LU81917A1 - Enzyme immobilise,son procede de preparation et procede pour realiser une reaction enzymatique - Google Patents

Description

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La présente invention concerne un enzvme immobilisé, un procédé de préparation de cet enzyme, ainsi au'un nrocêdé pour réaliser une réaction enzymatique utilisant l'enzyme immobilisé selon l'invention.

Il est connu de combiner un enzyme et un véhicule, le véhicule étant insoluble dans le milieu dans lequel l'enzyme doit être utilisé. Le but de l'immobilisation des enzymes est d'obtenir un produit enzymatique qui peut être aisément séparé du milieu de réaction et qui peut être réutilisé comme catalyseur biochimique.

"Plusieurs procédés chimiques ainsi que physiques sont connus pour fixer un enzyme à un véhicule insoluble. Par exemnle, l'enzyme peut être fixé à un véhicule par des liaisons chimiques covalentes.

Dans ce cas le véhicule contient des groupes actifs qui peuvent être introduits séparément et ces groupes actifs réagissent avec un ou plusieurs groupes actifs de l’enzyme. Des polysaccharides activés, des polymères synthétiques et des véhicules inorganiques activés ont été proposés comme matières poreuses actives. Il est également connu de coupler un enzyme à un véhicule par un agent de réticulation bi-fonctionel. Par exemple, l'aldéhyde glutanique est connu comme agent de réticulation. Gomme procédés physiques pour fixer un enzvme à un véhicule on peut mentionner la fixation » * ; à une résine échangeur d'ions, le capsulage en micro-capsules, l'inclusion dans des fibres de polymères synthétiques et l'occlusion dans des gels naturels ou synthétiques.

Quand des enzymes immobilisés doivent être utilisés pour la préparation d'un produit alimentaire, les procédés d'immobilisation utilisant un agent chimique de réticulation et/ou des polymères synthétiques ne sont généralement pas très recherchés, parce que les agents chimiques de réticulation, ainsi que les produits chimiques utilisés pour la préparation des polymères chimiques, • - 2 - meuvent ne pas être complètement inoffensifs. L'invention fournit un enzyme immobilisé dont les ingrédients sont inoffensifs pour les êtres humains et animaux.

Il a également été propose d'immobiliser un enzyme en l'enfermant dans un gel à l’amidon. Cette nroposition a été décrite dans le brevet des E.U.A. No. 3223593. A cet effet une solution claire et visqueuse est préparée en chauffant 3,25 g d'un amidon spécial (amidon Connaught) et 25 ml d'eau distillée. La solution refroidie est mélangée à une solution de cholestérinose de sérum de cheval, puis la composition peut gélifier. Selon la publication dans Anal. Chem. 37 (1965) (pages 1378-1381)le gel n'a qu'une très faible résistance mécanique et il est proposé dans cet article de résorber ce gel dans un morceau de mousse de polyuréthane à pores ouvertes. La fixation de l'enzyme au gel laisse également beaucoup à désirer, parce qu'environ 15¾ de l'enzyme sont facilement lavés.

Selon le brevet des E.U.A. No. 4106987 la glucose isomerase fixée à des cellules microbiennes est immobilisée dans une substance naturelle insoluble dans l'eau et formant un gel. L'amidon est mentionné comme une des substances utiles pour former le gel.

On a constaté avec surprise qu'un enzyme sans cellules peut être immobilisé de façon excellente dans un gel à l’amidon. Ainsi l'objet de l'invention est de fournir un enzyme immobilisé comprenant des structures formées de gel séché d'amidon dans lesquelles un ou plusieurs enzymes sans cellules sont enfermées.

L'enzyme immobilisé selon l'invention est de préférence de forme particulaire. Le produit a par surprise une bonne résistance mécanique. Le contenu en enzymes peut être ajusté à n'importe quelle valeur désirée, pourvu que le gel à l'amidon peut retenir l'enzyme. En général la quantité d'enzyme qui peut être absorbée * - 3 - dans le gel à l'amidon et qui peut être retenu dans celui-ci est au moins de 15¾ sur base de poids en amidon.

Un autre but de l'invention est un procédé pour préparer un enzyme immobilisé dans lequel un ou plusieurs enzymes sont absorbés dans un gel à l'amidon. Ce procédé est caractérisé par les étapes de mélanger une solution au moins partiellement gélifiée ayant une teneur en amidon de 20 à 601 en poids avec l'enzyme, de laisser gélifier le mélange pour former un gel et de lui donner la forme de structures formées séchées.

En pratique on prépare d'abord une solution d'amidon en malaxant l'amidon avec l'eau à une température élevée. La solution refroidie est ensuite /à une température à laquelle le(s) enzyme(s) à ajouter ne se décomposant) pas, nuis la solution qui peut être au moins partiellement gélifiée, est immédiatement mélangée avec l'enzyme. Puis le mélange obtenu peut gélifier. Le mélange de la solution avec l'enzyme est réalisé à la température la plus élevée possible pour éviter une gélification anticipée du mélange.

Un procédé très favorable selon leauel le mélange gélifié contenant l'enzyme est formé en des structures formées séchées consiste à filer à la presse le mélange, de sécher les fils obtenus et de découper les fils en pièce s.De cette façon un produit est obtenu sous forme de particules qui ont une grande résistance mécanique. Cette propriété est retenue quand le produit est mis en contact avec un liquide aqueux.

Le séchage peut être fait à l'air ambient ou sous pression réduite, à température élevée, mais pas tellement élevée qu'une désactivation de l'enzyme a lieu. En général, le séchage peut être réalisé d'une façon sûre à des températures inférieures à 30°C.

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Bien que n'importe quel amidon naturel, tel que l'amidon de maïs, de froment, de seigle, de tanioca, de cassave, de riz, de pomme de terre ou de sarrasin, ou des amidons de légumineuses,peut être utilisé comme amidon dans les produits ä enzyme immobilisé selon l'invention, des fractions d'amidon nur sénaré de ces amidons, telles que 1'amylopectine (la fraction ramifiée de l'amidon), neuvent être utilisées. Il est également nossible d'utiliser des dérivés de l'amidon permettant la préparation d'une solution d'une teneur de 20 à 60¾ en poids, cette solution ne gélifiant nas “complètement au bout d'une période de temps courte à la température maximum à laquelle elle peut être mélangée à l'enzyme (la température de décomposition de l'enzyme). L'amidon de nommes de terre, 1'amylopectine obtenu à partir de l'amidon de pommes de terre ou l'amidon de mais est l'amidon préféré.

L'invention peut être utilisée pour immobiliser différents enzymes, tels que lactase, invertase, catalase, glucose-oxydase, phosnhoglucose-oxydase, amino-acylase, phosphohvdrolase du mono-ester de l'acide orthophosphorique, et autres. De très bons résultats ont été obtenus avec lactase, catalase, glucose-oxydase, et une combinaison de catalase et glucose-oxydase.

En plus on a trouvé de façon surprenante que l'enzyme enfermé dans un gel d'amidon selon l'invention peut être purifié très facilement en extrayant l'enzyme immobilisé avec l'eau ou une solution de sel, par exemple une solution tampon.

A cet effet les granules de l'enzyme immobilisé peuvent être mis en suspension dans le liquide extracteur et la suspension peut être agitée légèrement. Puis l'enzyme immobilisé peut être enlevé par aspiration et, si nécessaire, le procédé peut être répété plusieurs fois. Comme liquide d'extraction un liquide tampon de 0,02 M de phosphate de potassium d'un pH de 7,0 est particulièrement - 5 - approprié. Il paraît qu'en utilisant ce procédé d'extraction une grande quantité, dans le cas de lactose autant que 7 5¾, de la teneur originale en azote dans l'enzvme immobilisé peut être enlevée sans diminution de l'activité de l'enzyme. Ceci était le cas pour une préparation d'enzvme disponible dans le commerce et obtenue à partir de Saccharomyces lactis.

Cette nossibilité de purifier la préparation d'enzyme d'une manière simple est très importante, parce que selon l'invention des « enzymes plutôt impurs d'un prix de revient beaucoup plus petit que les enzymes purifiés peuvent être utilisés comme matières de départ.

Les enzymes immobilisés selon l'invention sont extrêmement bien appropriés pour réaliser des réactions enzymatiques et pour cette raison l'utilisation d'enzvmes immobilisés selon l'invention et d'un enzyme préparé selon l'invention font partie de l'invention.

Une importante application d'un des enzymes immobilisés selon l'invention, c'est-à-dire la lactase immobilisée, est le traitement de lait ayant une teneur en graisse normale ou réduite ou de petit-lait, pour convertir la lactose qu'il contient en un mélange de glucose et de galactose. En particulier dans le cas de produits destinés à la consommation par les êtres humains ou les animaux, il est indésirable d'ajouter l'enzyme sous forme soluble, i parce que dans ce cas l'enzvme reste dans le produit. Tel qu'on l'a indiqué plus haut, des substances auxiliaires chimiques, généralement toxiques, c'est-à-dire des réactifs bifonctionels, tels que des dialdéhydes, cyanamides, résines époxy et autres sont nécessaires pour l'immobilisation de l'enzvme (brevet des E.U.A.

No. 3838007). D'autre part, dans le cas de préparationsd'enzyme qui sont enfermées physiquement ou chimiquement dans des gels, par exemple un gel de polyarcrylamide (voir Biotechnical and Bio-Engineering 1_5, 395-402 (1973) ), par polymérisation in situ, . - 6 - celles-ci restent polluées par des résidus des catalyseurs chimiques nécessaires pour la polymérisation, tels que des initiateurs de radicaux, et d'autres accélérateurs de la réaction de faible poids moléculaire et également toxiques.Les produits de lactase immobilisée selon l’invention n'ont pas de tels désavantages, parce que ces produits ont été préparés uniquement à partir de produits inoffensifs.

Un autre avantage de la lactose immobilisée selon l'invention est que l'efficacité de cette lactose ne diminue guère pendant son “utilisation. L'enzyme n'est non seulement solidement fixé à l'amidon, mais l'hydrolise de la lactose peut être réalisée d'une manière telle que l'enzyme immobilisé ne sera pas affaibli par obstruction des pores par le dépôt de protéines lactiques et d'autres ingrédients du lait sur les particules du véhicule. Ce désavantage se présente avec les enzymes immobilises connus (Chemical Week, Novembre 14,1977, pages 37-38). On a trouvé que les particules peuvent être érodées sans être désintégrées. De cette façon la surface des particules est nettoyée et une résistance supplémentaire à la diffusio^ qui peut être causée par la pollution, est évitée. Un tel procédé d'abrasion très lent peut être causé en agitant le contenu d'un réacteur contenant un mélange de particules d'un catalyseur enzymatique et un substrat (p.ex. un liquide contenant de la lactose), ou en maintenant les particules du catalyseur enzymatique à l'état fluidisé par un flux de liquide montant. En contrôlant l'énergie introduite par l'agitation ou la fluidisation respectivement, la vitesse d'abrasion désirée peut être facilement obtenue et le dépôt de protéines du lait ou d'autres dépôts polluants peuvent être évités de façon efficace.

, 7 - L'invertase ou -fructosidase est un enzyme qui peut être produit par certaines souches de Saccharomyces cerevisiae.

L'enzyme peut être utilisé nour préparer la fructose à partir de la saccharose et/ou de la maltose. Il paraît que dans la forme immobilisée selon l'invention l'invertase est également fixée de façon très forte au gel d'amidon. L'activité de l'invertase n'est pas réduite après stockage dans un tampon de pH 5,2 dans un réfrigérateur pendant 40 jours. L'enzyme immobilisé peut aussi être utilisé pour l'inversion de la saccharose à une température plus élevée, par exemple 40°C, sans affecter l'activité. A cette température plus élevée la réaction d'inversion avance considérable ment plus vite. Quand un enzyme impur a été utilisé dans l'enzyme immobilisé, il est possible de laver une ouantité considérable d'impuretés sans réduire l'activité de l'invertase.

La catalase peut être isolée du foie de vache et neut être utilisée pour l'élimination du peroxyde d'hydrogène utilisé comme désinfectant. Le peroxyde d'hydrogène utilisé nour la désinfection peut être produit en utilisant une glucose-oxydase immobilisée selon l'invention, après auoi la quantité restante de peroxyde d'hydrogène peut être éliminée à l'aide d'une catalase immobilisée selon l'invention. La catalase aussi bien que la glucose-oxydase sont très solidement fixées au gel d'amidon.

Une importante application des préparations enzymatiques décrites réside dans l'élimination de l'oxygène de liquides contenant de la glucose, telle que la bière ou d’autres boissons. La présence d'oxygène dans la bière est indésirable, parce qu'il peut provoquer un changement défavorable du goût. Pour éliminer - 8 - « l'oxygène de boissons contenant de la glucose, un enzyme immobilisi selon l'invention contenant de la catalase et de la glucose -oxydase peut être utilisé avec succès. Il est également possible de produire de l'acide gluconique à partir de la glucose à l'aide d'un catalyseur contenant lesdits enzymes en introduisant de 1'oxygène.

Les exemples suivants sont destinés à illustrer l'invention.

Exemple I.

80 g d'amidon de pomme de terre à l'état natif séché à l'air (teneur en humidité 17¾ en poids) et 100 g d'un tampon de 0,02 moles de phosphate de potassium d'un pH de 7,0 sont introduits dans une auge à double paroi d'un pétrisseur de laboratoire Werner Pfleiderer en acier inoxydable pourvu d'un moven de pétrissage en forme de sigma. En continuant à pétrisser le contenu du pétrisseur, il est chauffé à 96°C par chauffage à l'eau bouillante dans la double paroi. Quand cette température est atteinte, le pétrissage est continué pendant une heure. Ensuite le mélange est refroidi à 27°C dans environ 30 minutes, puis une solution de 3,5 g d'une préparation de lactase obtenue de Saccharomyces lactis dans 16,5 g d'une solution tampon de 0,02 mole de phosphate de potassium d'un pH de 7,0 est ajoutée. Ce mélange est pétri à température ambiante pendant une heure et puis le contenu du pétrisseur est transféré dans un récipient en verre qui est fermé et stocké pendant environ 16 heures à une température de 4°C.

Le jour suivant des fils sont produits à 20°C à l'aide d'une presse à filage en acier inoxydable pourvu d'une plaque ayant des trous d'un diamètre de 1,0 mm. Ensuite les fils filés à la presse sont séchés pendant 6 heures à 25 à 28°C dans un four de séchage à circulation d'air pour obtenir une teneur - 9 - * en humidité d'environ 13¾ en poids. La mouture dans un broyeur à impact rendant une courte période de temps et le tamisage produisent des granulés formés de particules cylindriques ayant un diamètre de 0,9 mm et une longueur de 0,4 à 1,2 mm. Les granulés ont une couleur légèrement brune et une odeur de moisi.

Exemple II.

Tel que décrit dans l'exemple I un mélange de 110 g d'amylo-pectineséchffe à l'air (teneur en humidité d'environ 11¾ en poids) et 110 g d'un tampon de 0,02 moles de phosphate de potassium d'un pH de 7,0 est pétri pendant 60 minutes à 85 à 90°C. Après refroidissement à 30°C, une solution de 5,0 g d'une préparation de lactase séché à l'air obtenu?de Saccharomyces lactis (teneur en humidité d'environ 11¾ en poids ) dans 25 g d'une solution tampon de 0,02 moles de phosphate d'un pH de 7,0 est ajoutée. Ensuite le mélange est pétri pendant une heure à 25°C et est ensuite laissé seul pendant 16 heures à 4°C.

Le filage sous pression, le séchage, la mouture et le tamisage selon l'exemple I fournissent des granulés similaires à ceux de l'exemple I.

EXEMPLE III

Tel que décrit dans l'exemple I un mélange de 97 g d'amidon de pomme de terre séché à l'air (teneur en humidité 17,2 ¾ en poid et 78 g d'un tampon de 0,02 moles de phosphate de potassium d'un pH de 7,0 est pétri en chauffant. Après avoir atteint la température de 90°C, le pétrissage est continué pendant une heure à 96°C. Le refroidissement à 28°C est effecté en environ 30 minutes, puis une solution de 4,0 g de lactase séchoe à l'air de Saccharomyces lactis (teneur en humidité d'environ 8,5¾ en poids) dans 25 g d'un tampon de 0,02 moles de nhosphate de potassium d'un pH de 7,0 est ajoutée au contenu de l'auge.

» - 10 -

Puis le mélange est pétri pendant une heure à 28-22°C et puis stocké dans un récipient en verre fermé pendant 16 heures à 4°C.

Le filage sous pression, le séchage, la mouture et le tamisage selon l'exemple I fournissent des granulés similaires à ceux de l'exemple I.

Exemnle IV

Purification du catalyseur enzymatinue de l'exemple II.

Dans un récipient de réaction fermé en verre muni d'un agitateur^ 100 g de granulés d'enzymes obtenus selon l'exemple II et 800 g d'un tampon de 0,02 moles de phosphate de potassium dans de l'eau distillée deux fois d'un pH de 7,0 sont agités légèrement en remuant pendant 7 heures. Puis l’agitation est arrêtée, la matière surnageante est aspirée et puis le traitement décrit est répété deux fois avec des parties fraîches de 800 g de liquide de lavage. Les granules ainsi obtenus satturés d'eau tamponnée sont directement appropriés pour le fractionnement hydraulitique de la lactose dans des systèmes aqueux. Aussi bien à l'état gonflé qu'à l'état sec cette matière est incolore, insipide et inodore.

Il paraissait qu'à l'état sec (teneur en humidité d'environ 11 à 13¾) le produit ne changeait pas pendant au moins trois mois, quand il était stocké à une température d'environ 4°C. Pendant la période de stockage l'activité spécifique reste identiciue à la valeur initiale de la préparation fraîchement produite.

Exemple V.

Hydrolyse de la lactose utilisant les granulés de catalyseur enzymatique gonflés et prélavés selon l'exemple IV.

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Substrat: une solution de monohydrate de lactose chimiquement pure dans un tamnon de 0,02 moles de phosohate de potassium dans de l'eau distillée deux fois d'un pH de 7,0 contenant aussi 2,0 mM de sulfate de magnésium par litre. Cette solution contient 5,28 g de lactose nar 100 ml calculée sur base de produit anhydre.

Dans un réacteur en verre à agitateur on introduit: 1800 g du substrat liquide ' 300 g de granulés de catalseur gonflés (contenant seulement 100 g de matière catalytique séchée à l'air, dans laquelle 5,0 g d'une préparation enzymatique séchée à l'air ont été absorbés).

La concentration de lactose diminue à 4,75 g de lactose anhydre par 100 ml en ajoutant le catalyseur. Tout en agitant de façon continue, mais à vitesse modérée, la diminution de la teneur en lactose dans le temps à 25°C est suivie à l'aide d'une analyse oxydimétrique automatique.

Plusieurs résultats observés pendant le temns de réaction de 60 minutes sont résumés dans le tableau A.

Tableau A

Hydrolyse de la lactose dans l'eau sous l'influence de ß-galactos dase (lactase) dans un gel d1amylonectine._

Temns écoulé Lactose convertie en % de la lactose initiale en minutes__________ 0 0 10 23 30 58 60 82 - 12 - %

Après une hydrolyse d’une heure,une teneur en lactose suffisamment basse nour l'application dans l'industrie laitière a été réalisée. La masse du catalyseur était enlevée du substrat liquide par filtration, le catalyseur était lavé deux fois avec des portions de 100 ml d'eau distillée deux fois, tamponnée avec du phosphate de potassium d'un pH de 7,0, et après aspiration du produit de lavage final, l'enzvme immobilisé était de nouveau mélangé avec 1800 g d'une solution fraîche de lactose.

Cette procédure était répétée 20 fois et on a trouvé que les résultats d'hydrolyse du tableau A restaient presque inchangés, même après la vingtième répétition.

Après la vingtième répétition le catalyseur était lavé et séché jusqu'à ce qu'un poids constant était réalisé. Une perte de poids de 6¾ par rapport au poids initial du catalyseur était intervenu dû à l'abrasion mécanique ou la dissolution respectivement .

Exemple VI

Tel ciue décrit dans l'exemple V, des essais d'hydrolyse étaient réalisés utilisant des granulés d'enzyme obtenusselon l'exemple I. 2,0 g de granules d'enzyme séchés à l'air selon l'exemple I par 40 g d'une solution aqueuse de lactose de 4,75 % et d'un pH de 7,0 et une température de 25,0°C étaient utilisées.

Après chaque essai la masse de catalvseur était enlevée par filtrage, le catalyseur était lavé de la même manière que dans l'exemple V et puis réutilisée pour l'essai suivant. Des résultats sont donnés dans le tableau B.

Essai No. ___ Degré d'hydrolyse________ % de lactose convertie % de lactose convertie après 10 minutes après 30 minutes - 13 - t

Tableau B

1 20 48 2 57 3 25 60 4 29 60 5 29 59 6 - 7 58 8 26 58 9 27 58 10 26,5 58

Après le vingtième essai, les granulés d'enzymes étaient séparés et contactés de nouveau avec 40 g d'une solution de lactose de 4,75¾. La composition totale pouvait rester là 12 fois 24 heures. Après cette période il apparut que les granulés d'enzyme avaient la même activité que la valeur de l'activité à l'essai No. 10.

Exemple VII

Tel que décrit dans l'exemple V, des essais d'hydrolyse étaient réalisés en utilisant des granulés d'enzvme selon l'exemple III. 4,0 g de granulés séchés à l'air selon l'exemple III étaient mis en suspension en agitant à vitesse modérée dans 80,0 g d'une solution de 4,75¾ de lactose dans un tampon de 0,02 moles de phosphate de notassium de nH 7,0.

Après un temps de contact 10, 30 et 60 minutes à une température de 25°C, la quantité de lactose convertie était déterminée au moyen d'une analyse oxydimétrique automatique. Le degré de réaction ou d'hydrolyse était exprimé comme pourcentage de lactose - 14 - t convertie. Après un temps de contact d'une heure, le substrat liquide était séparé les granulés d'enzymes par décantation.

Ensuite les granulés d'enzymes étaient lavés deux fois pendant environ 15 minutes avec des portions de 70 g de tampon de 0,02 moles de nhosphate de potassium d'un pH de 7,0 et ensuite remis en suspension dans une solution fraîche de lactose.

Ensuite les mêmes mesures étaient réalisées encore une fois. Pendant 5 jours consécutifs 4 séries de mesures oar jour étaient réalisées. Les résultats sont réaimés dans le tableau C.

Tableau C

Hydrolyse de la lactose dans l'eau sous l'influence de lactase dans un gel d'amidon de nomme de terre_

Temps de Degré de conversion en % de la lactose présente réaction initialement après la nième répétition_ en minutes n=0 n=3 n=6 n=10 n=15 n=19 10 18,0 28,5 31,0 30,0 26,0 25,5 30 - 61,0 64,0 62,0 57,0 57,0 60 74,0 83,0 86,0 82,0 82,0 83,0

Après la vingtième mesure, le catalyseur était lavé avec le tampon jusqu'à ce qu'un point constant était obtenu et par pesage on a déterminé qu'environ 4,2% du poids original des granulés étaient perdus dûs à l'abrasion.

Exemple VIII

Hydrolyse de la lactose de lait écrémé stérilisé à 25°C.

Substrat: Lait "Lilac" (Belgique) stérilisé à haute température; teneur en lactose : 4,8 g par 100 ml.

Equipement d'essai, procédure et analyse complètement identiques à ceux de l'exemple V. Dans cet exemple une série répétée de mesures avec la même préparation initiale d'enzvme était réalisée. Au total 20 hydrolyses ont été faites. Les résultats sont résumés dans le tableau D.

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Tableau D.

Hydrolyse de la lactose dans le lait écrémé à 25°C sous l'influence de ß -galactosidase enferme dans un gel d1 ainylonectine.

Temps de Degré de conversion de la lactose en î de la lactose réaction originalement présente après la niëme répétition._ en minutes n=0 n=l n=4 n=8 n=12 n=20 0 0 0 0 0 0 0 10 16,3 15,6 16,1 14,8 14,9 12,1 30 42,5 42,0 43,0 40,0 42,0 37,0 60 58,0 56,0 56,8 56,0 53,0 49,0 120 78,0 76,0 75,7 72,0 71,2 64,0

Exemple IX.

Préparation d'invertase immobilisée.

Tel que décrit dans l'exemple I un mélange de 40,0 g d'amylo-pectine séchée à l'air (teneur en humidité d'environ 13¾ en poids) et environ 50 ml d'un tampon de 0,02 moles de phosphate de potassium d'un oH de 5,2 était pétri pendant une heure à 90°C et puis refroidi à environ 40°C. Ensuite une solution de 0,8 g d’invertase dans environ 9 ml d'eau était ajoutée.

Ensuite, sous refroidissement continu jusqu'à 25°C, le mélange était pétri pendant une heure et puis stocké dans un réfrigérateur pendant 16 heures à environ 5°C.

Le mélange était filé sous pression de la même manière que décritedans l'exemple I, avec la différence qu'une plaque ayant des trous de 0,5 mm était utilisée. Le produit obtenu était séché dans un four à circulation d'air, puis moulu et tamisé pour obtenir une fraction ayant une grandeur de particules désirées d'environ 0,3-0,6 mm.

Exemple X.

Selon l'exemple V l'activité de l'invertase immobilisée préparée en accord avec l'exemple IX était mesurée. La quantité » - 16 - de glucose et de fructose formées était mesurée au moyen d'une analyse oxydimétrique automatiaue. Les mesures étaient répétées plusieurs fois. Entre les mesures la nrénration d'enzyme était stockée à 5°C dans un tamnon de 0,02 moles de phosphate de potassium d'un pH de 5,2. (Jne série d'essais était réalisée à 25°C et à 40°C. Les résultats sont repris dans le tableau E.

Tableau E.

Inversion de la saccharose.

Préparation de l'enzyme selon l'exemple IX.

Substrat: 5,4¾ en poids de saccharose dans un tampon de 0,02 moles de phosphate d'un pH de 5,2.

Rapport en poids de la préparation d'enzyme et du substrat = 1:80 Période de Degré de conversion de la saccharose en I de la stockage saccharose originalement présente_

avant la Réaction à 25°C Réaction à 40°C

mesure --- (en jours) après après après anrès _ 1Ô min. 30 min. 1Ô min. 20 min._ 1/4 27,0 62,0 45,0 75,0 1/2 30,0 62,0 50,0 80,0 2/3 28,0 - 50,0 75,0 1 26,0 59,0 47,0 72,0 2 25,5 60,0 40 28,0 61,0

De ces essais il apparaît que l'invertase immobilisée maintient son activité même après une période d'utilisation prolongée et peut aussi être utilisée à une température plus élevée (40°C).

Exemple XI.

A. Préparation de la catalase immobilisée.

Dans un pëtrisseur de laboratoire modèle Werner-Pfleiderer on introduisait: - 17 - * 80 g d'amylopectine séché à l'air

90 g d'un tamnon de 0,05 moles de phosphate de potassium d'un pH

Détrissait , s „λ de 5,6 on * j pendant une heure a 90 C.

Après refroidissement à 20° on ajoutait à la masse homogène: 30 g d'une solution obtenue en dissolvant ou dispersant 2,5 g de catalase (Sigma C1Q avec une activité de 3400 unités Sigma) « dans 27,5 g d'un tampon de 0,05 moles de phosphate de potassium d'un dH de 5,6.

pendant

Ensuite le pétrissage était continué / environ une heure. Après^la préparation était stocké dans un récipient fermé pendant 16 heures à 5°C et puis, après filage sous pression pour former des fils avec un diamètre de 0,5 mm, la préparation était séchée et réduite par mouture pour former des granulés formés de particules cylindriques ayant un diamètre de 0,45 mm et une longueur de 0,3 à 0,6 mm. Le produit séché à l'air contenait environ 100 unités d'activité de catalase par mg.

B. Détermination de la perte d'activité par lavage.

Détermination de perte d'enzyme au moyen d'une mesure électrométrique de l'oxygène libéré par la réaction du liquide de lavage utilisé avec une solution aqueuse de 0,04¾ de peroxyde d'hydrogène.

50 mg de l'enzyme obtenu selon A étaient agités pendant 15 minutes avec 2,0 ml de tampon de 0,7 moles de phosphate de potassiu d'un pH de 7,1. Après décantation, le liquide de lavage clair était versé et l'activité de la catalase dans ledit liquide était mesurée en permettant au liquide de lavage de réagir avec une solution de 0,04¾ de peroxyde d'hydrogène à 25,0°C et en mesurant la production d'oxygène avec une électrode d'oxygène. Cette procédure est réalisée 15 fois utilisant toujours le même - 18 -ft échantillon de 50 mg de catalase immobilisée. Anrès 6 lavages une perte totale de 35,3 unités d'activité apparaissait , c'est-à-dire seulement 0,7¾ de l'activité originalement présente de la catalase. Les pertes après le sixième lavage étaient négligeables.

Exemple XII

A. Préparation de catalase/glucose-oxydase immobilisée.

Dans un pétrisseur de laboratoire modèle Werner Pfleiderer, ’ on a introduit: 79 g d'amylopectine séchés à l'air 100 g de tampon de 0,01 mole de phosphate de pH 5,6 et on a pétri pendant une heure à 90°C.

Après refroidissement à 36°C, on a ajouté à la masse homogène: 21 g d'une solution obtenue en dissolvant dans ou en mélangeant avec 20 g de tampon de 0,01 mole de phosphate de pH 5,6 0,100 g du glucose-oxydase (Boehringer Grade I; activité 200 unités par mg) et 1.00 g de solution de catalase (Boehringer No. 106836; 260,000 unités par ml).

Le mélange a été pétri sous refroidissement continu pendant une heure pour obtenir une température finale de 30°C. Le mélange obtenu était stocke pendant 16 heures à 6°C; puis le gel obtenu était filé sous pression pour former des fils ayant un diamètre de 0,5 mm, les fils étaient séchés en utilisant un flux d'air de 30°C et finalement moulus pour former des grains ayant une longueur d'environ 0,5 mm.

B. Procédure de lavage: détermination de la perte d'enzyme par mesure de l'activité de l'eau de lavage; catalyse homogène.

4.0 g d'un produit séché à l'air (teneur en humidité d'environ 1 AÖ____* 1 A ~ _______ J .. ~ Ί , , ^ Λ__ * - 19 - oxydase d’environ 0,125 \ en poids étaient agités pendant différentes périodes de temns avec des portions de 30 g d'un tampon d'environ 0,005 mole de nhosphate de pH 5,6. Anrès décantation, double lavage du résidu avec des nortions de 25 ml d'une solution tamponnée fraîche et en combinant 11 liquides de lavage, l'activité totale de glucose-oxydase des liquides de lavage était déterminée. En rénëtant cette procédure de lavage avec la même matière, les résultats donnés dans le tableau F étaient obtenus.

Tableau F.

Perte d'enzvme en lavant

No. du lavage Temps en Température Perte d'enzvme en mg xx>

heures en °C

1 x 0,75 22 0,08 2 x 3 22 0,06 3 xx 16 6 0,05 4 x 4 22 0,02 5 xx 40 6 0,02 6 x 6 22 0,02 7 xx 90 6 0,02 x agité avec la solution tamponnée » xx au repos dans la solution tamponnée à 6°C xxx calculé à partir de l'activité mesurée dans le liquide de lavage.

La perte totale d'enzyme est inférieure à 0,27 mg ou 5,4¾ de la quantité totale.

C. Application des enzymes immobilisés r>our éliminer l'oxygène d'une solution de 0,5¾ de glucose._____ Méthode d'analyse.

0,200 g d'enzymes immobilisés , lavés en accord avec B étaient - 20 - i maintenus à 25,0°C à l'aide d'un thermostat, et pourvu de: a. un agitateur magnétique b. une électrode oxygène du type "Clark" et c. un tuyau capillaire pour l'aduction de gaz et une solution tamponnée aqueuse de 0,02 mole d'acétate de sodium de pH 4,59 était ajoutée pour obtenir un volume total de 32,0 ml.

Ensuite de l'air à la pression atmosphérique était passé . à travers le tube capillaire pendant que le dispositif de captage de l'oxygène était raccordé au moyen du Y.S.I. "moniteur d'oxygène biologique" (Yellow Springs Instrument Co.,Inc.) pourvu d'un enregistreur et connecté à l'électrode du type Clark. Quand la concentration de saturation était atteinte, l'instrument était ajusté à 1001 de saturation, après quoi de l'azote était passé sous pression atmosphérique jusqu'à ce que la valeur de saturation était réduite à 50¾. Alors la quantité d'oxygène dissout est d'environ 0,14 millimole par litre ou environ 4,4 mg par litre.

Ensuite 0,5 ml d'une solution aqueuse de 32¾ de glucose libre d'oxygène était injecté dans le récipient à travers le tube capillaire qui fasait sortir 0,5 ml de solution tamponnée (sort par le tube capillaire). La diminution d'oxygène qui commence immédiatement était enregistrée par rapport au temps en utilisant l'enregistreur raccordé. Dès que la quantité totale d'oygène avait été consommée, la solution de glucose était décantée du récipient de réaction, la préparation d’enzyme était lavée quatre fois avec des portions de 15 ml de solution tamponnée fraîche libre de glucose et l'essai était répété.

Cette procédure était répétée 5 fois au total. Après 15 minutes il apparaissait qu'environ 20¾ de la concentration de saturation d'oxygène était présente, tandis qu'après 30 minutes ' - 21 - % la solution était nresque libre d'oxygène. Aucune diminution de l'activité avait été trouvée.

Exemple XIII.

Elimination de l'oxygène de la bière.

Selon le procédé décrit dans l'exemple III C 32 ml de bière ("Heineken Oud Bruin") dont la teneur en oxygène était ajustée à 6,5 mg par litre étaient traités avec 200 mg d'un produit d'enzyme obtenu selon l'exemple XII A. Les résultats obtenus * sont donnés dans le tableau G.

Tableau G.

Teneur en oxygène de la bière après traitement avec glucose-oxydas catalase immobilisée à 25°C._ '

Minutes mg 02/l minutes mg 02/l 3 5,85 18 1,43 6 5,01 21 0,91 9 3,97 24 0,49 12 2,99 27 0,20 15 2,15 30 0,10

Tel qu'il sort du tableau G, une concentration d'oxygène acceptable pour la bière était réalisée, tandis qu'après 30 minutes on obtenait une bière presque libre d'oxygène ( < 0,lmg/l Exemple XIV

Formation d'acide gluconique à partir de la glucose.

On a fait agir 400 mg d'enzymes immobilisés obtenus selon l'exemple XII A sur une solution aqueuse de 0,9¾ de glucose tamponnée avec 0,005 mole de phosphate de potassium de pH 5,6, tout en passant de façon continue de l'oxygène sous pression atmosphérique.

La production d’acide gluconiaue apparaissait de la - 22 - i consommation d'une solution d’hydroxyde de sodium 0,1 N enregistrée au moyen de l'enregistreur d'un dispositif de titrage automatique, tout en maintenant le oH constant.

Il apparaît que par heure environ 4¾ de la glucose originalemen nrêsente est convertie en la quantité équivalente d'acide gluconique.

Bien entendu diverses modifications peuvent être aoportëes par l'homme de l'art aux modes de réalisation qui viennent d'être * décrits uniquement à titre d'exemples non limitatifs sans sortir „ du cadre de l'invention.

»

Claims (16)

1. Enzyme immobilisé caractérisé par des structures formées de gel d'amidon séché renfermant un ou plusieurs enzymes libre de cellules.,

2. Enzyme immobilisé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il a la forme de grains.

3. Enzyme immobilisé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce qu'il a une teneur maximum en enzyme de 15¾ en poids.

4. Enzyme immobilisé selon les revendications 1 à 3, caractérisé en ce que l'enzyme est lactase, invertase, catalase, glucose -oxydase ou catalase et glucose-oxydase.

5. Enzyme immobilisé selon les revendications 1 à 4, caractérisé en ce que l'amidon est l'amidon de pomme de terre, 1'amylopectine et/ou l'amidon de maïs.

6. Enzyme immobilisé selon les revendications 1 à 5, caractérisé en ce que l'amidon est 1'amylopectine.

7. Procédé de préparation d'un enzyme immobilisé en incorporant un ou plusieurs enzymes dans un gel d'amidon, caractérisé en ce qu'on mélange une solution d'amidon au moins partiellement gélifiée ayant une teneur en amidon de 20 à 60¾ en poids avec l'enzyme, qu'on laisse le mélange gélifier et qu'on le met en forme de structures formées séchées.

8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que la mise en forme du mélange gélifié se fait par filage sous - pression du mélange sous forme de fils, qu'on sèche les fils obtenus et qu'on réduit les fils séchés en pièces.

9. Procédé selon la revendication 7 ou 8, caractérisé en ce que l'enzvme est lactase, invertase , catalase, glucose-oxydase ou catalase et glucose-oxydase.

10. Procédé selon les revendications 7-9, caractérisé en ce - 24 - « que l'amidon est l'amidon de pomme de terre, 1'amylopectine et/ou l'amidon de maïs.

11. Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que l'amidon est 1'amylopectine.

12. Procédé de purification d'un enzyme immobilisé, caractérisé en ce qu'on extrait les structures formées selon une ou plusieurs des revendications 1 à 6 ou les structures formées obtenues en accord avec le procédé selon une ou olusieurs des 7-11 revendications / avec de l'eau ou une solution de sel.

13. Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que la solution de sel est une solution tamponnée.

14. Procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce que la solution tamponnée est une solution tamponnée de 0,02 mole de phosphate de potassium.

15. Procède selon les revendications 12 à 14, caractérisé en ce qu'on purifie une lactase immobilisée par extraction avec une solution tamponnée de 0,02 mole de phosphate de potassium de pH 7,0.

16. Procédé pour réaliser une réaction enzymtique, caractérisé en ce qu'on utilise un enzyme immobilisé en accord avec une ou plusieurs des revendications 1 à 6 ou un enzyme immobilisé obtenu selon une ou plusieurs des revendications 7 à 15.