MC200094A1 - Procédé optimal de production recombinante d'une métalloprotéine marine et ses applications - Google Patents

Description

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2 7 SEP. 2006

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io BREVET D ' INVENTION

TITRE DE L'INVENTION î

PROCÉDÉ OPTIMAL DE PRODUCTION RECOMBINANTE D'UNE 15 MÉTALLOPROTÉINE MARINE ET SES APPLICATIONS

DÉPOSANT :

EXSYMOL S.A.M.

20 INVENTEURS :

M. C. SEGUIN

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L'invention concerne un procédé de synthèse, selon des 35 techniques issues des biotechnologies, d'une métalloprotéine d'origine marine à la stabilité et l'activité enzymatique "supéroxyde dismutase" remarquables.

L'invention concerne également les applications cosmétique et thérapeutique de la métalloprotéine obtenue.

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Pour lutter contre les effets néfastes du stress oxydant et des espèces oxygénées réactives libérées dans tout organisme vivant, celui-ci produit entre autres, dans ses cellules, des 5 enzymes antioxydantes. La supéroxyde dismutase (ou "SOD") est l'une d'entre elles, avec une capacité à dismuter l'anion délétère supéroxyde en molécule d'oxygène et molécule de péroxyde d'hydrogène. Jouant un rôle particulièrement important dans la protection des membranes cellulaires, des protéines et 10 lipides essentiels, de 1'ADN, etc, la supéroxyde dismutase n'existe toutefois pas sous une forme unique, mais sous plusieurs isoformes selon la nature du métal situé au cœur de cette enzyme (Zelko et al., Free Rad. Biol. Med. (2002), vol.33, pp.337). Les principales métalloprotéines sont ainsi la 15 supéroxyde dismutase dite à cuivre-zinc (ou "CuZnSOD"), la supéroxyde dismutase dite à fer (ou "FeZnSOD") et la supéroxyde dismutase dite à manganèse (ou "MnSOD").

Toutefois, il a été montré, tant chez l'homme que l'animal, que les niveaux de supéroxyde dismutase dans l'organisme 20 déclinent avec l'âge ("Une supéroxyde dismutase capable de limiter au quotidien les lésions oxydatives", Nutranews, Novembre 2005), conduisant alors à une accumulation de plus en plus grande de dommages radicalaires et oxydatifs, et contribuant in fine à l'apparition de nombre de maladies 25 inflammatoires ou dégénératives, mais aussi plus simplement à une accélération du processus naturel de vieillissement, tel celui de la peau.

Dans les domaines thérapeutique, cosmétique ou nutraceutique, au regard de l'abondance de l'état de la 30 technique porté à la disposition du public, un apport exogène de supéroxyde dismutase focalise l'intérêt des industriels de ces filières depuis plusieurs décennies. L'origine de ces supéroxydes dismutases exogènes est ainsi, classiquement, soit naturelle, avec une enzyme extraite du monde animal ou du règne 35 végétal, soit chimique, avec la synthèse de molécules à propriétés supéroxydes dismutases (dites "SOD-like"), ou encore biotechnologique, lorsque l'enzyme est produite par exemple à partir d'un vecteur d'expression introduit dans un organisme hôte de production.

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Parmi les différentes isoformes de supéroxyde dismutase, nombre d'essais, notamment dans le domaine thérapeutique, ont porté sur la supéroxyde dismutase à cuivre-zinc. Longtemps, l'origine bovine a été prisée pour ce type de SOD, avec une 5 enzyme extraite du sang des bovins en raison d'une forte concentration dans leurs globules rouges. L'utilisation de tels extraits, notamment dans l'industrie cosmétique, est aujourd'hui considérablement freinée, voire même stoppée, de par le risque de contamination engendré depuis l'apparition de 10 1'encéphalopathie spongiforme bovine. Depuis une quinzaine d'années, des alternatives végétales ou bactériennes apparaissent pour l'obtention de cette CuZnSOD. Dans la littérature, il est ainsi relevé de nombreuses supéroxydes dismutases extraites de plantes, algues, légumes, souches 15 bactériennes diverses. Certaines espèces des fonds marins sont également étudiées, notamment les invertébrés marins que sont les coraux et les anémones de mer, de la famille des cnidaires. Ils présentent en effet la particularité de vivre en symbiose avec des organismes unicellulaires photosynthétiques, les 20 dinoflagellés, également appelés zooxanthelles ( Symbiodinixm sp.). Cette co-existence ou association a lieu à l'intérieur même de leurs tissus, et l'intérêt actuel de ces coraux et anémones de mer tient à leur mode de vie qui les contraint, afin d'assurer la photosynthèse de leurs symbiotes, à s'exposer à des 25 quantités suffisantes de soleil et ses radiations, en conséquence à des quantités d'oxygène inhabituelles et toxiques.

Afin de comprendre les mécanismes moléculaires susceptibles d'expliquer la capacité d'adaptation de ces espèces cnidariennes à un tel état d'hypéroxie, une équipe de chercheurs s'est 30 intéressée il y a peu à l'anémone de mer méditerranéenne Anemonia viridis, en la retenant comme modèle d'étude physiologique. Cette équipe a tout d'abord identifié les différentes supéroxydes dismutases présentes dans les deux "compartiments" de l'anémone, ses propres tissus et son 35 zooxanthelle. Les résultats ont alors démontré, de façon peu commune dans le règne animal, une grande diversité dans les supéroxydes dismutases identifiées (CuZnSOD, MnSOD et FeSOD), distribuées tant dans les tissus de l'animal "hôte" qu'au sein du zooxanthelle (Richier et al., Biochim. Biophys. Acta (2003),

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vol.1621, pp.84-91). Concernant l'isoforme majoritaire, à savoir la supéroxyde dismutase à cuivre et zinc, les auteurs dudit article font l'hypothèse d'une forme biologiquement inactive lorsqu'elle est associée au zooxanthelle.

5 Par la suite, à partir d'ARN extrait des tentacules de l'animal, cette même équipe a également identifié, puis cloné, deux gènes de structure susceptibles de coder pour une supéroxyde dismutase à cuivre et zinc, l'un pour la forme extracellulaire de l'enzyme appelée "EC-CuZnSOD", l'autre pour sa 10 forme intra-cellulaire appelée "IC-CuZnSOD" (Plantivaux et al., Free Rad. Biol. Med. (2004), vol.37, pp.1170-1181). Dans ce dernier article, par correspondance entre codons et acides aminés, il est ainsi décrit la séquence supposée en acides aminés de ces deux protéines enzymatiques.

15 Quelle que soit la nature de cette CuZnSOD, extra cellulaire ou intra-cellulaire, il est à noter, dans les deux documents de l'état de la technique susmentionnés, nulle comparaison de son activité antioxydante inhérente avec des SOD couramment utilisées et disponibles commercialement (dites "SOD 20 standards " ).

Compte tenu de ce qui précède, le problème technique que se propose de résoudre l'invention est de réussir à produire industriellement cette supéroxyde dismutase d'origine marine, réduite à sa forme extra-cellulaire mais pleinement 25 fonctionnelle, présentant une activité antioxydante efficace dans le traitement et la prévention des effets néfastes du stress oxydant, ainsi qu'un procédé pour la synthétiser ne présentant pas les inconvénients des procédés de l'art antérieur.

30 La solution de l'invention à ce problème a pour premier objet un procédé de synthèse d'une supéroxyde dismutase à cuivre et zinc dite EC-CuZnSOD recombinante comprenant une séquence en acides aminés identique ou homologue à celle d'une supéroxyde dismutase à cuivre et zinc extra-cellulaire dite EC-CuZnSOD 35 endogène de l'anémone de mer Anemonia viridis.

Le procédé selon l'invention comprend les étapes suivantes de :

introduction, dans un micro-organisme hôte, d'un acide nucléique comprenant une séquence nucléotidique codante

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pour la supéroxyde dismutase, dite EC-CuZnSOD recombinante, ainsi qu'une séquence nucléotidique promotrice de la transcription de cette séquence codante dans ledit microorganisme ;

5 - introduction, dans ledit micro-organisme, d'un acide nucléique comprenant une séquence codante pour une protéine métallochaperonne, ainsi qu'une séquence nucléotidique promotrice de la transcription de cette séquence codante dans ledit microorganisme ; et de 10 - culture dudit micro-organisme dans un milieu de culture supplémenté en ions cuivre et zinc, à une température inférieure à 30°C.

L'invention est illustrée par les séquences, les tests et compositions ci-après et la figure 1 sur la planche ci-jointe, 15 donnés purement à titre indicatif et non limitatif. La figure 1 montre un schéma d'un vecteur selon l'invention.

L'invention a également pour deuxième objet un acide nucléique synthétique, destiné à être introduit dans le micro-organisme hôte et, comprenant une séquence nucléotidique codante pour une 20 EC-CuZnSOD recombinante dont la séquence en acides aminés est identique ou homologue à la séquence en acides aminés d'une EC-CuZnSOD endogène d'Anemonia viridis. Cet acide nucléique comprend avantageusement, en outre, une séquence promotrice de la transcription de la séquence codante pour la EC-CuZnSOD 25 recombinante.

Par séquence nucléotidique synthétique, on entend une séquence nucléotidique hors de son environnement chromosomique naturel, c'est-à-dire qui n'est pas à l'état naturel. On entend notamment une séquence qui a été isolée et/ou purifiée, c'est-à-dire qui a 30 été prélevée directement ou indirectement, par exemple par copie, son environnement ayant été au moins partiellement modifié. On entend également désigner un acide nucléique obtenu par synthèse chimique.

La séquence codante pour la EC-CuZnSOD endogène d'Anemonia 35 viridis est la séquence SEQ ID NO 1, montrée en séquence 1 ci-après. La séquence en acides aminés de la EC-CuZnSOD endogène est la séquence SEQ ID NO 2, montrée en séquence 2 ci-après (Plantivaux et al., Free Rad. Biol. Med. (2004), vol.37, pp.1170-1181). Les codons et acides aminés en position 1 à 18

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séquences SEQ ID NO 1 et 2 respectivement codent pour ou correspondent à un peptide signal, tandis que les codons et acides aminés en position 19 à 192, reportés respectivement aux séquences SEQ ID NO 3 et SEQ ID NO 4, codent pour ou correspondent à une 5 protéine ayant une activité supéroxyde dismutase.

Ainsi, de façon préférée, l'acide nucléique introduit dans l'hôte comprend une séquence codante pour une EC-CuZnSOD recombinante dont la séquence en acides aminés est identique ou homologue à la séquence SEQ ID NO 4.

10 De préférence, la séquence de EC-CuZnSOD recombinante comprend entre 180 et 210 acides aminés, et de préférence 200 à 205 acides aminés.

Par séquence en acides aminés "homologue" à une séquence de référence, et en particulier à la séquence ID NO 4, on entend 15 désigner une séquence comprenant, par rapport à celle-ci, certaines modifications comme en particulier une délétion, addition ou substitution d'au moins un acide aminé, une troncature ou un allongement et/ou une fusion chimérique. On préfère une séquence homologue présentant au moins 80% 20 d'identité, de préférence au moins 95% d'identité avec la séquence de référence, à l'exclusion de 100% d'identité. Dans le cas d'une substitution, un ou plusieurs acides aminés, consécutifs ou non consécutifs, peuvent être remplacés par des acides aminés équivalents. L'expression "acide aminé équivalent" 25 vise ici à désigner tout acide aminé susceptible d'être substitué à l'un des acides aminés de la séquence de référence sans cependant en modifier les caractéristiques ou propriétés fonctionnelles essentielles, comme l'activité anti-oxydante. C'est le cas par exemple de la substitution de la leucine par la 30 valine ou 1'isoleucine, de l'acide aspartique par l'acide glutamique, de la glutamine par 1 ' asparagine, de l'arginine par la lysine, etc, les substitutions inverses étant naturellement envisageables dans les mêmes conditions. Par "pourcentage d'identité" entre deux séquences d'acides nucléiques ou d'acides 35 aminés, on entend désigner un pourcentage de nucléotides ou d'acides aminés identiques entre les deux séquences à comparer, obtenu après le meilleur alignement, ce pourcentage étant purement statistique et les différences entre les deux séquences étant réparties au hasard sur toute leur longueur. On entend

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désigner par "meilleur alignement" l'alignement pour lequel le pourcentage d'identité est le plus élevé.

L'acide nucléique introduit dans l'hôte comprend une séquence codante pour une EC-CuZnSOD recombinante, telle que 5 définie précédemment, qui est choisie de manière à coder pour ladite EC-CuZnSOD recombinante avec un fort taux d'expression dans l'organisme hôte. La séquence nucléotidique est déterminée notamment en tenant compte de la nature dégénérée du génome : les codons sont choisis parmi les codons les plus exprimés dans 10 le micro-organisme hôte.

Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, le choix des codons est tel que la séquence codante pour la EC-CuZnSOD recombinante présente un index d'adaptation des codons, ou C.A.I., de 0,95 dans le micro-organisme hôte, soit une 15 homologie d'au moins 95 % (à l'exception de 100 %) entre une séquence codante selon l'invention et la séquence endogène de l'anémone de mer Anemonia viridis. La séquence codante pour la EC-CuZnSOD recombinante peut être la séquence SEQ ID NO 5 montrée en séquence 5 ci-après. Celle-ci code pour une EC-20 CuZnSOD de séquence SEQ ID NO 2. De préférence, la séquence codante préférée est ou comprend la séquence en position 19 à 192 de SEQ ID NO 5, qui code pour EC-CuZnSOD de séquence SEQ ID NO 4. Tout particulièrement, la séquence préférée codante pour la EC-CuZnSOD est la séquence SEQ ID NO 6, montrée en séquence 25 6. Elle code pour la EC-CuZnSOD de séquence SEQ ID NO 7, montrée en séquence 7, qui comprend notamment une étiquette polyhistidine en position 5 à 10.

L'invention a également pour troisième objet un microorganisme hôte génétiquement modifié et exprimant une EC-30 CuZnSOD, dite recombinante, comprenant une séquence en acides aminés identique ou homologue à celle d'une supéroxyde dismutase à cuivre et zinc extra-cellulaire endogène de l'anémone de mer Anemonia viridis.

Le micro-organisme hôte peut être, par exemple, un micro-35 organisme procaryotique, tel qu'une bactérie, ou eucaryotique, tel qu'une levure. De préférence, le micro-organisme hôte est une souche bactérienne de Escherichia Coli ou E. Coli largement connue de l'Homme du métier (fournisseur : InVitrogen, référence : C6000-3). Selon un mode de réalisation préféré de

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l'invention, il est retenu la souche référence de E. Coli "BL21Star(DE3)" (fournisseur : InVitrogen, référence : C6010-3). Tout particulièrement, il est choisi la souche "BL2IStar(DE3)plysS" (fournisseur : InVitrogen, référence : 5 C6020-3), résistante à la toxicité de la EC-CuZnSOD recombinante tout en permettant un taux d'expression accru pour celle-ci.

En outre, puisque la demanderesse a retenu comme microorganisme hôte préféré la bactérie Escherichia Coli, très largement utilisée dans le domaine des biotechnologies, il est à 10 souligner les nombreuses difficultés liées à son utilisation : protéines recombinantes incorrectement repliées, précipitation de ces protéines, formation de corps d'inclusion, étape de renaturation nécessaire, etc. Ces difficultés reconnues n'auraient pas incité l'Homme du métier à choisir E. Coli comme 15 hôte préféré dans le procédé selon l'invention.

De préférence, le micro-organisme hôte selon l'invention comprend un acide nucléique comprenant la séquence codante SEQ ID NO 6.

L'acide nucléique introduit dans l'hôte comprend en outre 20 avantageusement une séquence promotrice de la transcription de la séquence codante pour la Ec-CuZnSOD recombinante, telle que définie précédemment. De préférence, et en particulier lorsque le micro-organisme hôte est E. Coli, ladite séquence promotrice est celle d'un bactériophage, en particulier le bactériophage 25 T7, portée par le plasmide "pDestl7" (fournisseur : InVitrogen, référence : 11803-012). Tout particulièrement, le promoteur du bactériophage T7 permet une expression optimale de EC-CuZnSOD recombinante de séquence identique SEQ ID NO 7 à partir de la séquence nucléotidique SEQ ID NO 6 dans E. Coli 30 BL2IStar(DE3)plysS.

Une souche de E. Coli "BL2IStar(DE3)plysS" préférée exprimant une EC-CuZnSOD recombinante de séquence SEQ ID NO 7 définie ci-après a été déposée le 7 septembre 2006 auprès de la Collection Nationale de Culture de Micro-organismes (CNCM) de l'Institut 35 Pasteur, 28 rue du Dr Roux, 75724 Paris Cédex 15, avec le numéro d'enregistrement CNCM 1-3667. Ce micro-organisme hôte déposé selon l'invention comprend un vecteur "pDEST17" (fournisseur : InVitrogen, référence 11803-012) lequel comprend la séquence SEQ

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ID NO 6 codante pour la EC-CuZnSOD recombinante de séquence SEQ ID NO 7 (figure 1).

L'invention a également pour objet une supéroxyde dismutase à cuivre et zinc recombinante comprenant une séquence en acides 5 aminés identique ou homologue à la séquence en acides aminés d'une EC-CuZnSOD endogène d'Anemonia viridis. De préférence, la EC-CuZnSOD selon l'invention est de séquence SEQ ID NO 7.

L'invention a également pour objet un vecteur comprenant l'acide nucléique objet de l'invention et tel que défini 10 précédemment.

De façon préférée, un vecteur recombinant de clonage et/ou d'expression comprend l'acide nucléique tel que défini précédemment, comprenant une séquence codante pour la EC-CuZnSOD recombinante, et une séquence promotrice de transcription. 15 Les vecteurs selon l'invention comportent les éléments nécessaires à l'expression, notamment, de préférence, un promoteur, des signaux d'initiation et de terminaison de la traduction, ainsi que des régions appropriées de régulation de la transcription. Ces vecteurs peuvent être maintenus de façon 20 stable dans la cellule et peuvent éventuellement posséder des signaux particuliers spécifiant la sécrétion de la protéine traduite.

Les différents signaux de contrôle sont choisis en fonction du micro-organisme hôte utilisé. A cet effet, l'acide nucléique 25 selon l'invention peut être inséré dans un vecteur à réplication autonome au sein de l'hôte choisi, ou dans un vecteur intégratif de l'hôte choisi. Parmi les systèmes à réplication autonome, on utilise de préférence en fonction de l'hôte, des systèmes de type plasmide, cosmide, phagemide ou minichromosome, ou des 30 systèmes de type viral. L'homme du métier connaît les technologies utilisables pour chacun de ces systèmes (Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T., Molecular Cloning : a laboratory Manual, 2^ éd., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989).

35 Parmi les vecteurs intégratifs de l'hôte, on peut utiliser par exemple des systèmes de type plasmidique ou viral.

Parmi les vecteurs non viraux, on préfère les polynucléotides nus tels que 1'ADN nu ou l'ARN nu selon la technique développée par la société VICAL, les chromosomes artificiels de bactérie

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(BAC, "bacterial artificial chromosome") ou les chromosomes artificiels de levure (YAC, "yeast artificial chromosome") pour l'expression dans la levure.

De façon préférée, le vecteur utilisé est le vecteur "pDestl7" 5 (fournisseur : InVitrogen, référence : 11803-012) dans lequel la séquence codante SEQ ID NO 3- 6 a été intégrée entre les sites de restriction Dral et EcoRl sur la carte dudit vecteur, en aval de la séquence promotrice du promoteur du bactériophage T7 et selon les techniques classiques de sous-clonage par digestion 10 enzymatique (Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T., Molecular Cloning : a laboratory Manual, 2nd éd., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989).

Un schéma du vecteur préféré est donné à la figure 1 sur la planche ci-après, sur lequel T7 indique une séquence promotrice 15 du bactériophage T7, RBS indique le site de liaison des ribosomes, 6xHis indique une étiquette (ou "tag") polyhistidine, EC-CuZnSOD indique la séquence SEQ ID NO 6 (considérée à partir de la position 31), yCCS une séquence codant pour une protéine métallochaperonne et Ampicillin indique un gène de résistance à 20 1'Ampicilline. Il s'agit du vecteur qui a été introduit dans la souche déposée auprès de la CNCM et décrite précédemment.

De tels vecteurs sont préparés sous forme de clones selon les méthodes couramment utilisées par l'homme du métier.

L'acide nucléique ou le vecteur comprenant l'acide nucléique 25 comprenant une séquence codante pour une EC-CuZnSOD recombinante et une séquence promotrice de transcription est introduit dans un micro-organisme hôte approprié par des méthodes standards, telles que par exemple la lipofection, l'éléctroporation, le choc thermique, la transformation après perméabilisation 30 chimique de la membrane, la fusion cellulaire.

L'acide nucléique introduit dans le micro-organisme hôte et codant pour une protéine métallochaperonne comprend une séquence codante pour ladite protéine et, de préférence, une séquence promotrice de sa transcription. Selon un mode de réalisation 35 préféré de l'invention, il est retenu une métallochaperonne de levure, tout particulièrement la yCCS ou "yeast copper chaperone for Cu/ZnSOD" (Ahl et al., Protein Expression Purif. (2004), vol.37, pp.311-319), et son gène LYS7 qui appartient à l'état de

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technique (Horecka J. et al., Gene (1995), 162(1), pp.87-92). La séquence promotrice est telle que définie pour EC-CuZnSOD.

Le micro-organisme selon l'invention peut comprendre en outre un tel acide nucléique et peut co-exprimer une telle protéine 5 chaperonne.

De façon préférée, un vecteur recombinant de clonage et/ou d'expression comprend cet acide nucléique. Le vecteur est tel que défini précédemment pour EC-CuZnSOD. La séquence codante pour une protéine métallochaperonne et la séquence codante pour 10 une EC-CuZnSOD peuvent être sur un même vecteur ou sur deux vecteurs distincts. De préférence, il est choisi un même vecteur, la construction étant réalisée selon une méthode classique de recombinaison (Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T., Molecular Cloning : a laboratory Manual, 2nd éd., Cold Spring 15 Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989). Les techniques d'introduction de l'acide nucléique codant pour une protéine métallochaperonne ou du vecteur comprenant cet acide nucléique dans l'hôte sont telles que définies pour EC-CuZnSOD. Ainsi, un même micro-organisme hôte coexprime une EC-CuZnSOD 20 recombinante et une protéine métallochaperonne, pour assurer l'expression d'une EC-CuZnSOD recombinante suffisamment porteuse d'ions cuivre. En effet, l'état de la technique rapporte des insuffisances quant à la métallisation en ions cuivre pour des protéines issues de systèmes bactériens (Hartman J.R. et al., 25 Proc. Natl. Acad. Sci. (1986), vol.83, pp.7142-7146). Une telle co-expression est également nécessaire pour permettre un repliement de la EC-CuZnSOD recombinante proche de celui de la protéine endogène.

Le micro-organisme hôte comprenant un acide nucléique codant 30 pour une EC-CuZnSOD recombinante et un acide nucléique codant pour une protéine chaperonne, est cultivé dans un milieu de culture approprié, supplémenté en ions cuivre et zinc, pour obtenir un taux d'expression optimal de la protéine recombinante et le remplissage des sites métalliques. En effet, il est admis 35 une assimilation des ions métalliques par le micro-organisme hôte, en particulier E. Coli (Ahl et al., Protein Expression Purif. (2004), vol.37, pp.311-319), au détriment de leur incorporation dans la protéine recombinante d'intérêt.

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Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, il est retenu un milieu de culture à base de peptone, d'un extrait de levure et de chlorure de sodium, tel le milieu "Luria Bertani" (LB Broth Base Powder®, fournisseur : Invitrogen), supplémenté 5 en ions métalliques par des solutions de sulfate de cuivre et sulfate de zinc, avec, préférentiellement, des concentrations de 3 à 6 mM pour la première, de 25 à 50 mM pour la seconde.

Le micro-organisme est de préférence cultivé à une température d'expression inférieure à 30°C pour réduire la formation de corps 10 d'inclusion. Il est ainsi particulièrement retenu la température de 25°C, notamment avec un hôte de E. Coli, et pour un temps de culture allant de lh30 à 3 heures. La densité optique de l'inoculât initial est préférentiellement de 0,6 à 0,8, tandis que celle de la culture est préférentiellement de 4 à 8 au 15 moment de la récolte de la protéine recombinante.

Le procédé selon l'invention peut comprendre, en outre, une étape de récolte de la EC-CuZnSOD recombinante exprimée et produite par le micro-organisme hôte, le mode de récolte par centrifugation étant retenu de préférence.

20 Le procédé peut comprendre, ensuite, une étape de purification, par toute technique connue de l'Homme du métier, par exemple par chromatographie d'affinité avec une étiquette marquée de plusieurs molécules d'histidine.

Le procédé peut enfin comprendre une étape de dosage de la EC-25 CuZnSOD exprimée, par exemple par la méthode de Bradford.

Selon un mode de réalisation particulièrement préféré, l'invention a pour objet un procédé de synthèse d'une EC-CuZnSOD, dite recombinante, ayant une séquence en acides aminés identique ou homologue à la séquence ID NO 4, caractérisé en ce 30 que ledit procédé comprend les étapes suivantes de :

introduction, dans un micro-organisme hôte de E. Coli, d'un acide nucléique comprenant une séquence codante pour la supéroxyde dismutase EC-CuZnSOD recombinante, et une séquence promotrice de la transcription de cette séquence 35 codante dans ledit micro-organisme, ladite séquence codante présentant un index d'adaptation des codons, ou C.A.I., de 0,95 par rapport à la séquence SEQ ID NO 3 et, ladite séquence promotrice étant d'origine bactériophage ;

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introduction, dans ledit micro-organisme, d'un acide nucléique comprenant une séquence codante pour une protéine métallochaperonne, ainsi que d'une séquence nucléotidique promotrice de la transcription de cette séquence codante 5 dans ledit microorganisme ; et de culture dudit micro-organisme dans un milieu de culture supplémenté en ions cuivre et zinc, à une température inférieure à 30°C.

Le procédé selon l'invention a ainsi permis à la demanderesse 10 d'obtenir de larges quantités de EC-CuZnSOD recombinante fonctionnelle, afin par exemple d'évaluer son activité antioxydante. Ce procédé est également avantageux en ce qu'il évite les difficultés liées à un procédé d'obtention de EC-CuZnSOD endogène à partir de la source animale. Ces difficultés 15 comprennent notamment le caractère urticant de l'anémone, les variations en concentration de EC-CuZnSOD dans ses cellules, et l'impossibilité de cultiver in vitro ses cellules. Le procédé selon 1'invention permet également de préserver la nature et d'exclure toute technique extractive sur l'animal.

20 De plus, puisqu'il n'a jamais été décrit, dans l'état de la technique, un procédé permettant, par des techniques de recombinaison génétique, la production de cette EC-CuZnSOD particulière telle que définie ci-avant, la demanderesse a dû établir, au prix de recherches intensives, les conditions du 25 procédé selon l'invention. En effet, bien que la production de macromolécules humaines ou animales dans un système d'expression hétérologue, procaryote par exemple, soit une technique couramment utilisée, il est admis qu'il n'existe pas de conditions dites "universelles", applicables quelle que soit la 30 macromolécule visée. La mise au point des conditions spécifiques d'un procédé de synthèse d'une nouvelle protéine recombinante est donc inventive.

Le procédé selon l'invention permet notamment de produire la EC-CuZnSOD d'intérêt avec une expression optimale. Par 35 "expression optimale", on entend notamment une expression dans des quantités suffisantes pour permettre une exploitation industrielle. On entend également une expression qui permet ensuite d'isoler la EC-CuZnSOD recombinante sous une forme soluble et stable, avec une pureté satisfaisante, permettant

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ainsi l'obtention d'une métalloprotéine fonctionnelle, c'est-à-dire active enzymatiquement et apte à être utilisée sans effets secondaires dans des formulations cosmétiques ou thérapeutiques.

La demanderesse a également évalué l'activité enzymatique de 5 la EC-CuZnSOD ainsi synthétisée, en particulier dans plusieurs fractions d'élution après une étape de purification. Une telle activité enzymatique a été estimée doublement par la demanderesse, d'une part, par la détermination du pouvoir antioxydant desdites fractions à inhiber la réduction du 10 cytochrome c dans le système couplé xanthine-xanthine oxydase (test 1 ci-après), et, d'autre part, par le calcul de leur activité spécifique. L'activité spécifique d'une enzyme correspond à la quantité de produit (en ^moles) formé par l'enzyme par unité de temps (en général la minute) par mg de 15 protéines totales dans le milieu réactionnel.

L'activité spécifique est exprimée, en règle générale, en unité (Unit) par gramme de protéines purifiées solubles.

La demanderesse a ainsi constaté que la EC-CuZnSOD recombinante selon l'invention présente une activité enzymatique 20 remarquable au regard des résultats de pouvoir antioxydant et d'activité spécifique de deux supéroxydes dismutases disponibles commercialement (dites SOD "standards"), dont une CuZnSOD d'origine humaine.

En effet, dans le test 1 ci-après, l'activité enzymatique des 25 SOD standards et de la EC-CuZnSOD recombinante selon l'invention a été déterminée en suivant l'inhibition de la réduction du cytochrome c par le couple xanthine-xanthine oxydase. Les résultats présentés dans le tableau 1 montrent que l'enzyme EC-CuZnSOD recombinante selon l'invention présente des propriétés 30 antioxydantes doublement supérieures aux deux enzymes de référence, pour une activité spécifique quasi-identique ou légèrement inférieure.

Une telle activité s'accompagne, en outre, et contrairement aux SOD standards, d'une stabilité exceptionnelle sur une large 35 plage de température pouvant aller jusqu'à 80°C.

En effet, dans le test 2, des échantillons de 10 jxg de protéine (SOD standards ou EC-CuZnSOD selon l'invention) ont été soumis pendant vingt minutes à chacune des températures suivantes : 20, 40, 60 et 80°C. Ensuite, l'activité enzymatique

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15

a été déterminée comme dans le test 1. Les résultats présentés dans le tableau 2 montrent que l'activité de la EC-CuZnSOD recombinante selon l'invention reste intacte pour des températures allant de 20° à 80°C. Nulle perte d'activité n'y est 5 en effet observée, ce qui traduit une forte résistance à des températures élevées, de surcroît sur une gamme de pH allant de 6 à 8.

Dans l'optique d'une utilisation dans les domaines cosmétique et thérapeutique, la demanderesse a ensuite évalué l'efficacité 10 in vitro de la EC-CuZnSOD selon l'invention, précisément sur un modèle illustrant la viabilité cellulaire de fibroblastes en culture soumis à un stress oxydant. Pour cela, dans le test 3, une lignée cellulaire de fibroblastes de souris est maintenue pendant 1 heure dans un milieu de culture additionné de 5 mM de 15 1,1'-dimethyl-4,4'-bipyridium, ou Paraquat, générateur d'anions supéroxydes, en l'absence d'enzyme antioxydante (témoin) puis en présence de EC-CuZnSOD selon l'invention et aux concentrations de 0,25 et 1 jxM. La viabilité des cellules de fibroblastes est mesurée. Les résultats présentés dans le tableau 3 démontrent, 20 en comparaison avec des fibroblastes témoin, un effet cytoprotecteur variable de 30 à 80 % selon les concentrations d'EC-CuZnSOD, objet de l'invention, utilisées. A la concentration de 1 ^iM notamment, il est même atteint une excellente protection de la lignée cellulaire de fibroblastes 25 face au stress oxydant induit.

Ainsi, selon un autre aspect, la présente invention concerne une composition cosmétique ou pharmaceutique comprenant, une quantité efficace d'une EC-CuZnSOD, dite recombinante, ayant une séquence en acides aminés identique ou homologue à la séquence 30 d'une EC-CuZnSOD, dite endogène, de l'anémone de mer Anemonia viridis, de préférence à titre d'agent actif à forte activité antioxydante et/ou antiradicalaire, et un ou plusieurs véhicules inertes usuels. De préférence, la EC-CuZnSOD dite recombinante est telle que définie précédemment, et telle qu'obtenue au terme 35 du procédé défini précédemment.

Parmi les véhicules inertes cosmétiquement ou pharmaceutiquement acceptables, on peut citer, à titre d'exemple, un tensioactif, un conservateur, un colorant, un

16

agent émulsionnant, un agent gélifiant, un agent humectant, un agent chélatant, etc.

Selon les besoins du domaine considéré, ladite composition peut également contenir d'autres ingrédients actifs, tels une 5 autre enzyme antioxydante. Préférentiellement, cette dernière, d'origine synthétique, animale, végétale, bactérienne ou à nouveau recombinante, est choisie dans le groupe constitué par une autre supéroxyde dismutase, une catalase ou un glutathion péroxydase.

10 De manière avantageuse, la teneur en EC-CuZnSOD dans les compositions selon l'invention est comprise entre 0,01 et 5 % en poids par rapport au poids total de la composition, de préférence entre 0,1 et 1 % en poids.

Les compositions conformes à l'invention peuvent se présenter 15 sous toutes les formes envisageables dans les domaines cosmétique et thérapeutique. Il sont, en particulier, adaptés pour une administration par voie topique sous forme, par exemple, de lait, gel, crème, etc.

Selon un autre aspect, l'invention concerne l'utilisation 20 d'une composition cosmétique ou pharmaceutique comprenant de la EC-CuZnSOD, dite recombinante, comprenant une séquence en acides aminés identique ou homologue à celle d'une EC-CuZnSOD, dite endogène, de l'anémone de mer Anemonia viridis, destinée à prévenir ou à lutter contre l'accumulation et/ou la 25 surproduction de dérivés réactifs de l'oxygène, ou de radicaux libres, et/ou ses conséquences, notamment cutanées.

De préférence, ladite EC-CuZnSOD recombinante est telle que définie précédemment et telle qu'obtenue au terme du procédé défini précédemment.

30 L'origine de ces dérivés réactifs de l'oxygène comprend des radiations ultra-violettes, divers polluants, la fumée de cigarettes, des oxydants chimiques, etc.

Les conséquences cutanées de l'accumulation de dérivés réactifs de l'oxygène comprennent les signes du vieillissement, 35 naturel ou photo-induit de la peau, et en particulier, la dégradation des fibres de collagène dans la matrice extracellulaire du derme, les manifestations inflammatoires de la peau, par exemple l'érythème. La EC-CuZnSOD selon l'invention

TR)

17

permet en particulier de réduire le nombre de sites neutrophiles d'inflammation.

L'invention a également pour objet l'utilisation de la EC-CuZnSOD, dite recombinante, telle que définie précédemment, et, 5 de préférence, telle qu'obtenue au terme du procédé défini précédemment pour la fabrication d'un médicament destiné à prévenir ou à lutter contre l'accumulation et/ou la surproduction de dérivés réactifs de l'oxygène ou de radicaux libres, et/ou ses conséquences pathologiques.

10 Lesdites conséquences pathologiques comprennent notamment le diabète, le cancer, certaines maladies inflammatoires, neurodégénératives et auto-immunes (Parkinson, Alzheimer, arthrite, etc).

Dans les applications ci-dessus, la supéroxyde dismutase à 15 cuivre et zinc, telle que définie précédemment et telle qu'obtenue au terme du procédé défini précédemment, est tout particulièrement utilisée comme agent antioxydant et/ou anti-radicalaire.

20 Séquence 1 : séquence nucléotidique SEQ ID NO 1 endogène codant pour la EC-CuZnSOD endogène de l'anémone de mer Anemonia viridis

ATG

AAG

CTC

TTA

GCG

TTT

CTT

TTG

GTG

TGT

TCC

AGT

GTT

GTT

CAG

ACA

TGT

GCT

GAA

GGT

GCG

GCA

ATG

TGT

TAC

ATG

AAG

CCA

AAC

CCA

GTA

CTC

25

CCT

GAC

ACC

ATA

GAC

ACC

AAA

GTG

ACA

GGA

ACC

GTC

ATG

CTT

TCT

CAA

AAG

TCT

CCA

TCA

GCT

AAA

ATC

AAA

ATC

ACT

TTG

AAT

TTG

AAA

GGC

TTA

CCA

CCA

AAC

ACT

CCA

CAT

GGA

TTT

CAT

GTA

CAT

CAA

TAT

GGG

GAT

ATC

GAC

ACG

AAC

GGT

TGT

CAG

AGT

ACC

GCT

TCT

CAC

TTC

AAT

CCT

TTT

GGT

GCT

ACA

CAC

GGC

GGA

CCT

CAA

GAT

GAT

GAA

AAA

CAC

CGA

CAC

GTT

GGT

30

GAC

CTT

GGT

AAC

GTG

ATG

TCA

AAC

GCA

GAA

GGC

AGA

ATC

AAG

ATA

ATG

TTG

TCC

GAC

TAC

TTG

GTG

TCT

CTT

TAT

GGA

CCT

TAC

TCT

GTT

ATT

GGT

CGC

TCA

TTT

GTG

ATA

CAC

GCC

AAA

ATA

GAC

GAC

TTA

GGA

AGA

GGT

ACA

GGA

GCA

GCA

AGA

AAA

GAG

AGT

TTA

AAG

ACT

GGT

AAC

GCT

GGA

GCA

CGT

CTG

GCA

TGT

TGT

ACG

ATT

GTC

CAT

GCA

GCT

CCT

GCG

GCT

GCT

TTG

AAA

35

TAA

ïsV

18

Séquence 2 : séquence d'acides aminés SEQ ID NO 2 de la EC-CuZnSOD endogène de l'anémone de mer Anemonia viridis, et susceptible d'être codée par la séquence nucléotidique SEQ ID NO 1

5

MKLLAFLLVCSSWQTCAEGAAMCYMKPNPVLPDTIDTKVTGTVMLSQKSPSAKIKITLNLKGL PPNTPHGFHVHQYGDIDTNGCQSTASHFNPFGATHGGPQDDEKHRHVGDLGNVMSNAEGRIKIM LSDYLVSLYGPYSVIGRSFVIHAKIDDLGRGTGAARKESLKTGNAGARLACCTIVHAAPAAALK

10

Séquence 3 : séquence nucléotidique SEQ ID NO 3 correspondant aux codons 19 à 193 de la séquence SEQ ID NO 1

GAA

GGT

GCG

GCA

ATG

TGT

TAC

ATG

AAG

CCA

AAC

CCA

GTA

CTC

CCT

GAC

ACC

ATA

GAC

ACC

AAA

GTG

ACA

GGA

ACC

GTC

ATG

CTT

TCT

CAA

AAG

TCT

CCA

TCA

GCT

AAA

ATC

AAA

ATC

ACT

TTG

AAT

TTG

AAA

GGC

TTA

CCA

CCA

AAC

ACT

CCA

CAT

GGA

TTT

CAT

GTA

CAT

CAA

TAT

GGG

GAT

ATC

GAC

ACG

AAC

GGT

TGT

CAG

AGT

ACC

GCT

TCT

CAC

TTC

AAT

CCT

TTT

GGT

GCT

ACA

CAC

GGC

GGA

CCT

CAA

GAT

GAT

GAA

AAA

CAC

CGA

CAC

GTT

GGT

GAC

CTT

GGT

AAC

GTG

ATG

TCA

AAC

GCA

GAA

GGC

AGA

ATC

AAG

ATA

ATG

TTG

TCC

GAC

TAC

TTG

GTG

TCT

CTT

TAT

GGA

CCT

TAC

TCT

GTT

ATT

GGT

CGC

TCA

TTT

GTG

ATA

CAC

GCC

AAA

ATA

GAC

GAC

TTA

GGA

AGA

GGT

ACA

GGA

GCA

GCA

AGA

AAA

GAG

AGT

TTA

AAG

ACT

GGT

AAC

GCT

GGA

GCA

CGT

CTG

GCA

TGT

TGT

ACG

ATT

GTC

CAT

GCA

GCT

CCT <

GCG GCT GCT TTG AAA TAA

25

Séquence 4 : séquence d'acides aminés SEQ ID NO 4 correspondant aux acides aminés 19 à 192 de la séquence SEQ ID NO 2

30 EGAAMCYMKPNPVLPDTIDTKVTGTVMLSQKSPSAKIKITLNLKGLPPNTPHGFHVHQYGDIDT NGCQSTASHFNPFGATHGGPQDDEKHRHVGDLGNVMSNAEGRIKIMLSDYLVSLYGPYSVIGRS FVIHAKIDDLGRGTGAARKESLKTGNAGARLACCTIVHAAPAAALK

35 Séquence 5 : séquence nucléotidique optimisée SEQ ID NO 5 codant pour une EC-CuZnSOD recombinante de séquence en acides aminés identique à la séquence SEQ ID NO 2

OTl/

19

ATG

AAA

CTG

CTG

GCG

TTT

CTG

CTG

GTT

TGT

AGC

AGC

GTT

GTT

CAG

ACC

TGT

GCC

GAA

GGT

GCG

GCG

ATG

TGT

TAT

ATG

AAA

CCG

AAT

CCG

GTT

CTG

CCG

GAT

ACC

ATC

GAT

ACC

AAA

GTT

ACC

GGC

ACC

GTT

ATG

CTG

AGC

CAG

AAA

AGC

CCG

AGC

GCG

AAA

ATC

AAA

ATC

ACC

CTG

AAC

CTG

AAA

GGT

CTG

CCG

CCG

AAT

ACC

CCG

CAT

GGC

TTT

CAT

GTT

CAC

CAG

TAT

GGC

GAT

ATT

GAT

ACC

AAC

GGT

TGT

CAG

AGC

ACC

GCC

AGC

CAT

TTT

AAT

CCG

TTT

GGT

GCC

ACC

CAT

GGT

GGT

CCG

CAG

GAT

GAT

GAA

AAA

CAT

CGC

CAT

GTG

GGC

GAT

CTG

GGT

AAC

GTT

ATG

AGC

AAT

GCC

GAA

GGC

CGT

ATC

AAA

ATC

ATG

CTG

AGC

GAT

TAT

CTG

GTG

AGC

CTG

TAT

GGT

CCG

TAT

AGC

GTG

ATT

GGC

CGT

AGC

TTT

GTG

ATC

CAC

GCC

AAA

ATT

GAT

GAT

CTG

GGT

CGT

GGC

ACC

GGT

GCA

GCC

CGT

AAA

GAA

AGC

CTG

AAA

ACC

GGT

AAT

GCC

GGT

GCC

CGT

CTG

GCG

TGT

TGT

ACC

ATT

GTT

CAT

GCC

GCC

CCG

GCG

GCG

GCG

CTG

AAA

TAA

15

Séquence 6 : séquence nucléotidique optimisée SEQ ID NO 6 codant pour une EC-CuZnSOD recombinante de séquence en acides aminés SEQ ID NO 7

ATG

TCG

TAC

TAC

CAT

CAC

CAT

CAC

CAT

CAC

CTC

GAA

TCA

ACA

AGT

TTG

TAC

AAA

AAA

GCA

GGC

TTT

AAA

GAA

AAT

TTA

TAC

TTC

CAA

GGT

GAA

GGT

GCG

GCG

ATG

TGT

TAT

ATG

AAA

CCG

AAT

CCG

GTT

CTG

CCG

GAT

ACC

ATC

GAT

ACC

AAA

GTT

ACC

GGC

ACC

GTT

ATG

CTG

AGC

CAG

AAA

AGC

CCG

AGC

GCG

AAA

ATC

AAA

ATC

ACC

CTG

AAC

CTG

AAA

GGT

CTG

CCG

CCG

AAT

ACC

CCG

CAT

GGC

TTT

CAT

GTT

CAC

CAG

TAT

GGC

GAT

ATT

GAT

ACC

AAC

GGT

TGT

CAG

AGC

ACC

GCC

AGC

CAT

TTT

AAT

CCG

TTT

GGT

GCC

ACC

CAT

GGT

GGT

CCG

CAG

GAT

GAT

GAA

AAA

CAT

CGC

CAT

GTG

GGC

GAT

CTG

GGT

AAC

GTT

ATG

AGC

AAT

GCC

GAA

GGC

CGT

ATC

AAA

ATC

ATG

CTG

AGC

GAT

TAT

CTG

GTG

AGC

CTG

TAT

GGT

CCG

TAT

AGC

GTG

ATT

GGC

CGT

AGC

TTT

GTG

ATC

CAC

GCC

AAA

ATT

GAT

GAT

CTG

GGT

CGT

GGC

ACC

GGT

GCA

GCC

CGT

AAA

GAA

AGC

CTG

AAA

ACC

GGT

AAT

GCC

GGT

GCC

CGT

CTG

GCG

TGT

TGT

ACC

ATT

GTT

CAT

GCC

GCC

CCG

GCG

GCG GCG CTG AAA TAA GAA TTC

35 Séquence 7 : séquence d'acides aminés SEQ ID NO 7 de la EC-CuZnSOD recombinante (sans peptide signal, avec une étiquette polyhistidine)

20

MSYYHHHHHHLESTSLYKKAGFKENLYFQGEGAAMCYMKPNPVLPDTIDTKVTGTVMLSQKS PS AKIKITLNLKGLPPNTPHGFHVHQ Y GDIDTNGCQST ASHFNPF G ATHGGPQDDEKHRHV GD LGNVMSNAEGRIKIMLSDYLVSLYGPYSVIGRSFVIHAKIDDLGRGTGAARKESLKTGNAGARLA CCTIVHAAPAAALK

Test 1 : détermination et comparaison des activités enzymatiques de SOD standards et d'une fraction purifiée de EC-CuZnSOD recombinante.

L'activité enzymatique des SOD standards et de EC-CuZnSOD recombinante selon l'invention a été déterminée en suivant 1'inhibition de la réduction du cytochrome c par le couple xanthine-xanthine oxydase, selon le protocole décrit par Me Cord et al. (The J. Biol. Chem. (1969), vol.244(22), pp.6049-6055). Les conditions de l'étude ont été les suivantes :

. absorbance : 550 nm . pH : 7,8

. température : 25°C Les résultats de cette étude sont reportés dans le tableau 1 ci-après .

Tableau 1

SOD standard 1 (SOD végétale)

SOD standard 2 (CuZnSOD humaine)

E C —CuZnSOD recombinante

% inhibition réduction cytochrome c

46 %

39 %

83 %

Activité spécifique (Unit/g de protéine)

184.000

136.842

122.000

Test 2 : détermination et comparaison des stabilités thermiques de SOD standards et d'une fraction purifiée de EC-CuZnSOD.

Des échantillons de 10 |xg de protéine (SOD standards ou EC-CuZnSOD selon l'invention) ont été soumis, pendant une durée de 20 minutes, à chacune des températures suivantes : 20, 40, 60 et 80°C, et selon le protocole décrit par Pan S.M. et al. (Bot. Bull. Acad. Sin. (1999), vol.40, pp.275-281). Au terme des 20

21

minutes de chauffage, il est déterminé l'activité enzymatique pour chaque échantillon, identiquement au test 1 ci-dessus. Les résultats de cette étude sont reportés dans le tableau 2 ci-après .

5

Tableau 2

Température ( °C)

20

40

60

80

SOD standard 1 (SOD végétale)

+

+

-

-

SOD standard 2 (CuZnSOD humaine)

+

+

+

-

EC-CuZnSOD recombinante

+

+

+

+

10 Test 3 : mise en évidence de l'effet cytoprotecteur d'une fraction purifiée de EC-CuZnSOD sur des fibroblastes en culture.

Le test a été réalisé sur une lignée cellulaire de fibroblastes de souris maintenus pendant 1 heure dans un milieu de culture 15 additionné de 5 mM de Paraquat générateur d'anions supéroxydes, en l'absence d'enzyme antioxydante (témoin) puis en présence de EC-CuZnSOD selon l'invention et aux concentrations de 0,25 et 1 jaM. La viabilité des cellules de fibroblastes est mesurée par la méthode d'incorporation au bromure de 3-(4,5-diméthylthiazol-2-20 yl)-2,5-diphenyltétrazolium (dite "MTT"). Les résultats de cette étude sont reportés dans le tableau 3 ci-après.

Tableau 3

témoin

EC-CuZnSOD recombinante (0,25 fiM)

EC-Cu Z n SOD recombinante (1 |iM)

% viabilité fibroblastes

5

30

8 0

25

<TR/

Composition 1 :

EC-CuZnSOD selon l'invention 1 %

Brij ™ 1,2 %

Alcool cétylique 2 %

Huile de paraffine 5 %

Acétate de vitamine E 0,5%

Trisamino™ (trométhamine) 0,6 %

Glycérine 5 % Phenonip™ (parabènes (parahydroxybenzoate) de butyle, éthyle,

isobutyle, méthyle, propyle et phénoxyéthanol) 0,5 %

Eau qsp 100

Composition 2 :

EC-CuZnSOD selon l'invention 0,2 %

Glycol dipropylene 7 %

Parabène (parahydroxybenzoate) de méthyle 0,1 %

Polyacrylate de sodium 0,008 %

Algin™ 0,005 % EDTA (éthylènediamine-sel disodique dihydraté de l'acide tétraacétique) 0,03 %

Eau qsp 100

23

REVENDICATIONS

1. Procédé de synthèse d'une supéroxyde dismutase à cuivre et

5 zinc comprenant une séquence en acides aminés identique ou homologue à celle d'une supéroxyde dismutase à cuivre et zinc extra-cellulaire endogène de l'anémone de mer Anemonia viridis, caractérisé en ce que ledit procédé comprend les étapes suivantes de :

10 - introduction, dans un micro-organisme hôte, d'un acide nucléique comprenant une séquence nucléotidique codante pour la supéroxyde dismutase, ainsi qu'une séquence nucléotidique promotrice de la transcription de cette séquence codante dans ledit micro-organisme ;

15 - introduction, dans ledit micro-organisme, d'un acide nucléique comprenant une séquence codante pour une protéine métallochaperonne, ainsi qu'une séquence nucléotidique promotrice de la transcription de cette séquence codante dans ledit microorganisme ; et de

20 - culture dudit micro-organisme dans un milieu de culture supplémenté en ions cuivre et zinc, à une température inférieure à 30°C.

2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il

25 comprend, en outre, une étape de récolte de la supéroxyde dismutase produite par le micro-organisme hôte.

3. Procédé selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que le micro-organisme hôte est Escherichia Coli et en ce que

30 la séquence nucléotidique codante pour la supéroxyde dismutase présente un index d'adaptation des codons de 0,95 dans E. Coli.

4. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la séquence codante pour ladite supéroxyde dismutase est

35 la séquence SEQ ID NO 6.

5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que la séquence en acides aminés de la supéroxyde dismutase à

24

cuivre et zinc synthétisée est identique à la séquence SEQ ID NO 7.

6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en 5 ce que ladite protéine métallochaperonne est une métallochaperonne de levure.

7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que ladite métallochaperonne de levure est la métallochaperonne

10 y CCS.

8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que l'acide nucléique codant pour la protéine métallochaperonne yCCS est le gène LYS7.

15

9. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que le micro-organisme hôte est la souche référence BL2IStar(DE3) d' E. Coli et en ce que le promoteur de transcription est le promoteur de bactériophage T7.

20

10. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que ladite souche référence BL2IStar(DE3) est la souche BL2IStar (DE3)plysS.

25 11. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que ledit milieu de culture comprend de la peptone, un extrait de levure et du chlorure de sodium et est supplémenté en ions cuivre et zinc par des solutions de sulfate de cuivre et sulfate de zinc.

30

12. Acide nucléique synthétique comprenant une séquence nucléotidique codante pour une supéroxyde dismutase à cuivre et zinc comprenant une séquence en acides aminés identique ou homologue à celle d'une supéroxyde dismutase à cuivre et zinc

35 extra-cellulaire endogène de l'anémone de mer Anemonia viridis.

13. Acide nucléique selon la revendication 12, caractérisé en ce que la supéroxyde dismutase à cuivre et zinc codée comprend une

JTV/

25

séquence en acides aminés identique ou homologue à la séquence SEQ ID NO 7.

14. Acide nucléique selon l'une des revendication 12 ou 13, 5 caractérisé en ce que la séquence nucléotidique codante comprend la séquence en position 19 à 192 de SEQ ID NO 5.

15. Acide nucléique selon l'une des revendications 12 à 14, caractérisé en ce qu'il comprend en outre une séquence

10 promotrice de la transcription de ladite séquence nucléotidique.

16. Vecteur recombinant de clonage et/ou d'expression exprimant une supéroxyde dismutase à cuivre et zinc, dite recombinante, comprenant une séquence en acides aminés identique ou homologue

15 à celle d'une supéroxyde dismutase à cuivre et zinc extracellulaire endogène de l'anémone de mer Anemonia viridis, caractérisé en ce qu'il comprend un acide nucléique selon l'une des revendications 12 à 15.

20 17. Composition cosmétique ou pharmaceutique comprenant une quantité efficace d'une supéroxyde dismutase à cuivre et zinc, dite recombinante, comprenant une séquence en acides aminés identique ou homologue à celle d'une supéroxyde dismutase à cuivre et zinc extra-cellulaire endogène de l'anémone de mer 25 Anemonia viridis, à titre d'agent actif à forte activité antioxydante et/ou antiradicalaire, et un ou plusieurs véhicules inertes usuels.

18. Composition selon la revendication 17, caractérisé en ce que 30 la supéroxyde dismutase, dite recombinante, comprise dans la composition comprend une séquence en acides aminés identique à la séquence SEQ ID NO 7.

19. Composition selon la revendication 18, caractérisé en ce 35 qu'elle comprend en outre une autre enzyme antioxydante,

d'origine synthétique, animale, végétale, bactérienne ou recombinante, choisie dans le groupe constitué par une supéroxyde dismutase, une catalase ou un glutathion péroxydase.

26

10

20. Composition selon l'une quelconque des revendications 17 à

19, caractérisé en ce que la teneur en supéroxyde dismutase dite recombinante est comprise entre 0,01 et 5 % en poids par rapport au poids total de la composition, de préférence entre 0,1 et 1 % en poids.

21. Composition selon l'une quelconque des revendications 17 à

20, caractérisé en ce qu'elle se présente sous forme de lait, gel, crème, pour une application par voie topique.

22. Utilisation d'une composition cosmétique selon l'une quelconque des revendications 17 à 21 pour prévenir ou lutter contre l'accumulation et/ou la surproduction de dérivés réactifs de l'oxygène, ou de radicaux libres, et/ou de ses conséquences

15 cutanées.

23. Utilisation selon la revendication 22, caractérisée en ce que lesdites conséquences cutanées comprennent les signes du vieillissement naturel ou photo-induit de la peau, en

20 particulier la dégradation des fibres de collagène dans la matrice extra-cellulaire du derme.

24. Utilisation selon la revendication 22, caractérisée en ce que lesdites conséquences cutanées comprennent les

25 manifestations inflammatoires de la peau, par exemple l'érythème, et en particulier le nombre de sites neutrophiles d'inflammation.

25. Utilisation d'une supéroxyde dismutase à cuivre et zinc, 30 dite recombinante, comprenant une séquence en acides aminés identique ou homologue à celle d'une supéroxyde dismutase à cuivre et zinc extra-cellulaire présente dans l'anémone de mer Anemonia viridis, pour la fabrication d'un médicament destiné à prévenir ou lutter contre l'accumulation de dérivés réactifs de 35 l'oxygène ou de radicaux libres, et/ou de ses conséquences pathologiques.

26. Utilisation selon la revendication 25, carcatérisée en ce que lesdites conséquences pathologiques comprennent le diabète,

TH/

27

le cancer, certaines maladies inflammatoires, neurodégénératives et auto-immunes.

27. Micro-organisme hôte, caractérisé en ce qu'il comprend un 5 acide nucléique selon l'une des revendications 12 à 15 ou un vecteur selon la revendication 16.

28. Supéroxyde dismutase à cuivre et zinc recombinante comprenant une séquence en acides aminés identique ou homologue

10 à la séquence en acides aminés d'une EC-CuZnSOD endogène d'Anemonia viridis.

15

TFv/

28

ABRÉGÉ

5 L'invention concerne un procédé de synthèse, selon des techniques issues des biotechnologies, d'une métalloprotéine d'origine marine à la stabilité et l'activité enzymatique de type "supéroxyde dismutase" remarquables. L'invention concerne également les applications cosmétique et thérapeutique de la 10 métalloprotéine obtenue.

15

ml

SEQUENCE LISTING

<110> EXSYMOL

<120> PROCEDE OPTIMAL DE PRODUCTION RECOMBINANTE D'UNE METALLOPROTEINE MARINE ET SES APPLICATIONS

<130> 10113

<160> 7

<170> Patentln version 3.3

<210> 1

<211> 579

<212> DNA

<213> Anemonia viridis

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(579)

<400> 1

atg aag ctc tta gcg ttt ctt ttg gtg tgt tcc agt gtt gtt cag aca 48

Met Lys Leu Leu Al a Phe Leu Leu val Cys Ser Ser val val Gin Thr 15 10 15

tgt gct gaa gqt gcg gca atg tgt tac atg aag cca aac cca gta ctc 96

Cys Al a Glu Gly Al a Al a Met Cys Tyr Met Lys Pro Asn Pro val Leu 20 25 30

cct gac acc ata gac acc aaa gtg aca gga acc gtc atg ctt tct caa 144

Pro Asp Thr île Asp Thr Lys val Thr Gly Thr val Met Leu Ser Gin 35 40 45

aag tct cca tca gct aaa atc aaa atc act ttg aat ttg aaa ggc tta 192

Lys Ser pro Ser Ala Lys Ile Lys Ile Thr Leu Asn Leu Lys Gly Leu 50 55 60

cca cca aac act cca cat gga ttt cat gta cat caa tat ggg gat atc 240

Pro Pro Asn Thr Pro His Gly Phe His val His Gin Tyr Gly Asp Ile 65 70 75 80

gac acg aac ggt tgt cag agt acc gct tct cac ttc aat cct ttt gqt 288

Asp Thr Asn Gly Cys Gin Ser Thr Ala ser His Phe Asn Pro Phe Gly 85 90 95

gct aca cac ggc gga cct caa gat gat gaa aaa cac cga cac gtt gqt 336

Ala Thr His Gly Gly Pro Gin Asp Asp Glu Lys His Arg His Val Gly 100 105 110

gac ctt ggt aac gtg atg tca aac gca gaa ggc aga atc aag ata atg 384

Asp Leu Gly Asn val Met Ser Asn Ala Glu Gly Arg île Lys île Met 115 120 125

ttg tcc gac tac ttg gtg tct ctt tat gga cct tac tct gtt att ggt 432

Leu ser Asp Tyr Leu val Ser Leu Tyr Gly Pro Tyr ser val île Gly 130 135 140

cgc tca ttt gtg ata cac gcc aaa ata gac gac tta gga aga gqt aca 480

Arg Ser Phe Val Ile His Ala Lys Ile Asp Asp Leu Gly Arg Gly Thr 145 150 155 160

gga gca gca aga aaa gag agt tta aag act gqt aac gct gga gca cgt 528

Gly Ala Ala Arg Lys Glu Ser Leu Lys Thr Gly Asn Ala Gly Ala Arg 165 170 175

ctg gca tgt tgt acg att gtc cat gca gct cct gcg gct gct ttg aaa 576

Page 1

V

Leu Ala Cys Cys Thr île val His Ala Ala Pro Ala Ala Ala Leu Lys 180 185 190

taa 579

<210> 2 <211> 192 <212> PRT

<213> Anemonia viridis <400> 2

Met Lys Leu Leu Ala Phe Leu Leu val cys Ser ser val val Gin Thr 15 10 15

Cys Ala Glu Gly Ala Ala Met Cys Tyr Met Lys Pro Asn Pro val Leu 20 25 30

Pro Asp Thr île Asp Thr Lys val Thr Gly Thr val Met Leu Ser Gin 35 40 45

Lys Ser Pro Ser Ala Lys île Lys île Thr Leu Asn Leu Lys Gly Leu 50 55 60

Pro Pro Asn Thr Pro His Gly Phe His val His Gin Tyr Gly Asp Ile 65 70 75 80

Asp Thr Asn Gly Cys Gin Ser Thr Ala ser His Phe Asn Pro Phe Gly 85 90 95

Ala Thr His Gly Gly Pro Gin Asp Asp Glu Lys His Arg His val Gly 100 105 110

Asp Leu Gly Asn Val Met Ser Asn Ala Glu Gly Arg île Lys Ile Met 115 120 125

Leu Ser Asp Tyr Leu val Ser Leu Tyr Gly Pro Tyr Ser val île Gly 130 135 140

Arg Ser Phe Val Ile His Ala Lys Ile Asp Asp Leu Gly Arg Gly Thr 145 150 155 160

Gly Ala Ala Arg Lys Glu Ser Leu Lys Thr Gly Asn Ala Gly Ala Arg 165 170 175

Leu Ala Cys Cys Thr île val His Ala Ala Pro Ala Ala Ala Leu Lys 180 185 190

<210> 3 <211> 525 <212> DNA

<213> Anemonia viridis <220>

<221> exon

Page 2

TFV

<222> (1)..(525)

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(525)

<400> 3

gaa gqt gcg gca atg tgt tac atg aag cca aac cca gta ctc cct gac 48

Glu Gly Ala Ala Met Cys Tyr Met Lys Pro Asn pro val Leu Pro Asp 15 10 15

acc ata gac acc aaa gtg aca gga acc gtc atg ctt tct caa aag tct 96

Thr île Asp Thr Lys val Thr Gly Thr val Met Leu ser Gin Lys Ser 20 25 30

cca tca gct aaa atc aaa atc act ttg aat ttg aaa ggc tta cca cca 144

Pro Ser Ala Lys île Lys Ile Thr Leu Asn Leu Lys Gly Leu Pro Pro 35 40 45

aac act cca cat gga ttt cat gta cat caa tat gqg gat atc gac acg 192

Asn Thr Pro His Gly Phe His Val His Gin Tyr Gly Asp Ile Asp Thr 50 55 60

aac gqt tgt cag agt acc gct tct cac ttc aat cct ttt ggt gct aca 240

Asn Gly Cys Gin Ser Thr Ala Ser His Phe Asn Pro Phe Gly Ala Thr 65 70 75 80

cac ggc gga cct caa gat gat gaa aaa cac cga cac gtt ggt gac ctt 288

His Gly Gly Pro Gin Asp Asp Glu Lys His Arg His val Gly Asp Leu 85 90 95

ggt aac gtg atg tca aac gca gaa ggc aga atc aag ata atg ttg tcc 336

Gly Asn val Met Ser Asn Ala Glu Gly Arg île Lys île Met Leu Ser 100 105 110

gac tac ttg gtg tct ctt tat gga cct tac tct gtt att ggt cgc tca 384

Asp Tyr Leu val Ser Leu Tyr Gly Pro Tyr Ser val île Gly Arg Ser 115 120 125

ttt gtg ata cac gcc aaa ata gac gac tta gga aga ggt aca gga gca 432

Phe val Ile His Ala Lys Ile Asp Asp Leu Gly Arg Gly Thr Gly Ala 130 135 140

gca aga aaa gag agt tta aag act ggt aac gct gga gca cgt ctg gca 480

Ala Arg Lys Glu Ser Leu Lys Thr Gly Asn Ala Gly Ala Arg Leu Ala 145 150 155 160

tgt tgt acg att gtc cat gca gct cct gcg gct gct ttg aaa taa 525

Cys Cys Thr île val His Ala Ala Pro Ala Ala Ala Leu Lys 165 170

<210> 4 <211> 174 <212> PRT

<213> Anemonia viridis <400> 4

Glu Gly Ala Ala Met Cys Tyr Met Lys Pro Asn Pro val Leu Pro Asp 15 10 15

Thr Ile Asp Thr Lys val Thr Gly Thr val Met Leu ser Gin Lys Ser 20 25 30

Pro Ser Ala Lys île Lys Ile Thr Leu Asn Leu Lys Gly Leu Pro Pro 35 40 45

Page 3

P \l

Asn Thr Pro His Gly Phe His val His Gin Tyr Gly Asp Ile Asp Thr 50 55 60

Asn Gly Cys Gin ser Thr Ala Ser His Phe Asn Pro Phe Gly Ala Thr 65 70 75 80

His Gly Gly Pro Gin Asp Asp Glu Lys His Arg His val Gly Asp Leu 85 90 95

Gly Asn val Met Ser Asn Ala Glu Gly Arg île Lys île Met Leu Ser 100 105 110

Asp Tyr Leu val Ser Leu Tyr Gly Pro Tyr ser val Ile Gly Arg Ser 115 120 125

Phe Val Ile His Ala Lys Ile Asp Asp Leu Gly Arg Gly Thr Gly Ala 130 135 140

Ala Arg Lys Glu Ser Leu Lys Thr Gly Asn Ala Gly Ala Arg Leu Ala 145 150 155 160

Cys Cys Thr île val His Ala Ala Pro Ala Ala Ala Leu Lys 165 170

<210> 5 <211> 579 <212> DNA <213> Artificial

<220>

<223> Séquence nucléotidique optimisée SEQ ID NO 5 codant pour une EC-CuZnSOD recombinante de SEQ ID NO 2, c'est-à-dire avec un peptide signal.

<220>

<221> exon <222> (1)..(579)

<400> 5

atg aaa ctg ctg gcg ttt ctg ctg gtt tgt agc agc gtt gtt cag acc 48

Met Lys Leu Leu Ala Phe Leu Leu Val Cys Ser Ser Val val Gin Thr 15 10 15

tgt gcc gaa ggt gcg gcg atg tgt tat atg aaa ccg aat ccg gtt ctg 96

Cys Ala Glu Gly Ala Ala Met Cys Tyr Met Lys Pro Asn Pro Val Leu 20 25 30

ccg gat acc atc gat acc aaa gtt acc ggc acc gtt atg ctg agc cag 144

Pro Asp Thr île Asp Thr Lys val Thr Gly Thr Val Met Leu Ser Gin 35 40 45

aaa agc ccg agc gcg aaa atc aaa atc acc ctg aac ctg aaa ggt ctg 192

Lys Ser Pro Ser Ala Lys Ile Lys Ile Thr Leu Asn Leu Lys Gly Leu 50 55 60

ccg ccg aat acc ccg cat ggc ttt cat gtt cac cag tat ggc gat att 240

Pro Pro Asn Thr Pro His Gly Phe His Val His Gin Tyr Gly Asp île 65 70 75 80

Page 4

Tfl/

gat acc aac gqt tgt cag agc acc gcc agc cat ttt aat ccg ttt ggt Asp Thr Asn Gly Cys Gin Ser Thr Ala Ser His Phe Asn Pro Phe Gly 85 90 95

288

gcc acc cat ggt ggt ccg cag gat gat gaa aaa cat cgc cat gtg ggc Ala Thr His Gly Gly Pro Gin Asp Asp Glu Lys His Arg His Val Gly

100

105

110

336

gat ctg gqt aac gtt atg agc aat gcc gaa ggc cgt atc aaa atc atg Asp Leu Gly Asn val Met Ser Asn Ala Glu Gly Arg île Lys île Met 115 120 125

384

ctg agc gat tat ctg gtg agc ctg tat ggt ccg tat agc gtg att ggc Leu Ser Asp Tyr Leu Val Ser Leu Tyr Gly Pro Tyr Ser val Ile Gly 130 135 140

432

cgt agc ttt gtg atc cac gcc aaa att gat gat ctg ggt cgt ggc acc Arg Ser Phe Val Ile His Ala Lys île Asp Asp Leu Gly Arg Gly Thr 145 150 155 160

480

ggt gca gcc cgt aaa gaa agc ctg aaa acc ggt aat gcc gqt gcc cgt Gly Ala Ala Arg Lys Glu Ser Leu Lys Thr Gly Asn Ala Gly Ala Arg 165 170 175

528

ctg gcg tgt tgt acc att gtt cat gcc gcc ccg gcg gcg gcg ctg aaa Leu Ala Cys Cys Thr île val His Ala Ala Pro Ala Ala Ala Leu Lys 180 185 190

576

taa

579

<210> <211> <212>

6

621 DNA

<213> Artificial

<220>

<223> séquence nucléotidique optimisée SEQ ID NO 6 codant pour une

EC-CuZnSOD recombinante de SEQ ID NO 7, qui ne comprend pas de peptide signal, mais qui comprend un "tag histidine", un "linker", etc

<220>

<221> CDS <222> (1)..(615)

<400> 6 "

atg tcg tac tac cat Met Ser Tyr Tyr His 1 5

cac cat His His cac cat His His cac ctc gaa His Leu Glu 10

tca aca Ser Thr agt ttg Ser Leu 15

48

tac aaa aaa gca ggc ttt aaa gaa aat Tyr Lys Lys Ala Gly Phe Lys Glu Asn 20 25

tta tac ttc Leu Tyr Phe caa ggt Gin Gly 30

gaa gqt Glu Gly

96

gcg gcg atg tgt tat atg aaa ccg aat ccg gtt ctg ccg gat acc atc Ala Ala Met Cys Tyr Met Lys Pro Asn Pro val Leu Pro Asp Thr Ile 35 40 45

144

gat acc aaa gtt acc ggc acc gtt atg ctg agc cag aaa agc ccg agc Asp Thr Lys val Thr Gly Thr val Met Leu Ser Gin Lys Ser Pro Ser 50 55 60

192

gcg aaa atc aaa atc acc ctg aac ctg aaa ggt ctg Ala Lys Ile Lys Ile Thr Leu Asn Leu Lys Gly Leu 65 70 75

ccg ccg aat acc Pro Pro Asn Thr 80

240

Page 5

tfV

528

ccg cat ggc ttt cat gtt cac cag tat ggc gat att gat acc aac ggt 288

Pro His Gly Phe His val His Gin Tyr Gly Asp île Asp Thr Asn Gly 85 90 95

tgt cag agc acc gcc agc cat ttt aat ccg ttt ggt gcc acc cat ggt 336

Cys Gin Ser Thr Ala ser His Phe Asn Pro Phe Gly Ala Thr His Gly 100 105 110

gqt ccg cag gat gat gaa aaa cat cgc cat gtg ggc gat ctg ggt aac 384

Gly Pro Gin Asp Asp Glu Lys His Arg His Val Gly Asp Leu Gly Asn 115 120 125

gtt atg agc aat gcc gaa ggc cgt atc aaa atc atg ctg agc gat tat 432

Val Met Ser Asn Ala Glu Gly Arg île Lys Ile Met Leu ser Asp Tyr 130 135 140

ctg gtg agc ctg tat ggt ccg tat agc gtg att ggc cgt agc ttt gtg 480

Leu val Ser Leu Tyr Gly Pro Tyr Ser val Ile Giy Arg Ser Phe val 145 150 155 160

atc cac gcc aaa att gat gat ctg ggt cgt ggc acc gqt gca gcc cgt Ile His Ala Lys Ile Asp Asp Leu Gly Arg Gly Thr Gly Ala Ala Arg 165 170 175

aaa gaa agc ctg aaa acc gqt aat gcc ggt gcc cgt ctg gcg tgt tgt 576

Lys Glu Ser Leu Lys Thr Gly Asn Ala Gly Ala Arg Leu Ala Cys Cys 180 185 190

acc att gtt cat gcc gcc ccg gcg gcg gcg ctg aaa taa gaattc 621

Thr île val His Ala Ala Pro Ala Ala Ala Leu Lys 195 200

<210> 7 <211> 204 <212> PRT <213> Artificial

<220>

<223> Synthetic Construct <400> 7

Met Ser Tyr Tyr His His His His His His Leu Glu Ser Thr Ser Leu 15 10 15

Tyr Lys Lys Ala Gly Phe Lys Glu Asn Leu Tyr Phe Gin Gly Glu Gly " 20 25 30

Ala Ala Met Cys Tyr Met Lys Pro Asn Pro val Leu Pro Asp Thr Ile 35 40 45

Asp Thr Lys Val Thr Gly Thr val Met Leu Ser Gin Lys Ser Pro Ser 50 55 60

Ala Lys Ile Lys Ile Thr Leu Asn Leu Lys Gly Leu Pro Pro Asn Thr 65 70 75 80

Pro His Gly Phe His val His Gin Tyr Gly Asp Ile Asp Thr Asn Gly 85 90 95

Cys Gin Ser Thr Ala Ser His Phe Asn Pro Phe Gly Ala Thr His Gly 100 105 110

Page 6

in/

Gly Pro Gin Asp Asp Glu Lys His Arg His Val Gly Asp Leu Gly Asn 115 120 125

Val

Met 130

Ser Asn Ala Glu

Gly Arg Ile 135

Lys île

Met 140

Leu Ser Asp Tyr

Leu 145

Val Ser Leu Tyr

Gly 150

Pro Tyr Ser val

île Gly Arg Ser Phe val 155 160

île His Ala Lys Ile Asp Asp Leu Gly Arg Gly Thr Gly Ala Ala Arg 165 170 175

Lys Glu Ser Leu Lys Thr Gly Asn Ala Gly Ala Arg Leu Ala Cys Cys 180 185 190

Thr île Val His Ala Ala Pro Ala Ala Ala Leu Lys 195 200

Page 7