MC580A1 - Procédé et moyen pour commander le sexe de la progéniture des mammifères - Google Patents

Description

690 à 695 697 à 704

G1/

Pile FA-20832-37,27,65, 51,53,67,24,39,42,44,43: 46,49,70^-4

BREVET D'IÎTVENTION

"Procédé et moyen pour commander le sexe de la progéniture des mammifères"

Société dite : SWB RESEARCH CORPORATION

La présente invention se rapporte d'une façon générale à un. procédé et à un moyen servant à commander le sexe de la progéniture des mammifères; ainsi qu'à des compositions permettant d'obtenir des enfants d'un sexe déterminé. Plus particulièrement, la présente invention se rapporte à la séparation des spermatozoïdes contenant des chromosomes X des spermatozoïdes contenant des chromosomes Y.

Il a été déterminé que le sexe de la descendance est commandé par les chromosomes ou cellules du sperme particulières qui ont fertilisé l'oeuf. C'est-à-dire que certains

des spermatozoïdes (appelés ci-après "sperme") sont connus du point de vue génotype comme contenant des chromosomes X ou chromosomes femelles, tandis que les autres contiennent des chromosomes Y ou chromosomes mâles. A l'examen au microscope, les chromosomes X apparaissent comme étant de plus grandes dimensions que les chromosomes Y. Quand un sperme contenant de^chromosomes X (appelés ci-après "spermes X") se combinent avec l'oeuf (qui contient des chromosomes X) il en résulte une descendance femelle. Lorsqu'uq/êperme contenant les chromosomes Y (appelés ci-après spermes Y) se combinent avec l'oeuf, il en résulte une descendance mâle. La population du sperme dans l'é jaculation d'un, mâle mammifère contient à la fois du sperme X et du sperme Y. Jusqu'à présent , on n'a pas pu séparer d'une façon satisfaisante ces spermes en composant X et en composant Y. Il est évident, cependant, que la séparation de deux types de spermes permettrait un choix ou une sélection du sexe final de la descendance.

En conséquence, la présente invention a pour but de fournir :

- un procédé présentant toutes garanties de succès permettant de commander le sens de la descendance des mammifères |

- un procédé permettant d e réaliser une séparation à peu près complète du sperme X et du sperme Y, séparation capable d'assurer une fertilisation normale dans l'éjacu-lation d'un mammifère;

- une nouvelle composition capable de produire une descendance de mammifères du sexe voulu 5

- un nouveau moyen pour séparer le sperme X du sperme Y, capable de produire une fertilisation normale.

la menace présentée par l'accroissement rapide de la population humaine et par une surpopulation finale est bien connue. Il est également bien connu qu'une forte incitation à la procréation humaine réside dans le désir d'avoir une descendance d'un sexe particulier, lorsque le sexe voulu n'est pas obtenu, d'autres enfants sont conçus, la présente invention donne la possibilité aux couples de choisir ou de commander le sexe de leur descendance et par suite leur donne la chance de réduire le nombre d'enfants en satisfaisant le désir d'avoir un enfant du sexe particulier. De plus, la présente invention est utile dans l'éle vage animal par le fait qu'elle permet de choisir le sexe de la descendance suivant la fin à laquelle on la destine.

la présente invention s'applique d'une façon considérable à résoudre les problèmes de nourriture du monde affamé :

(1) en réduisant le taux des naissances humaines

(2) en accroissant la production de protéines dans la nourriture animale à l'aide de programmes sélectifs produisant une majorité de bétail sur pied de sexe voulu.

D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention ressortiront de la description détaillée qui va suivre faite en regard des dessins annexés qui donnent à titre indicatif mais nullement limitatif plusieurs formes de réalisations conformes à l'invention.

Sur ces dessins ;

la figure 1 est un schéma représentant le procédé de la présente invention ;

la figure 2 représente schématiquement le processus à divers moments dans le temps;

la figure 3 est un oraphique illustrant la sépara

tion d'une population type de sperme en composantes de sexe différent;

la figure 4 est -une vue en coupe et en élévation d'un appareil destiné à être utilisé dans la présente invention j la figure 5 est une vue en coupe suivant la ligne 5-5 cle la figure 4 ;

la figure 6 est une vue en coupe suivant les lignes 6-6 de la figure 4 ;

la figure 7 est une vue de détail à plus grande échelle d'une partie de l'appareil représenté sur la figure 4.

Les figures de 8 à 10 sont des graphiques représentant des exemples particuliers de séparation du sperme obtenus à l'aide de la présente invention.

La présente invention est basée sur la découverte que deux génotypes du sperme de mammifère (X et Y) peuvent être séparés suivant des 'caractéristiques phénotypiques en appliquant une force de flottation faisant atteindre dans un milieu par le sperme qui flotte le mieux un niveau différent de celui atteint par le sperme qui flotte le moins bien. La force de flottation peut être positive, ce qui fait élever le corps, ou négative, ce qui fait tomber le corps dans le milieu. Comme exemple particulier de force de flottation, la pesanteur peut être considérée comme une force de flottation négative servant à séparer le sperme par sédimentation. On a trouvé que la sédimentation aux basses températures dans un milieu de caractéristiques réglées d'une façon critique se traduit par la séparation du sperme X du sperme Y.

Lorsqu'une particule inerte tombe à travers un

milieu, elle suit la loi de STOKES en ce qui concerne sa vitesse de sédimentation sous l'influence des forces physiques de flottation du liquide, de la viscosité du liquide, de la force de la pesanteur et de la différence de densité entre le milieu et les particules. A partir de la loi de StokeSjon a trouvé que

_ K( P - P' )mg V ~ ■ .3 pu)

— 1

où v = vitesse des particules (cm ; sec" )

•2

P= densité des particules (g/cm )

p'~ densité du milieu (g/cm )

m = masse des particules (g)

—2

g = accélération de la pesanteur (981 cm sec" )

—2

û) = tension de surface (g/cm" )

X = constante des particules, dépendant de leur forme géométrique.

Suivant la loi de Stokes, la vitesse des particules qui tombent varie suivant les dimensions et la forme de la particule ainsi que de la différence de densité entre le milieu et la particule. Lorsque la vitesse de chute d'une catégorie de particule suit la loi de Stokes, on obtient une répartition normale de G-auss de la floculation, de sorte que les diverses fractions de sédimentation contiennent des particules de densité et de volumes égaux.

On a trouvé que dans les conditions réglées avec soin, les sédiments de sperme à travers une colonne d'un milieu et les fractions supérieure et inférieure, lorsqu'elles sont inséminées, produisent des rapports de sexe différents. Les différences phénotypiques observées dans le sperme se rapportent à leurs génotypes de sexe.

La figure 1 est un schéma représentant le procédé

de la présente invention. Au cours du stade 11, du sperme frais est collecté à partir du mâle, lequel sperme contient des quantités égales de sperme X et de sperme Y. Ce sperme est mélangé avec un milieu nutritif au cours du stade 12. le milieu nutritif est absorbé dans le sperme au cours du stade 13, après quoi le mélange est progressivement refroidi au cours du stade 14. Lorsqu'il est refroidi, le mélange est soumis à une sédimentation au cours du stade 16. Les fractions de sédiments sont alors séparées au cours du stade 17 afin d'isoler le sperme 2 ou le sperme Y, à volonté. Le sperme qui contient les chromosomes voulus en combinaison avec le mélange nutritif est alors inséminé artificiellement au cours du stade 18 dans la femelle du type à partir duquel le sperme a été obtenu. Bien entendu, on peut également croiser un cheval avec un âne et avec un zèbre, comme on peut croiser un loup avec un chien.

La présente invention convient pour être utilisée avec tous les mammifères. Particulièrement intéressants sont les êtres humains et les autres primates, le bétail, les porcs, les moutons, les lapins, les chats, les chèvres, les chevaux, les ânes et les bovins. On a déterminé qu'il existe une différence de densité entre le sperme X et le sperme Y, le sperme X étant plus dense que le sperme Y. Chez un sanglier, la différence de densité entre les chromosomes X et Y est environ de 18 fa. Chez les taureaux et les étalons, la différence de densité est d'environ 10 fo, chez les mâles humains, le chromosome X est environ 5 "/° plus dense que le sperme Y. Chez le lapin, la différence est approximativement de 3

Le milieu choisi pour être utilisé au cours du stade 12 doit avoir une densité suffisamment proche de celle

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du sperme pour que la legère différence de densité qui existe entre le sperme X et le sperme Y se traduise par une sédimentation en fractions différentes. Par rapport à la densité, la viscosité doit être également appropriée afin de régler la sédimentation. De plus, le milieu ne doit pas altérer le taux de fertilité du sperme. C'est-à-dire que le milieu ne doit pas être dangereux pour le sperme et qu'il ne doit pas le détruire. Au contraire, le milieu doit fournir des éléments nutritifs servant à maintenir vivant le sperme, le sperme X, qui est relativement plus gros que le sperme Y, semble absorber sélectivement une plus grande quantité du milieu. Le milieu doit également présenter un pH approprié (c'est-à-dire un pH compris dans une gamme allant de 6,0 à 6,8) afin de lui permettre de servir de tampon. Un pH tombant en dehors de la gamme de 6,0 à 6,8 tend à nuire à la fertilité du sperme ou à être toxique. Une considération finale à propos du milieu est qu'il doit présenter les caractéristiques d'un corps fluide normal. C'est-à-dire que sa pression osmotique, ou osmolarité, doit être environ de 300 mm de mercure de telle sorte que le sperme n'éclate pas et ne se trouve pas comprimé. Dans toute la description qui va suivre, les mesures du pH, de la densité et de la viscosité sont effectuées à 20°C.

Un milieu nutritif extrêmement satisfaisant est constitué par une combinaison de jaune d'oeuf et de glycine. Le jaune d'oeuf présente des éléments nutritifs perméables au sperme qui sont absorbés et qui comprennent du glucose, du fructose et des acides aminés. Le jaune d'oeuf présente également un pH (environ de 6,2 à 6,8), une viscosité et une densité appropriées, et c'est un corps normalement fluide, de sorte qu'il est approprié à être utilisé

d'une façon générale comme milieu. Les valeurs particulières de densité, de viscosité, d'osmolarité et de pH voulues peuvent être obtenues en effectuant un réglage du jaune d'oeuf et de glycine av;.nt de l'utiliser. La densité du jaune d'oeuf en lui-même doit être aussi élevée que possible pour obtenir une sédimentation optimale. On a proposé d'ajouter de l'huile de graine de coton à l'alimentation des poules et de choisir une race appropriée (par exemple des leghorns) pour améliorer la densité du jaune d'oeuf.

Le lait frais de mammifère (en particulier le lait homogénéisé) et ses dérivatifs (par exemple la poudre de lait) peuvent remplacer le jaune d'oeuf pour fournir des éléments nutritifs et augmenter la fertilité, mais la densité doit être réglée pour pouvoir l'utiliser d'une façon appropriée. D'autres éléments de remplacement pour le jaune d'oeuf comprennent le jus de tomate, la crème de noix de coco provenant de noix de coco vertes, des fluides du corps vivant et des extraits, et des extraits de tissus (par exemple extraits ds foie). En variante, on peut utiliser de la dextrine en combinaison avec de la lecithine pour remplacer le jaune d'oeuf. La dextrine assure la densité, la viscosité et le pH et la lecithine sert d'élément nutritif. De plus, on peut utiliser du fructose, du glucose et d'autres monosaccharines pour former un milieu nutritif approprié.

De préférence, on utilise la glycine en solution aqueuse de 2 à 5 i° de glycine. Elle sert à régler le pH de la semence et à abaisser le point de congélation du milieu afin d'éviter un choc de température, le rapport de la glycine au jaune d'oeuf dépend de la température,

de la densité, de la viscosité et de l'osmolarité du mélange

de jaune d'oeuf. La solution de glycine présente une viscosité plus faible que celle du jaune d'oeuf, de sorte qu'une plus grande quantité de glycine est nécessaire lorsque la viscosité doit être diminuée. D'une façon générale, une seule partie de glycine à 4 f° est nécessaire pour une à quatre parties de jaune d'oeuf.

Il est probable que la glycine est absorbée dans le sperme à partir du milieu et qu'elle tend à augmenter la vitesse de chute du sperme l'ayant absorbée. Du fait que les spermes X sont plus gros que les spermes T, ils absorbent une plus grande quantité de glycine que ne le font les spermes Y. Par suite, la différence de densité entre les spermes X et les spermes Y est accentuée par l'absorption de la glycine à un état légèrement hypotonique C'est-à-dire qu'il y a une plus grande différence de densité entre les deux types de sperme lorsque leurs densités sont modifiées artificiellement par l'absorption de glycine

Comme autre variante, on peut remplacer la glycine par du glycérol dans le milieu nutritif. D'autres acides aminés, tels que le trypotophane, peut être utilisée avec des résultats satisfaisants.

Pour obtenir les meilleurs résultats, la densité du milieu nutritif varie suivant le type de mammifères ayant fourni le sperme. Pour les humains, ainsi que pour les lapins, la densité doit être comprise entre environ 1,01 à 1,19 g par cm . Pour une gamme inférieure de densité, la plus grande partie du sperme tombe à travers le mélange de sorte que les fractions inférieures sont constituées par des mélanges de sperme X et de sperme Y. Cependant, les fractions supérieures ne contiennent qu'une faible quantité de sperme Y séparé. Aux limites supérieures

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de la gamme de densité, peu de sperme tombe à travers le milieu, de telle sorte que les fractions supérieures contiennent un mélange de sperme X et de sperme Y. Au-dessus de 1,19, seul le sperme X peut être séparé. A une densité de 1 ,34, il ne se produit jjas du tout de sédimentation et tout le sperme flotte sur le milieu. Afin de réaliser une séparation complète entre le sperme X et le sperme Y, une densité de milieu supérieure à environ 1,026 est en général nécessaire à la fois pour les taureaux et pour les humains. Cependant, ce chiffre varie avec la viscosité, la température et les autres conditions. Plus la densité du milieu se rapproche de la densité moyenne du sperme et meilleurs sont les résultats. D'autre part, le milieu ne doit pas présenter une densité telle qu'elle empêche la sédimentation. Lorsque la densité du milieu se rapproche de celle du sperme le plus léger, la viscosité a relativement peu d'importance et elle peutêtre aussi faible que cela est réalisable en pratique, par exemple inférieure à 1,0 poise.

Le tableau ci-dessous indique la gamme des densités et des viscosités pour divers types de mammifères, en indiquant la limite inférieure de densité et de viscosité pour obtenir une séparation satisfaisante, et la limite supérieure pour obtenir une sédimentation satisfaisante. Toutes les mesures effectuées sur le tableau le sont à 20°C, la densité étant donnéeen g/cm^ et la viscosité en poises.

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TABLBAÇJ

Densité Viscosité

Basse

Haute

Basse

Haute

Homme

1

,022

1,09

0,02

1,2

Lapin

1

,022

1 ,09

0,02

1,2

Taureau

1

,023

1 ,10

0,07

3,0

Porc

1

,03

1,15

0,07

3,0

la viscosité du milieu est en rapport avec la densité. Pour les humains et les lapins, une densité de 1,02 g par cor correspond à une viscosité d'environ 1,00 poise. La densité supérieure de 1,09 correspond à environ 0,075 poise. La limite supérieure de la densité utilisable en pratique pour les humains et les lapins, 1,19 g par cm" , correspond à environ 0,05 poise.

La pression osmotique du milieu doit varier entre une limite inférieure d'environ 270 et une limite supérieure d'environ 330 mm de mercure.

L'absorption du milieu dans le sperme, stade 13, s'effectue de préférence pendant une période d'une durée d'environ 15 minutes. Bien qu'il soit possible de commencer à refroidir le mélange sans une période d'absorption de durée appréciable, il est en général avantageux de laisser l'absorption s'effectuer pendant une période de courte durée à la température ambiante. Le mélange de sperme et de milieu peut être maintenu à la température ambiante pendant une durée pouvant s'élever jusqu'à 3 heures pour permettre l'absorption. Il est probable qu'il se produit une absorption sélective de substances perméables, telles que la glycine, la glycérine, et le fructose à la température ambiante. En augmentant la durée de la période d'absorption au-delà des 15 minutes normales, on modifie le taux

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de sédimentation. C'est-à-dire que le sperme X qui est plus gros absorbe une plus grande quantité de milieu et tombe à une plus grande vitesse que le sperme Y ou le sperme X qui n'ont pas absorbé autant du milieu dense.

Après que le milieu a été absorbé dans le sperme, on refroidit progressivement le mélange afin d'immobiliser le sperme. Avec un équipement de refroidissement classique, il est commode de permettre au refroidissement de s'effectuer pendant quatre heures pour obtenir une température inférieure à 1,0°C. Cependant, avec un équipement de refroidissement rapide, on peut réduire la durée de cette période à quelques minutes seulement. Par suite, une période d'une durée comprise entre 1 et 300 minutes doit être prévue pour permettre au mélange de se refroidir à une température inférieure à 1,0°C. Après avoir atteint cette température, on peut maintenir le mélange jusqu'à une durée de 15 heures à la basse température.

Le temps nécessaire pour effectuer l'opération de sédimentation 16 peut varier considérablement. Avec des milieux de densité relativement faible, les particules tombent d'une façon relativement rapide, de sorte qu'une durée de sédimentation plus courte suffit. Au contraire, des milieux denses et visqueux tendent à ralentir la chute des particules inertes, de sorte qu'une période de durée relativement longue est nécessaire pour la sédimentation. En générai, il faut de 1 à 24 heures pour obtenir une sédimentation convenable.

En se reportant à la figure 2, la durée de la sédimentation doit être telle que les deux fractions soient à peu près complètement séparées c;.-mme on le voit au temps 12. Au temps 0, le sperme X (représenté par le signe O)

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et le sperme Y (représenté par le signe df) sont tous les deux mélangés ensemble lorsque le mélange refroidi pénètre dans la colonne de sédimentation. Après quelques heures, par exemple 4 heures pour le mode de réalisation particulier représenté, le sperme X qui est plus dense a tendance à se séparer du sperme T moins dense pendant la chute à travers la colonne de sédimentation. Le sperme X et le sperme T tombent tous les deux, mais le sperme X tombe plus rapidement. Au temps 12, dans l'exemple représenté, il se produit une séparation à peu près complète du sperme X et du sperme Y. A ce point la sédimentation doit être arrêtée et les fractions doivent être separées. Si les fractions ne sont pas séparées au moment voulu, ils se mélangent en se rapprochant du fond de la colonne de sédimentation, comme on le voit au temps 30.

Si l'on utilise une période de durée insuffisante pour la sédimentation, la chute est lente au point qu'il ne se produit qu'une faible séparation entre les fractions de sperme X et de sperme Y. Si l'opération de sédimentation prend plus de 24 heures environ, le milieu lui-même tend à se séparer. 0'est-à-dire que les ions minéraux et d'autres particules lourdes du milieu colloïdal se séparent après des périodes de longue durée. De plus, les particules du milieu précipitent du fluide si une période d'une durée supérieure à 24 heures est utilisée.

Pour obtenir une séparation plus complète des fractions, sans séparation nuisible du milieu, il est préférable que l'opération de sédimentation dure de 9 à 18 heures environ,suivant les types d'animaux et le type de milieu. Pour les humains, une période d'environ 12 heures est optimale pour obtenir une sédimentation appropriée,

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lorsqu'on utilise comme milieu du jaune' d'oeuf.

Suivant le milieu utilisé, il faut une température comprise entre -5,0°C et environ 1,0°C. En dessous de cette gamme de températures, les caractéristiques physiques du milieu sont modifiées dans une mesure telle qu'on n'obtient pas de sédimentation convenable. Pour des températures plus élevées, le sperme tend à nager ou à se déplacer de son propre mouvement à travers le milieu et ne se sépare pas comme des particules inertes tombant librement au cours de l'opération de sédimentation. Par suite, la température préférée pour un milieu constitué par du jaune d'oeuf et de la glycine est de 0,0°C.

Pendant le processus, il faut avoir soin d'éviter toute vibration excessive. Des secousses violentes tendent à déchirer les queues des spermatozoïdes. De plus, pendant l'opération de sédimentation, même des vibrations légères nuisent à la chute du sperme de sorte qu'il ne se comporte pas comme des particules inertes. Par ailleurs, une légère vibration tend à faciliter la sédimentation. Il faut prendre un soin particulier lorsqu'on extrait les fractions d'éviter toute vibration et toute contamination des fractions voisines. Dans ce but, il est avantageux d'effectuer la vidange goutte à goutte, avec environ -une à deux secondes par goutte. Après avoir évacué une fraction, le mélange restant doit pouvoir se décanter pendant une durée au moins aussi longue que la durée ayant été utilisée pour évacuer une fraction. Ainsi, si 45 secondes; sont nécessaires pour extraire une fraction, une seconde periode de 45 secondes doit s'écouler avant d'extraire les fractions suivantes.

Un autre facteur dont il faut tenir compte est qu'il faut éviter la lumière visible. La lumière nuit à la

fertilité du sperme et lui fait perdre son efficacité pour percer l'enveloppe protectrice d'un oeuf. La fertilité peut également être altérée par un pH extrêmement élevé ou extrêmement faible du milieu, (tombant en dehors de la gamme de 6,0 à 6,8 pour la plupart des espèces) par l'âge du sperme et par le nombre de spermatozoïdes motiles.

Les fractions qui peuvent être séparées au cours de l'opération 17 contiennent des quantités variables de sperme X et de sperme Y. Comme représenté sur la figure 3 qui indique d'une façon type les conditions qu'on ohtient en réalité avec chacune des espèces de mammifères mentionnées ici, une séparation à peu près complète du sperme X et du sperme Y est possible et a été obtenue à l'aide du procédé de la présente invention (Voir les exemples particuliers). Ainsi, sur la figure 3 qui se rapporte au sperme humain, la fraction comprise entre 1 et 3 contient à peu près tout le sperme X. La fraction comprise entre 14 et 23 contient à peu près tout le sperme Y. Une fraction efficace pour mettre en oeuvre la présente invention doit comprendre au moins 60 $ soit du sperme X soit du sperme Y (suivant la sélection) afin de surmonter le rapport 50-50 qui existe dans la nature. Pour des applications industrielles, au moins 75 i° du sperme doit être du sexe voulu, si la dépense nécessaire pour mettre en oeuvre le procédé ne doit pas être prohibitive.

De préférence, au moins 90 % du sperme doit être d'un seul type de façon à réduire le risque d'obtenir une descendance du sexe opposé à un taux statistique admissible. Bien entendu, une séparation de 100 % est la plus avantageuse du fait qu'il n'y a aucun risque d'erreur. Une séparation complète assure qu'en cas de conception la des

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cendance sera du sexe voulu, lorsqu'une séparation à peu près complète est réalisée, comme sur la figure 3, chaque fraction est constituée essentiellement par du sperme n'ayant que les chromosomes voulus dans un véhicule.

Un nouvel appareil, spécialement destiné à mettre en oeuvre le procédé décrit ci-dessus est représenté sur les figures de 4 à 6.

Gomme on le voit sur la figure 4? une colonne 21 est utilisée pour effectuer la sédimentation du mélange de sperme et de milieu. Un mécanisme d'alimentation approprié, indiqué en 22, sert à introduire le mélange de milieu et de sperme dans la colonne. La colonne 21 peut être constituée par un cylindre extérieur en verre 23 pourvu d'une fermeture ou bouchon 24 à son extrémité supérieure. L'extrémité inférieure du cylindre 23 peut être supportée par un double bouchon 26 qui sert également de fermeture h une chambre collectrice 27 disposée à l'extrémité inférieure de la colonne.

A l'intérieur du cylindre 23 est disposée une chambre de sédimentation ou burette 28 dans laquelle le mélange est introduit par le mécanisme d'alimentation 22. On a trouvé qu'une burette en verre d'un diamètre de 1,5 cm et d'une longueur de 15 cm est extrêmement satisfaisante. La burette est pourvue à son extrémité inférieure d'un robinet d'arrêt 29 permettant d'évacuer les fractions. Dans le mode de réalisation représenté, les fractions sont vidées dans un bêcher 31. La chambre collectrice 27 sert d'enceinte protégeant l'appareil pendant la vidange des fractions de la burette 28 dans lebécher 31.

Afin d'éviter toute turbulence aux fractions après la sédimentation, la burette 28 est pourvue de parois

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35 s'inclinant progressivement. Les burettes classiques présentent une courbure relativement brusque immédiatement au-dessus du robinet d'arrêt. Une telle structure produit une turbulence et des contre-courants des fractions de sédimentation, ce qui se traduit par une contamination des fractions voisines et le mélange du sperme X avec le sperme Y, La structure perfectionnée qui est représentée sur la figure 4 comporte une burette 28 munie de parois 35 s'inclinant progressivement de façon à éviter tout mélange et toute contamination par turbulence.

De préférence, comme on le voit sur la figure 7? l'ouverture du robinet d'arrêt 29 et la base des parois inclinées 35 ont d'une façon précise le même diamètre, de sorte qu'aucun obstacle ne se présente à l'écoulement dans le robinet d'arrêt. La pente des parois de base 35 de la burette, dans le mode de réalisation préféré, se poursuit à travers le robinet d'arrêt 29, de sorte que la diminution de diamètre est progressive. De cette façon, l'ouverture formée dans le robinet d'arrêt apparaît sous la forme d'un tronc de cône. L'ouverture supérieure du robinet d'arrêt 29 présente de préférence un diamètre qui est le double de celui de l'ouverture inférieure.

Le robinet d'arrêt 29 est pourvu d'une poignée allongée 32 traversant une ouverture 33 formée dans l'enceinte protectrice 27. On peut ainsi manoeuvrer le robinet d'arrêt pendant que le bêcher 31 se trouve à l'intérieur de la chambre 27. Après avoir collecté une fraction séparée dans le bêcher 31» on peut enlever celui-ci de l'enceinte par une ouverture appropriée 34 (figures 4 et 6).

Pour maintenir le mélangé en cours de sédimentation à la basse température nécessaire, une certaine quan

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tité de glace 40 est disposée à l'intérieur du cylindre extérieur 23j autour de la burette 28. Comme on le voit sur les figures 4 et 5, cet agencement assure que le mélange de sperme et de milieu disposé à l'intérieur de la burette 28 est maintenu à la température voulue.

Pour faire fonctionner l'appareil, un mélange pré-refroidi de sperme frais et de milieu est placé dans le mécanisme 22, représenté sous la forme d'une petite pipette, et il est transféré à la burette 28, qui est également remplie de milieu, le sperme, dont la densité est supérieure 'à celle du milieu qui l'entoure, tend à tomber ou à se sédimenter vers le bas en traversant le milieu. Suivant la loi de Stokes, le sperme X qui est plus dense tombe à une vitesse plus élevée que le sperme Y qui est moins dense, ce qui se traduit par le fait qu'il se produit une séparation entre le sperme X et le sperme Y. De faibles fractions du milieu sont vidées de la burette 28 à travers le robinet 29 dans le bêcher 31. Chaque fraction est essayée pour déterminer le nombre de spermatozoïdes afin de trouver des fractions qui contiennent le sperme X et celles qui contiennent le sperme Y.

Comme variante de mode de réalisation, on peut placer sur la burette des moyens servant à mesurer la densité, tels qu'un certain nombre de petits hydromètres, afin de déterminer l'emplacement des différentes fractions qui contiennent le sperme X et le sperme Y à mesure qu'elles se déplacent à travers la colonne. Ce mode de réalisation évite la nécessité de prélever de petites fractions et d'essayer chacune d'elles.

En utilisant du lait ou un corps fluide comme milieu, on peut déterminer l'emplacement des couches sédi-

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mentées sans les vidanger en utilisant une lumière mono-chromatique ou une énergie rayonnante de diverses fréquences afin de mesurer l'opacité du mélange. De cette façon, avec un milieu transparent ou translucide, tel que du lait, on peut placer sur un côté de la colonne une source de lumière et une cellule photoélectrique sur l'autre côté de la colonne (connectée à un amplificateur et à un enregistreur) afin de mesurer l'opacité du mélange et déterminer les points où sont disposées les couches séparées de sperme.

les emplacements d~s couches séparées peuvent également être déterminés en mesurant la conductivité en divers points dans la colonne. Dans ce but, des électrodes multiples sont disposées sur la colonnu afin de déterminer la variation de conductivité du contenu de la colonx"ie en divers points sur sa longueur, la conductivité des couches de sperme séparées est différente de celle du milieu de support,

D'autres moyens pour déterminer l'emplacement des couches de sperme sédimentées comprennent des techniques de microdensitométrie qui servent à mesurer la densité en utilisant une lumière polarisée et des techniques d'examen au microscope qui mesurent la diffusion de la lumière polarisée.

Dans un autre mode de réalisation, on peut remplacer la burette par un tube en gélatine, lorsque la séparation du sperme X et du sperme Y se produit, la température du tube et de son contenu est abaissée par paliers jusqu'à des températures bien inférieures à la congélation, par exemple une température de -20°C et le mélange séparé est congelé sur place, le tube congelé peut alors être découpé en fractions appropriées, à volonté, l'emmagasinage du

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sperme séparé est ainsi possible pendant des périodes de durée relativement longues.

Comme exemple général, servant à illustrer le fonctionnement de l'appareil, on peut préparer un milieu avec quatre parties de jaune d'oeuf et une partie d'une solution de glycine à 4 i» dans de l'eau. De la semence fraîchement collectée est mélangée avec ce milieu de telle sorte qu'on obtient une population de deux à trois cent millions de spermatozoïdes par millimètre et qu'on la laisse se reposer à la température ambiante pendant 15 minutes. La température du mélange est ensuite amenée à 0°C. Ce mélange est placé au sommet d'une colonne de^ilieu se trouvant dans une burette. Le milieu dans la colonne est également à une température de 0°C. Les spermatozoïdes peuvent alors se sédimenter pendant 12 heures, après quoi les fractions sont vidangées. Le nombre de spermatozoïdes contenus par chaque fraction est compté et on trace une courbe du nombre en fonction des fractions.

Exemple 1.

On a collecté de la semence humaine fraîche obtenue par des. rapports et on l'a mélangée avec un milieu formé de quatre parties de jaune d'oeuf et une partie de glycine à 4 La densité du milieu était de 1,0273, la viscosité était de 0,4326 poise et le pH de 6,09, toutes les mesures étant effectuées à 20°C. Le mélange a été absorbé dans la semence pendant une durée de 15 minutes et on l'a placé dans un réfrigérateur à 3°C. Après 8 heures, la température du mélange a été réduite à 0°C 12 heures plus tard, on a placé le mélange dans une colonne remplie du même milieu que celui décrit plus haut, maintenu à 0°C. Toute la colonne a été placée dans un réfrigérateur à 0°C

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pendant 18 heures. Ensuite,on a fait écouler des fractions de 15 gouttes, chaque fraction demandant 45 secondes pour s'écouler avec une période d'attente de 45 secondes entre chaque période d'écoulement. Un échantillon de chaque fraction a été prélevé dans une pipette et il a été dilué 200 fois avec une solution saline à 5 de formai. Les

-J- ~f"

un spermatozoïdes ont été comptés dans hémacytomètre sous mi croscope. Lorsqu'on a déterminé que les fractions de sperme étaient critiques par représentation graphique, on a essayé un second échantillon de la même fraction, et on a fait la moyenne des nombres de spermatozoïdes comptés les deux fois. Les nombres de spermatozoïdes obtenus ont été tracés en fonction des numéros de fractions sur la figure 3. On notera sur la figure 3 qu'on a obtenu deux pointes aux fractions 1 et 19.

Exemple 2.

On a collecté de la semence humaine fraîche obtenue par des rapports et on l'a nié langé ^avec un milieu constitué par quatre parties de jaune d'oeuf et une partie de glycine à 4 dans de l'eau. La densité du milieu était de 1,0239 et le pH de 6,10, tous les deux mesurés à 20°C. Le mélange a été absorbé dans la semence pendant une période d'une durée de 15 minutes et on l'a placé dans un réfrigérateur à 3°C. Après 1C heures, la température était réduite à 0°C 13 heures plus tard, on a placé le mélange dans une colonne contenant le même milieu que celui décrit plus haut, et on l'a maintenu à 0°C. Toute la colonne a été placée dans un réfrigérateur à 0°C. Après sédimentation pendant 9 heures 4-, on a fait écoule:.1 des fractions de 1 5 gouttes. Chaque fraction demandait 45 gouttes pour s'écouler, avec une période d'attente de 45 secondes entre chaque

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période d'écoulement. Un échantillon de chaque fraction a été pi-élevé dans une pipette et on l'a dilué 200 fois avec une solution saline à 5 f° de formai. On a compté les spermatozoïdes dans un hémacytomètre sous microscope. Les nombres critiques de spermatozoïdes ont été mesurés deux fois et on en a fait la moyenne. Les nombres de spermatozoïdes obtenus ont été tracés en fonction des numéros de fractions sur la figure 8. On notera sur la figure 8 qu'on a obtenu deux pointes pour les fractions 15 et 20.

Exemple 5.

On a collecté de la semence de taureau de Here-ford fraîche obtenue par des rapports et on l'a mélangée avec un milieu constitué de quatre parties de jaune d'oeuf et une partie de glycine à 4 i°. La densité à 20°G était de 1,0263. Le mélange a été absorbé dans la semence pendant une durée de 15 minutes et on l'a placé dans un réfrigérateur à 0°0 pendant 7 heures et demie. Ensuite, le mélange a été placé dans une colonne contenant le même milieu que celui décrit plus haut et il a été maintenu à 0°C. Toute la colonne a été placée dans un réfrigérateur à -0,5°C pendant 11 heures et demie. On a suivi le même mode opératoire d'écoulement et de comptage des spermatozoïdes que ceux qui ont été décrits dans les exemples 1 et 2. Les nombres de spermatozoïdes obtenus ont été tracés en fonction des numéros de fractions sur la figure 9. On notera sur la figure 9 qu'on a obtenu deux pointes aux fractions 1 et 20.

Exemple 4.

On a collecté de la semence de taureau de Jersey fraîche obtenue par des rapports et on l'a mélangée avec le même milieu que celui utilisé dans les exemples précé

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dents. La densité était de 1,0283, la viscosité de 0,430, et le pH de 6,1, toutes les mesures étant effectuées à 20°C. Le mélange a été absorbé dans la semence pendant une durée de 15 minutes et on l'a placé dans un réfrigérateur pendant 5 heures à une température de 0°C. Ensuite, on a placé le mélange dans une colonne contenant le même milieu que celui décrit plus haut et on l'a maintenu à 0°C. Toute la colonne a été placée dans un réfrigérateur à 0°C pendant 12 heures Après sédimentation, on a suivi le même mode opératoire d'écoulement et de mesure que ceux décrits dans les exemples précédents. Les nombres de spermatozoïdes obtenus ont été tracés en fonction des numéros de fraction sur la figure 10. On notera sur la figure 10 qu'on a obtenu deux pointes pour les fractions 1 et 18.

Les exemples précédents concernant les taureaux il-luatrjnt la tochniquë de séparation et on a déterminé qu'elle donnait plus de 60 fi de descendance d'un seul sexe lorsqu'elle est inséminée artificiellement en utilisant des techniques classiques.

Bien que la sédimentation soit décrite ici comme un mode de réalisation particulier de la présente invention, on voit que la séparation du sperme Y plus petit et moins dense du sperme X plus gros et plus dense peut être effectuée par n'importe quel moyen approprié. Ainsi, en appliquant une force plus importante que la pesanteur, (ou s'exerçant dans une direction différente), dans des conditions appropriées, on obtient une séparation suivant les dimensions et la forme des particules. On peut utiliser par exemple une centrifugeuse pour appliquer une force supérieure à la pesanteur. De plus, dans certains milieux, le sperme X et le sperme Y présentent des taux de flotta-

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tion différents, à la différence des taux de sédimentation et peuvent être séparés de cette façon. En fait, en choisissant un milieu d'une densité inférieure à la densité moyenne du sperme X et supérieure à la densité moyenne du sperme Y, on peut faire élever le sperme Y et on peut faire tomber le sperme X. En absorbant sélectivement des substances appropriées, on peut accroître la flottation positive, de la même façon que l'absorption sélective de glycine, par exemple, fait augmenter la flottation négative.

L'appareil permet la sédimentation de mélanges de spermes de sorte que le sperme X qui est plus dense tombe à une vitesse plus élevée que le sperme Y qui est moins dense et par suite s'en sépare. Le procédé permet d'obtenir une séparation à peu près complète des types de sperme en deux compositions nouvelles. Le choix de la composition appropriée permet de commander le sexe de la descendance produite à partir de cette composition,

O

Claims (34)

-25- - RESUME -A) - Procède pour séparer du sperme X du sperme Y, suivant des différences phénotypes, caractérisé par les points suivants séparément ou en combinaisons ;

1) Il consiste à mélanger du sperme frais avec un milieu nutritif visqueux perméable au sperme et à séparer le mélange en deux fractions, une fraction contenant tout le sperme X et une fraction contenant tout le sperme Y.

2) Oe sperme est du sperme humain.

3) Le sperme est du sperme de primates, de bétail:, de porc, de mouton, de lapin, de chat, de bufle, de chèvre et de cheval.

4) Le milieu nutritif visqueux, perméable au sperme contient au moins un élément tel que du jaune d'oeuf, de la dextrine, du lait de mammifère entier, du lait sec de mammifère, de la crème de noix de coco, du jus de tomate, du glycérol, du glucose, du fructose, de 1a, lecithine, un acide aminé, des fluides de corps vivants et des extraits de tissus.

5) Le milieu est constitué par un mélange d'un monosaccharide et d'un acide aminé.

6) Ce milieu est constitué par un mélange de jaune d'oeuf et de glycine.

7) Le milieu est constitué par un mélange de dextrine, de lécithine et d'acides aminés.

8) Le milieu est un fluide du corps.

9) Le milieu présente un pH compris entre 6,0 et 6,8 à 20°C, et une pression osmotique comprise entre 270 et 330 mm de mercure.

10) La séparation s'effectue en disposant le mélange de sperme et de milieu dans une colonne remplie

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avec du milieu, en laissant le sperme X et le sperme Y tomber à travers la colonne jusqu'à un point où le sperme X plus dense est à peu près complètement séparé du sperme Y moins dense, et à soutirer les fractions séparées de la colonne.

11) le sperme X est complètement séparé du sperme Y.

12) les fractions séparées sent congelées à l'intérieur d'une colonne, et la colonne congelée est découpée en fractions contenant du sperme du sexe voulu.

13) Après l'opération consistant à mélanger du sperme humain frais avec un milieu nutritif, on laisse absorber le milieu par le sperme, après quoi le mélange est refroidi jusqu'à une température inférieure à 1°C.

14) l'opération de séparation sépare au moins

60 fo du sperme comportant des chromosomes d'un sexe déterminé du sperme restant.

15) Au moins 75 f° du sperme d'un sexe déterminé se trouve séparé.

16) Au moins 90 $ du sperme d'un sexe déterminé se trouve séparé.

17) le milieu présente une densité comprise en-

■z tre 1,02 et 1,09 g par cm et une viscosité comprise entre 0,02 et 1,2 poise en les mesurant à 20°C.

18) le milieu présente une densité supérieure à 1,026 g par cm et une viscosité inférieure à 1,0 poise, les mesures étant effectuées à 20°C.

19) le sperme séparé contenant les chromosomes voulus est inséminé artificiellement sur une femelle de façon à concevoir une descendance du sexe voulu.

20) le mélange de milieu et de sperme est re-

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froidi et la séparation s'effectue en appliquant une force de flottation au sperme de façon à faire atteindre par le sperme le plus dense un niveau différent dans le milieu de celui qui est atteint par le sperme moins dense et tout le sperme X est séparé du sperme Y à l'intérieur du milieu, les fractions séparées contenant le sperme le plus dense étant séparées de celles contenant le sperme le moins dense, une femelle étant inséminée artificiellement avec le sperme contenant les chromosomes du sexe voulu, de façon à concevoir une descendance du sexe voulu.

21) La force de flottation est appliquée en laissant le sperme se sédimenter sous l'action de la pesanteur.

22) Le milieu nutritif présente une viscosité inférieure à 1,0 poise, une densité supérieure à 1,026 g par cnr' environ, un pH compris entre 6,0 et 6,8 (cette viscosité, cette densité et ce pH étant mesurés à 20°C), la température du mélange étant abaissée progressivement jusqu'à une température comprise entre -5°C et environ +1,0°C,en maintenant le sperme Y en suspension dans la fraction supérieure du milieu, tout en laissant le sperme X tomber dans une fraction inférieure du milieu pendant une période d'une durée comprise entre 1 à 24 heures environ, avant de séparer les fractions du milieu contenant le sperme X de celles quj/contiennent le sperme Y.

23) La pression osmotique du milieu nutritif est comprise entre 270 et 300 mm de mercure, l'opération consistant à abaisser la température s'effectuant pendant une période d'une durée comprise entre 1 et 300 minutes, et la séparation s'effectuant dans une colonne remplie avec le milieu maintenu à une température inférieure à 1,0°C, le

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sperme X et le sperme Y tombant à travers le milieu dans la colonne pendant une durée comprise entre 1 à 24 heures environ, après quoi les fractions séparées sont soutirées de la colonne.

24) le milieu nutritif est absorbé dans le sperme proportionnellement à la quantité de chromosomes qui existent dans ce sperme..

B) - Composition de matière résultant du procédé précédent, caractérisée par les points suivants séparément ou en combinaisons ;

25) Elle est constituée essentiellement par du sperme comportant des chromosomes X dans un milieu nutritif.

26) Elle est constituée essentiellement par du sperme comportant des chromosomes Y dans un milieu nutritif.

27) Elle est constituée par du sperme X humain dont la densité a été accrue artificiellement dans un milieu nutritif.

28) Elle est constituée par du sperme Y humain dont la densité a été accrue artificiellement dans un milieu nutritif.

29) Elle est constituée par du sperme humain dans un milieu nutritif, au moins 60 fo de ce sperme comportant des chromosomes X.

30) Elle est constituée par du sperme X et par du sperme Y dans un milieu nutritif, au moins 75 du sperme X étant séparé du sperme Y dans ce milieu.

31) Ce sperme est du sperme provenant d'un primate.

32) Ce sperme est constitué par du sperme du bétail, de porc, de mouton, de lapin, de chèvi-e, de chat, de bufle et de chevaux.

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33) Au moins 90 fo de ce sperme comporte des chromosomes d'un seul sexe.

34) Le milieu présente une viscosité inférieuro à 1,0 poise, une densité supérieure à 1,026 g par cm

(cette viscosité et cette densité étant mesurées à 20°C),

un pH compris entre 6,0 et 6,8 et une température inférieure à 1,0°0 environ. ,

0) - Appareil permettant de mettre en oeuvre le procédé précédent pour séparer du sperme X du sperme Y, comprenant un récipient destiné au mélange de sperme, un moyen de refroidissement adjacent à ce récipient, un moyen servant à introduire le mélange de sperme dans ce récipient, caractérisé en ce que le récipient est constitué par un cylindre dont le diamètre diminue progressivement à son extrémité inférieure, un robinet disposé en dessous de ce récipient et présentant une ouverture de diamètre diminuant progressivement afin d'enlever progressivement des parties de ce mélange de sperme, le diamètre minimum du récipient étant sensiblement le même que le diamètre maximum de l'ouverture du robinet, un moyen protecteur entourant ce robinet et espacé de celui-ci pour éviter la contamination du mélange qui est enlevé du ]

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