LU87207A1 - Vaccin derive de bacteries du genre yersinia procede pour sa preparation et applications - Google Patents
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Description
VACCIN DERIVE DE BACTERIES DU GENRE YERSINIA, PROCEDE POUR SA PREPARATION ET APPLICATIONS.
Arrière-plan technologique
Les bactéries du genre Yersinia sont des bacté-5 ries à Gram négatif appartenant à la famille des entérobactéries. Trois espèces sont pathogènes pour l'homme: Y. pestis est l'agent de la pesté; Y. pseudotuberculosis est l'agent de la pseudotuberculose et Y. enterocolitica est un agent de gastro-entérite. Y. enterocolitica est un 10 agent entéropathogène relativement fréquent. Sa distribution est cosmopolite et il comprend des souches ubiquitaires et des souches pathogènes pour les hommes et les animaux. De par son hétérogénéité phénotypique, l'espèce est subdivisée en sérogroupes sur base des antigènes somati-15 ques (Ag 0) lipopolysaccharidiques. Seuls quelques sérogroupes dont 0:3, 0:5,27, 0:8 et 0:9, se révèlent pathogènes pour les hommes et les animaux. Les souches du sérogroupe 0:8, isolées exclusivement en Amérique du Nord, apparaissent plus virulentes que les autres.
20 Le pouvoir pathogène de Y, enterocolitica est de type invasif. Après inoculation orale, les bactéries adhèrent à la surface de l'épithélium intestinal. Par un phénomène d'endocytose, elles pénètrent dans les entérocytes et traversent le cytoplasme, enfermées dans des vacuoles. 25 La présence de Y. enterocolitica dans la lamina propria y provoque une réaction inflammatoire. Les bactéries capables de neutraliser le système immunitaire de l'hôte se multiplient principalement dans les nodules lymphoïdes mésentériques.
30 Les infections à Y. enterocolitica entraînent un syndrome entérique consistant en des douleurs abdominales parfois accompagnées de diarrhée, d'adénite mésentérique ou d'iléite terminale aiguë.
Le pouvoir pathogène de Y. enterocolitica est 35 proche de celui de Y. pseudotuberculosis, responsable de la pseudotuberculose, et rappelle fortement celui de Y. pestis, agent de la peste.En effet, on observe dans tous les cas une capacité de franchir la barrière épithéliale 2 et de provoquer une adénite. La virulence relativement basse de Y. enterocolitica a conduit de nombreux chercheurs à choisir cette bactérie comme modèle pour l'étude du pouvoir invasif.
5 Le pouvoir invasif de Y. enterocolitica est as socié à la présence d'un plasmide (pYVe, Virulence-associa-ted plasmid of Y. enterocolitica) d'environ 70 kilobases (kb). Des hybridations ADN-ADN montrent une homologie de séquence de 90% entre les plasmides des souches des séro-Ί0 groupes 0:3, 0:5,27 et 0:9, et de 55% entre ceux-ci et le plasmide de Y, enterocolitica du sérogroupe 0:8. Des plasmides structurellement et phénotypiquement proches de ces derniers sont présents chez Y. pseudotuberculosis et Y. pestis. Ils sont fortement apparentés entre eux et sont 15 homologues à 55% avec le plasmide de Y. enterocolitica 0:8.
Les fonctions permettant la propagation des plasmides (fonctions de réplication) et les fonctions déterminant sa capacité de coexistence avec d'autres plas-20 mides dans la même bactérie (fonction d'incompatibilité) ont été situées sur les plasmides des Yersiniae.
Le plasmide de virulence de Y, enterocolitica confère à la bactérie plusieurs propriétés.
Les souches virulentes de Y. enterocolitica 25 exigent des ions calcium pour leur multiplication à 37°C. Ce phénotype de dépendance vis-à-vis du calcium (Ca D) se retrouve chez Y. pseudotuberculosis et Y. pestis. La région plasmidique qui détermine cette propriété s'étend sur environ 20 kb et est particulièrement bien conservée parmi 30 les 3 espèces de Yersinia (figure 1). Les mécanismes de la dépendance en calcium ne sont pas encore expliqués. Le fait que les plasmides des trois espèces de Yersinia déterminent une exigence en calcium pour la croissance à 37°C et que la région du plasmide conférant ce phénotype 35 est hautement conservée suggère qu'une forte pression de sélection joue en faveur de ce phénotype.
Le plasmide de Y. enterocolitica code pour au moins une vingtaine de polypeptides dont une protéine 3 cytoplasmique, l'antigène V, et des protéines de membrane externe qui ont été désignées par les initiales YOP (pour Yersinia Outer membrane Protein) ou POMP (pour Plasmid encoded Outer Membrane Protein) par les auteurs qui les 5 ont étudiées chez Y. pseudotuberculosis. Chez Y. enteroco-litica, sept YOP (ou POMP) ont été détectés qui sont identifiés par le sigle YOP (ou POMP) suivi du poids moléculaire en milliers de daltons. Pour deux de ces protéines cependant, les numéros introduits par d'autres auteurs ont 10 été gardés parce qu’elles sont relativement bien caractérisées ou que leur gène de structure a été localisé. Il s'agit de la protéine Y0P1 (produit du gène yopA) qui forme des appendices externes, et de la protéine YOP4, produit du gène yopD qui a été localisé sur le plasmide de Y^ 15 enterocolitica et de Y. pseudotuberculosis. Chez Y. entero-colitica, Y0P1 a un PM de 2 40 kilodaltons (Kda) tandis qu'il est de 150 Kda chez Y, pseudotuberculosis. Le PM de YOP4 est de 37,5 kda chez Y. enterocolitica et de 36 kda chez Y.pseudotuberculosis. Les gènes de structure d'autres 2 0 YOPs de Y. enterocolitica ont été situés sur le plasmide pYVe.
Des anticorps dirigés contre les YOPs sont présents dans le sérum de patients atteints de yersiniose. Les protéines de Y. enterocolitica sont immunologiquement 2 5 apparentées aux protéines de membrane externe détectées chez Y. pseudotuberculosis et Y. pestis.
L'expression des protéines de membrane externe de Y. enterocolitica dépend de la température et de la concentration en calcium dans le milieu de culture. Ces 30 protéines apparaissent uniquement après incubation des bactéries à 37°C dans un milieu carencé en calcium.
L'invasivité de Y. enterocolitica est un phénomène multiétapes. Plusieurs d'entre elles dont l'adhérence aux cellules épithéliales et la résistance à la phagocyto-35 se par les polymorphonucléaires semblent nécessiter la présence des protéines de membrane externe.
Le phénomène de dépendance vis-à-vis du calcium est associé au pouvoir pathogène de Y. enterocolitica.
4
Dans les modèles animaux, les souches indépendantes vis-à-vis du calcium (Ca I) se révèlent avirulentes et ne produisent plus que la protéine Y0P1, L'analyse de mutants d'insertion dans le plas-mide de Y. enterocolitica 0;9 a permis de définir trois ^ zones de transcription (virA, B et C) dans la région qui code pour le phénomène de Ca D (figure 1). La température contrôle leur expression au niveau de la transcription. Au contraire, les ions calcium n'ont que peu d'influence sur celle-ci. Ces expériences montrent également que 1'exprès- 1 0 sion de la plupart des'protéines de membrane externe codées par le plasmide est contrôlée par les unités de transcription virA, B et C.
Des résultats obtenus chez Y. pseudotuberculosis et Y· pestis montrent que les régions déterminant le phé-
1 S N
notype Ca D chez les trois espèces sont structurellement et fonctionnellement très proches. Les gènes de structure des YOPs sont situés sur les plasmides pYV de Y. pseudotuberculosis et de Y. pestis en dehors de la région gouvernant le phénotype Ca D. Il apparaît donc que la région Ca 2 0 D contient les gènes de contrôle d'un régulon, induits par la température et contrôlant l'expression des protéines de membrane externe.
Il a été indiqué que les protéines YOPs apparaissent dans la membrane externe de Y. enterocolitica in-2 R
cubée à 37°C en absence de calcium. On a également montré que, dans les mêmes conditions Y. enterocolitica relâchent un certain nombre de protéines dans le surnageant des cultures. On a également montré que les protéines relâchées comprennent les protéines YOPs et au moins une autre pro-^ téine qui n'avait pas été détectée dans la membrane externe.
La forme sous laquelle les protéines sont présentes dans le surnageant de culture est inconnue. Il apparaît cependant que ces protéines ne sont pas relâchées sous une forme soluble mais sont assemblées sous forme de vésicules ou d'agrégats. Curieusement, les YOPs apparaissent dans le surnageant de culture avant d'apparaître dans 5 la membrane externe. Il est donc clair que l'exportation de ces protéines implique l'existence d'un système particulier de sécrétion. Ce système pourrait être codé par la région déterminant le phénotype de Ca D.
5 Objet de l'invention
Les bactéries du genre Yersinia et en particulier de l'espèce Y. enterocolitica présentent une série de propriétés intéressantes, en particulier celles de (1) traverser la barrière intestinale sans léser la mu-10 queuse et activer le système immunitaire; (2 ) exporter en grande quantité des protéines codées par le plasmide pYV dans la membrane externe et même le milieu de culture; (3) posséder un système de régulation qui permet la pro-15 duction de ces protéines in vivo, notamment lors du contact avec le système immunitaire.
L'invention se propose de profiter de ces propriétés pour la construction d'un système immunogène. L'objectif visé est en particulier d'utiliser Y. enterocoliti-20 ca comme vecteur de propagation d'antigènes protecteurs en soumettant ces derniers à la régulation et à l'exportation caractéristiques des protéines codées par le plasmide de virulence de cette bactérie. Selon l'invention ceci peut se réaliser par l'insertion des gènes des antigènes pro-2 5 tecteurs dans le plasmide de Yersinia et en particulier de Y. enterocolitica. Du point de vue conceptuel, ce projet s'inscrit dans la lignée des vaccins basés sur le système de la vaccine.
Eléments caractéristiques de l'invention 30 L'invention concerne plus particulièrement un vaccin comportant des bactéries du genre Yersinia dans lesquelles au moins un des gènes plasmidiques codant pour une protéine de membrane externe est remplacé par au moins un gène bactérien ou viral codant pour une protéine ou un épi-35 tope contre lequel on souhaite vacciner.
On utilise plus particulièrement les Yersinia enterocolitica ou Yersinia pseudotuberculosis.
Dans la suite, lorsque la description se réfère 6 à l'utilisation de Yersinia enterocolitica, on peut également y substituer les Yersinia pseudotuberculosis.
Pour réaliser un tel vaccin, il est généralement nécessaire d'atténuer la virulence de Y. enterocolitica et 5 d'insérer les gènes étrangers dans le plasmide. Cette atténuation peut être obtenue par toute technique classique d ' atténuation.
Cependant on observe que généralement le remplacement de l'une ou l'autre protéine codée par le plasmide, 10 par un immunogène entraîne déjà une réduction notable de la virulence de Y. enterocolitica. Ceci constitue donc un avantage complémentaire important obtenu par la technique de l'invention.
A titre d'exemples, des vaccins pouvant être 15 produits de cette manière, on peut citer ceux obtenus avec les gènes de la sous-unité B de la toxine CT de Vibrio cholerae et de l'entérotoxine LT d'E.coli, de l'antigène de surface du virus de l'hépatite B (HBsAg) et de la protéine de surface CS de Plasmodium falciparum. Cette énumé-20 ration n'est bien entendu nullement limitative et d'autres possibilités tels que les gènes ayant déjà été étudiés pour la vaccine peuvent être envisagés tels que ceux de HBsAg, de 1 'hémagglutinine du virus de l'influenza et de la glycoprotéine D du virus de l'herpès simplex qui ont 2 5 été intégrés dans le génome du virus de la vaccine. Ces gènes sont exprimés par les cellules infectées in vitro et leurs produits sont intégrés à la membrane cellulaire ou sécrétés dans le milieu environnant. Les tests sur l'animal de laboratoire (lapin, hamster, souris) montrent l'ap-30 parition d'un taux élevé d'anticorps et d'une protection contre la maladie. Le gène d'enveloppe du virus du SIDA a également été intégré.dans le génome de la vaccine. Des souris infectées avec ces virus recombinants produisent des anticorps reconnaissant spécifiquement les protéines 35 d'enveloppe du virus du SIDA.
Les techniques opératoires à mettre en oeuvre sont de manière générale, celles du génie biologique bien connues de l'homme de l'art. Elles seront cependant 7 illustrées ci-après dans les exemples.
Selon un autre aspect de la présente invention, celle-ci concerne également un procédé de préparation d'un tel vaccin, dans lequel on remplace, dans des bactéries du genre Yersinia au moins un des gènes plasmidiques codant pour une protéine de membrane externe par au moins un gène bactérien ou viral codant pour une protéine ou un épitope contre lequel on souhaite vacciner.
Sous un autre aspect, l'invention porte également sur l'utilisation d'antigènes purifiés à partir de 1 0 souches de Y.enterocolitica recombinantes ou de leur surnageant de culture pour la réalisation de trousses diagnostiques permettant de détecter des anticorps spécifiques. Exemple
On remplace dans le plasmide de Y. enterocoli-15 tica 0:9 (pYVe09), les gènes des protéines exportées dans la membrane externe et le milieu de culture (yop) par les gènes d'antigènes protecteurs (qap). De cette manière, la virulence de Y, enterocolitica sera atténuée et l'expression du gène qap sera sous le contrôle du plasmide 2 0 pYVeO:9.
a. L'étude des gènes yop
Par mutagenèse, les gènes de structure yop peuvent être localisés sur pYVe09. Des tests de virulence permettent de choisir un ou plusieurs de ces gènes. Les 2 5 * gènes dont l'inactivation se traduit par une atténuation du pouvoir pathogène sont sélectionnés.
Afin de localiser les signaux de régulation et la phase ouverte de lecture de ces gènes, ceux-ci sont clonés et séquencés.
30
Cette étape permet de déterminer où et comment insérer le gène qap dans le gène yop.
b. Le placement du gène qap sous le contrôle des signaux de yop.
Le gène yop cloné sur un plasmide mobilisable, 3 5 est remplacé par le gène gap, tout en gardant les signaux de régulation du gène yop. Le plasmide est ensuite . i 8 introduit dans une souche de Y. enterocolitica 0:9 et l'expression de qap analysée in vitro.
c. Le placement du gène qap dans pYVe09.
Afin d'éliminer des plasmides inutiles et des résistances à des antibiotiques, le gène qap est introduit 5 dans pYVe09 suivant la méthode de Ruvkun et Ausubel ( 1981 ) .
d. L'étude in vivo des recombinants.
L'étude in vivo des recombinants débute par l'analyse de la réponse humorale d’animaux ayant reçu per 10 os les bactéries recombinées. La présence dans leur sérum d'anticorps dirigés contre l'antigène protecteur propagé par Y. enterocolitica atteste dans un premier temps, de la validité du système. Ces anticorps sont détectés par tests ELISA ou RIA, 15 1) Test de virulence.
Le plasmide pGB63 est un cointégrat conjugatif contenant le plasmide R388 et le plasmide de virulence de Y. enterocolitica W22 708 (sérogroupe 0:9) marqué par le transposon Tn3 (pYVe22 708 ::Tn3). Une mutagenèse par inser-20 tion d'un Mini-Mu dlac dans le plasmide pGB63 permet d'obtenir divers mutants. Deux de ces transposants sont touchés respectivement dans les gènes yop 51 et yop2 5 de pYVe22708. Ces 2 mutations se traduisent par l'absence de la protéine correspondante dans le surnageant de culture. 25 La virulence de ces deux souches est testée sur souris selon la méthode de Robins-Brown et Prpic (1985). La souche présentant la meilleure atténuation du pouvoir pathogène est gardée pour les expériences suivantes. 2) Localisation exacte du gène yop.
30 Les gènes yop51 et yop2 5 ont été situés respec tivement sur les fragments EcoRI E3 et E2 . Ces fragments ont été clonés dans le vecteur pACYC194 et introduits dans la souche Y. enterocolitica W22708 curée de son plasmide de virulence. Les clones obtenus n'expriment aucune YOP. 35 Cependant, lorsque le cointégrat contenant le plasmide de virulence muté au niveau du gène yop51 est introduit dans Y. enterocolitica (pACYCI84-E3) par conjugaison, les 9 * ‘ t conjuguants relâchent la protéine yop51 dans le milieu de culture.
On introduit le plasmide de la souche mutée au niveau de yop51, dans Y. enterocolitica (pACYCI84-E3). On 5 recherche ensuite Y0P51 par analyse électrophorétique des protéines du surnageant de culture (SDS-PAGE).
Ensuite, afin de localiser plus précisément les gènes yop51 et yop2 5 sur les fragments EcoRX E2 et E3, ces fragments sont clonés sur un plasmide mobilisable de type 10 (voir ci-dessous) et soumis à une mutagenèse par le système de transposition pMBLG21 (voir ci-dessous).
Les plasmides mobilisables en question possèdent un site de mobilisation (mob). Introduits dans certaines souches de E. coli, ils deviennent mobilisables grâce à la 15 complémentation en trans des gènes de transfert de RP4. Pour ce faire, on peut utiliser le plasmide RP4 lui-même ou un de ses dérivés dont l'un ou l'autre gène de résistance indésirable a été inactivé par insertion de transpo-son lactose Tn 951.
20 Le plasmide pMBLG31 est un plasmide conjugatif à réplication thermosensible qui contient l'élément transposable déréprimé Tn2506 conférant la résistance au chloram-phénicol. Le transposon est défectif et complémenté par un gène de transposition situé sur le plasmide vecteur, hors 25 du transposon. Les mutations engendrées sont donc stables.
Le clonage et la mutagenèse se font comme suit: - clonage des fragments E2 et E3 au niveau du site EcoRI situé dans le gène de résistance au chloramphénicol des plasmides mobilisables; 30 - transformation de E.coli S17-1 par les plasmides recom binants et ensuite, introduction par conjuguaison du plasmide 'pMBLG31; - incubation des transformants à 42 °C sur milieu contenant du chloramphénicol afin d'éliminer pMBLG31 et de sélec- 35 tionner pour l'insertion de Tn2506; - introduction par conjugaison des transposants dans la souche de Y. enterocolitica possédant le plasmide de virulence muté au niveau du gène yop correspondant; 4 ♦ 10 - analyse par électrophorèse (SDS-PAGE) des surnageants de culture des conjuguants pour rechercher l'expression des protéines YOPs; - étude par restriction des transposants dont le gène yop 5 a été altéré (localisation du gène). Le gène est séquen cé par la méthode de Sänger et Coulson ( 1977) afin de rechercher les signaux de régulation du gène yop (promoteur, séquence signal...) et la phase ouverte de lecture.
10 Un plasmide recombinant porteur du gène yop est clivé au niveau du gène yop, soit en aval des signaux de régulation présumés, soit même en aval des premiers codons du gène de structure; exposé à l'activité de l'exonucléase
Bal 131 de manière à obtenir des extrémités permettant le 15 clonage ultérieur dans les trois phases et additionné de linkers adaptés au gène gap à cloner.
Le gène gap est ensuite inséré dans ce plasmide.
Le nouveau plasmide obtenu est introduit dans la souche de Y. enterocolitica contenant le plasmide de 20 pYVe09 muté au niveau du gène yop.
Parmi les plasmides recombinants introduits dans Yersinia, on recherche ceux dans lesquels le clonage a été effectué en phase. Pour ce faire, on recherche la présence de l'Ag protecteur par "immunoblotting" sur colonies. 25 L'analyse ultérieure des clones obtenus consiste a; - localiser l'insertion de gap dans le gène yop par restriction enzymatique ou séquençage; - étudier in vitro les conditions d'expression (températu-30 re, concentration en ions calcium) et la localisation cellulaire du produit obtenu (cytoplasme, membrane externe, environnement extracellulaire). Ces analyses sont effectuées par électrophorèse (SDS-PAGE) et "Western blot".
35
Claims (14)
11 « REVENDICATIONS.
1. Vaccin caractérisé en ce qu'il comporte des bactéries du genre Yersinia dans lesquelles au moins un des gènes plasmidiques codant pour une protéine de membrane externe est remplacé par au moins un gène bactérien ou viral codant pour une protéine ou un épitope contre lequel on souhaite vacciner.
2. Vaccin selon la revendication 1 caractérisé en ce que les bactéries du genre Yersinia sont les bactéries Yersinia enterocolitica ou Yersinia pseudotuberculosis. 1 0
3. Vaccin selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2 caractérisé en ce que la virulence des bactéries du genre Yersinia est atténuée de manière classique.
4. Vaccin selon l'une quelconque des revendications 1 ou 3 caractérisé en ce que la virulence des bacté- 15 , ries du genre Yersinia est attenuee par le remplacement de l'une ou l'autre protéine codée par le plasmide par un immunogène.
5. Vaccin selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce que les gènes bacté- 2 0. riens ou virais sont la sous-unite B de la toxine CT de Vibrio cholerae et de l'entérotoxine LT d'E. coli, de l'antigène de surface du virus de l'hépatite B (HBsAg) ou de la protéine de surface CS de Plasmodium falciparum.
6. Vaccin selon l'une quelconque des revendica-2 5 tions 1 ou 4 caractérisé en ce que les gènes bactériens ou virais sont ceux de HBsAg/ de 1'hémagglutinine du virus de l'influenza et de la glycoprotéine D du virus de l'herpès simplex qui ont été intégrés dans le génome du virus de la vaccine, 30 , ,
7. Procédé de préparation d'un vaccin selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce qu'on remplace, dans des bactéries du genre Yersinia au moins un des gènes plasmidiques codant pour une protéine de membrane externe par au moins un gène bacté-35 rien ou viral codant pour un proteine ou un épitope contre lequel on souhaite vacciner.
8. Procédé selon la revendication 7 caractérisé « ' ’ ' -f 12 en ce qu'on utilise des bactéries Yersinia enterocolitica ou Yersinia pseudotuberculosis.
9. Préparation pharmaceutique contenant au moins le vaccin selon l'une quelconque des revendications 1 à 6.
10 Antigènes purifiés obtenus à partir d'une 5 souche y.enterocolitica recombinante ou de son surnageant de culture.
11. Utilisation d'antigènes purifiés selon la revendication 10 pour la réalisation de trousses diagnostiques. 10 12 . Yersinia modifiée par action sur le plasmide convenant comme vaccin.
13. Procédé pour modifier les bactéries du genre Yersinia caractérisé en ce qu'on remplace un des gènes plasmidiques codant pour une protéine de membrane externe 15 par au moins un gène bactérien ou viral codant pour une protéine ou un épitope.
14. Utilisation des Yersinia modifiées dans des vaccins. 2 0 2 5 30 35
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