MC1552A1 - Procede de fabrication de compositions anti-herpes synergiques - Google Patents

Description

BREVET D'INVENTION

Société ENS BIP LOGICALS INC.

1

Procédé de fabrication de compositions anti-herpès synergiques

L'invention concerne les compositions pharmaceutiques, et plus particulièrement des compositions pharmaceutiques utile: pour le traitement des infections virales telles que les infections d'herpès chez les mammifères.

Les infections par Herpes simplex virus (HSV) sont répandues dans les populations humaines, et posent un problème sanitai:

V

particulièrement difficile. L'herpès génital |constitue une grave menace de santé pour les femmes en particulier. Les femmes enceintes atteintes d'infections actives d'herpès génital au moment de l'accouchement ont une chance sur deux de le' transmettre à leurs bébés. L'American Academy of Pediatrics indique que 6 0% des bébés nés avec des infections HSV meurent, et que la moitié des survivants subissent des dommages sérieux au cerveau, au système nerveux et aux yeux ("Pediatrics" 6_6, 147-9 , 1980) . Il a également été suggéré que HSV-2 peut jouer un rôle dans l'apparition du cancer cervical. On a observé une association entre les rapports sexuels et le cancer cervical, qui peut s'expliquer par la transmission de HSV-2.

A l'inverse d'autres maladies transmises par voie sexuelle telles que la gonorrhée, la syphilis et l'uréthrite non gonococcique, les infections d'herpès ne sont actuelle^er.: pas curables. Beaucoup des médicaments actuellerent en uscj-^ clinique peuvent ne pas être eîzz :v:es pc~r ré.r:;r= -a

Ci.

10

2

gravité ou la durée des symptômes. Même après disparition des symptômes, le virus de l'herpès tend à rester dormant dans le tissu nerveux, pour n'être réactivé gu1 à une date ultérieure en une phase active d'infection, causant la récurrence de lisions ("plaies froides") et d'autres symptômes. On peut considérer un médicament comme efficace s'il diminue la gravité des lésions, permet une guérison plus rapide, allonge la période entre récurrences des infections d'herpès ou arrête complètement les récurrences.

Herpes simplex virus est l'un des membres de la famille des "Herpetoviridae"; d'autres membres de cette famille gui contaminent les humains sont le varicella-zoster, le cyto-mégalovirus et le virus d'Epstein-Barr. La famille comprend 15 aussi divers membres qui attaquent les animaux. Il existe par exemple, entre autres, trois types de virus d'herpès équins, un virus d'herpès porcin, un virus d'herpès canin et un virus d'herpès félin.

20 Comme pour tous les virus, le virus de l'herpès envahit des cellules hôtes saines sur lesquelles il compte pour pourvoir

à ses besoins en matière de réplication. Les virus de 1'hex-pè

codent pour certains des enzymes dont ils ont besoin pour la

;

réplication, au lieu de se reposer entièrement sur les 25 cellules hôtes pour tous leurs besoins. Par suite, les virus de-l'herpès sont sujets à une inhibition sélective par certains médicaments gui interviennent spécifiquement sur les enzymes viraux.

30 La Demande de brevet selon le Traité de Coopération en matière de Brevets US82/00/182 de K.O. Smith et ens Bio Logicals Inc. décrit des mélanges synergiques de 9-£ |2-hydroxy'-1 - (hydroxy-méthyl)-éthoxyJméthyiQguanine et de PFA ou PAA ou leurs sels, utilisables dans le traitement des cellules contaminées par 35 les virus de l'herpès.

On a maintenant découvert que des compositions thérapeutiques ayant une. bonne activité contre les virus de l'herpès peuvent

3

être préparées à partir de combinaisons d'interféron et de 9- £j2-hydroxy-1-(hydroxyméthyl)-éthoxyj méthyl] guanine, ou d'un sel pharmaceutiquement acceptable de celles-ci. Ces combinaisons sont beaucoup plus efficaces qu'on aurait pu le 5 prévoir en prenant en considération les activités des composés pris individuellement7 ce qui indique qu'une forme d'effet synergique se produit.

Ainsi, selon la présente invention, est fournie une composi-10 tion thérapeutique ayant une activité contre les infections par virus de l'herpès en combinant par mélange au moins un interféron avec la 9-£{_2-hydroxy-.1-(hydroxyméthyl)-éthoxyj méthyl]guanine, ou un sel pharmaceutiquement acceptable de celle-ci.

15

L'interféron est un polypeptide à bas poids moléculaire produit en tant qu'excrétion par divers types de cellules de mammifères viables. Ses propriétés, sa nature chimique et ses méthodes de préparation et de récupération ont été étudiées 20 et décrites de façon étendue ces dernières années, en raison de la valeur potentielle de ses propriétés pharmacologiques. On sait qu'il en existe plusieurs types. Bien que tous les types d'interféron soient utiles dans les compositions préparées selon la présente invention, on utilise de préférence 25 1'interféron y. Les concentrations d'interféron sont communément exprimées en "unités" standards, qui sont admises et décrites internationalement, et qui se rapportent au pouvoir d'une quantité donné d'interféron d'inhiber la réplication d'un virus dans des conditions standards. La 9-j^[2-hydroxy-1-30 (hydroxyméthyl)-éthoxyjméthyl]guanine (quelquefois désignée ci-après par G*) et ses procédés de préparation sont décrits dans la Demande de Brevet Européen No 81 304227.2 (Ogilvie cédée à ens Bio Logicals Inc.); la Demande de Brevet Européen No 82 401511.3 (Ashton et al. cédée à Merck & Co., Inc.) et 35 le Brevet US No 4 355 032 de Verheyden cédé à Syntex Corp.

Les compositions préparées selon l'invention peuvent bien entendu comprendre plus de deux ingrédients actifs. G* peut

4

4

être présente comme base libre, ou alternativement comme un sel pharmaceutiquement acceptable tel que chlorure, sel de sodium, phosphate, diphosphate, etc.

5 Les compositions préférées obtenues selon la présente invention paraissent être actives contre une grande variété de souches représentatives de HSV, des deux types I et II. Les compositions peuvent aussi être actives contre les virus d'herpès équins de divers types et les virus d'herpès porcins 10 (virus de la pseudo-rage).

A peu près chague souche de HSV produit des particules de virv qui sont en partie résistantes à chacun des médicaments mentionnés ci-dessus. Par exemple, si on examine une courbe de 15 titration caractéristique qui montre l'effet de concentrations en médicaments variables sur les formations de plaques de HSV (la méthode de titration en plaque virale de Roizman et Roane à laquelle on se référera plus en détail ci-après), la courbe est sigmoïde, c'est-à-dire qu'un petit nombre.de plaques 20 virales émergent en présence d'une concentration de médicament qui fait immédiatement disparaître les autres plaques. Ce sont \

ces plaques de virus partiellement résistantes au médicament que peut quelquefois faire disparaître un second médicament pouvant avoir un mode d'action différent du premier. Il peut 25 en résulter une action synergique entre le premier médicament et le.second, comme on le montrera ci-après.

Les quantités relatives de médicaments dans les compositions selon l'invention peuvent varier dans de.larges.limites..La 30 quantité, optimale de chaque médicament varie selon la nature de la formulation dans laquelle les médicaments doivent être appliqués, le type et la souche de HSV à traiter, et la gravité et l'emplacement de l'infection, entre autres facteurs. La quantité d'interféron, comme indiqué plus haut, est 35 communément exprimée en unités standards. En général, les compositions contenant de 50 à 500 000 unités d'interféron environ par microgramme de G* sont efficaces. Les compositions

4)

5

préférées sont celles contenant de 1000 à 200 000 unités d'interféron environ par microgramme de G*.

Pour l'administration aux patients, les compositions de 5 l'invention peuvent être appliquées de façon locale en pommade, crème ou poudre, parentérale, interthécale, en gouttes pour le nez, en gouttes pour les yeux ou en aérosols pour inhalations, ici encore selon la nature et la localisation de l'infection à traiter.

10

Les doses unitaires efficaces pour l'administration interthécale ou parentérale des compositions sont avantageusement comprises entre environ 0,1 et 100 mg de chaque médicament dans les combinaisons choisies par kg de corps de mammifère, 15 et plus particulièrement entre 0,5 et 2 0 mg par kg, de préférence environ 5 mg par kg, sur la base d'un dosage administré de 2 à 4 fois par jour. On préfère traiter l'infection par des doses d'attaque relativement fortes de la combinaison de médicaments, de façon à limiter les chances de développe-20 ment de souches virales résistantes dans l'infection.

Pour l'administration locale, on peut formuler de fa.çon connue des pommades ou crèmes dans des bases inertes classiques- (par exemple pétrolatum, etc.). Une quantité comprise 25 entre 0,1 et 10% en poids environ de médicaments totaux, a©

préférence entre 0,5 et 5% en poids, fournit une concentration convenable dans une pommade ou crème, pour administration locale 1 à 4 fois par jour. De telles formulations appliquées localement maintiennent effectivement un réservoir des médi-30 caments actifs contre les sites contaminés, de sorte que les concentrations de médicaments dans les formulations ne sont pas critiques, à condition bien sûr de ne pas utiliser un niveau de dosage nuisible aux zones de peau environnantes.

35 L'invention est davantage illustrée dans les résultats expérimentaux et les exemples spécifiques qui suivent.

Hn

6

Exemple 1

On a utilisé dans cette étude des fibroblastes fétaux humains (HFF) provenant de tissus fétaux. On a cultivé et conservé 5 les cellules dans le milieu de base d'Eagle (BME) additionné de 0,112% de bicarbonate de sodium, de L-glutamine 2mM, de 2 mg% de Néomycine et de 20% en volume de sérum de veau.

On a utilisé dans les essais HSV-1 souches Patton, une souche 10 constituée depuis longtemps et bien connue de herpès simplex virus type 1, comme montré dans les Tableaux présentés ci-après.

On a -utilisé une méthode de titration en plaque virale ^ (Roizman et Roane, 1961) pour déterminer le titre de la souche HSV. On a ensemencé des capsules de culture de tissu (35 par 10 mm, Corning) avec des cellules et on les a utilisées pour les essais quand elles étaient monocouches à 75% environ. On a inoculé des volumes (0,2 ml) de dilutions 20 logarithmiques de la souche de virus sur deux capsules de cultures de tissus chacune et on les a adsorbés pendant une heure avec agitation intermittente, on a retiré le vaccin et ajouté 2 ml de BME à 20% contenant 0,5% d'immun globuline humaine. Après une période d'incubation de 48 heures à 36°C 25 dans une atmosphère à 5% de CO2 , on a retiré le milieu de recouvrement et on a teinté les feuilles de cellules à l'aide d'une solution aqueuse à 0,05% de violet cristallisé. On a compté les plaques à l'aide d'un projecteur de profil Nikon qui grossissait .les capsules dix fois. On a fait la moyenne des résultats en double et calculé le nombre d'unités de - formation de plaques (PFU). Le titre du virus est ainsi exprimé comme le nombre d'unités de formation de plaques observé après croissance dans ces conditions.

35

On a utilisé comme médicaments antiviraux dans ces expériences des combinaisons de G* et d'interféron Y.

Pour faire des comparaisons entre les activités de différents médicaments et combinaisons, on a conduit des expériences par titration en plaque pour observer le pouvoir antiviral en observant et en comptant le nombre de PFU par capsule 5 après croissance des cellules contaminées dans le milieu de culture. A cet effet, on a inoculé dans des capsules de cultures de tissus (35 par 10 mm) comportant des monocouches de cellules de HFF à 75% de confluence environ 50 unités de formation de plaques de virus pour 0,2 ml et on a laissé 10 le virus s'adsorber pendant une heure en agitant par intermittence. Après avoir retiré le vaccin, on a ajouté aux capsules en double 2 ml de BME à 20% contenant 0,5% d'immun globuline et des dilutions triples du médicament approprié. Une série de capsules n'a pas reçu de médicament. Après une 15 période d'incubation de 48 heures à 36°C dans une atmosphère à 5% de CC>2 , on a retiré le milieu de recouvrement, on a teinté les cellules comme décrit ci-dessus et on a compté les plaques. On a fait la moyenne des résultats des plaques en double.

20

On a testé l'activité de combinaisons des médicaments par titration en plaque virale, à différentes concentrations, et on a effectué des titrations en plaque pour les médicaments individuels à titre de comparaison.

25

Les résultats sont donnés dans le Tableau 1. Les résultats de titre de virus sont exprimés en unités de formation de plaques (PFU) par capsule, le chiffre étant bien entendu d'autant plus bas que l'effet inhibiteur antiviral du médicament testé est 30 plus grand.

Ces chiffres montrent que, alors que 1'interféron Y seul n'a qu'un léger effet sur les cellules contaminées par le virus et que G* a un effet à des concentrations relativement 35 élevées, la combinaison dans des proportions convenables est beaucoup plus efficace et permet de réduire très sensiblement la quantité de composé G*.

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'TABLEAU 1

Essais .d1 inhibition en plaque contre des cellules HFF contaminées par HSV-1 Patton

Concentration d1interféron

(unités par ml)

10

100

1 000

0

PFU par capsule

PFU par capsule

PFU par capsule

PFU par capsule

Concentration de (microgrammes par ml)

G* .0 ,.0.2

27 . .

.23

24

31

0,064

24

26

19

29

0,2

18

20

7

18

.0 , 6.4

1

0

0

1

.2 ,.Q .

0

0.

0

0

... 0. .

30 .

.24

24

36

20 Exemple 2

On a essentiellement répété les procédures de l'exemple 1, mais en utilisant des mélanges de proportions égales d'interféron Y

et d'interféron a, avec des quantités variables de G*, et en

25 utilisant encore des cellules HFF contaminées par HSV-1 Patton.

Dans chaque expérience, la quantité d'interféron était de

1000 unités par ml d'interféron Y et 1000 unités par ml d'interféron a, pour une quantité totale de 2000 unités par ml d'interféron. Les résultats de titre de virus sont exprimés

5

30 dans ce cas en unités de formation de plaque par ml x 10 .

La valeur sous "facteur de réduction du titre" est le rapport du titre de virus de contrôle, c'est-à-dire sans médicament, à celui de l'expérience en présence de médicament. Les résultats sont présentés dans le Tableau 2 ci-après.

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. TABLEAU 2

. avec .

interféron .

. .sans interféron

Concentration de G* (microgrammes par .ml)

PFU/ml xîO5

facteur de réduction du titré

PFU/ml x1 O5

facteur de réduction du titre ■

0,02

.30

4,0 .

.11.5

1,0

0,064

.5

. 24,0

.90

1 ,3

1 0 0 . 1.00 1. ,2 1 20 1 ,0

Les résultats montrent qu'une action synergique se produit dans ces combinaisons de médicaments contre les souches de HSV testées. On peut s'attendre à obtenir in vivo au moins le même degré de synergie.

Exemple 3

2q Dans une autre expérience, on a incubé comme décrit des cellules HFF contaminées'par virus et effectué des titrations en plaques avec diverses combinaisons de G* et d'une combinaison interféron y/interféron a. Dans une série de capsules, on n'a pas utilisé de G*r et dans l'autre série de capsules on a utilisé 0,05 micro-

2^ gramme par ml de G*. L'interféron était dans tous les cas un mélange de quantités égales d'interféron Y et d'interféron a, les nombres indiqués dans les résultats suivants étant les quantités individuelles de chaque composant du mélange.

3Q Les résultats sont montrés dans le Tableau 3. Les valeurs sont présentées comme "facteur de réduction de titre", la valeur unitaire étant attribuée aux capsules ne contenant pas de médicament.

10

' 'TABLEAU 3

Concentration d'interféron (unités/ml)

0

10 .... . .1.00 1000

Facteur de réduc'tion du titre avec 0 micrôgràmme/ml de G* 1,0 1,1 1,1 1,6

Facteur de réduction du titre avec 0,05 microgramme/ml .de G* 1 ,0 1 ,3 3,0 27

Les quantités relatives et les concentrations de médicaments utilisées dans ces exemples sont appropriées pour des essais in vitro et pour démontrer la synergie des combinaisons, mais n'ont qu'une valeur illustrative. Les quantités relatives dans les combinaisons pour usage in vivo et lors de l'administration pratique pour des traitements contre les HSV sont telles qu'exposé précédemment, et peuvent n'être pas en relation étroite avec les proportions montrées ici dans les exemples spécifiques.

11

Claims (4)

Revendications.

1.- Procédé de fabrication d'une composition thérapeutique ayant une activité contre les infections virales d'herpès, caractérisé en ce qu'il consiste à combiner par mélange au moins un interféron avec la 9-J^j2-hydroxy-1 - (hydroxyméthyl) -

5 éthoxyjméthyljguanine ou un sel pharmaceutiquement acceptable de celle-ci.

2.- Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la quantité relative d'interféron utilisée est comprise entre

10 50 et 500 000 unités environ par microgramme de 9- j][2-hydroxy-1-(hydroxyméthyl)-éthoxyjméthyl]guanine ou de son sel.

3.- Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que 1'interféron est 1'interféron-y, 1'interféron-a ou un mélange

15 de ceux-ci.

4.- Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que la quantité relative .d'interféron utilisée est comprise entre 1000 et 200 000 unités environ par microgramme de 9-^Jj2-hydro-20 xy-1-(hydroxyméthyl)-éthoxyjméthyl]guanine ou de son sel.

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