MC1822A1 - Bacteriocines et compositions antivirales les contenant - Google Patents

Description

Les globules blancs du sang comprennent, entre autres composants, les cellules (lymphocytes) B et T.

Parmi les virus qui sont connus comme infectant les cellules T, un virus d'importance médicale extrême est le HTLV-III rétrovirus qui a été récemment identifié comme le virus responsable du Syndrome Immuno Déficitaire Acquis ou SIDA. On a montré que le virus HTLV-III (actuellement connu sous le nom de HIV), entrant en jeu dans le SIDA, peut infecter les cellules T-4 du sang et éventuellement les détruire. Les cellules suppresseurs T-8 ne sont pas sujettes à ces infections.

Une autre infection virale médicalement importante est la mononucléose infectieuse provoquée par le virus d'Epstein-Barr (EBV). On connaît un grand nombre d'autres virus infectant les cellules des mammifères, qui comprennent les virus de la grippe ainsi que d'autres.

Le virus du SIDA est bien entendu actuellement un problème médical particulièrement aigu, pour lequel on ne dispose généralement pas encore d'antidotes ayant une efficacité cura-tive prouvée. Le virus du SIDA peut infecter les cellules T du sang d'un patient et y rester en sommeil pendant de longues durées Cependant, lorsqu'un certain facteur déclenche sa reproduction, il transforme rapidement les cellules T hôtes jusqu'à ce qu'elles soient incapables d'exercer leur fonction immune contre les envahi seurs de l'organisme.

Des chercheurs ont précédemment identifié et isolé des protéines d'origine bactérienne maintenant dénommées bactério-cines. Ces protéines sont produites par une grande variété de bactéries, tant à Gram positif qu'à Gram négatif, et sont dénommées d'après la souche productrice. Les bactériocines agissent sur des souches bactériennes spécifiques qui sont normalement étroitement . liées à la souche productrice et empêchent leur multiplication en les tuant. La spécificité réside dans l'hétérogénéité antigénique des bactériocines et Leur interaction avec des récepteurs spécifiques à La surface des souches de bactéries sensibles. Les bactériocines peuvent varier par leur mode d'attaque sur leurs bactéries-cibles. Elles peuvent agir en inhibant toute la synthèse macromolécuLaire ou en inhibant des processus sélectifs dépendant d'un transport d'électrons et affectant le transport de K+ et la

production d'ATP. Certaines bactériocines peuvent réagir avec Les ribosomes en affectant ainsi de manière spécifique La synthèse des protéines ; d'autres inhibent La croissance ceLLulaire en provoquant La dégradation de L'ADN. Les bactériocines ayant en commun Leurs modes d'action ne sont pas nécessairement apparentées du point de vue de La structure ou du point de vue des antigènes.

L'utilité des bactériocines comme inhibiteurs séLec-

!

tifs de La croissance de ceLLuLes néopLasiques et tumorigènes a été récemment reconnue et a fait L'objet de pubLications. Dans Le ICRS JournaL of Médical Science, VoLume 4, pages 291-295,

juiLLet 1976, Farkas-HimsLey signaLe L'aptitude de La pyocine 1-4 à.inhiber La croissance de tumeurs induites par des cellules de fibrosarcome KHT chez la souris^tout en restant non toxique pour Les cellules non tumorales. Dans Eur. J. Clin, Oncol, 19,

pages 163-171 (1983), des chercheurs indiquent la capacité d'une bactériocine, la colicine HSC-lO,à inhiber de manière sélective la croissance de lymphocytes leucémiques de sang périphérique par rapport aux lymphocytes normaux et aux cellules de moelle osseuse voisines non cancéreuses.

L'aptitude des bactériocines à distinguer les cellules malignes des cellules saines a conduit à des spéculations quant au mode d'action de la bactériocine sur Les cellules-cibles ma-Lignes. On a proposé une hypothèse qui suggère que le phénotype oncogène de la cellule maligne est reconnu par La bactériocine et conduit éventuellement à l'incorporation et à l'interaction de la bactériocine dans sa cible finale, la mécanique métabolique ou génétique à L'intérieur de la cellule-cible. Cette hypothèse est supportée par l'observation du fait que La bactériocine est inoffensive pour les cellules saines normales ne possédant pas le phénotype oncogène et la capacité de métastase.

Un objet de La présente invention est de proposer un moyen pour la détection de cellules de mammifère infectées par un virus.

Un autre objet de la présente invention est de proposer des substances et des compositions qui peuvent être utilisées dans la thérapie de diverses infections et maladies induites par des virus.

3

La présente invention repose sur L'observation du fait que Les bactériocines sont capabLes de distinguer Les ceLLuLes de mammifère infectées par un virus et Les ceLLuLes de mammifère normaLes saines. Cette observation est à opposer aux observations précédentes de L'attaque des ceLLuLes cancéreuses par La bactériocine, dans L'hypothèse préaLabLe que Les bactériocines reconnaissent des éLéments de La morphoLogie de La celluLe qui sont manifestés par L'état oncogène de La cellule maligne. On pense en général que les cellules malignes possèdent des constituants de la membrane cellulaire qui confèrent à la cellule ses propriétés de croissance non réglée, non auto-limitée,qui à leur tour permettent la métastase. D'autre part, les cellules de mammifère infectées par un virus qui ne sont pas malignes sont auto-limitées quant à leurs schémas de croissance. On n'a pas trouvé jusqu'à présent que ces cellules étaient réceptives au mode d'action de la bactériocine.

On entend ici par "maligne" une cellule "ayant la propriété de croissance et métastase localement envahissante et destructrice", c'est-à-dire telle que définie dans Le Medical Dictionary de Stedman, 24e édition, Williams and Wilkins, Baltimore, Londres, 1982.

En conséquence, on comprendra facilement que les cellules de mammifère infectées par un virus mentionnées ici ne sont pas des cellules tumorigènes ou malignes du fait que Les cellules de mammifère infectées par un virus ont une croissance auto-limitée et possèdent un schéma de croissance qui, à première vue,n'est pas caractéristique des cellules malignes.

Selon la présente invention, on propose donc des bactériocines et des compositions les contenant pour L'utilisation dans le traitement de ceLLuLes de mammifère infectées par un virus.

On propose également dans le cadre de La présente invention un moyen pour déceler la croissance de cellules de mammifère non malignes, infectées par un virus, qui consiste à traiter ces cellules par des bactériocines et des compositions Les contenant.

Les bactériocines utiles dans la présente invention semblent avoir dans Leur structure chimique un site ou centre qui réagit de manière spécifique et sélective avec la cellule infectée par un virus. En outre, il semble que des doses appropriées des bactériocines tuent sélectivement les cellules infectées par un virus, sans affecter pratiquement les cellules saines, normaLes.

Ces bactériocines sont/dans de nombreux cas,les mêmes que celles qui tuent en les distinguant diverses cellules cancéreuses telles que fibrosarcome, leucémie lymphoblastique aiguë (LLA), carcinome cervical, adénocarcinome, carcinome des cellules squameuses, leucémie myélogène chronique, leucémie pro-lymphocytique, mastocytome et de nombreuses autres, ou inhibent Leur croissance. Des exemples spécifiques de bactériocines utiles dans la présente invention comprennent les pyocines, les vibrio-cines, les mycobactériocines et les colicines. On préfère spécialement pour l'utilisation dans l'invention La pyocine 1-4 et La colicine HSC10.

Les cellules de mammifère non malignes, infectées par un virus peuvent être décelées dans le cadre de la présente ivention par le traitement de ces cellules par une bactériocine.

Plus particulièrement, les cellules infectées par des virus peuvent être décelées par la croissance ou La mort des cellules traitées par la bactéricine.

Il existe un certain nombre de procédés connus de l'homme de l'art comprenant, mais sans limitation, les déterminations .Cou dosages) par fixation (fixation sur une enzyme, fixation de fluorescence et fixation de radioactivité) et les déterminations par absorption métabolique, y compris l'absorption de thymidine tritiée, La cytométrie d'écoulement, qui pourraient être utilisés efficacement pour déceler Les cellules non malignes, infectées par un virus, traitées par une bactériocine.

Les bactériocines peuvent être préparées en utilisant les techniques standards connues de fermentation bactérienne utilisant une souche de bactéries qui est capable de produire une bactériocine. On fait pousser les bactéries dans un fermenteur jusqu'à La phase exponentielle. Elle est suivie d'induction par l'utilisation d'un agent chimique ou physique convenable, qui provoque la synthèse de la bactériocine par la plupart des cellules (90-99 % d'entre elles). Un exemple d'un inducteur approprié est la myto-mycine C, à une teneur d'environ 0,5 pg/mL- Ensuite, on fait encore incuber Les cellules. Dans le cas de certaines cultures, la bactériocine est sécrétée dans Le milieu de fermentation. Dans d'autres

5

cas, les cultures ne libèrent pas la bactériocine, de sorte qu'il est nécessaire de briser la paroi cellulaire. Ceci peut être fait sous pression (par exemple 140 MPa) en utilisant une cellule de pression French. La bactériocine brute peut être séparée des débris 5 cellulaires par centrifugation et elle est ensuite contenue dans le liquide surnageant.

Après avoir récupéré le liquide surnageant, on peut utiliser des procédés classiques de séparation biochimique pour purifier la bactériocine. Par exemple, on utilise de préférence 10 le sulfate d'ammonium à diverses concentrations, initialement.

On sépare ensuite le sulfate d'ammonium résiduel par dialyse contre l'eau. On peut ensuite chromatographier le précipité contenant la bactériocine désirée sur une colonne d'un échangeur de cations faible tel qu'un "Sephadex DEAE-50" et séparer ses diverses protéines 15 par contrôle de l'absorption à 280 nm. On peut déterminer les fractions actives parmi les protéines ainsi séparées et les sélectionner en fonction de l'efficacité avec laquelle es portions aliquotes tuent les souches bactériennes connues comme étant sensibles à la bactériocine, c'est-à-dire la souche indicatrice. 20 on réunit ensuite les fractions de protéines actives. On peut mettre en oeuvre une nouvelle purification par chromatographie liquide haute performance CCLHP) basée sur la charge des protéines. On peut séparer l,es divers pics obtenus par contrôle de l'absorption à 280 nm et déterminer à nouveau leur activité contre la 25 souche indicatrice. La pureté finale de la protéine bactériocine peut être déterminée par électrophorèse au dodécylsulfate de sodium sur gel de polyacrylamide (SDSPAGE). La présence d'une bande principale après coloration par l'anazolène de sodium indique que la pureté de la bactériocine a été atteinte. Un exemple de purification de la vibriocine et de la colicine apparaît dans Microbios, 1969, 1B pages 87-89 et Cytobios, 1985, 42, pages 193-207, respectivement.

Ainsi donc, l'isolement sélectif et la purification des bactériocines appropriées pour l'utilisation dans la présente invention sont bien de la .compétence de l'homme de l'art. Les techniques de routine de production et sélection de bactériocines

comme décrit ci-dessus donneront facilement au technicien spécialisé des bactériocines spécifiques qui sont actives contre des cellules de mammifère infectées par un virus. Bien que la description suivante de modes de mise en oeuvre préférés spécifiques del'in vention décrive des bactériocines spécifiques particulières que l'on a trouvées actives et efficaces contre des cellules B et T infectées par des virus spécifiques telles que décrites, l'invention n'est nullement limitée à l'utilisation de ces bactériocines particulières Les bactériocines utiles dans la présente invention doivent être utilisées en quantité relativement faible, à titre

!

de précaution contre les problèmes de toxicité. Dans les études de toxicité effectuées sur des souris, la dose répétée efficace de 10 p.g par animal était efficace à 100 % sans effets toxiques quels qu'ils soient sur les souris. Cependant, la toxicité est manifeste avec des concentrations croissantes de bactériocines.

Avec des souris de souche C3H/J, des doses de 80 à 100 jag par souris étaient fatales. Avec d'autres espèces de souris telles que l'hybride C3DX2F1/J, on a remarqué une résistance dix fois plus grande que pour les souris C3H/J et la toxicité était atteinte

à 1 000 |ag par souris.

Etant donné que l'on préfère qu'une dose unitaire de la bactériocine ait pour but d'affecter un million de cellules infectées par un virus, on préfère administrer de 0,01 à 10 jag de bactériocine par traitement, de préférence de 0,1 à 1 ng par traitement. Des doses répétées de cette importance peuvent être administrées. On préfère ajouter la bactériocine à une population

-5 -2

donnée de lymphocytes pour arriver à un taux de 10 à 10 ng

-4 -3

par cellule-cible,mieux encore de 10 à 10 ng par cellule-cible. Cet ordre de grandeur de dose est considérablement plus faible que la dose nécessaire pour traiter des cellules cancéreuses.

La forme de dosage de la composition est commandée par les cas d'application des compositions de l'invention. Les compositions sont de préférence préparées en solutions pour l'injection parce que les bactériocines sont des protéines et seront digérées par les enzymes de l'estomac et également, de préférence, parce que les compositions sont utilisées dans l'attaque des lymphocytes.

En conséquence, Les supports préférés sont des milieux aqueux tampon nés et au sérum physiologique. Ces solutions sont formulées selon de techniques habituelles.

Les exemples spécifiques suivants illustrent encore l'invention.

Exemple 1 - Préparation de la bactériocine HSC10

A 200 l de milieu d'infusion cerveau et coeur (BHI, Difco Labs, Détroit, Michigan, USA), on ajoute un inoculum de La souche bactérienne productrice E. Coli HSC-10 que L'on a fait pousser pendant une nuit. On fait pousser la culture à 37°C jusqu'à ce que La croissance bactérienne atteigne la phase exponentielle. On ajoute ensuite à la culture un inducteur, à savoir la Mitomy-cine C,en quantité de 0,5 jjg/ml et on fait continuer la croissance pendant encore 4 à 5 heures.

On centrifuge le bouillon résultant dans une centrifugeuse Sharples pendant 90 minutes pour former un bouillon surnageant que l'on jette et un bouton ou pellet de matière solide et semi-solide. Le pellet a une masse humide de 505 g. On broie ensuite le matériau cellulaire dans le pellet en utilisant une cellule de pression French et on remet en suspension la matière résultante dans 1 % de son volume initial de tris (0,05M, pH 7,8). On centrifuge la suspension résultante et on jette le pellet de débris cellulaires.Le produit surnageant ainsi obtenu, contenant le lysat qui contenait la bactériocine brute, est transformé et purifié comme décrit ci-dessous à l'exemple 2.

Exemple 2 - Purification de la bactériocine

On débarrasse le Liquide surnageant contenant la bactériocine brute, obtenu à l'exemple 1, des protéines autres que la bactériocine active par précipitation par le sulfate d'ammonium à diverses concentrations. On garde la protéine qui est relarguée à une concentration de 35-50 % de sulfate d'ammonium dans le liquide surnageant et on jette le Liquide surnageant. On dialyse contre l'eau Le produit conservé, on centrifuge à 46 OOOxg et on conserve le liquide surnageant résultant à -20°C avant la purification suivante.

Après liquéfaction, on soumet le liquide surnageant

I

congelé à la chromatographie sur "Sephadex - DEAE A-50 ' et on le

recueille par fractions séparées en utilisant NaCl 0,0-1,0M dans le tampon tris 0,01M à pH 8,2 comme éluant et en contrôlant l'absorp tion à 280 nm.

On réunit les fractions intéressantes et on détermine leur activité contre la souche indicatrice E. Coli Y10 en utilisant le test de turbidité. En particulier, on utilise comme inoculum la souche indicatrice que l'on a fait pousser dans le milieu d'infusion cerveau-coeur à 37°C pendant une nuit pour obtenir la croissance exponentielle jusqu'à un nombre de cellules spécifique. On mélange ces bactéries avec des dilutions 2 x de la bactériocine partiellement purifiée comme décrit ci-dessus et on enregistre par spectrophotométrie l'inhibition de croissance de la souche indicatrice. Des courbes de réponse de croissance sont produites par ces mesures de turbidité, à partir desquelles on calcule les unités létales par ml de la colicine HSC10 eu égard à la concentration connue de bactériocine ajoutée au nombre connu de cellules de la souche indicatrice dans le milieu. La LU50, unités létales par ml nécessaires pour tuer 50 % de la population de souche indicatrice, est indiquée dans le tableau I ci-après et discutée en référence à ce tableau.

La purification ultérieure des fractions réunies est mise en oeuvre en utilisant la chromatographie liquide haute performance (CLHP) et on réunit les fractions recueillies au pic

I

d'absorption de 280 nm et on soumet des portions aliquotes au même test de turbidité que décrit ci-dessus.

On détermine la pureté de cette fraction finale par analyse SDS-PAGE par laquelle, après coloration par l'anazolène de sodium, on confirme la pureté de la bactériocine par la présence d'une bande principale.

Le tableau I ci-dessous indique les quantités de bactériocine récupérées à chaque étape dans la méthode décrite ci-dessus et l'activité bactéricide de ces quantités.

9

Tableau I Purification de la Colicine HSC

Protéine

•10

Activité de bactériocine*

Produit essayé

Totale (mg)

% de la valeur initiale

LU50

(p.g/ml)

Facteur Activité de puri-Spécifique fication

10

15

20

25

30

35

Lysat brut

Fraction 35-50 % de précipité

Fraction 35-50 % après "Sephadex DEAE-A50"

!

Produit actif du Sephadex après CLHP-DEAE

15 674 1 298

139,8 15,9

100 8,28

0,89 0,10

0,67 4,3 x 10 0,56 4,3 x 10

-5

-4

0,16 1,1 x 10

-3

10

26

0,63 4,0 x 10 930

* déterminée contre des bactéries par le test de turbidité.

On notera que la quantité de colicine HSC10 provenant du lysat de culture est seulement d'environ 0,10 % du poids initial du lysat ; ceci suggère que, de préférence, de grands volumes de bactéries sont cultivés pour produire les quantités nécessaires de bactériocine. La technique de purification préférée ici est suffisante pour établir un facteur de purification, rapporté à l'activité bactéricide de la protéine, de 930 auquel il faut seulement 0,63 p.g/ml de bactériocine pour inhiber la croissance de 50 % de la population de la souche indicatrice. La fraction qui est isolée pour l'étude ultérieure dans les exemples 3, 4 et 5 et dénommée ci-après HSC-10 provient du précipité après traitement par le "Sephadex-DEAE - A50".

Exemple 3 - Sélectivité de la Colicine HSC10 dans l'identification de leucocytes infectés par un virus in vitro

On enrichit sur "Ficoll-Paque" (marque déposée, Pharmacia Fine Chemicals, Dorval, Québec, Canada) des lymphocytes obtenus à partir de 14 patients différents atteints de SIDA, on les compte et on les divise en groupes d'expérience et groupes témoins. La colicine HSC10, extraite et purifiée comme décrit ci-dessus, est diluée dans le tampon tris à pH 7,4 et ajoutée à

h

10

la population expérimentale de lymphocytes pour arriver à un

-5 -2

rapport de 10 à 10 ng de bactériocine par cellule-cible. La population témoin reçoit seulement le diluant au tampon tris.

On distribue les deux populations de cellules dans 5 des microgodets et on les fait pousser pendant une nuit en présence de ^H-thymidine à 37°C en présence d'air humidifié à 5 % de C^. Ensuite, on récolte les cellules, on les débarrasse de l'excès de H-thymidine par lavage et on les fait passer dans un compteur à scintillation pour évaluer l'absorption de radioactivité qui est 10 un indice du métabolisme cellulaire et de la croissance. L'effet de la bactériocine est évalué par la réduction en % du nombre de désintégrations par minute (dpm) dans le groupe traité à la bactériocine par rapport aux groupes témoins.

Dans une expérience en parallèle, on ajoute de la 15 bactériocine à des lymphocytes obtenus chez 9 individus sains et on compare,par le test d'absorption de la ^H-thymidine, avec les lymphocytes sains témoins soumis seulement au diluant tampon-tris de la bactériocine.

On soumet aux essais un troisième groupe comprenant 20 3 patients d'un groupe SIDA à haut risque (par exemple des hémo-phi les), bien que la présence de SIDA chez ces patients n'ait pas été confirmée.

On mesure l'absorption de ^H-thymidine dans chacun des trois groupes en pourcentage du groupe témoin constitué dans 25 chaque cas par les patients dans les groupes respectifs sans traitement par la bactériocine.

Aux concentrations appliquées, la bactériocine présente les effets sur le nombre de lymphocytes infectés par HTLV-III (SIDA) des patients atteints de SIDA et sur les lymphocytes des 30 suspects de SIDA et des individus normaux sains indiqués dans le tableau II ci-dessous.

11

Tableau II

10

15

20

25

30

35

Absorption de La ^H-thymidine en % du témoin

Gamme Moyenne

Patients atteints de SIDA

15 tests (sur 14 patients différents) Inhibition 20-86 53

Inhibition Limite 99-105 102

Stimulation >110 270

Suspects de SIDA

3 tests (sur 3 patients différents) Inhibition

105

Inhibition Limite (90-110)

100-111 >110

145

Stimulation Normaux

14 tests (sur 9 individus différents) Inhibition

Inhibition Limite (90-110)

Stimulation

43-67 90-95 >110

51 93 166

Nombre de résultats de tests dans chaque catégorie

8 sur 15 (53%) (7 sur 14 patients)

2 sur 15 (13%) (2 sur 14 patients)

5 sur 15 (33%) (5 sur 14 patients)

0 sur 3 2 sur 3

1 sur 3

*4 sur 14 (29%) (4 sur 9 individus)

2 sur 14 (14%) (2 sur 9 individus)

8 sur 14 (57%) (7 sur 9 individus)

40

* Comme décrit ci-dessus, quatre échantillons prélevés sur des individus du groupe "normal", dont on sait qu'ils n'ont pas le virus du SIDA, sont sensibles aux bactériocines dans le test d'inhibition de l'absorption de la^H-thymidine, ce qui indique une infection virale. On confirme ultérieurement par le test à la 2-5 A synthétase que tous ces individus "faux positifs" sont atteints d'autres infections virales. Ce dernier test,décrit dans Journal of Infectious Diseases, Read, S.E. et autres, septembre 85, est largement connu et accepté dans la technique pour Le diagnostic précoce des infections virales. Dans une étude ultérieure, l'un des patients "faux positifs" présente une stimulation, contrairement à l'inhibition de l'absorption de la ^H-thymidine.

Si

12

Dans Les 15 tests effectués sur Les patients atteints de SIDA, 53 % présentent une inhibition de L'absorption de thymidine et 13 % présentent une inhibition Limite. Inversement, dans Les 14 tests effectués sur Les individus normaux, 57 % présentent une stimuLation effective de L'absorption de thymidine, 14 % présentent une inhibition Limite et 29 % (4 sur 14) présentent L'inhibition.

Aucun des trois patients suspects de SIDA ne présente de sensibiLité à La bactériocine. Au moment de ce test, Les tests et Les observations confirment qu'aucun de ces patients n'était porteur du virus du SIDA.

En résumé, un effet remarquable peut être observé à partir des résultats présentés dans Le tableau II. D'abord, le nombre de lymphocytes SIDA présentant L'absorption de La radioactivité est notablement réduit lorsque l'on introduit la bactériocine. En second Lieu, et cela est important, la croissance des lymphocytes normaux soumis aux mêmes concentrations de bactériocine ne semble pas être altérée (71 %). Ce qui est encore plus intéressant, 57 % des lymphocytes normaux qui ont été soumis à La bactériocine présentent une augmentation du comptage de radioactivité en comparaison avec ceux non traités. Ceci signifie une stimulation de la croissance des lymphocytes normaux, réponse qui permettra probablement à un nombre important de patients traités par La bactériocine d'avoir une plus grande immunité contre d'autres infections affectant des patients atteints de SIDA.

Pour identifier plus particulièrement la cible de l'attaque par la bactériocine sur les lymphocytes infectés par le

SIDA, on utilise des anticorps monoclonaux. On sait que le rapport des cellules productrices d'auxiliaires-inducteurs (sous-ensemble T,)

4

aux cellules productrices de suppresseurs (sous-ensemble Tg) qui interfèrent avec la réponse immune du patient atteint de SIDA, c'est-à-dire le rapport T^/Tg, est réduit chez Les patients atteints de SIDA - voir Evatt et autres, New England Journal of Medicine,

Vol. 313, page 4S3. Les cellules productrices d'auxiliaires-inducteurs (sous-ensembLe T^), qui activent les réponses immunes et sont donc des composants vitaux des défenses de l'organisme,

sont infectées par les virus HTLV-III et Leur fonction est altérée

13

ou inexistante. On a donc effectué des expériences dans Lesquelles on a utilisé des anticorps "monoclonaux spécifiques contre les cellules (New England Nuclear, numéro de catalogue NEN-038) et contre les cellules Tg (New England Nuclear, numéro de cata-5 logue NEI-039) pour évaluer la présence et les nombres de lymphocytes et Tg après traitement par la bactériocine de lymphocytes provenant d'un patient atteint de SIDA.

On trouve que les nombres de lymphocytes producteurs de suppresseurs (Tg)restent inchangés après traitement par La 10 bactériocine, tandis que Les nombres de cellules T^ infectées sont considérablement réduits.

En particulier, le test est effectué en utilisant des anticorps monoclonaux spécifiques dirigés contre Les cellules

T, et T0 décrites ci-dessus, préparés par le. procédé portant le 4 o

15 nom de Technique des Hybridomes. Cette technique est largement utilisée par l'homme de l'art.

Les anticorps monoclonaux contre T^ ou Tg ainsi préparés sont marqués par un composé fluorescent (par exemple l'iso-

cyanate de fLuorescéine) qui peut être décelé par suite de la 20 fluorescence du colorant en lumière ultraviolette.

Les cellules T^ et Tg sont ensuite associées avec leurs anticorps fluorescents respectifs et comptées en lumière ultraviolette.

Chacun des patients atteints de SIDA soumis au test 25 présente une diminution de 14-21 % de leurs lymphocytes T,. Leurs lymphocytes Tg sont soit pas affectés du tout, soit nominalement stimulés ou inhibés en présence de bactériocine.

Ainsi donc, selon Le mode de mise en oeuvre spécifique décrit ici, on a montré que Les bactériocines sont efficaces pour 30 réduire le nombre de lymphocytes T infectés par un virus. Plus particulièrement, L'utilité des bactériocines, par exemple la colicine HSC-10, est établie par la réduction du nombre des cellules T^ sans dommage correspondant mais plutôt avec une stimulation des cellules T normales.

14

Exemple 4

On peut déterminer par cytométrie d'écoulement l'effet de la bactériocine sur les lymphocytes de patients atteints de SIDA

ainsi que sur les lymphocytes infectés par d'autres virus tels

!

que virus d'angine grippale et virus de mononucléose infectieuse, 5 en utilisant des techniques semblables à celles décrites dans IRCS Médical Science, 11, pages 236-237 (1983).

En général, la technique comporte l'analyse de la teneur en ADN de chaque cellule dans un échantillon donné afin de déterminer à un instant donné le pourcentage de cellules existant 10 dans une phase spécifique du cycle cellulaire. Comme les bactériocines peuvent affecter ou altérer les cellules sensibles par dégradation de l'ADN conduisant à une coupure des nucléotidës, un nombre croissant de cellules traitées ayant peu d'ADN peut être décelé par cytométrie d'écoulement. On observe couramment que les 15 cellules sensibles à la bactériocine et traitées avec celle-ci s'accumulent dans les canaux "pré-G^" lorsque les résultats sont portés sur un histogramme, ce qui signifie une teneur décroissante en ADN, puisque l'ADN de ces cellules est dégradé.

Plus particulièrement, on isole sur "Picoll-Paque"

20 (marque déposée, Pharmacia Fine Chemicals, Montréal, Canada) des lymphocytes obtenus à partir de patients sur lesquels on a préalablement diagnostiqué une mononucléose infectieuse (pari infection par le virus d'Epstein-Barr) et on les colore par l'iodure de propidium. On ajoute à un échantillon 25 des lymphocytes isolés la colicine HSC-10 extraite et purifiée comme à l'exemple 1. On mesure ensuite la fluorescence cellulaire pendant le cycle de croissance dans un cytomètre d'écoulement (FCM). On utilise les lymphocytes à étudier auxquels on n'a pas ajouté de bactériocine pour calibrer les cellules dans la phase 30 Gq^I par rapport à un standard. On obtient par impression de données numériques le nombre total de cellules étudiées. Le pourcentage du total est calculé pour les cellules présentes dans les phases "pre-G^" et "Gq/G^" par intégration des cellules sous le pic. Le résultat est exprimé après soustraction ou addi-35 tion du pourcentage de variation qui se produit dans le nombre de cellules des témoins, c'est-à-dire les cellules infectées par un virus non exposées aux bactériocines.

15

Les résultats sont présentés dans Le tableau III. Tableau III

N° du N° de Cellules dans les phases itient test

Pré-G1

Pic

G0/G1

• SG2M

Sensil

1

1

+33

-14

-31

-2,0

+

2

+24

+17

-24

+0,2

+

2

3

+17

+11

-18

+1,0

+

4

+21

+30

-22

+1,3

+

3

5

+15

+14

-13

-2,6

+

4

6

-2,4

+13

"5,1

+7,6

+

5

7

+0,5

+4,6

-0,8

+0,3

-

6

8

"4,3

+7,5

+2,0

+2,2

+

7

9

+1,3

-1/1

"0,3

"1,2

-

Il y avait neuf tests effectués sur 7 individus. Six des sept patients soumis aux tests présentent sur leurs histogrammes une diminution des cellules de la phase Gq/G^ (voir colonne 5) et 5 patients sur 7 présentent une accumulation de cellules dans la phase pré-G^ (voir colonne 3). En résumé, dans 78 % des tests, les échantillons des patients présentent la sensibilité à la colicine HSC-10.

Exemple 5

Chez 4 patients classés dans la catégorie normaux dans le premier paragraphe de l'exemple 3 et qui semblaient avoir la grippe d'après les symptômes cliniques, on a trouvé une réaction positive transitoire avec les bactériocines. Ces patients ont ensuite donné un test positif à la présence de 2-5 A synthé-tase, présence qui indique une infection virale (J. Infections Diseases, Read S.E. et autres, septembre 1985). Après une durée suffisante pour récupérer des symptômes de grippe, on a à nouveau soumis ces patients au test de sensibilité à la bactériocine et trouvé qu'ils étaient négatifs. Une conclusion que l'on peut tenter de tirer de ces résultats est qu'au moins un virus de grippe est affecté par la bactériocine HSC-10.

16

Claims (35)

REVENDICATIONS

1. Procédé pour inhiber La croissance de ceLLuLes de mammifère non maLignes infectées par un virus, caractérisé en ce qu'iL consiste à traiter Lesdites ceLLuLes par une quantité d'une

5 bactériocine inhibant La croissance et tuant Les ceLLuLes.

2. Procédé selon La revendication 1, caractérisé en ce que Lesdites ceLLuLes de mammifère infectées par un virus sont des Lymphocytes infectés par un virus choisi parmi Le virus HTLV-III et Le virus de mononucléose infectieuse.

10 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que Lesdites cellules infectées par un virus sont des cellules T infectées par le virus HTLV-III.

4. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que lesdites cellules infectées par un virus sont des cellules T4

15 infectées par le virus HTLV-III.

5. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que La bactériocine est choisie parmi les pyocines, les vibriocines, les mycobactériocines et les colicines.

6. Procédé selon La revendication 3, caractérisé en ce 20 que La bactériocine est choisie parmi les pyocines et colicines.

7. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que la bactériocine est choisie parmi Les pyocines et Les colicines.

8. Procédé selon La revendication 4, caractérisé en ce que la bactériocine est choisie parmi La pyocine 1-4 et la coLicine

25 HSC-10.

9. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que la bactériocine est la coLicine HSC-10.

10. Procédé selon La revendication 1, caractérisé en ce que les ceLLuLes sont présentes dans un échantillon biologique

30 prélevé sur L'organisme d'un mammifère et elles sont traitées par une quantité de bactériocine comprise dans la gamme approchée

-5 -2

de 10 à 10 ng par cellule-cible.

11. Procédé selon La revendication 10, caractérisé en ce que la bactériocine est la HSC-10 et on l'administre en quantité

-4 -3

35 dans la gamme approchée de 10 à 10 ng par cellule-cible.

12. Procédé selon La revendication 1, caractérisé en ce que Les ceLLuLes de mammifère non malignes, infectées par un virus

à traiter consistent en Lymphocytes présents chez un mammifère vivant.

13. Procédé selon La revendication 11, caractérisé en ce que L'on administre au mammifère vivant une dose de bactériocine dans la gamme approchée de 0,01 à 10 microgrammes.

14. Procédé selon La revendication 13, caractérisé en ce que la bactériocine est la coLicine HSC-10 et en ce qu'on L'administre en quantité dans La gamme approchée de 0,1 à 1 microgramme.

15. Composition pharmaceutique utile pour inhiber La croissance de cellules de mammifère infectées par un virus et tuer ces cellules, caractérisée en ce qu'elle comprend une bactériocine comme ingrédient actif en mélange avec un diluant acceptable en pharmacie.

16. Composition selon La revendication 15, caractérisée en ce que la bactériocine est choisie parmi les pyocines, les vibriocines, les mycobactériocines et les colicines.

17. Composition selon la revendication 15, caractérisée i

en ce que la bactériocine est choisie parmi La pyocine 1-4 et la colicine HSC-10.

18. Composition pharmaceutique utile notamment pour traiter l'infection virale des leucocytes choisie parmi les infections de SIDA et l'infection virale de mononucléose infectieuse^

chez l'homme, caractérisée en ce qu'elle contient une bactériocine choisie parmi les pyocines. Les vibriocines, Les mycobactériocines et Les colicines.

19. Composition selon la revendication 18, caractérisée en ce que, dans Le cas d'une infection de SIDA, la bactériocine est la coLicine HSC-10.

20. Composition selon la revendication 19, caractérisée en ce que la quantité de coLicine HSC-10 administrée est suffisante pour assurer Le traitement des lymphocytes infectés par un virus avec une quantité de bactériocine dans la gamme approchée de 10 -2

à 10 ng par cellule-cible.

21. Composition selon la revendication 20, caractérisée en ce que la quantité de bactériocine administrée est dans La gamme -4 -3

approchée de 10 à 10 ng par cellule-cible.

22. Procédé de détection des cellules de mammifère non malignes, infectées par un virus, caractérisé en ce que l'on détei— mine les interactions desdites cellules avec une bactériocine.

23. Procédé de détection des cellules de mammifère non malignes, infectées par un virus, caractérisé en ce que l'on détermine l'inhibition de la croissance cellulaire après traitement par une bactériocine.

24. Procédé de détection de cellules de mammifère non malignes, infectées par un virus, caractérisé en ce que l'on observe la mort des cellules après traitement par une bactériocine.

25. Procédé selon l'une quelconque des revendications 22, 23 et 24, caractérisé en ce que ladite bactériocine est choisie parmi les pyocines, les vibriocines, les mycobactériocines et les colicines.

26. Procédé selon l'une quelconque des revendications 22,

23 et 24, caractérisé en ce que des cellules de mammifère non malignes, infectées par un virus consistent en lymphocytes.

27. Procédé selon la revendication 23, caractérisé en ce que l'on détermine la croissance cellulaire par des tests de fixation.

28. Procédé selon la revendication 23, caractérisé en ce que l'on détermine la croissance cellulaire en mesurant l'absorption d'un élément radioactif par lesdites cellules.

29. Procédé selon la revendication 24, caractérisé en ce que l'on observe la mort des cellules par cytométrie d'écoulement.

30. Réactif pour la détection de cellules de mammifère non malignes, infectées par un virus, caractérisé en ce qu'il consiste en une bactériocine.

31. Préparation liquide pour l'utilisation dans le diagnostic in vitro de cellules de mammifère non malignes, infectées par un virus, caractérisée en ce qu'elle consiste en une bactériocine en association avec un support liquide acceptable en pharmacie.

32. Préparation selon la revendication 31, caractérisée en ce qu'elle consiste en une suspension ou solution aqueuse de ladite bactériocine.

33. Préparation selon la revendication 32, caractérisée en ce que ladite suspension ou solution est un tampon.

19

34. Préparation selon la revendication 33, caractérisée en ce que ledit tampon est un tampon tris ou du sérum physiologique tamponné au phosphate.

35. Préparation selon la revendication 32, caractérisée en ce que la bactériocine est la colicine HSC-10.

O F? S CS S M A- L.

— -JS

Renvois

CURAU

Conseil en Propriété fnclustrielle

26bl», Boul. Princesse Charlotte MONTE-CARLO

Ptr procuration de moi rayé nu?