LU85868A1 - Composantes immunoactives immobilisoes dans une matiere poreuse - Google Patents
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Description
* *î
COMPOSANTES IΜί· ~T>-C ACTlVES IMîwB-IL-I SEES
\ - Γ'λ1»5 *01 s Z MAT X ZRE tC Pu T Si.· COP^slSSarCS® s^*-.*** 05 Un ,!imunoassay" constitue une technique analyti que Das sa sur 1 'ϊιιιγ.ι^θ c1 ur. antxgene pour Iss sites ö1 êssocicticn c'en anticrèr.e sur un anticoros. Les anti— cènes ou les antxcorcs sent rareres directement ou indirectement avec ur. isotope, une er.zyre, eu flucrocnrome 10 ou uns auure sur-stance nesurêDie · On etac_xt ces courcss d*étalonnage sur la base ce données obtenues après incubation d'échantillons eux contiennent des concentrations differentes, rais connues, d’antigene ou d’anticorps. Après une incubation, or. sépare les complexes associés 15 d1(antigène-anticorps}r ce l’antigène ou de l’anticorps libre. Ensuite, on mesure la quantité ce complexe formé ou d'antigène ou d'anticorps restant libre au moyen de détecteurs spécifiques dépendant du marqueur utilisé. Ce processus est répété cour ur. certain nombre c'échantil-20 Ions qui contiennent des quantités bxen déterminées d’antigènes ou c’anticoros et les résultats obtenus sont présentés sous forme d’un craphioue. Or. v porte la cuan-tité de marqueur que l'on mesure dans le complexe antigène-anticorps, ou bien dans l’antigène ou 11 anticorps 25 estent- 0p. fonction ess diversss conc0np.pGP.iops dBe.nti— cène ou ganticorps. Lorsque cette courbe g * étalonnéçe a 11 s 6 6 a cette rr'"* co*"s* £*6 i ^ ^ r- - · ~ _ tr erb tcst-rce sur et cc.rbcrt f Ze ρ··β·—^et cire ^ di w- JL . μ· 0 X .G C'» I 1* ·; ' - —*·—- ·- '*“* ü v-, ί· Ci ^ ^ ^ d d. ** *“ î— T *·*’ ,** > ce 1‘anticorps ou eu complexe antigène-anticorps par
Une autre variante de cette technique est basée sur l'addition au mélange d'un deuxième anticorps qui Ce fait précipiter sélectivement l'anticorps (avec l'antigène qui y est associé}, ce qui laisse finalement uniquement l'antigène non associé en solution. L'antigène non associé est alors sépare du complexe antigène-anticorps par centrirugstion ou car un autre moyen » certains 10 chercheurs ont fixé l'anticorps ou l'antigène sur la paroi d'un récipient en nlasticue et puis on introduit dans le récipient un échantillon contenant un antigène ou un anticorps. Le mélange ainsi obtenu est incubé et puis on sépare le complexe antigène-anticorps formé de 15 l’antigène ou de 1'anticorps libre en vidant simplement le récipient.
Plus récemment, on a cherché à associer des antigènes et des anticorps à eu dextrane lui-même, έ de la cellulose et â des produits similaires. Après incubation 20 le complexe antigène-anticorps esc séparé de manière simple des antigènes ou ces anticorps non associés.
Dans toutes ces méthodes, on détermine 1‘antigène ou l'anticorps associe et on mesure, à 1'aide d'un courbe d'étalonnage, la quantité d'antigène ou £!anticorps 25 qui était présente dans l’échantillon inconnu.
^ ___ i «U. — * h r ^ ί-.^- Î.__- __*r ~ - - / - j_ ce p.usieurs anticen.es et anticorps __eurs rapports res — oectirs ne sont p-as cetermines a~'rec précision.
But de la présente invention >
V
qui permet de fixer divers antigènes ou anticorps en ces J- GuOr 1 LU:iS Dl wH Œ ..... ... —J. J.6 manière que 1 ‘ inmuncsorbant ainsi préparé puisse être employé dans des déterminations immunologiques indivi-05 Quelles ou multiples.
Objet de la présente invention L'invention porte sur un irr unes:rbant utilisable dans les déterminations i~molog 2 r u e s . le sortant (ad-1G serbant) hydrophile ou hydrophobe est à rase d'une matrice poreuse par exemple en polytétrafluorétnylène (PïFE) où se trouve attaché d’une manière non covalente un polymère organique ou inorganique, hydrophile ou hydrophobe, insoluble dans l'eau, tel que le pclyacrylami-15 de, la cellulose, le silioaçel, le latex ou un polymère analogue, auquel sont associés par covalence des antigènes et-'ou ces anticoros en des Quantités bien déterminées et, s'il s'agit de divers antigènes et."eu anticorps, en des proportions bien déterminées encre-eux.
20 De préférence la porosité est comprise entre 20 et 80% en volume.
L'invention concerne également le procédé mis en ΟΘ13VITS pOlir réciLlSeir uH tlw-L. ^TiïïnuriC'SOr'Oc.n't-f fi 25 EIerrtent.s essentiels ce 11 cr.vent.ion
Selon I " invention les aroïcères ou les eniieoros _ __ / ^ .__ « _ . K _ __ .
tr-le cens l;eeu ow' evei** ere — r ' ^ s ^ ** rccrc'" - —J p- ^ ^ ^ ^ ^ Ä - * s~' ~ *- · _ ^ J- _ - _ U ^ - w % * *- en diverses orcOomions ims le '"‘etnre ce "nsef ces >
V
A_ L ' incorporation eu polymère insoluble cens la ma-trice de base peut se faire par voie sèche.
G5 Description détaillée ce 1*invention
La méthode utilisée tour immobiliser ces compt— * . . - . v ,__ c; ~ c; r ^ ** · *» **\ ^ s" t*ÄC ^ o ~ ^ ^ χ·'·· ä *“> ä ^ t* -· w? W* * - - -r w «.· ' k. . · m ·. c ' M W ·*. * — **,««.·.« W' ti i A W- w» W —- ·«-· V-i fcr- W ^-——w _ ^ ^ ^ ^ ^ w c „34 4?ί — _____ . ^ -__^.— 4 i_’SS -ac UX 0O0 S wUi. 000,^0710 0UIT0 c..;!'!-' ^ 00S OQj>k»I70 10 supports insolubles dans l'eau sont la cellulose, le po- lyacrvlamice, le silicacel, un latex, le sécharose, /f 1‘agarcse, etc.
La technique utilisée comporte essentiellement les étapes suivantes : 15 - on mélange ensemble le polymère poreux insoluble, ac tivé, non activé ou couplé par l'antigène ou anticorps avec la matrice poreuse de base à l'état pulvérulent pour former ur. mélange sec, - on soumet ce mélange sec à un traitement c'agglonéra-2G tion pour former ces agglomérats, - on soumet les agglomérats formés â ur: traitement de broyage pour former des agglomérats broyés, - on presse ensemble les agglomérats broyés pour former • t y»" -%·*- - rp c. ci—· 25 — or. soumet le comprime à des laminaces ~uscu1 à obten— uxor: c * ur: ri 2.π ou c u.00 θ u x. Z. 2.0 __ — — _ ___ *- „ r — ' Τ.Γ- -* 9 -, -, *. * - _ t· r-t ~ ~ -- , - Λ i ^ ^ ^ -
J
f- ^ Ο Ο Γ' S t Ô. U S f3· OS po ! VT' S^SS ” rj S C- Jl ' ” -L S S / C* w r · ~ ~ ^ *“ 0 idenrique ou diffêrenres, ecrporrant- ces quantirés connues de composés biologiques et cens un rapport connu de ces polymères ainsi chargés.
05 Dans certains cas c‘application, il peur erre in téressant que iesdit.es polymères poreux insolubles soient, de ncitiiGc chiirierues cif fér^ros - o-e.zr exerroXe îiv·-ärophoc-es et hyarophyles afin ce f ispeser de techniques g‘acrivarion différenciées.
10
Exemoles d'execution de l'invenrion L'invenrion sera décrire plus en dérail en référence aux exemples d'exécution de l'invenrion, donnés uniquement à titre d ‘ illustration sans caractère lirrdta-15 tir.
Exemole "* uerre recmoue pemer ce cerisrer en meme rems des anticorps humains dirigés contre le cyrorégaiovirus 20 et ces anricoms humains diricés contre ce® —er ' c®-nes de surface de 1 * hépatite E. Les deux ar.riçsnes sont associés, par des réactions différentes, à un support en po— lyacrylamide qui esr ensuite incorporé dans une marrice en PTFE « 25 1. On hydrate 10 ç de polyacrylarrdde 'dimensions oss ctcituXôs jT-ietot’éttss Xittts c θycXu£^t
Cette susDsnsior. est ttiteÎ i r j r s~ t G6t"dô.nt 5 *p — _ f -- 5 c 4. On ajoute 70 ni de solution d'antigène (1 mg es prccssns,·· r.x î cens nu tampon su pnospnate· L'antigène gu cytomégalovirus est obtenu, entre autres,, à partir d'un extrait ce glycine-hydroxy-05 de ce sodium d‘une culture de fibroblastes conta minée par le cy tot-égalovirus ayant un effet cytc— pathocene ce ?1%.
L· antagene ce sur rare ce i nepatite E est or-tenu notamment à partir ce plasma hur.ain conte-10 nant iscit anticene» l'antigene meme est, par ex emple, isolé du plasma par chromatographie d’af-f ini uê âvsc css c.ntloorDs γγοποοΙοπεϊοι cirices contre l'antigene ce surface ce l’hépatite E.
Les deux antigènes sont incubés 'séparément 15 pendant 1 heure avec ur. gel de polyacrylamide ac tive .
5. Après 1'incubation, ces gels sont lavés 5 fois au moyen de 10" ici de tarpon au phosphate Ç cf.
20 6. Les groupes alcéhyfiques libres ci gel activé
sont bloqués par une incubation de 4 heures au moyen d ’ êthanclamne féthanolamine C,1K, dH
=7,6).
7. Ensuite, les gels sont lavés 3 fois au moyen 25 de 100 ml de tampon au phosphate (0,G2K, pH = 7,2,- apres quoi le tampon est éliminé et les * _ __ __ / - / r - ___" - __ -v* b " „ 2 _ . - . - - - paisseur, 71 est tes sic le de produire rlusie-rs 7 y cl w "C. ΙΓ $ B· ir C- n * S 3 0 '-i ΞΓ S · 9. à. partir ΰβ C£tt£ rêUllie OU ûSC£~pû Ce petits disques ce 5 mm de diamètre. Ces disques sont examinés par détermination immunologique.
05 10. La détermination immunologique est effectuée comme suit : un petit disque est incubé avec 0,5 ml c'une dilution au 1/200 de sérum de patients (dilution dans une solution de sel physiologique tamcornee au onosc-rate, r· 7 » 2, oui contrent 1%
~/CN
10 c! albumine bovine et 0,2% de 70ΤΞΙ" V£r 20}. L'incu bation s'effectue à la température ambiante perçant meure. tn meme temps que -i.es ecnantliiOns inconnus, on met en oeuvre un échantillon de contrôle positif et un négatif (pour l'antigène de 15 surface ce l'hépatite B et le cytomégalovirus).
11. Après 1'incubation, les casques sont Lavés 5 fois avec 3 mb de tampon de lavage (solution ce
NaCl 0,15 molaire tamponnée au^qfhosphate, pH = - - * *7 . Ο'”· ^ γ^^τιτ ~ ber “ Γ ~ > qcl ^T")' ’··^'* V 2 20 12. 200 microlitres d'une solution d'anticorps antanurriarns learcues a la terex^ta se sont ancures avec les petits disques pendant 1 heure.
13. Les disques sont ce nouveau lavés 5 fois avec 3 ml ce tampon de lavage ( solution ce NaCl 0,15 25 molaire tamponnée au phosphate, pH = 7,2, qui vv-. — . j- p ST c. A. — m- O "" vWUw.a.wiàw ü ; J1, uC j. ► ta- v· r t»'p. jn “ ' rp >·-< ·: r cl· G“1 ~ **T * Λ Γ T-' " 16. La quantité de produit ferré enn'-.tatiruerrer.t 8
V
% ·» 5 déviation? standard au-dessus ou contrôle n-éga- . - * / --n · - ' _ _ .· j - Î.li | ± ^CiècuxUl JL. ΟΠ SSl COnSICc-S ~ c - — — «
La limite de 95%, déterminée sur une grande série de sérums négatifs, se trouve dans cette méthode 05 aux alentours d'une densité optique de 0,200, mais celle-ci doit être ce nouveau déterminée expérimentalement pour chaque application.
Ex envoie 2 10 Dosage de protéine C réactive (C.F. .F.) dans du sérum de patient? au moyen c'un irrunos?sa y enzymatique appliqué suivant une technique en sandwich. Dans cette application, la fraction de gammaglobuline d'un sérum anti-C.R.F. hyperimmur.isé est associée par covalence è 15 un polymère de polyacrylamice enfermé dans une feuille de PîFE poreuse. De petits ciscues contenant cet anticorps sont incubés avec du sérum ce patients et une série d'étalons. On fart ensuite réagir 1'antigène associé avec un anticorps .marqué par une enzyme. Après êlimirs-20 tion par lavage de la fraction conjuguée non associée, on ajoute un substrat. La réaction enzymatique cinétique mesurée constitue une mesure de l’antigène présent. On peut effectuer une détermination quantitative par comparaison avec les valeurs obtenues pour les étalons.
25 Dans un processus servant d'exemple on réalise iSS Dp ë X~ S U. X ΟΠ S S O 0 Va. Π Ο Θ S * » (crooseur des orer-ules = 4C rrucuDr. éorss , Lûr.uoe
2 ^ £ ' 0 X ^ USiO-^· 4 O 0 Λ- " r. ” — ^ O“*** " “"-mm. *- ~ΓΥ* C ÄVJ
d'une solution de Γ& Cl C 1Ξ ^rl-oire uEouunnèe su o / \
K
%: f.
. J___ i _ _ V - - „ 3· Le Ci.u tar a .l c eny c e est. ensuite e^mme par levage en 5 opérations âe lavage au moyen de 100 ml de tampon au phosphate 0,IM, pH = 7,2.
05 4. La feuille activée est transférée dans 50 ml d’une solution d’anticorps anti-C.E.?., en une concentration adaptée, dans eu tarpon au phosphate (pH = 7,2). Cette concentration varie entre 1 me er 0,001 mg/mi suivant la qualité de 1 * antisê-10 rum.
5. Acres une incubation ce 1 heure a 4 decrês Celsius la protéine non associée est éliminée par lavage en 5 opérations ce lavage au moyen de 100 ml ce tampon.
15 6. Les groupes aldêhvdiques libres du gel activé
sont bloqués par une incubation de 4 heures au moyen c’éthanolamine {êthanolamine 0,IM, pE
— f i C / · 7. On sèche la feuille et on y estampe ces petits 20 ersoues ce r mur. es ciaretre* S. Pour la détermination quantitative, or trans- V , r . , . „ ...
^.SS C Θ G X C S C2.SC BS C X Π S CSS "C U D Θ S
^ O ci Γ θϋΚ ΰ’Τ.Γ^.β G Θ S DUDêS c)Vc!it UCS Ce Γ-2 Clt-0 Τ-Οΰδ-β C «i r ΓΠ-. / t 25 of Les sccucs è. tesccr àiicss ^nr* ^c-xs cens un tcercDCT. ce ci I ucior. * soi ucicn ce Ne CI 0 · 15 inc— f— 4 r-, - _ ___ _ ^ m / -U r J? * ^ V« + ,riiiJ A c· 4- ”, ~ ~ - rr U. . ' v r. - r v- c — “P'rit1 „ ^ U „ „ ' _ ___ ___ - __ . . V . _v _______ _ ^ y ___ f __ _ ___ _ .
ml d'un tarpon de lavage ( solution de ire 21 C, 1:
V
Λ 10 ·.
— ·~^ ' ^ -- '—j—r r~ ' - 2_ ^."p, ^ Q —,'- -, — — _ 7-Γ — "7 2 Ο Ρ 7 η ,ι, -----,. (t) χ _ »,ηηΝ ^ z.j ; .
11. On ajoure ensuite aux disques, en 1 heure, ur. anticorps anti-C.R.P., conjugué avec ce la per- 05 oxydase, porté à une dilution appropriée dans une scluuion de Na Cl 0,15 molaire tamponnée au phosphate, pH = 7,2, contenant 1% d * albumine de boeuf et 2, 5 % de TwE-EN .
12. Apres 5 opérations de lavage au moyen de 3 ir.i 10 de tampon de lavage (solution de NaCl 0,15 molaire rançonnée au chosbhste, cH = 7,2, 0,5% de ^ _1_-._____ h--1 j, on agou^e ttw ncrc-titres te suDstra>- (10 mg d * orthcphénylènedianir.e, 10 ml de tampon au citrate et au phosphate, pH = 6,0,- C,1N et 10 15 microlitres de peroxyde d’hydrooène â 30%) et on incube pendant 30 minutes a 22 degrés Celsius en l'absence de lumière, 13. On arrête la réaction gu substrat au moyen de 1 ml d1 HCl IN.
20 14. On mesure la densité ottirue des lieu! des susmentionnés à 492 nn. A\ec la densité optique cas étalons, or. établit une courbe d'étalonnage sur laquelle on peut lire la concentration en C.R.F. des éehanriilons de sérum.
- w ----
Claims (9)
1. Imrnunosorbant utilisable dans les déterminations immuno logique s , caracmêrisê en ce qu'il est è base d'une matrice poreuse gu se trouve amené d'une maniéré C5 non covalente un polymère organique ou inorganique, hydrophile ou hydrophobe, insoluble dans l'eau, auquel sont associés car ccvê.ler.ce des a:.rimènes et/ou des anticorps en des quantités hier, dscemr.ées et, s'il s'agit de divers antigènes en-ou anriiorrs, en des propor-1Q tions bien déterminées enmre_·
2. Immunosorbann selon la revendication 1 caractérisé en ce que la porosité de matrice est comprise entre 20 et 80% en volume.
3. Immunosorbent selon la revendication 1 ou 2 15 caractérisé en ce que les antigènes ou les anticorps sont couplés par covalence à un polymère insoluble dans 1 ' eau qui avait déjà été préalablement incorporé â la îTi&rrice G6 r>cis6 ·
4. Immunosorbent selon la revendication 1 ou 2
20 C δ. I* crC TL θ ΙΓ i S θ δΠ 06- 006 1.6S δΓ.οόο^ΠΘΕ Str/OU 06S αΠ’ΟΧΟΟΓ'ΤΟβ sont couplés à un polymère insoluble dans l'eau qui est par la suite incorporé dans la matrice de base. 5 c ΧπΐιΓι'ΰΠΟΒΟΓΟδΓίτ. selon ic. osvenciccitLion 4 οδζτδο— ΟΘ-Γ036 6Γ 0er Ό06 °c * ngn 1 r CH.nc ' *6^0 25 auxquels divers antigènes et/ou anticorps ont été sêpa- r - i- î· e , C-^UI^L.9c - mr··»θ’*- Xj**^^r>*" o*“1 c %** n vendications 2 a c oaracrérrse er: ce eue les orsératrons 4T € 12 vencications I à 7 caractérisé en ce que la matière en-dIovss corne poivrière insoluble cens l'eau esc. la cellulose, le Oolvacrylantiâe, le silicagel, un latex, le sé-pnarose, ou 11 agarcse'cv .
5. Immuncsorbar.t selon l'une quelconque ces re vendications là“'caractérisé en ce que la matrice poreuse est en oclv-st.raf lucrétnvlène .
10. Procédé pour la préparation d’un immunosor- 10 ractêrisé en ce qu'il comporte les étapes suivantes : — on mélange ensemble le polymère poreux insoluble, activé, non activé ou couple par 1’antigène ou anticorps avec la matrice poreuse de base à l'état pulvérulent pour formier un mélange sec, 15. on soumet ce mélange sec à un traitement d’aggloméra tion pour former des agglomérats, - or. soumet les agglomérats formés à un traitement de broyage pour former des agglomérats broyés, — ou presse ensemble les agglomérats broyés pour former 20 un comprimé et - on soumet le comprimé â ces laminages jusqu'à obtention d’un film ou d5 une feuille.
11. Procédé selon la revendication 10 caractérisé en ce que ce film, selon l'invention est procuit de na- 25 nière pratiquement continue pour être ensuite découpée pc.IT tè3’JS ΓΓ;θνθΠ.£ cLppÜTGpZ".-.* ^ r P*" i/·' i O? *“ 0 “ 'i**' ' ."i»“ * c E, _ »·· ~ w l «. ti - ^ r ^ w „ π /" n?· ^ 1 ^ ^ jz, — -t * __ ^ cperatacr. : e mélangé spécifié cens la premiers étape 13 * ci-fessus, une compcsi t ior. constituée de tclym.eres rc— reus insolubles, de nature identique ou différentes, comportant des quantités connues de composés biologiques et cens un rapport connu ae ces polymeres ainsi cnarges.
14. Procédé selon la revendication 13 caractérisé en ce eue lesdit.es polymères poreux insolubles sont de nature chimiques différents, notamment hvdroohobes et nydrothvles afin -de discoser de technirues d’activation différence .1 B
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