LU86655A1 - Verfahren zur identifizierung von metastasen - Google Patents

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Description

f,
* BL-3966/BM
' Q A fi Q JJ GRAND-DUCHÉ DE LUXEMBOURG
Brevet N° * .
Monsieur le Ministre du 10 novembre 1986 de l’Économie et des Classes Moyennes ' „ , , Service de la Propriété Intellectuelle
___ LUXEMBOURG
Demande de Brevet d’invention 7 ---------------------------------------------------------( î) I. Requête
La soc. dite PROGEN BIQTEÇI1NIK ...GmbH., ..Im Neuenheimer Feld,519,........................... ( 2) D -. 6900...... Heidelberg____________________________________________________________________________________________________________________________________ représentée par E.Meners & E. T.Freulincrer, Incr. conseils en nropr.ind. , ( 3) 46 rue du „..Cimetière,......Luxembourg,._agissant en qualité de mandataires______ dépose(nt) ce ...............dix,, noverùxre-Miltneuf.-.cent -quatre tvingt.. six__( 4) à 20°°________heures, au Ministère de l’Économie et des Classes Moyennes, à Luxembourg: 1. la présente requête pour l’obtention d’un brevet d’invention concernant: "Verfahren zur .Identifizierung..„von,-Metastasen!___ ( 5) 2. la description en langue__________allemande..................................de l’invention en trois exemplaires; 3. ..........................................................planches de dessin, en trois exemplaires; 4. la quittance des taxes versées au Bureau de l’Enregistrement à Luxembourg, le__10 novembre 1986 ; 5. la délégation de pouvoir, datée de.................................Heidelberg.____ le_05 novembre..1986........... ; 6. le document d’ayant cause (autorisation); déclare(nt) en assumant la responsabilité de cette déclaration, que l’(es) inventeurs) est (sont): ( 6) ! 2-.-...-.....Dr......Gerda.....BRUDER,.......Bergheimer.....Strasse....llOA.,._____EL_=-j69.Q.Q..Heidelber.g.________________________ 2.......T..prof-......Dr ..Werner.-Wilhelm .ER2iNKE.r.-...Landfx.iedstrasse.-6-r-..H-=r-.-.6.90.0...Heidelberg revendique(nt) pour la susdite demande de brevet la priorité d’une (des) demande(s) de (7) -...................................=.-.......................................................................................—.................déposée(s) en (8).............-_________________________________________________ le (9).............................=_--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- sous le N° (10) ________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ au nom de (11) .............______________________________________________________________________________________________________________________ élit( élisent) domicile pour lui (elle) et, si désigné, pour son mandataire, à Luxembourg__' .
46 rue du Cimetière f Luxembourg___ ______________ Q2) solIiciteQnt) la délivrance d’un brevet d’invention pour l’objet décrit et représenté dans les annexes susmentionnées, avec ajournement de cette délivrance à____________________________________________dix-hu.it_________;______________________________________________mois. (13)
Le mandataire« Ernest ..Meyers_____________________________________________________________________________________________________________________________________ (14) Π. Procès-verbal de Dépôt
La susdite ddnrafide de brevet d’invention a été déposée au Ministère de l’Économie et des Classes Moyennes, Service delà Propriété Intellecî«ëlj^ i^pSsjjjbourg, en date du: 10 novembre 1986
Pr. le Ministre de l'Économie et des Classes Moyennes, à 10________________heures ( j \ 3 j P·r- ^ I Le chef du service de Impropriété intellectuelle, A 68007 / / f EXPLICATIONS RELATIVES AU FOtUvflJIAIRjnÆD^OT: /1. "/ i ; ( 1 ) s'il y a lieu "Demande de certificat d’addition au brevet principal, à la demande de brevet principal No......... ^Tdu Λ.. V..(2) inscrire les nom* prénom, profession.
. adresse du demandeur, lorsque celui-ci est un particulier ou les dénomination sociale, forme juridique, adresse du siège social, traque le demandeur est une personne morale-(3) inscrire
V
BL-3966 % «*
PATENTANMELDUNG
Verfahren zur Identifizierung von Metastasen PROGEN BIOTECHNIK GmbH Im Neuenheimer Feld 519 D - 6900 Heidelberg 4 ' ' ' 1 A 57 022 30.10.86.
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VERFAHREN ZUR IDENTIFIZIERUNG VON METASTASEN
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Erkennung von Metastasen einer ersten Geuebeklasse, die in einem Dirtsgewebe einer zueiten Gewebeklasse angesiedelt sind, bei dem Inter-mediärfΠamentproteine aus dem Gesamtgewebe mit spezifischen Antikörpern identifiziert werden.
Es ist bekannt, mit spezifischen Antikörpern histodiagno-stisch Intermediärfi1amentproteine zu identifizieren. Inter-mediärfilamentproteine sind Bestandteile des Cytoskeletts und jeweils typisch für eine Gewebeklasse. Eine solche Identifizierung ermöglicht es, Intermediärfilamentproteine von Metastasen dem Ursprungsgewebe beziehungsweise dem Primärtumor zuzuordnen.
Die Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß aus dem Gesamtgeuebe ein Homogenat gebildet wird, daß auf das Homoge-nat abbauend eingeuirkt wird, bis aus wenigstens einem großen Teil der Intermediärfilamentproteine jeweils ein Fragment, welches das alpha-helikale Mittelstück enthält, freigesetzt ist, daß dann die lösliche Fraktion abgetrennt wird und, daß dann die in der löslichen Fraktion enthaltenen alpha-helikalen Mittel stücke in löslicher Phase identifiziert werden.
Intermediärfilamentproteine (IF) bestehen aus tetrameren (jeweils 2 Homo- bzw. Heterodimere) Untereinheiten mit einem alpha-helikalen Mittelstück und beidseitig am Mittelstück hängenden unterschiedlich langen Endstücken. Im alpha-helikalen Mittelstück finden sich hinreichende Charakteristika für die Zuordnung eines IF-Proteins zum Gewebe. Die Mittelstücke sind relativ stabil, so daß ein Abbau zunächst an den Endstücken angreift und das Mittelstück zunächst in- ' ' 2 A 57 022 30.10.86.
takt läßt. Die Mittel stücke allein sind hinreichend löslich.
Nach der Erfindung werden zunächst die unterschiedlichen langen Endstücke abgebaut und die Mittelstücke intakt gelassen. Diese Mittelstücke können dann in der löslichen Phase nachgewiesen werden. Dazu geeignete Antikörper können mit bekannten Verfahren gewonnen werden, weshalb das hier nicht weiter abgehandelt wird.
Aufgabe einer Ueiterbi1 düng ist es, über das Ausmaß der Me-tastasierung eine Aussage zu machen. Diese Aufgabe wird dadurch gelöst, daß von den IF-Proteinen beider Gewebetypen des Homogenats ein vorgegebener Anteil identifiziert und quantifiziert wird, und daß daraus der Anteil des Metastasengewebes am Uirtsgewebe ermittelt wird. Diese Lösung nutzt den Umstand aus, daß das immunologisch biochemische Verfahren eine quantifizierbare Aussage liefert im Segensatz zu der bekannten Histodiagnose.
Es gibt verschiedene Cytokératine (CK NR 1 - 19), deren Expressionsmuster die verschiedenen Ephithelgeweben zugeordnet sind. Deshalb wird vorzugsweise bei Cytokeratinen die Art des jeweils zugeordneten Epithelgewebes anhand der relativen Anteile der identifizierten Cytokératine bestimmt und quantif iziert. Auch für_ diese Zuordnung liegen hinreichende Charakteristika in den alpha-helikalen Mittelstücken vor.
Um sicherzustellen, daß die alpha-helikalen Mittelstücke beim Abbau nicht so weit mit zerstört werden, daß die Identifikation behindert wird, empfiehlt es sich, daß diese nur so weit abgebaut werden, bis sie zu 80 bis 100 Gewichtsprozent bei einer Temperatur von 0-40 Grad Celsius in physiologischer Kochstalzlösung löslich sind. Das geschieht durch Abstoppen der Proteaseaktivität durch geeignete Inhibitoren.
* , . 3 A 57 022 30.10.36.
* Aus dem gleichen Grunde ist es zueckmäßig, die IF-Proteine nur so weit abzubauen· daß bei mindestens 30 Geuichtsprozent das alpha-helikale nittelstück intakt bleibt.
Bevorzugt wird dieses Verfahren angeuendet auf Lymphgeuebe als Uirtsgeuebe, da sich Metastasen im allgemeinen zunächst im Lymphgeuebe ansiedeln. Die IF-Proteine dienen dann als "Marker" für das Ursprungsgeuebe, das als Fremdgeuebe, zum Beispiel als Mammageuebe, in einem Lymphknoten -nachgeuiesen uurde.
Der teilweise Abbau kann chemisch, zum Beispiel mit Säuren oder Basen erfolgen. Der teilueise Abbau kann auch physikalisch, zum Beispiel durch Erhitzung oder Bestrahlung erfolgen. Vorzugsweise erfolgt der teilueise Abbau jedoch proteolytisch, weil auf diese Ueise bei den hier in Frage stehenden Proteinen der Abbau verhältnismäßig leicht genau so zu dosieren ist, daß die Mittelstücke einerseits löslich andererseits für die Identifizierung hinreichend intakt erhalten bleiben.
Die Erfindung wird nun anhand der beigefügten Beispiele näher erläutert.
> 4 A 57 022 30.10.86.
BEISPIEL_1
Nachweis von Metastasen in Lymphgewebe a) Es wird zunächst das Feuchtgewicht des Lymphknotengeuebes ermittelt. Das Gewebe uird im dreifachen Volumen - bezogen auf das Feuchtgewicht - einer phosphatgepufferten Kochsalzlösung (10 mM (millimolar) Natriumphosphat pH 7,4, 150 mM Natriumchlorid) mit Hilfe eines Messerhomogenisators bis zur breiartigen Konsistenz zerkleinert (es wird der Einsatz eines Polytron-Homogenisators der Firma Kinematica, Luzern / Schuei2 empfohlen). Dem Geuebebrei wird Chymotrypsin im Verhältnis 1:1000 (berechnet auf das Feuchtgewicht des Gewebes) zugesetzt. Es folgt ein Inkubationsschritt bei 30°C (Grad Celsius) (vorzugsweise im Thermoblock, eventuell im Llasserbad), der nach 60 Minuten abgestoppt wird. Das Abstoppen der Enzymaktivität geschieht durch Zusatz von 5 mM NCDC (2-Nitro-4-carboxyphenyl -N-N-diphenylcarbamat). Anschließend wird das Homcgenat 30 Minuten bei 104 g (g = Gravitationskonstante) zentrifugiert. Unter diesen Bedingungen werden 80 bis 95 Gewichtsprozent der alpha-helikalen Mittelstücke in noch identifizierbarem Zustand aus den IF-Proteinen freigesetzt.
b) Ermittlung des Vimentingehaltes und Bestimmung des Vimen-t ingehaltes
Im zentrifugierten Überstand wird Vimentin immunologisch durch einen Sandwich-ELISA bestimmt. Hierzu dient ein erster Antikörper GP-8. der sogenannte Fänger-Antikörper , der gegen ein erstes Epitop des al pha-helikalen Mi11e1 stückes gerichtet ist, und ein zueiter monoklonaler Antikörper V-100, der sogenannte Detektor-Antikörper, der gegen ein zweites Epitop des alpha-helikalen Mi11el stückes, das vom ersten Epitop un- » abhängig und verschieden ist, gerichtet ist. Der Antikörper V-100 ist mit Peroxidase gekoppelt und wird bei dern Bindung » > * 5 A 57 022 30.10.86.
t an das al pha-helikal e Mittelstück über die Enzymaktivität der Peroxidase nachgewiesen. Zur Standardisierung wird bekanntes, gereinigtes alpha-helikales Vimentin-Fragment dem gleichen Sandwich-ELISA mit den gleichen Antikörpern unterworfen. Der so erhaltene Vimentinwert dient dann als Bezugsgröße für die quantitative Auswertung der Meßergebnisse.
c) Ermittlung der Cytokératine und Bestimmung der Cytokera-t ingehalte
Im zentrifugierten Überstand werden die vorhandenen Cytokératine immunologisch durch einen Sandwich-ELISA bestimmt* Hierzu dient ein erster monoklonaler Antikörper PAN-CI, der sogenannte Fängei—Antikörper, der gegen ein erstes Epitop aller Cytokératine gerichtet ist. Es sind 19 monoklonale Antikörper C-401 bis C-419 vorgesehen, sogenannte Detektorantikörper, die einzeln spezifisch den einzelnen 19 bekannten Cytokeratinen zugeordnet sind.Die Detektorantikörper sind enzymatisch markiert wie die Detektorantikörper 0 -100. Der Nachweis und Standardisierung erfolgt entsprechend wie unter b) jedoch immer bezogen auf das spezielle der 19 möglichen Cytokératine, so daß man den relativen Anteil der einzelnen Cytokératine berechnen kann.
Uenn nur die Cytokératine Nr* 5, Nr. 7, Nr. 8, Nr. 14, Nr.
17 und Nr. 19 mit hinreichendem Anteil und gegebenenfalls zusätzlich die Cytokératine Nr. 15 und Nr. 18 nachgewiesen werden, dann läßt das auf eine Metastase eines Mamma-Tumors schließen.
6 A 57 022 30.10.86.
» m * BEISPIEL 2
Genauere Identifizierung einer Metastase für den Fall einer nach Beispiel 1 gefundenen Mammametastase
Im Falle, daß aufgrund der Untersuchung nach Beispiel 1 b) und c) im axillären Lymphknoten Mammametastasen nachgewiesen uurden. uird der Rezeptor-Gehalt für Östrogen und Progesteron im Homogenat aus Absatz a) Beispiel 1 bestimmt. Diese Rezeptor-Gehaltsbestimmung uird auf den nach Absatz c) Beispiel 1 gewonnen Gehalt an al pha-hel ikal em Cytokeratiri Fragmenten bezogen. Die gewonnene Bezugsgröße ist ein Maß für den Anteil derjenigen Metastasenzellen, die mit dem betreffenden Hormonrezeptor ausgestattet sind. Eine solche Bezugsgröße konnte bislang mit bekannten Mitteln nicht gewonnen werden; sie ist ein Maß für die zweckmäßig einzusetzende Chemotherapie.
BEISPIEL 3 und 4
Nachweis von Metastasen in Beckenkammbiopsien und Sternumpunktaten
Uie Beispiel 1 mit dem einzigen Unterschied, daß anstelle des Lymphknotengeuebes im Beispiel 3 Beckenkammbiopsien und im Beispiel 4 Sternumpunktate eingesetzt wird.
BEISPIEL 5
Gewinnung der Antikörper gegen Vimentin
Vimentin wird aus Augenlinsen von Rindern gereinigt, als Filament rekonstituiert, mit Chymotrypsin gespalten und das alpha-helikale Mittelstück chromatographisch abgetrennt und eingesetzt zur Herstellung der monoklonalen Antikörper mit Hilfe der Hybridomtechnik. Die Spezifität der Antikörper wird mit Hilfe der gereinigten alpha-helikalen Fragmente # . . 7 A 57 022 30.10.80.
festgestellt und Kreuzreaktionen mit den übrigen IF-Proteinen durch Immunreaktionen in nativem (beziehungsweise renaturiertem) und denaturiertem Zustand dieser Proteine ausgeschlossen.
BEISPIEL 6
Gewinnung der Antikörper gegen Cytokératine
Cytokeratin wird aus dem Cytoskelett von MCF-7 Kulturzellen (die Zellinie leitet sich von einem humanen Hamma-Carcinom ab) gereinigt, die Cytokératine Nr. 5-7 und 14 - 17 werden aus dem Cytoskelett von laktierendem Kuheuter gereinigt.
Nach Rekonstitution je eines sauren (Nr. 1-8) und eines basischen (Nr. 9 - 19 ) Cytokeratin werden nach Protease-Behandlung gereinigte Fragmente zur Immunisierung und Gewinnung von monoklonalen Antikörpern eingesetzt wie für Vimen-tin beschrieben.
BEISPIEL 7-11
Uie Beispiel 1-4, wobei jedoch statt den einzelnen Cytoke-ratinen einzeln zugeordnete Fänger-Antikörper solche Fängei— Antikörper eingesetzt werden, die in Kombination die einzelnen Cytokératine erkennen. Zum Beispiel die Kombination C-501 und C-504 erkennt das Cytokeratin Nr. X, die Kombination C-501 und C-503 erkennt das Cytokeratin (X + 1).

Claims (10)

1. Verfahren zur Erkennung von Metastasen einer ersten Gewebeklasse, die in einem Uirtsgewebe einer zweiten Gewebe-klasse angesiedelt sind, bei dem Intermediärfilamentproteine aus dem Gesamtgeuebe mit spezifischen Antikörpern identifiziert werden, dadurch gekennzeichnet, daß aus dem Gesamtgewebe ein Homogenat gebildet wird, daß auf das Homogenat abbauend eingewirkt wird, bis aus wenigstens einem großen Teil der Intermediärfilamentproteine jeweils ein Fragment, welches das alpha-helikale Mittelstück enthält, freigesetzt ist. daß dann die lösliche Fraktion aufgetrennt wird und, daß dann die in der löslichen Fraktion enthaltenen alpha-helikalen Mittelstücke in löslicher Phase immunologisch identifiziert werden.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß von den Intermediärfilamentproteinen beider Gewebetypen des Homogenats ein vorgegebener Anteil identifiziert und quantifiziert wird, und daß daraus der Anteil des Metastasengewebes am Uirtsgewebe ermittelt wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß bei Cytokeratin die Art des jeweils zugeordneten Epithelgewebes anhand der relativen Anteile der identifizierten Cytokératine (NR 1 - 19) bestimmt und quantifiziert wird und daß Cvtokeratinantei1 relativ zum Vimentinanteil bestimmt wird. A « » ♦» <. g A 57 022 30.10.86.
4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Intermediärfi1amentproteine nur so weit abgebaut werden, bis sie zu 60 bis 100 Gewichtsprozent bei einer Temperatur von 0-40 Grad Celsius in Uassei— beziehungsweise Pufferlösungen löslich sind.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Intermediärfilamentproteine nur so weit abgebaut werden, daß bei einer für die immunologische Bestimmung ausreichenden Menge der Moleküle das alpha-helikale Mittelstück intakt bleibt.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Uirtsgewebe Lymphgewebe ist.
7. Verfahren nach Anspruch 5 und 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Metastasengewebe ein anderes Organ ist.
8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der teilweise Abbau der Intermediärfi1amentproteine proteolytisch erfolgt._
9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der proteolytische Abbau in kontrol1ierter Ueise gestoppt wird.
10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß gleichzeitig der Anteil zweier oder mehrerer IF-Proteine bestimmt wird.
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