/CGGTATTCAGGAAACAA/MGB -3’;

E. bovis-Upstream-Primer SEQ ID NO.13: 5’- CGTGTCTAACGCAAGGAAGT -3’;

E. bovis-Downstream-Primer SEQ ID NO.14: 5’- ACTCGTTGCATGCATCAGTGT -3°;

E. bovis-Sonde SEQ ID NO.15: 5’- VIC/ACAGGTCTGTGATGCC/MGB -3°;

C. parvum-Upstream-Primer SEQ ID NO.16: 5’- TGCTTAAAGCAGGCTTCTGCC -3°;

C. parvum-Downstream-Primer SEQ ID NO.17: 5’-ATGCTTTCGCAGTAGTTCGT-3’;

C. parvum-Sonde SEQ ID NO.18: 5’-FAM/CCAGCATGGAATAATA/MGB-3’.

2. Die spezifischen Primer gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Reaktionssystem zur Durchführung einer multiplexen Fluoreszenz-PCR unter Verwendung der spezifischen Primer zwei Szenarien umfasst: Echtzeit-Fluoreszenz-PCR-Amplifikation von viraler RNA in Proben oder in vitro transkribierten RNA-Standards unter Verwendung des TransScript® Probe One-Step qRT-PCR SuperMix Kits. Das Reaktionssystem umfasst: 12,5 ul 2xPerfectStart™ Probe One-Step qPCR SuperMix, 0,5 ul TransScript® Probe One-Step RT/RI Enzyme Mix, je 0,5 ul Vorwärts- und Rückwärtsprimer und Sonde (Primer- und Sondekonzentration 10 umol/l), 1 ul Standard oder 3 ul genomische RNA aus der Probe, ergänzt mit ddH:O auf ein Endvolumen von 25 pl. Für die Amplifikation von viraler, bakterieller oder parasitirer DNA oder DNA-Standards in Proben wurde der GoTaq® Probe qPCR Master Mix verwendet. Reaktionssystem: 12,5 ul 2xGoTaq® Probe qPCR Master Mix, 1 ul Vorwärts- und Rückwärtsprimer und Sonde (Primer- und Sondekonzentration 10 umol/l), 1 ul Standard oder 3 ul genomische DNA der Probe, ergänzt mit ddH2O auf 25 pl.

3. Die spezifischen Primer gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Reaktionsprogramm für die multiplexe Fluoreszenz-PCR 5 Minuten bei 95 °C, 5 Sekunden bei 95 °C und 34 Sekunden bei 60 °C umfasst, wiederholt fiir 40 Zyklen, wobei die Fluoreszenz bei 60 °C erfasst wird.

4. Die spezifischen Primer gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass steriles Wasser als Negativkontrolle während der Multiplex-Fluoreszenz-PCR verwendet wird.

5. Die Verwendung der spezifischen Primer gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 bei de} 4603280 Herstellung von Produkten zum Nachweis der bovinen Durchfallerregern BVDV, BRV, E. coli, Salmonella, E. bovis und C. parvum.