MC1626A1

MC1626A1 - Procede de preparation d'interferon immun

Info

Publication number: MC1626A1
Application number: MC841727A
Authority: MC
Inventors: Fung Hsiang-Ku
Original assignee: Hoffmann La Roche
Priority date: 1983-09-20
Filing date: 1984-09-19
Publication date: 1985-09-26
Also published as: IL72988A0; DK447584D0; US4476049A; FI80906B; HUT35287A; FI80906C; HU196462B; ES536029A0; PH20996A; ZA846723B; GR80404B; NZ209589A; DK447584A; NO159609C; EP0140127B1; PT79231A; FI843670A0; KR910006602B1; AU575588B2; CA1214411A

Description

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La présente invention concerne un procédé de préparation d'interféron immun. Plus particulièrement, l'invention concerne un procédé pour extraire une forme à séquence intacte de l'interféron immun humain recom-5 binant à partir d'une préparation comprenant des microorganismes transformés contenant cette protéine. L'extraction s'effectue avec un réactif, comme le chlorhydrate de guanidine, qui inhibe la protéase ou l'activité enzymatique mais n'affecte pas l'activité de la pro-10 téine désirée. Les étapes restantes du procédé de purification après l'extraction au chlorhydrate de guanidine peuvent être celles qui sont connues des spécialistes de la purification des protéines.

La figure 1 présente 1'électrophorèse sur gel 15 de dodécylsulfate de sodium-polyacrylamide (SDS-PAGE)

de l'interféron immun humain recomJoinant purifié dans des conditions réductrices (A; 0,7 M ^-mercaptoéthanol) et des conditions non réductrices (B).

La figure 2 présente la comparaison entre la 20 séquence d'acides aminés prédite de l'interféron immun humain recombinant et la séquence d'ADN effective des espèces rlFN-^ 15K et 18K .

La figure 3 présente la séparation par chroma-tographie en phase liquide à haute pression (CLHP) de 25 rIFN-Jf 15K et 18K après traitement par CNBr.

La technique antérieure a mis au point plusieurs procédés pour effectuer 1'extraction et la purification de la famille de protéines .antivirales connue sous le nom d'interféron. A l'heure actuelle il y a trois grandes 30 classes connues d'interféron: IFN-o« (leucocyte),

IGN-£ (fibroblaste) et IFN-^(immun). Bien que les diverses classes d'interféron puissent être apparentées en termes d'activité antivirale, antiproliférative ou

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de disposition structurale, la technique antérieure a jusqu'à présent été incapable de concevoir un procédé uniforme pour l'extraction et la purification de toutes ces classes. De fait, un grand nombre des procédés utiles pour 5 l'extraction et la purification de l'interféron de leucocyte à partir d'un mélange brut d'autres protéines et de débris cellulaires ne fonctionneraient pas pour extraire et purifier l'interféron de fibroblaste ou immun à partir du même type de préparation. 10 L'étape d'extraction dans les procédés de purification de la technique antérieure faisait typiquement intervenir la lyse mécanique (c-à-d traitement aux ultra-sons) ou chimique de microorganismes produisant, souvent par des techniques recombinantes, la 15 protéine "étrangère" désirée. Cependant, durant ce procédé de lyse mécanique ou chimique diverses protéases cellulaires sont également libérées dans le mélange.

i

Ces protéases sont alors libres d'agir de façon enzy-matique sur et dégrader la protéine "étrangère" dans le 20 mélange. Ces protéases peuvent donc gêner ou inhiber la purification à l'homogénéité de. la forme complète ou mûre et biologiquement active de la protéine "étrangère".

L'invention a donc pour objet de fournir un procédé qui surmonte les limitations des tecnniques 25 d'extraction antérieures, par lequel on obtient la forme à séquence intacte de l'interféron immun et par lequel des fragments de dégradation protéolytique sont éliminés des préparations d'interféron immun purifiées.

Description des modes de réalisation préférés 30 on a découvert dans le cas de l'interféron immun que l'extraction avec l'une quelconque des techniques classiques comme le traitement aux ultra-sons ou la

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lyse mécanique décrits dans la technique antérieure ne donne pas d'interféron immun avec une séquence d'acides aminés intacte ou complète. Ce n'est que récemment que la technologie recombinante a avancé au point où il est 5 possible d'obtenir des quantités suffisantes de rlNF-Jf pour le caractériser et déterminer sa séquence d'acides aminés. En utilisant les techniques antérieures classiques pour extraire les préparations de rlNF-^et en déterminant la séquence d'acides aminés de la matière 10 purifiée, on a découvert que la préparation purifiée se composait en fait de diverses espèces protéiques apparentées de poids moléculaires différents. On a en outre découvert en faisant la séquence des acides aminés que ces espèces protéiques sont en fait la forme de séquence 15 intacte de l'interféron immun en combinaison avec des fragments proteolytiques de la sequence protéique intacte. La technique antérieure est donc jusqu'ici incapable d'extraire et purifier jusqu'à Homogénéité la forme intacte de l'interféron immun depourvue d'autres frag-20 ments protéolytiques d'interféron immun.

On a découvert que l'on peut prévenir la dégradation de rlNF-^en utilisant un reactif, comme le chlorhydrate de guanidine, qui inhibe la protéase ou l'activité enzymatique et qui n'affecte pas l'activité 25 du rINF-y, dans l'étape d'extraction initiale d'un procédé de purification pour obtenir des molécules homogènes et intactes. Le traitement aux ultra-sons de cellules congelées en l'absence de chlorhydrate de guanidine donne surtout un produit proteolytique (rlNF-^ ) 30 où manquent les résidus acides aminés C-terminaux

N° 132-146 d'• INF-^f. La composition en acides aminés et la séquence N-terminale de la molécule intacte est compatible avec ce qu'on attend d'après la séquence d'ADN.

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La séquence de base d'ADN de rlNF-^f telle qu'utilisée dans toute cette description est telle que décrite dans la référence 1.

On a trouvé de façon surprenante que 1'inter-5 féron immun conserve son activité biologique après une étape d'extraction au chlorhydrate de guanidine même si le chlorhydrate de guanidine détruit l'activité biologique lorsqu'on l'ajoute à une préparation purifiée d'interféron immun. On préfère que dans la pratique de 10 l'invention les microorganismes transformés soient en suspension dans le chlorhydrate de guanidine.

L'agent anti-protéolytique de l'invention peut être n'importe quel sel de guanidinium. Parmi ces sels de guanidinium on peut citer les sels avec des 15 acides organiques comme p. ex. l'acide acétique ou des acides minéraux comme p. ex. les halohydrates, c'est-à-dire le bromhydrate, le chlorhydrate, le fluorhydrate et 1'iodhydrate. Le sel de guanidinium préféré est le chlorhydrate de guanidine. La concentration de sel de 20 guanidinium dans le traitement des microorganismes n'est pas critique en ce qu'on peut utiliser n'importe quelle quantité efficace. On préfère cependant utiliser une solution 3 à 7 M du sel de guanidinium pour traiter les microorganismes et employer d'environ 3 à 9 volumes de 25 la solution de sel par gramme de microorganismes transformés. On peut atteindre la concentration du sel en complétant le sel dans un solvant comme l'eau ou les tampons aqueux, comme l'acétate d'ammonium, la pyridine/ acide acétique, etc. Il est également prévisible que 30 dans la pratique de l'invention on puisse utiliser d'autres réactifs inhibiteurs de protéase, comme l'urée ou le thiocyanate.

On peut finalement obtenir le rlNF-^f purifié en appliquant le surnageant E. coli après extraction et

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dilution appropriée directement sur un moyen de purification, de préférence en utilisant une étape de purification à anticorps monoclonaux. On peut automatiser le procédé d'extraction et de purification pour la pro-5 duction à grande échelle. Ainsi l'invention permet pour la première fois de disposer de grandes quantités de rIFN-y homogène et ainsi permet essais cliniques, études biologiques, cristallographie aux rayons X et études structure-fonction extensifs.

10 D'autres modes de réalisation préférés seront présentés dans la description et les exemples qui suivent.

L'interféron immun humain recombinant produit chez E. coli est de préférence extrait d'une pâte cellu-15 laire congelée par du chlorhydrate de guanidine 7 M et purifié par des moyens de purification appropriés comme par des colonnes d'affinité aux anticorps monoclonaux. On a obtenu un interféron purifié avec un PM apparent d'environ 18 000 daltons (18K) par SDS-PAGE par extrac-20 tion à la guanidine tandis qu'on a isolé une espèce à

PM plus faible (espèce majeure d'environ 15 000 daltons, 15K) par traitement aux ultra-sons en l'absence de guanidine. La séquence amino-terminale des protéines 18K comme 15K est compatible avec la séquence prédite à 25 partir de la séquence d'ADN codant pour cette protéine d'interféron immun humain.

On détermine la séquence C-terminale en analysant et en faisant la séquence du peptide C-terminal purifié après traitement à CNBr. La composition et la 30 séquence d'acides aminés du peptide C-terminal libéré à partir du rlFN-^" 18K correspondent à la séquence prédite de rIFN-^f indiquant que l'espèce 18K est la-.

i molécule intacte. D'un autre côté, après traitement à

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CNBr un fragment peptidiique différent est libéré de l'extrémité C du rIFN-df 15K. Sur la base de l'analyse des acides aminés et de la séquence, ce peptide différent correspond aux résidus acides aminés N° 121-131, indiquant 5 que l'espèce 15K est un produit protéolytique.

Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, le microorganisme employé comme récepteur dans les procédés de fermentation et sauf indication contraire est le microorganisme Escherichia coli K-12 10 souche 294 tel que décrit dans le brevet anglais

N° 2 055 382 A déposé à 1'American Type Culture Collection sous le N° d'accès ATCC N° 31446 le 28 octobre 1978. En outre, tout le présent travail d'ADN recombinant a été effectué selon les directives applicables 15 des Instituts nationaux de la Santé.

Cependant, l'invention comprend l'application non seulement d'E. coli K12 souche 294 mentionné ci-dessus, mais également d'autres souches d'E. coli comme E. coli MA210 ou E. coli RRl (ATCC N° 31343), ou 20 d'autres microorganismes dont beaucoup sont publiquement disponibles ou sont déposés et disponibles auprès d'institutions reconnues de dépôt de microorganismes, comme 1'American Type Culture Collection (voir p. ex. le catalogue ATCC).

25 Les anticorps monoclonaux sont préparés contre un polypeptide synthétique constitué des 16 derniers résidus acides aminés de l'extrémité C de RIFN-£- , c'est-à-dire les résidus acides aminés N° 131-146. L'un des anticorps monoclonaux (Mo 2-11.1) est utilisé pour la 30 purification de rlFN-Jf . De façon plus spécifique, les anticorps monoclonaux et la colonne d'affinité aux anticorps de l'invention sont préparés comme il est dit dans la demande de brevet européen publiée sous le N° 103898.

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L'invention est précisée par les exemples suivants.

Exemple 1

Synthèse d'un complexe protéine support-polypeptide 5 utilisé comme antigène

On couple le polypeptide H-Lys-Arg-Lys-Arg-Ser-Gln-Met-Leu-Phe-Arg-Gly-Arg-Arg-Ala-Ser-Gln-OH avec de la thyroglobuline (ci-dessous TG) selon le procédé de Goodfriend et coll. Science 144, 1334 (1964). 10 Le peptide lui-même peut être produit par des procédés classiques de synthèse des peptides. On peut utiliser le procédé en phase solide ou en phase liquide, bien que le procédé de synthèse en phase liquide soit intéressant dans de nombreux cas. Ce genre de procédés 15 de synthèse peptidique est décrit, par exemple, .par

Schrôder et Lubke dans "The Peptides", Vol. 1, Academic Press, New York, Etats-Unis, 1966, ou par Izumiya et coll. dans "Peptide- Syntheses", Maruzen, Tokyo, Japon, 19 75 , ou par Haruaki Yajima dans "Experiments in Bio-20 chemistry", tfoi. 1, pages 207-400, Tokyo Kagaku Dojin,

1977, et comprend, entre autres, les procédés de l'azide, du chlorure, de l'anhydride d'acide, de l'anhydride d'acide mixte, de CCM, de l'ester actif, le procédé utilisant le réactif de Woodward K, le procédé du carbodii-25 midazole, le procédé d'oxydation-réduction et le procédé de CCM/additif (p. ex. HONB, HOBt, HOSu).

Pour une description détaillée de la préparation du fragment 131-146 d'IFN-^voir la demande de brevet européen publiée sous le N" 103 898. 30 On mélange 2,5 mg dudit polypeptide avec 3,75

mg de TG et , après addition de 2 ml de tampon phosphaté 50 mM, on agite bien le mélange dans l'eau glacée. On y ajoute graduellement goutte à goutte une solution de 30,4 mg

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de chlorhydrate de cârbodiimide dans 200 ml d'eau distillée. On agite ensuite le mélange dans l'eau glacée pendant 3 h. Après la fin de la réaction, on effectue la dialyse contre l'eau distillée dans une mesure suffisante, puis on lyophilise pour donner 4,7 mg d'un complexe protéique.

Exemple 2

Préparation d'un antigène lié à l'enzyme pour 1'immuno-dosage enzymatique (IDE) pour la détection de l'anticorps

On prépara l'antigène lié à l'enzyme pour IDA selon Kitagawa et coll. Journal of Biochemistry, J79, 233 ( 1976).

(i) Introduction d'un groupe maieimido dans le polypeptide.

On dissout le polypeptide (350 nmoles) tel qu'obtenu dans l'exemple 1 dans 1 ml de tampon phosphate 100 mM (pH 6,8), et on ajoute la solution à une solution de 585 £ig (1,75 (îmoles ) de N-hydroxysuccinimide-ester de N— ( 4—carboxycyclohexylmethy 1 ) maleimide dans 70 (il de N,N-diméthylformamide. On agite le mélangé à 30° pendant 30 minutes. Après la fin de la reaction, on effectue un fractionnement en utilisant une colonne de Sephadex G-25 pour donner 185 moles d'une fraction polypeptidique avec le groupe maieimido qui y est introduit.

(ii) Couplage du polypeptide contenant le groupe maieimido avec la (J-D-galactosidase.

On mélange le polypeptide contenant le maieimido (16,5 nmoles) avec 3,3 nmoles de (3-D-galactosidase. Au bout de 18 h de réaction à 4°C, on ajoute 412,5 nmoles de (^-mercaptoéthanol pour terminer la réaction. On fractionne le polypeptide couplé à la (î-D-galactosidase sur une colonne de Sepharose 6B et on l'utilise pour les expériences ultérieures.

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Exemple 3 Immunisation

On inocule par voie sous-cutanée à 6 souris femelles BALB/C âgées de 7 à 8 semaines 40 jig (sur la 5 base de la protéine) du complexe pcotéique obtenu dans l'exemple 1 comme antigène en mélange intime avec l'adjuvant complet de Freund (immunisation primaire). Deux semaines après l'immunisation primaire, on inocule à nouveau aux souris par voie sous-cutanée l'antigène à 10 la même dose que ci-dessus intimement mélangée avec l'adjuvant incomplet de Freund (immunisation secondaire). Encore deux semaiens plus tard, on effectue une troisième immunisation de la même manière que dans l'immunisation secondaire. Six jours après la troisième immunisation, 15 on effectue un échantillonnage partiel de sang à partir des souris et on détermine les titres d'anticorps sériques par le porcédé IDE décrit ci-dessous (cF Immunopharmaco-logy _1, 3 L1978J). La souris numéro g-2 donne le plus naut titre d'anticorps et est soumise à une immunisation 20 finale par inoculation intraveineuse de 120 ug de l'antigène dissous dans 0,5 ml de chlorure de sodium aqueux. Les données des titres d'anticorps pour cnaque souris sont présentés au tableau 1.

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Tableau 1

Titres d'anticorps antipeptide cnez des souris immunisées

L/T (%)

Souris No.

Immunisation

Troisième

primaire 1)

secondaire

2 ) immunisation^ )

ï-l

4)

N.D.

24,5

2

N.D. 5)

19,3

35,3

3

-

N.D.

24 ,7

4

N.D.

1,3

1,7

5

N.D.

1,8

5,0

6

-

N.D.

0,8

Souris

normale

0,6

0,1

N.D.

1) Rapport de dilution sérique: 1/1000

2) Rapport de dilution sérique: 1/6300

3) Rapport de dilution sérique: 1/7800

4) -: non détectable

5) N.D.: non déterminé

!

L/T: (activité enzymatique liée/activité enzymatique totale ajoutée) x 100

Procédé IDE

On effectue la détection de l'activité d'anticorps dans le sérum des souris immunisées avec le complexe protéique obtenu dans l'exemple 2 ou dans le surnageant d'hybridome par le procédé IDE Llmmunology _1, 3 (1978)]. Ainsi, on dilue le sérum ou le surnageant d'hybridome avec du tampon A (Na2HP04 20mM, NaCl lOOmM,

11

NaN3 0,1% MgCl2 1 mM, pH 7,0), on mélange une fraction de 100 {il avec 100 yl du dérivé de polypeptide lié à l'enzyme (Exemple 2) et on laisse la réaction se dérouler à 24°C pendant 24 h. On ajoute ensuite 100 de cellulose 5 à 3% couplée avec de l'IgG anti-souris de lapin, et on laisse la réaction se dérouler à 24°C pendant 4 h. Après la fin de la réaction, on lave bien la cellulose avec du tampon A contenant 0,5% de Tween 20, puis on ajoute 500 (al de 4-méthylumbellif éryl-(5-D-galactoside a 20 |ig/ml 10 et, au bout de 2 h de réaction à 37°C, on ajoute 3 ml de tampon au carbonate 100 mM (pH 10,5) pour terminer la réaction. On mesure l'intensité de la fluorescence avec un fluoromètre (excitation: 365 nm; émission: 450 nm)

Exemple 4 15 Fusion cellulaire

Trois jours après l'immunisation finale telle que décrite dans l'exemple 3, on excise la rate de la souris on filtre sous pression a travers un tamis inoxydable, et on met en suspension dans le milieu essen-20 tiel minimum d'Eagle (MEM) pour donner une suspension de cellules de rate. Pour la fusion cellulaire, on utilise des cellules de myélome P3-xb3.Ag8.U1 (P3U1) provenant de souris BALB/C LCurrent Topics in Microbiology and Immunology, 8_1, 1 (197b) J. On effectue la fusion 25 cellulaire par le procédé original de Konler et Milstein, Nature 256, 495-497 (1975). Ainsi, on lave séparément trois fois les cellules de rate et les cellules P3U1 avec du MEM dépourvu de sérum et on mélange dans un rapport de 5:1 (en nombre de cellules). On centrifuge le 30 mélange à 800 tpm pendant 15 minutes, et les cellules se sédimentent. Après avoir enlevé avec soin le surnageant, on détache légèrement le sédiment, on ajoute 0,3 ml de

1

12

polyéthylèneglycol (PEG) à 45% 6000 (Koch-Light), et on laisse le mélange reposer dans une cuve d'eau chaude maintenue à 37°C pendant 7 minutes pour réaliser la fusion cellulaire. On y ajoute ensuite du MEM à raison de 2 ml par minute. Après addition de 12 ml au total de MEM, on centrifuge le mélange obtenu à 600 tpm pendant 15 minutes, puis on enlève le surnageant. On met en suspension le sédiment cellulaire dans un milieu RPMI-1640 auquel on a ajouté du sérum de foetus de veau à 10% (RPMI1640-10FCS) à une concentration de 2 x 10^ P3U1 cellules/ml et on ensemence 144 réservoirs sur des multiplats à 24 réservoirs (Linbro) avec 1 ml de la suspension.

Après ensemencement, on fait incuber les cellules à 37°C dans un incubateur au dioxyde de carbone gazeux à 5%. Au bout de 24 h, on commence une culture HAT-sélective en ajoutant du milieu RPMI1640-10FCS additionné de HAT

—4 — 7

(hypoxanthine 1 x 10 M, aminoptérine 4 x 10 M,

thymidine 1,6 x 10"^ M) à raison de 1 ml par réservoir. On continue la culture HAT-sélective tout en remplaçant 1 ml de l'ancien milieu par 1 ml de milieu HAT 3, 5 et 7 jours après le début de la culture. On note le croissance d'hybridomes 10 à 14 jours après la fusion cellulaire. Lorsque le bouillon de culture jaunit (environ 1 x 106 cellules/ml), on recueille le surnageant et on y recherche la présence d'anticorps par le procédé IDA. De cette manière, on examine les surnageants de 141 réservoirs où l'on avait noté une croissance d'hybridome. Deux réservoirs ( y 2-11 et ^ 2-100) présentent une intense activité d'anticorps et deux autres réservoirs ( y 2-62 et ^2-70) présentent une faible activité d'anticorps.

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Exemple 5 Clonage

On clone des hybridomes de trois rézervoirs 1^2-11, ^*2-62 et Jf2-100) qui sont positifs dans l'activité d'anticorps par le procédé de dilution limitante. Ainsi, on met en suspension des cellules d'hyori-dome dans RPMI1640-20FCS à une concentration d'au moins

2 cellules d'hybridome/ml et on répartit la suspension en fractions de 0,1 ml dans les reservoirs sur une microplaque de 96 réservoirs. Dans ladite distribution,

on ajoute par réservoir 5 x 10^ thymocytes de souris

BALB/C comme cellules d'alimentation. A la suite de cela on observe une prolifération cellulaire en 2 semaines environ. On recueille alors le surnageant et on y recher che la présence d'anticorps par le procédé IDA décrit dans l'exemple 3. On note l'activité d'anticorps dans

8 clones sur 19 du réservoir 2-11, dans 3 clones sur 54 du réservoir y2-62, et dans 5 clones sur 4 7 du réservoir ^2-100 (Tableau 2).

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Tableau 2

Activité d'anticorps anti-peptiae des hybridomes clonés

30

gybridome No. L/T (%)

y 2-11

lQ 1 68

2 31

3 63

6 68

7 67 15 9 69

12 42

18 60

Y 2-62

20 14 20

16 " 21

34 16

Y 2-100

25 2 69

3 ' 70

16 56

25 80

46 33

Sérum de souris hyperirranun 35

35

15

Exemple 6

Capacité de liaison des anticorps monoclonaux à IFN-^

On détermine la capacité de liaison des anticorps monoclonaux à IFN-Jf par le procédé suivant. A 300 \il d'une solution à 3% de cellulose couplée avec de l'anticorps IgG anti-souris de lapin, on ajoute 300 ^il du surnageant de culture de chacune de 2 ou 3 lignées cellulaires clonées provenant de chacun des réservoirs £2-11, £*2-62 et ^"2-100, et on laisse la réaction se dérouler à la température ambiante pendant 12 à 20 h. On lave alors à fond la cellulose avec du sel physiologique, et on y ajoute 550 U/ml d'IFN-^f obtenu par le procédé mentionné ci-dessous. Au bout de 3 à 4 h de réaction, on recueille le surnageant et on y ajoute 1'IFN-£* obtenu par le procédé mentionné ci-dessous. Au bout de 3a 4 h de réaction, on recueille le surnageant et on y détermine l'activité IFN-^par le procédé de lecture de l'effet cytopathique ICPE) en utilisant une microplaque LApplied Microbiology 16, 1706 (1968) J. Ainsi, on met 50 (il de MEM dans chacun des réservoirs d'une microplaque à 96 réservoirs et on ajoute au premier réservoir 50 yl de l'échantillon d'IFN, puis on procède à une dilution au double en série. A chaque réservoir ainsi préparé, on ajoute 50 yl d'une suspension cellulaire WISH (4 x 105 cellules/ml) dans du MEM contenant du FCS à 20%, et on effectue l'incubation dans un incubateur au dioxyde de carbone gazeux à 37°C pendant 24 h. Ensuite, on ajoute à chaque réservoir 50 pl d'une préparation de virus de stomatite vési-culaire (souche New Jersey) ajustée à une concentration de 2000 TCID^q (TCID^q: dose moyenne infectant la culture de tissus) et on effectue l'incubation dans un incubateur au dioxyde de carbone à 37°C. Environ 35 h plus tard,

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lorsque les cellules dans le réservoir dépourvu d'échantillon d'IFN présentent 100% de CPE, on observe chaque réservoir au microscope pour l'estimation du CPE, et l'inverse du facteur de dilution pour l'échantillon d'IFN dans le réservoir où l'on a noté 50% de CPE est appelé le titre IFN.

L'échantillon d'IFN-^ utilisé est le surnageant recueilli 72 h après stimulation des lymphocytes périphériques humains avec 40 yg/ml de concanavaline A et 15 ng/ml de 12-0-tétra-décanoylphorbol-13-acétate. Chaque ml de ce surnageant de culture contient 4400 unités d'IFN- r humain (labile à la chaleur et aux acides). Si des anticorps ayant une capacité de liaison à IFN-sont présents dans le surnageant de culture cellulaire cloné, alors l'IFN-y ajouté doit se lier aux anticorps sur la cellulose et il doit se produire une réduction de l'activité IFN-y du surnageant. Il s'ensuit que, pour le clone 2-11, on note une activité relativement intense de liaison à IFN- y et 50-75% de 1'IFN- Y ajouté (550 U/ml) est lié aux anticorps (Tableau 3).

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Tableau 3

Absorption de l'activité d'IFN-jfpar les anticorps monoclonaux.

Culture d'hybridome Activité IFN résiduelle

(U/ml)

Expérience Expérience 1 2

Y 2-11.1

138

275

Y 2-11.2

207

N.D.

y 2-11.6

N.D.

275

y 2-62.2

275

550

Y 2-62.3

275

550

Y 2-100.2

550

N.D.

Y 2-100.3

550

N.D.

_

550

Exemple 7

Formation d'ascite par des hybridomes monoclonaux producteurs d'anticorps

On provoque la formation d'ascite par inoculation intrapéritonéale à des souris BALB/c, prétraitées par voie intrapéritonéale avec 0,5 ml d'huile minérale, de 1 x 10^ cellules de clone ^ 2-11.1 capables de produire des anticorps ayant une activité de liaison à IFN-^f . Dix jours après l'administration intrapéritonéale des hybridomes, on prélève le liquide d'ascite et on y recherche l'activité d'anticorps jusqu'à

7

une dilution de 10 . Tandis que l'activité d'anticorps du surnageant de culture de eellules de clone correspondant est détectée jusqu'à une dilution de 10 , la

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formation d'ascite (ascitisation) aboutit à multiplier par 1000 environ l'activité d'anticorps.

Exemple 8

Purification d'anticorps monoclonal

En utilisant 4 ml du liquide d'ascite obtenu dans l'exemple 7 comme produit de départ, on effectue la purification d'anticorps monoclonal par le procédé de Staehelin et coll. (Journal of Biological Chemistry 256, 9750, L1981J). Ainsi, on centrifuge tout d'abord le liquide d'ascite à 10 000 tpm pendant 15 minutespour en enlever les substances de type fibrine puis on dilue avec du sel physiologique tamponné au phosphate (STP: NaH2PC>4 8,1 mM, KH2PC>4 1,5 mM, KC1 2,7 mM, NaCl 137 mM; pH 7,2) à une concentration à laquelle l'absorption UV à 280 nm ^ A20 0) est comprise entre 12 et 14. On ajoute ensuite du sulfate d'ammonium aqueux saturé à l'échantillon dilué à une concentration de sulfate de 47%. On agite le mélange à 4°C pendant 60 minutes pour effectuer un relargage puis on centrifuge (10 000 tpm, 15 minutes) pour donner un précipité. On dissout le précipité dans un tampon Tris 20 mM (pH 7,9) contenant du NaCl 50 mM et on dialyse contre 2 litres du même tampon. Deux heures plus tard, on remplace la solution dialysante par une fraction fraîche de 2 litres de la même solution et on continue la dialyse pendant encore 15 h. On enlève ensuite le précipité par centri-

I

fugation à 10 000 tpm pendant 15 minutes, et on ajuste le surnageant à une concentration telle que la valeur de A280 ^evient 20-30. On soumet cet échantillon à un fractionnement sur une colonne de DEAE-cellulose (8 ml,

Wnatman DE^2) équilibrée avec une quantité suffisante de tampon Tris (pH 7,9) contenant du NaCl 50 mM, l'élution

19

étant faite avec un tampon Tris contenant du Na Cl 50 mM à un débit de 1,5 ml/minute. Dans ces conditions, l'activité d'anticorps est détectée surtout dans les fractions effluentes. La confirmation que l'échantillon purifié 5 est l'anticorps est faite par le procédé SDS-PAGE tel que décrit par Laemmli et coll. Nature 227, 680 (19 70). Ainsi, une partie des fractions obtenue par relargage au sulfate d'ammonium et fractionnement à la DEAE-cellu-lose est soumise à une réduction avec du 2-mercapto-10 éthanol, suivie par une électrophorèse sur gel de SDS à 17% à 30 volts pendant 24 h. En accord avec les pics d'activité anticorps, on note deux bandes à des positions correspondant aux poids moléculaires d'environ 55 kilo-daltons (chaîne H) et environ 28 kilodaltons (chaîne L). 15 On recherche dans la fraction d'anticorps 17 ainsi purifiée l'activité de liaison à IFN-^ en ajoutant IFN-<j-(2200 (J/ml). On trouve ainsi qu'environ 50% de 1'IFN-jp est lié à l'anticorps (Tableau 4).

Table au 4

Echantillon

Dilution

'Activité IFN résiduelle (U/ml)

Y 2-11.1 fraction 17

10"1

1100

10-2

1100

ro 1

O

r-l

2200

lO"4

2200

Anticorps monoclonal

10"1

2200

anti-IgE

10-2

2200

10-3

2200

10-4

2200

20

Exemple 9

Sous-classe à laquelle appartiennent les anticorps monoclonaux

On dilue 10 fois la fraction d'anticorps 17 purifiée (Exemple 8) et on la soumet à une réaction d1immuno-précipitation dans la gélose (Test d'Ouchterlo-ny: Immunological Methods, Gel-Diffusion Techniques, Blackwell, Oxford, 1964) en utilisant des anticorps antisouris de chèvre IgGl, G2a, G2b et G3 (Miles) de manière à pouvoir identifier la sous-classe d'IgG à laquelle pourraient appartenir les anticorps monoclonaux 2-11.1. On trouve une seule bande distincte entre l'anticorps monoclonal et l'anticorps anti-souris de chèvre IgG2b, tandis qu'on ne note pas de formation de bande entre l'anticorps monoclonal et les autres anti-anticorps. On trouve donc que ledit anticorps monoclonal appartient à IgG2b (Tableau 5).

Tableau 5 Sous-classe d'anticorps monoclonaux

Antigène Anticorps tourbe de précipitation

Anticorps monoclonal de l'invention

(fraction 17) Anti-IgGl

" Anti-IgG2a

" Anti-IgG2b +

" Anti-IgG3

21

Exemple 10

On dialyse pendant la nuit contre NaHCO^ 0,1 M (pH 8,3) 25 ml (65,3 mg) de l'anticorps monoclonal provenant des fractions effluentes telles que purifiées par le procédé de l'exemple 8. Séparément, on lave à fond avec de l'eau 25 ml d'AFFI-GEL 10 (Bio-Rad) en utilisant un filtre en verre, on met en suspension dans NaHCO^ 0,1 M (pH 8,3) et on mélange avec l'anticorps ci-dessus. On agite doucement le mélange à 4°C pendant 4 h pour effectuer la réaction, puis on laisse reposer à 4°C pendant la nuit. On lave bien l'AFFI-GEL 10 avec NaHCO^ 0,1 M (pH 8,3) en utilisant un filtre en verre. Au gel on ajoute 25 ml d'une solution (pH 8,0 contenant de l'é-thanolamide 0,1 M et du NaCl 1,15 M. On agite le mélange à 4°C pendant 1 h pour bloquer les groupes actifs n'ayant peut-être pas encore réagi. On lave alors bien le gel avec du STP, et on le met en suspension dans 25 ml de STP contenant 0,1% de NaN^. On conserve la suspension à 4°C. Sur la base de la quantité d'anticorps ajouté et de la quantité d'anticorps dans le filtrat recueilli, on trouve que l'anticorps est conjugué au gel dans une proportion de 2,35 mg/ml de gel. On remplit une colonne avec le produit réactionnel obtenu de cette manière et on l'u-r tilise comme colonne d'anticorps.

Exemple 11

On utilise E. coli RR1 (pRK148cIts , pRC231/IFI-900) (la construction de cet organisme recombinant est décrite en détail dans la demande de brevet européen N° 99084) pour la production de rlFN-^ . Les plasmides pRK248cIts et pRC231/IFI-900 contiennent un répresseur lambda sensible à la température et des gènes d'IFN-^f respectivement. L'expression du gène de rIFN-^f

22

est sous le contrôle du promoteur P^.

On fait croître des cultures d'une nuit de E. coli RRl (pRK248cIts , pRC231/IFÏ-900) dans un bouillon LB à 30°C. On dilue un litre de la culture de la nuit avec un milieu M-9 minimal contenant des acides casaminés. A croissance logarithmique, on fait passer la culture de 30° à 42°C et on continue de la faire croître à 42"C pendant 2-3 h. On recueille les bactéries par centrifu-gation et on conserve les pellets bactériens à -20°C jusqu'à utilisation. Toutes les fermentation et tous les procédés sont conduits selon les directives sur 1'ADN recombinant des Instituts nationaux de la Santé.

On prépare des anticorps monoclonaux contre le peptide C-termianl 131-146 synthétique de rIFN-^f de la manière décrite ci-dessus. On utilise l'anticorps monoclonal Mo g 2-11.1 pour la purification de rlFN-^Jf . On prépare la colonne d'anticorps monoclonal comme il est dit dans l'exemple 10.

On conduit la carboxyméthylation de rlFN-^

14

par l'acide iodacétique C en présence de chlorhydrate de guanidine 6 M comme il est dit dans la reférence (3). On enlève l'excès de réactif par CLHP sur colonne à phases inversées C8. La digestion à la carboxypeptidase s'effectue dans NH^CO^ 0,2 M comme il est dit dans la 25 référence (4).

On traite le rlFN-^* avec CNBr (excès 100 fois molaire par rapport à la méthionine) dans l'acide formique à 70% comme il est dit dans la référence (5). On sépare les peptides CNBr par CLHP sur une colonne à phases inver-30 sées C-18. On utilise pour l'élution du peptide un gradient linéaire de 0 à 70% de CH^CN dans l'acide trifluor-acétique à 0,1%.

On hydrolyse des échantillons de protéine ou

10

15

20

23

de peptide pendant 20-24 h dans des tubes scellés, balayés par N2 , évacués dans de l'acide thioglycolique à 4% contenant de l'HCl à ébullition constante. On effectue les analyses d'acides aminés en utilisant un analyseur d'acides aminés à la fluorescamine comme il est dit dans la référence (6).

On utilise un séquenceur en phase gazeuse 4 70A ABI (Applied Biosystem, Inc.) pour les analyses de séquence des protéines carboxyméthylées comme il est dit dans la référence (7). On identifie les échantillons d'acides aminés PTH par CLHP à phases inversées sur une colonne ODS ultrasphère comme il est dit dans la référence (8).

Toutes les étapes de purification sont conduites à 4"C. On met en suspension des cellules congelées (25 g) dans trois volumes (75 ml) de chlorhydrate de guanidine 7 M (pH 7). On agite le mélange pendant 1 h puis on centrifuge pendant 1 h à 30 000 g. On dilue 10 fois le surnageant avec le sel physiologique tamponné au phosphate (STP) de Dulbecco ou un tampon au ûorate de sodium 0,15 M (pH 9,5) puis on centrifuge pendant 30 minutes à 30 000 g. Autre solution, on met en suspension des cellules congelées (25 g) dans 1,5 volume (37,5 ml) de tampon au borate de sodium 0,15 M (pH 9,5) et on agite pendant 1 h. On traite le mélange aux ultrasons 5 fois pendant 30 secondes puis on centrifuge pendant 1 h à 30 000 g. On mélange pendant 1 h les surnageants provenant de l'extraction au chlorhydrate de guanidine ou du traitement aux ultra-sons sur un agitateur rotatif avec 25 ml de silice et on pré-lave avec du STP. On verse le mélange dans une colonne et on lave la colonne avec 20 a 30 fois son volume de NaCl 1 M. On élue alors la colonne avec du chlorure de tétraméthylr?

24

ammonium 0,5 M dans un tampon au borate de sodium 0,01 M (pH 8,0). L'activité d'interféron est éluée dans environ 200 ml et séparée en 4 lots. On charge chaque lot sur une colonne d'affinité d'anticorps monoclonal ( % 2-11.1) (volume de lit 4 ml) équilibrée avec du STP. Après lavage avec 10 volumes de colonne de tampon STP, on élue la colonne avec du chlorhydrate de guanidine 1 M ou de 1'éthylèneglycol à 50% contenant NaCl 1 M et un tampon au phosphate de sodium 20 mM (pH 7,0). L'activité d'interféron est éluée dans les premiers 20 ml.

La SDS-PAGE est conduite comme il est dit par Laemmli (référence 9). On détermine la protéine par analyse à la fluorescamine avec de la sérum-albumine de boeuf cristalline comme standard de référence. On détermine l'activité d'interféron par un dosage d'inhibition de l'effet cytopathique avec le virus de la stomatite vésiculaire et des cellules WISH humaines comme il est dit dans la réference 10. Tous les titres d'interféron sont exprimés en unités de référence/ml calibrées contre le standard de référence d'un interféron immun humain partiellement purifié.

Un résumé du procédé de purification par extraction est présenté au tableau 6 (page 24). La récupération globale est de 25-32% et la purification est d'environ 100 à 769 fois avec une activité spécifique

7

moyenne de 1 x 10 unités/g. Le rendement total de rIFN-^f est 3 à 4 fois supérieur avec l'extraction à la guanidine. La SDS-PAGE du dernier stade de purification est moptrée en figure 1. La matière purifiée par extraction à la guanidine présente une seule bande à environ 18 000 daltons (rIFN-y 18 K) tandis que la matière du procédé de traitement aux ultra-sons donne une bande majeure à environ 15 000 daltons (rIFN-^j" 15 K) et une

25

bande mineure à environ 17 000 daltons (Fig. 1A). Sur gel non réducteur, il se forme des dimères et des oligomères de rlFN-£ (fig. 1B).

Le rIFN-yl8 K est homogène et la composition 5 en acides aminés est compatible avec celle prédite à

partir de la séquence d'ADN. Les compositions en acides aminés des rlFN-^ 15K et 18K sont données au tableau 7. Plusieurs centaines de picomoles de protéine 15K et 18K réduite et carboxyméthylée subissent une dégradation 10 d'Edman dans un séquenceur de protéine/peptide automaitque en phase gazeuse. Les séquences d'acides aminés N-ter-minales des 32 et 26 premiers résidus des protéines 15K et 18K respectivement sont en accord avec ce qui est prédit par la séquence d'ADN (fig. 2). On détecte des 15 cystéines "^C-carboxyméthylées dans les premier et troisième cycles des analyses de séquence. On ne détecte pas de méthionine N-terminale. L'analyse de la séquence N-terminale de rlFN-^ 18K et 15K démontre que la séquence de cette zone des deux protéiRes est identique à celle 20 prédite d'après la séquence d'ADN. On a également caractérisé les peptides C-terminaux pour déterminer s'il y a eu des suppressions ou des modifications dans cette région. L'analyse des acides aminés du mélange de digestion de la carboxypeptidase A (CPA) indique que de 25 la sérine et/ou de la glutamine (acides aminés C-terminaux) sont libérés par le rIFN-j'ISK, tandis que le rIFN-^f 15K n'est pas digéré par la CPA dans les mêmes conditions. Comme Ser-Gln est la séquence C-terminale de rIFN-^f l'espèce 18K semble avoir l'extrémité C intacte 30 tandis que l'espèce 15K a un résidu C-terminal différent (Lys) qui n'est pas clivé par CPA.

Les résidus C-terminaux prédits d'après les séquences d'ADN sont encore confirmés par analyse et séquençage des epptides C-terminaux après traitement à CNBr.

26

On sépare les peptides C-terminaux sur la colonne à phases inversées C-18 de CLHP(fig. 3). Un pic de peptide aigu (pic II), élué à partir de la partie précoce du gradient, est obtenu à partir du rIFN-^f 15K et ce peptide 5 est absent du mélange de digestion par CNBr du rIFN-£ 18K. L'analyse des acides aminés de ce peptide indique que ce peptide n'a pas d'homosérine ou d'homosérine-lac-tone et doit donc être le peptide CNBr C-terminal de la protéine 15K. Sur la base de l'analyse des acides aminés 10 (tableau 8), ce peptide correspond aux résidus acides aminés N° 121-131 d*IFN-^ (aucune arginine n'est détectable). La séquence des 11 acides aminés est confirmée par séquençage (Fig. 2). Dans le cas de rIFN~y 18K, on obtient un pic relativement large dans la partie 15 précoce de l'élution. Ce pic est encore séparé en deux pics par un gradient peu profond. Les analyses d'acides aminés indiquent que le premier pic est le peptide C-terminal CNBr de la protéine 18K (tableau 8) et la composition en acides aminés correspond aux résidus 20 acides aminés N° 138-146. On vérifie la séquence des 9 acides aminés par séquençage (Fig. 2). On détermine que l'acide aminé C-terminal de la protéine 15K est la lysine.

Ces résultats indiquent que l'espèce 18K est 25 la molécule de rIFN-jf' intacte, tandis que l'espèce 15K est un produit protéolytique. La liaison peptidique entre les résidus acides aminés N° 131 et 132 (Lys-Arg) est clivée sur l'espèce 15K.

Tableau b

Purification de rlFN-

Activité Activité totale spécifique unités unités/mg

Extraction à la guanidine

2,5 x 108 9 x 104

1,0 x 108 1 x 106

0,8 x 108 1 x 107

Etape de purification

Surnageant

Silice

Anticorps monoclonal

Surnageant

Silice

Anticorps monoclonal

Protéine totale mg

I.

2,806 98

8

II.

6,136 87

2

Traitement 8,0 x 107 4,5 x 107

2,0 x 107

aux ultra-sons 1,3 x 104 5,2 x 106

1,0 x 107

Purification Rendement nb fois %

100

11 40

110 32

400

100 56

769

25

28

Tableau 1_

Composition en acides aminés de rlFN-^ 15K et 18K (Nombre de résidus)

18K

(1-146)

15K

f1-131)

Asp

20 ^ 9

(20)

19,9

(20)

Thr

5,1

(5)

4,9

(5)

Sec

9,8

(11)

6,7

(9)

Glu

18,5

(18)

15,1

(16)

Pro

*

(2)

*

(2)

Gly

5,9

(5)

5,6

(4)

Ala

8,2

(8)

7,3

(7)

Cys

*

(2)

*

(2)

Val

9,1

(8)

9,1

(8)

Met

4,7

(4)

3,8

(3)

Ile

7,2

(7)

6,6

(7)

Leu

10,5

(10)

9,6

(9)

Tyr

5,5

(5)

4,8

(5)

Phe

10,3

(10)

8 ,2

(9)

His

1,8

(2)

2,5

(2)

Lys

19,9

(20)

16 ,9

(19)

Arg

8,6

(8)

5,6

(3)

Trp

*

(1)

*

(D

25 Les chiffres entre parenthèses indiquent la quantité prédité de résidus de la sequence d'ADN.

Valeurs non déterminées.

30

35

29

Table au 8 Peptides C-terminaux CNBr de 15K et 18K

15K

18K

Thr

0,9 (1)

Ser

1,1 (1)

0,84 (1

Glu

1,1 (1)

Pro

(1)

Gly

1,5 (1)

1,3 (1)

Ala

2,4 (3)

1,1 (1)

Leu

1,0 (1)

1,1 (1)

Phe

1,0 (1)

Lys

1,9 (2)

2,8 (3)

Positions en

séquence

121-131

138-146

Les chiffres entre parenthèses indiquent le nomtire prédit de résidus de la séquence d'ADN.

20 * non déterminé .

25

30

35

<*1

30

REFERENCES

1. Gray, P.W., et al.. Nature 295. 503-508 (1982)

2. Stahelin. T.. et al., J. Biol. Chem. 256. 9750-9754 5 (1981)

3. Allen, G., Sequencing of Protein and Peptides, pp. 30-31 (1981), North-Holland Publishing Co., Amsterdam, New York

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cology, pp. 55-77 (1982), Alan R. Liss, Inc., New York NY.

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20 10. Rubinstein, S., Familletti, P.C., and Pestka, S.. J. Virol. 37, 755-758 (1981).

25

30

35

31

Claims

REVENDICATIONS

1. Procédé pour extraire l'interféron immun humain recombinant intact à partir de microorganismes transformés contenant cette protéine, dans lequel on extrait

5 lesdits microorganismes transformés avec un inhibiteur de protéase.

2. Procédé de la revendication 1 où l'inhibiteur de protéase est le chlorhydrate de guanidine.

3. Procédé de la revendication 1 où les microorganismes 10 transformés sont en suspension dans une solution de chlorhydrate de guanidine.

4. Procédé de la revendication 3 où la solution est du chlorhydrate de guanidine au moins environ 4 M.

5. Procédé de la revendication 1 où la protéine d'inter-15 féron immun hàmain recombinant mûre intacte a un poids moléculaire d'environ 18 000 daltons.

6. Procédé selon les revendications 1 ou 2 où la préparation de microorganisme transformée est séparée après avoir été traitée avec l'inhibiteur de protéase en une fraction de

20 surnageant et une fraction de débrix cellulaire.

7. Procédé de la revendication 6, où l'inhibiteur de protéase est la chlorhydrate de guanidine.