MC2397A1 - Peptide ayant une affinité pour les tumeurs et agent de diagnostic radioactif et agent thérapeutique radioactif contenant ce peptide - Google Patents

Description

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PEPTIDE AYANT UNE AFFINITE POUR LES TUMEURS, ET AGENT DE DIAGNOSTIC RADIOACTIF ET AGENT THERAPEUTIQUE RADIOACTIF

CONTENANT CE PEPTIDE

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La présente invention concerne des peptides ayant une affinité pour les tissus tumoraux et les sels de ces peptides destinés à être utilisés dans l'imagerie de tissus pathologiques tels les tumeurs de mammifères, y compris les tumeurs humaines. La présente invention concerne aussi les 10 mêmes peptides marqués par des métaux radioactifs et leurs sels, marqués au technétium-99m, rhénium-186, rhénium-188, cuivre-62 ou indium-111, ainsi que les agents de diagnostic marqués par les métaux radioactifs et les agents thérapeutiques marqués par des métaux radioactifs contenant ces peptides marqués par des métaux radioactifs.

15 II est connu que les tissus tumoraux présentent souvent, à la surface de cellules, des protéines ou des carbohydrates complexes spécifiques des tumeurs. Bien que ces protéines n'apparaissent généralement que lorsque que le tissu est devenu malin, il est connu que, dans certains cas, ces protéines sont originellement présentes dans les 20 tissus normaux et que leur quantité augmente de façon très significative lorsque le tissu devient malin. Par conséquent, de nombreux efforts ont été faits pour obtenir des anticorps monoclonaux contre ces protéines ou les carbohydrates complexes pour les utiliser dans le diagnostic spécifique des tumeurs. Par exemple, dans le cas du carcinome colo-rectoral où l'expression 25 de I' ACE (Antigène carcino-embryonnaire) est significativement accrue, les tumeurs ont pu être détectées avec succès au cours d'expériences sur des animaux ou au cours de tests cliniques par une technique relevant de la médecine nucléaire utilisant des anticorps monoclonaux anti-ACE marqués avec un élément métallique, le ln-111. Cependant, parce que les anticorps 30 monoclonaux sont produits à partir de cellules isolées d'organismes vivants et que leur manipulation nécessite des méthodes compliquées et une compétence, leur usage n'est pas encore largement répandu.

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Une solution plus pratique pour - surmonter ces circonstances consisterait à analyser l'anticorps pour en déterminer une structure partielle contenant le site de liaison spécifique et à synthétiser chimiquement cette structure partielle afin de préparer un réactif. Dans cette perspective, une 5 étude a été publiée sur les essais de déchiffrage de la séquence peptidique des centres actifs de substances qui ont une action physiologique, telles les protéines présentes naturellement dans les tumeurs et les anti-corps monoclonaux anti-tumoraux, dans le but de reproduire des capacités de fixation équivalentes à celle des protéines ou des anti-corps monoclonaux 10 anti-tumoraux ( voir The Journal of Nuclear Medecine Newsline. Lantz Miller, vol. 34, n° 11, 15N-30N, 1993. 11, Synthetic Peptide Corne of Age).

Dans cette perspective, PCT/W09218534-A décrit un peptide de capacité de fixation équivalente à celle d'un anti-corps monoclonal (ci-après 15 dénommé "peptide EPPT"), les acides aminés étant dénotés par leur leur désignation normalisées à une ou trois lettres dans la présente demande.

D'après cette référence bibliographique, un anti-corps monoclonal reconnaissant spécifiquement la mucine non-glycosylée a été obtenu, et le peptide EPPT, qui est une structure partielle de la Région Déterminant la 20 Complémentarité antigénique (RDC) responsable de la fixation spécifique de l'anticorps, a été analysé et caractérisé.

La séquence d'acides aminés qui a été obtenue à partir de cette RDC est la séquence YCAREPPTRTFAYWGQG. Il a été démontré que cette séquence marquée à l'iode-125 est capable de se fixer aux cellules 25 tumorales ce qui est une preuve de son usage possible en tant qu'alternative à l'anticorps monoclonal et en tant qu'agent de diagnostic radioactif de la prochaine génération.

L'iode-123, le technétium-99m, et autres radioisotopes, peuvent être cités comme exemples d'isotopes radioactifs qui possèdent, dans 30 l'ensemble, toutes les caractéristiques requises d'agents de diagnostic radioactifs. En particulier, le technétium-99m est considéré comme étant le métal radioactif le plus approprié: il émet 140 KeV de rayons gamma, ce qui permet l'obtention de scintigrammes avec un appareil d'imagerie radioactive d'usage courant; il a une demie-vie de 6 heures ce qui convient au domaine 35 de la médecine nucléaire pour l'imagerie d'organes précis, la détection de troubles particuliers et l'examen de leurs mouvements; il a l'avantage d'être facilement disponible à bas prix car ses précurseurs sont maintenant courants.

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- Cependant, le peptide EPPT mentionné ci-dessus présente des problèmes qui n'ont pas encore été résolus tels, par exemple, le fait qu'une fois marqué au technétium-99m ou avec d'autres métaux radioactifs, son rendement de marquage n'est pas suffisant pour en permettre l'utilisation en 5 tant que produit d'usage médical, et le fait que, dès son administration, il cède de la radioactivité à des tissus normaux, en particulier les reins.

Etant donné les problèmes de bas rendement de marquage du peptide EPPT par le technétium-99m et autres éléments radioactifs et étant donné l'accumulation, dès son administration, des produits de son 10 catabolisme au niveau des tissus normaux, en particulier des reins, le but de la présente invention est de fournir un peptide ayant une affinité pour les tumeurs et dont les propriétés sont: un haut rendement de marquage par des métaux radioactifs, un catabolisme limité dans le corps vivant ou une accumulation limitée dans les tissus normaux, et une utilité dans l'imagerie et 15 le traitement de tissus pathologiques du tronc du corps tels le cancer du sein, le cancer de l'ovaire, et le cancer du colon des mammifères, humain inclus. La présente invention concerne aussi un peptide marqué par un métal radioactif comprenant ledit peptide et un métal radioactif, ainsi qu'un agent de diagnostic radioactif et un agent thérapeutique radioactif contenant ce 20 peptide.

La présente invention vise des peptides ayant une affinité pour les tumeurs et caractérisés par la formule X^YCAREPPTO^ (reférée ci-après en tant que "formule 1") ayant jusqu'à 20 résidus aminoacides, et les sels de ces peptides. Cette invention vise aussi un peptide marqué par un métal 25 radioactif comprenant un métal radioactif associé au peptide décrit ci-dessus et ses sels, et elle vise aussi un agent de diagnostic radioactif et un agent pharmaceutique radioactif contenant le peptide ci-dessus marqué par le métal radioactif. Dans la formule 1, X, est un composé organique basique contenant de 1 à 3 groupes aminés, la séquence d'acides aminés YCAR est 30 constituée des résidus aminoacides Y, C, A et R chacun d'eux pouvant être sous la forme-L- et/ou la forme-D, et X2 est une quelconque séquence d'acides aminés donnée.

X, peut être un composé organique basique obtenu en remplaçant par de fonctions aminés de 1 à 3 atomes d'hydrogène déterminés 35 quelconques appartenant à une chaîne alkyle saturée ou non-saturée ayant de 1 à 7 atomes de carbone ou à une chaîne alkyle saturée comportant de 1 à 7 atomes de carbone et substituée par le groupe -OH et/ou -COOH ou -NH-C(NH) NH2.

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Xi est lié au présent peptide à l'extrémité N-terminale de celui-ci, et est de préférence un acide aminé basique ayant de 1 à 3 groupes amino, par exemple, K ou R sous la forme L ou D. X2 peut être n'importe qu'elle séquence d'aminoacides située à la suite de la séquence YCAREPPT dans 5 laquelle les résidus aminoacides Y, C, A et R peuvent être sous la forme L et/ou la forme D. X2 est de préférence l'une des séquences RTNAYWG, RTFAYWG, RTNAYWGQG, et RTFAYWGQG dans lesquelles chacun des résidus aminoacides A, F, G, N, Q, R, T, W et Y peut être sous la forme L et/ou la forme D. De plus, l'extrémité N-terminale ou C-terminale du présent 10 peptide peuvent être modifiées chimiquement afin de contrôler le temps de rétention du peptide dans le sang.

Par exemple, lorsque est un acide aminé, la modification chimique de l'extrémité N-terminale peut être faite par acétylation, guanidylation, amidination, alcylation réductive, carbamylation, succinylation, 15 maléilation, acétoacétylation, nitrotroponylation, dinitrophénylation, trinitrophénylation, benzyloxycarbonylation, t-butoxycarbonylation, 9-fluorénylméthoxycarbonylation, et de préférence, par acétylation.

De même, le groupe carboxyl C-terminal de X2 peut être modifié chimiquement par amidation, estérification ou alcoolisation, et de préférence, 20 par amidation.

De plus, le peptide cité ci-dessus peut former plusieurs cations , anions et sels lorsqu'il est dissous dans des solutions aqueuses. Toute forme de ce peptide est inclue dans la présente invention.

Le peptide ayant une affinité pour les tissus tumoraux de la 25 présente invention peut être obtenu en effectuant sa synthèse à l'aide d'un synthétiseur de peptides manufacturé par Applied Biosystems Inc., puis en éliminant du peptide attaché aux billes de la phase solide simultanément le groupe protecteur et les billes, et ensuite, en purifiant le peptide par chromatographie en phase liquide de haute performance (HPLC) en utilisant 30 une colonne de type phase inversée. La synthèse peut aussi être effectuée par les méthodes courantes de chimie des peptides en phase solide telle la méthode FMOC.

Le présent peptide dissous dans un tampon physiologique salin, un tampon aqueux ou similaire, peut être marqué à des fins diagnostiques 35 par réaction avec un métal radioactif. Dans le cas du technétium-99m, le rhénium-186 ou le rhénium-188, les peptides marqués peuvent être préparés en utilisant une méthode courante qui consiste à procéder à l'addition audit peptide d'un agent réducteur ayant un potentiel rédox adéquat, tel le chlorure

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d'étain, et à effectuer ensuite le mélange avec une solution de pertechnétate de sodium ou une solution de perrhénate de sodium. Dans le cas du cuivre-62 ou de l'indium-111, les peptides marqués peuvent être préparés par mélange des peptides avec un sel neutre contenant des ions cuivre-62 ou 5 une solution aqueuse à faible acidité contenant des ions indium-111. De même, dans le cas de l'yttrium-90, les peptides marqués peuvent être préparés en effectuant le mélange du dit peptide avec une solution aqueuse de faible acidité à faible basicité contenant des ions yttrium-90. Si nécessaire, les impuretés ou les ions pertechnéate, perrhéate, cuivre-62, 10 indium-111 et yttrium-90 qui n'ont pas réagi peuvent être éliminés par HPLC.

De plus, le présent peptide peut être fourni sous la forme d'un kit afin qu'il puisse être préparé à la demande. Le kit peut inclure des stabilisateurs acceptables d'un point de vue pharmaceutique tels l'acide ascorbique et l'acide p-amino-benzoique, des réactifs utilisés pour ajuster le 15 pH tels des tampons aqueux, des excipients tels le D-mannitol et des agents qui aident à améliorer la pureté radiochimique tels les acides citrique, tartrique, et malonique.

L'agent de diagnostic marqué par un métal radioactif et contenant le peptide ayant une affinité pour les tumeurs de la présente invention peut 20 être administré par les moyens couramment employés d'administration parentérale telle l'injection intraveineuse en bolus. La quantité de radioactivité à administrer peut être déterminée de telle sorte à fournir un compte suffisant pour l'imagerie, en prenant en considération diverses variables telles le poids du patient, son âge et le type d'appareil d'imagerie 25 radioactive. Lorsqu'il s'agit d'un sujet humain, normalement il est préférable d'utiliser une quantité de radioactivité allant de 185 MBq à 1110 MBq.

De plus, l'agent thérapeutique marqué par un métal radioactif et qui contient le peptide ayant une affinité pour les tumeurs de la présente invention peut être administré par les moyens couramment employés 30 d'administration parentérale telle l'injection intraveineuse en bolus. La quantité de radioactivité à administrer peut être déterminée de sorte à fournir une dose de radiation suffisante pour permettre le traitement, en tenant compte du poids du patient, de son âge et sexe, du site à traiter et d'autres facteurs. Lorsque le sujet est humain, la quantité de radioactivité nécessaire 35 est normalement de 37 MBq à 18500 MBq, et de préférence de 370 MBq à 7400 MBq dans le cas du rhénium-186 et du rhénium-188. Dans le cas de l'yttrium-90, la quantité de radioactivité nécessaire est normalement de 37 MBq à 3700 MBq, et de préférence de 37 MBq à 1110 MBq. Cette technique

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sera détaillée dans les exemples ci-dessous, où les résidus aminoacides sous la forme D seront dénommés résidus d-aminoacides, et la Figure 1 présente un chromatogramme obtenu par HPLC après administration du peptide-1-technétium-99m,

5 la Figure 2 présente un chromatogramme obtenu par HPLC après administration du peptide-2-technétium-99m,

la Figure 3 présente un scintigramme de la totalité du corps d'une souris nude atteinte d'un cancer du larynx 5 minutes après administration du peptide-2-téchnetium-99m,

10 la Figure 4 présente un scintigramme de la totalité du corps d'une souris nude atteinte d'un cancer du larynx 20 minutes après administration du peptide-2-technétium-99m,

la Figure 5 présente un scintigramme de la totalité du corps d'une souris nude atteinte d'un cancer du larynx 5 minutes après administration du 15 peptide-14-technétium-99m,

la Figure 6 présente un scintigramme de la totalité du corps d'une souris nude atteinte d'un cancer du larynx 20 minutes après administration du peptide-14-technétium-99m,

la Figure 7 présente un chromatogramme obtenu par HPLC du 20 peptide-1 -technétium-99m,

la Figure 8 présente un chromatogramme obtenu par HPLC d'un mélange de peptide-1 -technétium-99m et de plasma humain après une incubation de 5 minutes à 4°C,

la Figure 9 présente un chromatogramme obtenu par HPLC d'un 25 mélange de peptide-1-technétium-99m et de plasma humain après une incubation de 30 minutes à 4°C,

la Figure 10 présente un chromatogramme obtenu par HPLC d'un mélange de peptide-1 -technétium-99m et de plasma humain après une incubation de 5 minutes à 4°C,

30 la Figure 11 présente un chromatogramme obtenu par HPLC d'un mélange de peptide-1 -technétium-99m et de plasma humain après une incubation de 30 minutes à 4°C,

la Figure 12 présente un chromatogramme obtenu par HPLC d'un mélange de peptide-8-technétium-99m et de plasma humain après une 35 incubation de 5 minutes à 4°C,

la Figure 13 présente un chromatogramme obtenu par HPLC d'un mélange de peptide-8-technétium-99m et de plasma humain après une incubation de 30 minutes à 4°C,

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la Figure 14 présente un chromatogramme obtenu par HPLC d'un mélange de peptide-8-technétium-99m et de plasma humain après une incubation de 5 minutes à 4°C,

la Figure 15 présente un chromatogramme obtenu par HPLC d'un 5 mélange de peptide-8-technétium-99m et de plasma humain après une incubation de 30 minutes à 4°C.

EXEMPLE 1 Synthèse de KYCAREPPTRTFAYWGQG 10 La synthèse a été effectuée à l'aide d'un synthétiseur de peptides

(Modèle 431 A) commercialisé par Applied Biosystems Inc. dans les conditions de synthèse de 0.25 mM par la méthode FMOC en utilisant une résine HMP (résine 4-hydroxy-méthyl-phénoxy méthyl-copolystyrène-1 % divinyl-benzène). La libération du peptide a été accomplie en laissant réagir 15 pendant 1,0 heure en présence d'une solution aqueuse d'acide trifluoroacétique (TFA) à 82.6 % contenant 6.5 % de phénol, 2.2 % d'éthanédithiol (EDT) et 4.3 % de thioanisol. La purification a été effectuée par chromatographie en phase liquide (HPLC) dans les conditions suivantes: Colonne: YMC-Pack R&DD-ODS-5-ST (20 x 150 mm),

20 Débit: 8 ml/min,

Eluant A: 0,1 % TFA/eau distillée,

Eluant B: 0,1 % TFA/acétonitrile,

Concentration du gradient: 0 min. (15 % B) -» 100 min (50 % B)

-> 120 min (75 % B)

25 En variante, des résines pré-chargées ont été utilisées pour effectuer la synthèse au lieu de la résine HMP.

De plus, la composition en acides aminés du produit d'élution correspondant au pic principal résultant de la synthèse a été déterminée à l'aide d'une station de travail PICOTAG-TM-Workstation fabriquée par 30 Waters Inc. pour confirmer qu'il s'agit bien du peptide désiré. Ensuite, le produit correspondant au pic dont la composition en acides aminés coïncide avec celle du peptide désiré a été lyophilisé avec un rendement de 62,4 mg (29,3 |jmol) de produit lyophilisé de séquence KYCAREPPTRTFAYWGQG (désigné comme "peptide-1" ci-après). La valeur analytique (nombre par 35 molécule) de la composition en acides aminés du peptide résultant est donnée ci-dessous en même temps que la valeur théorique (nombre par molécule) entre parenthèses:

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Peptide-1: Glx: 1,96 (2), Gly: 2,44 (2), Pro : 2,21 (2), Lys: 0,93 (1), Arg: 2,00

(2), Thr: 2,30 (2), Ala : 1,87 (2), Tyr: 2,14 (2), Cys: 0,35 (1), Phe: 0,93 (1), Trp:

-(1).

Afin de confirmer la fiabilité du synthétiseur de peptides, le peptide résultant a été séquencé en utilisant un analyseur de peptides automatique fabriqué par Applied Biosystems Inc. Le résultat de cette analyse montre que la séquence allant de l'extrémité N-terminale jusqu'au A du 13ème résidu aminoacide est identique à celle de la séquence désirée. Par conséquent, la séquence aminoacide du présent peptide a bien été confirmée comme étant la séquence KYCAREPPTRTFAYWGQG.

EXEMPLE 2

Synthèses des peptides YCAREPPTRTNAYWG. YCAREPPTRTFAYWG et

YCAREPPTRTFAYWGQG

Une fois la synthèse des peptides YCAREPPTRTNAYWG (ci-après désigné "peptide-2"), YCAREPPTRTFAYWG (ci-après désigné "peptide-3") et YCAREPPTRTFAYWGQG (ci-après désigné "peptide-4") effectuée, et leur composition en acides aminés déterminée selon les procédés décrits dans l'Exemple 1, les produits correspondant aux pics dont la composition en acides aminés coïncide avec les séquences ci-dessus ont été lyophilisés de sorte à obtenir 42 mg (23,5 pmol) de produit lyophilisé du peptide-2, 40 mg (22 pmol) ) de produit lyophilisé du peptide-3 et 25 mg (12,5 |jmol) de produit lyophilisé du peptide-4. Les valeurs analytiques (nombre par molécule) des compositions en acides aminés des peptides obtenus sont données ci-dessous en même temps que, entre parenthèses, les valeurs théoriques (nombre par molécule) des peptides désirés.

Peptide-2 = Asx: 1,11 (1), Glx: 1,04 (1), Gly: 1,09 (1), Arg: 2,0 (2), Thr: 2,07 (2), Ala : 1,93 (2), Pro: 1,88 (2), Tyr: 1,79 (2), Cys: 0,80 (1), Trp: - (1).

Peptide-3 = Glx: 1,35 (1), Gly: 1,39 (1), Arg: 2,0 (2), Thr: 2,48 (2), Ala: 2,05 (2), Pro: 2,11 (2), Tyr: 1,79 (2), Cys: 0,68 (1), Phe: 1,22 (1), Trp: - (1).

Peptide-4 = Glx: 1,98 (2), Gly: 1,95 (2), Arg: 2,30 (2), Thr: 1,84 (2), Ala: 1,89 (2), Pro: 2,30 (2), Tyr: 1,89 (2), Cys: 0,6 (1), Phe: 0,96 (1), Trp: - (1).

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Synthèses de d-KYCAREPPTRTFAYWGd-QG. d-Kd-Yd-CAREPPTRTFAYWGQG. KYCAd-REPPTRTFAYWGQG. KYCAREPPTD-RTFAYWGQG. KYCAd-REPPTD-RTFAYWGQG. KYCAD-REPPTD-5 RTFAYd-WGQG. KYCAREPPTD-RTNAYWGQG. KYCAREPPTRD-

TNAYWGQG. et KYCAREPPTRTNAd-YWGQG.

Après avoir efféctuè la synthèse de d-KYCAREPPTRTFAYWGd-QG (ci-après désigné "peptide-5"), d-Kd-Yd-CAREPPTRTFAYWGQG (ci-après désigné "peptide-6"), KYCAd-REPPTRTFAYWGQG (ci-après désigné 10 "peptide-7"), KYCAREPPTd-RTFAYWGQG (ci-après désigné "peptide-8"), KYCAd-REPPTd-RTFAYWGQG (ci-après désigné "peptide-9"), KYCAd-REPPTd- RTFAYd-WGQG (ci-après désigné "peptide-10"), KYCAREPPTd-RTNAYWGQG (ci-après désigné "peptide-11"), KYCAREPPTRd-TNAYWGQG (ci-après désigné "peptide-12"), et KYCAREPPTRTNAd-15 YWGQG. (ci-après désigné "peptide-13"), et après en avoir déterminé la compositions en acides aminés selon la méthode décrite dans l'Exemple 1, les produits correspondant aux pics dont la composition en acides aminés coïncide avec la composition désirée ont été lyophilisés de sorte à obtenir 47 mg (22,1 pmol) de produit lyophylisé correspondant au peptide-5, 11 mg 20 (5,16 pmol) de produit lyophylisé correspondant peptide-6, 29 mg (13,6 pmol) de produit lyophilisé correspondant au peptide-7, 32 mg (15,0 (jmol) de produit lyophilisé correspondant au peptide-8, 74 mg (34,7 |jmol) de produit lyophilisé corrrespondant au peptide-9, 67 mg (31,4 fjmol) de produit lyophilisé correspondant au peptide-10, 38,2 mg (17,9 [jmol) de produit 25 lyophilisé correspondant au peptide-11, 37,7 mg (17,7 [jmol) de produit lyophilisé correspondant au peptide-12, et 64,3 mg (30,9 pmol) de produit lyophilisé correspondant au peptide-13. Les valeurs analytiques (nombre par molécule) de la composition en acides aminés des peptides obtenus sont données ci-dessous en même temps que les valeurs théoriques (nombre par 30 molécule) entre parenthèses des peptides désirés.

Peptide-5 = Glu: 1,96 (2), Gly: 2,18 (2), Arg: 1,93 (2), Thr: 1,95 (2), Ala: 2,05 (2), Pro: 2,11 (2), Tyr: 1,79 (2), Cys: - (1), Phe: 1,07 (1), Lys: 0,96 (1), Trp: -

(1).

Peptide-6 = Glu: 1,93 (2), Gly: 2,20 (2), Arg: 2,02 (2), Thr: 1,88 (2), Ala: 1,91 35 (2), Pro: 2,13 (2), Tyr: 1,89 (2), Cys: - (1), Phe: 1,09 (1), Lys: 0,96 (1), Trp: -

(1).

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Peptide-7 = Glu: 1,98 (2), Gly: 2,18 (2), Arg: 1,84 (2), Thr: 2,01 (2), Ala: 1,90

(2), Pro: 2,15 (2), Tyr: 1,91 (2), Cys: - (1), Phe: 1,04 (1), Lys: 0,99 (1), Trp: -

(1).

Peptide-8 = Glu: 1,97 (2), Gly: 2,16 (2), Arg: 1,95 (2), Thr: 1,98 (2), Ala: 1,84 5 (2), Pro: 2,03 (2), Tyr: 2,06 (2), Cys: - (1), Phe: 1,01 (1), Lys: 0,99 (1), Trp: -

(1)-

Peptide-9 = Glu: 1,85 (2), Gly: 2,05 (2), Arg: 1,93 (2), Thr: 2,09 (2), Ala: 2,01

(2), Pro: 2,01 (2), Tyr: 1,92 (2), Cys: - (1), Phe: 1,04 (1), Lys: 0,99 (1), Trp: -

(1).

10 Peptide-10 = Glu: 1,83 (2), Gly: 2,11 (2), Arg: 1,94 (2), Thr: 2,06 (2), Ala: 1,97

(2), Pro: 2,01 (2), Tyr: 1,93 (2), Cys: - (1), Phe: 1,04 (1), Lys: 1,00 (1), Trp: -

(1).

Peptide-11 = Asp: 0,96 (1), Glu: 1,97 (2), Gly: 2,18 (2), Arg: 1,98 (2), Thr: 2,11 (2), Ala: 1,89 (2), Pro: 2,00 (2), Tyr: 1,93 (2), Cys: - (1), Lys: 1,00 (1), 15 Trp: - (1).

Peptide-12 = Asp: 0,98 (1), Glu: 1,98 (2), Gly: 2,16 (2), Arg: 1,98 (2), Thr: 2,01 (2), Ala: 1,96 (2), Pro: 2,00 (2), Tyr: 1,94 (2), Cys: - (1), Lys: 0,99 (1), Trp: - (1).

Peptide-13 = Asp: 0,96 (1), Glu: 1,97 (2), Gly: 2,18 (2), Arg: 2,00 (2), Thr: 20 1,99 (2), Ala: 2,05 (2), Pro: 2,04 (2), Tyr: 1,89 (2), Val: 0,95 (1), Cys: - (1), Lys: 0,97 (1).

EXEMPLE 4

Synthèse du peptide avec extrémité C-terminale modifiée (amidée)

Dans la méthode décrite dans l'Exemple 1, la résine PAL (Peptide 25 Amide Linker) fabriqué par Milligen Bioresearch Inc. a été utilisée au lieu de la résine HMP dans la synthèse du peptide-1 résultant dans l'amidation de l'extrémité C-terminale de ce dernier. L'excision du peptide a été effectuée en laissant réagir pendant 1,5 heure dans une solution aqueuse d'acide trifluoroacétique (TFA) contenant 6,5 % de phénol, 2,2 % d'éthanédithiol 30 (EDT) et 4,3 % de thioanisol. La purification a été faite par chromatographie liquide (méthode HPLC) dans les conditions suivantes:

Colonne: YMC-Pack ODS-SH-343-5 (20 x 250 mm),

Débit: 8 ml/min,

Eluant A: 0,1 % TFA/eau distillée,

35 Eluant B: 0,1 % TFA/acétonitrile,

Concentration du gradient: 0 min. (10 % B) -> 10 min (10 % B)

-► 50 min (75 % B) -► 60 min (90 % B)

4

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La composition en acides aminés a été déterminée selon la méthode décrite dans l'Exemple 1 et le produit de synthèse correspondant au pic dont la composition en acides aminés coïncide avec celle désirée a été lyophilisé de sorte à obtenir 10 mg (4,6 (jmol) de produit lyophilisé 5 correspondant au peptide-1 avec l'extrémité C-terminale amidée.

EXEMPLE 5

Synthèse du peptide avec extrémité C-terminale modifiée (amidéeï et N-

terminale modifiée (acétylée)

Après avoir effectué la synthèse du peptide-1 dont l'extrémité C-10 terminale a été amidée selon la méthode décrite dans l'Exemple 4, l'extrémité N-terminale a été acétylée par de l'anhydride acétique en utilisant le N-hydroxybenzotriasol (HOBT) comme activateur, et cette étape a été suivie de l'excision du peptide. Le peptide a été excis selon la méthode décrite dans l'Exemple 4 et sa composition en acides aminés a été analysée selon la 15 méthode décrite dans l'Exemple 1. Le produit correspondant au pic dont la composition en acides aminés coïncide avec la composition désirée a été lyophilisé de sorte à obtenir 10 mg (4,5 [jmol) de produit lyophilisé correspondant au peptide-1 avec extrémité C-terminale amidée et N-terminale acétylée.

20 EXEMPLE 6

Marquage du peptide synthétisé au technétium-99m A une solution de glucoheptanate de 40,3 pmol/300 pi ont été rajoutés 130 nmol/50 pi de chlorure d'étain et 1049 MBq de pertechnétate de sodium. Le volume de la solution a été ajusté à 1,3 ml puis le mélange a été 25 agité. Après avoir laissé reposer le mélange 30 minutes à température ambiente, la purité de marquage du glucoheptanate a été vérifiée par électrophorèse sur membrane d'acétate de cellulose comme étant de 95 % ou plus. Ensuite, 242 MBq/300 pi du mélange ont été ajoutés à une solution de 0,46 pmol/300 pi de peptide-1 obtenu dans l'Exemple 1 et la réaction a été 30 incubée au bain-marie à 100 °C pendant 20 minutes afin d'obtenir le peptide-1-technétium-99m désiré. Après avoir laissé refroidir le mélange de réaction à température ambiente, la pureté de marquage du peptide a été vérifiée comme étant de 98,3 % par la méthode HPLC.

Exemple 7

35 Comparaison des rendements de marquage au technétium 99 m in vitro des peptide-1. peptide-2. peptide-3 et peptide-4 Après avoir laissé reposer pendant 1 heure, 3 heures et 6 heures le peptide-1-technetium-99m obtenu dans l'Exemple 6 et les peptides-2 à -4

12

également marqués au technétium-99m en suivant la méthode de l'Exemple 6,

l'évolution dans le temps des rendements de marquage au technétium-99m de ces peptides a été analysée par chromatographie en phase liquide (méthode

HPLC) dans les conditions suivantes:

Colonne: Millipore puresil 5 pm C18 (4,6 x 150 mm),

Débit: 1 ml/min,

Eluant A: 0,1 % TFA/ eau distillée,

Eluant B: 0,1 % TFA/acétonitrile,

Concentration du gradient: 0 min. (10 % B) -> 5 min (10 % B)

-» 35 min (50 % B) -> 45 min (75 % B)

Les résultats sont reportés dans le Tableau 1.

Tableau 1

Evolution dans le temps du rendement de marquage au technétium-99m des peptide-1, peptide-2, peptide-3 et peptide^.

lil

2_h

êil peptide-1

98,3%

97,2%

96,6%

peptide-2

85,5%

71,8%

78,5%

peptide-3

96,3%

88,9%

84,4%

peptide-4

81,5%

81,2%

79,9%

Le résultat de l'analyse révèle une instabilité des marqueurs radioactifs dans le peptide-2, le peptide-3 et le peptide-4 et une importante dégradation au cours du temps. Leur rendement de marquage 3 heures après la préparation de ces peptides marqués est inférieur à 95 % ce qui est représente le seuil utile pour l'usage médical. Par contre, le peptide-1 de la présente invention possède un haut rendement de marquage, i.e de 98 % ou plus 1 heure après sa préparation et 96 % ou plus même 6 heures après sa préparation, ce qui confirme que le peptide-1 est stable et maintient un haut rendement de marquage au cours du temps.

Exemple 8

Comparaisons des cinétiques in vivo des peptide-1. peptide-2. peptide-3. peptide-4. peptide-5. peptide-6. peptide-7. peptide-8. peptide-9. peptide-10. peptide-11. peptide-12 peptide-13 et KYCAREPPTRTNAYWGQG marqués au technétium-99m

Le peptide-1-technétium-99m obtenu dans l'Exemple 6, les peptide-2, -3, et -4, marqués au technétium-99m obtenus dans l'Exemple 7, les peptide-5, -6, -7, -8, -9, -10, -11, -12, -13 et KYCAREPPTRTNAYWGQG

13

(ci-après désigné "peptide 14"), marqués au technétium-99m selon la méthode décrite dans l'Exemple 6, ont été administrés en quantités allant de 35 MBq à 45 MBq à des rats SD (Sprague-Dawley) pesant de 140 à 200 grammes et préalablement anesthésiés au Ravonal, l'administration ayant 5 été faite par injection intraveineuse dans la queue. Les animaux ont été sacrifiés 5, 30, 60 et 180 minutes après administration pour déterminer la répartition de la radioactivité dans les divers organes en utilisant un compteur mono-canal. Les résultats sont reportés dans les Tableaux 2 à 29.

Dans le cas du peptide-1-technétium-99m présenté dans les 10 Tableaux 2-3, 20 % et 80 % de la radioactivité totale ont été éliminés au niveau des urines respectivement 5 minutes et 60 minutes après administration. Aucune accumulation ou concentration importante de radioactivité n'a été observée dans les autres organes.

Dans le cas du peptide-2-technétium-99m présenté dans les 15 Tableaux 4-5, 3,0 % et 33 % environ de la radiactivité totale ont été éliminés au niveau des urines respectivement 5 et 60 minutes après administration. Une accumulation de radioactivité au niveau de quelques organes a été observée, mais 29 % et 49 % environ de la radioactivité totale étaient concentrés au niveau des reins 5 minutes et 60 minutes après administration. 20 Dans le cas du peptide-3-technétium-99m présenté dans les

Tableaux 6-7, 4,0 % et 42 % environ de la radioactivité totale ont été éliminés au niveau des urines respectivement 5 minutes et 60 minutes après administration. De plus, 18 % environ de la radioactivité totale étaient accumulés au niveau des reins de façon presque constante jusqu'à 180 25 minutes après administration. Une accumulation de radioactivité au niveau du foie et l'intestin grêle a aussi été détectée.

Dans le cas du peptide-4-technétium-99m présenté dans les Tableaux 8-9, 2,0 % et 28 % environ de la radioactivité totale ont été éliminés dans les urines respectivement 5 minutes et 60 minutes après administration. 30 De plus, 16 % et 32 % environ de la radioactivité totale étaient accumulés au niveau des reins respectivement 5 minutes et 60 minutes après administration. Une accumumation de radioactivité au niveau du foie et de l'intestin grêle a aussi été détectée. Il a été estimé que le peptide-4-technétium-99m se situe entre le peptide-2 et le peptide-3 en termes de 35 cinétique de rendement de marquage in vivo.

Dans le cas du peptide-14-technétium-99m présenté dans les Tableaux 28-29, 13 % et 68 % environ de la radioactivité totale ont été éliminés au niveau des urines respectivement 5 minutes et 60 minutes après

14

administration. Aucune accumulation importante n'a été observée dans les organes internes comme en témoigne la tendance à une baisse progressive de la radioactivité au niveau des reins, i.e 13 % et 8 % environ de la radioactivité totale respectivement 5 minutes et 60 minutes après 5 administration.

D'après ce qui précède, le peptide-1 -technétium-99m et le peptide-14-technétium-99m, qui sont les peptides de la présente invention, sont faiblement accumulés au niveau des organes internes tels que les reins et le foie; ces deux peptides sont éliminés rapidement au niveau des urines après 10 administration et possèdent une cinétique in vivo adéquate pour leur usage en tant qu'agents de diagnostics radioactifs. Par contre, les peptide-2 , -3 et-4-marqués au technétium-99m s'accumulent fortement dans les organes internes, en particulier au niveau des reins et ils possèdent donc des propriétés indésirables pour le diagnostic du tronc du corps. 15 En plus, comme le montre les Tableaux 14, 15, 18, 19, 20 et 21 de la série de Tableaux 1-21, dans le cas des peptides-7, -9 et -10 dans lesquels l'Arg du 5ème résidu aminoacide est sous la forme-d, le pourcentage de radioactivité retrouvée dans le foie et dans l'intestin grêle est réduit par rapport aux mêmes peptides ayant le résidu L-Arg à la position 20 correspondante. Le transport de ces peptides vers les canaux d'excrétion du système rénal a été facilité. Ce résultat suggère que les peptides-7, -9 et -10 possèdent une cinétique in vivo adéquate pour en permettre l'usage en tant qu'agents de diagnostics radioactifs pour l'obtention d'images de l'abdomen avec un bas bruit-de-fond.

%

- 15 -

Tableau 2

Biodistribution du peptide-1-technétium-99m dans des rats normaux (n=3)

* % Dl/organe (%DI/g)

5

mins.

3

0

mins.

foie

3,

6

3

±

1

7 5

2;

8

8

± °/

5 6

(0,

5

8

±

0

2 8 )

(0,

4

3

± °;

0 5 )

intestin grêle

2,

7

5

±

0

7 8

3,

1

4

db 0;

6 5

(0,

4

0

±

0

0 9 )

(0,

4

8

± 0,

1 2)

gros intestin

1,

6

3

±

0

3 8

0,

5

6

± °;

0 8

(0/

2

3

±

0

0 3 )

(°,

1

0

+ °,

0 3 )

estomac

0,

6

5

±

0

2 2

0,

4

5

± °/

1 4

(0,

2

7

±

0

0 6 )

(°,

1

6

± 0 /

0 5 )

pancréas

°/

3

3

±

0

2 0

°;

1

4

± 0 ;

0 6

(0,

8

2

±

0

5 1 )

(0>

3

4

± °>

1 5)

poumons

1,

0

9

±

0

5 2

4

5

+ 0,

0 9

( 1,

1

0

±

0

4 5 )

(°,

4

8

± 0,

0 7 )

coeur

°/

2

9

±

0

0 8

°>

i

2

± °>

0 1

(0,

4

9

±

0

1 1)

(°,

2

0

± 0 ,

0 2 )

reins

9/

6

5

±

1

9 9

6>

8

0

± 0 ;

8 4

( 8

0

6

2

6 6 )

(5,

3

6

± °>

3 1 )

sang total

1 7 t

3

8

±

1

5 8

6,

8

5

± l)

6 8

d,

5

6

±

0

0 7 )

(0>

6

2

±

1 4)

reste du coros

5 0,

3

1

±

2

8 2

2 5;

5

7

± 2,

5 5

(0,

3

9

±

0

0 3 )

(°,

2

0

± °>

0 3 )

urine

1 9/

4

6

±

8

8 5

5 5^

5

5

±4,

9 1

- 16 -

Tableau 3

Biodistribution du peptide-1-technétium-99m dans des rats normaux (n=3)

• % Dl/organe (%DI/g)

6

0

mins.

1

8

0

mins

•

foie

7

7

± °J

6

8

°;

9

9

±

°;

5

0

<0,

2

7

± 0,

1

2)

(°,

1

5

±

°

0

7)

intestin

3>

6

9

± o,

1

6

2,

0

9

±

0,

4

8

grêle

/

/

/

(o,

5

3

± 0,

0

2)

(0J

2

9

±

°

0

9)

gros

0;

2

4

± °J

0

1

3 ;

5

5

-4-

1,

2

2

intestin

/

(0;

0

4

± 0 f

0

0)

(°,

5

1

±

°;

1

6)

estomac o,

3

6

± °>

2

3

°/

6

6

°;

0

4

(0,

1

3

± 0,

0

8)

(0,

0

2

°.

0

1 )

pancréas

0

9

± °>

0

5

°;

0

6

±

°;

0

4

(o,

2

0

± o,

1

2)

(0,

1

6

±

°>

1

0)

pourrons

°/

1

9

± 0;

0

8

°>

0

7

±

°

0

4

(o.

2

2

± °;

1

0)

(°,

0

8

±

0

0

4)

coeur

°,

0

4

± 0,

0

1

°,

0

1

±

°;

0

0

(0;

0

6

± 0,

0

1 )

( 0 ;

0

1

±

°/

0

0)

reins

5,

2

2

± 0 f

9

3

4 f

7

5

±

l.

0

8

(3/

9

7

± 0 j

6

4)

(3,

6

9

±

0y

5

4)

sang

2)

0

6

± °)

3

3

0,

3

7

±

0 f

1

4

total

3)

/

r

(0>

1

8

± 0,

0

(0;

0

3

±

°;

0

1 )

reste c*u

3

9

± l)

1

2

2;

2

0

-t-

i;

5

1

corps

(0,

1

8

± °)

0

3)

<0,

2

0

±

°f

0

1 )

urine

OO

8

1

±°y

9

9

8 6y

0

1

±

3.

0

7

- 17 -

Tableau 4

Biodistribution du peptide-2-technétium-99m dans des rats normaux (n=3) * % D!/organe (%DI/g)

5

mins

•

3

0

mins m

foie

4,

3

0

± 0

1

7

2,

3

9

±

0}

3

7

(0,

6

9

o

+1

0

4)

(°;

3

7

±

0

6)

intestin grêle

2,

9

7

± 0

3

2

2 j

1

6

±

1

7

(°,

4

3

± 0

0

6)

( 0;

3

3

±

°,

0

5)

gros intestin

1 ,

4

8

± 0

1

4

0

6

1

±

°;

1

2

(0,

2

5

± 0

0

6)

(0;

1

1

±

0 )

0

1)

estoirac

°>

6

0

± 0

4

8

0,

4

4

±

°,

2

5

( °;

2

5

± 0

1

7)

(°,

1

5

±

°,

0

8)

pancréas

0;

1

9

± 0

0

2

0,

0

8

±

0

1

(0,

4

6

± 0

0

6)

(0;

2

2

±

°)

0

7 )

poumons

0 )

9

5

± 0

3

2

°>

3

8

±

0 )

0

9

( 1 )

1

2

± 0

3

2 )

(o,

4

6

±

of

0

7 )

coeur

°>

3

4

± 0

0

2

0

1

5

±

0

3

(0>

5

0

± 0

0

1 )

(o,

2

5

±

0 >

0

4 )

reins

2 8 y

5

7

± 2

3

6

4 5 -

1

0

±

3 f

6

5

(2 2,

2

8

± 2

3

4 )

(3 7}

l

5

±

2 ;

8

3)

sang total

1 91

1

0

± 1

8

6

6;

7

1

±

1^

0

0

7

5

± 0

2

2)

(0)

6

4

±

0,

1

0)

reste du

4 6,

2

3

± 1

9

7

2 4 j

5

2

±

4,

9

2

corps

/

( °J

3

7

± 0

0

3)

(0j

2

0

±

°)

0

3)

urine

2;

9

5

± 0

4

9

2 0,

1

7

±

b

8

7

- 18 -

Tableau 5

Biodistribution du peptide-2-technétium-99m dans des rats normaux (n=3)

* % Dl/organe (%DI/g)

6

0

mins

•

i

8

0

mins.

foie

1

7

6

+

°}

1

9

°l

9

3

o

+1

0 6

(0,

2

7

±

0,

0

3)

(0,

1

5

o

+1

0 1)

intestin

grêle

2f

4

6

±

°F

0

6

2,

2

7

o

+1

2 7

(0>

3

8

±

0f

0

2)

(0,

3

6

o

+1

0 2 )

gros o,

2

7

±

0

0

5

1 0 4

7

1

o

+1

1 4

intestin

(0>

0

4

±

0 }

0

0)

(°,

2

3

o

+1

0 2 )

estomac

0,

1

8

±

0

0

6

0 )

0

6

± 0

0 1

(0l

0

5

±

0f

0

2)

(°j

0

3

± 0

0 1 )

pancréas

°7

0

4

±

0 ?

0

1

0 }

0

2

± 0

0 0

(°l

1

1

±

°)

0

1 )

(°,

0

6

± 0

0 0 )

poumons

°»

1

7

±

0 )

0

2

°1

0

8

± 0

0 1

(0,

2

1

±

°

0

1 )

(0;

0

9

o

+1

0 1 )

coeur of

0

7

±

°;

0

1

°>

0

3

± 0

0 0

( °r

1

2

±

°

0

1 )

(°,

0

4

o

+1

0 0 )

reins

4 8 »

8

7

±

7 ,

8

0

4 2 j

4

6

o

+1

3 3

(4 2)

9

2

±

7

7

8)

( 3 2)

3

2

o

+1

7 8)

sang

2,

9

8

±

0 ,

6

3

1 ,

2

3

o

+1

2 6

total

/

/

)

(0,

2

8

±

°t

0

4)

(0;

1

0

o

+1

0 1 )

reste du

1 1 ,

2

4

±

1,

5

5

4 .

7

3

o

+1

6 8

corps

/

/

(°,

0

9

±

°)

0

1 )

(0Î

0

4

± 0

0 1 )

urine

3 3;

2

2

±

6;

0

5

41 )

2

7

1+ o

9 2

- 19 -

Tableau 6

Bicxiistribution du peptide-3-technétium-99m dans des rats normaux (n=3)

* % Dl/organe (%DI/g)

5

mins

•

3

0

mins.

foie

1 8)

8

CM

+1

CO

8

6

1 °»

2

1

± °;

9

5

(3I

0

9 ± 0,

3

6)

(1,

7

6

+ 0 ,

2

3>

intestin grêle

3I

1

7 ± 0}

3

9

6 ;

8

5

± l>

0

1

(0;

5

o

1+

o >—

0

6)

a,

1

0

±0)

1

1 )

gros intestin

î ?

4

1 ± 0,

1

6

°;

6

3

+ 0 }

0

2

(0>

2

7 ± 0

0

6)

(0,

0

9

+ 0J

0

1 )

estomac

°r

6

8 ± 0,

1

8

°i

6

3

± °)

3

7

(0,

2

5 ± 0

0

7)

(0>

2

0

± 0,

1

0)

pancréas

°;

2

1 ± 0,

0

4

°j

1

5

+ °,

0

2

(o,

5

CD

1+

O

0

8 )

(0)

2

5

± 0,

1

2)

poumons

1,

0

3 ± 0,

1

5

0,

4

9

± 0;

0

6

C 1,

2

4 ± 0,

2

1 )

(0>

5

4

± °,

0

4)

coeur

°

3

5 ± 0,

0

5

0 i

1

6

± °>

0

3

( 0

6

5 ± 0,

0

8 )

(°,

2

8

± 0

0

6 )

reins

1 7 j

8

3 ± 1 ,

7

4

1 9>

6

4

±

1

4

(14,

5

4 ± 0 ;

8

5)

( 1 6,

5

8

± 1

6

2)

sang total

1 5, 1

1 6

6 ± 2 ,

0 ± 0 ,

0 2

0

0)

9 ) (0,

0 9

4

2

o o

+1 +1

6 0

9

8)

reste du.

4 3>

5

3 ± 1 ,

5

3

2 3,

0

6

± 1 )

0

5

corps

(0)

3

9 ± 0 T

0

1)

(°;

2

0

± °)

0

1 )

urine

3

8

1 ± 1 r

2

2

32>

9

4

± l)

9

7

- 20 -

Tableau 7

Biodistribution du peptide-3-technétium-99m dans des rats normaux (n=3)

* % Dl/organe (%DI/g)

6 0 mins.

18 0 mins.

foie

1 0 j 9 9 ± 4 5 5

3, 8 0 ± 0; 9 5

(1, 7 3 ± 0; 7 4)

(0, 6 2 ± 0j 15)

intestin

10, 3 9 ± 4. 3 2

13, 8 7 ± 0, 6 7

grêle

; f

/ i

(1, 5 1 ± 0f 5 8)

(21 0 0 ± 0, 2 2)

gros

0. 4 2 ± 0. 2 1

0, 6 4 ± 0, 3 4

intestin t 1

1 »

(0, 0 6 ± 0, 0 2)

o e-

O

+1

OO

o o estomac

1 , 1 1 ± 0, 7 9

0 . 2 4 ± 0 11

( 0, 3 3 ± 0 , 2 7)

/""N

O

o

-J

1+

o o co pancréas

0, 1 0 ± 0, 0 1

0. 0 8 ± 0, 0 2

( 0 , 2 4 ± 0 0 4 )

(0, 1 9 ±0, 0 4)

pouxions

0, 2 8 ± 0 7 0 5

0, 2 2 ± 0 0 7

(0, 3 4 ± 0 0 6 )

(0, 2 4 ±0, 0 6)

coeur

0 0 9 ± 0, 0 1

0 0 5 ± 0 0 1

( 0, 1 5 ± 0, 0 2)

/"™N

O

o oo

1+

o o co reins

1 8 2 9 ± 4 2 1

16, 1 3 ± 1 3 3

(14, 7 7 ± 3, 37)

(1 2( 8 3 ± 2 5 2 )

sang

5. 7 7 ± 1 , 4 0

3, 2 6 ±0. 3 1

total r '

> 9

( 0, 5 6 ±0, 13)

<o

CO

o

1+

o o

en w reste du

13, 2 9 ± 1, 7 5

8. 0 2±2, 3 0

corps r—\ O

1+ o o

V

' /

(0, 0 7 ± 0, 0 2)

urine

4 1, 7 8 ±3, 3 8

5 5} 4 5 ± 3; 8 9

- 21 -

Tableau 8

Biodistribution du peptide-4-technétium-99m dans des rats normaux (n=3)

* % Dl/organe (%DI/g)

5 mins.

3 0 mins.

foie

1 6, 0 3 ± 3 8 9

6> 8 4 ± 0; 9 8

( 2; 7 2 ± 0 ) 7 0)

(1, 1 4 ±0} 2 4)

intestin

3 , 0 3 ± 0 f 7 5

4 , 1 1 ± 0; 3 6

grêle

(0, 4 5 ± 0, 11)

( 0 6 0 ± 0; 0 5)

gros

1. 3 7 ± 0, 3 9

1 l 3 ±0, 2 0

intestin

( 0, 2 2 + 0. 0 7 )

(0 1 8 ± 0 0 2 )

estomac

1 f 0 0+ 0, 4 6

1, 4 2 ± 0, 3 4

( 0 f 3 0 ± 0 13)

✓—s O

O

1+

o

O oo

N-/

pancréas

0 ) 3 0 ± 0, 0 9

0 } 3 1 ± 0 ^ 0 6

( 0, 7 7 + 0j 19)

(0, 7 4 ± 0, 11)

poumons

1 , 3 6 ± 0 3 2

0, 9 4 ±0, 0 8

( 1 , 6 1 ± 0 2 8 )

( 1 , 1 2 ± 0 j 11)

coeur

0 } 3 6 ± 0 18

0 } 2 4 ± 0; 0 4

(0, 6 6 ± 0^ 2 7)

( 0 , 4 4 ± 0, 0 7)

reins

15, 5 4 ±5) 3 5

2 5 ) 2 7 ± 3, 8 7

(12, 8 6 ± 3 9 0 )

(21, 5 2 ± 4 j 08)

sang

2 3 . 2 6 ± 3, 51

11, 3 1 ± 7} 17

total

7 J

(2, 3 0 ± 0, 3 6)

(1j 0 7 ± 0> 6 6)

reste du

4 5. 4 7 ± 2. 16

3 6, 1 8 ± 4 8 5

corps

; f

(0) 3 8 ± 0, 0 2)

(0T 2 9 ±0, 0 4)

urine

1 ) 8 9 ± 1, 5 0

1 7f 5 8 ± 2 j 9 6

- 22 -

Tableau 9

Bicxiistribution du peptide-4-technétium-99m dans des rats normaux (n=3)

* % Dl/organe (%DI/g)

6

0

mins

•

i

8

0

mins.

foie

3

8

5

± °,

5

9

2 j

7

7

±

°;

°;

1 6

(0,

6

0

± o 9

0

4)

C0>

4

6

±

0 3 )

intestin grêle-

5»

3

0

± °>

7

7

9,

0

6

±

1;

3 2

8

2

± °)

0

7)

( i,

2

4

±

°;

0 9 )

gros intestin

0 )

6

5

± °,

1

0

0 j

6

8

±

0 >

2 9

(0>

0

9

± °»

0

1 )

(0>

1

0

±

°>

0 6 )

estomac

1,

0

5

± 0 }

3

1

1 ,

0

6

±

4 6

(°7

3

2

± °)

1

2)

(°,

2

7

±

0 8 )

pancréas

°l

1

8

± °)

0

3

0

1

6

±

°,

0 3

(°,

3

8

± °>

0

4)

(01

3

6

±

0,

0 6 )

poumons

0T

6

0

± 0,

1

2

0^

3

0

±

0,

0 3

(0,

7

0

± °J

l

5 )

(0)

3

4

±

0 ,

0 2 )

coeur

0 ,

1

6

±

0

3

0,

1

0

±

0 ,

0 1

(0,

2

8

± °;

0

4 )

(°,

1

5

±

0 ,

0 2 )

reins

3 [1

7

7

± °>

9

7

2 1 )

0

6

±

i

4 3

(2 4,

5

5

± 1,

9

8)

( 1 9,

5

7

±

°

2 9 )

sang total

7

(01

7 7

3

2

« ^

—• O

+1 +1

3

1

0

4)

4 j

(0,

4 4

9 0

± ±

°

0^

5 7 0 6 )

reste du

2 3 »

9

6

± 1 >

5

5

1 4 ;

2

1

±

o,

4 1

corps

( °

1

9

± °>

0

1)

<•:

1

1

±

0

0 4 )

urine

2 8

0

7

±1,

4

2

42,

2

0

±

î,

9 6

- 23 -

Tableau 10

Biodistribution du peptide-5-technétium-99m dans des rats normaux (n=3)

* % Dl/organe (%DI/g)

5

mins

•

3

0

mins

foie

3>

3

6

o

+1

î

5

1,

6

8

±

0,

0

8

(0>

4

9

± 0,

0

1 )

(°)

2

3

±

0,

0

2)

intestin grêle

2>

3

6

o

+1

î

4

3,

0

4

±

0,

8

2

(0,

3

1

**

o

+1

0

1)

(°,

3

6

±

0,

0

9)

gros intestin

1; (°,

4 1

1 8

± °> ± °)

1 0

0

2)

0, (0,

4

0

4

5

± ±

o o

0 0

6

1 )

estomac

°J

6

2

o

+1

1

2

0,

2

8

±

0,

1

0

(0,

1

9

± 0,

0

6)

(°,

0

7

0

0

3)

pancréas

0 ,

3

0

o

+1

0

2

0^

1

5

±

0,

0

3

(or

6

4

o

+1

0

2)

C 0,

3

0

±

0,

0

6 )

poumons

0,

7

3

± 0,

0

4

0 )

2

8

±

°>

0

5

( 0,

8

0

± 0,

0

3)

(°,

3

0

±

0^

0

6)

coeur

°)

3

1

o

+1

0

7

1

1

±

0,

0

5

<°,

4

8

± °»

0

7 )

c°,

1

6

±

0 î

0

6)

reins

1

6

7

± 2)

5

7

7 >

7

1

±

0 ,

5

2

(8,

6

6

± 1,

8

2)

(5,

4

1

±

0,

3

3)

sang total

1 4 i

6 2

0 3

± 1;

± 0 J

5 1

1

4)

5, <°>

0 4

1 1

+! +1

<r>

o o

4 0

9

3)

reste du corps

•v ^

OO o

9 3

2 5

o

+i +i

3 0

9

3)

✓"S

O co

^ s*

7 1

0 4

± ±

co o

2 0

0

3)

urine

2 0,

7

5

± 2)

4

6

6 3,

6

8

±

4

3

2

- 24 -

Tableau 11

Biodistribution du peptide-5-technétium-99m dans des rats normaux (n=3)

* % Dl/organe (%DI/g)

6

0

mins

•

1

8

0 mins

•

foie -

1

6

7

±

0 ,

0

8

1,

3

9

± 0

0

6

intestin grêle

(°) 4 ^

(0;

2 0 6

5 8 0

± ± ±

0, 0, 0;

0 6

1

2) 1

0)

(0,

S

( 0

2 9 9

3 3 8

± 0 ± 2 ± 0

0 0 3

0) 6

9)

gros intestin estomac

°>

( °; o;

3

0

1

1 4 7

± ± ±

0,

0, °>

0

0

1

9

1 ) 3-

0 ,

(0> °)

3 0 0

0 4

2

± 0 ± 0 ± 0

1 0 0

5

2) 1

pancréas

(°, 0,

0

1

8 4

± ±

0, 0,

0 0

6) 1

(°, °>

0

1

1 1

± 0 ± 0

0 0

1 )

2

(0,

3

4

±

°;

0

3)

(°,

2

7

± 0

0

4)

poumons

0;

1

3

±

0 )

0

3

01

0

4

± 0

0

l

(0,

1

4

±

0;

0

2)

(0I

0

5

± 0

0

0 )

coeur

0

0

3

±

°>

0

0

0

1

± 0

0

0

(

0

5

±

0

0

0 )

(°r

0

1

± 0

0

0 )

reins

5 j

7

2

±

1^

1

3

5 )

0

3

± 0

2

0

(4,

1

4

±

0

6

7 )

(4,

0

4

± 0

0

7)

sang total

1 ,

( °,

7 1

3 5

± ±

°J 0,

7 0

7

7)

(°;

1 0

3 1

o o

+1 +1

0 0

4

0)

reste du corps

8I

(0>

3 0

6 6

± ±

1, °»

7 0

6

1 )

1,

(°,

9 0

6 2

± 1 ± 0

7 0

5

1 )

urine

7 8,

3

4

±

3J

0

8

8 5,

1

3

± 4

0

7

- 25 -

Tableau 12

Biodistribution du peptide-5-technétium-99m dans des rats normaux (n=3)

* % Dl/organe (%DI/g)

5

mins

•

3

0

mins

•

foie

2,

8

1

± 0 ,

4

0

1 ,

6

5

±0,

3

9

(0,

4

3

± 0,

0

3)

(0,

2

6

±0,

0

8)

intestin grêle

3>

0

1

± 0,

1

1

2,

7

8

± 0,

3

8

(o,

4

4

± °»

0

3)

(0,

4

0

± °7

0

7)

gros intestin

*>

6

0

± °»

1

7

0 ,

9

6

± 0,

2

7

(o,

2

2

± 0 (

0

2)

(0,

1

3

±

0

5)

estomac

5

9

± 0,

3

1

2,

9

3

± °y

5

9

4

1

± 0,

1

9)

( i,

1

0

± 0 N

1

4)

pancréas

°»

1

7

± °)

0

4

°)

1

1

±

0

5

3

7

± °>

0

7)

(0,

2

5

±

1

3 )

poumons o,

8

7

± °»

0

9

0,

3

4

+ 0#

0

6

n,

0

6

± °)

0

7 )

(°,

4

0

± 0 >

0

3)

coeur

4

6

± °>

0

9

0,

1

3

±

0

1

(o,

7

1

± 0 ,

1

2)

(0,

2

1

=t 0,

0

1 )

reins

1 3,

0

1

± 1 )

4

1

8>

2

2

± °)

4

0

(10,

9

5

± °J

6

2)

( 6 ;

8

6

± 0 }

6

0 )

sang total

16> <!/

9 5

5 8

± 3> ± 0 »

2 2

6

6)

6, (0,

2 6

7 1

± 0, db 0,

6 0

5

6)

reste du corps

5 5j <°>

6 4

8 5

± 1, ±0,

6 0

3

3)

2 5; (0,

2 2

1 1

co o

+1 +1

7 0

2

3)

urine

1 °,

8

1

+ 2,

3

2

5 3,

8

3

± 4}

5

3

- 26 -

Tableau 13

Biodistribution du peptide-6-teclinétium-99m dans des rats normaux (n=3)

* % Dl/organe (%DI/g)

6

0

mins

1

8 0

mins.

foie l>

2

5

± °,

4

4

0,

4

3 ± 0

0 2

(°,

2

1

± °)

0

8)

(°,

0

o

+1

oo

0 0 )

i ntfistin grêle

3>

8

9

± °)

6

7

3,

2

2 ± 1

2 7

(0>

5

6

± °;

0

7 )

(0>

5

4 ± 0

1 9)

gros intestin

1,

0

8

± 0,

4

1

1 ,

1

1 ± 0

8 4

(0,

1

6

± 0 i

0

6)

(0>

1

7 ± 0

1 1 )

estcarac

0,

3

5

± 1 )

2

0

4;

4

2 ± 0

4 1

( 1,

1

6

± °>

3

8)

Cl,

6

3 ± 0

3 2 )

pancréas

°;

0

5

± °>

0

1

°)

0

2 ± 0

0 1

(0,

1

2

± °r

0

2)

(0r

0

5 ± 0

0 0 )

poumons

°/

2

0

± 0 r

0

6

0

0

4 ± 0

0 1

( °>

2

2

± 0,

0

5)

(°

0

5 ± 0

0 1 )

coeur

0 >

0

8

± ° )

0

2

°

0

1 ± 0

0 0

( °>

l

3

± 0,

0

4 )

(°,

0

2 ± 0

0 0 )

reins

7 }

8

9

± °,

5

3

6,

2

3 ± 0

5 7

(6,

0

7

± 0 ,

4

8)

(5,

0

4 ± 0

5 2 )

sang total

3t

(°T

4

3

5 7

± 1 >

+ 0,

0 3

1

5)

°> (°,

6 0

6 ± 0

7 ± 0

4 3 0 4 )

reste du

1 9,

8

3

± °;

4

5

3J

4

2 ± 0

2 4

corps

(0,

1

7

± 0,

0

1 )

(0I

0

3 ± 0

0 0 )

urine

6 l>

5

0

± 5»

8

0

8 0,

6

8 ± 1

3 8

- 27 -

Tableau 14

Biodistribution du peptide-7-technétium-99m dans des rats normaux (n=3)

* % Dl/organe (%DI/g)

5 mins.

3 0 mins.

foie

2, 1 5 ± 0, 3 2

1 , 0 0 ± 0, 3 9

(0, 3 2 ± 0, 0 4)

(0, 1 6 ± 0, 0 6)

intestin

3 j 2 5 ± 0j 3 7

1, 4 6 ± 0f 6 5

grêle

(0, 4 4 ± 0; 0 4)

( 0; 2 3 ± 0j 11)

gros

2 , 3 7 ± 0 . 3 2

2, 4 3 ± l} 4 3

intestin

( 0, 3 2 ± 0, 0 6)

(0, 3 2 ± 0, 19)

estomac

0, 7 3 ± 0 j 0 7

0, 3 0 + 0, 12

(0, 2 1 ± 0, 0 4)

(0; 0 9 ± 0 , 0 4)

pancréas

0, 1 5 ± 0 , 0 3

0; 07±0; 0 1

( 0; 3 8 ± 0, 0 5)

(0, 1 6 ± 0, 0 6)

poumons

0, 9 0 ± 0 , 2 4

0, 3 6 ±0, 14

(1y 0 0 ± 0, 15)

(0, 4 0 ± 0, 18)

coeur

0r 4 2 ± 0, 1 3

0 , 1 2 ± 0 , 0 6

( 0, 6 6 ± 0, 15)

(0, 2 2 ± 0, 11)

reins

10, 7 9±0, 5 2

7 f 6 0 ± 3, 17

( 9, 1 6 ± 1 f 0 8)

(6, 8 4 ± 3, 15)

sang

16, 5 7±0, 38

6, 0 9 ± 3 , 0 8

total

(1, 5 7 ± 0, 0 6)

(0, 5 9 ± 0, 3 0)

reste du

57, 5 2 ±2( 45

1 8, 2 2 ± 5, 0 1

corps

(0, 4 7 ± 0; 0 2)

(0 , 1 5 + 0, 0 4)

urine

11, 4 9 ± 0, 6 3

6 5, 0 7 ± 4, 3 1

- 28 -

Tableau 15

Biodistribution du peptide-7-technétium-99m dans des rats normaux (n=3)

* % Dl/organe (%DI/g)

6

0

mins

•

1

8 0 mins

•

foie

1,

0

8

±0,

3

3

0,

2

3 ± 0 >

0

3

(0>

i

9

± °)

0

7)

( 0 ;

0

CJl

1+

o

0

1 )

intestin grêle

0,

5

9

± °>

0

8

0)

7

5 ± 0,

1

2

0

9

± 0,

0

2)

(Û,

1

2 ± 0,

0

1 )

gros intestin

0,

2

3

± 0,

0

6

0,

1

5 ± 0,

0

1

(0>

0

3

± °)

0

1 )

(Or

0

2 ± 0f

0

0)

estomac

0 ,

1

1

± 0 ,

0

4

0 )

0

7 ± 0j

0

2

(0;

0

3

± 0,

0

2)

(°,

0

2 ± 0 f

0

1 )

pancréas

0,

0

3

± °»

0

2

0 ,

0

1 ± 0 )

0

0

(°,

0

9

± 0,

0

5 )

(°,

0

3 ± 0 ,

0

1 )

pounons

0,

0

9

± °»

0

4

0,

0

2 ± 0,

0

0

(°r

1

0

± 0)

0

4 )

(°,

0

2 ± 0 ,

0

0 )

coeur

0,

0

3

± °;

0

1

0 J

0

l ± 0,

0

0

(0,

0

5

± °;

0

2 )

(0,

0

1 ± °#

0

0 )

reins

4,

7

8

± 1

1

1

2 ,

9

7 ± 0 >

1

8

( 4r

0

4

± 0,

6

4)

(2/

7

3 ± 0 ,

3

2)

sang total

1 ,

(°,

0

1

5 0

WK «"S

O O

+1 +1

3 0

5

4)

°>

(0,

0 0

6 ± 0, 1 ± 0;

0 0

5

1 )

reste du

8)

4

9

± 11

7

6

1^

6

9 ± 0,

5

1

corps

(°,

0

7

± °>

0

2)

(°,

0

O

+1

CM

0

l )

urine

8 3,

9

6

± 1}

5

8

9 4 ;

0

8 ± 0J

5

8

- 29 -

Tableau 16

Biodistribution du peptide-8-technétium-99m dans des rats normaux (n=3)

* % Dl/organe (%DI/g)

5 mins.

3 0 mins.

foie

2, 2 8 ±0, 3 7

1, 5 1 ± 0, 3 7

(0, 2 9 ± 0, 0 5)

(0, 2 0 ± 0; 0 7)

intestin

2, 8 2 ± 0, 3 7

2, 1 6 ± 0f 4 8

grêle

(0, 3 1 ±0, 0 4)

(0, 2 6 ± 0, 0 8)

gros

1 , 7 2 ± 0j 15

0, 6 2 ± 0, 0 7

intestin

( 0) 2 1 ± 0 j 0 3)

( 0 7 0 7 ± 0, 0 2)

estomac

0, 7 9 ± 0, 0 5

0, 3 4 ± 0} 15

(0, 2 1 ± 0, 0 4)

(0( l 4 ± 0, 0 9)

pancréas

0 , l 9 ± 0, 0 2

0, 0 7 ± 0, 0 1

(0; 3 4 ± 0, 0 5)

(0, 1 3 ± 0, 0 1)

poumons lr 0 1 ± 0, 10

0> 3 5 ± 0, 0 4

( 0 , 9 6 ± 0, 0 7)

(0, 3 3 ± 0; 0 6)

coeur

0, 3 8 ± 0, 0 8

0, 1 3 ± 0; 0 4

(0, 5 3 ± 0 # 0 7)

(0, l 9 ± 0, 0 5)

reins

1 0, 2 8 ± 0, 6 8

5, 6 2 ± 0, 7 4

(7, 4 3 ± 1, 10)

( 3 ) 9 5±0, 3 6)

sang

2 1, 0 1 ± 1, 3 4

6 j 8 0 ± 0 8 5

total

( 1 } 4 3 ± 0 , 0 9)

(0, 4 8 ±0, 0 6)

reste au

55, 0 3 ± 2, 00

2 5, 8 4 ± 3, 6 0

corps

1 1

( 0; 3 1 ± 0, 0 2)

(0, 1 5 ± 0, 0 2)

urine

14, 3 4 ± 3, 41

5 9; 8 6 ± 4; 9 6

- 30 -

Tableau 17

Biodistribution du peptide-8-technétium-99m dans des rats normaux (n=3) * % Dl/organe (%DI/g)

6 0 mins.

18 0 mins.

foie

0 , 9 3 ± 0, 17

0, 3 1 ± 0, 0 3

(0, 2 5 ± 0 r 0 2)

o o o

+1

m o o

intestin

4, 0 1 ± 0, 8 1

2, 9 9 ± 1, 2 0

grêle

> »

(0, 5 2 ± 0^ 13)

(0, 3 9 ±0, 10)

gros

0, 3 9 ± 0, 15

0, 3 7 ± 0, 2 5

intestin f J

r 7

(0, 0 5 ± 0, 0 2)

CO O

r*

o

+1

o o estomac

0, 1 5 ± 0; 0 1

0 , 0 3 ± 0, 0 1

(0, 0 4 ± 0j 0 1)

o o

1+ o o o pancréas

0T 0 4 ± 0, 0 1

0, 0 2±0, 0 0

O

O oo

1+

o

«M

o

( 0 , 0 4 ± 0 , 0 1)

poumons

0r 1 8 ± 0 0 6

0, 0 3 ± 0 , 0 0

(0, 1 7 ± 0f 0 5)

/""*N

o **

o co

1+ o o o coeur

0f 0 6 ± 0 0 2

0, 0 1 ± 0, 0 0

( 0 , 0 8 ± 0, 0 2)

(0f 0 2 ± 0, 0 1)

reins

5 y 7 0 ± 1 ) 5 0

4 , 1 2 ± 0 , 6 2

(4, 1 9 ± 1, 17)

(3, 2 3±0, 13)

sang

2, 6 0 ± 1 1 2

0} 4 5 ± 0 , 4 4

total

( 0, 1 9 ± 0; 0 7)

(0, 0 3 ± 0, 0 3)

reste du

13, 8 0 ± 3. 72

5, 6 G ± 3, 2 5

corps

/ '

' )

( 0, 0 8 ± 0, 0 3)

( 0 , 0 4±0, 0 2)

urine

7 3) 3 2 ± 6, 4 6

8 6; 2 5 ± 2, 7 9

- 31 -

Tableau 18

Biodistribution du peptide-9-technétium-99m dans des rats normaux (n=3)

• % Dl/organe (%DI/g)

5 mins.

3 0 mins.

foie

2 ) 0 4 ± 0, 15

0, 7 5 ± 0 , 2 0

( 0 , 3 2 ± 0 ; 0 2)

(0, 1 2 ± 0, 0 3)

intestin^

2 , 2 1 ± 0 , 16

1 , 2 2 ± 0 , 5 7

grêle

) ;

(0^ 3 3 ± 0 j 0 4)

(0, 1 9 ± 0, 0 9)

gros

1 ) 3 6 ± 0 0 6

0, 6 9 ± 0, 3 5

intestin

(0; 2 0 ± 0, 0 3)

(0, 1 0 ±0, 0 6)

estomac

0, 6 4 ± 0, 0 2

0, 2 3 ± 0, 0 7

(0, 1 8 ± 0; 0 1)

(0, 0 7 ± 0, 0 2)

pancréas

0, 1 4 ± 0 , 0 3

0, 0 5 ± 0; 0 1

(0, 4 4 ± 0, 2 1)

(0, 1 0 ± 0? 0 3)

poumons

0, 7 7 ± 0 , 0 4

0, 2 5 ± 0 , 0 5

(0, 8 9 ± 0, 0 4)

( 0; 2 8 ± 0; 0 4)

coeur

0, 3 2 ± 0 , 0 4

0, 1 0±0; 0 1

(0, 5 5 ± 0; 0 4)

(0, 17+0, 0 1)

reins

9, 5 2 ± 1, 0 7

6^ 1 8 ± 0> 7 1

(7, 7 6 ± 0, 5 9)

(4, 6 6±0, 9 0)

sang

15, 1 7 ± 2, 2 0

4, 0 8 ± 0 y 7 7

total

9 i

( 1, 4 4 ± 0| 18)

(0, 3 9 ± 0} 0 7)

reste du

5 7, 3 4 ± 2, 74

2 6, 1 6 ± 3 16

corps

» /

(0, 4 7 ± 0 ; 0 1)

( 0, 2 1 ± 0 , 0 3)

urine

16, 9 1 ± 4^ 82

6 2; 0 2 ± 5, 13

- 32 -

Tableau 19

Biodistribution du peptide-9-technétium-99m dans des rats normaux (n=3)

* % Dl/organe (%DI/g)

6 0 mins.

18 0 mins.

foie

0> 5 1 ± 0j 0 6

0, 3 2 ± 0^ 0 7

(0, 0 8 ± 0, 0 1)

(0, 0 5 ± 0, 0 1)

intestin

1 , 0 0 ± 0 . 0 9

0, 8 4 ± 0, 0 5

grêle

» )

( 0 , 1 4 ± 0, 0 2)

(0, 1 2 ± 0, 0 1)

gros

0. 3 2±0, 0 4

0, 3 3 ± 0. 2 8

intestin i f

9 f

( 0 , 0 4 + 0 , 0 0 )

/—S

o o

+1

o o estomac

0 , 1 3 ±0, 0 2

0, 0 8 ± 0, 0 4

(0, 0 4 ± 0, 0 1)

(0, 0 2 ± 0, 0 1)

pancréas

0 > 0 3 ± 0, 0 1

0, 0 2±0( 0 1

(0, 0 7±0( 0 1)

(0, 0 5 ± 0, 0 4)

poumons

0, 1 2 ± 0 , 0 1

0 , 0 2 ± 0 , 0 0

(0, 1 4±0; 0 1)

/—N

O o o

+1

CM O

o coeur

0 , 0 5 ± 0, 0 2

0 , 0 1 ± 0, 0 0

(0, 0 8 ± 0, 0 2)

(0, 0 1+0, 0 0)

reins

6 , 0 8 ± 0, 9 8

5, 4 1 ± 0, 4 1

( 4 , 8 5 ± 0 ; 6 0)

(3, 9 1 ± 0 p 3 3)

sang

1 , 9 2 ± 0; 2 0

0, 3 7 ± 0, 5 2

total

» )

(0, 1 8 ± 0, 0 2)

( 0; 0 3 ± 0, 0 5)

reste du

14, 2 8 ± 2, 25

4. 9 1 ± 2 . 4 7

corps

' /

(0, 1 1 ± 0, 0 2)

( 0f 0 4 + 0, 0 2 )

urine

7 6, 3 5 ± 3, 3 0

8 7, 8 5 ± 2, 70

- 33 -

Tableau 20

Biodistribution du peptide-10-technétium-99m dans des rats normaux (n=3)

* % Dl/organe (%DI/g)

5 mins.

3 0 mins.

foie-

2, 1 5 ± 0, 12

0, 9 1 ± 0, 11

(0; 3 4 ± 0T 0 3)

(0, 1 3 ± 0, 0 1)

intestin

2 4 8 ± 0, 0 8

1, 2 2 ± 0, 0 8

grêle

(0, 3 7 ±0, 0 6)

(0, 1 7 ± 0, 0 3)

gros

1 , 4 6 ± 0, 10

0, 5 0 ± 0 . 0 5

intestin

' F

(0, 2 4 ± 0, 0 2)

(0, 07±0, 0 1)

estomac

0, 6 4 ± 0, 0 4

0, 3 1 ± 0, 0 9

( 0 , 2 4 ± 0, 12)

(0> 0 9 ± 0 , 0 3)

pancréas

0, 1 2 ± 0, 0 1

0 } 0 6 ± 0 y 0 1

(0, 3 3 ± 0 f 0 2)

(0, 1 5 ± 0, 0 2)

poumons

0, 8 5 ± 0 ; 0 9

0, 3 6 ± 0 , 0 7

(0, 9 9 ± 0, 0 8)

(0, 4 0 ± 0, 0 2)

coeur

0, 3 4 ± 0r 0 8

0; 1 3 ± 0, 0 1

( 0 , 7 2 ± 0 , 2 8)

(0, 2 2 ± 0 j 0 0)

reins

12, 3 8 ± 2, 6 4

7 , 3 7 ± 0, 7 7

(10, 3l±l, 94)

(5, 7 8 ± 0 7 2 )

sang

14, 7 6 ± 1 , 55

6, 2 5 ± 1, 0 1

total

9 t

(1, 4 1 ±0, 14)

(0} 5 7 ± 0 10)

reste du

6 0 , 8 6 ± 3, 6 4

27. 8 9 ± 0 , 83

corps

(0, 4 9 ± 0, 0 3)

' 1

(0, 2 2 ± 0, 0 1)

urine

10, 02 + 5, 11

5 7 j 6 5 ± 1, 9 6

- 34 -

Tableau 21

Biodistribution du peptide-10-technétium-99m dans des rats normaux (n=3)

* % Dl/organe (%DI/g)

6 0 mins.

18 0 mins.

foie

0, 5 0 ± 0 , 0 6

0, 2 8+ 0, 0 3

(0, 0 8 ± 0, 0 1)

(0, 05 + 0, 0 1)

intestin

0, 8 4 + 0, 12

0, 8 1 ± 0. 19

grêle

1 )

(0; 1 2 ±0, 0 3)

(0, 1 3 ± 0, 0 3)

gros

0, 4 2 ± 0. 2 4

0. 1 7 ± 0, 0 7

intestin

' f

J 1

( 0, 0 7 + 0, 0 3 )

(0, 0 2±0, 0 1)

estomac

0, 1 4 ± 0, 0 3

0j. 0 4 ± 0. 0 1

(0, 0 5 ± 0, 0 2)

/

( 0 , 0 1 ± 0; 0 0)

pancréas

0, 0 3 ± 0 , 0 0

0, 0 1 ± 0 0 0

o o o

+1

co o o

s—'

/"N

o o o

+1

co o o

«w*

poumons

0; 16 + 0, 01

0 0 2 ± 0, 0 0

( 0 , 1 8 + 0r 0 2)

(0, 0 3 ± 0 0 0 )

coeur

0} 0 6±0j 0 1

0 0 1 ± 0; 0 0

(0, 0 9 ± 0 , 0 2)

(0, 0 1 ± 0 0 0 )

reins

6, 9 3 ± 1 , 6 0

6, 1 6 ± 1; 5 3

( 5 , 8 7 ± 1, 3 0)

(5, 1 0 ± 1 2 9)

sang

3, 1 6 ± 2, 5 0 ' *

0. 2 0 + 0, 2 3

total

( 0, 3 0 + 0, 2 4 )

(0; 0 2 ± 0 0 2 )

reste du

18, 4 9 ± 1 1, 5 4

3, 2 0 ± 0, 5 3

corps

' f

/ /

(0, 1 5 ± 0, 10)

(0; 0 3 ± 0 0 1)

urine

7 0; 4 4 ± 1 2f 7 3

8 9 y 1 9 ± 1, 2 4

- 35 -

Tableau 22

Biodistribution du peptide-11-technétium-99m dans un rat normal (n=1)

* % Dl/organe (%DI/g)

5

mins.

3 0 mins.

foie

1

9

0

1

4 8

intestin grêle

(°,

2> (0)

2 2 2

1) 4

3)

<0, 1 ; (0

1 8) 9 7

2 4)

gros intestin estomac

1,

(0ï °>

5 2 7

7

9) 2

°)

(°, 0,

5 6 0 8) 2 1

(07

2

3)

(°,

07)

pancréas

°>

1

3

0

0 5

(0,

2

4)

(0J

1 0)

poumons

0.

8

6

0;

2 7

(°,

7

3)

<07

2 6 )

coeur

0)

2

7

0,

0 9

( o;

3

7)

(0,

1 3)

reins

7>

1

9

8 J

8 5

(5,

2

7 )

(5,

9 7 )

sang total

1 9;

( 1)

9 3

3

1)

6; (0/

7 4 4 6)

reste du corps

5 9. (°.

6 3

8

2)

2 5,

(0>

5 5 1 4)

urine

13;

6

2

5 8,

9 9

- 36 -

Tableau 23

Biodistribution du peptide-11-technétium-99m dans un rat normal (n=1)

* % Dl/organe (%DI/g)

6 0 mins.

18 0 mins.

foie

1, 3 9

0, 4 1

(0r 1 7)

(0, 0 5)

intestin

3,8 8

4; 0 1

grêie

(0, 4 6)

(0, 4 5)

gros

0,5 3

1,3 9

intestin

(0, 0 6)

(0, 17)

estomac

0 3 7

0 0 7

O

O

V

/-N O

o tsO vy pancréas

0 0 6

0, 0 3

(0; 0 8)

(0, 0 7)

poumons

0, 2 2

0; 0 3

(0, 19)

(Q; 0 3)

coeur

0, 0 7

0, 0 1

(0} 0 9)

(0; 0 2)

reins

11,10

1 3; 7 8

(8, 4 5)

(10, 4 5)

sang

4, 8 6

0r 5 8

total

/

(0, 3 3)

( 0, 0 4)

reste du

2 1,31

19, 2 8

corps

/

(0, 12)

/

co, in urine

5 8,56

6 0, 6 7

- 37 -

Tableau 24

Biodistribution du peptide-12-technétium-99m dans des rats normaux (n=3)

* % Dl/organe (%DI/g)

5

mins

•

3

0

mins

foie

2

2

1

± °1

L

2

b

8

3

1

8

CO,

3

1

O

+l

0

2)

(O,

2

3

0

2)

intestin grêlé

2;

5

3

o

+l

0

7

2J

3

9

±0,

2

4

(0r

2

9

o

-H

0

2)

(0,

2

4

±0;

0

1 )

gros intestin

2,

3

4

± °;

3

6

b

5

3

±0,

5

7

(°,

2

8

± °i

0

3 )

(0,

1

7

±0,

0

5)

estcaiac

1

3

5

± °i

1

8

b

0

9

> O

+1

2

9

(0)

4

2

± °i

1

4)

(0,

2

8

±0>

0

8)

pancréas

°)

2

6

± °f

0

2

1

4

+ 0,

0

1

(0i

5

2

± °i

0

1 )

(0,

2

8

+ 0 ,

0

3)

pourrons

1 }

4

7

± °Ï

2

9

0;

6

6

± 0,

1

1

Cl,

5

2

± °>

1

3 )

(o,

6

5

± °i

0

8)

coeur

0}

5

8

± °;

0

3

°;

2

6

± °»

0

6

8

8

± °i

0

1 )

(o,

3

7

± 0,

0

7 )

reins

1 0 ;

5

6

± °î

2

2

1 o,

6

7

± 0,

5

9

C

8

6

± °;

8

2 )

(8,

4

2

± 0,

4

5)

sang total

1 8>

3

7

± 0 )

9

9

8,

8

0

± b

8

6

C 1,

4

1

± °f

0

9)

(o,

6

3

± 0,

1

3)

reste du

5 3 y

2

9

± 4,

5

0

2 9.

2

4

± 2>

2

2

corps

CO,

3

4

± 0,

0

3)

/

(o,

1

8

± 0;

0

1 )

urine

•

1 5 ;

2

5

+ 5;

4

9

47,

5

5

± K,

5

6

%

- 38 -

Tableau 25

Biodistribution du peptide-12-technétium-99m dans des rats normaux (n=3)

* % Dl/organe (%DI/g)

6

0

mins.

1

8

0

mins

•

foie.

1 ,

9

3

± 0

3 8

1 ,

6

3

±

1

0

3

(0,

2

7

± 0

0 6 )

(0,

2

3

±

0

1

6)

intestin grêle

°>

7

6

± 0

0 4

4r

3

6

±

0

9

6

(0,

0

9

± 0

0 2)

(0;

5

4

±

0

1

5)

gros intestin

0,

7

6

± 0

0 4

0,

6

8

±

0

2

8

(0;

0

9

± 0

0 2 )

(0,

0

8

±

0

0

4)

estomac

°>

8

0

± 0

0 9

0 >

6

4

±

0

3

1

(0,

2

0

± 0

0 2 )

(0,

1

8

±

0

0

3)

pancréas

0/

1

0

± 0

0 1

°>

0

5

±

0

0

2

(0,

1

8

± 0

0 2 )

(0;

1

1

±

0

0

3)

poumons

°;

2

9

± 0

0 3

°;

2

9

±

0

3

8

(0;

2

9

± 0

0 5 )

(0,

3

2

±

0

4

3)

coeur

°y

1

0

± 0

0 4

0;

5

3

±

0

8

7

(0;

1

5

± 0

0 5 )

(°,

7

7

±

1

2

9)

reins

1 [>

7

3

± 0

3 8

1 l)

l

7

±

1

2

2

(8,

4

2

± 0

0 9 )

(7,

9

4

+

0

3

6)

sang total

3 j

7

0

± 0

3 2

°»

9

3

±

0

1

8

(0;

2

8

± 0

0 2 )

(0,

0

7

±

0

0

1 )

reste, au corps

1 l>

9

7

± 1

7 9

5,

0

1

±

3

1

9

(°f

0

8

± 0

0 1 )

(°r

0

3

±

0

0

2)

urine

6 1 >

5

1

± 2

5 3

7 5}

2

0

±

8

I

6

- 39 -

Tableau 26

Biodistribution du peptide-13-technétium-99m dans des rats normaux (n=3)

* % Dl/organe (%DI/g)

5 mins.

3 0 mins.

foie ly 80±0} 19

1, 2 0 ±0, 2 6

(0, 36±0, 0 3)

(0, 2 1 ±0; 0 2)

intestin

1, 9 9 ±0, 0 9

1. 6 2 ± 0 . 2 1

grêle

/ / (0, 4 1 ±0, 0 3)

' J

(0, 2 9 ±0, 0 7)

gros

1, 25±0, 21

0, 5 8 ± 0. 2 7

intestin

* /

/ w

(0; 27±0; 0 5)

(0, 1 1 ±0, 0 4)

estomac

0; 5 6±0j 10

0; 2 8 ± 0 j 0 4

(0, 3 7 ±0, 0 4)

(0; 1 3 ±0, 0 2)

pancréas

0, 1 1± 0, 0 2

0, 0 8 ±07 0 5

(0, 3 6 ± 0, 0 5)

(0, 2 2 ±0 12)

pourrons

0, 8 1 ± 0; 2 1

0, 2 5 ± 0, 0 4

(1, 0 5±0; 2 0)

(0, 3 5 ± 0j 0 3)

coeur

0, 3 2±0; 0 4

0, 1 1 ±0; 0 0

(0, 6 1 ± 0, 0 9)

(0, 2 1 ± 0, 0 1)

reins

15, 0 3±0; 12

14, 3 5 ± 2, 8 6

( 1 3; 6 1 ± 0^ 3 1)

(12, 1 5 ± 2j 0 9)

sang

13, 6 8 ± 0, 9 6

5, 9 0 ±1. 5 2

total

' J

' )

(1, 6 8±0j 15)

(0, 6 8 ± 0; 17)

reste au

59, 9 1+0, 4 9

3 0, 8 5 ±9, 5 1

corps

/ '

/ /

(0, 6 0 ± 0, 0 7)

(0, 3 0 ± 0j 10)

urine

10, 3 0 ± 5, 73

4 7, 1 8 ± 1 0, 7 0

- 40 -

Tableau 27

Biodistribution du peptide-13-technétium-99m dans des rats normaux (n=3)

* % Dl/organe (%DI/g)

6 0 mins.

18 0 mins.

foie

0, 7 0±0> 10

0, 2 9 ±0, 0 5

(0; 1 3 ± 0, 0 2)

(0, 0 5 ± 0 j 0 1)

intestin

2, 0 2 ±0. 2 0

4, 4 8 ± 4, 2 1

grêle

1 1

(0, 3 7 ±0, 0 5)

<0; 8 1 ± 0, 7 6)

gros

0. 4 0 ± 0, 15

0, 2 3 ± 0 . 15

intestin

) t

7 7

(0? 0 7 ± 0; 0 2)

(0, 0 4 ± 0 0 2 )

estomac

0, 2 1 ± 0, 0 8

0, 0 4 ± 0; 0 1

(0, 0 9 ± 0; 0 4)

(0, 0 2 ± 0, 0 1)

pancréas

0, 0 3 ± 0, 0 1

0, 0 2 ± 0; 0 1

(0, 09 + 0, 0 1)

(0, 0 5 ± 0, 0 3)

poumons

0, 1 2 ± 0; 0 2

0, 0 2 ± 0? 0 0

(0, 1 6±0, 0 3)

(0, 0 3 ± 0, 0 0)

coeur

0, 0 5 ± 0, 0 1

0 , 0 1 ± 0 0 0

(0, OSiO, 0 2)

(0, 0 1 ± 0, 0 0)

reins

1 2, 9 1 ±1, 5 6

10, 8 3 ± 2, 3 4

( 1 l} 0 9 ± 0, 8 4)

(8, 9 2 ±1; 6 4)

sang

2, 1 6 ± 0, 6 6

0, 3 4 ±0, 2 2

total

/ )

(0; 2 5 ± 0; 0 8)

(0, 0 4 ± 0; 0 3)

reste du

15, 2 1 ± 7, 9 1

2, 6 5 ± 0, 7 7

corps

/ /

' 7

(0; 1 5±0, 0 8)

(0^ 0 3 ± 0, 0 1)

urine

6 1 y 1 5 ± 9, 1 6

8 1, 2 2 ± 2, 17

- 41 -

Tableau 28

Biodistribution du peptide- 14-technétium-99m dans des rats normaux (n=3)

* % Dl/organe (%DI/g)

5 mins.

3 0 mins.

foie

2 j 6 5 ±0, 6 6

1, 6 0 ± 0, 3 4

(0, 3 4 ± 0 f 0 8)

(0, 2 2 ± 0, 0 5)

intestin

2, 7 3 ±0, 2 4

2. 3 4 ±0, 3 2

grêle

" 1

(0, 3 3 ±0f 0 2)

' 7

(0, 3 2 ± 0 , 0 4)

gros

0, 72 + 0, Il

0, 7 7 ± 0, 10

intestin

' f

/ /

(0, 1 9 ± 0r 0 3)

(0, 0 9 ±0; 0 1)

estomac

0, 2 9 ± 0, 10

l, 6 6 ±0; 19

(0, 4 0 ±0; 0 7)

(0; 60±0, 0 4)

pancréas

0; 1 5 ± 0, 0 1

0; 0 9±0; 0 0

(0, 3 3 ± 0j 0 3)

(0, 1 6±0, 0 3)

poumons

0, 8 1 ± 0f 0 9

0} 3 2±0} 0 5

( 0, 8 1 ± 0f 0 7)

C 0, 3 2 + 0 0 3 )

coeur

0, 3 3 ± 0, 0 2

0, l 1 ± 0; 0 2

(0, 4 9 ± 0; 0 5)

C0; 1 7 ± 0 0 1)

reins

1 2} 7 6 ± 2; 4 5

9j 0 9 ± 0, 5 6

( 9 ; 1 5 ± 2} 2 4)

C 6 ^ 7 6 ± 0, 2 5)

sang

18, 1 0 ± 0, 7 1

1 y 99±4j 33

total

> /

( 1,- 4 0 ± 0, 0 5)

(0, 6 5 ± 0^ 3 4)

reste du

5 5, 1 6 ± 1; 4 3

2 5, 8 6 ± 4j -3 6

corps

(0, 3 6 ± 0J 0 2)

(0, 1 8 ± 0, 0 3)

urine

12, 8 8 ± 1, 38

5 3, 5 8 ±3, 9 0

%

- 42 -Tableau 29

Biodistribution du peptide-14-technétium-99m dans des rats normaux (n=3) * % Dl/organe (%DI/g)

6

0 mins.

1

8 0 mins

•

foie

0,

9

7 ± O,

1 5

o»

3

8 ± 0

0

2

intestin grêle

(°, 4 , (0,

1 8 6

4 ± 0, 8 ± 2, 6 ± 0,

0 3 )

1 8

2 5)

S, (0,

0 2 7

6 ± 0

7 ± 0 4 ± 0

0 7 0

1) l

3)

gros intestin estomac

(0,

o,

7 0 6

9 ± 0, 9 ± 0, 8 ± 0,

4 1 0 5 ) 3 3

0,

co,

1,

8 l

9

3 ± 0

0 ± 0

1 ±0

2 0 4

0

3) 4

(0,

7

1 ± 0,

0 5 )

<°.

8

1 ± 0

2

8)

pancréas

°,

0

4 ± 0y

0 1

°,

0

3 ± 0

0

2

(°,

0

8 ± 0,

0 l )

(0,

0

6 ± 0

0

5)

poumons

0; (0,

1 1

4 ± 0 T

5 ± 0,

0 1 0 l )

0, (°,

0 0

4 ± 0 4 ± 0

0 0

1

1 )

Coeur

0 )

0

5 ± 0;

0 1

0,

0

1 ± 0

0

0

(0,

0

7 ± 0 j

0 1 )

0

2 ± 0

0

0)

reins

8,

0

7 ± 1 ?

0 3

6,

5

3 ± 1

7

1

(S

0

7 ± 0;

4 0)

( 4 ;

5

3 ± 0

9

2)

sang total

2

( 0 ,

5 2

3 ± 0 j 1 ± 0;

6 1 0 5 )

(°;

9 0

7 ± 0

8 ± 0

8 0

1

7)

reste au corps

1 4, (0,

4

1

5 ± 1 ) 0 ±0,

7 6 0 5)

4,

<0/

7 0

8 ± 0 3 ± 0

9 0

8

1)

urine

6 7

6

6 ± 8;

3 7

7 9,

7

1 ± 2

0

5

43

Exemple 9

Stabilité in vivo du peptide marqué au technétium-99m Le peptide-1 -technétium-99m obtenu selon la méthode de l'Exemple 5 a été administré à des rats. Ces rats ont été sacrifiés 1 heure 5 après administration pour en recueillir le sang. De la même façon, le peptide-2-technétium-99m obtenu selon la méthode de l'Exemple 6 a été utilisé en suivant la méthode décrite ci-dessus et le sang des rats a été recueilli. Le sang des rats traités respectivement par le peptide-1 et le peptide-2 a été centrifugé à 4000 tour/minute pendant 10 minutes pour séparer le plasma du 10 sang. Le plasma a ensuite été filtré à l'aide d'une membrane de filtration de 0,2 |jm et analysé par HPLC. La stabilité in vivo desdits peptides a été déterminée pour chacun d'eux en comparant les chromatogrammes HPLC obtenus après administration aux chromatogrammes HPLC obtenus avant administration des peptides.

15 Le chromatogramme HPLC du peptide-2-technétium-99m présente des pics multiples supplémentaires par rapport au chromatogramme HPLC obtenu avant administration. Ce résultat témoigne d'une influence d'autres substances se trouvant dans le sang sur le peptide-2-technétium-99m. D'autre part, dans le cas du peptide-1 -technétium-99m, qui est le peptide de 20 la présente invention, le pic apparaissant au temps de rétention 16 minutes dans le chromatogramme HPLC obtenu avant administration du peptide est apparu 4 minutes environ plus rapidement et se trouve donc déplacé au temps de rétention 12 minutes par rapport à son temps de rétention avant administration.Toutefois, ce pic a conservé son aspect distinct après avoir 25 été mélangé au plasma et ne se trouve pas divisé en pics multiples comme dans le cas du peptide-2-technétium-99m. Cela tend à montrer que le peptide 1-technétium 99m est présent à l'état unitaire dans le plasma et est radiochimiquement plus stable que le peptide 2-technétium. Les profils HPLC de ces deux peptides marqués sont présentés dans les Figures 1 et 2. 30 Exemple 10

Visualisation d'une souris nude atteinte d'un cancer du larynx avec le peptide synthétisé marqué au technétium-99m Le peptide-14-technétium-99m a été préparé selon la méthode décrite dans les Exemples 1 et 6. La valeur analytique (nombre par molécule) 35 de la composition en anions acides du peptide-14-technétium-99m obtenu est présentée ci-dessous en même temps que la valeur théorique (nombre par molécule) entre parenthèses.

44

Peptide-14 = Asn: 1,1 (1), Glx: 2,0 (2), Gly: 2,1 (2), Arg: 1,9 (2), Thr: 2,0 (2), Ala: 1,9 (2), Pro: 2,1 (2), Tyr: 2,0 (2), Lys: 0,9 (1), Cys: - (1), Trp (1).

Ensuite, 5 x 106 cellules tumorales HEp2 (Carcinome Humain Epidermoïde; ATCC n° CCL 23) ont été mises en suspension dans 1,0 ml de 5 milieu de culture (milieu minimum essentiel de Eagle contenant 90 % de Earle BSS et 10 % de sérum bovin foetal). Un volume de 100 pi de cette suspension a été administré à des souris BALB/C nu/nu âgées de 6 semaines par injection sous-cutanée dans une portion latérale du corps. Deux semaines plus tard et après avoir confirmé la croissance de tumeurs de 0,3 grammes environ, les 10 souris ont été anesthésiées au Ranoval et il leur a été administré de 15 MBq à 20 MBq de peptide-14-technétium-99m obtenu selon la méthode décrite ci-dessus et de peptide-2-technétium-99m obtenu selon la méthode décrite dans l'Exemple 7, par injection dans la veine de la queue. Des images ont été prises par gammagraphie 5 et 20 minutes après administration. Les 15 scintigrammes de la totalité des corps des souris traitées ont été obtenus pour chacun de ces deux peptides 5 minutes et 20 minutes après administration et les scintigrammes sont présentés dans les Figures 3, 4, 5, et 6.

Les animaux ont été ensuite immédiatement sacrifiés pour déterminer la répartition de la radioactivité dans chacun des organes à l'aide 20 d'un compteur à Nal mono-canal. Le rapport de la radioactivité présente dans la tumeur [T] à celle présente dans le muscle [M] (désigné ci-après comme "rapport [T] / [M]") a été déterminé. Dans le cas du peptide-14-technétium-99m, le rapport [T] / [M] était de 4,50 ± 0,71 (n=3) 20 minutes après administration tandis que, dans le cas du peptide-2-technétium-99m, le rapport 25 [T] / [M] était de 3,38 ± 0,71 (n=3). Ce résultat indique que la liaison d'un résidu aminoacide Lys à l'extrémité N-terminale du peptide selon la présente invention améliore la visualisation du tronc du corps ce qui suggère une utilité de ce peptide comme agent de diagnostic radioactif.

Exemple 11

30 Stabilité du peptide synthétisé et marqué au technétium-99m in vitro dans le plasma humain

Le peptide-8-technétium-99m obtenu dans l'Exemple 8 a été mélangé à 10 volumes d'équivalent de plasma humain (ROCKLAND Inc.: PLASMA STÉRILE contenant de l'EDTA) et le mélange a été incubé à 37 °C. 35 Un mélange contenant le peptide-1-technétium-99m obtenu selon l'Exemple 6 a également été préparé par la même méthode.

45

Cinq minutes et 30 minutes après avoir effectué le mélange, celui-ci a été filtré au travers d'une membrane de filtration de 0,2 |jm puis analysé par HPLC. La stabilité in vitro des peptides a été déterminée par comparaison des profils HPLC obtenus au profil HPLC du peptide-1 obtenu avant d'avoir 5 effectué le mélange. Les profils HPLC du peptide-1 -technétium-99m seul et de chacun des peptides désignés ci-dessus marqués au technétium-99m et incubés avec du plasma à 4 °C et à 37 °C sont présentés dans les Figures 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 et 15; pour chacune de ces températures, l'analyse par HPLC a été réalisée 5 minutes et 30 minutes après avoir effectué le 10 mélange.

Tableau 30

% de substances radioactives non-identifiées dans le plasma après 5 min/4 °C

aDrès 30 min/4 °C

peptide-1 5,3

40,1

peptide-8 0

3,16

Tableau 31

% de substances radioactives non-identifiées dans le plasma après 5 min/37 °C

aorès 30 min/37 °C

peptide-1 12,4

59,4

peptide-8 0

2,04

La proportion de substances non-identifiées était de 5,3 % et de 40 % de la radioactivité totale utilisée respectivement 5 minutes et 30 20 minutes après avoir effectué le mélange à 4 °C. Ce résultat a été confirmé par l'apparition de nouveaux pics sur les chromatogrammes HPLC. D'autre part, dans le cas du peptide-8-technétium-99m dont le 10ème résidu de la séquence aminoacide est une Arg sous la forme-D, cette proportion était de 0% et de 3,2 % à 4 °C respectivement 5 minutes et 30 minutes après avoir 25 effectué le mélange.

De plus, afin d'évaluer l'influence des enzymes du plasma, la proportion de substances non-identifiées a été déterminée 5 minutes après avoir effectué le mélange, à 4 °C et à 37 °C. Dans le cas du peptide-1-technétium-99m, cette proportion, 5 minutes après avoir effectué le mélange, 30 était de 5,3 % à 4 °C et de 12,5 % à 37 °C. En revanche, dans le cas du peptide-8-technétium-99m, cette proportion était de 0 % à 4 °C et de 0 % à 37 °C, 5 minutes après avoir effectué le mélange. Ce résultat confirme que le

46

peptide-8-technétium-99m n'est pas catabolisé par les enzymes du plasma. Par conséquent, il est suggéré que le remplacement d'une partie de la séquence d'acides aminés avec des acides aminés de forme-D permet d'augmenter la stabilité in vivo du peptide.

5

Exemple 12 Affinité antiaéniaue du peptide-14 synthétisé Il est connu que le peptide classique YCAREPPTRTNAYWG se fixe à l'épitope VTSAPDTRPAPGST du noyau protéique de la mucine. Cet 10 épitope a été synthétisé puis conjugué à l'albumine de sérum bovin (BSA). Le peptide conjugué a été utilisé comme antigène artificiel dans la mesure de l'affinité antigénique du peptide-14 par méthode de dosage radio-immunologique. Le dosage est détaillé plus bas.

A chaque tube de 2 ml contenant des billes de polystyrène de 15 6,35mm de diamètre, a été ajouté un aliquot de 200 pl d'une solution à 10 |jg/ml d'antigène artificiel dilué dans un tampon de carbonate de sodium à 50 mmol de pH 9,5. Après avoir laissé les tubes se reposer à 4 °C pendant une nuit, fa surface interne des tubes a été rinçée trois fois avec une solution de lavage composée de 0,05 % (v/v) de Tween 20 dans du PBS (tampon 20 phosphate salin de pH 7,5). Pour bloquer les portions des billes de polystyrènes auxquelles l'antigène ne s'est pas fixé, 200 pi d'une solution de BSA à 1 % dans du PBS ont été ajoutés à chaque tube. Après avoir laissé les tubes se reposer pendant 3 heures à température ambiente, la surface interne des tubes a été rinçée trois fois.

25 Le peptide-14 a été dilué à des concentrations de 500, 100, 50,

10, 5, 1, 0,5, 0,1 et 0,05 |jg/ml dans du PBS contenant 1 % de PRIONEX (marque déposée) (un produit de remplacement de l'albumine commercialisé par Pentapharm, Ltd.). De même, un anticorps (anticorps monoclonal de type souris) dont le déterminant antigénique est la séquence du peptide-3 a été 30 dilué à 15 pg/ml dans une solution de PBS contenant 1 % de PRIONEX. Chacune des solutions contenant les peptides dilués a ensuite été ajoutée à chaque tube de 200 pi, et, à chacun de ces tubes, 100 pi d'une solution d'anticorps préparée à l'avance a ensuite été ajoutée. Après avoir laissé les tubes se reposer pendant 3 heures, la surface interne des tubes a été rinçée 35 trois fois avec l'agent de lavage.

Un anticorps de mouton anti-souris marqué à l'iode-125 (3,7 MBq/ml, commercialisé par Amersham Co.) a été dilué 100 fois dans une solution de PBS à 1 % de BSA. A chaque tube ont été ajoutés 200 pi

47

d'anticorps anti-souris dilués. Après avoir laissé reposer les tubes pendant 2 heures à 37 °C, la surface interne des tubes a ensuite été rinçée trois fois avec l'agent de lavage. La radioactivité a été mesurée avec un compteur de rayonnement gamma à puit automatique. Les résultats sont présentés dans

5 le Tableau 30 et la Figure 16. Une courbe de saturation et une courbe scatchard, toutes deux élaborées à partir de ces résultats, sont présentées dans la Figure 17 et la Figure 18. Les résultats obtenus confirment que le peptide-14 possède une affinité pour l'antigène tumoral et que cette affinité pour l'antigène (Ka) est de 2,34 x 107.

10 La Figure 16 présente l'évolution du rapport de radioactivité en fonction de l'évolution de la concentration du peptide lorsque le peptide utilisé est le peptide-14,

la Figure 17 présente la courbe de saturation dans le cas du peptide-14,

15 la Figure 18 présente la courbe scatchard dans le cas du peptide-

14.

48

Tableau 32 Pouvoir de fixation du peptide-14 (PT)

PT

(g/ml)

PT (mol/1)

-log (PT (mol/1) }

Pourcentage de peptide fixé (%)

Quantité de peptide fixé

(mol x10 ^)

Quantité de peptide fixé/ quantité de peptide non-fixé

5,0X10"4

2, 4 x 10"A

3,623

63, 669

llj 577

4, 9. X 10"9

1,0X10-4

4, 8 x 10"5

4,322

58,585

10, 653

2^ 2 x 10"'

5,0xl0"5

2j 4 x 10"5

4,623

60, 869

11, 068

4,6 x 10"8

1; 0 x 10"5

4, 8 x 10 "6

5,322

60, 056

10,920

2,3 x 10"7

5, 0 x 10 "6

2} 4 x 10"6

5,623

50,293

9, 145

3,8 x 10"7

1, 0x 10"6

4, 8 x 10"7

6,322

38,129

6; 933

1,5 x 10 6

5,0X10"7

2,4x10 7

6, 623

42, 941

7, 808

3,3 x 10"6

1, 0x 10"7

4,8X10 8

7,322

27,890

5, 072

1, 1 x 10"5

5; 0 x 10 "8

2,4X10""

7, 623

29, 517

5, 367

2,3 x 10 "5

49

Claims (16)

REVENDICATIONS

1. Un peptide, ou un de ses sels, ayant une affinité pour les tissus tumoraux, dont la séquence aminoacide est constituée de 20 ou moins

5 résidus aminoacides, cette séquence étant décrite par la formule Xr YCAREPPT-X2 dans laquelle A, C, E, P, R, T et Y représentent les résidus aminoacides sous leur désignation conventionnelle à une lettre, chacun des résidus aminoacides A, C, R, et Y de la séquence YCAR pouvant indépendamment être sous la forme-L ou la forme-D, X^ représentant un 10 composé organique basique portant de 1 à 3 fonctions aminés, et X2 représentant une quelconque séquence d'acides aminés donnée.

2. Un peptide, ou un de ses sels, ayant une affinité pour les tissus tumoraux selon la revendication 1, dans lequel Xi est une chaîne alkyle comportant de 1 à 7 atomes de carbone saturée ou non-saturée dans

15 laquelle de 1 à 3 atomes d'hydrogène ont été substitués par des groupes aminés, ou une chaîne alkyle comportant de 1 à 7 atomes de carbone saturée substituée par le groupe -OH et/ou le groupe -COOH ou -NH-C(NH)NH2 et dans laquelle de 1 à 3 atomes d'hydrogène ont été substitués par des groupes aminés.

20

3. Un peptide, ou un de ses sels, ayant une affinité pour les tumeurs selon les revendications 1 ou 2 dans lequel X^ est le résidu aminoacide K ou R sous la forme-L ou la forme-D, les abréviations K et R représentant les résidus aminoacides sous leur désignation conventionnelle à une lettre.

4. Un peptide, ou un de ses sels, ayant une affinité pour les tissus 25 tumoraux selon les revendications 1, 2 ou 3, dans lequel X^ est un résidu aminoacide K sous la forme-L ou la forme-D, et X2 est une séquence d'acides aminés RTNAYWG dans laquelle les résidus aminoacides R, T, N, A, Y, W et G peuvent être indépendamment sous la forme-L ou sous la forme-D, les abréviations K, R, T, N, A, Y, W et G représentant les aminoacides sous leur 30 désignation conventionnelle à une lettre.

5. Un peptide, ou un de ses sels, ayant une affinité pour les tissus tumoraux selon les revendications 1, 2 ou 3, dans lequel X^ est le résidu

50

aminoacide K sous la forme-L ou la forme-D, et X2 est la séquence d'acides aminés RTNAYWGQG dans laquelle les résidus aminoacides R, T, N, A, Y, W, G et Q peuvent être indépendamment sous la forme-L ou sous la forme-D, les abréviations K, R, T, N, A, Y, W, G et Q représentant les aminoacides sous 5 leur désignation conventionnelle à une lettre.

6. Un peptide, ou un de ses sels, ayant une affinité pour les tissus tumoraux selon les revendications 1, 2, 3, 4 ou 5, dont l'extrémité N-terminale a été modifiée chimiquement par une réaction sélectionnée parmi celles de la liste constituée par les réactions d' acétylation, de guanidylation,

10 d'amidination, d'alkylation par réduction, de carbamylation, de succinylation, de maléilation, d'acétoacétylation, de nitrotroponylation, de dinitrophénylation, de trinitrophénylation, de benzyloxycarbonylation, de t-butoxycarbonylation, et de 9-fluorénylméthoxycarbonylation.

7. Un peptide, ou un de ses sels, ayant une affinité pour les tissus 15 tumoraux selon la revendication 6, dont l'extrémité N-terminale a été acétylée.

8. Un peptide, ou un de ses sels, ayant une affinité pour les tissus tumoraux selon les revendications 1, 2, 3, 4 ou 5, dont l'extrémité C-terminale a été modifiée chimiquement par amidation ou estérification.

9. Un peptide, ou un de ses sels, ayant une affinité pour les tissus 20 tumoraux selon les revendications 1, 2, 3, 4 ou 5, dont l'extrémité N-terminale a été modifiée chimiquement par une réaction sélectionnée parmi celles de la liste constituée par les réactions d' acétylation, de guanidylation, d'amidination, d'alkylation par réduction, de carbamylation, de succinylation, de maléilation, d'acétoacétylation, de nitrotroponylation, de dinitrophénylation, 25 de trinitrophénylation, de benzyloxycarbonylation, de t-butoxycarbonylation, et de 9-fluorénylméthoxycarbonylation, et dont la partie C-terminale a été modifiée chimiquement par amidation ou estérification.

10. Un peptide, ou un de ses sels, ayant une affinité pour les tissus tumoraux selon la revendication 9, dont la partie N-terminale a été acétylée, et

30 dont l'extrémité C-terminale a été amidée ou estérifiée.

11. Un peptide marqué par un métal radioactif constitué d'un peptide, ou un de ses sels, ayant une affinité pour les tissus tumoraux selon les revendications 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10, et d'un métal radioactif.

12. Un agent de diagnostic radioactif comprenant un peptide marqué 35 par un métal radioactif suivant la revendication 11.

13. Un agent de diagnostic radioactif suivant la revendication 12 dans lequel le métal radioactif est le technétium-99m.

51

14. Un agent de diagnostic radioactif suivant la revendication 12 dans lequel le métal radioactif est le rhénium-186 ou le rhénium-188.

15. Un agent de diagnostic radioactif suivant la revendication 12 dans lequel le métal radioactif est le cuivre-62.

lequel le métal radioactif est rindium-111.

17. Un agent thérapeuthique radioactif comprenant un peptide marqué par un métal radioactif suivant la revendication 11.

18. Un agent thérapeuthique radioactif suivant la revendication 17 dans 10 lequel le métal radioactif est le rhénium-186 ou le rhénium-188.

19. Un agent thérapeuthique radioactif suivant la revendication 17 dans lequel le métal radioactif est ryttrium-90.

5

16. Un agent de diagnostic radioactif suivant la revendication 12 dans

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