MC1654A1 - Procede et dispositif d'analyse automatique d'echantillons biologiques - Google Patents

Description

La présente invention concerne un procédé nouveau pour l'identification, le tri et le comptage entièrement automatiques de particules de très petites dimensions, et notamment mais non exclusivements des micro-organismes d'origine animale ou végétale, ainsi que pour 1'exp1oitation des résultats obtenus dans des domaines aussi variés que les analyses biologiques telles que celles du lait ou du sang, les contrôles automatiques de pollution bactérienne, par exemple dans le pilotage automatique des stations d'épuration d'effluents industriels ou d'eau potable, ce procédé se caractérisant par sa précision, sa rapidité et son bon marché.

Divers procédés visant à atteindre des résultats semblables sont connus. Par exemple, dans le cas de l'analyse du sang humain, le processus usuel consiste dans un premier temps à préparer manuellement chaque échantillon par divers traitements mécaniques et/ou chimiques, puis à l'examiner au microscope de manière à analyser et compter les divers éléments cellulaires recherchés. Cette technique est longue et laborieuse et comporte cependant un taux d'erreur admis entre 20 et 30 %.

De même, pour analyser et compter les bactéries présentes dans un liquide, l'opérateur doit prélever des échantillons du liquide, puis procéder sur chacun à des cultures permettant de faire apparaître les bactéries, ce qui provoque des délais de plusieures heures, et enfin analyser et compter ces bactéries par référence à des formes connues, avec les mêmes limitations et inconvénients que ci-dessus.

Plus généralement, il n'existe pas de procédé automatique et répétitif permettant d'obtenir les résultats cherchés de manière rapide et continue, tout en évitant l'erreur humaine.

L'invention permet d'atteindre ce résultat par la mise en oeuvre d'une succession d'opérations dont le principe est individuellement connu pour d'autres applications, mais qui sont ici combinées et adaptées l'une à l'autre en vue 5 de ce nouveau résultat.

La première opération consiste à préparer et à déposer de manière automatique et continue une succession d'échantillons sur un support continu, en les répartissant sur un trajet d'exploration d'un système d'enregistrement de tous 10 les échantillons successifs par une caméra vidéo.

La seconde opération consiste dans ledit enregistrement par la caméra vidéo de l'image donnée par un microscope, comportant des éléments optiques particuliers.

La troisième opération consiste dans la décomposition 15 de l'image de chaque échantillon suivant un découpage quadrillé comportant un certain nombre de lignes et colonnes, définissant pour chaque échantillon un certain nombre de zones bien définies ou "pixels", en vue de l'analyse de chaque échantillon conformément à des techniques classiques en elles-mêmes. 20 La quatrième opération consiste dans ladite analyse d'image en fonction du niveau d'éclairement de chaque pixel,au moyen d'un ordinateur, dont les résultats d'analyse sur tous les échantillons sont traités statistiquement puis digitalisés sur imprimante, ce qui permet, non seulement de connaître à 25tout moment le résultat de l'analyse, mais au surplus de suivre avec le temps l'évolution de ce résultat.

La mise en oeuvre de ces diverses opérations appelle un certain nombre de commentaires :

Commentaires sur la première opération : 30 Chaque échantillon subit une préparation physico

chimique, en amont de la phase de dépôt sur le support. Cette préparation est comparahle aux traitements usuels pour le produit considéré, mais moyennant certaines modifications.

Ainsi, dans les techniques antérieures, par exemple 5 la phase de "coloration" n'avait pour but que de rendre visibles toute une catégorie de cellules telles que les bactéries, sans préjuger de leur état de développement ou de mort. Selon la présente invention, la coloration a pour but d'indiquer l'état viable de certaines cellules et de les visualiser sans co-10 lorer les artefacts.

De même, après la coloration, l'application d'un traitement d'épifluorescence (en général en rayonnement UV par dessus),dont la ré-émission est filtrée permet la mise en évidence de toutes les cellules contenant un noyau, tandis qu'un 15 traitement d'immunofluorescence permet de les extraire de façon spécifique.

Enfin,chaque échantillon est déposé automatiquement par pulvérisation, ou par soufflage sur le support continu,

sous forme de gouttes calibrées d'épaisseur et de diamètre 20 constants.Ces gouttes sont réparties de façon régulière et homogène sur le support, pour être vues successivement par la caméra. Dans une première réalisation, le support est un disque horizontal tournant autour de son axe, et les gouttes sont déposées eil cercles concentriques, de manière à être explorées

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soit suivant lesdits cercles successifs, soit par une exploration alternativement radiale et circulaire. Selon une seconde réalisation, le support est une bande continue se déroulant depuis un rouleau d'alimentation et s'enroulant sur un rouleau récepteur, le tout étant logé dans une cassette jetable. Cela 30 élimine la nécessité de laver le support comme dans le cas du

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disque. En général, 1mm représente le nombre de gouttes dont le résultat statistique est pris comme valeur pour un échantillon, et ainsi de suite pour les suivants. Bien entendu,après chaque mesure, le support subit un lavage, contrôlé automatiquement. 5 Commentaires sur la seconde opération :

Le système utilisé comprend la combinaison d'un micros cope équipé d'une optique spéciale, et d'une caméra vidéo, dont la photo est transmise à un microscope transmettant des informations en continu, il était donc nécessaire d'en assurer une 10 mise au point correcte en permanence. A cet effet, il est prévu entre l'objectif et le support d'échantillons une vis micrométrique garantissant une focalisation mécanique constante. Ce microscope est de préférence éclairé en UV directs, puisque l'observation est photographiée par la caméra, qui peut recelé voir davantage de lumière que l'oeil humain.

Commentaires sur la troisième opération: La photographie de l'échantillon par la caméra est ; i transmise à l'ordinateur qui va procéder à son analyse conformément à des techniques complexes mais bien connues. De ce 20 fait il n'est pas nécessaire de développer la description de ces techniques. On se bornera donc à rappeler que l'image étant envoyée en mémoire dans l'ordinateur ("acquisition"), on détermine d'abord la valeur minimum de 1'ëclai rement d'un pixel correspondant à une particule à prendre en considération 25 ("seuillage"), puis, ce seuil étant fixé pour un échantillon, on détermine le contour de chaque particule. On notera toutefois que c'est en particulier par l'exploitation de cette technique que le procédé de l'invention se différencie fondamentalement des techniques manuelles classiques, qui se

30 bornaient à une comparaison visuelle avec une série de formes

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données. Cette différence se traduit à la fois par la précision et la rapidité des opérations, par opposition à la simple comparaison visuelle, lente, imprécise, et source d'erreurs .

La phase suivante de cette opération est le tri entre les particules ainsi définies par leurs dimensions et leurs formes. Ce tri s'effectuant pour chaque goutte, les résultats de toutes les gouttes sont ensuite traités statistiquement, ce qui assure la précision des informations recueillies, aussi bien en un moment déterminé que dans leur évolution dans le temps.

Bien entendu, la technique générale de l'analyse d'image ou de forme ("pattern récognition") étant devenue classique, toutes les opérations auxiliaires également connues dans cette technique sont utilisables, telle que le prétraitement de l'image en vue de l'élimination des "bruits de fond", pour bénéficier d'une image plus nette, le filtrage, la dilatation, l'érosion ou la s que le11is ation de l'image, ces techniques pouvant intervenir dans ces cas spécifiques .

On va maintenant illustrer l'invention en se référant à deux exemples d'applications pratiques de ce procédé.

Exemple 1.

Dans cet exemple, le procédé selon l'invention est appliqué àrecherclier des bactéries dans le lait.

Dans ce cas, la première opération comporte la coloration de l'échantillon au moyen d'acridine orange à

pH 6. Dans la goutte vont alors apparaître : les globules de graisses, non colorés, les leucocytes vivants, de

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forme semblables aux globules de graisse,mais qui en sont différenciés par leur coloration, les bacilles, en forme de bâtonnets, et les coques en forme de ronds, apparaissant avec ou sans acide ribonucléique (ARN) en cours de "mort"

5 et acide desoxyribonucléique (ADN) revivifiab1es. On connait donc ainsi dès lors le nombre de germes totaux et le nombre de leucocytes, que l'on identifie par epifluorescence, par éclairage par dessus à UV 400 u, avec réémission d'un spectre vers 600 nano u que l'on peut filtrer.

]0 On peut alors, dans les bacilles, rechercher le clostridium butyricum et le pseudomonas fluorescens. Pour les extraire on utilise 1'immunofluorescence avec un sérum correspondant au germe cherché et un colorant spécifique .

15 On procède alors aux opérations suivantes sur l'échantillon, toujours à basse température :

a On obtient les germes totaux en ajoutant à l'échantillon 1 % de cyanure et 10 % d'acridine orange,et en soumettant des gouttes du produit de réaction aux

20 opérations 2 et 3.

b^ On obtient le pseudomonas seul en recommençant l'essai a_, mais sans colorant.

c_ On obtient le clostridium seul en recommençant a., mais en ajoutant à la fois l'acridine orange et le sérum spécifique coloré.

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Quel que soit le processus a_, b ou c choisi, on photographie alors l'image donnée par le microscope par une caméra, la photo étant transmise en mémoire d'ordinateur sous forme d'un rectangle découpé par 512 lignes et 512

30 colonnes, soit 262144 points ou pixels. La profondeur de

chaque point c'est-à-dire la quantité de lumière reçue, est représentée par un chiffre ou "bit". Dans le cas présent, on utilise six bits, soit 64 niveaux, le zéro correspondant au noir et le 63 au blanc. Les images,

étant des objets éclairés, se détachent sur fond noir (aux parasites près). Au départ d'une opération d'analyse, on fixe la valeur minimum d'éclairement (seuil) à partir de laquelle un point va être décompté comme élément d'objet. Ce "seuillage" étant fixé, on passe à la phase "contour", c'est-â-dire la détermination du périmètre de chaque objet, et on répertorie tous les objets dans un tableau, dans lequel, selon les coordonnées de chaque périmètre, on en détermine un certain nombre de paramètres tels que la "plus grande longueur", ainsi qu' un "facteur de forme", qui, à partir du cercle, pris arbitrairement pour = 1, conduit à séparer les objets "longs" des objets "ronds". On trie alors dans le tableau les seuls objets intéressants en fonction des paramètres choisis, et les résultats sont enfin traités statistiquement, pour chaque goutte et pour l'ensemble des gouttes. Dans le cas présent l'analyse d'une goutte représente une seconde et demi,

avec un pourcentage admis d'erreur de 5 %. Ces valeurs sont à rapprocher des durées, et de la marge, d'erreur admises jusqu'à présent, et elles résultent de l'automatisation complète des opérations.

Exemple 2 : Analyse du sang.

L'application du procédé de l'invention permet dans ce cas non seulement d'évaluer avec rapidité et précision les cellules proprement dites, c'est-à-dire les globules rouges et les globules blancs, mais également de

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déceler et de compter automatiquement les parasites qu'ils contiennent, et qui n'avaient jamais pu faire l'objet d'une telle opération antérieurement en raison de leur très petite taille. Ainsi par exemple, grâce à 5 l'invention, il est maintenant possible de procéder à la recherche et au comptage automatique des parasites du paludisme dont la dimension est de l'ordre de 2 microns.

Plus précisément, l'analyse du sang par le procédé selon l'invention est réalisée en suivant le 20 processus suivant :

En premier lieu, le dépôt sur le support est effectué de manière continue et automatique par pulvérisation ou soufflage. Cela représente un progrès par rapport aux techniques antérieures où chaque goutte de sang était 15 écrasée entre un support et une plaquette de verre, ce qui détruisait ou altérait les cellules.

La phase de coloration à l'acridine orange à pH 6 a pour résultat une différenciation entre les globules rouges qui, étant sans noyau, ne contiennent ni ARN ni 20 ADN et demeurent donc non colorés, tandis que, au contraire, les globules blancs, étant vivants, contiennent un noyau et diverses inclusions, qui prendront des colorations différentes (ADN pour le noyau, ARN pour les inclusions).

Par contre, dans le cas de la présence de 25 parasites sanguins à l'intérieur d'un globule rouge, ces parasites seront mis en évidence par coloration car ils contiennent de 1'ADN et de 1'ARN.

On procède à l'analyse d'image conformément aux techniques générales évoquées précédemment, mais en 30 prenant en compte la complexité des "objets".

En effet, si les globules blancs, colorés, sont bien connus et faciles à identifier et à compter, à partir de leur contour, on trouve, à l'intérieur de ce contour extérieur un ou plusieurs contours intérieurs, 5 constituant des noyaux, à l'intérieur desquels, on peut déceler encore d'autres constituants. Il devient alors possible, en fonction du nombre d'objets décelés, d'identifier et compter différents types de constituants polynucléaires .

10 II en est de même pour les parasites des globules rouges, ce qui représente une grande originalité du présent procédé. Ainsi par exemple, le parasite du paludisme se présente sous forme d'un anneau ouvert (ARN) portant à ses deux extrémités des excroissances ou chatons (ADN), ce qui, malgré 15 leur très petites dimensions (2 microns) permet pour la première fois leur comptage automatique et continu dans le sens soumis à l'analyse.

Les applications de ce nouveau procédé, été évoquées au début,sont en fait pratiquement illimitées, 20 et notamment dépassent le simple comptage de particules dans un liquide. Ainsi on peut en envisager l'application au tri et au comptage de défauts de surfaces dans des matériaux solides. L'adaptation de ce procédé à de telles applications aifera l'objet de futurs additifs au présent 25 brevet.

Claims (1)

1. RESUME

   Procédé pour l'identification, le tri et le comptage continus et automatiques de particules de petites dimensions, selon la revendication 1 du Brevet Principal, caractérisé en ce qu'il consiste, dans une première opération à 5 préparer et déposer de manière continue une succession d'échantillons sur un support en déplacement continu, en les répar-tissant sur le trajet d'exploration d'un système d'enregistrement par une caméra vidéo des images de ces échantillons données par un microscope, dans une seconde opération, à pro-^ céder audit enregistrement, dans une troisième opération à décomposer l'image de chaque échantillon suivant un découpage quadrillé en vue, dans une quatrième opération de l'analyse de ladite image conformément aux techniques dites de "pat-tern récognition", et enfin à traiter statistiquement les 15 résultats de cette analyse, à les digitaliser et à les délivrer matériellement à l'opérateur.

   C. C"

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