MC1553A1 - Proteine d'interferon immunitaire humain et son procede de production - Google Patents

Description

1

La présente,invention concerne une protéine d'interféron immunitaire humain et un procédé de production de cette protéine par la technique du génie génétique .

Les interférons (parfois désignés ci-après par l'abréviation IF) sont des protéines élaborées par des cellules d'animaux supérieurs stimulées par des virus, des acides nucléiques, etc. et ils sont doués, entre autres, d'activités antivirale et antitumorale .

A l'heure actuelle, on classe généralement les interférons en trois types différents par leurs propriétés caractéristiques, à savoir les types a, 3 et y. : les - types a et 3 sont induits par des virus ou par des acides nucléiques et le type y par des mitogènes, etc.

Les études portant sur l'IF de type a (désigné ci-après par l'abréviation IF-a) et l'IF de type 3(désigné ci-après par l'abréviation IF-3) ont permis de réaliser des progrès très importants et les mécanismes dè production de ces interférons ont été élucidés dans une mesure considérable. En outre, du fait des progrès réalisés dans les techniques du génie génétique, il est maintenant possible d'obtenir IF-a, IF-31 et IF-a.j comme protéines biologiquement actives en grandes quantités, par la culture d'Escherichia coli (IF-a et IF-3^) et de levures (IF-a^) /~D.V. Goeddel et collaborateurs, Nature, 287, 411 (1980) ; E. Yelverton et collaborateurs, Nucleic Acids Res., 9, 731 (1981) ; D. V. Goeddel et collaborateurs, Nucleic Acids Res. 8_, 4057

(1980) ; R. Hitzeman et collaborateurs, Nature, 293, 717

(1981)7. En outre, des tentatives de production sur une grande échelle sont en cours, en vue de la conduitè d'essais cliniques utilisant ces protéines.

L'IF de type y (parfois désigné ci-après par l'abréviation IF-y) est produit à partir de cellules immunocompétentes (immunocytes) dans des circonstances telles qu'une transformation de lymphocytes (passage à des cellules blastiques) ou une production de lymphokines a lieu, et en conséquence, on l'appelle interféron immunitaire (parfois désigné ci-après par l'abréviation I-IF).

L'interféron I-IF est considéré comme doué d'une plus grande activité contre la prolifération de cellules ou activité antitumorale comparativement aux interférons IF-a et IF-8, et par conséquent, on attend de lui davantage, du point de vue des applications cliniques. Toutefois, par suite de diverses limitations, telles que la présence nécessaire de lymphocytes frais pour la production de I-IF, tous les systèmes efficaces de production n'ont pas encore été établis. Il est suggéré que, dans des systèmes expérimentaux différents, des espèces cellulaires différentes puissent produire des espèces moléculaires différentes de I-IF. Leurs structures et propriétés restent encore inconnues sous de nombreux aspects.

En revanche, les interférons sont très inféodés à l'espèce et, en conséquence, des interférons destinés à être utilisés-chez des humains doivent être d'origine humaine. Toutefois, attendu que la production d'interférons immunitaires humains sur une grande échelle est difficile, son application clinique est impossible à l'heure actuelle, par conséquent, on a attendu de mettre au point une technologie par laquelle l'I-IF humain de grande pureté puisse être produit aisément en grandes quantités et de façon peu coûteuse.

La Demanderesse a entrepris des travaux de recherche en vue de mettre au point une technologie pour l'obtention de la protéine d'I-IF humain désirée, qui implique le clonage du gène d'I-IF humain par l'utilisation de la technique de manipulation des gènes et introduction de la molécule ADN recombinant ainsi obtenue dans un h§te pour l'expression du gène d'I-IF humain. La présente invention est l'aboutissement de ces travaux de recherche.

La présente invention propose une protéine-d'interféron immunitaire.', humain recombinant pratiquement pure et un procédé de production de ladite protéine, qui consiste à cultiver un transformant dont 1'ADN contient une séquence de bases codant l'interféron immunitaire humain et à purifier le liquide, contenant la

protéine d'interféron immunitaire humain ainsi obtenue en utilisant un anticorps monoclonal capable de s'attacher à l'interféron immunitaire humain.

Gray et collaborateurs, considérant qu'ils pouvaient avoir cloné l'un des gènes d'I-IF humain, ont rapporté

la séquence d'amino-acides d'un polypeptide qu'ils ont déduite de ce résultat /"Nature, 295, 503 (1982YJ. Des relations similaires ont été faites ensuite par Devos.; èt collaborateurs /""Nucleic Acids Research, Jl_0, 2487 (1982^7 et par Derynck et collaborateurs /~ibid. 10, 3605 (198227- Toutefois, jusqu'à maintenant, la présence de substances de type IF n'a été qu'une spéculation basée sur l'activité antivirale détectée. Aucun compte-rendu ne mentionne qu'une protéine d'interféron immunitaire humain pratiquement pure pourrait être obtenue.

La Demanderesse a établi un interféron immunitaire humain pratiquement pur et un procédé de production de cet interféron, et elle a par conséquent réalisé la présente invention.

L'ADN codant l'I-IF humain que l'on doit utiliser conformément à la présente invention est par exemple un ADN contenant une séquence de bases représentée par la formule

(5') TGT

TAC

TGC

CAG

GAC

<

o o

TAT

GTA

AAA

GAA

GCA

GAA AAC

CTT

AAG

AAA

TAT

TTT AAT

GCA

GGT

CAT

TCA

GAT GTA

GCG

GAT

AAT

GGA

ACT

CTT

TTC

TTA

GGC

ATT

TTG AAG

AAT

TGG

AAA

GAG

GAG

AGT

GAC

AGA

AAA

ATA

ATG CAG

AGC

CAA

ATT

GTC

TCC

TTT

TAC

TTC

AAA

CTT

TTT AAA

AAC

TTT

AAA

GAT

GAC

CAG

AGC

ATC

CAA

AAG

AGT GTG

GAG

ACÇ

ATC

AAG

GAA

GAC

ATG

AAT

GTC

AAG

o eh eh eh eh eh

AAT

AGC

AAC

AAA

AAG

AAA

CGA

GAT

GAC

TTC

GAA AAG

CTG

ACT

AAT

TAT

TCG

GTA

ACT

GAC

TTG

AAT

GTC CAA

CGC

AAA.

GCA

ATA

CAT

GAA

CTC

ATC

CAA

GTG

ATG GCT

GAA

CTG

TCG

CCA

GCA

GCT

AAA

ACA

GGG

AAG

CGA AAA

AGG

AGT

CAG

ATG

CTG

TTT

CGA

GGT

CGA

AGA

GCA TCC

CAG

-X

(?)

(I)

dans laquelle X représente TAA, TGA ou TAG.

L'ADN (I) mentionné ci-dessus peut avoir, à son extrémité 5 ' , la séquence y ATG AAA TAT ACA AGT TAT ATC TTG GCT TTT CAG CTC TGC ATC GTT TTG GGT TCT CTT GGC 3' (II) ou ATG (III).

L'ADN (I) est avantageusement raccordé en aval d'un promoteur tel qu'un promoteur de tryptophane (trp), un promoteur de lactose (lac) ou un promoteur du facteur Tu d'allongement de la chaîne protéinique (tufB), notamment un promoteur de trp.

Dans la formule (I) , 1 'oligonucléotide représenté par X est avantageusement TAA.

Dans le présent mémoire, de même que sur les dessins annexés, les symboles utilisés ont les définitions données sur le tableau I.

TABLEAU I

ADN : Acide désoxyribonucléique

A : Adénine

T : Thymine

G : Guanine

C : Cytosine

ARN : Acide ribonucléique dATP : Triphosphate de déso'xyadénosine dTTP : Triphosphate de désoxythymidine dGTP : Triphosphate de désoxyguanosine dCTP ; Triphosphate de désoxycytidine

ATP : Triphosphate d'adénosine

EDTA : Acide éthylènediaminetétra-acétique

SDS : Dodécylsulfate de sodium

Giy : Glycine

Ala : Alanine

Val : Valine

Leu : Leucine

Ile : Isoleucine

i {

5

Ser : Sérine

Thr : Thréonine

Cys : Cystéine

Met : Méthionine

!

5 Glu : Acide glutamique

A p : Acide aspartique

Lys : Lysine

Arg : Arginine

His : Histidine

10 Phe : Phénylalanine

Tyr : Tyrosine

Trp : Tryptophane

Pro : Proline

Asn : Asparagine

15 Gin : Glutamine

Z : Carbobenzoxy

Boc : Tertio.-butoxycarbonyle

Mtr : 4-méthoxy-2/3,6-triméthylbenzènesulfonyle

Pme : Pentaméthylbenzènesulfonyle

20 OBu : Ester de tertio.-butyle

ONB : N-hydroxy-5-norbornène-2,3-dicarboxy-imido-ester

DCC : N,N'-dicyclohexylcarbodiimide

DCU : N,N'-dicyclohexylurée

25 HONB : N-hydroxy-5-norbornène-2,3-dicarboxy-imide

HOBt : N-hydroxybenzotriazole

CHA : Cyclohexylamine

DCHA ; Dicyclohexylamine

TEA : Triéthylamine

30 TFA : Acide trifluoracétique

MSA : Acide méthanesuifonique

THF : Tétrahydrofuranne

DMF : Diméthylformamide

MeOH : Méthanol

35 AcOEt : Acétate d'éthyle

Conformément à la présente invention, un ADN double-brin codant pour I'1-IF humain peut être produit par exemple par culture de cellules humaines

sécrétant l'I-IF, telles que des lymphocytes de sang périphérique humain, en isolant du bouillon de culture un ARN messager (m) codant pour l'I-IF humain, en synthétisant sur cette base un ADN complémentaire (ADNc) simple-brin en utilisant par exemple une transcriptase réverse,

en en faisant dériver un ADN double-brin, en l'insérant dans un plasmide, en transformant par exemple Escherichia coli avec le plasmide résultant et en isolant un plasmide contenant 1 ' ADN.c.

Les lymphocytes de sang périphérique humain que l'on doit utiliser conformément à l'invention peuvent être des cellules non sensibilisées ou des cellules sensibilisées.

La substance à utiliser dans la mise en oeuvre de la présente invention pour induire il'I-IF peut être une substance d'un type quelconque pourvu qu'elle puisse amener des cellules lymphocytaires humaines à produire de l'I-IF. On peut donc mentionner, entre autres, la phytohémagglutinine (PHA), la concanavaline A (ConA), 1'entérotoxine staphylococcique A (SEA), la neuraminidase-galactose oxydase (NAGO) et le 12-0-tétradécanoylphorbol-13-acétate (TPA). On peut les utiliser seuls on en associations .

L'induction de l'i-lFpeut être effectuée en cultivant les cellules dans un milieu connu tel que le milieu RPMI-1640 ou le milieu MEM, de préférence le milieu RPMI-1640 contenant du sérum de foetus de veau. On conduit la culture dans l'intervalle de températures de 35 à 39°C, notamment de 36 à 38°C pendant une période de 12 à 72 heures, notamment de 22 à 26 heures. Les cellules sont recueillies par le procédé connu et, après l'addition d'un inhibiteur de RNase, tel que le thiocyanure de guanidine, la bentonite, l'héparine, l'acide polyvinylsulfu-rique, l'acide aurine-tricarboxylique, un complexe de vanadium, le pyrocarbonate de diéthyle (DPC) ou le dodécyl-sulfate de sodium (SDS), les cellules sont lysées par l'addition de N-laurylsarcosine, de "Tween 80" ou de "Nonidet P-4Q", par exemple. On effectue ensuite l'extraction

de l'ARN. Le cas échéant, après addition de phénol, de phénol-chloroforme ou une addition similaire à cet extrait contenant l'ARN, le processus d'extraction est réitéré. La fraction d'ARN est recueillie par précipitation à l'éthanol. Attendu qu'il est connu que la plupart des ARNm présents dans le cytoplasme de cellules d'eucaryotes ont une séquence poly A à leur extrémité 3' on recueille des ARN poly(A+) en utilisant un produit du type oligo(dT)cellulose ou poly(U)sépharose, par exemple, et on les fractionne par centrifugation dans un gradient de densité de saccharose. On injecte une portion aliquote de chaque fraction dans des ovocytes de Xenopus laevis en vue de la traduction J. B. Gurdon et collaborateurs, Nature, 233, 177 (1971 )J7- La protéine résultante est soumise à un test d'activité antivirale. On peut obtenir de cette manière une fraction 12-16S contenant l'ARN messager relatif à I-IF. L'ARNm peut aussi être purifié par électrophorèse sur gel de formamide-polyacrylamide ou par électrophorèse sur gel d'agarose en utilisant le glyoxal.

En utilisant comme matrice l'ARNm ainsi obtenu, on synthétise une chaîne d'ADN complémentaire (ADNc), par exemple par la méthode connue d'utilisation d'une transcriptase réverse, et on convertit l'ADNc en un ADN double-brin (T. Maniatis et collaborateurs, Cell, 8, 163 (1976)7.

On insère cet ADN par exemple dans le plasmide pBR322 au site de clivage de l'endonucléase de restriction PstI ou SphI, par exemple par la méthode d'addition de queues d1homopolymère dG-dC ou dA-dT /~T. S. Nelson, Methods-'ih Enzymology, 6£5, 41 (1979) , Academic Press Inc., New York7« L'ADN recombinant est introduit par exemple dans Escherichia coli X1776 en vue de la transformation. La sélection de transformants peut être effectuée sur la base de la résistance à la tétracycline ou de la résistance à l'ampicilline. Par ailleurs, un oligo-nucléotide ayant une séquence de bases correspondant vraisemblablement à la séquence d'amino-acides du

8

polypeptide d'I-IF est chimiquement synthétisé puis

32

marqué au phosphore P pour former une sonde et, en utilisant dette dernière, on trie secondairement les transformants résistant à la tétracycline ou résistant à l'ampicilline déjà obtenus pour obtenir les clones désirés', par exemple par l.la méthode connue d'hybridation de colonies rM. Grunstein et D. S:. Hogness, Proc. Natl. Acad.'Sci. Etats-Unis d'Amérique, 72., 3961 (1975j_7.

Les clones positifs dans cette hybridation de colonies sont soumis à un examen de la séquence de bases, par exemple par la méthode de Maxam-Gilbert / A.M. Maxam & W. Gilbert,Proc. Natl. Acad. Sci. Etats-Unis d'Amérique 74, 560 (1977}_7, ou par la méthode de terminaison de chaîne de synthèse d'un dinucléotide, utilisant le phage M13 (J. Messing et collaborateurs, Nucleic Acids Res., £, 309 (1981 J_/ pour la confirmation de la présence du gène d'I-IF. Ensuite, le gène d'I-IF est excisé en totalité ou en partie du clone obtenu de la manière indiquée ci-dessus et il est attaché en aval d'un promoteur appro-

i prié et de la séquence SD (Shine et Dalgarno) en vue de l'introduction dans un hôte convenable.

A titre d'exemples de promoteur,-on peut mentionner les promoteurs indiqués ci-dessus. Des hôtes appréciés sont des souches d'Escherichia coli (294, W3110, 0600, etc.), parmi lesquelles on apprécie spécialement la souche 2.94.

La souche 294 est un organisme connu £~K. Backman et collaborateurs, Proc. Natl. Acad. Sci. Etats-Unis d'Amérique, 12.> 4174 (197627 et elle est également déposée à l'Institute for Fermentation, d'Osaka, sous le numéro de dépôt IFO-14171.

La transformation d'un hôte avec 11ADN conformément à la présente invention est effectuée par exemple par la méthode connue /~~S. N. Cohen et collaborateurs,

Proc. Natl. Acad. Sci. Etats-Unis d'Amérique, 69, 2110 (19722.7.

Le transformant ainsi obtenu est cultivé dans un milieu connu.

Le milieu est par exemple le milieu M9 gui contient du glucose et des casamino-acides £~J. Miller, Experiments in Molecular Genetics, 431-433 (Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1972)7. Pour activer efficacement le promoteur, on peut éventuellement ajouter de l'acide 3$-indolylacrylique ou un agent similaire.

La culture est en général effectuée à 15-43°C pendant 3 à 24 heures. Le cas échéant, on peut effectuer une aération et/ou une agitation.

Lorsque la culture est terminée, les cellules sont recueillies par la méthode connue et, par exemple, après mise en suspension dans un tampon, elles sont lysées par un traitement aux ultrasons, par le lysozyme et/ou par congélation et décongélation par exemple. Ensuite, la liqueur surnageante est recueillie par centri-fugation. Pour la lyse cellulaire, une congélation et une décongélation suivies d'un traitement au lysozyme sont préférables.

L'I-IF humain dans la liqueur surnageante ci-dessus peut être purifié avantageusement par l'utilisation d'un anticorps monoclonal capable de se fixer à l'I-IF humain, de préférence un anticorps monoclonal contre le poly peptide.1.de formule :

(N) (C) \

H-X-Lys Arg Ser Gin Met Leu Phe Arg Gly-Y-OH (IV)

dans laquelle X est une liaison ou un résidu de peptide ou d'amino-acides ayant 1 à 16 amino-acides comptés à partir du terminus C de la chaîne peptidique de :

(N) !

Ile Gin Val Met Ala Glu Leu Ser Pro Ala ,

(C)

Ala Lys Thr Gly Lys Arg et Y est un résidu de peptide ou d'amino-acides ayant 1 à 5 amino-acides comptés à partir du terminus N de la chaîne peptidique de

10

(N) (C)

Arg Arg Ala Ser Gin,

qui est un polypeptide nouveau.

En ce qui concerne le polypeptide (IV), il est préférable que Y représente Arg Arg Ala Ser Gin ou/et que X représente Lys Arg. En outre, il est préférable que le polypeptide (IV) contienne 15 à 25 résidus d'amino-acides.

Cet anticorps monoclonal peut avantageusement être utilisé sous la forme d'une colonne d'anticorps.

La colonne d'anticorps peut être préparée par exemple par couplage de l'anticorps monoclonal mentionné ci-dessus à l'état purifié tel qu'on l'obtient à partir du liquide d'ascite inoculé avec les hybridomes à l'aide d'un support approprié, de la manière mentionnée ci-dessous.

Le support peut être de nature quelconque pourvu qu'après le couplage, l'I-IF puisse être adsorbé spécifiquement et efficacement et puisse ensuite être élué par des moyens convenables. A titre d'exemple, un gel d'agarose sous la forme de perles, qui est activé de manière à faciliter la liaison du groupe amino primaire d'une protéine, par exemple le produit "AFFI-GEL 10" (Bio-Rad Lab., Etats-Unis d'Amérique), peut être utilisé avantageusement dé la manière suivante. La réaction du produit "AFFI-GEL 10" avec l'anticorps est conduite dans une solution tampon telle qu'une solution de bicarbonatée 0,001-1 M, notamment 0,1 M. Des conditions réactionnelles que l'on peut utiliser impliquent une température de 0 à 20°C, une durée de 10 minutes à 24 heures et un pH variable, et des conditions préférées impliquent une _ réaction à 4°C pendant 4 heures et à pH 3-10. Le rapport quantitatif entre "AFFI-GEL 10" et l'anticorps peut être choisi" dans la plage allant jusqu'à environ 50 mg d'anticorps par ml de "AFFI-GEL" attendu que, dans cette plage, la quantité d'anticorps couplé avec le produit

11

"AFFI-GEL" croît lorsque la quantité d'anticorps augmente. Du point de vue de l'efficacité de couplage, l'anticorps est utilisé en une quantité n'excédant pas 30 mg sur ladite base. Le produit de couplage anticorps-support ainsi obtenu est correctement lavé avec la même solution tampon que celle qui est utilisée pour la réaction puis il est laissé au repos pendant plusieurs jours ou traité avec du chlorhydrate d'éthanolamine à une concentration finale de 0/05 M à 4°C pendant une heure ou par quelqu'autre procédé de manière à bloquer les groupes actifs restants n'ayant pas réagi, et on en garnit une colonne appropriée pour obtenir une colonne d'anticorps.

En vue d'effectuer une purification avec la colonne d'anticorps ci-dessus, on dissout dans un tampon pratiquement neutre tel qu'un tampon au phosphate ou un tampon au chlorhydrate de Tris, une solution contenant la protéine d'interféron immunitaire humain telle que la liqueur surnageante de la lyse cellulaire, par exemple et on fait adsorber la solution à la colonne d'anticopps; Cette dernière est lavée avec le même tampon puis 1'I-IF est élué. Des éluants que l'on peut utiliser comprennent une solution faiblement acide (par exemple une solution d'acide acétique), une solution contenant du polyéthylène-glycol, une solution contenant un peptide ayant une plus grande affinité pour l'anticorps que pour la protéine désirée, une solution de sel à forte concentration et une association de ces possibilités, entre autres. Les éluants qui n'activent pas dans une mesure considérable la décomposition de l'I-IF humain sont préconisés.

L'éluat de la colonne est neutralisé avec un tampon par la méthode classique. Le cas échéant, l'opération de purification peut être répétée en utilisant la colonne d'anticorps ci-dessus.

£a solution de protéine I-IF humaine ainsi obtenue est dialysée et, le cas échéant, elle peut être transformée en une poudre par lyophilisation. Dans la conduite de la lyophilisation, on peut ajouter un agent

12

stablisant tel que sorbitol, mannitol, dextrose, maltose ou glycérol.

La protéine d'interféron immunitaire humain ainsi obtenue, lorsqu'elle est titrée en vue de déterminer son Activité antivirale dans un test d'évaluation de l'effet d'inhibition de la dégénérescence de cellules WISH dérivées d'amnios humain par le virus de la stomatite vésiculaire (VSV), montre une activité spécifique qui

*7

n'est pas inférieure à 10 U/mg.

L'activité de IF, exprimée en U/ml (unités/ml)' a été déterminée de la manière suivante. Un interféron IF-a international de référence pour lequel l'unité a été établie et un interféron IF-y brut dérivé de leucocytes ont été titrés dans le test d'estimation de l'effet inhibiteur contre la dégénérescence cellulaire causée dans une lignée de cellules FL dérivées d'amnios humain par le VSV, le titre de l'interféron IF-y dérivé de limphocytes a été déterminé par comparaison des titres trouvés, et ledit IF-y a.été utilisé comme IF-y de référence au laboratoire. Dans le calcul du titre en IF-y dans une substance, cet interféron IF-y de référence de laboratoire a toujours été utilisé en parallèle dans l'épreuvè mentionnée ci-dessus dans le système WISH-VSV et le calcul du titre a été effectué sur la base du rapport des titres.

La protéine d'interféron immunitaire humain de la présente invention contient avantageusement un polypeptide ayant la séquence d'amino-acides de formule:

(N)H-Y-Z^ Tyr Gin Asp Pro Tyr Val Lys Glu

Ala

Glu Asn

Leu

Lys

Lys Tyr

Phe

Asn

Ala

Gly

His

Ser

Asp Val

Ala

Asp

Asn Gly

Thr

Leu

Phe

Leu

Gly

Ile

Leu Lys

Asn

Trp

Lys Glu

Glu

Ser

Asp

Arg

Lys

Ile

Met Gin

Ser

Gin

Ile Val

Ser

Phe

Tyr

Phe

Lys

Leu

Fhe Lys

Asn

Phe

Lys Asp

Asp

Gin

Ser

Ile

Gin

Lys

Ser Val

Glu

Thr

Ile Lys

Glu

Asp

Met

Asn

Val

13

Lys

Phe Phe

Asn Ser Asn

Lys

Lys

Lys

Arg

Asp

Asp

Phe

Glu Lys

Leu Thr Asn

Tyr

Ser

Val

Thr

Asp

Leu

Asn

Val Gin

Arg Lys Ala

Ile

His

Glu

Leu

Ile

Gin

Val

Met Ala

Glu Leu Ser

Pro

Ala

Ala

Lys

Thr

Gly

Lys

Arg Lys

Arg Ser Gin

Met

Leu

Phe

Arg

Gly

Arg

Arg

Ala Ser

Gln-OH(C)

(V)

où Y représente Met ou une liaison chimique et Z^ et Z2 représentent chacun Cys ou 1/2 Cys. La protéine d'I-IF humain de la présente i.invention contient avantageusement ledit polypeptide à un degré de pureté non inférieur à 90 % et notamment non inférieur à 95 %, sur base sèche.

Une protéine d'interféron immunitaire humain produite par le procédé de la présente invention se caractérise de la façon suivante :

1) elle a un poids moléculaire de 17 000 + 1000 à 1'électrophorèse sur gel SDS-polyacrylamide (17/5 %) ;

2) elle contient de la cystéine ou de l'hémi-cystine ou de la méthionine comme amino-acide de terminaison amino ;

3) elle se combine avec un anticorps monoclonal contre H-Lys-Arg-Lys-Arg-Ser-Gln-Met-Leu-Phe-Gly-Arg-Arg-Ala-Ser-Gln-OH.

La protéine d'interféron humain produite conformément à la présente invention peut être utilisée aux mêmes fins et de la même manière que l'interféron I-IF obtenu par les procédés classiques. Par suite de sa plus faible teneur en impuretés protéiniques et en substance pyrogène/ on peut l'utiliser de façon plus sûre comme substance de préparation d'injections, par exemple.

La protéine d'I-IF humain de la présente invention est douée d'activité antivirale/ antitumorale, inhibitrice de prolifération des cellules et immuno-activatrice. La protéine d'I-IF humain de la présente

14

invention peut être utilisée, à des fins médicales,

telle quelle ou sous la forme d'un mélange avec de l'eau stérilisée,de la sérum albumine humaine (SAH), une solution physiologique de sel ou/et d'autres supports, véhicules ou diluants connus physiologiquement acceptables pour produire une composition pharmaceutique contenant ledit I-IF humain, et on peut l'administrer par voie parentérale ou localement. Par exemple, on peut l'administrer par voie intraveineuse ou intramusculaire ou par toute autre voie à une dose de 100 000 à 100 000 000 unités, de préférence de 50 000 000-60 000 000 unités, par humain adulte, par jour.

Les préparations pharmaceutiques contenant la protéine d'I-IF humain de la présente invention peuvent aussi contenir d'autres composants inertes physiologiquement acceptables tels qu'un sel, un diluant, un adjuvant, un autre support, un tampon, un liant, un surfactant et un préservateur. Pour l'administration parentérale, les préparations sont présentées sous la forme d'une suspension dans une solution aqueuse stérilisée ou dans un solvant physiologiquement acceptable en ampoules ou sous la forme d'une poudre stérilisée (pouvant en général être obtenue par lyophilisation d'une solution d'I-IF), devant être diluée avec un diluant avant l'usage.

En outre, les préparations contenant la protéine d'interféron immunitaire humain mentionnées ci-dessus peuvent encore contenir d'autres ingrédients actifs tels que IF-a ou IF-g ou une lymphokine (par exemple 1'interleukine 2) en une quantité de 1-99 %

sur la base de la substance de la présente invention.

Sur les dessins annexés :

- la figure 1 représente la carte de restriction pour le plasmide pHIT3709 obtenu dans l'exemple 1 (vii) la portion hachurée à hachures montant de gauche à droite indiquant la région qui dode pour un peptide qui est vraisemblablement le peptide signal et la portion hachurée à hachures descendant de gauche à droite indiquant la

15

région qui code pour le polypeptide I-IF.

- la figure 2 illustre la structure primaire (séquence des bases) de l'insertion dans le plasmide pHIT3709 obtenu dans l'exemple 1 (vii) ;

- la figure 3 représente le schéma de construction pour ptrp701 et ptrp771 décrits respectivement en (i) et (ii) dans l'exemple 2 ;

- la figure 4 est le schéma de construction de pHITtrp1101 décrit dans l'exemple 2 (iii) ;

- la figure 5 est le schéma de construction pour pHITtrp2101 décrit dans l'exemple 2 (iv) ;

- la figure 6 montre les résultats de 1'électrophorèse de l'exemple 6 (i) ; et

- la figure 7 montre les résultats de détermination du poids moléculaire dans l'exemple 6 (i).

La présente '.invention est illustrée en outre par les exemples pratiques et les exemples de référence suivants, mais ces exemples ne doivent pas être interprétés comme limitant la portée de la présente invention.

L'hybridome y 2 - 11.1 de souris B décrit dans les exemples de référence suivants a été déposé au C.N.C.M. de l'Institut Pasteur, Paris, FRANCE, sous le numéro de dépôt 1-242.

Exemple 1

(i) Isolement d'ARNm codant pour l'I-IF humain

On a fait incuber à 37°C des lymphocytes préparés à partir de sang humain périphérique, dans le milieu RPMI-1640 (contenant 10 % de sérum de foetus de veau) renfermant 15 ng/ml de 12-0-tétradécanoylphorbol-13-acétate (TPA) et 40 ug/ml de concanavaline A pour l'induction de I-IFN. Au bout de 24 heures, les lymphocytes

1 0

humains;iinduits de cette façon (1x10 cellules)

ont été détruits dans une solution de thioguanidine (thiocyanate de guanidine 5M, 5 % de mercaptoéthanol, chlorhydrate dè Tris 50 mM, pH 7,6, EDTA 10 mM) dans un homogénéiseur en "TefIon". Ensuite, du N-lauroyl sarcosinate de sodium a été ajouté à la concentration de 4 % et le mélange après homogénéisation a été déposé

16

sur 6 ml de chlorure de césium 5,7 M /chlorure de césium 5,7 M, éthylènediaminetétra-acétate (EDTA) 0,1 M/ et centrifugé à 15°C et à 24 000 tr/min pendant 30 heures en utilisant un rotor Beckman "SW27" pour obtenir un précipité d'ARN. Ce précipité d'ARN a été dissous dans du N-lauroyl sarcosinate de sodium à 0,25 % puis précipité avec de l'éthahol, ce qui a donné 8,3 mg d'ARN. On a laissé cet ARN se fixer par absorption, dans une solution de sel à forte concentration (NaCl 0,5M, chlorhydrate de Tris 10 mM ; pH 7,6, EDTA 1 mM, 0,3 % de SDS), sur une colonne d'oligo (dT) cellulose, et l'ARNm contenant la séquence poly(A) a été élué avec une solution de sel à faible concentration (chlorhydrate de Tris 10 mM, pH 7,6, EDTA 1 mM, SDS 0,3 %) pour obtenir 700 (j,g d'ARNm. Cet ARNm a été reprécipité à l'éthanol puis dissous dans 0,2 ml d'une solution (contenant du chlorhydrate de Tris 10 mM, à pH 7,6, de 11EDTA 2 mM, avec 0,3 %

de SDS) , la solution a été traitée à 65°C pendant 2 minutes et fractionnée par centrifugation dans un gradient de densité de 10 à 35 % de saccharose à 20°C et à 25 000 tr/min pendant 21 heures en utilisant un rotor Beckman "SW27",

i pour obtenir 22 fractions. Des portions aliquotes de chaque fraction ont été injectées dans des ovocytes de Xenopus laevis et les protéines synthétisées ont étéà titrées en vue de déterminer leur activité en interféron /"activité antivirale telle que déterminée par l'épreuve d'inhibition de l'effet cytopathique utilisant le virus de la stomatite vésiculaire sur des cellules WISH dérivées d'amnios humain (W.E. Stewart, The interferon System, Springer New York, 1979, page 11|7. On a constaté de cette manière que la fraction 12 (dont la constante de sédimentation est de 12-14S) avait une activité de 195 unités par jxg d'ARN. L'ARNm dans la fraction 12 ainsi obtenue pesait environ 20 ug.

(ii) Synthèse d'ARN à un seul brin

En utilisant l'ARNm ci-dessus et une trans-criptase réverse, on a fait incuber 100 ni d'un mélange réactionnel (5 pg d'ARNm, 50 p,g d'oligo (dT) , 100 unités

17

de transcriptase réverse, 1 mM de chacun des triphosphates dATP, dCTP, dGTP et dTTP, 8 mM de MgCl2, 50 mM de KC1, 10 mM de dithiothréitol et 50 mM de chlorhydrate de Tris ; pH 8,3) à 42°C pendant 1 heure puis on en a éliminé des protéines par addition de phénol et on a traité le mélange avec des l'hydroxyde de sodium décinormal à 70 °C pendant 20 minutes pour éliminer l'ARN par décomposition.

(iii) Synthèse d'ADN double-brin

L''ADN complémentaire à un seul brin ainsi synthétisé a été soumis à une réaction dans 50 p,l d'un mélange réactionnel (le même mélange que ci-dessus excepté que l'ARNm et l'oligo dT étaient absents) à 42°C pendant 2 heures pour synthétiser l'ADN double-brin.

(iv) Addition de queues dC

L'ADN double-brin a été traité avec la nucléase S1 dans 50 ul d'un mélange réactionnel (ADN double-brin, acétate de sodium 0,1 M, pH 4,5, NaCl 0,25 M, ZnSO^ 1,5 mM, 60 unités de nucléase S1) à la température ambiante pendant 30 minutes. Le mélange réactionnel a été débarrassé des protéines par addition de phénol et l'ADN a été précipité à l'éthanol. L'ADN ainsi obtenu a été amené à réagir avec la transférase terminale dans 50 m,1 d'un mélange réactionnel (ADN double-brin, cacodylate de potassium 0,14 M, Tris (base) 0,3 M (pH 7,6), dithiothréitol 2 mM, CoCl2 1 mM, dCTP 0,15 mM, 30 unités de transférase terminale) à 37°C pendant 3 minutes en vue de l'allongement de l'ADN double-brin d'environ 20 motifs déoxycytidine à chaque extrémité 3' de l'ADN. Cette série de réactions a donné environ 300 ng d'ADN double-brin à queues de déoxycytidine.

( v) Clivage d'un plasmide d'Escherichia coli et addition de queues dG

On a traité séparément 10 tig d'ADN de plasmide PBR 322 d'Escherichia coli avec l'enzyme de restriction PstI dans 50 jjlI d'un mélange réactionnel / 10 |ig d'ADN,

NaCl 50 mM, chlorhydrate de Tris 6 mM (pH 7,4), MgCl2 6 mM, 2-mercaptoëthanol 6 mM, 100 jxg/mg de sérum-albumine

18

de boeuf, 20 unités de FstI/ à 37°C pendant 3 heures en vue du clivage au niveau du site unique de reconnaissance de PstI dans l'ADN de pBR322, on a ensuite éliminé les protéines du mélange réactionnel avec du phénol et on a encore soumis l'ADN à un traitement à la transférase terminale dans 50 jil d'un mélange réactionnel /—10 jj,g d'ADN, cacodylate de potassium 0,14 M, Tris (base) 0,3 M, pH 7,6, dithiothréitol 2 mM, CoCl2 1 mM, dGTP 0,15 mM, 30 unités de transférase terminale/ à 3 7°C pendant 3 minutes pour l'allongement de l'ADN de plasmide de pBR322 ci-dessus d'environ 8 motifs de déoxyguanidine à chacune de ses extrémités 3'.

(vi) Renforcement de l'ADNc et transformation d'Escherichia coli

On a effectué le renforcement en chauffant 0,1 ng de l'ADN double-brin synthétique ainsi obtenu et 0,5 |ig du plasmide pBR322 ci-dessus dans une solution contenant 0,1M de NaCl, 50 mM de chlorhydrate de Tris, à pH 7,6, 1 mM d'EDTA, à 65°C pendant 2 minutes puis à 45°C pendant 2 heures, l'opération étant suivie d'un refroidissement progressif. La transformation d'Escherichia coli X1776 a été effectuée selon la méthode d'Enea et collaborateurs /~J. Mol. Biol. 96, 495 (1975j_7.

(vii) Isolement du plasmide contenant l'ADNc

Environ 8500 colonies résistant à la tétra-cycline ont été isolées de la sorte et l'ADN de chaque colonie a été fixé à un filtre de nitrocellulose (M. Grunstein et D.S. Hogness, Proc. Natl. Acad. Sci. Etats-Unis d'Amérique, 12_, 3961 (1975J_7-

En procédant séparément, sur la base de la séquence d'amino-acides de IF-y rapportée par D.V. Goeddel et collaborateurs /""Nature, 295, 503 (1982YJ, on a utilisé la méthode du triester R. Créa et collaborateurs, Proc. Natl. Acad. Sci. Etats-Unis d'Amérique, 75, 5765 (1978}/ pour effectuer la synthèse chimique de

A A

deux oligonucléotides de 5'TCCTGGCAGTAGC3' et

19

G G T T

5'ACATTCATATCCTCCT3' correspondant vraisemblablement et respectivement aux amino-acides n° 1-5 (Cys. Try.

Cys. Gin. Asp.) et aux amino-acides n° 77-82 (Lys. Gin.

Asp. Met. Asn. Val.) de ladite séquence d'I-IFN. Ces oligonucléotides ont été traités avec la polynucléotide kinase de T4 dans 50 |il d'un mélange réactionnel (0,2 ng d'oligonucléotide, 50 mM de chlorhydrate de Tris pH 8,0,

32

10 mM de MgC^, 10 mM de mercaptoéthanol, 50 fiCi de y-

P ATP, 3 unités de polynucléotide kinase de T4) à 37°C

pendant une heure. Ces oligopeptides ainsi marqués au 32

phosphore P à l'extrémité 5' ont été utilisés comme sondes et renforcés avec l'ADN sur le filtre de nitro-cellulose mentionné ci-dessus par la méthode de Lawn et collaborateurs /"Nucleic Acids Res., 9, 6103 (1981|7. Quatre souches ont été isolées par auto-radiographie;

elles étaient réactives envers les deux sondes oligo-nucléotidiques ci-dessus.

Des ADN plasmidiques ont été isolés des cellules bactériennes de chacune de ces souches par la méthode à l'alcali £~H.C. Birnboim et J. Doly, Nucleic Acids Res., 1_, 1513 (1979J_/. Les insertions dans les ADN plasmidiques ont été excisées avec l'enzyme de restriction PstI. Parmi les plasmides isolés, on a choisi celui qui contenait l'insertion la plus longue et on l'a nommé "pHIT3709".

La structure (séquence de bases) de la séquence d'ADNc insérée dans le plasmide pHIT3709 a ensuite été déterminée par la méthode de terminaison des chaînes synthétiques de dinucléotides et par la méthode de Maxam-Gilbert. Ladite structure primaire était telle que représentée sur la figure 2 (on renvoie à la demande de brevet monégasque N° 1626 déposée le 24 mars 1983 au nom de la Demanderesse).

La séquence de bases de la région codante de IF-y (codon n° S1 à n° 146) de pHIT3709 était identique à celle qui est représentée sur la figure 3 de Nucleic Acids Res., JJO, 2487 et suivantes (1982).

20

Exemple 2

(1) Le plasmide ptrp601 (le vecteur étant pBR322)

contenant la portion constituant le promoteur pour la synthèse du tryptophane dans Escherichia coli /"fragment d'ADN contenant promoteur et opérateur, 276 paires de bases, G.N. Bennett et collaborateurs, J. Mol. Biol., 121, 113 (1978]_7 a été construit en tant que plasmide d'expression.

Le plasmide pBR322 a été coupé séparément avec les enzymes de restriction EcoRI et Aval. Les extrémités collantes ainsi obtenues du fragment EcoRI-Aval qui contenait le gêne résistant à la tétracycline ont été réunies avec le grand fragment d'ADN polymérase I. La conjugaison de ce fragment au site de clivage par PvuII de ptrp601 a été rendue possible au moyen d'ADN ligase de T4. Le plasmide ptrp701 a été construit de cette façon, (figure 3).

(ii) En vue d'exclure chacun des. deux sites de clivage par l'enzyme de restriction Clal présents dans ptrp701, on a soumis ce plasmide à un traitement de décomposition partielle avec Clal pour obtenir un plasmide ptrp701 dans lequel chacun des deux sites de clivage par Clal avait été coupé. Après réunion des extrémités collantes avec' le grand fragment de l'ADN polymérase I,

le plasmide ptrp701 ainsi obtenu a été de nouveau conjugué en utilisant l'ADN ligase de T4 pour former le plasmide ptrp771 (figure 3).

(iii) Le plasmide pHIT3709 a été coupé avec l'enzyme de restriction PstI pour former le fragment PstI contenant le gêne structural de IF-y. Ce fragment a ensuite été soumis à la digestion partielle par l'enzyme de restriction BstNI pour former le fragment BstNI-PstI qui a été coupé

au niveau du site BstNI présent dans le gène structural de IF-y. Les extrémités collantes du site de clivage de BstNI ont été assemblées avec le grand fragment d'ADN polymérase I. Le fragment ainsi obtenu et l'adapteur oligonucléotidique

21

"'CGATAATGTGTTACTGCC TATTACACAATGACGG

qui a été synthétisé chimiquement par la méthode au triester mentionnée ci-dessus et qui contient le codon ATG de départ de synthèse de la protéine, ont été réunis par ligation au moyen d'ADN ligase de T4.

Le gène d'IF-y réuni par ligation avec l'adapteur mentionné ci-dessus a été inséré séparément dans le site Pstl-Clal du vecteur plasmidique ptrp771 en aval du promoteur de tryptophane, en utilisant l'ADN ligase de T4. On a ainsi construit un plasmide pHITtrp1101 d'expression de IF-y (figure 4).

(iv) Le plasmide pHITtrp2101 a été construit par un perfectionnement du plasmide pHITtrp1101, comme indiqué ci-après,

Le.plasmide ptrp601 a tout d'abord été traité avec les enzymes de restriction Clal et Hpall pour former 0,33 kb du fragment Clal-Hpall contenant le promoteur trp. Ce fragment a été fixé par ligation à pHITtrp1101 qui a été coupé avec Clal et traité avec une phosphatase alcaline, en utilisant l'ADN ligase de T4. On a ainsi obtenu le plasmide pHITtrp2101 contenant deux promoteurs trp successifs (figure 5).

On a obtenu une souche E. coli 294/pHIT.trp.2101 par transformation d'Escherichia coli 294 avec le plasmide pHIT.trp2101 par la méthode décrite par Cohen et collaborateurs (voir ci-dessus).

Exemple 3

On a fait incuber E. coli 294/pHITtrp2101 dans 200 ml de milieu M9 contenant 8 (j,g/ml de tétracycline, 0,4 % de casamino acide et 1 % de glucose dans un ballon d'un litre, à 37°C. Lorsque la croissance des bactéries a atteint le stade KU220, on a ajouté de l'acide 3 g-indolylacrylique (IAA) à une concentration de 30 |ig/ml et on a poursuivi 1'incubation du mélange pendant 4 heures.

22

Exemple 4

Après avoir centrifugé 1,2 1 de la solution de culture obtenue dans l'exemple 3, on a recueilli les cellules et on les a mises en suspension dans 60 ml de chlorhydrate de Tris 0,05 M (pH 7,6) contenant 10 % de saccharose. On a ajouté à cette suspension 0,3 ml de fluorure de phénylméthylsulfonyle (PMSF) 0,2 M, 24 ml de solution de NaCl 5M, 2,4 ml d'éthylènediamine tétra-acétate (EDTA) 0,2 M, 2,4 ml de spermidine 1 M et 2,4 ml de lysozyme (5 mg/ml). On a laissé reposer le mélange à 0°C pendant une heure, on l'a fait incuber à 37°C pendant 5 minutes et on l'a ensuite détruit à 0°C pendant 30 secondes en utilisant un désintégrateur ultrasonore ARTEK (Etats-Unis d'Amérique).

Cette solution de lysat a été centrifugée à 105 000 x g pendant 1 heure pour recueillir 66 ml de liqueur surnageante.

Exemple 5

On a dilué 60 ml de la liqueur surnageante obtenue dans l'exemple 4 avec du chlorhydrate de Tris 20 mM contenant de l'EDTA 1 mM et du NaCl 0,15 M (pH 7,6) (solution TEN) pour ajuster le volume à 150 ml et on a soumis la dilution à l'action d'une colonne d'anticorps anti-IF-y (9 ml) préparée par la méthode décrite dans l'exemple de référence 10. La colonne a été lavée corEecte ment avec la solution TEN puis avec cette même solution contenant 0,01 % de "Nonidet P-40" (Shell) et du chlorure de sodium 0,5 M. Ensuite, on a élué l'IF-y avec de l'acide acétique 0,1 M contenant du chlorure de sodium 0,25 M. L'éluat a été immédiatement neutralisé avec du chlorhydrate de Tris 1 M (pH 7,6) . La solution résultante a été dialysée vis-à-vis d'eau distillée à 4°C pendant 16 heures et, après congélation avec un mélange d'acétone et de neige carbonique, elle a été lyophilisée en donnant une poudre.

Les résultats obtenus sont reproduits ci-

dessous ;

23

Protéine Activité Activité spé- Taux de ré-

(mg) totale cifique cupération (U) (U/mg) (%)

Liqueur surnageante r

5 du lysat 250,8 4x10a 1,6x10b

Après traitenent sur la colonne d'anti- 7

corps 2,0 1,5x10 7,5x10 37,5

L'activité spécifique de la protéine d'inter-

10 féron immunitaire humain ainsi obtenue comme produit final [sur la base de la détermination de l'activité

virale par l'épreuve d'inhibition de l'effet cytopathique en utilisant des cellules VSV et WISH (comme décrit ci-

7

dessus dans le présent mémoire)] a été de 7,5 x 10 U/mg. 15 La caractérisation de cette protéine est mentionnée ci-dessous .

Exemple 6

Caractérisation de la protéine d'interféron immunitaire humain 20 (i) Poids moléculaire

La protéine obtenue dans l'exemple 5 a été traitée avec du 2-mercaptoéthanol, soumise à une électrophorèse (15 mV, 6 heures) sur gel de SDS-polyacrylamide (17,5 %) et colorée au bleu Coomassie. La protéine a pu être 25 identifiée par une bande unique (figure 6). D'après la relation qui existe entre, la distance de migration des marqueurs de poids moléculaire simultanément soumis à 1*électrophorèse et la distance de migration de la protéine, le poids moléculaire de la protéine a été 30 estimé . égal à 17 000 + 1000 (figure 7). Pour la protéine non traitée au 2-mercaptoéthanol, on a détecté une bande additionnelle dans une position correspondant à un poids moléculaire de 33 000 + 2000. Cette valeur est environ deux fois le poids moléculaire de IF-y , à savoir 35 17 000 + 1000, ce qui donne à penser que la bande est due à la présence de IF-y dimérisé.

(ii) Analyse des amino-acides

Une portion aliquote de la protéine obtenue dans l'exemple 5 a été placée dans un tube en verre en

24

vue de l'hydrolyse et .une quantité 200 fois plus grande (en poids/volume) d'acide chlorhydrique contenant 4 % d'acide thioglycolique, à point d'ébullition constant,

a été ajoutée. Le tube a été scellé sous pression réduite et l'hydrolyse a été conduite à 110°C pendant 24, 48 et 72 heures. Après chaque hydrolyse, le tube a été ouvert, l'acide chlorhydrique a été chassé sous pression réduite et le résidu a été dissous dans de l'acide chlorhydrique 0,02 N et analysé au moyen d'un analyseur d'amino-acides à grande'vitesse, Hitachi modèle 835.

Pour le dosage de la cystine et de la cystéine, la protéine ci-dessus a été oxydée à l'acide performique conformément aux indications données par Hirs et collaborateurs [Methods in Enzymology, 1J_, 197, (1967)] et elle a été hydrolysée de la même manière que ci-dessus pendant 24 heures, et l'acide cystéinique a été dosé quantitativement en utilisant l'analyseur d'amino-acides. La moyenne de trois valeurs obtenues après 24, 48 et 72 heures d'hydrolyse a été utilisée comme valeur trouvée pour chaque amino-acide excepté pour la sérine, la thréonine, la thyrosine et le tryptophane, pour lesquels les valeurs ont été estimées par extrapolation à 0 heure de la période d'hydrolyse. Les résultats sont reproduits sur le tableau II.

TABLEAU II

Amino-acide•détecté

Moles,%

Amino-acide détecté

Moles, %

Acide aspartique

13,4

Méthionine

2,9

Thréonine

3,6

Isoleucine

4,8

Sérine

7,4

Leucine

6,8

Acide glutamique

12,5

Thyrosine

' 3,4

Proline

1,4

Phénylalanine

6,7

Glycine

3,8

Lysine

13,5

Alanine

5/3

Histidine

1,5 •

Acide cystéique

1/3

Arginine

5,4

Valine

5,7

Tryptophane

0,9

(iii) Analyse des amino-acides de terminaison amino

La protéine obtenue dans 1'exemple 13a été oxydée à l'acide performique conformément à la méthode

25

décrite par Hirs et collaborateurs £~Methods in Enzymo-loÇfY/ H/ 197 (1967V7" puis elle a été soumise à l'analyse des amino-acides de terminaison amino selon la version modifiée par Edman de la méthode de dégradation d'Iwanaga et collaborateurs /~~Eur. J. Biochem., 8, 189 (1969j_7-Les phénylthiohydantoïne -amino-acides résultants (PTH-amino-acides) ont été identifiés et dosés quantitativement sur un chromatographe en phase liquide à haute performance Varian .(Etats-Unis d'Amérique), modèle 5040 en utilisant une colonne Ultra-sphère-ODS (Altex, Etats-Unis d'Amérique ; 4,6 x 250 mm, diamètre des particules 5 p,m) par la méthode d'Archer et collaborateurs, £~,Altex Chromatogram, 3^, 8 (19801/. On a ainsi détecté la sulfone de PTH-méthionine et l'acide PTH-cystéique.

Comme le font ressortir les exemples mentionnés ci-dessus, des protéines d'interféron immunitaire humain à l'état pratiquement pur ayant, une activité spécifique

7

au moins égale à 7,5 x 10 U/mg peuvent être produites conformément à la présente invention.

Exemple 7

Préparation injectable

On dissout 5 mg de protéine d'I-IF humain de la présente invention (activité spécifique égale à

7

2 x 10 U/mg) dans 100 ml de sérum albumine humaine à 5 %. On filtre la solution en utilisant un filtre à membrane (diamètre des pores : 0,2 (im) et on la distribue dans 100 fioles, dans des conditions aseptiques. La solution contenue dans les fioles est lyophilisée dans des conditions aseptiques en donnant des préparations injectables à usage extemporané.

La préparation est dissoute dans 1 ml d'eau distillée avant l'usage.

Dans les exemples de référence suivants, on a effectué la chromatographie sur couche mince en utilisant des plaques de gel de silice 60F2^4 Merck ou des plaques de cellulose AVICEL SF de Funakoshi Yakuhin, avec les solvants de développement mentionnés ci-dessous :

26

1

Rf : Chloroforme-méthanol-acide acétique = 9:1:0,5

2

Rf : Acétate d"éthyle-pyridine-acide acétique-eau = 30:10:3:5

3

Rf : Chloroforme-méthanol-eau = 7:3:0,5

4

Rf : n-butanol-pyridine-acide acétique-eau = 30:20:6:24

5

Rf Acétate d'éthyle-n-butanol-acide acétique-eau = 1:1:1:1.

Exemple de référence 1 (i) Production de Z-Ser-Gln-OBu*"

On a dissous 10,1 g de Z-Gln-OBut dans 500 ml de méthanol et on a conduit une réduction catalytique dans un courant d'hydrogène gazeux en utilisant du noir de palladium comme catalyseur. Le catalyseur a été enlevé par filtration et le solvant a été chassé par distillation. Le résidu a été dissous conjointement avec 7,5 g de Z-Ser-OH et 6,8 g de HONB dans 250 ml de DMF et la solution a été refroidie avec de la glace. On a ajouté 7,15 g de DCC en refroidissant à la glace et on a agité le mélange à 0°C pendant 4 heures et à la température ambiante pendant 12 heures. La DCU formée a été enlevée par filtration et le solvant a été chassé par distillation. Le résidu a été extrait avec 300 ml d'AcOEt et l'extrait a été lavé avec du bicarbonate de sodium aqueux à 4 %, de l'acide chlorhydrique 0,2 N et de l'eau dans l'ordre indiqué, et il a été déshydraté sur du sulfate anhydre de sodium. Le solvant a ensuite été chassé par distillation et le précipité cristallin résultant a été recueilli par filtration, séché et recristallisé dans de l'acétonitrile. Rendement 6,5 g (51,2 %), point de fusion 97-100°C, /~o,7q5= -24,1° (c = 0,40, méthanol) Rf1 = 0,64.

Analyse élémentaire :

Calculé pour C20H29°7N3

C, 56,72 % ; H, 6,90 % ; N, 9,92 %

Trouvé C, 56,21 % ; H, 6,72 % ; N, 9,76 %

27

t

(ii) Production de Z-Ala-Ser-Gln-OBu

On a dissous 4,23 g de Z-Ser-Gln-OBu*" dans 300 ml de méthanol et on a procédé à la réduction cata-lytique dans un courant d'hydrogène gazeux en utilisant le noir de palladium comme catalyseur. Le catalyseur a été séparé par filtration et le solvant a été chassé par distillation. Le résidu a été dissous conjointement avec 2,34 g de Z-Ala-OH et 2,27 g de HONB dans un solvant mixte composé de 200 ml d'AcOEt, 200 ml de dioxanne et 100 ml de DMF, et la solution a été refroidie à la glace. On a ajouté 2,38 g de DCC en refroidissant et on a agité le mélange à 0°C pendant 4 heures et à la température . ambiante pendant 12 heures. La DCU a été séparée par filtration et le solvant a été chassé par distillation. On a ajouté de 1'acétonitrile et de l'éther au résidu et on a recueilli par filtration le précipité ' cristallin .'résultant, on l'a séché et on l'a recristallisé dans de 1'acétonitrile. Rendement 3,72 g (75,3 %) , p.f. 165-170°C, /~a7^5= -41,2° (c = 0,50, méthanol), Rf1 = 0,60.

Analyse élémentaire :

Calculé pour C23H34°8N4 :

C, 55,86 % ; H, 6,93 % ; N, 11,33 %

Trouvé C, 55,58 % ; H, 6,74 % ; N, 11,12 %

+-

(iii) Production de Z-Arg(Pme)-Ala-Ser-Gln-OBu

On a dissous 3,46 g de Z-Ala-Ser-Gln-OBut dans 300 ml de méthanol et on a effectué la réduction catalytique dans un courant d'hydrogène gazeux en utilisant le noir de palladium comme catalyseur. Le catalyseur a été enlevé par filtration et le solvant a été chassé par distillation. Le résidu a été dissous dans 150 ml de DMF conjointement avec du Z-Arg (Pme)-OH /""préparé à partir de 4, 54 g de Z-Arg(Pme)-OH.CHA7 et 1,9 g de HOBt, et la solution a été refroidie à la glace. On a ajouté 1,9 g de DCC et on a agité le mélange à 0°C pendant 4 heures et à la température ambiante pendant 15 heures. La DCU a été enlevée par filtration et le solvant a été chassé par distillation. On a ajouté de

28

l'acétate d'éthyle au résidu et on a recueilli par filtration le précipité résultant, on l'a séché et on l'a reprécipité dans du méthanol et de l'acétate d'éthyle. Rendement 4,55 g (75,5 %) , p.f. 130-134°C, /"W^5 = -24,1° (c = 0,26, méthanol), Rf"* 0,57.

Analyse élémentaire :

Calculé pour C4ûHg0O1^gS.1/2H20 :

C, 55,22 % ; H, 7,07 % ; N, 12,88 % ; S, 3,69 Trouvé C, 55,23 % ; H, 6,93 % ; N, 12,54 % ; S, 3,48

(iv) Production de Z-Arg(Pme)-Arg(Pme)-Ala-Ser-Gln-OBut

On a dissous 4,3 g de Z-Arg(Pme)-Ala-Ser-Gln-OBu*" dans 400 ml de méthanol et on a procédé à la réduction catalytique dans un courant d'hydrogène gazeux en utilisant le noir de palladium comme catalyseur. Le catalyseur a été enlevé par filtration et le solvant a été chassé par distillation. Le résidu a été dissous dans 2 00 ml de DMF conjointement avec du Z-Arg (Pme)-OH /""préparé à partir de 3,24 g de Z-Arg(Pme)-OH.CHA7 et 1,42 g de HOBt et la solution a été refroidie à la glace. On a ajouté 1,41 g de DCC et on a agité le mélange à 0°C pendant 4 heures et à la température ambiante pendant 20 heures. La DCU a été enlevée par filtration et le solvant a été chassé par distillation. On a ajouté de l'acétate d'éthyle au résidu et on a recueilli par filtration le précipité résultant, on l'a séché et on l'a reprécipité dans du méthanol et de 1'acétate d'éthyle. Rendement 4,4 g

(71,7 %), p.f. 125-130°C, /"a7n5= -18,0° (c = 0,40,

1

méthanol), Rf 0,63.

Analyse élémentaire :

Calculé pour C57Hgg01^2S2.H20

C, 54,96 % ; H, 7,12 % ; N, 13,50 % ; S, 5,15 Trouvé C, 54,66 % ; H, 6,92 % ; N, 13,32 % ; S, 5,34

(v) Production de Z-Arg (Pme)-Gly-OBu*"

t

On a dissous 13,0 g de Z-Gly-OBu dans 500 ml de MeOH et on a procédé à la réduction catalytique dans un courant d'hydrogène gazeux en utilisant le noir de palladium comme catalyseur. Le catalyseur a été enlevé par filtration et le filtrat a été concentré sous pression

29

réduite. Le résidu a été dissous dans 200 ml de DMF et additionné de Z-Arg (Pme)-OH /""préparé à partir de 20,0 g de Z-Arg (Pme)-OH. CHA.7 et de 5,4 g de HOBt, l'addition étant suivie d'un refroidissement à la glace. On a ajouté 8,2 g de DCC et on a agité le mélange pendant 48 heures. La DCU formée a été enlevée par filtration et le filtrat a été concentré. Le résidu a été dissous dans 500 ml d'acétate d'éthyle et la solution ainsi obtenue a été lavée avec une solution aqueuse à 4 % de bicarbonate de sodium et une solution aqueuse à 10 % d'acide citrique, déshydratée sur du sulfate de sodium et concentrée. De l'éther de pétrole a été ajouté et le précipité a été recueilli par filtration. Rendement 19,8 g (96,8 %), p.f. 71-73°C, /"a/*3 = * 0,2° (c = 0,9, DMF),, Rf1 0,62.

Analyse élémentaire Calculé pour C^H^gO^N^S :

C, 58,93 % ; H, 7,18 % ; N, 11,09 % ; S, 5,08 Trouvé C, 59,42 % ; H, 7,58 % ; N, 10,95 % ; S, 4,84

(vi) Production de Z-Phe-Arg(Pme) -Gly-OBut

■ +-

On a dissous 10,0 g de Z-Arg(Pme)-Gly-OBu dans 500 ml de MeOH et on a procédé à la réduction catalytique. Le produit a ensuite été dissous dans 300 ml de DMF. On a ajouté 4,72 g de Z-Phe-OH et 2,35 g de HOBt et on a refroidi le mélange avec de la glace. On a ajouté 3,59 g de DCC et on a agité le mélange entier pendant 15 heures. La DCU formée a été séparée par filtration et le filtrat a été concentré. Le résidu a été dissous dans 400 ml d'acétate d'éthyle et la solution ainsi obtenue a été lavée avec du bicarbonate de sodium aqueux à 4 % et de l'acide citrique aqueux à 10 %, déshydratée sur du sulfate-ide sodium et concentrée• On a ajouté de l'éther et on a recueilli par filtration le précipité cristallin, résultant, et on l'a fait recristalliser dans un mélange MeOH-éther. Rendement 10,5 g (85,3 %), p.f. 101 -103°C /cÏ_7q6 = ~ 8,3° (c = 0,9, DMF), Rf1 0,64

30

Analyse élémentaire Calculé pour C^QHg^OgNgS :

C, 61,67 % ; H, 6,99 % ; N, 10,79 % ; S, 4,12 Trouvé C, 61,66 % ; H, 6,56 % ; N, 10,93 % ; S, 4,14

(vii) Production de Z-Leu-Phe-Arg (Pme) -Gly-OBu1"

On a réduit catalytiquement 5,5 g de Z-Phe-+-

Arg(Pme)-Gly-OBu dans 300 ml de MeOH puis on l'a dissous dans 300 ml de DMF. On a ajouté du Z-Leu-OH (préparé à partir de 3,31 g de Z-Leu-OH.DCHA) et 1,47 g de HONB et on a refroidi le mélange avec de la glace. On a ajouté 1,68 g de DCC et on a agité le mélange entier pendant 48 heures. La DCU formée a été enlevée par filtration et le filtrat a été concentré. Le résidu a été dissous dans 300 ml de AcOEt et la solution ainsi obtenue a été lavée avec du bicarbonatée!de sodium aqueux à 4 % et de l'acide citrique aqueux à 10 %, déshydratée sur ^£30^ et concentrée. On a ajouté de l'éther et on a recueilli le précipité par filtration. Rendement 6,2 g (98,3 %), p.f. 171-173°C, /â_7p6 = - 15,5° (c = 0;9, DMF), Rf1 0,64. Analyse élémentaire Calculé pour C^gHg^O^N^S :

C, 61,93 % ; H, 7,34 % ; N, 10,99 % ; S, 3,59 Trouvé C, 62,02 % ; H, 7,37 % ; N, 11,08 % ; S, 3,59

(viii) Production de Boc-Met-Leu-Phe-Arg(Pme)-Gly-OBut

On a réduit catalytiquement 6,0 g de Z-Leu-t

Phe-Arg(Pme)-Gly-OBu dans 200 ml de méthanol et on l'a ensuite dissous dans 150 ml de DMF. On a ajouté du Boc-Met-OH (préparé à partir de 3,0 g de Boc-Met-OH.DCHA) et 1,39 g de HONB et on a refroidi le mélange avec de la glace. On a ajouté 1,59 g de DCC et on a agité le mélange entier pendant 15 heures. La DCU formée a été enlevée par filtration et le filtrat a été concentré. Le résidu a été dissous dans un mélange de n-butanol et d'acétate d'éthyle et la solution a été lavée avec de l'acide citrique aqueux à 10 %, déshydratée sur du sulfate de sodium et concentrée. On a ajouté de l'éther puis on a recueilli les cristaux par filtration. Rendement 6,2 g (93,1 %), p.f. 192-195°C, /â_7p6 = " 19,7°

31

(c = 1,0, DMF), Rf1 0,64.

Analyse élémentaire

Calculé pour C48H76°1oN8S2 :

C, .58,27 % ; H, .7,74 % ; N, 11,33 % ; S, 6,48 Trouvé C, 58,48 % ; H, 7,79 % ; N, 11,34 % ; S, 5,98

(ix) Production de Boc-Gln-Met-Leu-Phe-Arg(Pme)-Gly-OH

On a ajouté à 5,5 g de Boc-Met-Leu-Phe-Arg (Pme) -Gly-OBu*" 50 ml de TFA et on a agité le mélange par secousses à la température ambiante pendant 10 minutes puis on l'a concentré. On a ajouté de l'éther et on a recueilli le précipité par filtration puis on l'a séché. On l'a dissous dans 50 ml de DMF et on a refroidi la solution avec de la glace puis on y a ajouté 1,8 ml de TEA. On a ajouté du Boc-Gln-ONB (préparé à partir de 1,85 g de Boc-Gln-OH, 1,49 g de HONB et 1,90 g de DCC) et on a agité le mélange pendant 15 heures puis on l'a concentré. On a ajouté de l'acide acétique puis de l'acétate d'éthyle et on a recueilli par filtration le précipité résultant. Rendement 5,3 g (89,8 %) , p.f. 181 -183 °c (décomposition.) , /-o7q6 = - 19,6° (c = 1,0, DMF), Rf1 0,30.

Analyse élémentaire

Calculé pour C49H760-| 2N1 0S2 :

C, 55,45 % ; H, 7,22 % ; N, 13,20 % ; S, 6,04

Trouvé C, 55,39 % ; H, 7,17 % ; N, 13,34 % ; S, 6,20

x) Production de Z-Ser-NHNH-Boc

On a dissous 10,0 g de Z-Ser-OH et 6,2 g de carbazate de tertio.-butyle dans 150 ml de diméthylfor-mamide et on a refroidi la solution à la glace. On a ajouté 8,0 g de HONB et 9,3 g de DCC et on a agité le mélange pendant 15 heures. La DCU formée a été enlevée par filtration et le filtrat a été concentré. Le résidu a été extrait à l'acétate d'éthyle et la solution dans l'acétate d'éthyle a été lavée avec du bicarbonate de sodium aqueux à 4 % et de l'acide citrique aqueux à 10 %, déshydraté sur Na^O^ et concentré. On a ajouté de l'éther et on a recueilli les cristaux par filtration. Rendement 7,3 g (50,4 %), p.f. 95-98°C, /~a7o6 = ~ 6,2° (c = 0,8, DMF), Rf1 = 0,62.

32

Analyse élémentaire :

Calculé pour C„_H„_0,.N :

c 16 23 6 3

C, 54,38 % ; H, 6,56 % ; N, 11,89 %

Trouvé : C, 54,77 % ; H, 6,88 % ; N, 12,29 %

(xi) Production de Z-Arg(Pme)-Ser-NHNH-Boc

3,9 g de Z-Ser-NHNH-Boc ont été réduits catalytiquement dans 300 ml de MeOH puis dissous dans 50 ml de DMF. On a ajouté du Z-Arg (Pme)-OH /""préparé à partir de 6,2 g de Z-Arg (Pme)-OH.CHA.7 et 1,5 g de HOBt et on a refroidi le mélange à la glace. On a ajouté 2,3 g de DCC et on a agité le mélange entier pendant 15 heures. La DCU formée a été séparée par filtration et le filtrat a été concentré. Le résidu a été dissous dans de l'acétate d'éthyle et la solution dans l'acétàte d'éthyle a été lavée avec du bicarbonate de sodium aqueux à 4 % et de l'acide citrique à 10 %, déshydratée sur du sulfate de sodium et concentrée. De l'éther a été ajouté et le' précipité résultant a été recueilli par filtration. Rendement 7,45 g (93,7 %), p.f. 100-101°C, /ô7q6= 0,9. (c = 1,2, DMF) , Rf1 = 0,51.

Analyse élémentaire :

Calculé pour CggH^OgN.^ :

C, 55,06 % ; H, 6",86 % ; N, 13,62 %; S, 4,46 % Trouvé C, 55,49 % ; H, 6/94 % ; N, 13,14 %; S, 3,86 %

(xii) Production de Z-Lys(Mtr)-Arg(Pme)-Ser-NHNH-Boc

On a dissous 3,9 g de Z-Arg(Pme)-Ser-NHNH-Boc dans 300 ml de MeOH et on a effectué une réduction catalytique. Le produit a été dissous dans 50 ml de DMF,

et la solution a été additionnée de Z-Lys(Mtr)-OH /_ préparé à partir de 3,4 g de Z-Lys(Mtr)-OH.DCHA7 et de 0/88 g de HOBt. Le mélange a été refroidi à la glace et additionné de 1,34 g de DCC. Le mélange entier a été agité pendant 20 heures. La DCU formée a été séparée par filtration et le filtrat a été concentré. Du AcOEt a été ajouté et le précipité pulvérulent a été recueilli par filtration et .recristallisé dans un mélange MeOH-AcOEt. Rendemant 5,1 g (93,4 %), p.f. 103-105°C/ /~a7p6- 7,2° (c = 0,8, DMF), Rf1 0,57.

Analyse élémentaire :

Calculé pour e^H^O^ 3NgS2 ;

C, 55,50 % ; H, 6,94 % ; N, 11,89 % ; S, 6^05 % Trouvé C, 55,70 % ; H, 7,15 % ; N, 11,60 % ; S, 5,63 %

(xiii) Production de Z-Arg(Pme)-Lys(Mtr)-Arg(Pme)-Ser-NHNH-Boc

On a dissous 4,8 g de Z-Lys(Mtr)-Arg(Pme)-Ser-NHNH-Boc dans 300 ml de MeOH et on a effectué une réduction catalytique. Le produit a été dissous dans 70 ml de DMF et additionné de Z-Arg(Pme)-OH /préparé à partir de 2,8 g de Z-Arg(Pme)-OH.CHA/ et de 0,74 g de HOBt Le mélange a été refroidi à la glace et additionné de 1,12 g de DCC. Le mélange entier a été agité pendant 15 heures. La DCU formée a été séparée par filtration et le filtrat a été concentré. Le résidu a été dissous dans du AcOEt et la solution dans le AcOEt a été lavée avec du bicarbonate de sodium aqueux à 4 % et de l'acide citrique aqueux à 10 %, déshydratée sur Na2S04 et concentrée. De l'éther a été ajouté, et le précipité résultant a été recueilli par filtration et reprécipité dans un mélange MeOH-éther. Rendement 5,8 g (89,8 %), p.f. 136-137°C /""o/p6- 6,6° (c = 1,0, DMF), Rf1 0,58.

Analyse élémentaire :

Calculé pour CggHggO^gN^3S3 :

C, 55,56 % ; H, 6,99 % ; N, 12,76 % ; S, 6,74 % Trouvé C, 55,34 % ; H, 7,07 % ; N,.1-2,50 % ; S, 6,59 %

(Xiv) Production de Z-Lys(Mtr)-Arg(Pme)-Lys(Mtr)-Arg(Pme)-Ser-NHNH-Boc

On a dissous 3,0 g de Z-Arg(Pme)-Lys(Mtr)-Arg(Pme)-Ser-NHNH-Boc. dans 150 ml de MeOH et on a effectué une réduction catalytique. Le produit a été dissous dans 60 ml de DMF et additionné de Z-Lys (Mtr) -OH J_ préparé à partir de 1,54 g de Z-Lys (Mtr)-OH. DCHA.7 et de 0,31 g de HOBt. Le mélange a été refroidi à la glace et additionné de 0,57 g de DCC. Le mélange entier a été agité pendant 15 heures. La DCU formée a été séparée par filtration et le filtrat a été concentré. Le résidu a été dissous dans du AcOEt et la solution dans le AcOEt a été lavée

34

avec une solution aqueuse à 4 % de bicarbonate de sodium et de l'acide citrique aqueux à 10 %, déshydratée sur Na2S04 et concentrée. De Héther a été ajouté et le précipité cristallin a été recueilli par filtration et 'recristallisé dans l'acétate d'éthyle. Rendement 2,70 g (72,8 %), p.f. 123-125°C, /V ^6= -5,9° (c = 1,1, DMF), Rf1 0,57.

Analyse élémentaire :

Calculé pour Cg^ 5S4 :

C, 5-5,73 % ; H, 7,02 % ; N, 11,89 % ; S, 7,26 % Trouvé C, 55,89 % ; H, 7,30 % ; N, 11,72 % ; S, 7,08 %

(xiv) Production de Boc-Gln-Met-Leu-Phe-Arg (Pme) -Gly-Aasg (Pme)

4-

Arg(Pme)-Ala-Ser-Gln-OBu

On a dissous 1,0 g de Z-Arg(Pme)-Arg(Pme)-

4-

Ala-S.er-Gln-OBu dans 100 ml de MeOH et on a procédé à une réduction catalytique. Le produit a ensuite été dissous dans 20 ml de DMF et la solution a été additionnée de 0,85 g de Boc-Gln-Met-Leu-Phe-Arg(Pme)-Gly-OH et de 135 mg de HOBt. Le mélange a été refroidi à la glace et additionné de 210 mg de DCC. Le mélange entier a été agité pendant 20 heures. La DCU formée a été séparée par filtration et le filtrat a été concentré. Du MeOH a été ajouté et le précipité résultant a été recueilli par filtration. Rendement 1,50 g (87,4 %), p.f. 216-217°C

o £ 1

(décomposition), / a7D - 11,8° (c = 1,0, DMF), Rf 0,43. Analyse élémentaire :

Calculé pour cg8H-| 54°23N22S4 :

C, 55,09 % ; H, 7,27 % ; N, 14,42 % ; s, 6,00 %

Trouvé C, 54,81 % ; H, 7,33 % ; N, 14,23 % ; S, 5,79 %

(xvi) Production de H-Lys-Arg-Lys-Arg-Ser-Gln-Met-Leu-

Phe-Arg-Gly-Arg-Arg-Ala-Ser-Gln-OH

On a ajouté à 1,0 g de Boc-Gln-Met-Leu-Phe-

4-

Arg(Pme)-Gly-Arg(Pme)-Arg(Pme)-Ala-Ser-Gln-OBu 10 ml -de TFA et on a agité le mélange par secousses à la température ambiante pendant 50 minutes puis on l'a concentré. De l'éther a été ajouté et le précipité a été recueilli par filtration et séché.

35

On a ajouté séparément 10 ml de TFA à 0,83 g de Z-Lys(Mtr)-Arg(Pme)-Lys(Mtr)-Arg(Pme)-Ser-NHNH-Boc et on a agité le mélange par secousses à la température ambiante pendant 10 minutes puis on l'a concentré. De 5 l'éther a été ajouté et le précipité a été recueilli par filtration et séché. On l'a dissous dans 10 ml de DMF et on a refroidi la solution avec un mélange de neige carbonique et d'acétone puis on a ajouté 0,23 ml de HC1 6,2 N/AcOEt et du nitrite d'isoamyle (0,0 75 ml). 10 La température a été maintenue entre -25 et -20°C pendant 20 minutes (réaction négative au test à l'hydrazine) et le mélange réactionnel a été de nouveau refroidi avec un mélange de neige carbonique et d'acétone puis neutralisé avec 0,25 ml de TEA. Le composant aminé a été dissous 15 dans 40 ml de DMF et la solution a été refroidie à la glace. On a ajouté 0,16 ml de TEA et la solution d'azide mentionnée ci-dessus. Le mélange entier a été agité à 4°C pendant 72 heures et versé dans de l'acide acétique dilué. Le précipité formé a été recueilli par filtration 20 et lavé avec de 1'acétonitrile aqueux. Rendement 1,40 g

1

(81,5 %), Rf 0,09. Une partie (400 mg) de ce produit a été dissoute dans.60 ml de TFA-thioanisole-sulfure de méthyle (8:1:1) contenant du MSA 0,15 M et la solution a été agitée par secousses à la température ambiante 25 pendant 2 heures. On a ajouté 400 mg de AcONH^ et on a concentré le mélange. On a ajouté l'éther et on a recueilli le précipité par filtration puis on l'a séché. On l'a dissous dans une petite quantité de AcOH 1 N et on a fait passer la solution sur une colonne de "Sephadex G-25" 30 (2,2 x 120 cm) en utilisant comme éluant de l'acide acétique 1 N. On a rassemblé les fractions de 160 ml à 260 ml et on les.a lyophilisées. On a ensuite fait passer le lyophilisât sur une colonne de "Amberlite IRA-410"

(forme acétate) et on a lyophilisé le produit. Ce nouveau 35 lyophilisât a été purifié par chromatographie en phase liquide sous haute pression en utilisant une colonne

TSK-LS-410 (2,14 x 7,5 cm + 2,14 x 30 cm) pour obtenir le

_ 24

composé identifié ci-dessus. Rendement 45 mg, J_ a/D - 45,9°

36

(c = 0,7, AcOH 0,1 N), Rf4 (cellulose) 0,20.

Analyse des amino-acides : Lys 1,71, Arg 4,71 , Ser 1,69, Glu 2,12, Gly 1,00, Ala 1,03, Met 0,32,

Leu 1,30, Phe 1,08 (taux moyen de récupération 77 %). Exemple de référence 2

Synthèse du complexe polypeptide-protéine de support

Le polypeptide obtenu dans l'exemple de référence 1 (xvi) a été couplé avec la thyroglobuline (TG ci-après) conformément à la méthode de Goodfriend et collaborateurs /""Science, 144, 1334 (1964)_7. On a donc mélangé 2,5 mg dudit polypeptide avec 3,75 mg de TG et, après addition de 2 ml de tampon au phosphate 50 mM, on a agité correctement le mélange dans l'eau glacée.

On y a ajouté graduellement goutte à goutte une solution de 30,4 mg de chlorhydrate de carbodiimide dans 200 ml d'eau distillée. Ensuite, on a agité le mélange dans de l'eau glacée pendant 3 heures. Après la réaction, on a effectué une dialyse dans une mesure suffisante contre de l'eau glacée, puis on a effectué une lyophilisation pour obtenir 4,7 mg d'un complexe de protéine. Exemple de référence 3

Préparation d'un antigène lié à un enzyme pour la détection d'un anticorps par la méthode EIA

L'antigène lié à un enzyme destiné à la méthode EIA a été préparé comme décrit par Kitagawa et collaborateurs /"Journal of Biochemistry, J79, 233, (1976)_7. (i) Introduction d'un groupe maléimido dans le polypeptide

Le polypeptide (350 nmoles) obtenu dans l'exemple de référence 1 (xvi) a été dissous dans 1 ml de tampon au phosphate 100 mM (pH 6,8) et la solution a été ajoutée à une solution de 585 jj.g (1,75 |imoles)

d'ester de N-hydroxysuccinimide de N-(4-carboxycyclohexyl-méthyl) maléimide dans 70 jj.1 de N,N-diméthylformamide. Le mélange a,été agité à 30°C pendant 30 minutes. Après la réaction, on a effectué un fractionnement eh utilisant une colonne "Sephadex G-25" pour obtenir 185 nmoles d'une fraction polypeptidique dans laquelle le groupe maléimido avait été introduit.

37

(ii) Couplage du polypeptide contenant le groupe maléimido avec la $-D-galactosidase

Le: polypeptide contenant le groupe maléimido (16,5 nmoles), tel qu'obtenu dans l'exemple de référence 3 (i) , a été mélangé avec 3,3 nmoles de g-D-galactosidase. Après 18 heures de réaction à 4°C, on a ajouté 412,5 nmoles de g-mercaptoéthanol pour arrêter la réaction. Le polypeptide couplé avec la 3-D-galactosidase a été fractionné sur une colonne de "Sepharose 6B" et utilisé pour les essais subséquents.

Exemple de référence 4 Méthode EIA

La détection de l'activité en anticorps du sérum de souris immunisées avec le complexe de protéine obtenu dans l'exemple de référence 2 ou dans la liqueur surnageante d'hybridome a été conduite à l'aide de la méthode EIA /""immunology, î_, 3, (1978YJ. Le sérum ou la liqueur surnageante^d'hybridome a donc été dilué avec un tampon A (Na2HP04 20 mM, NaCl 100 mM, NaN^ 0,1 %; MgCl2 1 mM, pH 7,0), une portion de 100—|j,l de la dilution a été mélangée avec 100 ni du dérivé polypeptidique obtenu dans l'exemple 3, et on a laissé la réaction s'effectuer à 24°C pendant 24 heures. Ensuite, on a ajouté 100 ni de cellulose à 3 % couplée avec l'IgG antisouris de lapin, et on laissé la réaction se poursuivre à 24°C pendant 4 heures. Après la réaction, la cellulose a été lavée correctement avec le tampon A contenant 0,5 % de "Tween 20" puis on ajouté 500 ni de 4-méthylumbelli-féryl-g-D-galactoside à 20 ng/ml et, après 2 heures de réaction à 37°C, on a ajouté 3 ml de tampon au carbonate 100 mM (pH 10,5) pour arrêter la réaction. L'intensité de fluorescence a été mesurée avec un fluoromètre (excitation : 365 nm ; émission : 450 nm).

Exemple de référence 5 Immunisation

On a inoculé à thacune de 6 femelles de souris BALB/C âgées de 7 à 8 semaines, par voie sous-cutanée, 40 |ig (sur la base de la protéine) du complexe de protéine

38

obtenu dans l'exemple de référence 2 (comme antigène) en mélange intime avec l'adjuvant complet de Freund (immunisation primaire). Deux semaines après l'immunisation primaire, on a inoculé l'antigène aux souris par voie sous-cutanëe à la même dose que ci-dessus,

en mélange intime avec l'adjuvant incomplet de Freund (immunisation secondaire). Deux semaines plus tard, on a procédé à une troisième immunisation de la même manière que dans l'immunisation secondaire. Six jours après la troisième immunisation, on a effectué sur les souris un prélèvement partiel du sang et on a déterminé les titres en anticorps du sérum par la méthode EIA décrite dans l'exemple de référence 4. La souris portant le numéro y-2 a présenté le plus haute titre en anticorps et elle a été soumise à l'immunisation finale par inoculation intraveineuse de 120 ug de l'antigène dissous dans 0,5 ml de chlorure de sodium aqueux. Les titres en anticorps pour chaque souris sont représentés sur le tableau III.

TABLEAU III

Titres en anticorps antipeptide chez des souris immunisées

N° de la

L/B (%)

souris

Immunisation primaire 1)

Immunisation secondaire 2)

Immunisation tertiaire 3)

y-1

-4)

N.D.

24,5

2

N.D5)

19,3

35,3

3

-

N.D

24,7

4

N.D

1,3

1,7

5

N.D

1,8

5,0

6

-

N.D

0,8 '

Souris normale

0,6

0,1

N.D

I

1) Taux de dilution du sérum : 1/1000

2) Taux de dilution du sérum : 1/6300

3) Taux de dilution du sérum : 1/7800

4) -î Non détectable

5) ND : Non déterminé

39

. L/T : (Activité en enzyme lié/activité en enzyme ajouté total) x 100 Exemple de référence 6 Fusion cellulaire

L'immunisation a été effectuée par la méthode décrite dans l'exemple de référence 5. Trois jours après l'immunisation finale, la rate de la souris y-2 a été excisée, on lui a fait traverser sous pression une toile métallique d'acier inoxydable et on l'a mise en suspension dans le milieu essentiel minimal de Eagle (MEM) pour obtenir une suspension de cellules spléniques. Pour effectuer la fusion cellulaire, on a utilisé des cellules de myélome P3-x63.Ag8.U1 (P3U1) dérivées de souris BALB/C £~Current Topics in Microbiology and Immuno-logy, 81_, 1 , (1978_)7. La fusion des cellules a été effectuée par la méthode originale /"Nature, 256, 495, 1975]_7. Des cellules spléniques et des cellules P3U1 ont donc été lavées séparément trois fois avec le milieu MEM dépourvu de sérum et elles ont été mélangées dans un rapport de 5:1 (relativement au nombre de cellules). Le mélange a été centrifugé à 800 tr/min pendant 15 minutes, en sorte que les cellules se sont sédimentées. Après avoir convenablement enlevé la liqueur surnageante, on a légèrement désagrégé le sédiment, on y a a ajouté 0,3 ml de polyéthylèneglycol (PEG) 6000 (Koch-Light) à 45 % et on a laissé reposer le mélange dans un récipient contenant de l'eau tiède, maintenu à 37°C, pendant 7 minutes de manière à effectuer la fusion des cellules. Ensuite,

on y a ajouté du milieu MEM à la vitesse de 2 ml/min.

Après l'addition d'un total de 12 ml de milieu MEM, le mélange résultant a été centrifugé à 600 tr/min pendant 15 minutes puis la liqueur surnageante a été enlevée. Le sédiment cellulaire a été mis en suspension dans le milieu RPMI-1640 additionné de 10 % de sérum de foetus de veau (RPMI1640-10FCS) à une concentration de

5

2x10 cellules P3U1/ml et chacune des 144 cupules présentées sur des plaques à rangées de 24 cupules (Linbro) a été ensemencée avec 1 ml de la suspension. Après

40

l'ensemencement, on a fait incuber les cellules à 37°C dans un incubateur à 5 % d'anhydride carbonique gazeux. Au bout de 24 heures, on a mis en route une culture sélective envers le milieu HAT par addition de milieu

PRMI1640-1OFCS additionné de HAT (1 x 10 4 M d'hypoxan-

-7 -5

thine, 4 x 10 M d'aminoptérine, 1,6 x 10 M de thymi-

dine) (milieu HAT) en quantité de 1 ml par cupule. La culture HAT-sélective a été poursuivie tout en remplaçant 1 ml du milieu ancien par 1 ml de milieu HAT frais, 3, 5 et 7 jours après le début de la culture. La croissance d'hybridomes a été observée 10 à 14 jours après la fusion des cellules. Lorsque le bouillon de culture a pris une couleur jaune (environ 1 x 10 cellules/ml) la liqueur surnageante a été recueillie et examinée en vue de détecter la présence d'anticorps par la méthode EIA. On a examiné de cette manière les liqueurs surnageantes de 141 cupules dans lesquelles on avait observé la croissance d'hybridomes. Deux cupules (y2-11 et y2-100)' ont donné une activité intense en anticorps et deux autres (y2-62 et y2-70) ont présenté une faible activité en anticorps.

Exemple de référence 7 Clonage

Des hybridomes provenant de trois cupules (y2-11, 62 et 100) dont l'activité en anticorps était positive ont été clonés par la méthode de dilution limite. Des hybridomes ont donc été mis en suspension dans le milieu RPMI1640-20FCS à une concentration de 2 hybridomes/ml et la suspension a été distribuée par portions de 0,1 ml dans les cupules d'une plaque pour microtitrage à 96

5

cupules (Nunc). Dans ladite distribution, 5 x 10 thymocytes de souris BALB/c par cupule ont été ajoutés comme cellules nourricières. En conséquence, on a observé une prolifération des cellules en deux semaines environ. La liqueur surnageante a ensuite été recueillie et examinée pour détecter la présence d'anticorps par la méthode EIA décrite dans l'exemple 4. Une activité d'anticorps a été observée dans 8 des 19 clones provenant de y2-11, dans

41

3 des 54 clones provenant de y2-62 et 5 des 47 clones provenant de y-2-100.

Exemple de référence 8

Formation d'ascite par des hybridomes producteurs d'anticorps monoclonaux

La formation d'ascite a été provoquée par inoculation intrapéritonéale à des souris BALB/c, préalablement traitées avec 0,5 ml d'huile minérale, de g

1 x 10 cellules clonales de y-2-11.1 capables de produire des anticorps doués d'activité de liaison à l'IFN-y. Dix jours après l'administration intrapéritonéale d'hybridomes, le liquide d'ascite a été prélevé et l'activité

des anticorps a été examinée jusqu'à un facteur de dilution 7

de 10 . Bien que l'activité des anticorps de la liqueur surnageante de la culture de cellules clonales correspondantes ait été détectée jusqu'à un factèur de dilution

4

de 10 , la formation d'ascite (processus ascitogène)

a abouti à une élévation de l'activité des anticorps d'un facteur 1000 environ.

Exemple de référence 9

Purification d'anticorps monoclonaux

En utilisant 4 ml du liquide d'ascite obtenu dans l'exemple de référence 8 comme matière de départ, on a effectué une purification d'anticorps monoclonaux par la méthode de Staehelin et collaborateurs f~journal of Biolqgical Chemistry, 256, 9750 (1981]_7- Le liquide d'ascite a donc été tout d'abord centrifugé à 10 000 tr/min pendant 15 minutes pour en éliminer les substances du type de la fibrine puis il a été dilué avec une solution de sel tamponné au phosphate (PBS : NaH2PC>4 8,1 mM,

KH2P04 1,5 mM, KC1 2,7 mM, NaCl 137 mM ; pH 7,2) jusqu'à une concentration pour laquelle l'absorption ultraviolette à 280 nm (a2qq) pour ladite dilution s'est échelonnée de 12 à 14. Ensuite, une solution aqueuse saturée de sulfate d'ammonium a été ajoutée à l'échantillon dilué, à une concentration en sulfate de 47 %. Le mélange a été agité à 4°C pendant 60 minutes pour effectuer le relargage puis il a été centrifugé (10 000 tr/min, 15 minutes) pour

42

former un précipité. Le précipité a été dissous dans un tampon au Tris 20 mM (pH 7,9) contenant 50 mM de NaCl et la solution a été dialysée contre 2 litres du même ; tampon. Deux heures plus tard, la solution dialysante a été remplacée par une portion neuve de 2 litres de la même solution et la dialyse a été poursuivie pendant encore 15 heures. Lepprécipité a ensuite été séparé par centrifugation à 10 000 tr/min pendant 15 minutes et la concentration de la liqueur surnageante a été ajustée de manière que la valeur A2gQ se situe entre 20 et 30. Cet échantillon a été soumis à un fractionnement sur une colonne de DEAE-cellulose (8 ml, "Whatman DE,.2") équilibrée avec une quantité suffisante de tampon au Tris contenant 50 mM de NaCl. Après un lavage poussé avec le même tampon à une vitesse d'écoulement de 1,5 ml/min, la concentration en NaCl a été élevée linéairement de 50 mM à 500 mM. Dans ces conditions, l'activité des anticorps a été détectée principalement dans les fractions sortantes.

Exemple de réféfence 10

Vingt-cinq ml (65,3 mg) des anticorps monoclonaux provenant des fractions sortantes telles que purifiées par le mode opératoire de l'exemple de référence 9, ont été dialysés pendant la nuit contre une solution 0,1 M de NaHCO^ (pH 8,3). En procédant séparément, on a lavé à fond 25 ml de "AFFI-GEL 10" (Bio-Rad) avec de l'eau en utilisant un filtre en verre, on les a mis en suspension dans du bicarbonate de sodium 0,1 M (pH 8,3)

et on a mélangé la suspension avec l'anticorps ci-dessus. Le mélange a été agité modérément à 4°C pendant 4 heures pour accomplir la réaction puis on l'a laissé reposer à 4°C pendant la nuit. Le "AFFI-GEL 10" résultant a été lavé correctement avec du bicarbonate de sodium 0,1 M (pH 8,3) en utilisant un filtre en verre. On a ajouté au gel 25 ml d'une solution (pH 8,0) contenant de l'éthanol-amine 0,1 M et du NaCl 0,15 M. Le mélange a été agité par secousses à 4°C pendant une heure de manière à bloquer -le restant éventuel de groupes actifs n'ayant pas réagi. Ensuite, le gel a été lavé correctement au PBS et mis

43

en suspension dans 25 ml de PBS contenant 0,1 % de NaN^. La suspension a été conservée à 4°C. Sur la base de la quantité ajoutée d'anticorps et de la quantité d'anticorps se trouvant dans le filtrat.recueilli, on a trouvé 5 que l'anticorps était conjugué avec le gel dans une proportion de 2,35 mg/ml de gel. Une colonne a été garnie avec le produit de réaction obtenu de cette manière et utilisée comme colonne d'anticorps.

Claims (2)

1. 44

   rieure a

   .RESUME L'invention a pour objets::

   I. Une protéine caractérisée par les particularités suivantes prises séparément ou en cotibinaisons : 5 1. Il s'agit d'un interféron immunitaire humain recombinant pratiquement pure.

   (tNoVs rwyès nuPs 2. Elle a une activité spécifique

   ^ m ors o ,

   ^ 0 _ï)as~10 U/mg.

   3. Elle est sous une forme lyophilisée. 10 II. Un procédé de production d'une protéine d'interféron immunitaire humain recombinant pratiquement pure, caractérisé par les points suivants pris séparément ou ensemble :

   1. Il consiste à cultiver un transformant 15 ayant un ADN contenant une séquence de bases codant l'interféron immunitaire humain pour produire et accumuler de l'interféron immunitaire humain dans les cellules du transformant, à lyser les cellules et à purifier la solution résultante contenant 11interféron immunitaire

   20 humain en utilisant un anticorps monoclonal capable de s'attacher à l'interféron immunitaire humain.
2. 2. L'interféron immunitaire humain recombinant

   7

   a une activité spécifique non inférieure à 10 U/mg.

   3. La séquence de bases codant 1'interféron 25 immunitaire humain répond à la formule :

   (5') TGT TAC TGC CAG GAC CCA TAT GTA AAA GAA \ GCA GAA AAC CTT AAG AAA TAT TTT AAT GCA GGT \ CAT TCA GAT GTA GCG GAT AAT GGA ACT CTT TTC TTA GGC ATT TTG AAG AAT TGG AAA GAG GAG AGT 30 GAC AGA AAA ATA ATG CAG AGC CAA ATT GTC TCC

   TTT TAC TTC AAA CTT TTT AAA AAC TTT AAA GAT GAC CAG AGC ATC CAA AAG AGT GTG GAG ACC ATC AAG GAA GAC ATG AAT GTC AAG TTT TTC AAT AGC

   35

   45

   AAC AAA AAG AAA CGA GAT

   GAC

   TTC

   GAA

   AAG

   CTG

   ACT AAT TAT TCG GTA ACT

   GAC

   TTG

   AAT

   GTC

   CAA

   CGC AAA GCA ATA CAT GAA

   CTC

   ATC

   CAA

   GTG

   ATG

   GCT GAA CTG TCG CCA GCA

   GCT

   AAA

   ACA

   GGG

   AAG

   CGA AAA AGG AGT CAG ATG CTG

   TTT

   CGA

   GGT

   CGA

   AGA GCA TCC"' CAG-X (3')

   où X représente TAA, TGA ou TAG.

   4. L'anticorps monoclonal est un anticorps contre le polypeptide de formule :

   (N)

   H-X-Lys Arg Ser Gin Met Leu Phe Arg Gly-Y-OH

   dans laquelle X est une liaison ou un résidu de peptide ou d'amino-acides ayant 1 à 16 amino-acides à compter du terminus C de la chaîne peptidique de

   (N) ■ :>:• I

   Ile Gin Val Met Ala Glu Leu Ser Pro Ala !

   (C) J

   Ala Lys Thr Gly Lys Arg et Y est un résidu de peptide ou d*amino-acides ayant 1 à 5 amino-acides à compter du terminus N de la' chaîne peptidique de;Ôsr) (C) /;Arg Arg Ala Ser Gin. /;5. Y représente Arg Arg Ala Se- Gin.;6. X représente Lys Arg.;III. Un procédé de préparation d'une composition pharmaceutique contenant une quantité efficace d'interféron immunitaire humain recombinant pratiquement pur, comportant les particularités suivantes prises individuellement ou ensemble :;1. Il consiste à mélanger ledit interféron immunitaire humain avec un support, un véhicule ou un;46;diluant approprié pharmaceutiquement acceptable.;2. L'interféron immunitaire humain recombinant;7;a une activité spécifique non inférieure à 10 U/mg.;3. La composition est une préparation injectable.;O R;en pages;, contenant rayé nul;R AU onseîTen Propriété Industrielle 26 b1*, Boul. Princesse Charlotte monte-carlo lakwfe_ o^iuut