LU86337A1 - Recipients de cultures cellulaires eucaryotes et procede de revetement de surface plastique par vaporisation metallique,en vue de la realisation de cultures cellulaires eucaryotes in vitro - Google Patents
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Description
*
RÉCIPIENTS DE CULTURES CELLULAIRES EUCARYOTES ET PROCÉDÉ DE REVÊTEMENT DE SURFACE PLASTIQUE PAR VAPORISATION MÉTALLIQUE, EN VUE DE IA RÉALISATION DE CULTURES CELLULAIRES EUCARYOTES IN VITRO
05 La présente invention vise essentiellement à l'a mélioration des propriétés de surfaces habituellement utilisées pour les cultures in vitro de cellules eucaryotes (par opposition aux cultures de cellules proca-ryotes, telles les bactéries).
10 L'ancrage et la croissance des cellules eucaryo tes normales nécessitent un support doté de propriétés particulières, qui ne sont d'ailleurs pas exactement définies. La mouillabilité et les charges négatives du support paraissent des caractéristiques importantes pour 15 le succès de ces cultures. Différents matériaux peuvent se prêter aux cultures de cellules eucaryotes, tels le verre (normal et borosilicate), les plastiques (cellophane, perspex, ... et surtout polystyrène), les plaques métalliques (titane dans des appareillages industriels) 20 (cfr PAUL J., Cell and Tissue Culture, Churchill Livingstone, Edinburgh & New York, 1975,· JACOBY W.B. & PASTAN I.H. Eds.,' Cell culture, In "Methods in Enzymology", vol. 58, Academie Press, New York, 1979).
Avec le développement de la technologie des cul-25 tures cellulaires, les supports les plus utilisés actuellement, parce que les plus faciles d'emploi, sont des récipients en polystyrène, pré-stêrilisés (par irradiation ou par des vapeurs toxiques) et à usage unique. Pour les cellules eucaryotes dépendantes de l'ancrage, 30 plusieurs fournisseurs proposent des récipients dont la surface est traitée en vue de permettre une croissance "optimale" des cellules.
Ces récipients ne donnent cependant pas totalement satisfaction aux utilisateurs et l'invention a pour 35 objet d'apporter une amélioration aux récipients existants étant entendu qu'il convient de maintenir les possibilités d'observation, notamment d'observation au mi- 2 croscope, liées à l'utilisation des récipients habituels de culture.
La solution est apportée selon 1'invention par le * fait que l'on procède au recouvrement par vaporisation 05 d'une couche métallique mince de préférence de titane sur les supports de polystyrène. En effet, le dépôt d'une couche métallique mince respecte la transparence des supports de culture, et l’application des techniques de microscopie.
10 L'invention porte donc sur un récipient permet tant dans de bonnes conditions des cultures cellulaires eucaryotes tout en maintenant la transparence des supports de culture caractérisé en ce que ledit récipient comporte au moins partiellement un revêtement d'une cou-15 ehe métallique mince, de préférence de titane.
Sous un autre aspect, l'invention porte sur un procédé visant à améliorer les supports de cultures cellulaires eucaryotes en maintenant la transparence de ceux-ci caractérisé en ce qu'on y applique une couche 20 métallique par une technique de vaporisation.
Ledit support peut être de nature quelconque compatible avéc l'usage envisagé, c'est-à-dire qu'il doit pouvoir être facilement stérilisé, d'un prix raisonnable, facilement thermoformable, et bien entendu transpa-25 rent. Ce support est de préférence réalisé en polymère qui est constitué essentiellement de polystyrène, le cas échéant avec des quantités mineures qu'un autre co-monomère et les additifs habituels, bien connus dans la technique.
30 Les différentes analyses qualitatives et quanti tatives ont révélé des qualités nettement accrues de ce recouvrement métallique, par rapport au support polystyrène généralement employé. Ces qualités s'appliquent à différents types cellulaires et notamment les cellules 35 ostéogéniques.
Les procédés de métallisation sont en eux-mêmes largement connus et les techniques courantes peuvent « 3 être mises en oeuvre.
À titre d'illustration, l'exemple qui suit décrit une technique ayant donné largement satisfaction.
05 EXEMPLE 1 ï EXEMPLE DE MISE EN OEUVRE DU PROCÉDÉ A_1 MATÉRIEL UTILISÉ # Fil de titane : largeur : 1 mm 10 épaisseur : 0,2 mm longueur s 200 mm poids : environ 0,06 g # Support de culture : boîtes de pétri FALCON, ref.
3001, diamètre 35 mm (Falcon, Div. Becton-Dickinson, 15 P.O. Box 233, Cockeysville, MD 20130, USA).
# Evaporateur : EDWARDS 306 COATER, muni d'une platine planétaire et d'un filament hélicoïdal de tungstène. (Edwards High Vacuum, Grand Island Blvd., Grand Island, NY 14072, USA).
20
* TECHNIQUE DE MÉTALLISATION
Les pompes à rotation et à diffusion de l'évapo-rateur Edwards sont préchauffées. Le fil de titane est replié sur lui-même et introduit dans le filament de 25 tungstène, de telle sorte qu'il ne dépasse pas de la partie hélicoïdale de ce filament. Ce dernier est ensuite replacé aux bornes de l'électrode adéquate.
Les boîtes de pétri sont déposées sur la platine rotative de 1'êvaporateur, située à une distance de 30 30 cm par rapport à l'électrode. Les cloches sont replacées sur l'appareil. La pompe rotative est enclenchée pour obtenir un vide primaire de 10-1-10“^ Torr. La pompe à diffusion est ensuite mise en action, ce qui permet l'obtention d'un vide secondaire de 10"^-10"6 Torr. À 35 cette pression, la platine est mise en rotation (l'électrode étant disposée latéralement dans l'enceinte, la rotation des boîtes autour de l'axe central et sur 4 » $ elles-mêmes permet un dépôt régulier et homogène du titane) .
Le circuit de basse tension est connecté. La ten-* sion est progressivement augmentée (de 1 à 4, en unités 05 arbitraires de l'appareillage), jusqu'à incandescence du filament, puis très lentement jusqu'à évaporation du titane. Dans le cas du titane, cette évaporation se réalise aux environs de 1550°C.
Les différents circuits sont coupés, l'air admis 10 dans l'enceinte permet l'ouverture de celle-ci et la récupération des boîtes coatées de titane. L'épaisseur de la couche de titane déposée dans ces conditions peut être estimée à environ 15-20 nm, par comparaison avec une mesure réalisée dans un évaporateur BALZERS UNION, 15 muni d'un quartz piézoélectrique.
TESTS PHYSIQUES ET BIOLOGIQUES
ANALYSE DU SPECTRE DE DISPERSION DES RAYONS X
20 Cette analyse fut réalisée dans un microscope électronique à balayage JEOL JSM 35, équipé d'un spec-tromètre à dispersion de l'énergie des rayons X (KEVEX), permettant l'analyse des éléments d'une surface. La sensibilité descend jusqu'au sodium (n. at. 11). La hauteur 25 des pics du graphe est proportionnelle aux concentrations relatives.
La figure 1 correspond â un fragment de titane avant évaporation (10 KeV, 10.000 coups). On y voit les deux pics caractéristiques du titane.
30 La figure 2 correspond à un fond de boîte de pé tri FALCON Vierge (10 KeV, 20.000 coups). Les éléments détectés sont signalés par des flèches. Les pics proéminents à la droite du graphe viennent du support de laiton sur lequel la boîte fut déposée pour l'analyse.
35 La figure 3 correspond à un fond de boîte de pé tri FALCON recouvert de titane dans les conditions décrites en 2.2 (10 KeV, 20.000 coups). On détecte nette- 5 äi ment la présence des deux pics du titane.
TRANSPARENCE AVANT ET APRES RECOUVREMENT DE TITANE
' Un des avantages opératoires du procédé consiste 05 à laisser possible l'observation directe des cellules cultivées au microscope photonique à contraste de phase . La transparence de la préparation doit donc être tenue en compte.
La mesure fut réalisée au microspectrophotomètre 10 REICHERT. Les boîtes de culture vierges ont servi à l'étalonnage de l'appareil pour une transmittance de 100%. Les boîtes recouvertes de titane montrent une transmittance de 50 à 70%.
TESTS BIOLOGIQUES 15 -----------------
La prolifération et l'adhésion des ostéoblastes et des cellules mésenchymateuses ont été quantifiées sur les supports plastiques vierges et recouverts de titane. En outre, les cinétiques de croissance ont été com-20 parées avec celle obtenue après l'adjonction d'une matrice organique (collagène) sur le polystyrène. S'il apparaît, dans tous les cas, la présence de titane produit des résultats supérieurs.
Qualitativement, le support polystyrène-titane a 25 été aussi testé comparativement sur un autre modèle de culture : la néoformation in vitro des îlots de Langerhans, et sa supériorité est également apparue.
Claims (4)
1. Récipient permettant dans de bonnes conditions des cultures cellulaires eucaryotes tout en maintenant la transparence des supports de culture, caractérisé en 05 ce que ledit récipient comporte au moins partiellement un revêtement d'une couche métallique mince.
2. Récipient selon la revendication 1, caractérisé en ce que le revêtement sous forme d'une couche métallique mince est constituée de titane. 10
3. Récipient selon la revendication 1 ou 2, ca ractérisé en ce que ledit support est constitué essentiellement de polystyrène, les cas échéant avec des quantités mineures qu'un autre co-monomère et les additifs habituels, bien conmis dans la technique.
4. Procédé permettant d'améliorer les supports de culture cellulaires eucaryotes en maintenant la transparence de ceux-ci, caractérisé en ce qu'on -y applique une couche métallique par une technique de vaporisation. i
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1986
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