MD3322717T2 - Noi peptide și combinație de peptide pentru utilizare în imunoterapie împotriva cancerului ovarian epitelial și a altor cancere - Google Patents

Noi peptide și combinație de peptide pentru utilizare în imunoterapie împotriva cancerului ovarian epitelial și a altor cancere Download PDF

Info

Publication number
MD3322717T2
MD3322717T2 MDE20180524T MDE20180524T MD3322717T2 MD 3322717 T2 MD3322717 T2 MD 3322717T2 MD E20180524 T MDE20180524 T MD E20180524T MD E20180524 T MDE20180524 T MD E20180524T MD 3322717 T2 MD3322717 T2 MD 3322717T2
Authority
MD
Moldova
Prior art keywords
peptide
cell
cells
cancer
ovca
Prior art date
Application number
MDE20180524T
Other languages
English (en)
Inventor
Heiko Schuster
Janet Peper
Philipp Wagner
Hans-Georg Rammensee
Original Assignee
Immatics Biotechnologies Gmbh
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Immatics Biotechnologies Gmbh filed Critical Immatics Biotechnologies Gmbh
Publication of MD3322717T2 publication Critical patent/MD3322717T2/ro

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4748—Tumour specific antigens; Tumour rejection antigen precursors [TRAP], e.g. MAGE
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/17—Lymphocytes; B-cells; T-cells; Natural killer cells; Interferon-activated or cytokine-activated lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/10—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K40/11—T-cells, e.g. tumour infiltrating lymphocytes [TIL] or regulatory T [Treg] cells; Lymphokine-activated killer [LAK] cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/40—Cellular immunotherapy characterised by antigens that are targeted or presented by cells of the immune system
    • A61K40/41—Vertebrate antigens
    • A61K40/42—Cancer antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/40—Cellular immunotherapy characterised by antigens that are targeted or presented by cells of the immune system
    • A61K40/41—Vertebrate antigens
    • A61K40/42—Cancer antigens
    • A61K40/4254—Adhesion molecules, e.g. NRCAM, EpCAM or cadherins
    • A61K40/4255—Mesothelin [MSLN]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/40—Cellular immunotherapy characterised by antigens that are targeted or presented by cells of the immune system
    • A61K40/41—Vertebrate antigens
    • A61K40/42—Cancer antigens
    • A61K40/4256—Tumor associated carbohydrates
    • A61K40/4257—Mucins, e.g. MUC-1
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4727—Mucins, e.g. human intestinal mucin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70539—MHC-molecules, e.g. HLA-molecules
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2833—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against MHC-molecules, e.g. HLA-molecules
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/115—Aptamers, i.e. nucleic acids binding a target molecule specifically and with high affinity without hybridising therewith ; Nucleic acids binding to non-nucleic acids, e.g. aptamers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6881—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for tissue or cell typing, e.g. human leukocyte antigen [HLA] probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/575—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/5758—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumours, cancers or neoplasias, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides or metabolites
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/515—Animal cells
    • A61K2039/5158—Antigen-pulsed cells, e.g. T-cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2121/00—Preparations for use in therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K40/00
    • A61K2239/46—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K40/00 characterised by the cancer treated
    • A61K2239/59—Reproductive system, e.g. uterus, ovaries, cervix or testes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2300/00—Mixtures or combinations of active ingredients, wherein at least one active ingredient is fully defined in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/16—Aptamers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/136—Screening for pharmacological compounds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/70503—Immunoglobulin superfamily, e.g. VCAMs, PECAM, LFA-3
    • G01N2333/70539—MHC-molecules, e.g. HLA-molecules
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/04—Screening involving studying the effect of compounds C directly on molecule A (e.g. C are potential ligands for a receptor A, or potential substrates for an enzyme A)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)

Abstract

Prezenta invenţie se referă la o peptidă, proteine, acizi nucleici şi celule pentru utilizare în metode imunoterapeutice. În particular, prezenta invenţie se referă la imunoterapia cancerului. În plus, prezenta invenţie se referă la un epitop peptidic al celulelor T citotoxice asociate tumorii, singuri sau asociaţi cu alte peptide asociate tumorii, care pot servi, de exemplu, drept componente farmaceutice active ale formulelor de vaccin care stimulează răspunsurile imunitare antitumorale sau pentru stimularea celulelor T ex vivo şi transferarea la pacienţi. Peptidele legate de molecule ale complexului major de histocompatibilitate (MHC), sau peptidele ca atare, pot fi, de asemenea, ţinte ale anticorpilor, ale receptorilor solubili ai celulelor T şi ale altor molecule de legare.

Description

Prezenta invenţie se referă la o peptidă, proteine, acizi nucleici şi celule pentru utilizare în metode imunoterapeutice. În particular, prezenta invenţie se referă la imunoterapia cancerului. În plus, prezenta invenţie se referă la un epitop peptidic al celulelor T citotoxice asociate tumorii, singuri sau asociaţi cu alte peptide asociate tumorii, care pot servi, de exemplu, drept componente farmaceutice active ale formulelor de vaccin care stimulează răspunsurile imunitare antitumorale sau pentru stimularea celulelor T ex vivo şi transferarea la pacienţi. Peptidele legate de molecule ale complexului major de histocompatibilitate (MHC), sau peptidele ca atare, pot fi, de asemenea, ţinte ale anticorpilor, ale receptorilor solubili ai celulelor T şi ale altor molecule de legare.
Prezenta invenţie se referă la o peptidă derivată din molecule HLA de clasă I ale celulelor tumorale umane care se pot folosi în formule de vaccin pentru inducerea de răspunsuri imunitar antitumorale sau drept ţinte pentru dezvoltarea de compuşi sau celule active din punct de vedere farmaceuticIimunologic.
FUNDAMENTELE INVENŢIEI
Cancerul ovarian epitelial (EOC) rămâne principala cauză de deces datorată malignităţilor ginecologice şi a cincea principală cauză de deces legată de cancer în lumea occidentală, cauzând în jur de 22.000 de diagnostice noi şi 14.000 de decese în SUA în 2014 (1). Singura opţiune de tratament curativ disponibil este îndepărtarea completă a tumorii chirurgicale într-un stadiu timpuriu non-metastatic. Cu toate acestea, majoritatea pacienţilor (>70%) sunt diagnosticaţi cu boală în stadiul III sau IV cauzată de lipsa simptomelor precoce specifice. În ciuda progresului în regimurile de chimioterapie şi aprobarea recentă a bevacizumabului pentru terapia de primă linie, majoritatea pacienţilor recidivează în interval de câteva luni sau ani după tratamentul iniţial (2, 3).
Având în vedere efectele secundare severe şi cheltuielile asociate cu tratarea cancerului, este necesară identificarea factorilor care pot fi folosiţi în tratamentul cancerului în general şi al cancerului de prostată în special.
Imunoterapia cancerului reprezintă o opţiune de ţintire specifică a celulelor canceroase concomitent cu minimizarea efectelor secundare. Imunoterapia cancerului foloseşte existenţa antigenilor asociaţi tumorii. Clasificarea curentă a antigenilor asociaţi tumorii (TAA) cuprinde următoarele grupuri principale:
a) Antigeni pentru cancer testicular: Primele TAA identificate vreodată care se pot recunoaşte de către celulele T aparţin acestei clase, denumite iniţial antigeni de cancer testicular (CT) deoarece expresia membrilor clasei se face în diferite tipuri histologice de tumori umane şi, în ţesuturile naturale, are loc numai în spermatocite/spermatogoniile din testicul şi, ocazional, din placentă. Deoarece celulele testiculare nu exprimă molecule HLA de clasă I şi II, aceşti antigeni nu pot fi recunoscuţi de celulele T în ţesuturi normale şi prin urmare pot fi consideraţi specifici tumorii din punct de vedere imunologic specifice tumorii. Exemple bine cunoscute de antigeni CT sunt membrii familiei MAGE şi NY-ESO-1. b) Antigeni de diferenţiere: Aceste TAA sunt comune tumorilor şi ţesutului normal din care provin tumorile. Majoritatea antigenilor de diferenţiere cunoscuţi sunt identificaţi în melanoame şi melanocite normale. Multe dintre aceste proteine corelate cu linia melanocitară sunt implicate în biosinteza melaninei şi prin urmare nu sunt specifice tumorii, dar sunt totuşi folosite pe scală largă pentru imunoterapia cancerului. Exemplele includ, fără a se limita la, tirozinază şi Melan-A/MART-1 pentru melanom sau PSA pentru cancer prostatic. c) TAA-uri supraexprimate: Genele care codifică TAA-uri larg exprimate au fost depistate în tipuri histologice diferite de tumori precum şi în multe ţesuturi normale, în general cu nivele reduse de expresie. Este posibil ca mulţi dintre epitopii procesaţi şi posibil prezentaţi de ţesuturile normale să fie sub nivelul prag pentru recunoaşterea de către celulele T, în timp ce supraexprimarea lor în celulele tumorale poate declanşa un răspuns anticanceros prin încălcarea toleranţei anterior stabilite. Exemplele cunoscute pentru această clasă de TAA-uri sunt Her-2/neu, survivina, telomeraza sau WT1. d) Antigeni specifici tumorii: Aceste TAA unice apar din mutaţii ale genelor normale (cum ar fi β-catenina, CDK4 etc.). Unele dintre aceste modificări moleculare sunt asociate cu transformări neoplazice şi/sau progresie. Antigenii specifici tumorii sunt în general capabile să inducă un răspuns imunitar puternic fără a purta riscul unor reacţii autoimune împotriva ţesuturilor normale. Pe de altă parte aceste TAA sunt în majoritatea cazurilor relevante numai tumorii exacte din care au fost identificate şi de obicei nu sunt comune mai multor tipuri individuale de tumori. Specificitatea (sau asocierea) cu tumoarea a unei peptide poate apărea, de asemenea, dacă peptida provine dintr-un exon din tumoare (asociat tumorii) în cazul izoformelor specifice tumorii (asociate tumorii). e) TAA care apar prin modificări anormale post-translaţie: aceste TAA apar din proteine care nu sunt nici specifice, nici supra-exprimate în tumori, dar care devin totuşi asociate tumorii prin procese post-translaţionale active în mod principal în tumori. Exemplele pentru aceste clase apar din tipare de glicozilare alterată, care duc la epitopi noi în tumori cum ar fi pentru MUC1 sau evenimente de tip scindarea proteinei in timpul degradării, care pot sau nu să fie specifice tumorii. f) Proteine oncovirale: aceste TAA sunt proteine virale care pot juca un rol critic în procesul oncogen şi acestea, deoarece sunt străine (nu au origine umană) pot evoca un răspuns al celulelor T. Exemple de astfel de proteine sunt proteinele papilomavirusului uman de tip 16, E6 si E7, care sunt exprimate in carcinomul cervical. În ultimele două decenii, pe baza unor constatări clinice diverse, EOC a fost recunoscut drept o tumoare extrem de imunogenă. Prezentând o frecventă infiltrare a celulelor imune, EOC a fost printre primele tipuri de cancer unde s-a putut stabili o asociere definitivă a infiltrării celulelor T şi a prognosticului clinic. În cadrul acestor populaţii de celule T infiltrante au fost identificate celule T reactive la tumoare şi specifice antigenului. În contrast, celulele T reglatoare rezidente în tumori (Treg-uri) sunt corelate negativ cu rezultatul clinic. Mai mult, s-a dovedit că citokinele stimulatoare imune au indus răspunsuri tumorale convingătoare la pacienţi individuali. Eficacitatea abordărilor imunoterapeutice pentru terapia cancerului a fost ilustrată de dezvoltarea şi recentă şi aprobarea inhibitorilor de punct de control imun arătaţi în tratamentul melanomului. Mai mult decât atât, vaccinarea peptidică specifică antigenului şi transferul de celule T adoptive încep să arate succes în melanom şi în alte tumori imunogene, de exemplu carcinomul cu celule renale. Imunoterapia personalizată are chiar un potenţial curativ şi au fost prezentate rezultate uimitoare pentru pacienţi individuali. Imunoterapia bazată pe celule T vizează epitopi peptidici derivaţi din proteine asociate tumorii sau specifice tumori, care sunt prezentate de molecule ale complexului major de histocompatibilitate (MHC). Antigenii care sunt recunoscuţi de limfocitele T specifice tumorii, epitopii acestora, pot fi molecule derivate din toate categoriile de proteine, cum ar fi enzimele, receptorii, factorii de transcriere etc. care sunt exprimate şi care, comparativ cu celulele nemodificate cu aceeaşi origine, sunt, de obicei, suprareglate în celulele respectivei tumori. Există două clase de molecule MHC, MHC de clasă I şi MHC de clasă II. Moleculele MHC de clasă I sunt compuse dintr-un lanţ greu alfa şi din beta-2-microglobuline, molecule MHC de clasă II ale unui lanţ alfa şi ale unui lanţ beta. Conformaţia lor tridimensională prezintă o incizură de legare care este folosită pentru interacţiuni necovalente cu peptide. Moleculele MHC de clasă I pot fi găsite pe majoritatea celulelor nucleate. MHC de clasă I prezintă peptide care rezultă din clivajul proteolitic al proteinelor predominant endogene, produse ribozomale defecte (DRIP) şi peptide mai mari. Totuşi, proteinele derivate din compartimentele endozomale sau surse exogene se regăsesc frecvent pe moleculele MHC de clasă I. Această modalitate non-clasică de prezentare a clasei I este cunoscută în literatura de specialitate ca „prezentare încrucişată» (Brossart şi Bevan, 1997; Rock et al., 1990). Moleculele MHC de clasă II se pot găsi numai pe celulele „profesioniste» prezentatoare de antigen (APC) şi prezintă iniţial peptidele unor proteine exogene sau transmembranare captate de APC-uri, de exemplu în timpul endocitozei, şi care sunt procesate ulterior. Complexele de peptidă şi MHC de clasă I sunt recunoscute de celule T CD8-pozitive purtătoare de receptor de celule T (TCR) adecvat, în timp ce complexele de peptidă şi molecule MCH de clasă II sunt recunoscute de celule T helper CD4-pozitive cu TCR-ul adecvat. Este bine cunoscut că TCR, peptida şi MHC sunt prezente în raport stoechiometric 1:1:1. Celulele T pozitive pentru CD4 joacă un rol important în inducerea şi susţinerea răspunsurilor efective de către celulele T citotoxice pozitive pentru CD8. Identificarea epitopilor celulelor T CD4-pozitive derivate din antigenii asociaţi tumorilor (TAA) are o mare importanţă pentru dezvoltarea de produse farmaceutice care declanşează răspunsuri imunitare antitumorale (Gnjatic et al., 2003). La locul tumorii, celulele T helper susţin un mediu citokinic favorabil celulelor T (CTL-favorabil) (Mortara et al., 2006) şi atrag celulele efectoare, de exemplu CTL-uri, celule natural killer (NK), macrofage şi granulocite (Hwang et al., 2007). În absenţa inflamaţiei, exprimarea moleculelor MHC de clasă II este limitată în principal la celulele sistemului imunitar, în special la celulele profesioniste prezentatoare de antigen (APC) cum ar fi monocitele, celulele derivate din monocite, macrofagele sau celulele dendritice. La pacienţii cu cancer, celulele tumorale au fost identificate că exprimă molecule MHC de clasă II (Dengjel et al., 2006). Peptidele alungite (mai lungi) pot acţiona ca epitopi activi ai MHC de clasă II. Celulele T helper, activate de epitopii MHC de clasă II, joacă un rol important în modularea rolului efector al CTL în imunitatea antitumorală. Epitopii celulelor T care declanşează un răspuns din partea celulelor T helper de tip TH1 susţin funcţiile efectorii ale celulelor T killer CD8, care includ funcţii citotoxice îndreptate împotriva celulelor tumorale care prezintă pe suprafaţa celulară complexe MHC/peptide asociate tumorii. Astfel epitopii peptidei unei celule T helper asociate tumorii, singur sau asociat cu alte peptide asociate tumorii, poate servi ca ingredient farmaceutic activ al formulelor de vaccin care ar stimula răspunsul imunitar antitumoral. S-a demonstrat pe modele animale ()(mamifere), de exemplu şoarece, că chiar şi în absenţa limfocitelor T CD8 pozitive, celulele T CD4-pozitive sunt suficiente pentru inhibarea manifestărilor tumorale prin inhibarea angiogenezei prin sinteza de interferon gamma (IFNγ) (Beatty şi Paterson, 2001; Mumberg et al., 1999). Există dovezi pentru celule T CD4 ca efectori antitumorali direcţi (Braumuller et al., 2013; Tran et al., 2014). Deoarece exprimarea constitutivă a moleculelor HLA de clasă II este, de obicei, limitată la celulele imune, posibilitatea de izolare a peptidelor de clasă II direct din tumori primare nu a fost considerată anterior posibilă. Totuşi, Dengjel et al. au reuşit să identifice un număr de epitopi MHC de clasă II direct din tumori (WO 2007/028574, EP 1 760 088 B1). Deoarece ambele tipuri de răspuns, CD8 şi CD4 dependente, contribuie împreună şi sinergic la efectul antitumoral, identificarea şi caracterizarea antigenilor asociaţi tumorii recunoscuţi de celule T CD8+ (ligand: moleculă MHC de clasă I + epitop peptidă) sau celule T helper CD4-pozitive (ligand: moleculă MHC de clasă II + epitop peptidă) este important în dezvoltarea de vaccinuri tumorale. Pentru ca o peptidă MHC de clasă II să declanşeze (inducă) un răspuns imunitar celular, trebuie, de asemenea, să se lege de o moleculă MHC. Acest proces depinde de alelele moleculei MHC şi de polimorfismele specifice ale secvenţei de aminoacizi ai peptidei. Peptidele care leagă MHC de clasă I au de obicei o lungime de 8-12 resturi de aminoacizi şi conţin două resturi conservate („ancore») în secvenţa acestora, care interacţionează cu incizura de legare corespunzătoare a moleculei MHC. Astfel, fiecare alelă MHC are un „motiv de legare» care determină ce peptide se pot lega specific de incizura de legare. În cazul reacţiile imunitare dependente de MHC de clasă I, peptidele nu numai că se pot lega de anumite molecule MHC de clasă I exprimate de celulele tumorale, dar trebuie să fie şi recunoscute ulterior de celulele T care prezintă receptori specifici pentru celulele T (TCR). Pentru ca proteinele să fie recunoscute de limfocitele T ca antigeni specifici tumorii sau asociaţi tumorii, şi pentru a putea fi utilizate în terapie, trebuie îndeplinite anumite condiţii prealabile. Antigenul trebuie să fie exprimat preponderent în celulele tumorale, şi deloc sau nici măcar în cantităţi mici în ţesuturile sănătoase. Într-o realizare preferată, peptida trebuie să fie supraprezentată de celulele tumorale comparativ cu ţesuturile sănătoase normale. Este, de asemenea, de dorit ca respectivul antigen să nu fie prezent într-un singur tip de tumoare, şi să fie prezent în concentraţii mari (de exemplu, număr de copii per celulă pentru respectiva peptidă). Antigenii specifici tumorii şi asociaţi tumorii sunt adesea derivate din proteine implicate direct în transformarea unei celule normale într-o celulă tumorale datorită funcţiei lor, de exemplu, în controlul ciclului celular sau suprimarea apoptozei. Suplimentar, ţintele din aval pentru proteinele care cauzează direct transformarea pot fi reglate în sens crescător şi prin urmare pot fi asociate indirect tumorii. Aceşti antigeni asociaţi indirect tumorii pot fi de asemenea ţinta unei abordări de tip vaccinare (Singh-Jasuja et al., 2004). Este esenţială prezenţa epitopilor în secvenţa de aminoacizi a antigenului pentru a se asigura faptul că o astfel de peptidă („peptidă imunogenă»), fiind derivată dintr-un antigen asociat tumorii, duce la un răspuns in vitro sau in vivo al celulelor T. În principiu, orice peptidă care se poate lega de o moleculă MHC poate funcţiona ca epitop al celulei T. Cerinţa prealabilă pentru inducerea unui răspuns al celulelor T, in vitro sau in vivo, este prezenţa unei celule având TCR corespunzător şi absenţa toleranţei imunologice pentru acest anumit epitop. Prin urmare, TAA sunt un punct de plecare pentru dezvoltarea unei terapii bazate pe celule T, incluzând, însă nelimitându-se la vaccinuri tumorale. Metodele pentru identificarea şi caracterizarea TAA sunt bazate, de obicei, pe utilizarea de celule T care se pot izola de la pacienţi sau subiecţi sănătoşi sau sunt bazate pe generarea de profiluri diferenţiate sau tipare de exprimare diferenţiate pentru peptide între tumori şi ţesuturi normale. Cu toate acestea, identificarea genelor supraexprimate în ţesuturi tumorale sau linii celulare tumorale umane sau exprimate selectiv în astfel de ţesuturi sau linii celulare nu asigură informaţii precise asupra utilizării antigenilor care se transcriu din aceste gene într-un tratament imunitar. Aceasta deoarece numai o subpopulaţie individuală de epitopi ai acestor antigeni este adecvată pentru o astfel de aplicaţie deoarece o linie de celule T cu TCR corespunzător trebuie să fie prezentă iar toleranţa imunologică pentru acest anumit epitop trebuie să fie absentă sau minimală. Într-o concretizare foarte preferată a invenţiei este, deci, important să se selecteze numai acele peptide prezentate peste sau selectiv împotriva cărora se poate găsi o celulă T funcţională şi/sau proliferantă. Astfel de celule T funcţionale sunt definite ca celule T care, la stimularea cu un anumit antigen, pot fi extinse clonal şi pot executa funcţii efector („celule T efectoare»). Peruzzi et al. (in; Peruzzi, D., et al., MMP11: A Novel Target Antigen for Cancer Immunotherapy. Clin Cancer Res June 15 2009 (15) (12) 4104-4113) descrie o peptidă antigenică asociată tumorii (TAA) (TUMAP) care constă din secvenţa de aminoacizi 237-YTFRYPLSL-245 derivată din MMP-11 (stromelysin-3). În cazul ţintirii peptidei-MHC de către TCR-uri specifice (de exemplu, TCR solubile) şi anticorpi în conformitate cu invenţia, imunogenitatea peptidelor subiacente este secundară. În aceste cazuri, prezentarea este factorul determinant.
REZUMATUL INVENŢIEI
Într-un prim aspect, prezenta invenţie se referă la o peptidă constând din secvenţa aminoacidică în conformitate cu SEQ ID NO 82 sau o sare acceptabilă farmaceutic a acesteia.
Tabelele următoare prezintă peptidele aşa cum sunt ele prezentate, valorile lor SEQ ID NO respective şi genele-sursă (subiacente) prospective pentru aceste peptide. SEQ ID NO: 82 este în conformitate cu invenţia. Toate peptidele din Tabelul 1 şi Tabelul 2 se leagă la HLA-A*02. Peptidele din Tabelul 2 au fost descrise anterior în liste mari ca rezultate ale screeningurilor cu debit mare cu rate de eroare mari sau calculate folosindu-se algoritmi, dar nu au fost deloc asociate anterior cu cancerul. Peptidele din Tabelul 3 sunt peptide suplimentare care pot fi utile în combinaţie cu celelalte peptide descrise. Peptidele din Tabelul 4 sunt, de asemenea, utile în diagnosticul şi/sau tratamentul diferitelor alte malignităţi care implică o supraexprimare sau o supraprezentare a polipeptidei respective.
Tabelul 1: Peptide în conformitate cu descrierea; X = S, R sau G
SEQ ID NO Secvenţă Genă Legare HLA 1 QFITSTNTF MUC16 A*24:02 2 STETSTVLY MUC16 A*01 3 AHSKITTAM MUC16 B*39:01 4 AVKTETSTSER MUC16 A*31:01 5 AVTNVRTSI MUC16 B*13 6 DALTPLVTI MUC16 B*5101 7 DALVLKTV MUC16 B*51 8 DPYKATSAV MUC16 B*51 9 EPETTTSFITY MUC16 B*35 10 ERSPVIQTL MUC16 B*39:01 11 ETILTFHAF MUC16 A*25 12 EVISSRGTSM MUC16 A*25 13 EVITSSRTTI MUC16 A*25 14 EVTSSGRTSI MUC16 A*25 15 FPEKTTHSF MUC16 B*35 16 FPHSEETTTM MUC16 B*35 17 FPHSEITTL MUC16 B*35 18 FQRQGQTAL MUC16 B*15:01 19 GDVPRPSSL MUC16 B*08:01 20 GHESHSPAL MUC16 B*39:01 21 GHTTVSTSM MUC16 B*39:01 22 GTHSPVTQR MUC16 A*31:01 23 GTSGTPVSK MUC16 A*11 24 HPDPQSPGL MUC16 B*35 25 IPRVFTSSI MUC16 B*51 26 ISDEVVTRL MUC16 C*05 27 ISIGTIPRI MUC16 B*15:17 28 ISKEDVTSI MUC16 B*15:17 29 ITETSAVLY MUC16 A*01 30 ITRLPTSSI MUC16 B*15:17 31 KDTAHTEAM MUC16 B*44:02 32 KEDSTALVM MUC16 B*40/B*44 33 KEVTSSSSVL MUC16 B*40/B*44/? 34 LPHSEITTL MUC16 B*35 35 LTISTHKTI MUC16 B*15:17 36 LTKSEERTI MUC16 B*15:17 37 RDSLYVNGF MUC16 B*44:02 38 RETSTSQKI MUC16 B*18:01 39 RSSGVTFSR MUC16 A*31:01 40 SAFESHSTV MUC16 B*51 41 SATERSASL MUC16 C*03/? 42 SENSETTAL MUC16 B*40/B*44/? 43 SEQRTSPSL MUC16 ? 44 SESPSTIKL MUC16 B*40/? 45 SPAGEAHSL MUC16 B*07/B*56 46 SPAGEAHSLLA MUC16 B*56:01 47 SPHPVSTTF MUC16 B*07:02 48 SPHPVTALL MUC16 B*07:02 49 SPLFQRSSL MUC16 B*0702 50 SPQNLRNTL MUC16 B*35/B*07:02 51 SPRLNTQGNTAL MUC16 B*07:02 52 SPSEAITRL MUC16 B*07:02 53 SPSKAFASL MUC16 B*35/B*07:02 54 SPSSPTPKV MUC16 B*07:02 55 SPSSQAPVL MUC16 B*07:02 56 SQGFSHSQM MUC16 B*15:01 57 SRTEVISSR MUC16 B*27 58 SSAVSTTTI MUC16 B*15:17 59 SSPLRVTSL MUC16 n/a 60 STASSSLSK MUC16 A*11 61 STQRVTTSM MUC16 B*07? 62 STSQEIHSATK MUC16 A*11 63 SVLADLVTTK MUC16 A*03:01 64 SVPDILSTSW MUC16 A*24:02 65 TAGPTTHQF MUC16 C*03 66 TEISSSRTSI MUC16 B*49:01 67 TENTGKEKL MUC16 B*40/B*44 68 TETEAIHVF MUC16 B*18 69 TEVSRTEVI MUC16 B*49:01 70 TExVLQGLL MUC16 B*40/B*44/? 71 TPGGTRQSL MUC16 B*07:02/B*35 72 TPGNRAISL MUC16 B*07:02/B*35 73 TPNSRGETSL MUC16 B*07:02 74 TSGPVTEKY MUC16 B*35 75 TSPAGEAHSL MUC16 ? 76 VHESHSSVL MUC16 B*39:01 77 VPRSAATTL MUC16 B*07:02/B*35 78 VTSAPGRSI MUC16 B*15:17 79 VTSSSRTSI MUC16 B*15:17 80 YPDPSKASSAM MUC16 B*35 81 AAWLRSAAA MMP11 B*55/B*56 82 APAAWLRSAA MMP11 B*55/B*56 83 APAAWLRSAAA MMP11 B*55/B*56 84 LPSPVDAAF MMP11 B*35 85 RGVPSEIDAAF MMP11 B*58 86 EAGPPAFYR ESR1 A*66 87 STSSHSLQK ESR1 A*03/A*11 88 APHLHLSA KLK10 B*56:01 89 APHLHLSAA KLK10 B*56:01 90 RALAKLLPL KLK10 B*08/A*02 91 SAASGARAL KLK10 C*03 92 VLVDQSWVL KLK10 A*02 93 DYLKRFYLY MMP7 A*24 94 SETKNANSL MMP7 B*44/B*41/B*40 95 SSDPNAVMY MMP7 A*01 96 YPFDGPGNTL MMP7 B*35 97 YPFDGPGNTLAH MMP7 B*35 98 NEIERVFVW EYA2 B*44:02 99 NVGGLIGTPK EYA2 A*03 100 RVKEMYNTY EYA2 A*30/A*32 101 SAPLRVSQL EYA2 ? 102 DTDEYVLKY EFHC1 A*01 103 KDSTKTAF EFHC1 B*44 104 SKAPVLTY EFHC1 B*15:03 105 AEYTDVLQKI EPS8L1 B*49 106 EYTDVLQKI EPS8L1 A*24 107 RPHLTSDA EPS8L1 B*56 108 RPHLTSDAV EPS8L1 B*56 109 RPHLTSDAVA EPS8L1 B*56 110 SAKSIYEQR EPS8L1 A*31 111 SPEEGARVY EPS8L1 B*35 112 SQYPVNHLV EPS8L1 B*15 113 YPVNHLVTF EPS8L1 B*35 114 AAASAIKVI IDO1 C*12 115 IHDHVNPKAFF IDO1 B*38 116 NPKAFFSVL IDO1 B*07 117 NPSVREFVL IDO1 B*35 118 RSYHLQIVTK IDO1 A*11/A*03 119 RYMPPAHRNF IDO1 A*24 120 TEFEQYLHF SOX17 B*18/B*44 121 VSDASSAVYY SOX17 A*01 122 AEIEADRSY LAMC2 B*44 123 AQKVDTRAK LAMC2 A*03 124 HPSAHDVIL LAMC2 B*35:03 125 RIKQKADSL LAMC2 B*08 126 SEGASRSLGL LAMC2 B*37 127 SVDEEGLVLL LAMC2 A*02 128 SVHKITSTF LAMC2 A*25 129 TREATQAEI LAMC2 B*39 130 VYFVAPAKF LAMC2 A*24 131 APQSAHAAF SGPL1 B*07 132 ETIIIFHSL EYA3 A*25 133 TELLVKAY SGPL1 B*18 134 WQEGRASGTVY SGPL1 B*15 135 IRSENFEEL CRABP2 B*39 136 KIAVAAASK CRABP2 A*03 137 NVMLRKIAV CRABP2 B*08 138 RELTNDGELIL CRABP2 B*40/B*44 139 VAAASKPAV CRABP2 ? 140 SPNAIFKAL SOX9 B*07 141 SSKNKPHVKR SOX9 A*31 142 TPASAGHVW SOX9 B*07 143 YTDHQNSSSY SOX9 A*01 144 AEVLLPRL MSLN B*40 145 AVLPLTVAEVQK MSLN A*03 146 LPTARPLL MSLN B*07 147 RVRELAVAL MSLN A*02 148 NLPIFLPRV MLPH A*02 149 RVHPEEQGW MLPH B*58 150 TVKPSGKPR MLPH A*31 151 YYEHVKARF MLPH A*24 152 AARPAGATL ERBB2 B*07 153 MPNPEGRYTF ERBB2 B*35 154 FYIKTSTTV CRABP2 A*24 155 RTTEINFKV CRABP2 A*02 156 YIKTSTTV CRABP2 B*08 157 GQAAQGPTI DDR1 B*15 158 HRFLAEDAL DDR1 B*39:01 159 EEVARFYAA FOLR1 B*45 160 NPNEEVARF FOLR1 B*35 161 NPNEEVARFY FOLR1 B*35 162 KSQTLLGK ULK1 A*11/A*03 163 DELISKSF YPEL1 B*18 164 HDELISKSF YPEL1 B*35 165 GRAYLFNSV YPEL1 B*27 166 YLFNSVVNV YPEL1 A*02 167 APDNRPAL MUC1 B*07/B*35 168 HHSDTPTTL MUC1 B*38/B*39 169 HPMSEYPTY MUC1 B*35 170 LQRDISEM MUC1 B*51 171 LQRDISEMF MUC1 B*51 172 AIAEIGNQL MMP9 A*02 173 DVAQVTGALR MMP9 A*68 174 SEDLPRAVI MMP9 B*49/B*40 175 APDAKSFVL LGALS1 B*35 176 EVAPDAKSF LGALS1 A*25 177 FPFQPGSVAEV LGALS1 B*35 178 GEVAPDAKSFVL LGALS1 B*40 179 LPDGYEFKF LGALS1 B*35
Tabelul 2: Peptide suplimentare în conformitate cu descrierea, X = S, R sau G
SEQ ID NO Secvenţă Clasă MHC Genă 180 DKAFTAATTEVSR II MUC16 181 ELGPYTLDRNSLYVN II MUC16 182 ELGPYTLDRNSLYVNG II MUC16 183 FDKAFTAATTEVSR II MUC16 184 GPYTLDRNSLYVN II MUC16 185 LGPYTLDRDSLYVN II MUC16 186 LGPYTLDRNSLYVN II MUC16 187 LGPYTLDRNSLYVNG II MUC16 188 STETITRLSTFPFVTG II MUC16 189 ELQWEQAQDYLKR II MMP7 190 ELQWEQAQDYLKRF II MMP7 191 GINFLYAATHELGHS II MMP7 192 LQWEQAQDYLKR II MMP7 193 LQWEQAQDYLKRF II MMP7 194 SELQWEQAQDYLKR II MMP7 195 SELQWEQAQDYLKRF II MMP7 196 VPYNILTPYPGPR II EPS8L1 197 YVPYNILTPYPGPR II EPS8L1 198 GNWKIIRSENFEEL II CRABP2 199 GNWKIIRSENFEELLK II CRABP2 200 NWKIIRSENFEEL II CRABP2 201 PNFSGNWKIIRSENF II CRABP2 202 VMLRKIAVAAASKPA II CRABP2 203 WKIIRSENFEEL II CRABP2 204 LQRYSSDPTGALT II EGFR 205 NPTTYQMDVNPEGK II EGFR 206 NPTTYQMDVNPEGKY II EGFR 207 DDGGQFVVTTNPVNNDG II CDH1 208 DKEGKVFYSITGQGADTPP II CDH1 209 DKEGKVFYSITGQGADTPPV II CDH1 210 DKNMFTINRNTGVI II CDH1 211 DKNMFTINRNTGVIS II CDH1 212 DPELPDKNMFTINRNTG II CDH1 213 DPELPDKNMFTINRNTGVI II CDH1 214 DPELPDKNMFTINRNTGVIS II CDH1 215 DPELPDKNMFTINRNTGVISV II CDH1 216 DPELPDKNMFTINRNTGVISVV II CDH1 217 DPELPDKNMFTINRNTGVISVVT II CDH1 218 DVNTYNAAIAYTILS II CDH1 219 DVNTYNAAIAYTILSQ II CDH1 220 EGKVFYSITGQGADT II CDH1 221 EGKVFYSITGQGADTPP II CDH1 222 EGKVFYSITGQGADTPPV II CDH1 223 ELPDKNMFTINRNTGVIS II CDH1 224 GGQFVVTTNPVNN II CDH1 225 GKVFYSITGQGADT II CDH1 226 GPFPKNLVQIKSNKDK II CDH1 227 GPFPKNLVQIKSNKDKE II CDH1 228 GPFPKNLVQIKSNKDKEGK II CDH1 229 KNMFTINRNTGVI II CDH1 230 KNMFTINRNTGVIS II CDH1 231 LPDKNMFTINRNTG II CDH1 232 LPDKNMFTINRNTGVI II CDH1 233 LPDKNMFTINRNTGVIS II CDH1 234 PELPDKNMFTINRNTGVI II CDH1 235 PELPDKNMFTINRNTGVIS II CDH1 236 QDPELPDKNMFTINRNTGVIS II CDH1 237 SQDPELPDKNMFTINRNTGVIS II CDH1 238 SQDPELPDKNMFTINRNTGVISVVT II CDH1 239 SVPRYLPRPANPDE II CDH1 240 TDGVITVKRPLRFHNPQ II CDH1 241 TRAELDREDFEHVK II CDH1 242 VPRYLPRPANPDE II CDH1 243 ALEFRALEPQGLL II AGRN 244 ALEFRALEPQGLLL II AGRN 245 DTRIFFVNPAPPY II AGRN 246 DTRIFFVNPAPPYL II AGRN 247 DTRIFFVNPAPPYLW II AGRN 248 DTRIFFVNPAPPYLWP II AGRN 249 DTRIFFVNPAPPYLWPA II AGRN 250 EFRALEPQGLLL II AGRN 251 GAPVPAFEGRSFLAFPTL II AGRN 252 GDTRIFFVNPAPPYLWP II AGRN 253 GDTRIFFVNPAPPYLWPA II AGRN 254 IVDVHFDPTTAFRAPD II AGRN 255 KVRVWRYLKGKDLVAR II AGRN 256 LALEFRALEPQGLLL II AGRN 257 LEFRALEPQGLLL II AGRN 258 SGPFLADFNGFSH II AGRN 259 TGDTRIFFVNPAPPYLWPA II AGRN 260 TRIFFVNPAPPYL II AGRN 261 VDVHFDPTTAFRAPD II AGRN 262 VDVHFDPTTAFRAPDV II AGRN 263 VRVWRYLKGKDLVAR II AGRN 264 APVPAFEGRSFLAFPT II AGRN 265 APVPAFEGRSFLAFPTL II AGRN 266 ALRGLLPVLGQPIIR II MSLN 267 DLPGRFVAESAEVLLP II MSLN 268 DLPGRFVAESAEVLLPR II MSLN 269 GQPIIRSIPQGIV II MSLN 270 GQPIIRSIPQGIVA II MSLN 271 LGQPIIRSIPQGIVA II MSLN 272 LPAALACWGVRGSL II MSLN 273 LPGRFVAESAEVLL II MSLN 274 LPGRFVAESAEVLLP II MSLN 275 LPGRFVAESAEVLLPR II MSLN 276 LRGLLPVLGQPIIR II MSLN 277 PGRFVAESAEVLLPR II MSLN 278 PGRFVAESAEVLLPRL II MSLN 279 QPIIRSIPQGIVA II MSLN 280 RGLLPVLGQPIIR II MSLN 281 SRTLAGETGQEAAPL II MSLN 282 STERVRELAVALAQK II MSLN 283 TDAVLPLTVAEVQ II MSLN 284 VAEVQKLLGPHVEG II MSLN 285 VAEVQKLLGPHVEGLK II MSLN 286 VLGQPIIRSIPQGIVA II MSLN 287 VRGSLLSEADVRALG II MSLN 288 VRGSLLSEADVRALGG II MSLN 289 LPAALACWGVRGSLL II MSLN 290 AIKVLRENTSPKANKE II ERBB2 291 DPSPLQRYSEDPTVPLPS II ERBB2 292 DPSPLQRYSEDPTVPLPSE II ERBB2 293 ELVSEFSRMARD II ERBB2 294 ELVSEFSRMARDPQ II ERBB2 295 IPVAIKVLRENTSPKANKE II ERBB2 296 RRLLQETELVEPLTPS II ERBB2 297 SPQPEYVNQPDVRPQPP II ERBB2 298 VKPDLSYMPIWKFPDE II ERBB2 299 ASGMRYLATLNFVHR II DDR1 300 IASGMRYLATLNFVHR II DDR1 301 KEVKIMSRLKDPN II DDR1 302 LNQFLSAHQLEDK II DDR1 303 NPAYRLLLATYARPP II DDR1 304 NPAYRLLLATYARPPR II DDR1 305 SNPAYRLLLATYARPP II DDR1 306 SNPAYRLLLATYARPPR II DDR1 307 DPSTDYYQELQRDISE II MUC1 308 VETQFNQYKTEAASR II MUC1 309 GRQVWVYTGASVLGPR II MMP9 310 NQLYLFKDGKYWRFSEG II MMP9 311 RQVWVYTGASVLGPR II MMP9 312 SGRQVWVYTGASVLG II MMP9 313 SGRQVWVYTGASVLGP II MMP9 314 SGRQVWVYTGASVLGPR II MMP9 315 VDPRSASEVDRMFPG II MMP9 316 GEVAPDAKSFVLN II LGALS1 317 LTVKLPDGYEFKFPNRLNL II LGALS1 318 VRGEVAPDAKSFVLN II LGALS1 319 VRGEVAPDAKSFVLNLG II LGALS1
Tabelul 3: Peptide suplimentare utile pentru terapiile cancerului, X = S, R sau G
SEQ ID NO Secvenţă Clasă MHC Genă 320 ATSKIPLAL I MUC16 321 ITSSRTTI I MUC16 322 LNFTITNLQ I MUC16 323 TATSPMVPAS I MUC16 324 TTLPESRPS I MUC16 325 VELRVLALP I LRFN4 326 AEDNLIHKF I NLRP2 327 REDLERLGV I NLRP7 328 DTKDPAVTEW I TLR7 329 ILISKLLGA I TLR7 330 SESLRTLEF I TLR7 331 VLAELVAKL I TLR7 332 INTSILLIF I TLR3 333 ALQPLLHTV I IL17RD 334 RLMDNLPQL I IL17RD 335 LIISPTREL I DDX10 336 ADSKVLLF I WDR35 337 DSLLEQANNAI I WDR35 338 DYQGIKFVKR I WDR35 339 EVVGYFGRF I WDR35 340 KYVKGLISI I WDR35 341 SIGTPLDPK I WDR35 342 TASDKILIV I WDR35 343 GVIKVISGF I NOC3L 344 KVKLENKLK I NOC3L 345 SSSEPVHAK I NOC3L 346 SSSEPVHAKK I NOC3L 347 LSDQLAQAI I DNASE1 348 LSDIVIEKY I WDR27 349 SLDDHVVAV I WDR27 350 SQIDQQNSV I LRIF1 351 STIDPSGTRSK I LRIF1 352 VFRDQEPKI I LRIF1 353 VLREKEAAL I LRIF1 354 TRLQQAQAL I POLR2J3 355 VAAPEHISY I POLR2J3 356 NSKKKVAL I DDX52 357 QNSKKKVAL I DDX52 358 RDNTVHSF I DDX52 359 KQVSEFMTW I RASGEF1B 360 KTKPQSIQR I RASGEF1B 361 THIELERL I RASGEF1B 362 IAPKILQL I RASGEF1B 363 DIASVSGRW I BICC1 364 KPKQPSKSV I BICC1 365 MPAETIKEL I BICC1 366 SAVKEGTAM I BICC1 367 EEEKLQAAF I COMMD10 368 DEFNLQKM I EMC1 369 DEYKVTAF I EMC1 370 ETNIGGLNW I EMC1 371 FPQTALVSF I EMC1 372 GEFGKKADGLL I EMC1 373 GSMGSFSEK I EMC1 374 IFLIDGVTGRI I EMC1 375 IPPEVQRI I EMC1 376 IPYSPDVQI I EMC1 377 QVAPPVLKR I EMC1 378 TEKNVIAAL I EMC1 379 VGKVKFASL I EMC1 380 VPFSHVNI I EMC1 381 VVYQYWNTK I EMC1 382 YPSKQFDVL I EMC1 383 AADDSADKV I ZNF217 384 HHKEKQTDV I ZNF217 385 KQTDVAAEV I ZNF217 386 KSAFPAQSK I ZNF217 387 NEVVQVHAA I ZNF217 388 SEDLNKHVL I ZNF217 389 GETIHIPTM I BCAT1 390 GPKLASRIL I BCAT1 391 GVKKPTKAL I BCAT1 392 KEKPDPNNL I BCAT1 393 KVSERYLTM I BCAT1 394 LPVFDKEEL I BCAT1 395 LSKLTDIQY I BCAT1 396 DLSNIINKL I WDR12 397 RVWDVESGSLK I WDR12 398 SPTTSHVGA I WDR12 399 VEIEYVEKY I WDR12 400 VERNKVKAL I WDR12 401 REAVSKEDL I PANK2 402 IMGGNSILHSA I STXBP6 403 KQFEGSTSF I STXBP6 404 EEFLRQEHF I OASL 405 ETIPSEIQVF I OASL 406 EVGEALKTVL I DMD 407 KLEDLEEQL I DMD 408 LKIQSIAL I DMD 409 MNVLTEWLAAT I DMD 410 AIQDKLFQV I CHCHD6 411 FPNFDKQEL I SMARCAD1 412 GQTKEVLVI I SMARCAD1 413 KLIESTSTM I SMARCAD1 414 KPYQKVGL I SMARCAD1 415 KQESIVLKL I SMARCAD1 416 NANNRLLL I SMARCAD1 417 SEVPNGKEV I SMARCAD1 418 TNNIGSIAR I PANK2 419 DAKGRTVSL I GPX8 420 IIKKKEDL I GPX8 421 DVIDVVQAL I C20orf194 422 EEFKITSF I C20orf194 423 SDFEKTGF I C20orf194 424 DEDRLLVVF I USP34 425 HHSNIPMSL I USP34 426 LFPSLIKNL I USP34 427 NTNIPIGNK I USP34 428 SDQVADLR I USP34 429 THFSFPLRL I USP34 430 TYDSVTDKF I USP34 431 AESLYEIRF I TM9SF1 432 DEFLGLTHTY I TM9SF1 547 IITEVITRL I MUC16 548 KMISAIPTL I MUC16 549 TYSEKTTLF I MUC16
Tabelul 4: Peptide suplimentare utile pentru terapiile cancerului, X = S, R sau G
SEQ ID NO Secvenţă Clasă MHC Genă 433 ALDFFGNGPPVNY II IFI30 434 ALDFFGNGPPVNYKT II IFI30 435 DFFGNGPPVNYK II IFI30 436 DFFGNGPPVNYKT II IFI30 437 DFFGNGPPVNYKTGN II IFI30 438 DFFGNGPPVNYKTGNL II IFI30 439 DFFGNGPPVNYKTGNLY II IFI30 440 LQALDFFGNGPPVNYKTGN II IFI30 441 QALDFFGNGPPVNYK II IFI30 442 QPPHEYVPWVTVNGKP II IFI30 443 SPLQALDFFGNGPPVNYKTG II IFI30 444 SPLQALDFFGNGPPVNYKTGN II IFI30 445 SPLQALDFFGNGPPVNYKTGNLY II IFI30 446 GPPFSSSQSIPVVPR II GPR64 447 LPSSLMNNLPAHDM II GPR64 448 LPSSLMNNLPAHDME II GPR64 449 LPSSLMNNLPAHDMEL II GPR64 450 SPIGEIQPLSPQPSAPI II GPR64 451 DEVTQPFVIDEKTAEIR II PCDHB5 452 KYPELVLDKALDREER II PCDHB5 453 KYPELVLDKALDREERPE II PCDHB5 454 VTQPFVIDEKTAEIR II PCDHB5 455 DGRTIVDLEGTPVVSPD II FNDC1 456 DGRTIVDLEGTPVVSPDG II FNDC1 457 DKPILSLGGKPLVG II FNDC1 458 GDGRTIVDLEGTPVVSPD II FNDC1 459 GDGRTIVDLEGTPVVSPDG II FNDC1 460 GGDGRTIVDLEGTPVVSPD II FNDC1 461 GGDGRTIVDLEGTPVVSPDG II FNDC1 462 GRTIVDLEGTPVVSPD II FNDC1 463 KVKEYILSYAPALKPF II FNDC1 464 KVKEYILSYAPALKPFG II FNDC1 465 LGGDGRTIVDLEGTPVVSPDG II FNDC1 466 RTHEIKKLASESVYV II FNDC1 467 VKEYILSYAPALKPF II FNDC1 468 YSKTQYNQVPSEDFERTPQ II CXADR 469 AAPNLSRMGAIPVMIP II CXADR 470 AAPNLSRMGAIPVMIPA II CXADR 471 APNLSRMGAIPVMIP II CXADR 472 APNLSRMGAIPVMIPA II CXADR 473 GYSKTQYNQVPSEDFERTPQ II CXADR 474 SKTQYNQVPSEDFER II CXADR 475 SKTQYNQVPSEDFERTP II CXADR 476 SKTQYNQVPSEDFERTPQ II CXADR 477 VAAPNLSRMGAIPVMIPA II CXADR 478 VIILYSGDKIYD II CXADR 479 YSKTQYNQVPSEDFER II CXADR 480 GHLFALRSLDYE II PCDHB3 481 AAEPGYLVTKVVAVDG II PCDHB3 482 AAEPGYLVTKVVAVDGD II PCDHB3 483 AAEPGYLVTKVVAVDGDS II PCDHB3 484 AAEPGYLVTKVVAVDGDSG II PCDHB3 485 AEPGYLVTKVVAVDG II PCDHB3 486 AEPGYLVTKVVAVDGD II PCDHB3 487 AEPGYLVTKVVAVDGDS II PCDHB3 488 EPGYLVTKVVAVDG II PCDHB3 489 EPGYLVTKVVAVDGD II PCDHB3 490 EPGYLVTKVVAVDGDS II PCDHB3 491 AEPGYLVTKVVAVD II PCDHB3 492 ADSTEFRPNAPVPLVI II CTPS2 493 ADSTEFRPNAPVPLVID II CTPS2 494 DADSTEFRPNAPVPLVI II CTPS2 495 DADSTEFRPNAPVPLVID II CTPS2 496 DADSTEFRPNAPVPLVIDM II CTPS2 497 DADSTEFRPNAPVPLVIDMP II CTPS2 498 DADSTEFRPNAPVPLVIDMPE II CTPS2 499 DSTEFRPNAPVPL II CTPS2 500 DSTEFRPNAPVPLV II CTPS2 501 DSTEFRPNAPVPLVI II CTPS2 502 DSTEFRPNAPVPLVID II CTPS2 503 DSTEFRPNAPVPLVIDMP II CTPS2 504 DSTEFRPNAPVPLVIDMPE II CTPS2 505 KDADSTEFRPNAPVPLVID II CTPS2 506 STEFRPNAPVPL II CTPS2 507 STEFRPNAPVPLVI II CTPS2 508 STEFRPNAPVPLVID II CTPS2 509 STEFRPNAPVPLVIDMP II CTPS2 510 AGDYTIANARKLIDE II RP2 511 ETLERLQEL DMD 512 ADITYAIEADSESVK II FAT1 513 DITYAIEADSESVK II FAT1 514 KRDNYQIKVVASDHGE II FAT1 515 KRDNYQIKVVASDHGEK II FAT1 516 RDESFVIDRQSGRLK II FAT1 517 RDNYQIKVVASDHGE II FAT1 518 SPSELDRDPAYAIVT II FAT1 519 TPPQFSSVKVIHVTSPQ II FAT1 520 VPLPDIQEFPNY II FAT1 521 GPQLFHMDPSGTFVQ II PSMA5 522 DKNYFEGTGYARVPTQP II LAMA3 523 DKNYFEGTGYARVPTQPH II LAMA3 524 DSKPLYTPSSSFGVS II LAMA3 525 IQRQVKEINSLQSDFT II LAMA3 526 KNYFEGTGYARVPT II LAMA3 527 KNYFEGTGYARVPTQP II LAMA3 528 KNYFEGTGYARVPTQPH II LAMA3 529 SPRVVPNESIPIIPIP II PTPRG 530 SPRVVPNESIPIIPIPD II PTPRG 531 SSPRVVPNESIPIIP II PTPRG 532 SSPRVVPNESIPIIPIP II PTPRG 533 SSPRVVPNESIPIIPIPD II PTPRG 534 DDKGYTLMHPSLTRPY II CACHD1 535 DVGGAGYVVTISHTIHS II CACHD1 536 GAGYVVTISHTIH II CACHD1 537 GAGYVVTISHTIHS II CACHD1 538 GGAGYVVTISHTIH II CACHD1 539 GGAGYVVTISHTIHS II CACHD1 540 VGGAGYVVTISHTIHS II CACHD1 541 MTRTFHDLEGNAVKRDSG II ERMP1 542 RTFHDLEGNAVKR II ERMP1 543 RTFHDLEGNAVKRDSG II ERMP1 544 SGTFFPYSSNPANPK II ERMP1 545 SGTFFPYSSNPANPKP II ERMP1 546 TRTFHDLEGNAVKR II ERMP1
Prezenta invenţie se mai referă, în general, la peptida în conformitate cu prezenta invenţie pentru utilizare în tratamentul bolilor proliferative, cum ar fi, de exemplu, cancer ovarian, cancer pulmonar cu celule non-mici, cancer pulmonar cu celule mici, cancer renal, cancer cerebral, cancer de colon sau rect, cancer de stomac, cancer hepatic, cancer pancreatic, cancer de prostată, leucemie, cancer de glandă mamară, carcinom cu celule Merkel, melanom, cancer esofagian, cancer de vezică urinară, cancer uterin, cancer de vezică biliară, cancer de cale biliară şi alte tumori care arată o supraexprimare a unei proteine din care provine o peptidă în conformitate cu SEQ ID NO 82, în particular cancer ovarian.
Prezenta invenţie se referă şi la peptidele descrise în invenţie şi care au capacitatea de a se lega la o moleculă a complexului major de histocompatibilitate (MHC) umană de clasă I.
Prezenta invenţie se referă în continuare la peptida descrisă în prezenta invenţie, în care respectiva peptidă include legături non-peptidice.
Prezenta invenţie se referă suplimentar la peptida în conformitate cu prezenta invenţie, în care respectiva peptidă face parte dintr-o proteină de fuziune, în special fuzionată cu aminoacizi N-terminali ai lanţului invariant (Ii) asociat cu antigenul HLA-DR sau fuzionată cu un anticorp (sau în secvenţa unui anticorp), cum ar fi, de exemplu, un anticorp care este specific pentru celulele dendritice.
Prezenta invenţie se referă în continuare la un acid nucleic care codifică peptidele conform prezentei invenţii. Prezenta invenţie se referă în continuare la acidul nucleic conform prezentei invenţii, care este ADN, ADNc, APN, ARN sau combinaţii ale acestora.
Prezenta invenţie se referă în continuare la un vector de exprimare care exprimă un acid nucleic conform prezentei invenţii.
Prezenta invenţie se referă în continuare la o peptidă conform prezentei invenţii, un acid nucleic conform prezentei invenţii sau un vector de exprimare conform prezentei invenţii pentru utilizare în tratarea bolilor şi în medicină, în special în tratarea cancerului.
Prezenta invenţie se mai referă la anticorpi care sunt specifici împotriva peptidei în conformitate cu prezenta invenţie sau complexe ale peptidelor menţionate în conformitate cu prezenta invenţie cu MHC şi metode de realizare a acestora.
Prezenta invenţie se referă în continuare la receptori de celule T (TCR), în special TCR solubil (sTCR) şi TCR clonate transformate în celule T autologe sau alogene şi metode de realizare a acestora, precum şi celule NK sau alte celule care poartă respectivul TCR sau care reacţionează încrucişat cu TCR menţionate.
Anticorpii şi TCR sunt exemple de realizare suplimentare ale utilizării imunoterapeutice a peptidei în conformitate cu invenţia la îndemână.
Prezenta invenţie se referă în continuare la o celulă-gazdă cuprinzând un acid nucleic în conformitate cu prezenta invenţie sau un vector de exprimare aşa cum a fost descris mai înainte. Prezenta invenţie se referă în continuare la celula-gazdă în conformitate cu prezenta invenţie care este o celulă prezentatoare de antigen şi, preferabil, este o celulă dendritică.
Prezenta invenţie se referă în continuare la o metodă de producere a unei peptide în conformitate cu prezenta invenţie, metoda cuprinzând cultivarea celulei-gazdă conform prezentei invenţii şi izolarea peptidei din celula-gazdă sau din mediul său de cultură.
Prezenta invenţie se referă în continuare la metoda menţionată în conformitate cu prezenta invenţie în care antigenul este încărcat pe molecule de MHC de clasă I exprimate pe suprafaţa unei celule prezentatoare de antigen adecvate sau a unei celule prezentatoare de antigen artificiale prin punerea în contact a unei cantităţi suficiente de antigen cu o celulă prezentatoare de antigen.
Prezenta invenţie se referă în continuare la metoda în conformitate cu prezenta invenţie în care celula prezentatoare de antigen cuprinde un vector de exprimare care exprimă respectiva peptidă care conţine SEQ ID NO 82.
Prezenta invenţie se referă în continuare la celulele T activate produse prin metoda în conformitate cu prezenta invenţie, în care celula T menţionată recunoaşte selectiv o celulă care exprimă o polipeptidă cuprinzând o secvenţă de aminoacizi în conformitate cu prezenta invenţie.
Este descrisă o metodă de distrugere a celulelor ţintă la un pacient la care celulele ţintă exprimă aberant o polipeptidă cuprinzând orice secvenţă de aminoacizi conform prezentei invenţii, metoda cuprinzând administrarea unui număr eficace de celule T produse în conformitate cu prezenta invenţie la pacient.
Prezenta invenţie se referă, de asemenea, la utilizarea oricărei peptide descrise, acidul nucleic în conformitate cu prezenta invenţie, vectorul de exprimare în conformitate cu prezenta invenţie, celula în conformitate cu prezenta invenţie, limfocitul T activat, receptorul celulelor T sau anticorpul sau alte molecule de legare peptidică şi/sau peptidă-MHC în conformitate cu prezenta invenţie ca medicament sau la fabricarea unui medicament.
De preferinţă, medicamentul este activ împotriva cancerului.
De preferinţă, respectivul medicament este pentru o terapie celulară, un vaccin sau o proteină bazată pe un TCR sau anticorp solubil.
Prezenta invenţie se mai referă la o utilizare în conformitate cu prezenta invenţie, în care celulele canceroase respective sunt cancer ovarian, cancer pulmonar cu celule non-mici, cancer pulmonar cu celule mici, cancer renal, cancer cerebral, cancer de colon sau rect, cancer de stomac, cancer hepatic, cancer pancreatic, cancer de prostată, leucemie, cancer de glandă mamară, carcinom cu celule Merkel, melanom, cancer esofagian, cancer de vezică urinară, cancer uterin, cancer de vezică biliară, cancer de cale biliară şi, preferabil celule de cancer ovarian.
De exemplu, un anticorp sau un TCR solubil poate fi utilizat pentru colorarea secţiunilor tumorii pentru detectarea prezenţei unei peptide de interes în complex cu MHC.
Opţional, anticorpul poartă o funcţie efectoare suplimentară, cum ar fi un domeniu de stimulare imunitară sau o toxină.
Utilizările terapeutică şi diagnostică împotriva cancerelor suplimentare sunt prezentate în următoarea descriere mai detaliată a produselor de exprimare subiacente (polipeptide) ale peptidei în conformitate cu invenţia.
DESCRIEREA DETALIATĂ A INVENŢEI
Stimularea unui răspuns imunitar depinde de prezenţa unor antigeni recunoscuţi ca străini de către sistemul imunitar al gazdei. Descoperirea antigenilor asociaţi tumorilor a creat posibilitatea de a folosi sistemul imunitar al gazdei pentru a interveni asupra creşterii tumorale. În prezent imunoterapia cancerului explorează diferite mecanisme de a valorifica atât componenta umorală cât şi pe cea celulară a sistemului imunitar.
Elemente specifice ale răspunsului imunitar celular sunt capabile de a recunoaşte şi distruge în mod specific celulele tumorale. Izolarea celulelor T din populaţiile celulare care infiltrează tumorile sau din sângele periferic sugerează că aceste celule au un rol important în reacţia imunitară naturală împotriva cancerului. În special celulele T CD8-pozitive capabile să recunoască moleculele de clasă I ale peptidelor purtătoare ale complexului major de histocompatibilitate (MHC), care includ, de obicei, 8 până la 10 resturi de aminoacizi derivate din proteine sau produse ribozomale defectuoase (DRIP) localizaţi în citozol, joacă un rol important în acest răspuns. Moleculele MHC umane sunt desemnate şi ca antigeni leucocitari umani (HLA).
Prezenta invenţie se referă în continuare la o peptidă descrisă în prezenta invenţie, în care respectiva peptidă include legături non-peptidice, aşa cum este descris mai jos.
Prezenta invenţie se referă suplimentar o peptidă în conformitate cu prezenta invenţie, în care respectiva peptidă face parte dintr-o proteină de fuziune, în special fuzionată cu aminoacizi N-terminali ai lanţului invariant (Ii) asociat cu antigenul HLA-DR sau fuzionată cu un anticorp (sau în secvenţa unui anticorp), cum ar fi, de exemplu, un anticorp care este specific pentru celulele dendritice, adică se leagă de celulele dendritice.
Prezenta invenţie se referă în continuare la un acid nucleic care codifică o peptidă în conformitate cu prezenta invenţie. Prezenta invenţie se referă în continuare la acidul nucleic conform prezentei invenţii, care este ADN, ADNc, APN, ARN sau combinaţii ale acestora.
Prezenta invenţie se referă în continuare la un vector de exprimare care exprimă şi/sau prezintă un acid nucleic în conformitate cu prezenta invenţie.
Prezenta invenţie se referă în continuare la o peptidă în conformitate cu prezenta invenţie, un acid nucleic în conformitate cu prezenta invenţie sau un vector de exprimare în conformitate cu prezenta invenţie pentru utilizare în medicină.
Prezenta invenţie se referă, de asemenea, la anticorpii descrişi mai în detaliu mai jos şi metodele pentru realizarea lor. Preferaţi sunt anticorpii care sunt specifici pentru peptidele prezentei invenţii şi/sau pentru peptidele prezentei invenţii atunci când sunt legate de MHC-ul lor. Anticorpii preferaţi pot fi monoclonali.
Prezenta invenţie se referă, de asemenea, la receptori de celule T (TCR), în particular receptori de celule T solubili (sTCR), care vizează peptida în conformitate cu prezenta invenţie şi/sau complecşii peptidă-MHC ai acestora, precum şi metodele pentru realizarea lor.
Prezenta invenţie se referă, de asemenea, la anticorpi care vizează peptida în conformitate cu prezenta invenţie şi/sau complexele peptidă-MHC ale acestora, precum şi metodele pentru realizarea lor.
Prezenta invenţie se referă în continuare la o celulă-gazdă cuprinzând un acid nucleic în conformitate cu prezenta invenţie sau un vector de exprimare aşa cum a fost descris mai înainte. Prezenta invenţie se referă în continuare la celula-gazdă conform prezentei invenţii care este o celulă prezentatoare de antigen. Prezenta invenţie se referă în continuare la celula-gazdă conform prezentei invenţii în care celula prezentatoare de antigen este o celulă dendritică.
Prezenta invenţie se referă, de asemenea, la o metodă de producere a unei peptide în conformitate cu prezenta invenţie, metoda menţionată cuprinzând cultivarea celulei-gazdă în conformitate cu prezenta invenţie şi izolarea peptidei din celula-gazdă şi/sau din mediul său de cultură.
Prezenta invenţie se referă, de asemenea, la o metodă in vitro pentru producerea de celule T activate, metoda cuprinzând contactul in vitro al celulelor T cu molecule MHC de clasă I umane încărcate cu antigen exprimate pe suprafaţa unei celule prezentatoare de antigen adecvate pentru o perioadă de timp suficientă pentru activarea celulelor T menţionate într-un mod specific antigenului, respectivul antigen fiind cel puţin o peptidă în conformitate cu prezenta invenţie.
Prezenta invenţie se referă, de asemenea, la o metodă în care antigenul este încărcat pe molecule de MHC de clasă I exprimate pe suprafaţa unei celule prezentatoare de antigen adecvate prin punerea în contact a unei cantităţi suficiente de antigen cu o celulă prezentatoare de antigen.
Prezenta invenţie se referă în continuare la metoda în conformitate cu prezenta invenţie în care celula prezentatoare de antigen cuprinde un vector de exprimare care exprimă respectiva peptidă care conţine SEQ ID NO: 82.
Prezenta invenţie se referă, de asemenea, la celule T activate produse prin metoda în conformitate cu prezenta invenţie, care recunosc selectiv o celulă care exprimă aberant o polipeptidă cuprinzând o secvenţă de aminoacizi în conformitate cu prezenta invenţie.
Este descrisă o metodă de ucidere a celulelor ţintă la un pacient la care celulele ţintă exprimă aberant o polipeptidă cuprinzând orice secvenţă de aminoacizi conform prezentei invenţii, metoda cuprinzând administrarea pacientului unui număr eficace de celule T în conformitate cu prezenta invenţie.
Prezenta invenţie se referă, de asemenea, la utilizarea oricărei peptide descrise, a unui acid nucleic în conformitate cu prezenta invenţie, a unui vector de exprimare în conformitate cu prezenta invenţie, a unei celule în conformitate cu prezenta invenţie sau a unei celule T activate în conformitate cu prezenta invenţie ca medicament sau în fabricarea unui medicament.
Prezenta invenţie se referă, de asemenea, la o utilizare în conformitate cu prezenta invenţie în care respectivul medicament este un vaccin, o celulă, o populaţie de celule, cum ar fi, de exemplu, o linie celulară, sTCR şi anticorpi monoclonali.
Prezenta invenţie se referă, de asemenea, la o utilizare în conformitate cu prezenta invenţie în care respectivul medicament este activ împotriva cancerului.
Prezenta invenţie se referă, de asemenea, la o utilizare în conformitate cu prezenta invenţie în care respectivele celule canceroase sunt celule de cancer ovarian.
Stimularea unui răspuns imunitar depinde de prezenţa unor antigeni recunoscuţi ca străini de către sistemul imunitar al gazdei. Descoperirea antigenilor asociaţi tumorilor a creat posibilitatea de a folosi sistemul imunitar al gazdei pentru a interveni asupra creşterii tumorale. În prezent imunoterapia cancerului explorează diferite mecanisme de a valorifica atât componenta umorală cât şi pe cea celulară a sistemului imunitar.
Elemente specifice ale răspunsului imunitar celular sunt capabile de a recunoaşte şi distruge în mod specific celulele tumorale. Izolarea celulelor T din populaţiile celulare care infiltrează tumorile sau din sângele periferic sugerează că aceste celule au un rol important în reacţia imunitară naturală împotriva cancerului. În special celulele T CD8-pozitive capabile să recunoască moleculele de clasă I ale peptidelor purtătoare ale complexului major de histocompatibilitate (MHC), care includ, de obicei, 8 până la 10 resturi de aminoacizi derivate din proteine sau produse ribozomale defectuoase (DRIP) localizaţi în citozol, joacă un rol important în acest răspuns. Moleculele MHC umane sunt desemnate şi ca antigeni leucocitari umani (HLA).
Un progres extraordinar în domeniul imunoterapiei împotriva cancerului în ultimii ani a dus la aprecierea largă a acestora (31, 32) ca supliment potenţial curativ (33) sau ca alternativă la abordările chimioterapice standard. Mai multe lucrări demonstrează importanţa antigenilor mutanţi prezentaţi de HLA şi asociaţi tumorilor de tip sălbatic drept antigeni valoroşi de respingere a tumorii. Prin urmare, identificarea pe scară largă a antigenilor tumorali specifici cancerului prezentaţi de HLA adaugă o altă piesă importantă la puzzle-ul înţelegerii modului în care sistemul imunitar identifică şi recunoaşte celulele tumorale.
In prezenta invenţie, inventatorii s-au concentrat asupra cancerului ovarian epitelial (EOC) cu scopul de a caracteriza în mod cuprinzător imunopeptidomul EOC şi de a evalua antigenii prezentaţi de HLA pentru utilitatea lor în aplicaţii clinice. Până în prezent, doar puţini antigeni prezentaţi de HLA au fost identificaţi pentru EOC, iar majoritatea studiilor clinice s-au bazat pe antigeni de cancer testicular prezişi sau stabiliţi care nu sunt neapărat, de asemenea, frecvent prezentaţi de EOC, fapt care ar putea fi confirmat prin analiza noastră.
Inventatorii demonstrează o exprimare consecventă şi ridicată a moleculelor HLA de clasă I pe celule tumorale ovariene în conformitate cu datele publicate anterior. Mai mult, inventatorii arată la un singur nivel celular că EOC prezintă, de asemenea, o exprimare puternică a moleculelor HLA-DR. Această exprimare puternică a fost subliniată în continuare prin identificarea de către noi a unei cantităţi mari de liganzi MHC de clasă II emanaţi din tumori ovariene, precum şi din fracţii celulare tumorale foarte îmbogăţite.
Profilarea imunopeptidomului a 34 de tumori ovariene în comparaţie cu peste 85 de surse benigne de origine diferită a relevat câteva sute de antigeni asociaţi cu EOC. Printre antigenii TOP100 HLA de clasă I EOC care nu sunt prezentaţi pe niciunul dintre ţesuturile din setul nostru de date benigne, MUC16 a fost în mod clar cel mai excepţional. În ceea ce priveşte atât numărul liganzilor HLA identificaţi (>80), cât şi frecvenţa de prezentare în cohorta de pacienţi (⁓80%), acest lucru este fără precedent pentru orice alt antigen tumoral şi entitate tumorală pe care inventatorii le-au investigat până acum. Mai mult, inventatorii au putut stabili că mai mult de 70% dintre liganzii HLA derivaţi din MUC16 sunt imunogeni şi capabili să amorseze celule T la indivizi sănătoşi, ceea ce face din mucina 16 un antigen de primă clasă fără egal pentru imunoterapia EOC. Profilarea imunopeptidomului oferă, în plus, un mod de etalare pentru perspective mecaniciste aparente asupra EOC, care sunt reflectate în ligandomul HLA al liganzilor HLA atât de clasă I, cât şi de clasă II. Liganzii HLA din kinazele şi fosfatazele importante (DDR1, EYA2), factorii de transcripţie (SOX9, SOX17), proteinele asociate cu imunosupresia (IDO1, galectina-1) precum şi markerii moleculari stabiliţi şi suspectaţi pentru EOC (MUC1, KLK10, FOLR1) sunt doar câteva de menţionat. În special pentru HLA de clasă II, mezotelina, un ligand stabilit de MUC16, a fost identificată drept antigen asociat cu tumora TOP1. Mai multe studii au demonstrat rolul crucial al axei MUC16/MSLN pentru invadarea şi metastazarea celulelor în EOC, precum şi în alte tumori, cum ar fi cancerul pancreatic sau mezoteliomul, sugerând faptul că epitopii celulelor T ale acestor antigeni trebuie testaţi în continuare la alte malignităţi. Inventatorii au putut arăta că colorarea MSLN este corelată direct cu colorarea MUC16 şi că exprimarea ridicată a MSLN formează un factor prognostic negativ în EOC.
Pentru prima dată au fost utilizate mai multe ţesuturi benigne şi tipuri de celule diferite (PBMC-uri, măduvă osoasă, ficat, rinichi, colon, ovar) pentru acest tip de profilare selectivă a imunopeptidomului. Din cauza restricţiilor în numărul de ţesuturi disponibile pentru investigare, inventatorii nu pot exclude complet faptul că antigenii individuali ar putea fi prezentaţi şi de molecule HLA în alte organe. Relevanţa funcţională stabilită a acelor antigeni pentru EOC şi, în special, imunogenitatea peptidelor respective la persoanele sănătoase face ca o prezentare a acestor antigeni în alte ţesuturi să fie improbabilă.
Termenul „răspuns celular T» se referă la proliferarea şi activarea specifică a funcţiilor efectoare induse de o peptidă, in vitro sau in vivo. Pentru celule T citotoxice restricţionate la MHC de clasă I, funcţiile efectoare pot fi de liză a celulelor ţintă cu peptide pulsate, precursori de peptide pulsate sau care prezintă peptide naturale, de secreţie de citokine, preferabil interferon gamma, TNF-alfa sau IL-2 indusă de peptide, secreţie de molecule efectoare, preferabil granzime sau perforine induse de peptidă, sau degranulare.
Termenul „peptidă» este folosit în prezentul document pentru a desemna o serie de resturi aminoacid conectate între ele de obicei prin punţi peptidice între grupările alfa-amino şi carbonil ale aminoacizilor adiacenţi. Peptidele au, preferabil, o lungime de 9 aminoacizi, dar pot avea lungimea de 8 aminoacizi şi de 10, 11 sau 12 aminoacizi şi, în cazul peptidelor MHC de clasă II (variante alungite ale peptidelor descrise), pot avea o lungime de 15, 16, 17, 18, 19 sau 20 de aminoacizi.
Mai mult, termenul „peptidă» va include săruri ale unei serii de resturi aminoacid conectate între ele, de obicei, prin punţi peptidice între grupările alfa-amino şi carbonil ale aminoacizilor adiacenţi. De preferinţă, sărurile sunt săruri acceptabile din punct de vedere farmaceutic ale peptidelor, cum ar fi, de exemplu, sărurile de clorură sau acetat (trifluoroacetat). Trebuie menţionat că sărurile peptidelor în conformitate cu prezenta invenţie diferă în mod substanţial de peptidele în starea lor in vivo, întrucât peptidele nu sunt săruri in vivo.
Termenul „peptidă» include, de asemenea, „oligopeptidă». Termenul „oligopeptidă» este folosit în prezentul document pentru a desemna o serie de resturi aminoacid conectate între ele de obicei prin punţi peptidice între grupările alfa-amino şi carbonil ale aminoacizilor adiacenţi. Lungimea oligopeptidei nu este critică pentru invenţie atât timp cât epitopul corect (sau epitopii corecţi) se includ în aceasta. Oligopeptidele au, de obicei, o lungime mai mică de 30 de aminoacizi, dar mai mare de 15 aminoacizi.
Termenul „peptidele din prezenta invenţie» va include, de asemenea, peptida care constă din peptida definită mai sus în conformitate cu SEQ ID NO: 82.
Termenul „polipeptidă» desemnează o serie de resturi aminoacid conectate între ele de obicei prin punţi peptidice între grupările alfa-amino şi -carbonil ale aminoacizilor adiacenţi. Lungimea polipeptidei nu este critică pentru invenţie atâta timp cât sau epitopii corecţi se păstrează. Spre deosebire de termenii „peptidă» sau „oligopeptidă», termenul „polipeptidă» se referă la molecule care conţin mai mult de circa 30 de resturi de aminoacid.
O peptidă, oligopeptidă, proteină sau polinucleotidă care codifică o astfel de moleculă este „imunogenă» (desemnată prin termenul „imunogen» în prezenta invenţie) dacă este capabilă să inducă un răspuns imunitar. În cazul prezentei invenţii, imunogenitatea este definită mai specific ca fiind abilitatea de a induce un răspuns mediat de celulele T. Astfel, o „imunogenă» este o moleculă capabilă să inducă un răspuns imunitar şi, în cazul prezentei invenţii, o moleculă capabilă să inducă un răspuns al celulelor T. Într-un alt aspect, imunogenul poate fi peptida, complexul peptidei cu MHC, oligopeptida şi/sau proteina care este utilizată pentru a ridica anticorpi sau TCR-uri specifice împotriva acesteia.
Un „epitop» al celulei T de clasă I necesită o peptidă scurtă care se leagă de receptorul MHC de clasă I formând un complex ternar (catenă alfa MCH de clasă I, beta-2-microglobulină şi peptidă) care poate fi recunoscut de o celulă T care poartă un receptor de celulă T corespunzător care se leagă de complexul MHC/peptidă cu afinitatea adecvată. Peptidele care se leagă de molecule MHC de clasă I au de obicei o lungime de 8-14 aminoacizi, cel mai frecvent având lungimea de 9 aminoacizi.
La oameni există trei loci genetici diferiţi care codifică moleculele MHC de clasă I (moleculele MHC ale omului sunt şi antigeni leucocitari umani desemnaţi (HLA)): HLA-A, HLA-B, and HLA-C. HLA-A*01, HLA-A*02, and HLA-B*07 sunt exemple de diferite alele MHC de clasă I care pot fi exprimate din aceşti loci.
Tabelul 5: Frecvenţele de exprimare F pentru HLA*A02 şi HLA-A*24 şi cele mai frecvente serotipuri HLA-DR. Frecvenţele sunt deduse din frecvenţele haplotipurilor Gf din populaţia americană adaptate din Mori et al. (Mori et al., 1997) folosind formula Hardy-Weinberg: F = 1-(1-Gf)2. Combinaţiile de A*02 sau A*24 cu anumite alele HLA-DR pot fi îmbogăţite sau mai puţin frecvente decât s-a estimat pe baza frecvenţelor singulare datorită unor dezechilibre de legare. Pentru detalii, vezi Chanock et al. (Chanock et al., 2004).
Alelă Populaţie Fenotip calculat din frecvenţa alelei A*02 Caucaziană (America de Nord) 49,1% A*02 Afro-americană (America de Nord) 34,1% A*02 Asiatic-americană (America de Nord) 43,2% A*02 Latino-americană (America de Nord) 48,3% DR1 Caucaziană (America de Nord) 19,4% DR2 Caucaziană (America de Nord) 28,2% DR3 Caucaziană (America de Nord) 20,6% DR4 Caucaziană (America de Nord) 30,7% DR5 Caucaziană (America de Nord) 23,3% DR6 Caucaziană (America de Nord) 26,7% DR7 Caucaziană (America de Nord) 24,8% DR8 Caucaziană (America de Nord) 5,7% DR9 Caucaziană (America de Nord) 2,1% DR1 Afro-(nord)-americană 13,20% DR2 Afro-(nord)-americană 29,80% DR3 Afro-(nord)-americană 24,80% DR4 Afro-(nord)-americană 11,10% DR5 Afro-(nord)-americană 31,10% DR6 Afro-(nord)-americană 33,70% DR7 Afro-(nord)-americană 19,20% DR8 Afro-(nord)-americană 12,10% DR9 Afro-(nord)-americană 5,80% DR1 Afro-(nord)-americană 6,80% DR2 Afro-(nord)-americană 33,80% DR3 Afro-(nord)-americană 9,20% DR4 Afro-(nord)-americană 28,60% DR5 Afro-(nord)-americană 30,00% DR6 Afro-(nord)-americană 25,10% DR7 Afro-(nord)-americană 13,40% DR8 Afro-(nord)-americană 12,70% DR9 Afro-(nord)-americană 18,60% DR1 Latino-(nord)-americană 15,30% DR2 Latino-(nord)-americană 21,20% DR3 Latino-(nord)-americană 15,20% DR4 Latino-(nord)-americană 36,80% DR5 Latino-(nord)-americană 20,00% DR6 Latino-(nord)-americană 31,10% DR7 Latino-(nord)-americană 20,20% DR8 Latino-(nord)-americană 18,60% DR9 Latino-(nord)-americană 2,10% A*24 Filipine 65% A*24 Neneţia, Rusia 61% A*24:02 Japonia 59% A*24 Malaysia 58% A*24:02 Filipine 54% A*24 India 47% A*24 Coreea de Sud 40% A*24 Sri Lanka 37% A*24 China 32% A*24:02 India 29% A*24 Australia de Vest 22% A*24 SUA 22% A*24 Samara, Rusia 20% A*24 America de Sud 20% A*24 Europa 18%
Peptida invenţiei, de preferinţă atunci când este inclusă într-un vaccin al invenţiei, aşa cum este descris aici, se leagă de diferite tipuri de HLA. Un vaccin poate include şi peptide MHC de clasă a II-a cu pan-legare şi peptide care se leagă la alte alele, care vor fi utile pentru medicamente personalizate. Prin urmare, vaccinul descris poate fi utilizat pentru tratarea cancerului la pacienţi care sunt A*02 pozitivi, întrucât nu este necesară nicio selecţie pentru alotipurile MHC de clasă II din cauza pan-legării acestor peptide.
Într-o realizare preferată, termenul „secvenţă nucleotidică» se referă la un heteropolimer al dezoxiribonucleotidelor.
Secvenţa nucleotidică ce codifică o anumită peptidă, oligopeptidă sau polipeptidă poate fi întâlnită în mod natural sau poate fi construită artificial. În general, segmentele ADN care codifică peptidele, polipeptidele şi proteinele care fac subiectul acestei invenţii sunt asamblate pornind de la fragmente ADNc şi liganzi scurţi oligonucleotidici sau de la serii de oligonucleotide, care asigură o genă sintetică capabilă de a fi exprimată într-o unitate de transcriere recombinantă care conţine elemente regulatoare derivate dintr-un operon microbian sau viral.
Aşa cum se utilizează aici, termenul „o codificare (sau codare) cu nucleotide pentru o peptidă» se referă la o codificare cu o secvenţă de nucleotide pentru peptidă care include coduri de start şi stop artificiale (făcute de om) compatibile pentru sistemul biologic pentru care secvenţa urmează să fie exprimată, de exemplu, o celulă dendritică sau un alt sistem celular util pentru producerea de TCR.
Aşa cum este utilizată aici, referirea la o secvenţă de acid nucleic include atât acid nucleic monocatenar, cât şi acid nucleic dublu-catenar. Astfel, de exemplu pentru ADN, secvenţa specifică, dacă contextul nu indică altminteri, se referă la ADN-ul monocatenar al secvenţei respective, la duplexul respectivei secvenţe cu complementul acesteia (ADN dublu catenar) şi la complementul secvenţei respective.
Termenul „regiune de codare» se referă la acea porţiune a genei care codifică, fie în mod natural, fie în mod normal, produsul de exprimare al acelei gene în mediul său genomic natural, adică regiunea care codifică in vivo produsul de expresie nativ al genei respective.
Regiunea de codificare poate fi derivată dintr-o genă non-mutantă („normală»), mutantă sau alterată ori poate fi derivată chiar dintr-o secvenţă ADN sau o genă sintetizată în întregime în laborator folosindu-se metode bine cunoscute profesioniştilor din domeniul sintezelor ADN.
Termenul „produs de exprimare» se referă la polipeptida sau proteina care reprezintă produsul natural de translaţie al genei şi orice echivalenţi de codificare a secvenţei de acid nucleic rezultaţi din degenerarea codului genetic care, astfel, codifică aceiaşi aminoacizi.
Termenul „fragment», atunci când se referă la o secvenţă de codificare, înseamnă o porţiune de ADN care conţine mai puţin decât regiunea completă de codificare, al cărei produs complet de exprimare reţine, în principal, aceeaşi funcţie sau activitate biologică ca şi produsul de exprimare al întregii regiuni de codificare.
Termenul „segment ADN» se referă la un polimer ADN, sub forma unui fragment separat sau ca o componentă a unei construcţii ADN mai mari, care a fost obţinută din ADN izolat cel puţin o dată în formă substanţială pură, adică fără contaminanţi endogeni şi în cantităţi sau concentraţii care permit identificarea, manipularea şi recuperarea segmentului şi a secvenţelor nucleotidice componente prin metode biochimice standard, de exemplu prin utilizarea unui vector de clonare. Aceste segmente sunt furnizate sub forma unui cadru deschis de citire, neîntrerupt de secvenţe interne netraduse (sau introni) care sunt de obicei prezente în genele eucariote. Secvenţele de ADN netradus pot fi prezente în aval de cadrul de citire deschis, unde acestea nu interferă cu manipularea sau exprimarea regiunilor de codificare.
Termenul „amorsă» se referă la o secvenţă de acid nucleic scurtă care se poate împerechea cu o monocatenă ADN şi care asigură un capăt 3'-OH liber la nivelul căruia ADN polimeraza începe sinteza unei catene de dezoxiribonucleotide.
Termenul „promotor» se referă la o regiune ADN implicată în legarea ARN-polimerazei pentru a iniţia transcrierea.
Termenul „izolat» se referă la faptul că materialul este îndepărtat din mediul său original (de exemplu, mediul natural, dacă apare în mod natural). De exemplu, o polinucleotidă sau polipeptidă care apare natural într-un animal viu nu este izolată; dar aceeaşi polinucleotidă sau polipeptidă separată de una sau toate materialele coexistente din sistemul natural reprezintă un izolat. Aceste polinucleotide pot face parte dintr-un vector şi/sau aceste polinucleotide sau polipeptide pot face parte dintr-un compus, dar rămânând izolate deoarece vectorul sau compusul nu face parte din mediul natural.
Polinucleotidele şi polipeptidele recombinate sau imunogene, dezvăluite în conformitate cu prezenta invenţie, pot să fie în formă „purificată». Termenul „purificat» nu se referă la puritate absolută; mai degrabă este intenţionat ca definiţie relativă, şi poate include produse care sunt înalt purificate sau produse care sunt numai parţial purificate, deoarece aceşti termeni sunt înţeleşi de cei instruiţi în domeniul relevant. Pentru exemplificare, clonele individuale izolate dintr-o bibliotecă de ADNc au fost purificate în mod convenţional până la omogenitate electroforetică. Purificarea materialelor de început sau naturale până la cel puţin un ordin de mărime, preferabil la două sau trei ordine de mărime, şi ideal la patru sau cinci ordine de mărime este de dorit în special. Mai mult, este descrisă în mod special o polipeptidă revendicată care are o puritate de, preferabil, 99,999%, sau cel puţin 99,99% sau 99,9%; sau chiar şi 99% ca greutate sau mai mare.
Produsele de exprimare a acizilor nucleici şi polipeptidelor descrise conform prezentei invenţii, precum şi vectorii de exprimare care conţin aceşti acizi nucleici şi/sau aceste polipeptide pot fi în „formă îmbogăţită». În accepţiunea documentului, termenul „îmbogăţit» se referă la faptul că materialul respectiv este în concentraţie de cel puţin 2, 5, 10, 100 sau 1000 de ori mai mare decât concentraţia sa naturală (de exemplu), mai avantajos 0,01% masic, preferabil cel puţin 0,1% masic. Produsele îmbogăţite cu 0,5%, 1%, 5%, 10% şi 20% masic sunt de asemenea de interes. Secvenţele, compuşii, vectorii, clonele şi celelalte materiale care sunt cuprinse în prezentul brevet pot fi, în funcţie de interes, în formă îmbogăţită sau izolată.
În accepţiunea prezentului document, termenii „porţiune», „segment» şi „fragment», atunci când sunt folosiţi în raport cu polipeptidele, se referă la o secvenţă continuă de resturi, cum ar fi resturi de aminoacid, care secvenţă formează un subset al unei secvenţe mai mari. De exemplu, dacă o polipeptidă este supusă unui tratament cu oricare dintre endopeptidazele uzuale, cum ar fi tripsina sau chimotripsina, oligopeptidele care rezultă din acest tratament reprezintă porţiuni, segmente sau fragmente ale polipeptidei iniţiale. Atunci când sunt folosiţi în raport cu polinucleotidele, aceşti termeni se referă la produse obţinute prin tratarea polinucleotidelor respective cu oricare dintre endonucleazele uzuale.
În accepţiunea prezentului brevet, termenul de „identitate procentuală» sau „procentaj identic», cu referire la o secvenţă, presupune că o secvenţă este comparată cu o secvenţă patentată sau descrisă după alinierea secvenţei care se compară („secvenţa comparată») cu secvenţa descrisă sau patentată („secvenţă de referinţă»). Identitatea procentuală se determină conform următoarei formule:
identitate procentuală = 100 [1-(C/R)]
unde C este numărul de diferenţe dintre secvenţa de referinţă şi secvenţa comparată pe lungimea aliniamentului dintre secvenţa de referinţă şi cea comparată, în care
(i) fiecare bază sau aminoacid din secvenţa de referinţă care nu are un corespondent aliniat, bază sau aminoacid, în secvenţa comparată şi (ii) fiecare lipsă din secvenţa de referinţă şi (iii) fiecare bază sau aminoacid aliniat(ă) din secvenţa de referinţă care diferă de baza sau aminoacidul aliniat din secvenţa comparată, reprezintă diferenţe;
(iiii) alinierea trebuie să înceapă la poziţia 1 a secvenţelor aliniate;
şi R este numărul de baze sau aminoacizi din secvenţa de referinţă pe lungimea alinierii cu secvenţa comparată, orice lipsă apărută în secvenţa de referinţă fiind de asemenea numărată ca bază sau aminoacid.
Dacă există un aliniament între secvenţa comparată şi secvenţa de referinţă pentru care identitatea procentuală calculată anterior este aproximativ egală cu, sau mai mare decât o identitate procentuală minimă specificată, atunci secvenţa comparată are o identitate procentuală minimă specificată cu secvenţa de referinţă, deşi pot exista aliniamente pentru care anterior-menţionata identitate procentuală să fie mai mică decât identitatea procentuală specificată.
După cum s-a menţionat mai sus, prezenta invenţie se referă, prin urmare, la o peptidă constând din secvenţa aminoacidică în conformitate cu SEQ ID NO 82.
În prezenta invenţie, termenul „omolog» se referă la gradul de identitate (consultaţi secţiunea „Identitate procentuală» de mai sus) dintre secvenţele a două secvenţe de aminoacizi, adică secvenţe peptidice sau polipeptidice. Anterior menţionata „omologie» se stabileşte prin compararea a două secvenţe aliniate in condiţii optime cu secvenţele care vor trebui comparate. O astfel de omologie a secvenţei se poate calcula prin crearea unei alinieri folosind, de exemplu, algoritmul ClustalW. Programe de analiză a secvenţei disponibile în mod obişnuit, mai specific Vector NTI, GENETYX sau alte instrumente sunt furnizate de baze de date publice.
Specialiştii în domeniu vor putea analiza dacă celulele T induse de o variantă a peptidei specifice vor putea reacţiona încrucişat cu peptida în sine (Appay et al., 2006; Colombetti et al., 2006; Fong et al., 2001; Zaremba et al., 1997).
Celulele T pot apoi reacţiona încrucişat cu celulele şi pot ucide celulele care exprimă o polipeptidă care conţine secvenţa naturală de aminoacizi a peptidei înrudite definite în descrierea invenţiei. După cum se poate deriva din literatura de specialitate şi baze de date (Rammensee et al., 1999; Godkin et al., 1997), anumite poziţii ale peptidelor care leagă HLA sunt de obicei reziduuri ancoră care constituie o secvenţă centrală care corespunde tiparului de cuplare al incizurii de cuplare a receptorului HLA, care este definit de proprietăţile polare, electrofizice, hidrofobe şi spaţiale ale lanţului polipeptidei care constituie incizura de cuplare.
Într-o realizare a prezentei invenţii, peptida face parte dintr-o proteină de fuziune care conţine, de exemplu, cei 80 aminoacizi N-terminali ai lanţului invariabil asociat antigenului HLA-DR (p33, următoarea „Ii») derivaţi din NCBI, număr de identificare GenBank X00497. În alte fuziuni, peptidele din prezenta invenţie pot fi fuzionate la un anticorp aşa cum este descris aici, sau o parte funcţională a acestuia, în special într-o secvenţă a unui anticorp, astfel încât să fie direcţionate în mod specific de respectivul anticorp, sau, de exemplu, către sau într-un anticorp care este specific pentru celulele dendritice descrise în acest document.
În plus, peptida se poate ulterior modifica pentru a îmbunătăţi stabilitatea şi/sau legarea de molecule MHC pentru a exercita un răspuns imun mai puternic. Metodele pentru această optimizare a secvenţei de peptidă este cunoscută în domeniu şi poate include, de exemplu, introducerea unor legături non-peptidice.
O legătură non-peptidică este, de exemplu, -CH2-NH, -CH2S-, -CH2CH2-, -CH=CH-, -COCH2-, -CH(OH)CH2-, şi -CH2SO-. US 4,897,445 furnizează o metodă pentru sinteza în fază solidă a unor legături non-peptidice (-CH2-NH) în lanţuri de polipeptide care implică polipeptide sintetizate de procedurile standard şi legături non-peptidice sintetizate prin reacţia dintre o amino-aldehidă şi un aminoacid în prezenţa NaCNBH3.
Peptidele care conţin secvenţele descrise mai sus pot fi sintetizate cu ajutorul unor grupări chimice suplimentare prezente la capetele amino- sau carboxi-terminale, pentru a îmbunătăţi stabilitatea, biodisponibilitatea şi/sau afinitatea peptidelor. De exemplu, grupările hidrofobe, cum ar fi carbo-benzoxil, dansil sau T-butil-oxi-carbonil pot fi adăugate capătului peptidic amino-terminal. Similar, o grupare acetil sau o grupare 9-fluorenil-metoxi-carbonil se poate plasa la capătul amino-terminal al peptidei. În plus, grupările hidrofobe, cum ar T-butil-oxi-carbonil, sau o grupare amido- pot fi adăugate capătului peptidic amino-terminal.
O peptidă în care peptida include punţi non-peptidice este o concretizare preferată a invenţiei. În general, peptidele (cel puţin cele care conţin legături peptidice între resturile de acid amino) pot fi sintetizate prin modul Fmoc-poliamidă al sintezei peptidelor în stare solidă, după cum se arată în Lukas et al. (Lukas et al., 1981) şi referinţele citate în document. Protecţia temporară a grupării N-amino este asigurată de gruparea 9-fluorenilmetiloxicarbonil (Fmoc). Clivajul repetitiv al acestei grupări de protecţie cu intensă labilitate de bază este realizat folosind 20% piperidină în N,N-dimetilformamidă. Funcţionalităţile lanţurilor secundare se pot proteja sub forma butil-eterilor (în cazul serinei, treoninei şi tirozinei), a butil-esterilor (în cazul acizilor glutamic şi aspartic), a derivaţilor butiloxicarbonil (în cazul lizinei şi histidinei), a derivaţilor tritil (în cazul cisteinei) şi a derivaţilor de 4-metoxi-2,3,6-trimetilbenzensulfonil (în cazul argininei). Dacă resturile C-terminale sunt glutamina sau asparagina, pentru protejarea funcţiei amido a lanţului secundar se va folosi gruparea 4,4'-dimetoxibenzhidril. Suportul în faza solidă este furnizat de un polimer polidimetil-acrilamidă format din cei trei monomeri dimetilacrilamidă (schelet-monomer), bisacriloetilen diamină (agent de legătură) şi acriloilsarcozin-metil-ester (agent de funcţionalizare). Agentul de legătură peptidă-răşină scindabil folosit este derivatul labil în mediu acid al acidului 4-hidroximetil-fenoxiacetic. Toţi derivaţii aminoacizi sunt adăugaţi sub formă de derivaţi simetrici anhidri preformaţi cu excepţia asparaginei şi glutaminei, care sunt adăugate folosind o procedură de cuplare inversă mediată de N,N-diciclohexil-carbodiimidă/1-hidroxibenzotriazol. Toate reacţiile de cuplare şi deprotejare sunt monitorizate folosind proceduri care folosesc ninhidrină, trinitrobenzen, acid sulfonic şi izotin-test. După finalizarea sintezei, peptidele sunt scindate din suportul rezinic cu îndepărtarea concomitentă a grupărilor protectoare ale lanţurilor secundare prin tratarea cu acid trifluoroacetic 95% care conţine un amestec curăţător 50%. Substanţele de curăţare folosite cel mai frecvent includ etan-ditiol, fenol, anisol şi apă, alegerea exactă fiind dependentă de aminoacizii constituenţi ai peptidei sintetizate. De asemenea, pentru sintetizarea peptidelor, se poate utiliza o combinaţie de metode în stare solidă şi în stare de soluţie (a se vedea, de exemplu, (Bruckdorfer et al., 2004 şi referinţele citate în acest document).
Acidul trifluoroacetic este îndepărtat prin evaporare in vacuo, cu triturarea ulterioară cu dietileter, care duce la formarea peptidei brute. Toate substanţele de curăţare prezente sunt eliminate printr-o procedură simplă de extragere, care, după liofilizare în fază apoasă, conduce la peptida brută fără substanţe de curăţare. Reactivii pentru sinteza peptidelor sunt în general disponibili, de exemplu, de la Calbiochem-Novabiochem (Nottingham, Regatul Unit).
Purificarea poate fi realizată prin una sau mai multe tehnici, precum recristalizarea, cromatografia cu excludere dimensională, cromatografia cu schimb de ioni, cromatografia cu interacţiune hidrofobă şi (de regulă) cromatografia lichidă de înaltă performanţă în fază inversă, folosind, de exemplu, separare în gradient de acetonitril/apă.
Analiza peptidelor poate fi efectuată folosind cromatografie în strat subţire, electroforeză, în particular electroforeză capilară, extragere în fază solidă (CSPE), cromatografie lichidă de înaltă performanţă în fază inversă, analiză a aminoacizilor după hidroliza acidă şi prin analiză spectrometrică în masă la bombardarea rapidă cu atomi (FAB), dar şi analiză spectrometrică în masă de tip MALDI şi ESI-Q-TOF.
Pentru a selecta peptide supraprezentate, se calculează un profil de prezentare arătând prezentarea mediană a probei, precum şi variaţia replicării. Profilul juxtapune probe ale entităţii tumorale de interes pentru o linie de bază a probelor de ţesut normal. Fiecare dintre aceste profiluri poate fi apoi consolidat într-un scor de supraprezentare, calculându-se valoarea p a unui model liniar cu efecte combinate (Pinheiro et al., 2015), care se ajustează pentru testarea multiplă prin rata de descoperire falsă (Benjamini şi Hochberg).
Pentru identificarea şi cuantificarea relativă a liganzilor HLA prin spectrometrie de masă, moleculele HLA din probele de ţesut îngheţat prin şoc au fost purificate şi peptidele asociate cu HLA au fost izolate. Peptidele izolate au fost separate şi secvenţele au fost identificate prin experimente online de nano-electropulverizare-ionizare (nanoESI) prin cromatografie de lichid-spectrometrie de masă (LC-MS). Secvenţele peptidice rezultate au fost verificate prin compararea modelului de fragmentare a TUMAP naturale înregistrate din probe de cancer ovarian cu modele de fragmentare ale peptidelor de referinţă sintetice corespunzătoare ale secvenţelor identice. Deoarece peptidele au fost identificate direct ca liganzi ai moleculelor HLA ale tumorilor primare, aceste rezultate furnizează dovezi directe pentru procesarea şi prezentarea naturale ale peptidelor identificate pe ţesutul canceros primar obţinut de la paciente cu cancer ovarian.
Pipeline-ul descoperirii XPRESIDENT® v2.1 (vezi, de exemplu, US 2013-0096016) permite identificarea şi selectarea candidaţilor relevanţi pentru vaccinare cu peptide supraprezentate pe baza cuantificării relative directe a nivelurilor de peptide HLA-restricţionate pe ţesuturile canceroase comparativ cu mai multe ţesuturi şi organe necanceroase diferite. Acest lucru a fost realizat prin dezvoltarea unei cuantificări diferenţiale fără etichete utilizându-se datele LC-MS obţinute, procesate de un pipeline patentat de analiză a datelor, combinându-se algoritmi pentru identificarea secvenţelor, gruparea spectrală, numărarea ionilor, alinierea timpului de retenţie, deconvoluţia de stare a încărcării şi normalizarea.
Au fost stabilite nivelurile de prezentare, inclusiv estimările de eroare pentru fiecare peptidă şi probă. Au fost identificate peptide prezentate exclusiv pe ţesuturi tumorale şi peptide supraprezentate în tumoră faţă de ţesuturi şi organe necanceroase.
Complexele HLA-peptidă din probe de ţesut de cancer ovarian au fost purificate şi peptidele HLA-asociate au fost izolate şi analizate prin LC-MS (vezi exemplele). Toate peptidele TUMAP conţinute în prezenta aplicaţie au fost identificate cu această abordare pe probe de cancer ovarian primar, confirmându-se prezentarea acestora pe cancer ovarian primar.
Peptidele TUMAP identificate pe mai multe ţesuturi de cancer ovarian şi ţesuturi normale au fost cuantificate utilizându-se numărarea de ioni la datelor LC-MS fără etichete. Metoda presupune că zonele de semnal LC-MS ale unei peptide se corelează cu abundenţa sa în probă. Toate semnalele cantitative ale unei peptide în diferite experimente LC-MS au fost normalizate pe baza tendinţei centrale, mediate per probă şi fuzionate într-o diagramă de bare, denumită profil de prezentare. Profilul de prezentare consolidează diferite metode de analiză, cum ar fi căutarea în baza de date cu proteine, gruparea spectrală, deconvoluţia de stare de încărcare (decompresie) şi alinierea şi normalizarea timpului de retenţie.
Prezenta invenţie furnizează o peptidă care este utilă în tratarea cancerelor/tumorilor, de preferinţă cancer ovarian care supraprezintă sau prezintă exclusiv peptida invenţiei. Spectrometria de masă a arătat că peptida este prezentată în mod natural de moleculele HLA pe probe de cancer ovarian uman primar.
S-a constatat că gena-/proteinele-sursă (denumite, de asemenea, „proteine de lungime completă» sau „proteine subiacente») din care se derivă peptidele sunt foarte supraexprimate în cancer comparativ cu ţesuturile normale - „ţesuturi normale», în raport cu această invenţie, înseamnă celule tisulare ovariene sănătoase sau alte celule tisulare normale care demonstrează un grad ridicat de asociere tumorală a genelor-sursă. Mai mult, peptidele în sine sunt puternic supraprezentate pe ţesutul tumoral - „ţesut tumoral», în raport cu această invenţie, înseamnă o probă de la o pacientă care suferă de cancer ovarian -, însă nu şi pe ţesuturi normale.
Peptidele legate de HLA se pot recunoaşte de către sistemul imunitar, în special de limfocite T. Celulele T pot distruge celulele care prezintă complexul HLA-peptidă recunoscut, de exemplu celulele de cancer ovarian care prezintă peptidele derivate.
Peptida din prezenta invenţie s-a dovedit a fi capabilă să stimuleze răspunsurile celulelor T şi/sau sunt supraprezentate şi astfel pot fi utilizate pentru producerea de anticorpi şi/sau TCR-uri, cum ar fi sTCR-uri solubile, conform prezentei invenţii. Mai mult, complexul format de peptide cu MHC-ul respectiv poate fi folosit şi pentru producţia de anticorpi specifici şi/sau TCR, în particular sTCR, în conformitate cu prezenta invenţie. Metodele respective sunt bine cunoscute de experţii în domeniu şi pot fi găsite şi în literatura de specialitate respectivă. Astfel, peptida din prezenta invenţie este utilă pentru generarea unui răspuns imunitar la un pacient, prin care celulele tumorale pot fi distruse. Răspunsul imunitar la pacient se poate induce prin administrarea directă a peptidelor descrise sau a substanţelor precursor adecvate (de exemplu peptide elongate, proteine sau acizi nucleici care codifică aceste peptide) pacientului, în mod ideal combinate cu un agent care creşte imunogenitatea. Răspunsul imunitar care are originea în astfel de vaccinare terapeutică se poate aştepta să fie foarte specific împotriva celulelor tumorale deoarece peptidele ţintă ale prezentei invenţii nu sunt prezente pe ţesuturi normale în numere de copii comparabile, fapt care previne riscul unor reacţii autoimune nedorite îndreptat împotriva celulelor normale ale pacientului.
Prezenta descriere se referă şi la receptori de celule T (TCR-uri) care cuprind un lanţ alfa şi un lanţ beta („TCR-uri alfa/beta»). Prezenta descriere se referă, de asemenea, la acizi nucleici, vectori şi celule-gazdă pentru exprimarea TCR-urilor şi peptidelor din prezenta descriere, precum şi la metodele de utilizare ale acestora.
Termenul „receptor de celule T» (prescurtat TCR) se referă la o moleculă heterodimerică cuprinzând un lanţ polipeptidic alfa (lanţ alfa) şi un lanţ polipeptidic beta (lanţ beta), în care receptorul heterodimeric este capabil să se lege cu un antigen peptidic prezentat de o moleculă HLA. Termenul include, de asemenea, aşa-numitele TCR-uri gamma/delta.
Într-una dintre concretizări, descrierea oferă o metodă de producere a unui TCR aşa cum este descris aici, metoda cuprinzând cultivarea unei celule-gazdă capabile să exprime TCR-ul în condiţii adecvate pentru promovarea exprimării TCR.
Descrierea într-un alt aspect se referă la metode în conformitate cu descrierea în care antigenul este încărcat pe molecule de MHC de clasă I exprimate pe suprafaţa unei celule prezentatoare de antigen adecvate sau a unei celule prezentatoare de antigen artificiale prin punerea în contact a unei cantităţi suficiente de antigen cu o celulă prezentatoare de antigen sau antigenul este încărcat pe terameri MHC de clasă I prin tetramerizarea monomerilor complexului antigen/MHC de clasă I.
Lanţurile alfa şi beta ale TCR-urilor alfa/beta şi lanţurile gamma şi delta ale TCR-urilor gamma/delta sunt considerate, în general, ca având fiecare două „domenii», respectiv domenii variabile şi constante. Domeniul variabil constă într-o concatenare a regiunii variabile (V) şi a regiunii de unire (J). Domeniul variabil poate include, de asemenea, o regiune lider (L). Lanţurile beta şi delta pot include, de asemenea, o regiune de diversitate (D). Domeniile constante alfa şi beta pot include, de asemenea, domenii transmembranare C-terminale (TM) care ancorează lanţurile alfa şi beta la membrana celulară.
În ceea ce priveşte TCR-urile gamma/delta, termenul „domeniu variabil TCR gamma», aşa cum este utilizat aici, se referă la concatenarea regiunii TCR gamma V (TRGV) fără regiunea lider (L) şi a regiunii TCR gamma J (TRGJ), iar termenul „domeniu constant TCR gamma» se referă la regiunea TRGC extracelulară sau la o secvenţă TRGC trunchiată C-terminal. În mod similar, termenul „domeniu variabil TCR delta» se referă la concatenarea regiunii TCR delta V (TRDV) fără regiunea lider (L) şi a regiunii TCR delta D/J (TRDD/TRDJ), iar termenul „domeniu constant TCR delta» se referă la regiunea TRDC extracelulară sau la o secvenţă TRDC trunchiată C-terminal.
TCR-urile din prezenta descriere se leagă de preferinţă la un complex de molecule peptidice-HLA cu o afinitate de legare (KD) de aproximativ 100 µM sau mai puţin, de aproximativ 50 µM sau mai puţin, de aproximativ 25 µM sau mai puţin ori de aproximativ 10 µM sau mai puţin. Mai preferate sunt TCR-urile cu afinitate ridicată care au afinităţi de legare de aproximativ 1 µM sau mai puţin, de aproximativ 100 nM sau mai puţin, de aproximativ 50 nM sau mai puţin, de aproximativ 25 nM sau mai puţin. Exemple nelimitatoare de afinitate de legare preferate pentru TCR-urile prezentei invenţii includ: de la aproximativ 1 nM până la aproximativ 10 nM; de la aproximativ 10 nM până la aproximativ 20 nM; de la aproximativ 20 nM până la aproximativ 30 nM; de la aproximativ 30 nM până la aproximativ 40 nM; de la aproximativ 40 nM până la aproximativ 50 nM; de la aproximativ 50 nM până la aproximativ 60 nM; de la aproximativ 60 nM până la aproximativ 70 nM; de la aproximativ 70 nM până la aproximativ 80 nM; de la aproximativ 80 nM până la aproximativ 90 nM; şi de la aproximativ 90 nM până la aproximativ 100 nM.
Aşa cum este utilizat aici în legătură cu TCR-urile din prezenta descriere, „legare specifică» şi variante gramaticale ale acestei sintagme sunt utilizate pentru a desemna un TCR care are o afinitate de legare (KD) pentru un complex molecular peptidă-HLA de 100 µM sau mai puţin.
TCR-uri alfa/beta heterodimerice din prezenta descriere pot avea o legătură disulfurică introdusă între domeniile lor constante. TCR-urile preferate de acest tip le includ pe cele care au o secvenţă de domeniu constant TRAC şi o secvenţă de domeniu constant TRBC1 sau TRBC2, cu excepţia faptului că Thr 48 din TRAC şi Ser 57 din TRBC1 sau TRBC2 sunt înlocuite cu reziduuri de cisteină, cisteinele menţionate formând o legătură disulfurică între secvenţa de domeniu constant TRAC şi secvenţa de domeniu constant TRBC1 sau TRBC2 a TCR-ului.
Cu sau fără legătura între lanţuri introdusă menţionată mai sus, TCR-urile heterodimerice alfa/beta din prezenta descriere pot avea o secvenţă de domeniu constant TRAC şi o secvenţă de domeniu constant TRBC1 sau TRBC2, iar secvenţa de domeniu constant TRAC şi de domeniu constant TRBC1 sau TRBC2 a TCR-ului poate fi legată de legătura disulfurică nativă dintre Cys4 din exonul 2 al TRAC şi Cys2 din exonul 2 al TRBC1 sau TRBC2.
TCR-urile din prezenta descriere pot cuprinde o etichetă detectabilă aleasă din grupul constând dintr-un radionuclid, un fluorofor şi biotină. TCR-urile din prezenta descriere pot fi conjugate cu un agent activ terapeutic, cum ar fi un radionuclid, un agent chimioterapeutic sau o toxină.
Într-una dintre concretizări, un TCR din prezenta descriere care are cel puţin o mutaţie în lanţul alfa şi/sau cel puţin o mutaţie în lanţul beta a modificat glicozilarea în comparaţie cu TCR-ul fără mutaţie.
În altă concretizare, un TCR cuprinzând cel puţin o mutaţie în lanţul alfa TCR şi/sau lanţul beta TCR are o afinitate de legare pentru şi/sau o semiviaţă de legare pentru un complex de molecule peptidă-HLA care este cel puţin dublu faţă de un TCR cuprinzând lanţul alfa TCR fără mutaţie şi/sau lanţul beta TCR fără mutaţie. Creşterea afinităţii TCR-urilor specifice tumorii şi exploatarea acesteia se bazează pe existenţa unei ferestre pentru afinităţi optime ale TCR-urilor. Existenţa unei astfel de ferestre se bazează pe observaţii conform cărora TCR-urile specifice pentru agenţii patogeni cu HLA-A2-restricţionaţi au valori KD care sunt în general de aproximativ 10 ori mai mici în comparaţie cu TCR-uri specifice pentru autoantigenii asociaţi tumorii HLA-A2-restricţionate. Este cunoscut acum că, deşi antigenii tumorali au potenţialul de a fi imunogeni, deoarece tumorile apar din propriile celule ale individului, numai proteinele cu mutaţie sau proteinele cu procesare translaţională modificată vor fi văzute ca străine de către sistemul imunitar. Antigenii care sunt reglaţi în sens crescător sau supraexprimaţi (aşa-numiţii autoantigeni) nu vor induce neapărat un răspuns imun funcţional împotriva tumorii: Celulele T care exprimă TCR-uri foarte reactive la aceşti antigeni au fost selectate negativ în timus într-un proces cunoscut sub numele de toleranţă centrală, ceea ce înseamnă că rămân doar celulele T cu TCR-uri cu afinitate scăzută pentru autoantigeni. Prin urmare, afinitatea TCR-urilor sau a variantelor din prezenta descriere pentru o peptidă inovatoare poate fi îmbunătăţită prin metode bine cunoscute în domeniu.
Prezenta descriere se mai referă la o metodă de identificare şi de izolare a unui TCR în conformitate cu prezenta descriere, respectiva metodă cuprinzând incubarea de PBMC-uri de la donatori sănătoşi HLA-A*02-negativi cu monomeri peptidici/A2, incubarea PBMC-urilor cu tetramer-ficoeritrină (PE) şi izolarea celulelor T cu aviditate ridicată prin analiză cu sortare de celule activată prin fluorescenţă (FACS)-Calibur.
Prezenta descriere se mai referă la o metodă de identificare şi de izolare a unui TCR în conformitate cu prezenta descriere, respectiva metodă cuprinzând obţinerea unui şoarece transgenic cu întreaga loci a genei TCRαꞵ complet umani (1,1 şi 0,7 Mb) ale cărui celule T exprimă un repertoriu divers de TCR-uri uman, repertoriu care compensează deficienţa de TCR-uri de şoarece, imunizând şoarecele cu Peptidă, incubând PBMC-urile obţinute de la şoarecii transgenici cu tetramer-fitoceritrină (PE) şi izolând celulele T cu aviditate ridicată prin analiză cu sortare de celule activată prin fluorescenţă (FACS)-Calibur.
Într-unul dintre aspecte, pentru a obţine celule T care exprimă TCR-uri din prezenta descriere, acizii nucleici care codifică lanţurile TCR-alfa şi/sau TCR-beta din prezenta descriere sunt clonaţi în vectori de exprimare, de exemplu gamma-retrovirus sau gamma-lentivirus. Virusurile recombinante sunt generate şi apoi testate pentru funcţionalitate, cum ar fi specificitatea antigenică şi aviditatea funcţională. O parte alicotă a produsului final este apoi utilizată pentru a transduce populaţia de celule T ţintă (în general purificată din PBMC-urile pacientului), care este extinsă înainte de perfuzare în pacient.
Într-un alt aspect, pentru a obţine celule T care exprimă TCR-uri din prezenta descriere, ARN-urile TCR-urilor sunt sintetizate prin tehnici cunoscute în domeniu, de exemplu, cu sisteme de transcripţie in vitro. ARN-urile de TCR sintetizate in vitro sunt apoi introduse în celulele T CD8 + primare obţinute de la donatori sănătoşi prin electroporare pentru a reexprima lanţurile TCR-alfa şi/sau TCR-beta specifice tumorii.
Pentru a creşte exprimarea, acizii nucleici care codifică TCR-urile din prezenta descriere pot fi legaţi în mod operaţional cu promotori puternici, cum ar fi repetiţiile terminale lungi retrovirale (LTR-uri), citomegalovirusul (CMV), virusul celulelor stem murine (MSCV) U3, fosfogliceratul kinazic (PGK) , ꞵ-actina, ubiquitina şi un promotor compus de virus simian 40 (SV40)/CD43, factorul de alungire (EF)-1a şi promotorul de virus formator de focar splenic (SFFV). Într-o concretizare preferată, promotorul este heterolog cu acidul nucleic exprimat.
În afară de promotori puternici, casetele de exprimare a TCR-urilor din prezenta descriere pot conţine elemente suplimentare care pot îmbunătăţi exprimarea transgenică, inclusiv un tract polipurinic central (cPPT), care promovează translocarea nucleară a construcţiilor lentivirale (Follenzi et al., 2000), şi elementul de reglare post-transcripţional al virusului hepatitei marmotei (wPRE), care creşte nivelul de exprimare transgenică prin creşterea stabilităţii ARN-ului (Zufferey et al., 1999).
Lanţurile alfa şi beta ale unui TCR din prezenta invenţie pot fi codificate de acizi nucleici localizaţi în vectori separaţi sau pot fi codificate de polinucleotide localizate în acelaşi vector.
Realizarea unei exprimări de suprafaţă de nivel ridicat a TCR-urilor necesită ca atât lanţurile TCR-alfa, cât şi lanţurile TCR-beta ale TCR-urilor introduse să fie transcrise la niveluri ridicate. Pentru a realiza acest lucru, lanţurile TCR-alfa şi TCR-beta din prezenta descriere pot fi clonate în construcţii bi-cistronice într-un singur vector, care s-a dovedit a fi capabil să depăşească acest obstacol. Utilizarea unui loc viral de intrare intra-ribozomal (IRES) între lanţurile TCR-alfa şi TCR-beta are ca rezultat exprimarea coordonată a ambelor lanţuri, deoarece lanţurile TCR-alfa şi TCR-beta sunt generate dintr-o singură transcriere care este scindată în două proteine în timpul translaţiei, asigurându-se producerea unui raport molar egal al lanţurilor TCR-alfa şi TCR-beta. (Schmitt et al. 2009).
Acizii nucleici care codifică TCR-urile din prezenta descriere pot fi optimizaţi cu codoni pentru a creşte exprimarea de la o celulă-gazdă. Redundanţa în codul genetic permite codificarea unor aminoacizi de către mai mulţi codoni, însă anumiţi codoni sunt mai puţin „optimi» decât alţii din cauza disponibilităţii relative a ARNt-urilor corespondente, precum şi a altor factori (Gustafsson et al., 2004). Modificarea secvenţelor de gene TCR-alfa şi TCR-beta astfel încât fiecare aminoacid să fie codificat de codonul optim pentru exprimarea genelor de mamifere, precum şi eliminarea motivelor de instabilitate a ARNm-ului sau a locurilor de îmbinare criptice, s-a dovedit că îmbunătăţeşte semnificativ exprimarea genelor TCR-alfa şi TCR-beta (Scholten et al., 2006).
Mai mult, împerecherea greşită între lanţurile de TCR-uri introduse şi endogene poate cauza dobândirea de specificităţi care prezintă un risc semnificativ pentru autoimunitate. De exemplu, formarea de dimeri de TCR-uri mixte poate reduce numărul de molecule CD3 disponibile pentru formarea de complexe TCR împerecheate corespunzător şi, prin urmare, poate scădea semnificativ aviditatea funcţională a celulelor care exprimă TCR-ul introdus (Kuball et al., 2007).
Pentru a reduce împerecherea greşită, domeniul C-terminal al lanţurilor TCR introduse din prezenta descriere poate fi modificat pentru promovarea afinităţii între lanţuri, reducând totodată capacitatea lanţurilor introduse de a se împerechea cu TCR-ul endogen. Aceste strategii pot include înlocuirea domeniilor TCR-alfa şi TCR-beta C-terminale umane cu omologii lor murini (domeniul C-terminal murinizat); generarea unei a doua legături de disulfură între lanţuri în domeniul C-terminal prin introducerea unui al doilea reziduu de cisteină atât în ​​lanţurile TCR-alfa, cât şi în lanţurile TCR-beta ale TCR-ului introdus (modificare a cisteinei); schimbarea între ele a reziduurilor care interacţionează în domeniile C-terminale ale lanţurilor TCR-alfa şi TCR-beta („buton în gaură»); şi fuzionarea domeniilor variabile ale lanţurilor TCR-alfa şi TCR-beta direct cu CD3ζ (fuziune CD3ζ). (Schmitt et al. 2009).
Într-una dintre concretizări, o celulă-gazdă este modificată pentru a exprima un TCR al prezentei descrieri. În concretizările preferate, celula-gazdă este o celulă T umană sau un progenitor de celule T. În unele concretizări, celula T sau progenitorul celulei T este obţinut de la un pacient cu cancer. În alte concretizări, celula T sau progenitorul celulei T este obţinut de la un donator sănătos. Celulele-gazdă din prezenta descriere pot fi alogene sau autologe în raport cu un pacient care urmează să fie tratat. Într-una dintre concretizări, gazda este o celulă T gamma/delta transformată pentru a exprima un TCR alfa/beta.
O „compoziţie farmaceutică» este compoziţie potrivită pentru administrarea la o fiinţă umană într-un cadru medical. De preferinţă, o compoziţie farmaceutică este sterilă şi produsă conform recomandărilor GMP.
Compoziţiile farmaceutice conţin peptidele fie în forma liberă fie sub forma unei săruri acceptabile din punct de vedere farmaceutic (a se vedea mai sus). În accepţiunea prezentului document, „sare acceptabilă din punct de vedere farmaceutic» se referă la un derivat al peptidei menţionate în care peptida este modificată prin formarea de săruri acide sau bazice ale agentului. De exemplu, sărurile acide sunt preparate din baza liberă (de obicei, în forma neutră, medicamentul are un grup -NH2 neutru) implicând reacţia cu un acid adecvat. Acizii adecvaţi pentru pregătirea sărurilor acide includ atât acizi organici (de exemplu acid acetic, acid propionic, acid glicolic, acid piruvic, acid oxalic, acid malic, acid malonic, acid succinic, acid maleic, acid fumaric, acid tartaric, acid citric, acid benzoic, acid cinamic, acid mandelic, acid metansulfonic, acid etansulfonic, acid p-toluensulfonic, acid salicilic şi alţii asemenea lor). cât şi acizi anorganici, cum ar fi acidul clorhidric, acidul bromhidric, acidul sulfuric, acidul azotic, acidul fosforic şi alţii asemenea lor. Dimpotrivă, preparatele sărurilor bazice ale grupărilor acide care pot face parte din peptidă sunt preparate folosind o bază acceptabilă farmaceutic, cum ar fi hidroxidul de sodiu, hidroxidul de potasiu, hidroxidul de amoniu, hidroxidul de calciu, trimetilamina sau altele asemenea.
Într-o concretizare preferată în mod special, compusul farmaceutic cuprinde peptidele sub forma unor săruri de acid acetic (acetaţi), trifluor-acetaţi sau săruri de acid clorhidric (cloruri).
Preferabil, medicamentul din prezenta invenţie este unul imunoterapeutic, de exemplu un vaccin. Acesta poate fi administrat direct pacientului, în organul afectat sau administrat pe cale sistemică, i.d., i.m., s.c., i.p. şi i.v. sau aplicat ex vivo celulelor preluate de la pacient sau unei linii de celule umane care sunt apoi administrate pacientului sau utilizate in vitro pentru selectarea unei subpopulaţii de celule imune derivate de la pacient, care sunt apoi readministrate pacientului. Dacă acidul nucleic este administrat celulelor in vitro, poate fi util ca celulele să fie transfectate astfel încât să coexprime citochine imunostimulatoare, cum este interleukina 2. Peptida poate fi substanţial pură sau combinată cu un adjuvant stimulator imun (vezi mai jos) ori poate fi utilizată în combinaţie cu citokine imunostimulatoare sau poate fi administrată cu un sistem de livrare adecvat, de exemplu lipozomi. De asemenea, peptida poate fi conjugată cu un transportor adecvat, cum ar fi hemocianina melcului Megathura crenulata (keyhole limpet hemocyanin, KLH) sau mannan (vezi WO 95/18145 şi (Longenecker et al.1993)). Peptida poate fi, de asemenea, ţintită, o proteină de fuziune sau o moleculă hibridă. Se anticipează că peptidele a căror secvenţă este furnizată în prezenta invenţie vor stimula celule T CD4 sau CD8. Cu toate acestea, stimularea celulelor T CD8 este mai eficientă în prezenţa celulelor T helper CD4. În consecinţă, pentru epitopii MHC de clasă I care stimulează celulele T CD8, partenerul sau secţiunile de fuziune ale unei molecule hibride furnizează în mod adecvat epitopi care stimulează celule T CD4-pozitive. Epitopii care stimulează CD4 şi CD8 sunt bine-cunoscuţi în domeniu şi includ pe cei identificaţi în prezenta invenţie.
Într-unul dintre aspecte, vaccinul cuprinde cel puţin o peptidă care are secvenţa de aminoacizi prezentată SEQ ID NO. 82 şi cel puţin o peptidă suplimentară, de preferinţă două până la 50, mai preferabil două până la 25, chiar mai preferabil două până la 20 şi cel mai preferabil două, trei, patru, cinci, şase, şapte, opt, nouă, zece, unsprezece, doisprezece, treisprezece, paisprezece, cincisprezece, şaisprezece, şaptesprezece sau optsprezece peptide. Peptida(ele) poate (pot) fi preluată(e) din unul sau mai multe TAA specifice şi se pot lega de molecule MHC de clasă I.
Un alt aspect al invenţiei furnizează un acid nucleic (de exemplu o polinucleotidă) care codifică o peptidă din invenţie. Polinucleotida poate fi, de exemplu, ADN, ADNc, APN, ARN sau o combinaţie a acestora, în helix simplu şi/sau dublu sau în forme native sau stabilizate de polinucleotide, cum ar fi, de exemplu, polinucleotidele cu bază de fosforotioat şi poate conţine sau nu introni, cu condiţia să codifice pentru peptidă. Desigur, numai peptidele care conţin resturi de aminoacid existente în mod natural şi unite prin legături peptidice care apar în mod natural sunt codificabile de o polinucleotidă. Un alt aspect al invenţiei constă în furnizarea unui vector de expresie care exprimă o polipeptidă, conform invenţiei.
Au fost dezvoltate mai multe metode de legare a polinucleotidelor, în special a ADN-ului, de vectori, de exemplu, prin terminale coezive complementare. De exemplu segmentului ADN i se pot adăuga regiuni homopolimerice complementare care să fie introduse în ADN-ul vector. Vectorul şi segmentul ADN sunt apoi unite prin punţi de hidrogen între cozile complementare homopolimer pentru a forma molecule ADN recombinate.
Agenţii de legătură sintetici care conţin unul sau mai multe situri limitative oferă o modalitate alternativă de alăturare a segmentelor ADN la vectori. Agenţii de legare care conţin o varietate de situri de endonucleaze de restricţie sunt disponibili comercial de la mai multe surse, dintre care amintim pe International Biotechnologies Inc., New Haven, CN, SUA.
O metodă preferabilă de modificare a ADN-ului care codifică polipeptida invenţiei utilizează reacţia de polimerază în lanţ descrisă de Saiki RK, et al. (Saiki et al., 1988). Această metodă poate fi utilizată pentru introducerea ADN-ului într-un vector potrivit, de exemplu prin implementarea în locaţii cu restricţii adecvate sau poate fi utilizată pentru modificarea ADN-ului în alte moduri, după cum este cunoscut în literatura de specialitate. În cazul utilizării unor vectori virali, sunt preferaţi vectorii virus variolic sau adenovirus.
ADN-ul (sau în cazul vectorilor retrovirali, ARN-ul) pot fi apoi exprimaţi într-o gazdă adecvată pentru a produce o polipeptidă compusă din peptidă sau varianta invenţiei. Prin urmare, ADN-ul care codifică peptida sau varianta din invenţie poate fi utilizat în conformitate cu tehnicile cunoscute, modificate corespunzător instrucţiunilor prezente, în vederea construirii unui vector de expresie, care este apoi utilizat pentru transformarea unei celule-gazdă corespunzătoare pentru exprimarea şi producerea polipeptidei din invenţie. Astfel de tehnici includ cele descrise, de exemplu, în US 4,440,859, 4,530,901, 4,582,800, 4,677,063, 4,678,751, 4,704,362, 4,710,463, 4,757,006, 4,766,075 şi 4,810,648.
ADN-ul (sau în cazul vectorilor retrovirali, ARN-ul) care codifică polipeptida care formează compusul invenţiei poate fi cuplat cu o mare varietate de alte secvenţe ADN pentru introducerea într-o gazdă adecvată. ADN-ul însoţitor va depinde de natura gazdei, modul de introducere a ADN-ului în gazdă şi dacă se doreşte integrarea sau întreţinerea episomală.
În general, ADN-ul este inserat într-un vector de expresie, cum ar fi o plasmidă, cu orientarea corectă şi intervalul potrivit de citire pentru expresie. Dacă este necesar, ADN-ul poate fi corelat cu secvenţele de nucleotide de transcriere şi translaţie corespunzătoare, recunoscute de gazda dorită, cu toate că astfel de controale sunt disponibile în general în vectorul de expresie. Vectorul este apoi introdus în gazdă prin tehnicile standard. În general, nu toate gazdele vor fi transformate de vector. Prin urmare, va fi nevoie de selectarea unor celule-gazdă transformate. Una dintre tehnicile de selectare implică înglobarea în vectorul de exprimare a unei secvenţe ADN cu toate elementele de control necesare, care să codifice o trăsătură selectabilă din celula transformată, cum ar fi de exemplu rezistenţa la antibiotic.
Alternativ, gena unei asemenea trăsături selectabile poate fi pe un alt vector, care este folosit pentru a cotransforma celula-gazdă dorită.
Celulele-gazdă care au fost transformate de ADN-ul recombinant din cadrul invenţiei sunt apoi cultivate un timp suficient şi în condiţii corespunzătoare, cunoscute celor iniţiaţi, în conformitate cu îndrumările din acest document, pentru a permite exprimarea polipeptidei, care poate fi apoi recuperată.
Sunt cunoscute numeroase sisteme de exprimare, inclusiv bacterii (de exemplu, E. coli şi Bacillus subtilis), drojdii (de exemplu, Saccharomyces cerevisiae), fungi filamentoşi (de exemplu, Aspergillus spec.), celule vegetale, celule animale şi celule provenite de la insecte. Este de preferat ca sistemul să poată fi format din celule de mamifere, cum ar fi celulele CHO, disponibile din ATCC Cell Biology Collection.
O plasmidă vector tipică din celulă de mamifer pentru expresia constitutivă este compusă din protomerul CMV sau SV40 cu o coadă poli-A adecvată şi un marker de rezistenţă, cum ar fi neomicina. Un exemplu este pSVL, disponibil la Pharmacia, Piscataway, NJ, SUA. Un exemplu de vector de expresie la mamifere inductibil este pMSG, disponibil tot de la Pharmacia. Plasmide-vector utile provenite din drojdii sunt pRS403-406 şi pRS413-416 şi sunt disponibile comercial de la Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA 92037, SUA. Plasmidele pRS403, pRS404, pRS405 şi pRS406 sunt plasmide integrative din drojdii (Yeast Integrating plasmids, YIp) şi includ markerii selectabili din drojdii HIS3, TRP1, LEU2 şi URA3. Plasmidele pRS413-416 sunt plasmide centromer provenite din drojdii (Yeast Centromere plasmid, Ycp). Vectorii bazaţi pe stimulenţi CMV (de exemplu de la Sigma-Aldrich) furnizează o expresie tranzitorie sau stabilă, o expresie sau secreţie citoplasmică şi o marcare N-terminală sau C-terminală în diferite combinaţii de FLAG, 3xFLAG, c-myc sau MAT. Aceste proteine de fuziune permit detectarea, purificarea şi analiza proteinei recombinante. Fuziunile marcate dublu oferă flexibilitate la detectare.
Regiunea de reglare promotoare pentru citomegalovirusul uman puternic (CMV) determină creşterea nivelurilor expresiei de proteină constitutivă până la 1 mg/l în celulele COS. Pentru liniile de celule cu potenţial mai mic, nivelurile de proteină sunt în jurul valorii de ~0,1 mg/l. Prezenţa originii de replicare SV40 va conduce la niveluri ridicate de replicare a ADN-ului în celule COS permisive pentru replicarea SV40. Vectorii CMV, de exemplu, pot conţine originea pMB1 (derivată din pBR322) pentru replicare în celule bacteriene, gena b-lactamază pentru selecţia rezistenţei la ampicilină în bacterie, hGH polyA şi originea f1. Vectorii care conţin secvenţa de preprotripsină lider (PPT) pot direcţiona secreţia de proteine de fuziune FLAG în mediul de cultură pentru purificare cu ajutorul anticorpilor ANTI-FLAG, răşinilor şi plăcilor. Ceilalţi vectori şi celelalte sisteme de exprimare sunt bine cunoscute în domeniu pentru că sunt folosite cu o gamă variată de celule-gazdă.
Într-o altă realizare, două sau mai multe peptide invenţiei sunt codificate şi exprimate astfel în ordine succesivă (similar mărgelelor înşirate pe un fir). Procedând astfel, peptidele pot fi legate sau fuzionate împreună prin benzi de aminoacizi lianţi, cum ar fi de exemplu LLLLLL, sau pot fi legate fără alte peptide suplimentare între ele. Aceste construcţii pot fi utilizate, de asemenea, pentru terapia cancerului şi pot induce răspunsuri imunitare implicând MHC I şi MHC II.
Această invenţie este legată şi de o serie de celule-gazdă transformate cu un vector polinucleotidic, creat în cadrul prezentei invenţii. Celula-gazdă poate fi procariotă sau eucariotă. Este posibil ca celulele bacteriene să fie celule-gazdă procariote preferate în anumite circumstanţe şi, de regulă, sunt o tulpină de E. coli, cum ar fi, de exemplu, tulpinile E. coli DH5, disponibile de la Bethesda Research Laboratories Inc., Bethesda, MD, SUA, şi RR1, disponibile de la American Type Culture Collection (ATCC) din Rockville, MD, SUA (No ATCC 31343). Printre celulele-gazdă eucariote se numără celulele de drojdie, insecte şi mamifere, de preferinţă celule de vertebrate precum cele de la şoarece, şobolan, maimuţă sau linii de celule fibroblastice sau de colon umane. Celulele-gazdă provenite din drojdii includ YPH499, YPH500 şi YPH501, care sunt disponibile în general de la Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA92037, SUA. Celulele-gazdă preferate provenite de la mamifere includ celulele ovariene de hamster chinezesc, disponibile de la ATCC ca CCL61, celulele embrionare de cobai NIH elveţian, NIH/3T3 disponibile de la ATCC ca CRL 1658, celulele COS-1 derivate din rinichii de maimuţă disponibile de la ATCC ca CRL 1650 şi celulele 293 care sunt celule embrionare renale umane. Celulele preferate provenite de la insecte sunt celulele Sf9, care pot fi transfectate cu vectori de exprimare a baculovirusului. O prezentare generală a opţiunilor de celule-gazdă adecvate poate fi găsită, de exemplu, în manualul scris de Paulina Balbás şi Argelia Lorence „Methods in Molecular Biology Recombinant Gene Expression, Reviews and Protocols», Partea I, ediţia a doua, ISBN 978-1-58829-262-9 şi în alte lucrări cunoscute în domeniu.
Transformarea celulelor-gazdă adecvate cu un produs ADN obţinut pe baza acestui patent este realizată folosind metode bine cunoscute care depind de obicei de tipul de vector folosit. În ceea ce priveşte transformarea celulelor-gazdă procariote, vezi, de exemplu, Cohen et al. (Cohen et al., 1972) şi (Green and Sambrook, 2012). Transformarea celulelor de drojdii este descrisă în Sherman et al. (Sherman et al., 1986). Metoda lui Beggs (Beggs, 1978) este de asemenea utilă. Referitor la celulele de la vertebrate, reactivii utili în transferul unor astfel de celule, de exemplu, formule pe bază de fosfat de calciu şi DEAE-dextran sau lipozom, sunt disponibili de la Stratagene Cloning Systems sau de la Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD20877, SUA. Electro-permeabilizarea este de asemenea utilă pentru transformarea şi/sau transfectarea celulelor şi este o metodă bine cunoscută pentru transformarea celulelor provenite din drojdii, bacterii, insecte şi a celulelor vertebrate.
Celulele transformate cu succes, adică celulele care conţin o construcţie ADN din prezenta invenţie, pot fi identificate prin tehnici bine cunoscute, cum este PCR. Alternativ, prezenţa proteinei în stratul supranatant poate fi detectată folosind anticorpi.
Se va aprecia că anumite celule-gazdă din cadrul invenţiei sunt utile în pregătirea peptidei din invenţie, de exemplu celule de bacterii, de drojdii şi de insecte. Totuşi, şi alte celule-gazdă pot fi utile pentru anumite metode terapeutice. De exemplu, celulele prezentatoare de antigen, cum ar fi celulele dendritice, pot fi şi ele utile pentru exprimarea peptidei din invenţie, astfel încât să fie încărcate în moleculele MHC adecvate. Prin urmare, această invenţie prezintă o celulă-gazdă, compusă dintr-un acid nucleic, sau un vector de expresie, conform invenţiei.
Într-o integrare optimă, celula-gazdă este o celulă prezentatoare de antigen, în particular o celulă dendritică sau o celulă prezentatoare de antigen. Celulele APC încărcate cu o proteină de fuziune recombinantă, care conţine fosfatază acidă prostatică (PAP), sunt în prezent în curs de investigare de către U.S. Food and Drug Administration (FDA) la data de 29 aprilie 2010 pentru tratamentul cancerului de prostată asimptomatic sau minim simptomatic (Sipuleucel-T) (Rini et al., 2006; Small et al., 2006).
Un alt aspect al invenţiei se referă la o metodă de producere a unei peptide, metoda cuprinzând cultivarea unei celule-gazdă şi izolarea peptidei din celula-gazdă sau din mediul său de cultură.
În altă integrare a peptidei, acidul nucleic sau vectorul de expresie inventat este utilizat în medicină. De exemplu, peptida poate fi pregătită pentru injectare intravenoasă (i.v.), injectare subcutanată (s.c.), injectare intradermică (i.d.), injectare intraperitoneală (i.p.) sau injectare intramusculară (i.m.). Metodele preferate de administrare injectabilă pentru peptidă sunt s.c., i.d., i.p., i.m. şi i.v. Metodele preferate de administrare injectabilă pentru ADN sunt i.d., i.m., s.c., i.p. şi i.v. Pot fi date doze de peptidă şi ADN cuprinse, de exemplu, între 50 µg şi 1,5 mg, preferabil între 125 µg şi 500 µg, şi vor depinde de peptida sau ADN-ul respectiv. Dozele din acest interval au fost utilizate cu succes în studii anterioare (Walter et al., 2012).
Polinucleotida utilizată pentru vaccinare activă poate fi substanţial pură sau poate fi conţinută de un vector sau de un sistem de livrare adecvat. Acidul nucleic poate fi ADN, ADNc, APN, ARN sau o combinaţie dintre acestea. Metodele pentru conceperea şi introducerea unui astfel de acid nucleic sunt bine cunoscute în domeniu. O prezentare generală este furnizată, de exemplu, de (Teufel et al., 2005). Vaccinurile polinucleotidice sunt uşor de preparat, însă modul de acţiune al acestor vectori în inducerea unui răspuns imunitar nu este pe deplin înţeles. Printre vectorii şi sistemele de livrare adecvate se numără ADN-ul şi/sau ARN-ul viral, cum ar fi sistemele bazate pe adenovirus, virusul vaccinia, retrovirusuri, adenovirusuri asociate sau hibrizi care conţin elemente din mai multe virusuri. Printre sistemele de livrare nevirale se numără lipide cationice şi polimeri cationici, bine cunoscuţi în domeniul livrării ADN-ului. Se poate folosi administrarea fizică, cum ar fi cea pe calea unui „pistol genic». Peptida sau peptidele codificată(e) de acidul nucleic poate (pot) fi o proteină de fuziune, de exemplu cu un epitop care stimulează celulele T pentru celula CDR opusă respectivă, după cum s-a observat mai sus.
Medicamentul din invenţie poate include şi unul sau mai mulţi adjuvanţi. Adjuvanţii sunt substanţe care ameliorează sau potenţează nespecific răspunsul imunitar (de exemplu, răspunsuri imunitare mediate de celule T CD8-pozitivr şi celule T helper (TH) la un antigen, şi care prin urmare poate fi considerat util în medicamentul din prezenta invenţie. Adjuvanţii adecvaţi includ, dar nu sunt limitaţi la 1018 ISS, săruri de aluminiu, AMPLIVAX®, AS15, BCG, CP-870,893, CpG7909, CyaA, dSLIM, flagelină sau liganzi TLR5 derivaţi din flagelină, ligand FLT3, GM-CSF, IC30, IC31, Imiquimod (ALDARA®), resiquimod, ImuFact IMP321, interleukine precum IL-2, IL-13, IL-21, interferon alfa sau beta sau derivaţi pegilaţi ai acestuia, IS Patch, ISS, ISCOMATRIX, ISCOM, JuvImmune®, LipoVac, MALP2, MF59, monofosforil lipid A, Montanide IMS 1312, Montanide ISA 206, Montanide ISA 50V, Montanide ISA-51, emulsii apă-în-ulei sau ulei-în-apă, OK-432, OM-174, OM-197-MP-EC, ONTAK, OspA, sistem de vectori PepTel®, microparticule pe bază de poli(lactid co-glicolid) [PLG] şi dextran, talactoferină SRL172, virozomi şi alte particule similare virusurilor, YF-17D, capcană VEGF, R848, beta-glucan, Pam3Cys, stimulon Aquila's QS21, care este derivat din saponină, extracte microbacteriene şi imitatoare sintetice ale peretelui celular bacterian şi alţi adjuvanţi patentaţi, cum ar fi Ribi Detox, Quil sau Superfos. Adjuvanţii de tipul Freund sau GM-CSF sunt de preferat. Mai mulţi adjuvanţi imunologici (de exemplu, MF59) specifici pentru celulele dendritice, precum şi prepararea lor, au fost descrişi anterior (Allison şi Krummel, 1995). De asemenea, pot fi utilizate citokine. Mai multe citokine au fost legate direct de influenţarea migrării celulelor dendritice în ţesuturi limfoide (de exemplu, TNF-), accelerând maturarea celulelor dendritice în celule prezentatoare de antigen pentru limfocite T eficace (de exemplu, GM-CSF, IL-1 şi IL-4) (U.S. Pat. No. 5,849,589) şi acţionând ca imunoadjuvanţi (de exemplu, IL-12, IL-15, IL-23, IL-7, IFN-alfa, IFN-beta) (Gabrilovich et al., 1996).
Oligonucleotidele imunostimulatoare CpG au fost raportate şi ca amelioratoare ale efectelor adjuvanţilor în formulele de vaccin. Fără a fi demonstrat teoretic, oligonucleotidele CpG acţionează prin activarea sistemului imunitar înnăscut (neadaptiv) prin receptori de tip Toll (TLR), în principal TLR9. Activarea TLR9 declanşată prin CpG ameliorează răspunsul umoral şi celular antigen-specific pentru o gamă variată de antigeni, inclusiv antigeni peptidici sau proteici, virus viu sau mort, vaccinuri cu celule dendritice, vaccinuri celulare autologe şi conjugate polizaharidice din vaccinuri profilactice şi terapeutice. Mai important, ameliorează maturizarea şi diferenţierea celulelor dendritice care duce la ameliorarea activării celulelor TH1 şi generarea de limfocite T citotoxice (CTL) puternice, chiar şi în absenţa ajutorului celulelor T CD4. Biasul TH1 indus prin stimularea TLR9 se menţine chiar şi în prezenţa unor adjuvanţi de vaccin cum ar fi alaunul sau adjuvantul Freund incomplet (IFA) care în mod normal promovează biasul TH2. Oligonucleotidele CpG prezintă o activitate adjuvantă chiar mai mare când este formulată sau coadministrată cu alţi adjuvanţi sau în formulări de tip microparticule, nanoparticule, emulsii lipidice sau alte formulări similare, care sunt necesare pentru a induce un răspuns puternic atunci când antigenul este relativ slab. Acestea accelerează şi răspunsul imunitar şi permit dozelor de antigen să fie reduse cu aproximativ două ordine de mărime, cu răspunsuri de tip anticorp comparabile cu vaccinul în doză completă fără CpG conform unor experimente (Krieg, 2006). US 6,406,705 B1 descrie utilizarea combinată de oligonucleotide CpG cu adjuvanţi non-acid nucleic şi un antigen pentru a induce un răspuns imunitar specific antigenului. Un antagonist TLR9 CpG este dSLIM (double Stem Loop Immunomodulator) de la Mologen (Berlin, Germania) care este o componentă preferată din compoziţia farmaceutică a prezentei invenţii. Se pot utiliza şi alte molecule care leagă TLR cum ar fi TLR7, TLR8 şi/sau TLR9 care leagă ARN.
Alte exemple de adjuvanţi utili includ, dar fără a se limita la, celule CpG modificate chimic (de exemplu, CpR, Idera), analogi de ARNdc, cum ar fi Poly(I:C) şi derivaţi ai acestora (de exemplu, AmpliGen®, Hiltonol®, poli-(ICLC), poli(IC-R), poli(I:C12U), ADN sau ARN non-CpG bacterian, precum şi molecule mici şi anticorpi imunoactivi, precum ciclofosfamidă, sunitinib, Bevacizumab®, Celebrex, NCX-4016, sildenafil, tadalafil, vardenafil, sorafenib, temozolomide, temsirolimus, XL-999, CP-547632, pazopanib, VEGF Trap, ZD2171, AZD2171, anti-CTLA4, alţi anticorpi care ţintesc structuri cheie ale sistemului imunitar (de exemplu, receptorul anti-CD40, anti-TGF-beta, anti-TNF-alfa) şi SC58175, care poate acţiona terapeutic şi/sau ca adjuvant. Cantităţile şi concentraţiile adjuvanţilor şi aditivilor utili în contextul prezentei invenţii se pot determina direct de un profesionist fără a necesita experimente inutile.
Adjuvanţii preferaţi sunt anti-CD40, imiquimod, resiquimod, GM-CSF, ciclofosfamidă, sunitinib, bevacizumab, interferon alfa, oligonucleotide şi derivaţi de CpG, poli(L:C) şi derivaţi, ARN, sildenafil şi formulări sub formă de particule cu PLG sau virozomi.
Într-o formulare preferată a compusului farmaceutic conform invenţiei, adjuvantul este selecţionat dintr-un grup care constă din factori stimulatori ai coloniilor, cum ar fi factorul stimulator al coloniilor de granulocite macrofage (GM-CSF, sargramostim), ciclofosfamidă, imiquimod, resiquimod şi interferon alfa.
În concretizarea preferată a compusului farmaceutic conform invenţiei adjuvantul este selecţionat dintr-un grup care constă din factori stimulatori ai coloniilor, cum ar fi factorul stimulator al coloniilor de granulocite macrofage (GM-CSF, sargramostim), ciclofosfamidă, imiquimod şi resiquimod. În formularea preferată a compusului farmaceutic conform invenţiei, adjuvantul este ciclofosfamidă, imiquimod sau resiquimod. Adjuvanţii şi mai preferaţi sunt Montanide IMS 1312, Montanide ISA 206, Montanide ISA 50V, Montanide ISA-51, poly-ICLC (Hiltonol®) şi anticorp monoclonal anti-CD40 sau combinaţii ale acestora.
Această compoziţie este folosită pentru administrare parenterală, cum ar fi subcutanată, intradermică, intramusculară sau orală. Pentru aceasta, peptidele şi opţional alte molecule sunt dizolvate sau in suspensie într-un mediu de transport (transportor) farmacologic acceptabil, preferabil apos. În plus, compoziţia poate conţine excipienţi, cum ar fi tampoane, agenţi de legare, agenţi explozivi, diluanţi, arome, lubrifianţi etc. Peptidele pot fi, de asemenea, administrate împreună cu substanţe care stimulează imunitatea, cum ar fi citokinele. Lista exhaustivă de excipienţi care se pot folosi în această compoziţie poate, de exemplu, fi preluată din A. Kibbe, Handbook of Pharmaceutical Excipients (Kibbe, 2000). Compoziţia poate fi folosită pentru prevenirea, profilaxia şi/sau tratamentul bolilor adenomatoase sau canceroase. Exemple de formule pot fi găsite, de exemplu, în EP2113253.
Este important de înţeles că răspunsul imunitar declanşat de vaccin în conformitate cu invenţia atacă cancerul în diferite stadii celulare şi în diferite stadii de dezvoltare. Mai mult, sunt atacate diferite căi de semnalizare asociate cancerului. Acesta este un avantaj faţă de vaccinurile care vizează doar una sau câteva ţinte, ceea ce poate determina adaptarea uşoară a tumorii la atac (evadare a tumorii). Mai mult, nu toate tumorile individuale exprimă acelaşi model de antigeni. Prin urmare, o combinaţie de mai multe peptide asociate tumorii asigură faptul că fiecare tumoare poartă cel puţin unele dintre ţinte. Compoziţia este concepută astfel încât fiecare tumoare este de aşteptat să exprime mai mulţi dintre antigeni şi să acopere mai multe căi independente necesare pentru creşterea şi menţinerea tumorii. Astfel, vaccinul poate fi „de uz general» pentru o populaţie mai mare de pacienţi. Acest lucru înseamnă că o preselectare a pacienţilor care urmează să fie trataţi cu vaccinul poate fi restricţionată la tiparea HLA, nu necesită evaluări suplimentare ale biomarkerului pentru exprimarea antigenului, dar este totuşi asigurat că mai multe ţinte sunt atacate simultan de răspunsul imunitar indus, ceea ce este important pentru eficacitate (Banchereau et al., 2001; Walter et al., 2012).
Aşa cum este utilizat aici, termenul „eşafodaj» se referă la o moleculă care se leagă în mod specific la un determinant (de exemplu, antigenic). Într-o variantă de realizare, un eşafodaj este capabil să direcţioneze entitatea la care este ataşat (de exemplu, un (al doilea) fragment de legare la antigen) la un loc-ţintă, de exemplu la un tip specific de celulă tumorală sau stromă tumorală care poartă determinantul antigenic (de exemplu, complexul unei peptide cu MHC conform aplicaţiei la îndemână). Într-o altă variantă de realizare, un eşafodaj este capabil să activeze semnalizarea prin antigenul-ţintă, de exemplu un antigen al complexului receptorului de celule T. Eşafodajele includ, dar nu sunt limitate la anticorpi şi fragmente ale acestora, domenii de legare la antigen ale unui anticorp, cuprinzând o regiune variabilă cu catenă grea de anticorpi şi o regiune variabilă a catenei uşoare de anticorp, proteine de legătură care conţin cel puţin un motiv repetat de ankirină şi molecule SDAB (Single Domain Antigen Binding - Legătură de antigen la un domeniu singular), aptameri, TCR (solubile) şi celule (modificate), cum ar fi celule T alogene sau autologe. Pentru a evalua dacă o moleculă este un eşafodaj legat la o ţintă, se pot efectua teste de legare.
Legarea „specifică» înseamnă că eşafodajul leagă complexul peptidă-MHC de interes mai bine decât alte complexe peptidiă-MHC care apar în mod natural, într-o măsură în care un eşafodaj înarmat cu o moleculă activă care este capabil să distrugă o celulă care poartă ţinta specifică nu este capabil să distrugă o altă celulă fără ţinta specifică, dar care prezintă alte complexe peptidă-MHC. Legarea la alte complexe peptidă-MHC este irelevantă dacă peptida complexului peptidă-MHC reactiv încrucişat nu apare în mod natural, adică nu este derivat din peptidomul HLA uman. Testele de evaluare a distrugerii celulelor-ţintă sunt bine cunoscute în domeniu. Testele trebuie efectuate folosindu-se celule-ţintă (celule primare sau linii celulare) cu prezentare peptidă-MHC nealterată sau celule încărcate cu peptide, astfel încât nivelurile peptidă-MHC să fie atinse în mod natural.
Fiecare eşafodaj poate cuprinde o marcare care asigură faptul că eşafodajul legat poate fi detectat prin determinarea prezenţei sau absenţei unui semnal furnizat de etichetă. De exemplu, eşafodajul poate fi marcat cu un colorant fluorescent sau cu orice altă moleculă marker celular aplicabilă. Astfel de molecule-marker sunt bine cunoscute în domeniu. De exemplu, o marcare cu fluorescenţă, furnizată, de pildă, de un colorant cu fluorescenţă, poate furniza o vizualizare a aptamerului legat prin microscopie cu fluorescenţă sau scanare cu laser ori citometrie în flux.
Fiecare eşafodaj poate fi conjugat cu o a doua moleculă activă, cum ar fi, de exemplu IL-21, anti-CD3, anti-CD28.
Pentru informaţii suplimentare despre eşafodajele polipeptidice, consultaţi, de exemplu, secţiunea de fond din WO 2014/071978A1 şi referinţele citate aici.
Aptamerii (a se vedea, de exemplu, WO 2014/191359 şi literatura de specialitate citată în acest document) sunt molecule scurte de acid nucleic monocatenar, care se pot plia în structuri tridimensionale definite şi pot recunoaşte structuri-ţintă specifice. Aptamerii au părut a fi alternative adecvate pentru dezvoltarea terapiilor ţintite. S-a dovedit că aptamerii se leagă selectiv de o varietate de ţinte complexe cu afinitate şi specificitate ridicate.
Aptamerii care recunosc molecule localizate pe suprafaţa celulară au fost identificaţi în ultimul deceniu şi oferă mijloace pentru dezvoltarea abordărilor diagnostice şi terapeutice. Deoarece s-a dovedit că aptamerii nu posedă aproape nicio toxicitate şi imunogenitate, aceştia sunt candidaţi promiţători pentru aplicaţii biomedicale. Într-adevăr, aptamerii, de exemplu aptamerii care recunosc antigenul de membrană specific prostatei, au fost folosiţi cu succes pentru terapii ţintite şi s-au dovedit a fi funcţionali în modelele in vivo de xenogrefă. Mai mult, au fost identificaţi aptameri care recunosc linii celulare tumorale specifice.
Aptamerii ADN pot fi selectaţi pentru a dezvălui proprietăţi de recunoaştere cu spectru larg pentru diferite celule canceroase, în special pentru cele derivate din tumori solide, în timp ce celulele sănătoase non-tumorigene şi primare nu sunt recunoscute. Dacă aptamerii identificaţi recunosc nu numai un subtip specific de tumoare, ci interacţionează mai degrabă cu o serie de tumori, acest lucru face ca aptamerii să fie aplicabili pentru aşa-numitele diagnostice şi terapii cu spectru larg.
În plus, investigarea comportamentului de legare celulară cu citometrie în flux a arătat că aptamerii prezintă afinităţi aparente foarte bune care sunt în intervalul nanomolar.
Aptamerii sunt utili în scopuri diagnostice şi terapeutice. Mai mult, s-a putut arăta că unii dintre aptameri sunt preluaţi de celulele tumorale şi, astfel, pot funcţiona ca vehicule moleculare pentru livrarea ţintită a agenţilor anticancer, cum ar fi siARN în celulele tumorale.
Aptamerii pot fi selectaţi împotriva ţintelor complexe, cum ar fi celulele şi ţesuturile şi complexele peptidei care cuprind, de preferinţă care constau, dintr-o secvenţă în conformitate cu SEQ ID NO 82 în conformitate cu invenţia, la îndemână cu molecula MHC, folosindu-se tehnica celulă-SELEX (Systematic Ligands by Exponential enrichment - Evoluţie sistematică a liganzilor prin îmbogăţire exponenţială).
Peptida din prezenta invenţie se poate folosi pentru a genera şi a dezvolta anticorpi specifici contra complecşilor MHC/peptidă. Acestea se pot folosi pentru tratament, direcţionarea toxinelor sau substanţelor radioactive către ţesutul bolnav. Un alt uz al acestor anticorpi poate fi ţintirea radionuclizilor către ţesutul bolnav în scopuri imagistice, cum ar fi PET. Acest uz poate ajuta la depistarea metastazelor mici sau pentru stabilirea dimensiunii şi localizării exacte a ţesutului bolnav.
Prin urmare, un alt aspect al invenţiei este furnizarea unei metode pentru producerea unui anticorp recombinant care se leagă în mod specific la un complex major de histocompatibilitate (MHC) de clasă I uman care este complexat cu un antigen HLA-restricţionat, metoda cuprinzând: imunizarea unui mamifer non-uman modificat genetic care cuprinde celule care exprimă respectivul complex major de histocompatibilitate (MHC) de clasă I sau de clasă II uman cu o formă solubilă a moleculei MHC de clasă I complexată cu respectivul antigen HLA-restricţionat; izolarea moleculelor ARNm din celulele producătoare de anticorp ale respectivului mamifer non-uman; producerea unei biblioteci de prezentare a fagilor care prezintă molecule de proteină codificate de respectivele molecule ARNm; şi izolarea cel puţin a unui fag din respectiva bibliotecă de prezentare a fagilor, cel puţin un fag care prezintă anticorpul respectiv cu legare specifică la complexul major de histocompatibilitate (MHC) de clasă I uman complexat cu antigenul HLA-restricţionat menţionat.
Un alt aspect al invenţiei este acela de a furniza un anticorp care se leagă în mod specific la un complex major de histocompatibilitate (MHC) de clasă I, fiind complexat cu un antigen restricţionat HLA, în care anticorpul este, de preferinţă, un anticorp policlonal, un anticorp monoclonal, un anticorp bi-specific şi/sau un anticorp himeric.
Metodele respective pentru producerea unor astfel de anticorpi şi complexe majore de histocompatibilitate de clasă I cu catenă unică, precum şi alte instrumente pentru producerea acestor anticorpi sunt descrise în WO 03/068201, WO 2004/084798, WO 01/72768, WO 03/070752 şi în publicaţii (Cohen et al., 2003a; Cohen et al., 2003b; Denkberg et al., 2003).
Preferabil, anticorpul se leagă la complex cu o afinitate de legare mai mică de 20 nanomolari, preferabil sub 10 nanomolari, care este considerată ca fiind „specifică» în contextul prezentei invenţii.
Prezenta invenţie se referă la o peptidă constând din secvenţa aminoacidică în conformitate cu SEQ ID NO 82.
Prezenta invenţie se referă şi la peptida în conformitate cu invenţia şi care au capacitatea de a se lega la o moleculă a complexului major de histocompatibilitate (MHC) umană de clasă I sau de clasă II.
Prezenta invenţie se referă, de asemenea, la peptidele în conformitate cu invenţia în care respectiva peptidă include legături non-peptidice.
Prezenta invenţie se referă suplimentar la peptidele în conformitate cu invenţia, în care peptida face parte dintr-o proteină de fuziune, care cuprinde în special aminoacizi N-terminali ai lanţului invariant (Ii) asociat cu antigenul HLA-DR sau în care peptida este fuzionată cu (sau în) un anticorp, cum ar fi, de exemplu, un anticorp care este specific pentru celulele dendritice.
O altă concretizare a prezentei invenţii se referă la o peptidă care nu apare în mod natural, în care respectiva peptidă constă dintr-o secvenţă de aminoacizi conform SEQ ID NO: 82 şi a fost produsă sintetic (de exemplu, sintetizată) ca o sare acceptabilă farmaceutic. Metodele de producere sintetică de peptide sunt bine cunoscute în domeniu. Sărurile peptidei în conformitate cu prezenta invenţie diferă în mod substanţial de peptidele în starea lor in vivo, întrucât peptidele generate in vivo nu sunt săruri. Forma de sare non-naturală a peptidei mediază solubilitatea peptidei, în special în contextul compoziţiilor farmaceutice care cuprind peptidele, de exemplu vaccinurile peptidice descrise în prezentul document. Pentru a furniza în mod eficace peptidele subiectului care trebuie tratat, este necesară o solubilitate suficientă şi cel puţin substanţială a peptidei (peptidelor). De preferinţă, sărurile sunt săruri ale peptidei acceptabile farmaceutic. Aceste săruri în conformitate cu invenţia includ săruri alcaline şi alcalino-pământoase, cum ar fi sărurile din seria Hofmeister cuprinzând sub formă de anioni PO4 3-, SO4 2-, CH3COO-, Cl-, Br-, NO3 -, ClO4 -, I-, SCN- şi de cationi, NH4 +, Rb+, K+, Na+, Cs+, Li+, Zn2+, Mg2+, Ca2+, Mn2+, Cu2+ and Ba2+. În special, sărurile sunt alese din (NH4)3PO4, (NH4)2HPO4, (NH4)H2PO4, (NH4)2SO4, NH4CH3COO, NH4Cl, NH4Br, NH4NO3, NH4CIO4, NH4I, NH4SCN, Rb3PO4, Rb2HPO4, RbH2PO4, Rb2SO4, Rb4CH3COO, Rb4Cl, Rb4Br, Rb4NO3, Rb4CIO4, Rb4I, Rb4SCN, K3PO4, K2HPO4, KH2PO4, K2SO4, KCH3COO, KCl, KBr, KNO3, KClO4, KI, KSCN, Na3PO4, Na2HPO4, NaH2PO4, Na2SO4, NaCH3COO, NaCl, NaBr, NaNO3, NaCIO4, NaI, NaSCN, ZnCI2 Cs3PO4, Cs2HPO4, CsH2PO4, Cs2SO4, CsCH3COO, CsCl, CsBr, CsNO3, CsCIO4, CsI, CsSCN, Li3PO4, Li2HPO4, LiH2PO4, Li2SO4, LiCH3COO, LiCl, LiBr, LiNO3, LiClO4, LiI, LiSCN, Cu2SO4, Mg3(PO4)2, Mg2HPO4, Mg(H2PO4)2, Mg2SO4, Mg(CH3COO)2, MgCl2, MgBr2, Mg(NO3)2, Mg(ClO4)2, MgI2, Mg(SCN)2, MnCl2, Ca3(PO4),, Ca2HPO4, Ca(H2PO4)2, CaSO4, Ca(CH3COO)2, CaCl2, CaBr2, Ca(NO3)2, Ca(ClO4)2, CaI2, Ca(SCN)2, Ba3(PO4)2, Ba2HPO4, Ba(H2PO4)2, BaSO4, Ba(CH3COO)2, BaCl2, BaBr2, Ba(NO3)2, Ba(ClO4)2, BaI2 şi Ba(SCN)2. De preferat sunt, în special, acetatul de NH, MgCl2, KH2PO4, Na2SO4, KCl, NaCl şi CaCl2, cum ar fi, de exemplu, sărurile cu clorură sau acetat (trifluoroacetat).
În general, peptidele (cel puţin cele care conţin legături peptidice între resturile de acid amino) pot fi sintetizate prin modul Fmoc-poliamidă al sintezei peptidelor în stare solidă, după cum se arată în Lukas et al. (Lukas et al., 1981) şi referinţele citate în document. Protecţia temporară a grupării N-amino este asigurată de gruparea 9-fluorenilmetiloxicarbonil (Fmoc). Clivajul repetitiv al acestei grupări de protecţie cu intensă labilitate de bază este realizat folosind 20% piperidină în N,N-dimetilformamidă. Funcţionalităţile lanţurilor secundare se pot proteja sub forma butil-eterilor (în cazul serinei, treoninei şi tirozinei), a butil-esterilor (în cazul acizilor glutamic şi aspartic), a derivaţilor butiloxicarbonil (în cazul lizinei şi histidinei), a derivaţilor tritil (în cazul cisteinei) şi a derivaţilor de 4-metoxi-2,3,6-trimetilbenzensulfonil (în cazul argininei). Dacă resturile C-terminale sunt glutamina sau asparagina, pentru protejarea funcţiei amido a lanţului secundar se va folosi gruparea 4,4'-dimetoxibenzhidril. Suportul în faza solidă este furnizat de un polimer polidimetil-acrilamidă format din cei trei monomeri dimetilacrilamidă (schelet-monomer), bisacriloetilen diamină (agent de legătură) şi acriloilsarcozin-metil-ester (agent de funcţionalizare). Agentul de legătură peptidă-răşină scindabil folosit este derivatul labil în mediu acid al acidului 4-hidroximetil-fenoxiacetic. Toţi derivaţii aminoacid sunt adăugaţi sub formă de derivaţi simetrici anhidri preformaţi cu excepţia asparaginei şi glutaminei, care sunt adăugate folosind o procedură de cuplare inversă mediată de N,N-diciclohexil-carbodiimidă/1-hidroxibenzotriazol. Toate reacţiile de cuplare şi deprotejare sunt monitorizate folosindu-se proceduri de testare care folosesc ninhidrină, trinitrobenzen, acid sulfonic sau izotină. După finalizarea sintezei, peptidele sunt scindate din suportul rezinic cu îndepărtarea concomitentă a grupărilor protectoare ale lanţurilor secundare prin tratarea cu acid trifluoroacetic 95% care conţine un amestec curăţător 50%. Substanţele de curăţare folosite cel mai frecvent includ etan-ditiol, fenol, anisol şi apă, alegerea exactă fiind dependentă de aminoacizii constituenţi ai peptidei sintetizate. De asemenea, pentru sintetizarea peptidelor, se poate utiliza o combinaţie de metode în stare solidă şi în stare de soluţie (a se vedea, de exemplu, (Bruckdorfer et al., 2004 şi referinţele citate în acest document).
Acidul trifluoroacetic este îndepărtat prin evaporare in vacuo, cu triturarea ulterioară cu dietileter, care duce la formarea peptidei brute. Toate substanţele de curăţare prezente sunt eliminate printr-o procedură simplă de extragere, care, după liofilizare în fază apoasă, conduce la peptida brută fără substanţe de curăţare. Reactivii pentru sinteza peptidelor sunt în general disponibili, de exemplu, de la Calbiochem-Novabiochem (Nottingham, Regatul Unit).
Purificarea poate fi realizată prin una sau mai multe tehnici, precum recristalizarea, cromatografia cu excludere dimensională, cromatografia cu schimb de ioni, cromatografia cu interacţiune hidrofobă şi (de regulă) cromatografia lichidă de înaltă performanţă în fază inversă, folosind, de exemplu, separare în gradient de acetonitril/apă.
Prezenta invenţie se referă în continuare la un acid nucleic care codifică peptidele în conformitate cu invenţia.
Prezenta invenţie se referă în continuare la acidul nucleic în conformitate cu invenţia, care este ADN, ADNc, APN, ARN sau combinaţii ale acestora.
Prezenta invenţie se referă în continuare la un vector de exprimare care exprimă un acid nucleic conform prezentei invenţii.
Prezenta invenţie se referă în continuare la o peptidă conform prezentei invenţii, un acid nucleic conform prezentei invenţii sau un vector de exprimare conform prezentei invenţii pentru utilizare în medicină, în special în cancerul ovarian.
Prezenta invenţie se referă în continuare la o celulă-gazdă cuprinzând un acid nucleic conform invenţiei sau un vector conform invenţiei.
Prezenta invenţie se referă, de asemenea, la celula-gazdă în conformitate cu prezenta invenţie care este o celulă prezentatoare de antigen şi, preferabil, este o celulă dendritică.
Prezenta invenţie se referă în continuare la o metodă de producere a unei peptide în conformitate cu prezenta invenţie, metoda cuprinzând cultivarea celulei-gazdă conform prezentei invenţii şi izolarea peptidei din celula-gazdă sau din mediul său de cultură.
Prezenta invenţie se referă în continuare la metoda în conformitate cu prezenta invenţie în care antigenul este încărcat pe molecule de MHC de clasă I exprimate pe suprafaţa unei celule prezentatoare de antigen adecvate prin punerea în contact a unei cantităţi suficiente de antigen cu o celulă prezentatoare de antigen.
Prezenta invenţie se referă în continuare la metoda în conformitate cu invenţia în care celula prezentatoare de antigen cuprinde un vector de exprimare care exprimă respectiva peptidă care conţine SEQ ID NO: 82.
Prezenta invenţie se referă în continuare la celulele T activate produse prin metoda în conformitate cu prezenta invenţie, în care celulele T menţionate recunosc selectiv o celulă care exprimă în mod aberant o polipeptidă cuprinzând o secvenţă de aminoacizi în conformitate cu prezenta invenţie.
Este descrisă o metodă de ucidere a celulelor ţintă la un pacient la care celulele ţintă exprimă aberant o polipeptidă cuprinzând orice secvenţă de aminoacizi conform prezentei invenţii, metoda cuprinzând administrarea pacientului unui număr eficace de celule T în conformitate cu prezenta invenţie.
Prezenta invenţie se referă, de asemenea, la o peptidă descrisă, un acid nucleic în conformitate cu prezenta invenţie sau un vector de exprimare în conformitate cu prezenta invenţie, o celulă în conformitate cu prezenta invenţie sau o limfocită T citotoxică activată în conformitate cu prezenta invenţie pentru utilizare în medicină. Prezenta invenţie se referă, de asemenea, la o utilizare în conformitate cu prezenta invenţie în care respectivul medicament este activ împotriva cancerului.
Prezenta invenţie se referă, de asemenea, la o utilizare în conformitate cu invenţia în care medicamentul este un vaccin.
Prezenta invenţie se referă, de asemenea, la o utilizare în conformitate cu invenţia în care celulele canceroase menţionate sunt celule de cancer ovarian sau alte celule tumorale solide sau hematologice, cum ar fi cele de cancer pancreatic, cancer cerebral, cancer renal, cancer de colon sau rectal ori leucemie.
Termenul „anticorp» sau „anticorpi» este utilizat aici într-un sens larg şi include anticorpi atât policlonali, cât şi monoclonali. În plus faţă de moleculele de imunoglobulină intacte sau „complete», în termenul „anticorpi» sunt incluse, de asemenea, fragmente (de exemplu, fragmente de CDR, Fv, Fab şi Fc) sau polimeri ai acelor molecule de imunoglobulină şi versiunile umanizate ale moleculelor de imunoglobulină, atât timp cât acestea manifestă oricare dintre proprietăţile dorite (de exemplu, legarea specifică a unei polipeptide marker de cancer ovarian, livrarea unei toxine într-o celulă de cancer ovarian care exprimă o genă marker de cancer la un nivel crescut şi/sau inhibarea activităţii unei polipeptide marker de cancer ovarian) în conformitate cu invenţia.
Ori de câte ori este posibil, anticorpii invenţiei pot fi achiziţionaţi din surse comerciale. Anticorpii conform invenţiei pot fi generaţi, de asemenea, folosindu-se metode bine cunoscute. Specialiştii în domeniu vor înţelege că pot fi utilizaţi fie polipeptide markeri de cancer de ovarian de lungime completă, fie fragmente ale acestora pentru generarea anticorpilor în conformitate cu invenţia. O polipeptidă de utilizat pentru generarea unui anticorp al invenţiei poate fi purificată parţial sau complet dintr-o sursă naturală sau poate fi produsă utilizându-se tehnici cu ADN recombinant.
De exemplu, un ADNc care codifică o peptidă conform prezentei invenţii, cum ar fi o peptidă cu SEQ ID NO 82, poate fi exprimat în celule procariote (de exemplu, bacterii) sau celule eucariote (de exemplu, celule de drojdii, de insecte sau de mamifere), după care proteina recombinantă poate fi purificată şi utilizată pentru a genera un preparat de anticorpi monoclonali sau policlonali care leagă în mod specific polipeptida marker de cancer ovarian utilizată conform invenţiei.
Un specialist în domeniu va realiza că generarea a două sau mai multe seturi diferite de anticorpi monoclonali sau policlonali maximizează probabilitatea obţinerii unui anticorp cu specificitatea şi afinitatea necesare utilizării sale preconizate (de exemplu, ELISA, imunohistochimie, imagistică in vivo, terapie cu imunotoxine). Anticorpii sunt testaţi pentru activitatea dorită prin metode cunoscute, în conformitate cu scopul pentru care anticorpii urmează să fie utilizaţi (de exemplu, ELISA, imunohistochimie, imunoterapie etc.), pentru îndrumări suplimentare privind generarea şi testarea anticorpilor (vezi, de exemplu, Greenfield, 2014 (Greenfield, 2014)). De exemplu, anticorpii pot fi testaţi în teste ELISA, imunoamprente (Western blots), colorare imunohistochimică a cancerelor pulmonare fixate cu formalină sau secţiuni de ţesut îngheţat. După caracterizarea iniţială in vitro, anticorpii destinaţi utilizării diagnostice terapeutice sau in vivo sunt testaţi conform metodelor cunoscute de testare clinică.
Termenul „anticorp monoclonal», aşa cum este utilizat aici, se referă la un anticorp obţinut dintr-o populaţie substanţial omogenă de anticorpi, adică anticorpii individuali cuprinzând populaţia sunt identici, cu excepţia mutaţiilor posibile în mod natural care pot fi prezente în cantităţi minore. Anticorpii monoclonali descrişi în mod specific includ anticorpi „himerici», în care o porţiune din catena grea şi/sau uşoară este identică sau omoloagă cu secvenţele corespunzătoare din anticorpi derivaţi dintr-o specie particulară sau aparţinând unei anumite clase sau subclase de anticorpi, în timp ce restul catenei (catenelor) este identic sau omolog cu secvenţele corespunzătoare din anticorpii derivaţi de la o altă specie sau aparţinând unei alte clase sau subclase de anticorpi, precum şi fragmente ale unor astfel de anticorpi, atât timp cât aceştia prezintă activitatea antagonistă dorită (US 4,816,567).
Anticorpii monoclonali ai invenţiei pot fi generaţi folosindu-se metode de hibridom. Într-o metodă de hibridom, un şoarece sau alt animal-gazdă adecvat este, de obicei, imunizat cu un agent de imunizare pentru a obţine limfocite care produc sau sunt capabile să producă anticorpi care se vor lega în mod specific la agentul imunizant. Ca alternativă, limfocitele pot fi imunizate in vitro.
Anticorpii monoclonali pot fi obţinuţi, de asemenea, prin metode de ADN recombinant, cum ar fi cele descrise în US 4,816,567. ADN-ul care codifică anticorpii monoclonali ai invenţiei poate fi izolat uşor şi secvenţializat utilizându-se proceduri convenţionale (de exemplu, prin utilizarea probelor oligonucleotidice care sunt capabile să se lege în mod specific la genele codificatoare ale catenelor grele şi uşoare ale anticorpilor murinici).
Metodele in vitro sunt, de asemenea, adecvate pentru prepararea anticorpilor monovalenţi. Digestia anticorpilor pentru a produce fragmente ale acestora, în particular fragmente Fab, poate fi realizată folosindu-se tehnici de rutină cunoscute în domeniu. De exemplu, digestia poate fi efectuată folosindu-se papaină. Exemple de digestie cu papaină sunt descrise în WO 94/29348 şi US 4,342,566. Digestia cu papaină a anticorpilor produce, de obicei, două fragmente identice de legare la antigen, numite fragmente Fab, fiecare cu un singur situs de legare a antigenului şi un fragment Fc rezidual. Tratamentul pepsinei generează un fragment F(ab')2 şi un fragment pFc'.
Fragmentele de anticorpi, fie că sunt ataşate la alte secvenţe sau nu, pot include de asemenea inserţii, deleţii, substituţii sau alte modificări selectate ale unor regiuni particulare sau reziduuri specifice de aminoacizi, cu condiţia ca activitatea fragmentului să nu fie modificată sau degradată în mod semnificativ faţă de anticorpul nemodificat sau fragmentul de anticorp. Aceste modificări pot furniza unele proprietăţi suplimentare, cum ar fi eliminarea/adăugarea de aminoacizi capabili de legare la disulfuri, creşterea biolongevităţii, modificarea caracteristicilor secretoare etc. În orice caz, fragmentul de anticorp trebuie să posede o proprietate bioactivă, cum ar fi activitatea de legare, reglarea legării la domeniul de legare, etc. Regiunile funcţionale sau active ale anticorpului pot fi identificate prin mutageneza unei regiuni specifice a proteinei, urmată de exprimarea şi testarea polipeptidei exprimate. Astfel de metode sunt uşor de înţeles pentru un specialist în domeniu şi pot include mutageneza specifică situsului acidului nucleic care codifică fragmentul de anticorp.
Anticorpii conform invenţiei pot cuprinde suplimentar anticorpi umanizaţi sau anticorpi umani. Formele umanizate ale anticorpilor non-umani (de exemplu, murini) sunt imunoglobuline himerice, catene de imunoglobulină sau fragmente ale acestora (cum ar fi Fv, Fab, Fab 'sau alte subsecvente de legare la antigenului ale anticorpilor) care conţin o secvenţă minimă derivată din imunoglobulină non-umană. Anticorpii umanizaţi includ imunoglobuline umane (anticorp receptor) în care resturile dintr-o regiune determinantă complementară (CDR) a recipientului sunt înlocuite cu resturi dintr-o CDR a unei specii non-umane (anticorp donor), de exemplu de şoarece, şobolan sau iepure cu specificitatea, afinitatea şi capacitatea dorite. În unele cazuri, resturile de cadru Fv (FR) ale imunoglobulinei umane sunt înlocuite cu resturi non-umane corespunzătoare. Anticorpii umanizaţi pot cuprinde, de asemenea, resturi care nu se găsesc nici în anticorpul receptor, nici în secvenţele de CDR sau de cadru importate. În general, anticorpul umanizat va cuprinde, practic, toate cel puţin unul şi, de obicei, două domenii variabile în care toate sau, practic, toate regiunile CDR corespund cu cele ale unei imunoglobuline non-umane şi toate sau, practic, toate regiunile FR sunt cele ale unei secvenţe de consens a imunoglobulinelor umane. Anticorpul umanizat optim va cuprinde, de asemenea, cel puţin o porţiune dintr-o regiune constantă de imunoglobulină (Fc), de obicei cea a unei imunoglobuline umane.
Metodele de umanizare a anticorpilor non-umani sunt bine cunoscute în domeniu. În general, un anticorp umanizat are unul sau mai multe resturi de aminoacid introduse în el dintr-o sursă non-umană. Aceste reziduuri de aminoacid non-umane sunt adesea denumite reziduuri de „import», care sunt, de obicei, luate dintr-un domeniu variabil de „import». Umanizarea poate fi realizată, practic, prin substituirea CDR-urilor sau a secvenţelor CDR de la rozătoare pentru secvenţele corespunzătoare unui anticorp uman. În consecinţă, astfel de anticorpi „umanizaţi» sunt anticorpi himerici (US 4,816,567), în care, practic, mai puţin de un domeniu variabil uman intact a fost substituit cu secvenţa corespunzătoare de la o specie non-umană. În practică, anticorpii umanizaţi sunt, de obicei, anticorpi umani în care unele resturi CDR şi, posibil, unele resturi FR sunt substituite cu resturi din situsuri analoage în anticorpi de la rozătoare.
Pot fi folosite animale transgenice (de exemplu, şoareci), care sunt capabile, după imunizare, să producă un repertoriu complet de anticorpi umani în absenţa producţiei de imunoglobulină endogenă. De exemplu, s-a descris că deleţia homozigotă a genei regiunii de legare a catenei grele de anticorp la şoareci mutanţi himeric şi de filiaţie germinală conduce la inhibarea completă a producţiei de anticorpi endogeni. Transferul seriei de gene de imunoglobulină cu filiaţie germinală umană în astfel de şoareci mutanţi cu filiaţie germinală va conduce la producerea de anticorpi umani după provocarea de către un antigen. Anticorpii umani pot fi, de asemenea, produşi în biblioteci de afişare a fagilor.
Anticorpii din invenţie sunt, preferabil, administraţi unui subiect într-un agent purtător acceptabil din punct de vedere farmaceutic. În mod obişnuit, o cantitate adecvată dintr-o sare acceptabilă din punct de vedere farmaceutic este utilizată în formulă pentru a face formularea izotonică. Exemplele de agent purtător acceptabil din punct de vedere farmaceutic includ soluţia salină, soluţia Ringer şi soluţia de dextroză. pH-ul soluţiei este, preferabil, de la aproximativ 5 la aproximativ 8 şi, mai preferabil, de la aproximativ 7 până la aproximativ 7,5. Agenţii purtători suplimentari includ preparate cu eliberare prelungită, de exemplu matrice semipermeabile de polimeri hidrofobi solizi care conţin anticorpul, matricele fiind sub formă de articole formate, de exemplu, pelicule, lipozomi sau microparticule. Va fi evident pentru persoanele de specialitate din domeniu că anumiţi agenţi purtători pot fi mai preferabili în funcţie de, de exemplu, calea de administrare şi concentraţia anticorpului care este administrat.
Anticorpii pot fi administraţi subiectului, pacientului sau celulei prin injectare (de exemplu, intravenoasă, intraperitoneală, subcutanată, intramusculară) sau prin alte metode, cum ar fi perfuzia, care asigură eliberarea sa în sânge într-o formă eficace. De asemenea, anticorpii pot fi administraţi pe căi intratumorale sau peritumorale pentru a exercita efecte terapeutice locale, precum şi sistemice. Este preferabilă injectarea locală sau intravenoasă.
Dozele şi schemele eficace pentru administrarea anticorpilor pot fi determinate empiric şi realizarea unor astfel de determinări se află în domeniul de specialitate. Specialiştii în domeniu vor înţelege că doza de anticorpi care trebuie administrată va varia în funcţie de, de exemplu, subiectul care va primi anticorpul, calea de administrare, de tipul particular de anticorp utilizat şi alte medicamente administrate. O doză zilnică tipică de anticorp utilizat singur poate varia de la aproximativ 1 µg/kg până la 100 mg/kg de greutate corporală sau mai mult pe zi, în funcţie de factorii menţionaţi mai sus. După administrarea unui anticorp, preferabil pentru tratarea cancerului ovarian, eficacitatea anticorpului terapeutic poate fi evaluată în diverse moduri bine cunoscute de către specialiştii în domeniu. De exemplu, mărimea, numărul şi/sau distribuţia cancerului pulmonar la un subiect care primeşte tratament pot fi monitorizate utilizându-se tehnici standard de imagistică tumorală. Un anticorp administrat terapeutic care opreşte creşterea tumorii, are ca rezultat contracţia tumorală şi/sau împiedică dezvoltarea de tumori noi în comparaţie cu evoluţia bolii care ar avea loc în absenţa administrării anticorpului este un anticorp eficace pentru tratamentul cancerului pulmonar.
Un alt aspect al invenţiei este acela de a furniza o metodă pentru producerea unui receptor de celule T solubil (sTCR) care să recunoască un complex peptidă-MHC specific. Astfel de receptori de celule T solubili pot fi generaţi din clone de celule T specifice şi afinitatea lor poate fi crescută prin mutageneză care vizează regiunile determinante de complementaritate. În scopul selectării receptorilor de celule T, poate fi utilizat o afişare de fagi (US 2010/0113300, (Liddy et al., 2012)). În scopul stabilizării receptorilor celulelor T în timpul afişării fagilor şi în cazul utilizării practice ca medicament, catena alfa şi catena beta pot fi legate, de exemplu, prin legături disulfurice non-native, alte legături covalente (receptor de celulă T cu o singură catenă) sau prin domenii de dimerizare (Boulter et al., 2003; Card et al., 2004; Willcox et al., 1999). Receptorul de celule T poate fi legat de toxine, medicamente, citokine (a se vedea, de exemplu, US 2013/0115191), domenii care recrutează celule efectoare precum domeniul anti-CD3, etc. pentru a executa anumite funcţii asupra celulelor-ţintă. Mai mult, poate fi exprimată în celule T utilizate pentru transferul adoptiv. Informaţii suplimentare pot fi găsite în WO 2004/033685A1 şi WO 2004/074322A1. O combinaţie de sTCR-uri este descrisă în WO 2012/056407A1. Alte metode pentru producere sunt prezentate în WO 2013/057586A1.
În plus, peptidele şi/sau TCR ori anticorpii sau alte molecule de legare ale prezentei invenţii pot fi utilizate pentru a verifica diagnosticul de cancer de la un patolog pe baza unei probe biopsiate.
Anticorpii sau TCR-urile pot fi utilizate, de asemenea, pentru teste diagnostice in vivo. În general, anticorpii sunt etichetaţi printr-o radionucleotidă (cum ar fi 111In, 99Tc, 14C, 131I, 3H, 32P sau 35S), astfel încât tumora să poată fi localizată folosind imunoscintiografie. Într-una dintre realizări, anticorpii sau fragmentele acestora se leagă la domeniile extracelulare a două sau mai multe ţinte ale unei proteine selectate din grupul format din proteinele menţionate mai sus, iar valoarea de afinitate (Kd) este mai mică de 1 x 10 µM.
Anticorpii pentru utilizare diagnostică pot fi etichetaţi cu sonde adecvate pentru detectarea prin diferite metode imagistice. Metodele pentru detectarea sondelor includ, dar nu se limitează la, fluorescenţă, lumină, microscopie confocală şi electronică; imagistică prin rezonanţă magnetică şi spectroscopie; fluoroscopie, tomografie computerizată şi tomografie cu emisie de pozitroni. Sondele adecvate includ, dar nu se limitează la, fluoresceină, rodamină, eozină şi alţi fluorofori, radioizotopi, aur, gadoliniu şi alte lantanide, fier paramagnetic, fluor-18 şi alţi radionuclizi cu emisie de pozitron. În plus, probele pot fi bi- sau multifuncţionale şi pot fi detectate folosind una sau mai multe dintre metodele prezentate aici. Aceşti anticorpi pot fi marcaţi direct sau indirect cu sondele menţionate. Ataşarea probelor la anticorpi implică ataşarea covalentă a probei, încorporarea probei în anticorp şi ataşarea covalentă a unui compus chelator pentru legarea probei, printre alte acţiuni bine cunoscute în domeniu. Pentru imunohistochimie, proba de ţesut bolnav poate fi proaspătă sau congelată ori poate fi încorporată în parafină şi fixată cu un conservant, cum ar fi formalina. Secţiunea fixată sau încorporată care conţine proba intră în contact cu un anticorp etichetat principal şi cu un anticorp secundar, anticorp folosit pentru a detecta exprimarea proteinelor in situ.
Un alt aspect al acestei invenţii include o metodă in vitro de producere a celulelor T activate, metoda constând în contactarea celulelor T in vitro cu molecule MHC umane încărcate cu antigen, exprimate pe suprafaţa unei celule prezentatoare de antigen adecvate, pentru o perioadă de timp suficientă pentru activarea celulelor T într-un mod specific antigenului, antigenul fiind o peptidă conform invenţiei. Este de preferat să se utilizeze o cantitate suficientă de antigen împreună cu celula prezentatoare a antigenului.
Este de preferat o celulă de mamifer, care are un nivel redus sau inexistent de funcţionare ca transportator de peptidă TAP. Printre celulele adecvate, care nu sunt transportatoare de peptidă TAP se numără celulele T2, RMA-S şi Drosophila. TAP este transportatorul asociat cu procesarea antigenului.
Linia de celule umane T2 deficiente în încărcarea peptidei este disponibilă de la American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, USA, având Nr. de catalog CRL 1992; linia de celule Drosophila, linia Schneider 2 este disponibilă de la ATCC cu NR. de catalog CRL 19863; linia de celule RMA-S de şoarece este descrisă în Ljunggren et al. (Ljunggren and Karre, 1985).
De preferinţă, înainte de transfectare, celula-gazdă nu exprimă în mod substanţial nicio moleculă MHC de clasă I. Este, de asemenea, de preferat ca celula stimulatoare să exprime o moleculă importantă pentru furnizarea unui semnal de costimulare pentru celule T, cum ar fi oricare dintre B7.1, B7.2, ICAM-1 şi LFA3. Secvenţele de acid nucleic ale numeroase molecule de MHC de clasă I şi ale moleculelor de costimulator sunt disponibile public în bazele de date GenBank şi EMBL.
În cazul unui epitop MHC de clasă I utilizat ca antigen, celulele T sunt celule T CD8-pozitive.
Dacă o celulă care prezintă antigen este transfectată pentru a exprima un astfel de epitrop, este de preferat ca celula să conţină un vector care exprimă peptida care conţine SEQ. ID NO: 82.
Se pot folosi o serie de alte metode pentru generarea celulelor T in vitro. De exemplu, în generarea CTL pot fi folosite limfocite cu infiltrare tumorală autologe. Piebanski et al. (Piebanski et al., 1995) au utilizat limfocite autologe din sânge periferic (PLB) în pregătirea celulelor T. Mai mult, este posibilă producerea de celule T autolog prin pulsarea de celule dendritice cu peptidă sau polipeptidă sau prin infectare cu un virus recombinant. De asemenea, pot fi folosite celule B pentru producerea de celule T autologe. În plus, celule macrofage pulsate cu peptidă sau polipeptidă sau infectate cu virus recombinant pot fi utilizate pentru prepararea de celule T autologe. S. Walter et al. (Walter et al., 2003) descriu pregătirea in vitro a celulelor T prin utilizarea de celule prezentatoare de antigen artificiale (aAPC), aceasta reprezentând, de asemenea, o modalitate potrivită de generare de celule T pentru peptida aleasă. În prezenta invenţie, celulele aAPC au fost generate prin cuplarea unor complexe de peptide MHC preformate pe suprafaţa unor particule de polistiren (microgranule) prin biochimie biotină:streptavidină. Acest sistem permite controlul exact al densităţii MHC pe celulele aAPC, fapt ce permite amplificarea selectivă a răspunsurilor de aviditate ridicată sau scăzută a celulei T specifice antigenului cu eficienţă crescută, din probele de sânge. Pe lângă complexele MHC:peptidă, celulele aAPC trebuie să poarte alte proteine cu activitate de costimulare, cum ar fi anticorpi anti-CD28 cuplaţi pe suprafeţele lor. Mai mult, astfel de sisteme bazate pe aAPC necesită adesea adăugarea unor factori solubili adecvaţi, de exemplu citokine precum interleukina-12.
Pentru pregătirea celulelor T se pot utiliza, de asemenea, celule alogene, iar o metodă este descrisă detaliat în WO 97/26328. De exemplu, pe lângă celulele de Drosophila şi celulele T2, se pot utiliza şi alte celule pentru prezentarea antigenilor, cum ar fi celule CHO, celule de insecte infectate cu bacilovirus, bacterii, drojdii, celule ţintă infectate cu vaccin. În plus, pot fi folosiţi viruşi vegetali (a se vedea, de exemplu, Porta et al. (Porta et al., 1994), care descrie dezvoltarea virusului mozaicului din Vigna unguiculata, ca fiind un sistem cu productivitate ridicată pentru prezentarea de peptide străine.)
Celulele T activate, care sunt orientate spre peptidele din invenţie, sunt utile în terapie. Astfel, un aspect suplimentar al invenţiei constă în descrierea celulelor T activate care se pot obţine prin metodele anterior menţionate în această invenţie.
Celulele T activate, care sunt produse de metoda de mai sus, vor recunoaşte selectiv o celulă care exprimă aberant o polipeptidă ce conţine o secvenţă de aminoacizi cu SEQ ID NO: 82.
Este de preferat ca celula T să recunoască celula interacţionând prin TCR cu complexul HLA/peptidă (de exemplu, legare). Celulele T sunt utile într-o metodă de distrugere a celulelor ţintă la un pacient ale cărui celule ţintă exprimă aberant o polipeptidă care conţine o secvenţă de aminoacizi din invenţie, atunci când pacientului îi este administrat un număr eficient de celule T activate. Celulele T care sunt administrate pacientului pot fi preluate de la pacient şi activate conform descrierii de mai sus (adică sunt celule T autologe). Alternativ, celulele T nu sunt preluate de la pacient, ci de la alt individ. Desigur, este de preferat ca sursa să fie un individ sănătos. Prin „individ sănătos», inventatorii înţeleg că individul are o stare generală de sănătate bună, de preferat un sistem imunitar puternic şi, mai bine, nu suferă de nicio boală care să poată fi testată sau detectată.
In vivo, celulele ţintă pentru celulele T CD8-pozitive conform prezentei invenţii pot fi celule tumorale (care, uneori, exprimă MHC de clasă II) şi/sau celulele stromale care înconjură tumoarea (celule tumorale) (care, uneori, pot şi ele exprima MHC de clasă II; (Dengjel et al., 2006)).
Celulele T din prezenta invenţie pot fi utilizate ca ingrediente active ale unei compoziţii terapeutice. Astfel, invenţia furnizează, de asemenea, o metodă de ucidere a celulelor-ţintă la un pacient ale cărui celule ţintă exprimă aberant o polipeptidă care conţine o secvenţă de aminoacizi din invenţie, metoda constând în administrarea unui număr eficient de celule T pacientului, aşa cum s-a arătat mai sus.
Prin „exprimată aberant», inventatorii înţeleg, de asemenea, că polipeptida este supra-exprimată în comparaţie cu nivelurile normale de exprimare sau că gena este silenţioasă în ţesutul din care este derivă tumoarea, însă în tumoare este exprimată. Prin „supraexprimată», inventatorii înţeleg că polipeptida este prezentă la un nivel de cel puţin 1,2 ori mai mare decât în ţesutul normal; de preferat de cel puţin 2 ori şi, mai preferabil, de cel puţin 5 ori sau 10 ori mai mare decât nivelul prezent în ţesutul normal.
Celulele T pot fi obţinute prin metode cunoscute în domeniu, precum cele descrise mai sus.
Protocoale pentru acest aşa-numit transfer adoptiv de celule T sunt bine cunoscute în domeniu. Recenzii pot fi găsite în: Gattioni et al. şi Morgan et al. (Gattinoni et al., 2006; Morgan et al., 2006).
Un alt aspect al prezentei invenţii include utilizarea peptidelor complexate cu MHC pentru generarea unui receptor de celule T al cărui acid nucleic este clonat şi introdus într-o celulă gazdă, de preferinţă o celulă T. Această celulă T modificată poate fi transferată unui pacient pentru terapia cancerului.
Toate moleculele din această invenţie, adică peptida, acidul nucleic, anticorpul, vectorul de exprimare, celula T activată, receptorul celulei T sau acidul nucleic care îl codifică sunt utile pentru tratamentul unor afecţiuni caracterizate de celule care evită un răspuns imunitar. În consecinţă, orice moleculă din prezenta invenţie poate fi utilizată ca medicament sau pentru fabricarea unui medicament. Molecula poate fi utilizată ca atare sau combinată cu altă(e) moleculă(e) din invenţie sau cu o moleculă/molecule cunoscută(e).
Deoarece polipeptidele subiacente ale peptidelor, astfel cum sunt descrise şi menţionate în tabelele de mai sus, sunt foarte exprimate în cancerul ovarian şi sunt exprimate la niveluri destul de scăzute în celulele normale, ţintirea peptidelor derivate din produsele proteice ale următoarelor gene pot fi, de preferinţă, integrate într-o strategie terapeutică:
Prezenta invenţie furnizează în continuare un medicament util în tratarea cancerului, în special cancer ovarian şi alte malignităţi.
Prezenta invenţie mai include un kit care cuprinde:
(a) un recipient conţinând o compoziţie farmaceutică conform descrierii de mai sus, în soluţie sau în formă liofilizată; (b) opţional, un al doilea container care conţine un diluant sau o soluţie de reconstituire pentru formula liofilizată; şi (c) opţional, instrucţiuni pentru (i) utilizarea soluţiei sau (ii) reconstituirea şi/sau utilizarea formulei liofilizate. Trusa poate conţine suplimentar şi una sau mai multe din următoarele: (iii) soluţie tampon, (iv) dizolvant, (v) filtru, (vi) ac sau (v) seringă. Recipientul este, preferabil, o sticlă, o fiolă, o seringă sau o eprubetă, şi poate fi un recipient reutilizabil. Compusul farmacologic este, preferabil, liofilizat. Trusele din prezentul brevet vor conţine, preferabil, formula liofilizată care face obiectul prezentului brevet într-un recipient adecvat şi instrucţiunile pentru reconstituirea şi/sau utilizarea acesteia. Recipientele adecvate includ, de exemplu, sticle, fiole (de exemplu fiole dublu compartimentate), seringi (cum ar fi seringile dublu-compartimentate) şi eprubete. Recipientul poate fi construit dintr-o varietate de materiale, de exemplu sticlă sau plastic. Preferabil, trusa şi/sau recipientul conţin instrucţiuni privind (sau asociate cu) recipientul, care prezintă instrucţiunile de reconstituire şi/sau administrare. De exemplu, eticheta poate indica dacă formula liofilizată trebuie reconstituită la o concentraţie a peptidelor descrisă anterior. În plus eticheta poate indica dacă formula este utilizabilă sau destinată pentru administrarea subcutanată. Recipientul care conţine formula poate fi o fiolă pentru utilizări multiple, care permite administrarea repetată (de exemplu, 2-6 administrări) a formulei reconstituite. Trusa poate include în plus şi un al doilea recipient care conţine un dizolvant adecvat (de exemplu, soluţie de bicarbonat de sodiu). La amestecarea dizolvantului cu formula liofilizată, concentraţia finală de peptide în formula reconstituită este preferabil de cel puţin 0,15 mg/ml/peptidă (=75 μg) şi preferabil nu depăşeşte 3 mg/ml/peptidă (=1500 μg). În plus trusa poate include şi alte materiale necesare din punct de vedere comercial şi al utilizării, inclusiv alte soluţii tampon, alţi dizolvanţi, filtre, ace, seringi şi pliante cu instrucţiuni de utilizare. Trusele din prezentul brevet pot prezenta un singur recipient care conţine formula compusului farmacologic conform cu prezentul brevet, cu sau fără alte componente (de exemplu alţi compuşi sau alte formule farmacologice ale acestor alţi compuşi) sau pot prezenta câte un recipient distinct pentru fiecare compus. Preferabil, trusele din invenţie includ o formă de condiţionare care face obiectul brevetului ambalată pentru utilizarea în combinaţie cu coadministrarea cu un al doilea compus (cum ar fi adjuvanţii (de exemplu GM-CSF, agent chimioterapeutic, produs natural, hormon sau antagonist, agent antiangiogenetic sau inhibitor de angiogeneză, agent inductor de apoptoză sau chelator) sau cu un compus farmacologic al acestora. Componentele trusei pot fi pre-amestecate sau fiecare componentă poate fi într-un recipient separat, distinct, înainte de administrarea către pacient. Componentele trusei se pot furniza în una sau mai multe soluţii lichide, preferabil soluţii apoase, şi în mod ideal ca soluţii apoase sterile. Componentele trusei pot fi furnizate de asemenea şi în stare solidă, care se poate converti în stare lichidă prin adăugarea solvenţilor adecvaţi, care se vor furniza preferabil într-un recipient distinct. Recipientul unei truse terapeutice poate fi fiolă, eprubetă, flacon, sticlă, seringă sau orice altă formă de depozitare a unui solid sau lichid. De obicei, dacă este vorba de mai mult de un singur component, trusa va include şi o a doua fiolă sau un alt recipient, care permite dozarea separată. Trusa poate include şi un alt recipient pentru un lichid farmacologic acceptabil. Preferabil, trusa terapeutică va include şi un sistem (de exemplu unul sau mai multe ace, seringi, picurătoare pentru ochi, pipete etc.) care permit administrarea agenţilor care fac obiectul invenţiei şi care intră în componenţa trusei. Formula prezentă este una adecvată pentru administrarea peptidelor pe o cale de administrare acceptabilă, cum ar fi orală (enterală), nazală, oftalmică, subcutanată, intradermică, intramusculară, intravenoasă sau transdermică. Preferabil, administrarea va fi subcutanată şi, cel mai preferabil, intradermică. Administrarea se poate face prin injectomat. Deoarece peptida din invenţie este izolată din cancer ovarian, medicamentul din invenţie este folosit, de preferinţă, pentru tratarea cancerului ovarian. De preferinţă, peptidele incluse în vaccin sunt identificate printr-o metodă care cuprinde: (a) identificarea peptidelor asociate tumorii (TUMAP-uri) prezentate de o probă tumorală de la pacientul individual; (b) compararea peptidelor identificate la litera (a) cu un depozit (bază de date) de peptide descris mai sus; şi (c) selectarea a cel puţin unei peptide din depozit (baza de date) care se corelează cu o peptidă asociată tumorii identificată la pacient. De exemplu, TUMAP-urile prezentate de proba tumorală sunt identificate de: (a1) compararea datelor de exprimare de la proba tumorală cu datele de exprimare dintr-o probă de ţesut normal corespunzător tipului de ţesut din proba tumorală pentru identificarea proteinelor exprimate excesiv sau exprimate în mod aberant în proba tumorală; şi (a2) corelarea datelor de exprimare cu secvenţe de liganzi MHC legaţi de molecule MHC de clasă I şi/sau clasă II din proba tumorală pentru identificarea liganzilor MHC derivaţi de proteine supraexprimate sau exprimate în mod aberant de tumoare. De preferinţă, secvenţele liganzilor MHC sunt identificate prin eluarea peptidelor legate din molecule MHC izolate din proba tumorală şi secvenţierea liganzilor eluaţi. De preferinţă, proba de tumoare şi ţesutul normal sunt obţinute de la acelaşi pacient. TUMAP-urile pot fi identificate la pacient de novo şi apoi incluse în vaccin. Ca un exemplu, TUMAP-urile candidate pot fi identificate la pacient prin (a1) compararea datelor de exprimare de la proba tumorală cu datele de exprimare dintr-o probă de ţesut normal corespunzător tipului de ţesut din proba tumorală pentru identificarea proteinelor exprimate excesiv sau exprimate în mod aberant în proba tumorală; şi (a2) corelarea datelor de exprimare cu secvenţe de liganzi MHC legaţi de molecule MHC de clasă I şi/sau clasă II din proba tumorală pentru identificarea liganzilor MHC derivaţi de proteine supraexprimate sau exprimate în mod aberant de tumoare. Ca un alt exemplu, proteinele pot fi identificate ca fiind cele care conţin mutaţii unice pentru proba tumorală în raport cu ţesutul normal corespunzător de la pacientul individual, iar TUMAP-urile pot fi identificate ca fiind cele care vizează în mod specific mutaţia. De exemplu, genomul tumorii şi ţesutul normal corespunzător pot fi secvenţiate prin secvenţializarea întregului genom: Pentru descoperirea mutaţiilor nesinonime în regiunile codificatoare de proteine ale genelor, ADN-ul şi ARN-ul genomice sunt extrase din ţesuturile tumorale, iar ADN-ul genomic normal nemutant este extras din celule mononucleare (PBMC-uri) din sânge periferic. Abordarea NGS aplicată se limitează la resecvenţierea regiunilor de codificare a proteinelor (resecvenţiere a exomului). În acest scop, ADN-ul exonic din probe umane este capturat folosindu-se truse de îmbogăţire a ţintei de la furnizor, urmate de secvenţiere cu, de exemplu, un HiSeq2000 (Illumina). Adiţional, ARNm-ul tumoral este secvenţiat pentru cuantificarea directă a exprimării genelor şi validarea genelor mutante exprimate în tumorile pacienţilor. Milioanele de rezultate de citire a secvenţelor sunt procesate prin algoritmi software. Lista de ieşire conţine mutaţii şi exprimarea genică. Mutaţiile somatice specifice tumorii sunt determinate prin compararea cu variaţiile de linii germinale derivate de PBMC-uri şi sunt prioritizate. Peptidele identificate de novo pot fi apoi testate pentru imunogenitate aşa cum este descris mai sus pentru depozit, iar TUMAP-urile candidate care posedă imunogenitate adecvată sunt selectate pentru a fi incluse în vaccin. Într-un exemplu de concretizare, peptidele incluse în vaccin sunt identificate prin: (a) identificarea peptidelor asociate tumorii (TUMAP-uri) prezentate de o probă tumorală de la pacientul individual; şi (b) selectarea a cel puţin unei peptide identificate de novo la litera (a) şi confirmarea imunogenităţii acesteia. De preferinţă, vaccinul este o formulare lichidă care constă din peptidele individuale dizolvate între 20%-40% DMSO, de preferinţă aproximativ 30%-35% DMSO, de exemplu aproximativ 33% DMSO. Fiecare peptidă care trebuie inclusă într-un produs este dizolvată în DMSO. Concentraţia soluţiilor peptidice unice trebuie aleasă în funcţie de numărul de peptide care trebuie incluse în produs. Soluţiile de peptidă-DMSO individuale se amestecă în părţi egale pentru a se obţine o soluţie care conţine toate peptidele care trebuie incluse în produs cu o concentraţie de ~2,5 mg/ml per peptidă. Soluţia amestecată este apoi diluată la 1:3 cu apă pentru injecţii pentru a se atinge o concentraţie de 0,826 mg/ml per peptidă în 33% DMSO. Soluţia diluată este filtrată folosindu-se un filtru steril de 0,22 µm. Se obţine soluţia vrac finală. Soluţia vrac finală este introdusă în flacoane şi este depozitată la -20°C până în momentul utilizării. Un flacon conţine 700 µl de soluţie care conţine 0,578 mg din fiecare peptidă. Din această cantitate, 500 μl (aproximativ 400 µg per peptidă) vor fi aplicaţi pentru injectare intradermală. Prezenta invenţie va fi descrisă acum în următoarele exemple care arată încorporările preferate ale acesteia, fără a fi totuşi limitată la acestea.
FIGURI
Figura 1 prezintă exprimarea HLA-A, B, C (a) şi HLA-DR (b) a diferitelor subseturi de celule din cancer ovarian şi ţesut ovarian benign. Pentru Figura 1 a fost utilizat testul t Student bilateral neîmperecheat cu corecţia lui Welch din cauza unei variaţii inegale între cele două grupuri de comparaţie. Exprimarea HLA de clasă I (A) şi HLA-DR (B) pe diferite tipuri de celule din EOC şi ţesut ovarian benign după disocierea enzimatică caracterizată prin markeri de suprafaţă celulară distincţi (compartimente de leucocite: CD45+, compartimente de celule tumorale/celule epiteliale: CD45-EpCam+, compartimente de celule endoteliale: CD45-CD31+). Fiecare punct de date reprezintă media experimentelor triplicate efectuate pentru fiecare probă. Pentru testarea semnificaţiei au fost utilizate teste t bilaterale (* p <0,05; ** p <0,01).
Figurile de la 2A până la D arată profilarea comparativă a imunopeptidomului EOC faţă de ţesuturi benigne. (A) Profilarea comparativă a proteinelor-sursă de ligand HLA de clasă I reprezentate în EOC (n=34) şi ţesuturile benigne. Frecvenţa prezentării HLA-restricţionate a proteinelor-sursă este indicată pe axa y, separat pentru EOC (deasupra axei x) şi surse benigne (dedesubtul axei x). Proteinele-sursă au fost clasificate (de la stânga la dreapta) în funcţie de frecvenţa lor de prezentare specifică a EOC. Caseta din partea stângă evidenţiază proteinele-sursă de ligand TOP100 HLA prezentate exclusiv de EOC. (B) Nor de cuvinte pentru proteinele-sursă de ligand HLA de clasă I specific TOP 100 EOC (denumirea genei recomandată de uniprot). Mărimea fontului (5-26) se corelează cu numărul absolut de pacienţi cu cancer care prezintă liganzi HLA ai proteinelor-sursă respective. (C) Profilarea comparativă a proteinelor-sursă de ligand HLA de clasă II reprezentate în EOC (n=22) şi ţesuturile benigne. (D) Nor de cuvinte pentru proteinele-sursă de ligand HLA de clasă II specific TOP 100 EOC (denumirea genei recomandată de uniprot). Mărimea fontului (3-11) se corelează cu numărul absolut de pacienţi cu cancer care prezintă liganzi HLA ai proteinelor-sursă respective.
Figura 3 prezintă originea celulară a liganzilor HLA de clasă I asociaţi TOP100 EOC. Diagramele vulcan ale abundenţei relative a liganzilor HLA în imunopeptidomul de clasă I al populaţiilor de celule îmbogăţite de OvCa 84 analizate prin cuantificare fără etichete. Panourile arată, în partea stângă (A), leucocite infiltrante tumorale (CD45+) vs. celule tumorale (CD45- Epcam+) şi, în partea dreaptă (B), celule stromale (CD45- EpCam-) vs. celule tumorale. Linia punctată orizontală indică pragul de semnificaţie (p <0,05) Sunt evidenţiaţi liganzii exclusivi TOP100 EOC (MUC16 (roşu), DDR1, EYA2, SOX9, TLR7, OASL), precum şi liganzii derivaţi din antigeni asociaţi leucocitelor (CD132, CD8, LSP1) şi antigeni asociaţi stromei (celulei endoteliale) (vWF).
Figura 4 prezintă colorarea imunohistochimică şi nivelurile serice ca markeri-surogat pentru prezentarea liganzilor. Colorarea imunohistochimică a carcinoamelor ovariene seroase de grad înalt pentru MUC16 (CA-125) cu scor de imunoreactivitate scăzut (IRS4), intermediar (IRS6) şi ridicat (IRS12) (A). Colorarea imunohistochimică pentru mezotelină (dreapta, IRS8) şi IDO1 (stânga, IRS 12; toate la magnificaţie 200x) (B). Corelarea prezentării ligandului HLA şi a exprimării proteinei-sursă a antigenilor asociaţi TOP100 EOC selectaţi. Exprimarea MUC16 (n=23), IDO1 (n=23) şi MSLN (n=16) a fost analizată prin colorare imunohistochimică (C) sau prin analiză serică a CA-125 (n=30) în ziua intervenţiei chirurgicale (D). Pentru MSLN au fost incluse doar cazurile pentru care au fost disponibile date despre imunopeptidomul HLA de clasă II. Pentru testarea semnificaţiei statistice a fost utilizat testul non-parametric Mann-Whitney (p <0,05 a fost considerat semnificativ).
Figura 5 arată relevanţa prognostică a MUC16 şi MSLN. Colorări imunohistochimice au fost efectuate pe TMA-uri cu 71 probe de EOC seros de grad înalt de la pacienţi cu reducţie documentată optim. (A) Diagramă Kaplan-Meier care ilustrează influenţa exprimării MUC16 (panoul din stânga, scor de exprimare scăzut, <7, n=41; scor de exprimare ridicat, >7, n=30) şi exprimare MSLN (panoul din dreapta, exprimare scăzută, <6, n=15; exprimare ridicată, >6, n=52) asupra supravieţuirii globale. (B) Impactul infiltrării celulelor T CD3 în compartimentul intraepitelial (panoul din stânga, CD3E, infiltrare scăzută, <7 celule/HPF, n=13; infiltrare ridicată, >7, n=57) sau stroma fibrovasculară (panoul drept, CD3S, infiltrare scăzută, <7 celule/HPF, n=40; infiltrare ridicată, >7, n=30) asupra supravieţuirii totale a pacienţilor. (C) Analiza de subgrup a colorării combinate de CD3 şi MLN (toate limitele de scor ca mai sus) pentru celule T intraepiteliale CD3 (panoul de sus, MSLN scăzut/CD3E ridicat, n=11; MSLN scăzut/CD3E scăzut, n=40; MSLN ridicat/CD3E scăzut, n=14; MSLN ridicat/CD3E ridicat, n=1) sau celule T fibrovasculare CD3 (panoul de jos, MSLN scăzut/CD3S ridicat, n=30; MSLN ridicat/CD3S scăzut, n=7; MSLN scăzut/CD3S scăzut, n=21; MSLN ridicat/CD3S ridicat, n=8).
Figura 6 arată analiza prin citometrie în fluxului pentru EOC şi ţesut ovarian benign. Prezentare exemplificativă a strategiei de gating pentru OvCa 48 care arată selecţia de leucocite CD45+, celule endoteliale CD45-CD31+ şi celule tumorale sau epiteliale CD45-EpCam+.
Figura 7 arată analiza de saturaţie a identificărilor de proteine-sursă de ligand HLA pentru EOC. Analiza de saturaţie pentru identificările de proteine-sursă este descrisă separat pentru proteinele de ligand HLA de clasă I (A) şi HLA de clasă II (B). Numărul mediu de proteine-sursă unice a fost calculat pentru fiecare număr de surse cu 1000 de eşantionări aleatorii din cele 34 de surse de EOC. Regresia exponenţială a fost utilizată pentru a determina acoperirea maximă calculată a accesului la proteinele-sursă (liniile punctate) pentru EOC.
Figura 8 arată frecvenţa şi numărul de prezentări ale ligandului HLA între probele de EOC. Prezentarea HLA a antigenilor asociaţi cu EOC selectaţi, precum şi numărul de diferite peptide prezentate de HLA (codificare prin culori) sunt vizualizate pentru fiecare EOC individual (numărul pacientului deasupra fiecărei coloane), atât pentru antigeni de clasă I (sus), cât şi de clasă II (jos).
EXEMPLE
Materiale şi metode
Probe de ţesut
Toate probele de ţesut au fost colectate la Spitalul Universitar din Tübingen după obţinerea consimţământului informat al pacientului în conformitate cu principiile Declaraţiei de la Helsinki. Toate protocoalele de studiu au fost aprobate de comisia de revizuire instituţională locală. Dacă nu este menţionat altfel, probele au fost păstrate la -80°C până la utilizarea ulterioară. Tiparea HLA cu două cifre a fost efectuată prin PCR de amorsă specifică de secvenţă (SSP) folosindu-se HLA-Ready Gene System (Innotrain, Kronberg, Germania) şi evaluarea tipării a fost efectuată cu SCORE Software (Olerup, Stockholm, Suedia) la Departamentul de Medicină Transfuzională al Spitalul Universitar din Tübingen. Tiparea HLA cu patru cifre de înaltă rezoluţie a fost realizată prin secvenţiere de generaţia următoare pe un GS Junior Sequencer folosindu-se GS GType HLA Primer Sets (ambele Roche, Basel, Elveţia). Ţesuturile normale au fost obţinute de la Bio-Options Inc, CA, SUA; BioServe, Beltsville, MD, SUA; Capital BioScience Inc, Rockville, MD, SUA; Geneticist Inc., Glendale, CA, SUA; Spitalul Universitar din Geneva; Spitalul Universitar din Heidelberg; Spitalul Universitar din München; ProteoGenex Inc., Culver City, CA, SUA; Spitalul Universitar din Tübingen. Consimţămintele informate scrise ale pacienţilor a fost obţinut înainte de intervenţiile chirurgicale sau autopsii. Ţesuturile au fost congelate rapid imediat după excizare şi stocate până la izolarea TUMAP la -70°C sau temperaturi mai joase.
Disocierea ţesuturilor
Ţesuturile de EOC, precum şi ţesuturile benigne de ovar şi trompă uterină au fost proaspăt colectate de la pacienţii supuşi rezecţiei/reducţiei tumorii sau salpingooforectomiei. Ţesuturile au fost fragmentate în bucăţi mici <2 mm3 şi transferate într-o soluţie de disociere enzimatică conţinând 400 U/ml colagenază tip IV, 5 U/ml dispază (ambele de la Life Technologies, Carlsbad, CA) şi 0,1mg/ml DNase (Roche, Basel, Elveţia) în DMEM (Life Technologies) cu 10% ser fetal de viţel (Lonza, Basel, Elveţia). Disocierea a fost efectuată pe un agitator rotativ (Infors HT, Basel, Elveţia) timp de 3 ore la 37°C. Fragmentele de ţesut rămase (de obicei <1% din greutatea iniţială) au fost îndepărtate folosindu-se un filtru de celule de 100 µm (BD, Franklin Lakes, NJ). Suspensiile celulare singulare au fost spălate de două ori cu PBS şi eritrocitele au fost lizate folosindu-se tampon de liză cu clorură de amoniu.
Cuantificarea moleculelor de suprafaţă HLA
Exprimarea de suprafaţă a HLA a fost determinată folosindu-se testul citometric în flux de cuantificare QIFIKIT (Dako, Glostrup, Danemarca) conform instrucţiunilor producătorului. Celulele au fost colorate cu anticorp monoclonal pan-HLA de clasă I specific W6/32, HLA-DR specific L243 sau control al izotipului respectiv. Discriminarea tipurilor de celule s-a bazat pe colorarea markerilor de suprafaţă cu anticorpi marcaţi fluorescent direcţionaţi împotriva CD45 (clonă AmCyan 2D1, BD), CD31 (PeCy7, clonă WM59, Biolegend, San Diego, CA), EpCam (APC, clonă HEA125, Miltenyi, Bergisch-Gladbach, Germania) şi CD34 (APCCy7, clonă 581, Biolegend). A fost adăugat 7-AAD (BioLegend) ca marker de viabilitate imediat înainte de analiza pe un instrument LSR SORP Fortessa (BD). Au fost înregistrate triplicate pentru fiecare probă cu intensităţi mediane de fluorescenţă utilizate pentru calcularea exprimării moleculelor de suprafaţă.
Separarea celulelor:
Separarea celulelor a fost efectuată folosindu-se două protocoale consecutive de separare a celulelor activate magnetic (MACS) conform instrucţiunilor producătorului (Miltenyi). Separările au fost efectuate folosindu-se coloane XS şi un separator SuperMACS (ambele Miltenyi). Prima separare a vizat selectarea pozitivă a leucocitelor CD45+. Fracţia negativă a fost ulterior îmbogăţită pentru celule tumorale EpCam+. Se presupune că restul fracţiei „EpCam» CD45 reprezintă fracţia de celule stromale.
Izolarea liganzilor HLA
Moleculele HLA de clasă I şi clasă II au fost izolate prin purificare de imunoafinitate standard descrisă anterior 42. Anticorpul monoclonal pan-HLA de clasă I specific W6/32 a fost utilizat pentru izolarea HLA de clasă I, iar anticorpul monoclonal pan-HLA de clasă II Tü39, precum şi anticorpul monoclonal HLA-DR specific L243 au fost folosiţi pentru izolarea HLA de clasă II.
Analiza imunopeptidomului prin LC-MS/MS
Analiza imunopeptidomului a fost realizată pe un spectrometru de masă LTQ OrbitrapXL (Thermo Fisher, Waltham, MA) echipat cu o sursă de ioni cu pulverizare nanoelectronică şi cuplat la un Ultimate 3000 RSLC Nano UHPLC System (Dionex, Sunnyvale, CA). Probele de peptidă au fost încărcate cu 3% solvent B (20% H2O, 80% acetonitril şi 0,04% acid formic) pe o coloană de 2 cm PepMap 100 C18 Nanotrap (Dionex) la un debit de 4 µl/min timp de 10 minute. Separarea a fost efectuată pe o coloană de 50 cm PepMap C18 cu o dimensiune a particulelor de 2 µm (Dionex) montată într-un cuptor cu coloană funcţionând la 50°C. Gradientul aplicat a variat de la 3% până la 30% solvent B în 140 minute la un debit de 175 nil/min.
(Solvent A: 99% H2O, 1% ACN şi 0,1% acid formic; Solvent B: 20% H2O, 80% ACN şi 0,1% acid formic). Analiza prin spectrometrie de masă a fost efectuată în modul de achiziţie dependentă de date folosindu-se o metodă „top cinci» (adică în timpul fiecărei scanări de sondaj, cei mai abundenţi cinci ioni precursori au fost selectaţi pentru fragmentare). Scanările de sondaj au fost înregistrate în Orbitrap la o rezoluţie de 60.000. Analiza MS/MS a fost efectuată prin disociere indusă prin coliziune (CID, energie de coliziune normalizată 35%, timp de activare 30 ms, lăţime de izolare 1,3 m/z) cu analiza ulterioară în cvadrupolul cu capcană liniară (LTQ). Intervalul de masă pentru liganzi HLA de clasă I a fost limitat la 400-650 m/z, cu posibile stări de încărcare 2+ şi 3+ selectate pentru fragmentare. Pentru HLA de clasă II, intervalul de masă a fost stabilit la 300-1500 m/z, permiţându-se fragmentare cu stări de încărcare pozitivă ≥2.
Probele de HLA de clasă I au fost analizate în 5 replicări tehnice, în timp ce, pentru probele de HLA de clasă II, achiziţia tipică a fost realizată cu 3 replicări tehnice. Rulările iniţiale au fost efectuate fără excludere dinamică, în timp ce, pentru rulări consecutive, a fost activată o excludere dinamică de 5 secunde.
Prelucrarea şi analiza datelor de spectrometrie de masă
Analiza datelor de spectrometrie de masă a fost efectuată utilizându-se Proteome Discoverer 1.3 (ThermoFisher). Listele de vârfuri au fost căutate în raport cu proteomul uman cuprins în baza de date Swiss-Prot (www.uniprot.org, lansată la 27 septembrie 2013, incluzând 20.279 de secvenţe proteice revizuite) folosindu-se motorul de căutare Mascot (Mascot 2.2.04, Matrix Science, Boston, MA). Toleranţa de masă pentru procesare a fost de 5 ppm pentru ioni precursori şi 0,5 Da pentru ioni fragmente. Nu a fost selectată nicio specificitate de clivaj şi singura modificare dinamică permisă a fost metionina oxidată. Intervalul de încredere pentru peptide a fost determinat folosindu-se algoritmul percolator cu o valoare-ţintă q ≤0,05 (5% FDR). Filtre adiţionale de postprocesare au fost un IonScor Mascot ≥20, rangul motorului de căutare = 1 şi lungimea peptidelor de 8-12 aminoacizi pentru liganzi HLA de clasă I şi de 12-25 aminoacizi pentru liganzi HLA de clasă II. Gruparea proteinelor a fost dezactivată pentru a se asigura adnotări multiple de peptide dacă secvenţele corespund mai multor proteine din cauza conservării. Adnotarea HLA-urilor a fost efectuată folosindu-se algoritmi de predicţie pentru HLA găzduite la SYFPEITHI (www.syfpeithi.de) şi NETMHC 3.4 (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHC/). În cazul unor rezultate ambigue, sunt menţionate alele multiple. Pentru profilare comparativă „potriviri singulare», adică peptide prezentate numai pe o singură sursă, valorile PSM ≤5 au fost eliminate din ambele seturi de date.
Cuantificarea fără etichete a peptidelor pe tumoare vs. CD45+ şi tumoare vs. celulele stromale a fost efectuată folosindu-se Sieve 2.1 (Thermo Fisher). Cel puţin 3 replicări de fişiere brute de MS pentru fiecare fracţie celulară îmbogăţită, precum şi rezultatele din precipitate de MHC din ţesuturi integrale au fost aliniate împreună cu un decalaj maxim al timpului de retenţie (RT) de 2,5 minute. Cadrele au fost generate pe baza evenimentelor de scanare MS2 cu lăţimea RT maximă de 3,5 minute şi toleranţa de masă de 5 ppm. Identificările au fost importate de la Proteome Discoverer folosindu-se rezultatele căutării Mascot (vezi mai sus). A fost utilizată normalizarea cromogramei curentului ionic total pentru a se adapta diferenţele de intensitate ale probelor.
Analiza imunogenităţii liganzilor HLA de clasă I
Amorsarea limfocitelor citotoxice specifice peptidelor (CTL) a fost efectuată folosindu-se un protocol stabilit care implică celule prezentatoare de antigen artificiale (aAPCs) (30). aAPC-urile au constat din granule de polistiren acoperite cu streptavidină (diametru de 5,6 µm; Bangs Laboratories, Fishers, IN). Granulele au fost resuspendate la 2x106 particule per ml şi incubate cu 10 nM de complexe peptidă-MHC biotinilate şi 10 nM de anticorp anti-CD28 stimulator (clonă 9.3 derivată de la ATCC, Manassas, VA) fiecare timp de 30 de minute la temperatura ambiantă. Celulele T au fost izolate din sânge integral de donatori sănătoşi folosindu-se un kit de izolare a celulelor magnetice CD8 (Miltenyi). Au fost cultivate un milion de celule T per godeu în plăci cu 96 de godeuri (Corning, Corning, NY, SUA) şi acestea au fost stimulate cu acelaşi număr de aAPC-uri încărcate în prezenţa a 5 ng/ml de IL-12 (PromoCell, Heidelberg, Germania). Celulele T au fost stimulate de 3 ori în total, cu interval de stimulare săptămânal. S-au adăugat 40 U/ml de IL-2 la 2 zile după fiecare stimulare. Amorsarea celulelor T a fost evaluată prin colorare MHC-multimer la o săptămână după ultima rundă de stimulare.
Construcţia micromatricelor tisulare (TMA)
Probele tumorale încorporate în parafină ale pacientelor cu carcinom seros de grad înalt al ovarului sau al trompei uterine (EOC) cu cel puţin FIGO stadiul II-III şi operate la Spitalul Universitar pentru Femei al Universităţii din Tübingen între 1999 şi 2008 au fost prelevate din arhivele Institutului de Patologie. După confirmarea subtipului histologic şi gradarea în conformitate cu criteriile publicate (43), În studiu au fost incluse iniţial 154 de cazuri. A fost construită o micromatrice tisulară (TMA) aşa cum s-a descris anterior (44). Am folosit şase nuclee cu diametrul de 0,6 mm pentru fiecare pacientă (maximum trei nuclee fiecare din două locuri diferite ale tumorilor primare - cel puţin două nuclee separate). În plus, am construit un TMA folosind ţesut înglobat în parafină din tumorile primare ale cazurilor colectate prospectiv pentru analiza ligandomului. Secţiuni cu grosimea de 3 µm au fost tăiate, rehidratate şi supuse unui pretratament specific pentru imunohistochimie. În total, 23 de cazuri au fost evaluate pentru determinarea imunoscorului şi corelarea cu datele despre imunopeptidom.
Imunohistochimie
Pentru imunohistochimie au fost utilizaţi următorii anticorpi primari şi diluţii: CD3 (1:100, şobolan, monoclonal SP7, DCS, Hamburg, Germania), CD8 (1:200, şoarece, monoclonal C8/144B, DAKO), MUC16 (1:450, şoarece, monoclonal M11, DAKO, Glostrup, Danemarca), IDO1 (1:25, şoarece, monoclonal, ABCAM, Cambridge, Regatul Unit) şi MSLN (1:100, şoarece, monoclonal SPM143, GeneTex, Irvine, CA, SUA). Secţiunile de ţesut au fost pretratate cu soluţie-tampon EDTA (pH 8,6) la 95°C timp de 36 de minute. Colorarea imunohistochimică a fost efectuată pe un echipament automat de imunocolorare în conformitate cu instrucţiunile producătorului folosindu-se kitul de detectare iView DAB (ambele Ventana, Tucson, AZ, SUA).
Determinarea imunoscorului
Cuantificarea TIL-urilor a fost efectuată prin evaluarea mai întâi a numărului mediu de celule imunocolorate per câmp de putere mare (HPF=400x) prin numărarea a cel puţin 2 HPF pentru fiecare nucleu. Într-o a doua etapă a fost calculat numărul mediu de limfocite per HPF pentru setul de nuclee triple stâng şi drept şi pentru toate nucleele împreună. Acest număr mediu bilateral a fost utilizat pentru calcule suplimentare. Stroma tumorii fibro-vasculare (CD3S şi CD8S) şi compartimentul intraepitelial al tumorii (CD3E şi CD8E) au fost evaluate separat.
Pentru exprimarea CA 125, intensitatea colorării IDO1 şi MSLN a fost clasificată de la 0 la 3, înmulţit cu un scor de la 1 la 4 pentru procentajul de celule tumorale (1: 0-10%; 2: 10-50%; 3: 50-80%; 4: 80-100%). Pentru toţi parametrii, cazurile au fost separate în quartile şi cea mai bună separare între două quartile a fost definită ca valoare de întrerupere între exprimarea ridicată şi cea scăzută. Dintre cele 154 de cazuri de TMA, 71 de pacienţi au fost supuşi unei reducţii tumorale optime documentate (<1 cm de masă tumorală reziduală) şi au putut fi evaluaţi cu succes pentru TIL şi exprimarea proteinelor. Determinarea imunoscorului şi analiza datelor clinice au fost efectuate de investigatori independenţi.
Analiză statistică/Vizualizare
Dacă nu se menţionează altfel, toate figurile şi analizele statistice au fost generate folosindu-se Graphpad Prism 6.0 (software Graphpad, La Jolla, CA, SUA) sau Microsoft Office 2010 (Microsoft). Norii de cuvinte au fost creaţi folosindu-se un applet online (www.wordle.net). Analiza Kaplan-Meier a fost efectuată folosindu-se software-ul statistic SPSS (versiunea 21, IBM Corp., Armonk, NY, SUA). Dacă nu se specifică altfel, a fost efectuat testul t Student bilateral neîmperecheat. Valorile p mai mici de 0,05 au fost considerate semnificative din punct de vedere statistic. Au fost utilizate testul omnibus Agostino-Pearson pentru verificarea normalităţii şi testul F pentru verificarea varianţei egale. Pentru Figura 1 a fost utilizat testul t Student bilateral neîmperecheat cu corecţia lui Welch din cauza unei variaţii inegale între cele două grupuri de comparaţie. A fost utilizat testul non-parametric Mann-Whitney în Figura 4 deoarece distribuţia normală nu a putut fi evaluată în toate cazurile din cauza dimensiunilor mici ale probelor. A fost utilizată corelaţia Spearman pentru corelarea scorurilor IHC ale MSLN şi MUC16, deoarece seturile de date nu arătau o distribuţie normală. Valorile p care compară două curbe de supravieţuire Kaplan-Meier în Figura 5 au fost calculate folosindu-se testul log-rank (Mantel-Cox) în Graphpad Prism.
Exemplul 1: Numărul de HLA pe suprafaţa celulelor şi tiparea HLA
condiţie prealabilă majoră pentru dezvoltarea imunoterapiilor mediate de celule T este exprimarea moleculelor de MHC de pe suprafaţa celulelor tumorale. Prin urmare, inventatorii au analizat şi cuantificat numărul de molecule HLA-A, B, C, precum şi HLA-DR, prin citometrie în flux pe diferite subseturi de celule de tumori ovariene (n=11), precum şi pe ţesuturi benigne din ovar şi trompa uterină ( n=8) obţinute prin disociere enzimatică. Analiza a vizat cuantificarea separată a exprimării HLA specifice tipului de celule pentru leucocite (CD45+), celule tumorale/epiteliale (Epcam+) şi celule endoteliale (CD31+; ultimele dintre acestea doar într-un subset de 7 tumori ovariene). Pentru strategia completă de gating, vezi Figura 6. Numărul median de molecule HLA per celulă a fost eterogen atât între diferite tipuri de celule, cât şi între pacienţi individuali, variind de la ~5.000 până la 150.000 de molecule HLA de clasă I şi de la ~500 până la 330.000 de molecule HLA-DR. Numărul de molecule HLA-A, B şi C a fost semnificativ mai mare (p=0,0205) pe leucocitele izolate din tumoare faţă de ţesutul benign, ceea ce indică o reacţie inflamatorie continuă în interiorul tumorii. Au fost, de asemenea, observate diferenţe puternice în exprimarea HLA de clasă I la compararea celulelor tumorale cu celule epiteliale derivate din ţesuturi benigne. Exprimarea moleculelor HLA de clasă I a fost semnificativ mai mare (p=0,0021) la celulele tumorale (~75.000 molecule/celulă), însă a rămas în intervalul altor celule stromale, cum ar fi celulele endoteliale (~95.000 molecule/celulă). În mod surprinzător, inventatorii au evidenţiat o exprimare de la puternică (~105.000 de molecule/celulă) la, într-o oarecare măsură, extraordinar de ridicată a celulelor HLA-DR pe celulele de EOC (>300.000 molecule/celulă), în timp ce celulele epiteliale benigne au fost, practic, negative pentru HLA-DR (p=0,0108). În total, inventatorii au putut observa o exprimare crescută a moleculelor MHC de clasă I şi de clasă II în tumori.
Analiza ligandomului HLA şi profilarea comparativă dezvăluie prezentarea antigenului specific EOC. Pentru a cartografia repertoriul liganzilor HLA ai EOC, inventatorii au izolat molecule de HLA din ţesut tumoral în vrac şi au efectuat spectrometrie de masă pentru a caracteriza ligandomul HLA pentru un total de 34 de EOC-uri (pentru caracteristicile pacienţilor şi tiparea HLA, consultaţi Tabelul 7).
Tabelul 7
ID OvCa Vârstă Tip de tumoare Stadializare TNM Tipare HLA MHC de clasă I Tipare HLA MHC de clasă II OvCa 9 65 carcinom ovarian seros T3cNxM1G2R1 A*02:01, A*03:01, B*07:02, B*40:02, C*07:02, C*12:01 DQB1*03:01, DQA1*03:01, DQA1*05:01, DRB1*11:01, DRB1*04:01, DRB3*02:02, DRB4*01:01, DPB1'02:01, DPB1*13:01 OvCa 10 60 carcinom ovarian seros T3bN1M1G2R1 A*02:01, A*11:01, B*44:05, B*51:01, C*02:02, C*15:02 DQB1*02:02, DQB1*05:01, DQA1*01:01, DQA1*03:01, DRB1*01:01, DRB1*09:01, DRB4*01:01, DPB1*04:01, DPB1*05:01 OvCa 12 62 carcinom ovarian seros T3cN0G2R0 A*24:02, A*31:01, B*35:03, B*49:01, C*07:01, C*12:03 DQB1*03:01, DQB1*05:04, DQA1*01:02, DQA1*03:01, DRB1*01:01, DRB1*04:01, DRB4*01:01, DPB1*02:01, DPB1*05:01 OvCa 13 62 carcinom ovarian seros T1cN1G3R0 A*02, B*35, B*40, C*03, C*04 DQB1*04, DQB1*06, DRB1*08, DRB1*13 OvCa 15 75 carcinom ovarian seros T3cN0G3R0 A*11:01, A*24:02, B*07:02, B*55:01, C*03:03, C*07:02 DQB1*03:01, DQA1*05:01, DRB1*11:01, DRB1*03:17, DRB3*02:02, DPB1*03:01 OvCa 16 45 carcinom ovarian seros T3bN1G3R0 A*02, B*40, B*44, C*03, C*05 DQB1*06, DRB1*08, DRB1*13, DRB1*14, DRB3 OvCa 23 29 carcinom ovarian seros T3aN1G3R0 A*01, A*03, B*08, B*35, C*04, C*07 DQB1*02, DQB1*03, DRB1*03, DRB1*12, DRB3 OvCa 28 66 carcinom ovarian seros T2bN0G3R0 A*01:01, A*02:01, B*27:05, B*52:01, C*01:02, C*02:02 DQB1*05:01, DQB1*06:01, DQA1*01:01, DQA1*03:01 DRB1*01:03, DRB1*15:02, DRB5*01:02, DPB1*04:01 OvCa 39 45 carcinom ovarian seros T3cN1G3R1 A*25:01, A*31:01, B*07:02, B*18:01, C*12:03, C*07:02 DQB1*06:02, DQA1*01:02, DRB1*15:01, DRB1*16:09, DRB5*01:01, DRB5*01:11, DPB1*04:01, DPB1*04:02 OvCa 41 66 carcinom ovarian seros şi endometrial T3cN0G3R1 A*02, A*24, B*18, B*51, C*02, C*12 DQB1*03, DQ7, DRB1*11, DRB3 OvCa 43 61 carcinom ovarian seros T3cN1G3R2 A*02, A*32, B*18, B*35, C*04, C*07 DQB1*03, DQB1*05, DQ9, DRB1*01, DRB1*07, DRB4 OvCa 45 63 carcinom ovarian diferenţiat (în principal endometrioid) T1cN0G3R0 A*01, A*23, B*08, B*44, C*04, C*07 DQB1*02, DRB1*03, DRB1*07, DRB3, DRB4 OvCa 48 71 carcinom ovarian seros T3cN1G3R0 A*02:01, A*25:01, B*15:01, B*41:02, C*03:04, C*17:01 DQB1*03:02, DQB1*03:04, DQA1*03:01, DRB1*04:01, DRB1*13:03, DRB3*01:01, DRB4*01:01, DPB1*02:01 OvCa 53 48 carcinom ovarian seros T3bN1G3R0 A*02, A*03, B*27, B*35, C*02, C*04 DQB1*02, DQB1*03, DQ7, DRB1*03, DRB1*11, DRB3 OvCa 54 66 carcinom ovarian seros T3cN1M1G3R2 A*02:01, A*11:01, B*35:01, B*35:03, C*04:01, C*12:03 DQB1*05:01, DQB1*05:03, DQA1*01:01, DRB1*01:03, DRB1*14:01, DRB3*02:02, DPB1*04:01, DPB1*02:01 OvCa 57 58 carcinom ovarian endometrioid T1cN0G1R0 A*25, A*32, B*15, B*18, C*03, C*12 DQB1*05, DQB1*06, DRB1*01, DRB1*15, DRB5 OvCa 58 74 carcinom ovarian seros T3cN1G3R1 A*02, A*03, B*35, C*03, C*04 DQB1*05, DRB1*01 OvCa 59 47 carcinom ovarian seros T3cN1G3R2 A*03, A*30, B*13, C*06 DQB1*02, DRB1*07, DRB4 OvCa 60 50 carcinom ovarian seros T3cN1G3R1 A*24:02, A*25:01, B*13:02, B*18:01, C*12:03, C*06:02 DRB1*08:01, DRB1*13:01, DQB1*04:02, DQB1*06:03, DQA1*04:01, DQA1*01:03, DPB1*02:01, DPB1*03:01 OvCa 64 56 carcinom ovarian seros T3cN1G3R1 A*01, A*25, B*08, C*07 DQB1*02, DRB1*03, DRB3 OvCa 65 55 carcinom ovarian seros T3cN1M1G3R1 A*01, A*24, B*15, B*35, C*04, C*14 DQB1*03, DQB1*05, DRB1*10, DRB1*11, DRB3 OvCa 66 73 carcinom ovarian seros T2bN0G3R0 A*11:01, A*29:02, B*18:01, B*44:03, C*05:01, C*16:01 DRB1*03, DRB*0701, DRB3*0202, DRB4*0101, DQB1*02:01, DQB1*02:02, DQA1*02:01, DQA1*05:01, DPB1*02:02, DPB1*03:01 OvCa 68 69 carcinom ovarian seros T3cN1G3R1 A*02:01, A*01:01, B*44:02, B*37:01, C*06:02, C*05:01 DRB1*10:01, DRB1*04:01, DRB4*04:01, DQB1*05:01, DQB1*03:01, DQA1*01:01, DPB1*04:01 OvCa 69 68 carcinom ovarian seros T3cN0G1R1 n/a n/a OvCa 70 48 carcinom ovarian seros T3cN1M1G1R1 A*01, A*02, B*07, C*07 DQB1*03, DQB1*05, DRB1*09, DRB1*14, DRB3, DRB4 OvCa 72 53 carcinom ovarian seros T3bN1G3R0 A*03:01, A*01:01, B*08:01, B*07:02, C*07:02, C*07:01 DRB1*01:01, DRB1*03:01, DRB3*01:01, DQB1*05:01, DQB1*02:01, DQA1*01:01, DPB1*04:01 OvCa 73 69 carcinom ovarian seros T3cN1G3R0 A*01:01, B*08:01, C*07:01 DRB1*03:01, DRB1*03:42, DRB3*01:01, DRB3*01:14, DQB1*02:01, DQA1*05:01, DPB1*04:01 OvCa 74 79 carcinom ovarian endometrioid T3bNxG1R1 A*02:01, B*18:01, B*51:01, C*07:02, C*15:02 DRB1*11:04, DRB1*07:01, DRB3*02:02, DRB4*01:01, DQB1*03:01, DQB1*02:02, DQA1*02:01, DQA1*05:01, DPB1*04:02, DPB1*02:01 OvCa 79 57 carcinom ovarian endometrioid T2bN0G2R0 A*01:01, A*31:01, B*08:01, B*51:01, C*07:01, C*15:02 DQB1*03:03, DQA1*02:01, DRB1*07:01, DRB1*09:01, DRB4*01:01, DPB1*13:01, DPB1*02:01 OvCa 80 93 carcinom ovarian seros T3cNxG3R2 A*25:01, A*32:01, B*18:01, B*39:01, C*12:03 DRB1*01:01, DRB1*12:01, DRB3*02:02, DQB1*03:01, DQB1*05:01, DQA1*01:01, DQA1*05:01, DPB1*04:01 OvCa 81 78 carcinom ovarian seros T3cNxG3R2 A*02:01, B*45:01, B*56:01, C*07:02, C*01:02 DRB1*04:02, DRBB1*11:01, DRB4*01:01, DRB3*02:02, DQB1*03:01, DQB1*03:02 OvCa 82 48 carcinom ovarian seros T3cN1G3R0 A*01:01, A*03:01, B*08:01, B*38:01, C*07:01, C*12:03 DRB1*04:02, DRB1*03:01, DRB4*01:01, DRB3*01:01, DQB1*02:01, DQB1*03:02, DQA1*03:01, DQA1*05:01, DPB1*04:01, DPB1*13:01 OvCa 83 50 carcinom ovarian seros T1cN0G2R0 A*02, A*11, B*51, B*55, C*03, C*15 DQB1*03, DQB1*05, DRB1*09, DRB1*14, DRB3, DRB4 OvCa 84 70 carcinom ovarian seros T3cN1G3R1 A*02:01, B*07:02, B*44:02, C*07:02, C*05:01 DRB1*15:01, DRB5*01:01, DQB1*06:02, DQA1*01:02, DPB1*04:01, DPB1*04:02
Pentru MHC de clasă I, inventatorii au putut identifica 22.920 de peptide unice (în medie 1.263/probă) provenind din 9.136 de proteine-sursă diferite (în medie 1.239/probă), atingând >90% din acoperirea maximă realizabilă estimată (vezi Figura 7a).
Exemplul 2: Identificarea principalilor liganzi HLA asociaţi cancerului
Având obiectivul de a extrage cei mai specifici liganzi HLA pentru EOC din acest vast catalog de date, inventatorii au comparat proteinele-sursă de ligand HLA cu o bază de date internă de surse benigne („Baza de date cu ligandomi benigni HLA») constând din probe din PBMC-uri (n=30 ), măduvă osoasă (n=10), ficat (n=15), colon (n=12), ovar (n=4) şi rinichi (n=16). Baza de date cu ligandomi benigni HLA conţine 31.032 de peptide reprezentând 10.012 proteine-​​sursă şi a fost stabilită folosindu-se sânge sau măduvă osoasă de la donatori sănătoşi, precum şi ţesuturi normale evaluate histopatologic, toate analizate cu acelaşi pipeline ca şi pentru EOC-uri. Pentru profilare comparativă „potriviri singulare» (adică peptide prezentate numai pe o singură sursă, cu valori PSM reduse) au fost eliminate din ambele seturi de date pentru a se ţine cont de potrivirile false. Analiza comparativă a celor două seturi de date respective (vezi Figura 2A) a evidenţiat 379 de proteine-​​sursă MHC de clasă I prezentate exclusiv de EOC la cel puţin trei dintre pacienţii testaţi, evidenţiindu-se un repertoriu peptidic HLA specific. Proteinele-sursă specifice TOP100 EOC clasificate în funcţie de frecvenţa lor de prezentare sunt vizualizate în Figura 2B. Cea mai importantă proteină-sursă de ligand HLA specific EOC obţinută prin această analiză a fost mucina 16 (MUC16), cunoscută şi sub denumirea de antigen al cancerului 125 (CA-125). Global, la peste 80% dintre pacienţi (26/34) au fost prezentaţi mai mult de 80 de liganzi HLA diferiţi derivaţi din MUC16 (vezi Tabelul 8).
Tabelul 8
Secvenţă Nr. ID Surse HLA AHSKITTAM 3 OvCa 80 B*39:01 AVKTETSTSER 4 OvCa 12, OvCa 79 A*31:01 AVTNVRTSI 5 Ovca 59, OvCa 60 B*13 DALTPLVTI 6 OvCa 74 B*51:01 DALVLKTV 7 OvCa 41, OvCa 74, OvCa 79, OvCa 83 B*51 DPYKATSAV 8 OvCa 10, OvCa 41, OvCa 69 OvCa 74, OvCa 79, OvCa 83 B*51 EPETTTSFITY 9 OvCa 65 B*35 ERSPVIQTL 10 OvCa 80 B*39:01 ETILTFHAF 11 OvCa 48, OvCa 64, OvCa 80 A*25 EVISSRGTSM 12 OvCa 48, OvCa 60, OvCa 64, OvCa 80 A*25 EVITSSRTTI 13 OvCa 60, Ovca 64 A*25 EVTSSGRTSI 14 OvCa 60, Ovca 64, OvCa 80 A*25 FPEKTTHSF 15 OvCa 65 B*35 FPHSEETTTM 16 OvCa 13, OvCa 65 B*35 FPHSEITTL 17 OvCa 12, OvCa 13, OvCa 53 B*35 FQRQGQTAL 18 OvCa 48 B*15:01 GDVPRPSSL 19 OvCa 72 B*08:01 GHESHSPAL 20 OvCa 80 B*39:01 GHTTVSTSM 21 OvCa 80 B*39:01 GTHSPVTQR 22 OvCa 39, OvCa 79 A*31:01 GTSGTPVSK 23 OvCa 83 A*11 HPDPQSPGL 24 OvCa 65 B*35 IITEVITRL 547 OvCa 83 A*02 IPRVFTSSI 25 OvCa 41, OvCa 74 B*51 ISDEVVTRL 26 OvCa 16 C*05 ISIGTIPRI 27 OvCa 65 B*15:17 ISKEDVTSI 28 OvCa 65 B*15:17 ITETSAVLY 29 OvCa 65 A*01 ITRLPTSSI 30 OvCa 65 B*15:17 KDTAHTEAM 31 OvCa 68 B*44:02 KEDSTALVM 32 OvCa 16 B*40/B*44 KEVTSSSSVL 33 OvCa 16, OvCa 70 B*40/B*44/? KMISAIPTL 548 OvCa 81, OvCa 83 A*02 LPHSEITTL 34 OvCa 12, OvCa 13 B*35 LTISTHKTI 35 OvCa 65 B*15:17 LTKSEERTI 36 OvCa 65 B*15:17 QFITSTNTF 1 OvCa 60 A*24:02 RDSLYVNGF 37 OvCa 68 B*44:02 RETSTSQKI 38 OvCa 60 B*18:01 RSSGVTFSR 39 OvCa 79 A*31:01 SAFESHSTV 40 OvCa 41, OvCa 74, OvCa 79, OvCa 83 B*51 SATERSASL 41 OvCa 13, OvCa 16, OvCa 70 C*03/? SENSETTAL 42 OvCa 16, OvCa 70 B*40/B*44/? SEQRTSPSL 43 OvCa 70 n.a. SESPSTIKL 44 OvCa 13, OvCa 70 B*40/? SPAGEAHSL 45 OvCa 72, OvCa 81, OvCa 84 B*07/B*56 SPAGEAHSLLA 46 OvCa 81 B*56:01 SPHPVSTTF 47 OvCa 84 B*07:02 SPHPVTALL 48 OvCa 9, OvCa 72, OvCa 84 B*07:02 SPLFQRSSL 49 Ovca 72 B*0702 SPQNLRNTL 50 OvCa 23, OvCa 72, OvCa 84 B*35/B*07:02 SPRLNTQGNTAL 51 OvCa 72, Ovca 84 B*07:02 SPSEAITRL 52 Ovca 84 B*07:02 SPSKAFASL 53 OvCa 9, OvCa 23, OvCa 39, OvCa 69, OvCa 72, OvCa 84 B*35/B*07:02 SPSSPTPKV 54 OvCa 72 B*07:02 SPSSQAPVL 55 OvCa 84 B*07:02 SQGFSHSQM 56 OvCa 48 B*15:01 SRTEVISSR 57 OvCa 53 B*27 SSAVSTTTI 58 OvCa 65 B*15:17 SSPLRVTSL 59 OvCa 69 n.a. STASSSLSK 60 OvCa 83 A*11 STETSTVLY 2 OvCa 64, OvCa 65, OvCa 68 A*01 STQRVTTSM 61 OvCa 72 n.a. STSQEIHSATK 62 OvCa 83 A*11 SVLADLVTTK 63 OvCa 72 A*03:01 SVPDILSTSW 64 OvCa 60 A*24:02 TAGPTTHQF 65 OvCa 58 C*03 TEISSSRTSI 66 OvCa 12 B*49:01 TENTGKEKL 67 OvCa 16 B*40/B*44 TETEAIHVF 68 OvCa 41, OvCa 80 B*18 TEVSRTEVI 69 OvCa 12 B*49:01 TExVLQGLL 70 OvCa 16, OvCa 66, OvCa 70 B*40/B*44/? TPGGTRQSL 71 OvCa 9, OvCa 23, OvCa 39, OvCa 72, OvCa 84 B*07:02/B*35 TPGNRAISL 72 OvCa 23, OvCa 72, OvCa 84 B*07:02/B*35 TPNSRGETSL 73 OvCa 72 B*07:02 TSGPVTEKY 74 OvCa 58 B*35 TSPAGEAHSL 75 OvCa 81 n.a. TTLPESRPS 324 OvCa 70 n.a. TYSEKTTLF 549 OvCa 12, OvCa 41, OvCa 60, OvCa 65 A*24 VHESHSSVL 76 OvCa 80 B*39:01 VPRSAATTL 77 OvCa 23, OvCa 72, OvCa 84 B*07:02/B*35 VTSAPGRSI 78 OvCa 65 B*15:17 VTSSSRTSI 79 OvCa 65 B*15:17 YPDPSKASSAM 80 OvCa 65 B*35
Aceste date evidenţiază procesarea şi prezentarea frecvente ale MUC16 de o multitudine de diferite alotipuri de HLA, neegalate de niciun alt antigen specific EOC şi oglindite doar de proteine ​​menajere prezentate frecvent (>95%), cum ar fi beta-actina (în total, 149 de peptide diferite identificate). Printre proteinele-sursă specifice TOP100 EOC au fost identificaţi alţi antigeni asociaţi tumorilor bine stabilite, cum ar fi MUC1 sau KLK10, precum şi antigeni cu funcţii imun-evazive bine documentate, cum ar fi indoleamina-2,3-dioxigenaza (IDO1) sau galectina-1 (LGALS1).
Datorită puterii celulelor T CD4 în susţinerea sau generarea unui răspuns imun antitumoral, inventatorii au utilizat aceeaşi abordare pentru a analiza în continuare peptide prezentate de MHC de clasă II în EOC (n=22), producând 9.162 de peptide (în medie 598/probă), reprezentând 2.330 de proteine-sursă (în medie 319/probă), atingând >80% din acoperirea realizabilă (vezi Figura 7B). Setul de date de liganzi benigni HLA pentru MHC de clasă II a conţinut 7.267 de peptide, reprezentând 1.719 proteine-​​sursă derivate din măduvă osoasă (n=5), PBMC-uri (n=13), colon (n=2), ficat (n=7) şi rinichi (n=17). Analiza antigenilor prezentaţi de TOP100 MHC de clasă II a evidenţiat o imagine mai eterogenă şi complexă (Figura 2C). Este de notat că peptidele prezentate de MHC ale mezotelinei (MSLN), un ligand stabilit de MUC16, au putut fi identificate la aproape 50% dintre pacienţi (10/22; Figura 2D). MUC16 în sine nu se număra printre antigenii de clasă II TOP100, însă, cu toate acestea, liganzii respectivi au putut fi detectaţi la patru pacienţi.
Pe lângă proteinele-sursă de ligand HLA specifice TOP100 EOC, inventatorii au căutat în continuare antigeni stabiliţi asociaţi cancerului testicular şi tumorilor care au fost folosiţi anterior pentru aplicaţii clinice pentru a verifica abundenţa lor (Her2neu, WT1, NY-ESO-1, hTert şi p53). Deşi inventatorii au putut identifica peptide prezentate de HLA pentru toţi antigenii, cu excepţia NY-ESO-1, niciuna dintre acestea nu a fost prezentat exclusiv pe EOC (Tabelul 9). Singurii liganzi arătând prezentare specifică EOC, deşi cu frecvenţă scăzută (3/34), au fost liganzii HLA de clasă I (dar nu şi HLA de clasă II) de la Her2neu.
Tabelul 9
SEQ ID Her2neu Restricţie HLA Surse de prezentare ERBB2 (receptor de tirozin-protein kinaze erbB-2) 554 TYLPTNASLSF A*23/A*24 2x OvCa 153 MPNPEGRYTF B*35 1x OvCa 152 AARPAGATL B*07 1x OvCa 291 AIKVLRENTSPKANKE HLA de clasă II 1x OvCa 292 DPSPLQRYSEDPTVPLPS HLA de clasă II 2x OvCa 293 DPSPLQRYSEDPTVPLPSE HLA de clasă II 1x OvCa 294 ELVSEFSRMARD HLA de clasă II 2 x PBMC 295 ELVSEFSRMARDPQ HLA de clasă II 2 x PBMC, 1 x rinichi 296 IPVAIKVLRENTSPKANKE HLA de clasă II 1 x OvCa 297 RRLLQETELVEPLTPS HLA de clasă II 2 x ficat 298 SPQPEYVNQPDVRPQPP HLA de clasă II 1 x OvCa 291 VKPDLSYMPIWKFPDE HLA de clasă II 1 x OvCa WT-1 Proteină tumoare Wilms 558 RMFPNAPYL A*02 8 x PBMC, 1 x Ficat 557 QRNMTKLQL B*13 2 x OvCa, 1x ficat, 1x PBMC-uri 555 GVFRGIQDV B*13 2 x OvCa 550 ALLPAVPSL A*02 1 x OvCa hTert Transcriptază inversă a telomerazei 556 LMSVYVVEL A*02 2 x PBMC p53 Antigen tumoral celular p53 552 RPILTIITL B*07 4 x PBMC, 2 x ficat, 2 x rinichi, 3 x OvCa 553 TYSPALNKMF A*24 1 x PBMC, 1 x ficat, 2 x OvCa 551 GRNSFEVRV B*27 1 x PBMC, 1 x ficat, 1 x rinichi, 1 x OvCa
Exemplul 3: Originea celulară a peptidelor prezentate de HLA asociate EAC-ului
Deoarece EOC-urile încorporează nu numai celulele canceroase, ci reprezintă, mai degrabă, un amestec eterogen de tipuri de celule diferite, inventatorii s-au întrebat dacă antigenii TOP100 MHC de clasă I au fost într-adevăr prezentaţi iniţial de celule canceroase. În acest scop, inventatorii au digerat EOC-uri şi au separat leucocite CD45+, celule tumorale EpCam+, precum şi celule stromale negative pentru cei doi markeri (pentru eficacitatea îmbogăţirii, vezi Tabelul 10) şi, ulterior, au efectuat ligandomică HLA individuală pentru fiecare dintre subseturi.
Tabelul 10: Eficacităţi ale îmbogăţirii celulelor:
Procentajul de celule este dat în fiecare fracţiune înainte (PreSort) şi după MACSorting
PreSort Fracţie CD45+ Fracţie EpCam+ Fracţie EpCam- OvCa CD45+ EpCam+ Viabilitate CD45+ EpCam+ Viabilitate CD45+ EpCam+ Viabilitate CD45+ EpCam+ Viabilitate 84 74,7 18,3 80,2 93,5 6,2 71,6 10,7 85,7 88,2 4,5 22,1 64,0 73 23,1 12,3 81,2 95,7 1,7 77,2 3,4 73,3 87,6 1,7 3,2 87,4 70 76,2 8,83 78,9 96 1,3 82,7 3,4 94 66,4 3,1 4,5 65,4 60 77,4 5,2 92,3 94,8 1,7 90,2 5,2 79,7 88,7 3,8 10,7 89,5 57 31,9 50,5 94,1 93,6 5,0 90,6 1,4 95,3 96,7 0,8 7,2 95,3
Inventatorii au utilizat cuantificarea fără etichete pentru a determina sursa fiecărui ligand HLA identificat într-un total de 5 EOC-uri (pentru un exemplu reprezentativ, vezi Figura 3). Aşa cum era de aşteptat, liganzii HLA derivaţi din MUC16, identificaţi pe (4/5) probe de EOC, au fost găsiţi întotdeauna ca fiind suprareprezentaţi pe celule canceroase îmbogăţite, cu o suprareprezentare mediană de 5 ori (interval de 1,8-135 ori) dependentă de eficacitatea îmbogăţirii.
Acelaşi lucru s-a dovedit a fi valabil şi pentru alţi câţiva antigeni TOP100 prezentaţi frecvent, precum DDR1, SOX9, CRABP1 / 2, EYA2, LAMC2, MUC1 sau KLK10. Cu toate acestea, o serie de alţi antigeni, în special cei cunoscuţi ca fiind reglaţi în sens crescător de interferon, cum ar fi receptorii Toll-like (TLR3, TLR7) sau sintaza proteică 2'-5'-oligoadenilat-like (OASL), nu au putut fi arătate în mod neechivoc ca fiind prezentate de celulele tumorale, ci, mai degrabă, au prezentat o suprareprezentare puternică pe leucocitele CD45+ şi/sau celulele stromale. În afară de antigenii asociaţi tumorilor, inventatorii au recunoscut, de asemenea, liganzi de la proteine-sursă cu exprimare specifică tipului de celule. De exemplu, liganzii derivaţi din CD8, CD132 sau proteina specifică limfocitelor 1 (LSP1) au fost găsiţi ca fiind foarte suprareprezentaţi pe celule CD45+, iar factorul van Willebrand (vWF), cel mai probabil exprimat de celulele endoteliale din stromă, a fost găsit ca fiind foarte suprareprezentat în subsetul stromal, subliniind puterea acestei abordări a tipului celular.
Exemplul 4: Analiza imunogenităţii liganzilor derivaţi din MUC16
Pentru aplicabilitatea vaccinurilor peptidice, imunogenitatea este un imperativ major. Pentru a evalua potenţialul imunogen al liganzilor HLA identificaţi, inventatorii au folosit un protocol de amorsare a celulelor T care a implicat celule prezentatoare de antigen artificiale şi celule T izolate din sânge de la donatori sănătoşi. Rezultatele acestei analize pentru antigenul MUC16 asociat EOC numărul unu sunt prezentate în Tabelul 11. Dintre 23 de peptide diferite testate până în prezent, 18 s-au dovedit a fi imunogene la cel puţin 1/3 dintre donatori. Această rată de recunoaştere de aproape 80% confirmă prezenţa MUC16 naiv care recunoaşte celule T în populaţia umană. Rezultate similare au fost obţinute şi pentru alţi antigeni TOP100 (de exemplu, IDO1, LGALS1).
Tabelul 11: Analiza imunogenităţii liganzilor HLA prezentaţi de EOC din MUC16/CA-125
HLA Secvenţă SEQ ID Donatori pozitivi/testaţi A*01 STETSTVLY 2 0 / 2 A*02 IITEVITRL 547 3 / 10 A*02 KMISAIPTL 548 4 / 6 A*03 SVLADLVTTK 63 0 / 1 A*11 STSQEIHSATK 62 2 / 6 A*11 GTSGTPVSK 23 0 / 5 A*24 TYSEKTLLF 549 2 / 2 A*24 AVTNVRTSI 5 1 / 3 A*25 ETILTFHAF 11 2 / 2 A*25 EVITSSRTTI 13 1 / 1 A*25 EVTSSGRTSI 14 2 / 3 A*25 EVISSRGTSM 12 1 / 3 B*07 SPHPVTALL 48 0 / 1 B*07 SPQNLRNTL 50 1 / 1 B*07 LPHSEITTL 34 0 / 2 B*07 SPSKAFASL 53 2 / 2 B*07 VPRSAATTL 77 1 / 2 B*07 TPGNRAISL 72 2 / 2 B*15 SQGFSHSQM 56 4 / 5 B*15 FQRQGQTAL 18 1 / 6 B*27 ERSPVIQTL 10 1 / 2 B*51 DALVLKTV 7 1 / 3 B*51 DPYKATSAV 8 3 / 3 8/10 alotipuri 18/23 liganzi HLA 34 / 73
Exemplul 5: Biomarkeri pentru prezentarea liganzilor HLA
[000309] Imunoterapia cancerului specifică antigenilor (de exemplu, vaccinare peptidică, transfer de celule T adoptive) necesită o selecţie strictă de antigenilor candidaţi într-un interval de timp scurt. Cu toate acestea, analiza ligandomului HLA nu este întotdeauna posibilă din cauza lipsei de material adecvat. O alternativă fezabilă ar fi utilizarea biomarkerilor pentru prezicerea prezenţa liganzilor HLA pe celulele tumorale. Pentru a evalua dacă exprimarea proteinelor analizată prin imunohistochimie (scor de imunoreactivitate, IRS) ar putea servi drept marker-surogat pentru prezentarea liganzilor HLA, inventatorii au analizat antigenii TOP100 MHC de clasă I MUC16 şi IDO1, precum şi antigenul TOP100 MHC de clasă II MSLN prin imunohistochimie şi au corelat intensitatea colorării (Figura 4A) cu prezenţa sau absenţa liganzilor HLA pe aceleaşi tumori. Atât pentru MUC16, cât şi pentru MSLN, scorurile de colorare au fost semnificativ mai mari la tumorile care au prezentat liganzi HLA ai proteinelor-sursă respective (Figura 4C). Acelaşi lucru a fost valabil şi pentru nivelurile serice de CA-125 determinate în ziua intervenţiei chirurgicale (Figura 4D), ceea ce indică faptul că aceşti parametri ar putea fi folosiţi pentru o selectare adecvată a antigenilor candidaţi pentru vaccinare peptidică. În schimb, IDO1 nu a arătat o asociere semnificativă cu prezentarea liganzilor.
Exemplul 6: Relevanţa prognostică a axei MUC16/MSLN
Din cauza importanţei lor ca ţinte pentru imunoterapie, inventatorii au dorit să evalueze dacă MSLN şi MUC16 au, de asemenea, relevanţă prognostică la pacienţii similari cu colectivul nostru de imunopeptidom. În acest scop, inventatorii au analizat exprimarea ambilor antigeni, precum şi gradul de extindere a infiltrării celulelor T prin imunohistochimie într-o micromatrice tisulară (TMA) de cancere ovariene seroase de grad înalt (FIGO stadiul II-III). Pentru a evita factorii de confuzie relevanţi din punct de vedere prognostic, inventatorii au restricţionat analiza la 71 de pacienţi cu cancere restricţionate optim (masă reziduală sub <1 cm).
Deşi inventatorii nu au observat niciun efect prognostic pentru colorarea MUC16, colorarea puternică a MSLN a fost asociată cu o scădere semnificativă a limitei notabile (p=0,0572) a medianei supravieţuirii globale de la 50 la 28 de luni (Figura 5A). În pofida relevanţei lor prognostice diferite, scorurile de colorare pentru MUC16 şi MSLN au arătat o corelaţie directă şi extrem de semnificativă (coeficient de corelaţie Spearman r=0,5237; interval de încredere 95% = 0,3159-0,6835, semnificaţie bilaterală p <0,001).
Pentru evaluarea infiltrării celulelor T, inventatorii au evaluat, separat, numărul de celule T CD3 din compartimentul intraepitelial al tumorii (CD3E) şi din stroma fibrovasculară (CD3S). Este de notat că numai numărul de celule T intraepiteliale au prezentat un impact semnificativ din punct de vedere prognostic (p <0,0063), în timp ce infiltrarea stromei înconjurătoare singure nu a avut nicio relevanţă prognostică (Figura 5B). Doar într-o analiză de subgrupuri care a combinat colorarea MSLN şi CD3 a putut fi observat un beneficiu prognostic semnificativ pentru tumori cu infiltrare scăzută de MSLN şi ridicată cu celule T (Figura 5C) atât pentru CD3E (p <0,001), cât şi pentru CD3S (p <0,0049). Cel mai surprinzător, combinaţia între infiltrarea ridicată cu celule T intratumorale (CD3E) şi colorarea scăzută a MSLN a definit un subset de supravieţuitori de cancer pe termen lung (10/11 pacienţi cu supravieţuire confirmată peste 3 ani).
Referinţe citate
Allison, J. P. et al., Science 270 (1995)
Andersen, R. S. et al., Nat.Protoc. 7 (2012)
Appay, V. et al., Eur.J Immunol. 36 (2006)
Banchereau, J. et al., Cell 106 (2001)
Beatty, G. et al., J Immunol 166 (2001)
Beggs, J. D., Nature 275 (1978)
Benjamini, Y. et al., Journal of the Royal Statistical Society.Series B (Methodological), Vol.57 (1995)
Boulter, J. M. et al., Protein Eng 16 (2003)
Braumuller, H. et al., Nature (2013)
Brossart, P. et al., Blood 90 (1997)
Bruckdorfer, T. et al., Curr.Pharm.Biotechnol. 5 (2004)
Card, K. F. et al., Cancer Immunol.Immunother. 53 (2004)
Chanock, S. J. et al., Hum.Immunol. 65 (2004)
Cohen, C. J. et al., J Mol.Recognit. 16 (2003a)
Cohen, C. J. et al., J Immunol. 170 (2003b)
Cohen, S. N. et al., Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 69 (1972)
Coligan JE et al., (1995)
Colombetti, S. et al., J Immunol. 176 (2006)
Dengjel, J. et al., Clin Cancer Res 12 (2006)
Denkberg, G. et al., J Immunol. 171 (2003)
Falk, K. et al., Nature 351 (1991)
Fong, L. et al., Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 98 (2001)
Gabrilovich, D. I. et al., Nat.Med 2 (1996)
Gattinoni, L. et al., Nat.Rev.Immunol. 6 (2006)
Gnjatic, S. et al., Proc Natl.Acad.Sci.U.S.A 100 (2003)
Godkin, A. et al., Int.Immunol 9 (1997)
Green MR et al., 4th, (2012)
Greenfield EA, 2nd, (2014)
Hwang, M. L. et al., J Immunol. 179 (2007)
Jung, G. et al., Proc Natl Acad Sci U S A 84 (1987)
Kibbe AH, rd, (2000)
Krieg, A. M., Nat.Rev.Drug Discov. 5 (2006)
Liddy, N. et al., Nat.Med. 18 (2012)
Ljunggren, H. G. et al., J Exp.Med 162 (1985)
Longenecker, B. M. et al., Ann N.Y.Acad.Sci. 690 (1993)
Lukas, T. J. et al., Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 78 (1981)
Lundblad RL, 3rd, (2004)
Meziere, C. et al., J Immunol 159 (1997)
Morgan, R. A. et al., Science 314 (2006)
Mori, M. et al., Transplantation 64 (1997)
Mortara, L. et al., Clin Cancer Res. 12 (2006)
Mueller, L. N. et al., J Proteome.Res. 7 (2008)
Mueller, L. N. et al., Proteomics. 7 (2007)
Mumberg, D. et al., Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 96 (1999)
Pinheiro J et al., (2015)
Plebanski, M. et al., Eur.J Immunol 25 (1995)
Porta, C. et al., Virology 202 (1994)
Rammensee, H. G. et al., Immunogenetics 50 (1999)
Rini, B. I. et al., Cancer 107 (2006)
Rock, K. L. et al., Science 249 (1990)
Rodenko, B. et al., Nat.Protoc. 1 (2006)
Saiki, R. K. et al., Science 239 (1988)
Seeger, F. H. et al., Immunogenetics 49 (1999)
Sherman F et al., (1986)
Singh-Jasuja, H. et al., Cancer Immunol.Immunother. 53 (2004)
Small, E. J. et al., J Clin Oncol. 24 (2006)
Sturm, M. et al., BMC.Bioinformatics. 9 (2008)
Teufel, R. et al., Cell Mol.Life Sci. 62 (2005)
Tran, E. et al., Science 344 (2014)
Walter, S. et al., J.Immunol. 171 (2003)
Walter, S. et al., Nat Med. 18 (2012)
Willcox, B. E. et al., Protein Sci. 8 (1999)
Zaremba, S. et al., Cancer Res. 57 (1997)
Siegel, R., Ma, J., Zou, Z. & Jemal, CA Cancer J. Clin. 64, 9-29 (2014).
Coleman, R.L.et al Nat. Rev. Clin. Oncol. 10, 211-224 (2013).
Herzog, T.J. & Pothuri, B.. Nat. Clin. Pract. Oncol. 3, 604-611 (2006).
Kandalaft, L.E., Powell, D.J., Jr., Singh, N. & Coukos, G. J. Clin. Oncol. 29, 925-933 (2011).
Zhang, L., et al. N. Engl. J. Med. 348, 203-213 (2003).
Schlienger, K., et al. Clin. Cancer Res. 9, 1517-1527 (2003).
Matsuzaki, J., et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 7875-7880 (2010).
Fisk, B., Blevins, T.L., Wharton, J.T. & Ioannides, C.G. J. Exp. Med. 181, 2109-2117 (1995).
Curiel, T.J., et al. Nat. Med. 10, 942-949 (2004).
Vlad, A.M., et al. Cancer Immunol. Immunother. 59, 293-301 (2010).
Hodi, F.S., et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105, 3005-3010 (2008).
Robert, C., et al. Lancet 384, 1109-1117 (2014).
Wolchok, J.D., et al. N. Engl. J. Med. 369, 122-133 (2013).
Rosenberg, S.A., et al.. Clin. Cancer Res. 17, 4550-4557 (2011).
Walter, S., et al. Nat. Med. 18, 1254-1261 (2012).
Rosenberg, S.A. Sci. Transl. Med. 4, 127ps128 (2012).
Tran, E., et al.. Science 344, 641-645 (2014).
Mantia-Smaldone, G.M., Corr, B. & Chu, C.S. Hum. Vaccin. Immunother. 8, 1179-1191 (2012).
Haridas, D., et al. FASEB J. 28, 4183-4199 (2014).
Deng, J., et al. Cancer Metastasis Rev. 32, 535-551 (2013).
Luo, L.Y., et al. Cancer Res. 63, 807-811 (2003).
Uyttenhove, C., et al. Nat. Med. 9, 1269-1274 (2003).
Sorensen, R.B., et al.. PLoS One 4, e6910 (2009).
van den Brule, F., et al. Lab. Invest. 83, 377-386 (2003).
Rubinstein, N., et al. Cancer Cell 5, 241-251 (2004).
Perez-Diez, A., et al. Blood 109, 5346-5354 (2007).
Braumuller, H., et al. Nature 494, 361-365 (2013).
Hassan, R. & Ho, M. Eur. J. Cancer 44, 46-53 (2008).
Schoggins, J.W., et al. Nature 472, 481-485 (2011).
Walter, S., et al. J. Immunol. 171, 4974-4978 (2003).
Couzin-Frankel, J. Cancer immunotherapy. Science 342, 1432-1433 (2013).
Mellman, I., Coukos, G. & Dranoff, G. Nature 480, 480-489 (2011).
Perez, S.A., et al. Cancer 116, 2071-2080 (2010).
Matsushita, H., et al. Nature 482, 400-404 (2012).
Robbins, P.F., et al. Nat. Med. 19, 747-752 (2013).
Gubin, M.M., et al. Nature 515, 577-581 (2014).
Andersen, R.S., et al. Cancer Res. 72, 1642-1650 (2012).
Lu, Y.C., et al. Clin. Cancer Res. 20, 3401-3410 (2014).
Rolland, P., Deen, S., Scott, I., Durrant, L. & Spendlove, I. Clin. Cancer Res. 13, 3591-3596 (2007).
Cheng, W.F., et al. Br. J. Cancer 100, 1144-1153 (2009).
Berlin, C., et al. Leukemia (2014).
Blaustein, A. & Kurman, R.J. Blaustein's pathology of the female genital tract, (Springer, New York, NY, 2011).
Pham, D.L., et al. Int. J. Gynecol. Pathol. 32, 358-367 (2013).

Claims (14)

1. O peptidă constând din secvenţa de aminoacizi conformă cu SEQ ID NO 82.
2. Peptida în conformitate cu Revendicarea 1, în care respectiva peptidă include şi legături non-peptidice.
3. Peptida în conformitate cu Revendicarea 1 sau 2, în condiţiile în care peptida face parte dintr-o proteină de fuziune, în particular care conţine aminoacizi N-terminali ai lanţului invariabil asociat antigenului HLA-DR (Ii).
4. Un receptor de celule T, preferabil un receptor de celule T recombinant, solubil sau legat de membrană care este reactiv cu un ligand HLA, unde respectivul ligand constă din secvenţa de aminoacizi din SEQ ID NO 82.
5. Un anticorp, în particular un anticorp solubil sau legat de membrană, care recunoaşte în mod specific peptida în conformitate cu Revendicarea 1, preferabil peptida în conformitate cu oricare dintre Revendicarea 1 atunci când este legată de o moleculă MHC.
6. Un acid nucleic care codifică o peptidă în conformitate cu oricare dintre Revendicările 1 sau 3 or pentru un TCR în conformitate cu Revendicarea 4 sau un anticorp în conformitate cu Revendicarea 5, opţional legat la o secvenţă de promotori heterologi sau un vector de exprimare care exprimă respectivul acid nucleic.
7. O celulă-gazdă recombinantă care cuprinde peptida în conformitate cu Revendicarea 1 sau 3 ori acidul nucleic ori vectorul de exprimare conform Revendicării 6, în care respectiva celulă-gazdă este preferabil o celulă prezentatoare de antigen, cum ar fi o celulă dendritică, sau respectiva celulă-gazdă este, de preferinţă, o celulă T ori o celulă NK.
8. O metodă pentru producerea peptidei în conformitate cu cu oricare dintre Revendicările 1 sau 3 ori pentru producerea receptorului de celule T în conformitate cu Revendicarea 4 sau un anticorp în conformitate cu Revendicarea 5, metoda care cuprinde cultivarea unei celule-gazdă în conformitate cu Revendicarea 7, care prezintă peptida în conformitate cu Revendicarea 1 sau exprimă acidul nuceli ori vectorul de exprimare în conformitate cu Revendicarea 6 şi izolarea peptidei sau a TCR-ului ori a anticorpului din celula-gazdă sau mediul său de cultură.
9. O metodă in vitro pentru producerea de limfocite T activate, metoda cuprinzând contactarea in vitro a celulelor T cu molecule de MHC de clasă I umane încărcate cu antigen exprimate pe suprafaţa unei celule prezentatoare de antigen adecvate sau o construcţie artificială care imită o celulă prezentatoare de antigen pentru o perioadă de timp suficientă pentru a activa numitele celule T într-o manieră specifică antigenului, în care respectivul antigen este o peptidă în conformitate cu Revendicarea 1.
10. O limfocită T activată produsă prin metoda în conformitate cu Revendicarea 9 care recunoaşte selectiv o celulă care exprimă aberant o polipeptidă cuprinzând o secvenţă de aminoacizi dată în Revendicarea 1.
11. O compoziţie farmaceutică cuprinzând cel puţin un ingredient activ selectat din grupul constând din peptida în conformitate cu Revendicarea 1 sau 3, acidul nucleic sau vectorul de exprimare în conformitate cu Revendicarea 6, celula în conformitate cu Revendicarea 7, limfocita T activată în conformitate cu Revendicarea 10 sau anticorpul în conformitate cu Revendicarea 5 ori receptorul de celule T în conformitate cu Revendicarea 4 şi un purtător acceptabil farmaceutic şi, opţional, excipienţi şi/sau stabilizatori acceptabili farmaceutic.
12. Peptida în conformitate cu Revendicarea 1 sau 3, acidul nucleic sau vectorul de exprimare în conformitate cu Revendicarea 6, celula în conformitate cu Revendicarea 7, limfocita T activată în conformitate cu Revendicarea 10 sau anticorpul în conformitate cu Revendicarea 5 sau receptorul de celule T în conformitate cu Revendicarea 4 pentru utilizare în medicină, de preferinţă pentru utilizare în diagnosticarea şi/sau tratarea cancerului.
13. Peptida în conformitate cu Revendicarea 1 sau 3, acidul nucleic sau vectorul de exprimare în conformitate cu Revendicarea 6, celula în conformitate cu Revendicarea 7, limfocita T activată în conformitate cu Revendicarea 10 sau anticorpul în conformitate cu Revendicarea 5 sau receptor de celule T în conformitate cu Revendicarea 4 pentru utilizare în diagnosticarea şi/sau tratarea cancerului în conformitate cu Revendicarea 12, în care cancerul menţionat este selectat din grupul de cancer ovarian, cancer pulmonar cu celule non-mici, cancer pulmonar cu celule mici, cancer renal, cancer cerebral, cancer de colon sau rect, cancer de stomac, cancer hepatic, cancer pancreatic, cancer de prostată, leucemie, cancer de glandă mamară, carcinom cu celule Merkel, melanom, cancer esofagian, cancer de vezică urinară, cancer uterin, cancer de vezică biliară, cancer de cale biliară şi alte tumori care arată o supraexprimare a unei proteine din care provine o peptidă în conformitate cu SEQ ID NO 82, în particular cancer ovarian.
14. Un kit care conţine: a) un recipient cu o compoziţie farmaceutică care conţine peptida în conformitate cu Revendicarea 1 sau 3, acidul nucleic sau vectorul de exprimare în conformitate cu Revendicarea 6, celula în conformitate cu Revendicarea 7, limfocita T activată în conformitate cu Revendicarea 10 sau anticorpul în conformitate cu Revendicarea 5 ori receptorul de celule T în conformitate cu Revendicarea 4, în soluţie sau sub formă liofilizată; b) opţional, un al doilea recipient conţinând un diluant sau o soluţie de reconstituire pentru formula liofilizată; c) opţional, cel puţin una sau mai multe peptide selectate din grupul constând din SEQ ID NO 1-81 şi 83-549 şi d) opţional, instrucţiuni pentru (i) utilizarea soluţiei sau (ii) reconstituirea şi/sau utilizarea formulei liofilizate şi e) conţinând, suplimentar, una sau mai multe dintre următoarele: (iii) o soluţie-tampon, (iv) un diluant, (v) un filtru, (vi) un ac sau (v) o seringă.
999. SDODR
MDE20180524T 2015-07-15 2016-07-14 Noi peptide și combinație de peptide pentru utilizare în imunoterapie împotriva cancerului ovarian epitelial și a altor cancere MD3322717T2 (ro)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201562192670P 2015-07-15 2015-07-15
GBGB1512369.8A GB201512369D0 (en) 2015-07-15 2015-07-15 Novel peptides and combination of peptides for use in immunotherapy against epithelial ovarian cancer and other cancers
PCT/EP2016/066706 WO2017009400A1 (en) 2015-07-15 2016-07-14 Novel peptides and combination of peptides for use in immunotherapy against epithelial ovarian cancer and other cancers

Publications (1)

Publication Number Publication Date
MD3322717T2 true MD3322717T2 (ro) 2020-11-30

Family

ID=54013984

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
MDE20180524T MD3322717T2 (ro) 2015-07-15 2016-07-14 Noi peptide și combinație de peptide pentru utilizare în imunoterapie împotriva cancerului ovarian epitelial și a altor cancere

Country Status (36)

Country Link
US (22) US9889159B2 (ro)
EP (2) EP3705491A1 (ro)
JP (10) JP6862411B2 (ro)
KR (2) KR20220075451A (ro)
CN (2) CN114163501A (ro)
AU (4) AU2016293047B9 (ro)
BR (2) BR112017028558A2 (ro)
CA (2) CA2992506A1 (ro)
CL (5) CL2018000124A1 (ro)
CO (1) CO2018000252A2 (ro)
CR (4) CR20200409A (ro)
CY (1) CY1123505T1 (ro)
DK (1) DK3322717T3 (ro)
EA (1) EA201890027A1 (ro)
ES (1) ES2807832T3 (ro)
GB (1) GB201512369D0 (ro)
HR (1) HRP20201281T1 (ro)
HU (1) HUE049937T2 (ro)
IL (3) IL308200A (ro)
LT (1) LT3322717T (ro)
MA (3) MA42441B1 (ro)
MD (1) MD3322717T2 (ro)
ME (1) ME03808B (ro)
MX (2) MX2018000543A (ro)
MY (1) MY189596A (ro)
NZ (1) NZ739128A (ro)
PE (2) PE20180693A1 (ro)
PH (1) PH12018500005A1 (ro)
PL (1) PL3322717T3 (ro)
PT (1) PT3322717T (ro)
RS (1) RS60647B1 (ro)
SG (7) SG10202100291XA (ro)
SI (1) SI3322717T1 (ro)
UA (1) UA124875C2 (ro)
WO (1) WO2017009400A1 (ro)
ZA (1) ZA201800129B (ro)

Families Citing this family (65)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2704744T3 (es) 2012-06-13 2019-03-19 Incyte Holdings Corp Compuestos tricíclicos sustituidos como inhibidores de FGFR
EA035095B1 (ru) 2013-04-19 2020-04-27 Инсайт Холдингс Корпорейшн Бициклические гетероциклы в качестве ингибиторов fgfr
US10851105B2 (en) 2014-10-22 2020-12-01 Incyte Corporation Bicyclic heterocycles as FGFR4 inhibitors
WO2021173560A1 (en) 2020-02-24 2021-09-02 Immatics US, Inc. Methods for expanding t cells for the treatment of cancer and related malignancies
MA41551A (fr) 2015-02-20 2017-12-26 Incyte Corp Hétérocycles bicycliques utilisés en tant qu'inhibiteurs de fgfr4
MX373169B (es) 2015-02-20 2020-04-24 Incyte Holdings Corp Heterociclos bicíclicos como inhibidores de receptores del factor de crecimiento fibroblástico (fgfr).
GB201507030D0 (en) * 2015-04-24 2015-06-10 Immatics Biotechnologies Gmbh Immunotherapy against lung cancers, in particular NSCLC
GB201512369D0 (en) * 2015-07-15 2015-08-19 Immatics Biotechnologies Gmbh Novel peptides and combination of peptides for use in immunotherapy against epithelial ovarian cancer and other cancers
PH12022551111A1 (en) 2015-10-05 2023-08-23 Immatics Biotechnologies Gmbh Peptides and combination of peptides for use in immunotherapy against small cell lung cancer and other cancers
RU2729116C2 (ru) 2015-12-16 2020-08-04 Гритстоун Онколоджи, Инк. Идентификация, производство и применение неоантигенов
JP7075125B2 (ja) 2016-05-25 2022-05-25 イマティクス バイオテクノロジーズ ゲーエムベーハー 標的としてのおよび胆嚢がんおよび胆管がんおよびその他のがんに対する免疫療法で使用するための新規ペプチド、ペプチド組み合わせ
GB201609193D0 (en) 2016-05-25 2016-07-06 Immatics Biotechnologies Gmbh Novel peptides, combination of peptides as targets for use in immunotherapy against gallbladder cancer and cholangiocarcinoma and other cancers
EP4317432A3 (en) 2016-12-08 2024-04-17 Immatics Biotechnologies GmbH T cell receptors with improved pairing
DE102016123893A1 (de) 2016-12-08 2018-06-14 Immatics Biotechnologies Gmbh T-Zellrezeptoren mit verbesserter Bindung
IL299051A (en) * 2017-01-27 2023-02-01 Immatics Biotechnologies Gmbh New peptides and their combinations for immunotherapy against ovarian cancer and other cancers
EA201991444A1 (ru) 2017-01-27 2019-12-30 Имматикс Байотекнолоджиз Гмбх Новые пептиды и комбинации пептидов для применения в иммунотерапии рака яичника и других видов рака
MA47367B1 (fr) * 2017-01-27 2023-06-28 Immatics Biotechnologies Gmbh Nouveaux peptides et combinaison de peptides à utiliser en immunothérapie contre le cancer de l'ovaire et d'autres cancers
AR111960A1 (es) 2017-05-26 2019-09-04 Incyte Corp Formas cristalinas de un inhibidor de fgfr y procesos para su preparación
SG11202000025SA (en) 2017-07-14 2020-02-27 Immatics Biotechnologies Gmbh Improved dual specificity polypeptide molecule
KR20260039788A (ko) 2017-10-10 2026-03-20 시애틀 프로젝트 코포레이션 핫스팟을 이용한 신생항원 동정
CA3083097A1 (en) 2017-11-22 2019-05-31 Gritstone Oncology, Inc. Reducing junction epitope presentation for neoantigens
DE102017127984B4 (de) 2017-11-27 2019-12-05 Immatics US, Inc. Verfahren für die Vermehrung und Aktivierung von γδ-T-Zellen
EP3749753B1 (en) 2018-02-09 2025-04-02 Immatics US, Inc. Methods for manufacturing t cells
DE102018108612A1 (de) 2018-03-21 2019-09-26 Immatics US, Inc. Verfahren zur erhöhung der persistenz von adoptiv infundierten t-zellen
CR20200590A (es) 2018-05-04 2021-04-26 Incyte Corp Formas sólidas de un inhibidor de fgfr y procesos para prepararlas
MA52493A (fr) 2018-05-04 2021-03-10 Incyte Corp Sels d'un inhibiteur de fgfr
CN110531077B (zh) * 2018-05-25 2023-07-07 荣昌生物制药(烟台)股份有限公司 间皮素免疫组化检测试剂盒
WO2020028562A1 (en) * 2018-07-31 2020-02-06 Loma Linda University Snail sirna-loaded mesoporous silica nanoparticles
WO2020185532A1 (en) 2019-03-08 2020-09-17 Incyte Corporation Methods of treating cancer with an fgfr inhibitor
WO2020191172A1 (en) 2019-03-19 2020-09-24 Immatics US, Inc. Cd28 t cell cultures, compositions, and methods of using thereof
DE102019108125B4 (de) * 2019-03-28 2022-02-03 Immatics US, Inc. Cd28 t-zellkulturen, zusammensetzungen und verfahren zu deren verwendung
WO2020243134A1 (en) 2019-05-27 2020-12-03 Immatics US, Inc. Viral vectors and their use in adoptive cellular therapy
MX2021015033A (es) 2019-06-06 2022-01-18 Immatics Biotechnologies Gmbh Clasificacion con contraseleccion utilizando peptidos de secuencias similares.
CN118666956A (zh) * 2019-06-25 2024-09-20 蒙特利尔大学 肿瘤抗原肽、肽组合、核酸、负载体、疫苗及其用途
WO2021007269A1 (en) 2019-07-09 2021-01-14 Incyte Corporation Bicyclic heterocycles as fgfr inhibitors
US20210032370A1 (en) 2019-08-02 2021-02-04 Immatics Biotechnologies Gmbh Recruiting agent further binding an mhc molecule
CA3150197A1 (en) * 2019-08-09 2021-02-18 Immatics US, Inc. Methods for peptide mass spectrometry fragmentation prediction
WO2021067374A1 (en) 2019-10-01 2021-04-08 Incyte Corporation Bicyclic heterocycles as fgfr inhibitors
TWI891666B (zh) 2019-10-14 2025-08-01 美商英塞特公司 作為ｆｇｆｒ抑制劑之雙環雜環
WO2021076728A1 (en) 2019-10-16 2021-04-22 Incyte Corporation Bicyclic heterocycles as fgfr inhibitors
EP4069696A1 (en) 2019-12-04 2022-10-12 Incyte Corporation Tricyclic heterocycles as fgfr inhibitors
BR112022010664A2 (pt) 2019-12-04 2022-08-16 Incyte Corp Derivados de um inibidor de fgfr
WO2021146424A1 (en) 2020-01-15 2021-07-22 Incyte Corporation Bicyclic heterocycles as fgfr inhibitors
DE102020111571A1 (de) 2020-03-11 2021-09-16 Immatics US, Inc. Wpre-mutantenkonstrukte, zusammensetzungen und zugehörige verfahren
DE102020106710A1 (de) 2020-03-11 2021-09-16 Immatics US, Inc. Wpre-mutantenkonstrukte, zusammensetzungen und zugehörige verfahren
EP4165059A1 (en) * 2020-06-13 2023-04-19 Complete Omics Inc. Method and system for neoantigen analysis
TW202227616A (zh) 2020-08-21 2022-07-16 美商英麥提克斯股份有限公司 分離ｃｄ８＋選擇ｔ細胞的方法
KR20230135589A (ko) 2020-12-31 2023-09-25 이매틱스 유에스 인코포레이티드 Cd8 폴리펩타이드, 조성물 및 이의 사용 방법
TW202304459A (zh) 2021-04-12 2023-02-01 美商英塞特公司 包含ｆｇｆｒ抑制劑及ｎｅｃｔｉｎ－４靶向劑之組合療法
EP4326858A4 (en) * 2021-04-23 2025-03-12 VLP Therapeutics, Inc. GALECTIN-TARGETED IMMUNOTHERAPY
US12162940B2 (en) 2021-05-05 2024-12-10 Immatics Biotechnologies Gmbh BMA031 antigen binding polypeptides
CN113241177B (zh) * 2021-05-19 2024-05-10 上海宝藤生物医药科技股份有限公司 一种评估免疫力水平的方法、装置、设备及存储介质
WO2022261159A1 (en) 2021-06-09 2022-12-15 Incyte Corporation Tricyclic heterocycles as fgfr inhibitors
EP4352059A1 (en) 2021-06-09 2024-04-17 Incyte Corporation Tricyclic heterocycles as fgfr inhibitors
JP2024534825A (ja) 2021-08-24 2024-09-26 イマティクス ユーエス，アイエヌシー． 条件付きリガンド交換により産生されたペプチドｍｈｃ複合体を使用する免疫細胞の選択
TW202332765A (zh) 2021-09-20 2023-08-16 美商英麥提克斯股份有限公司 用於ｔ細胞療法之ｔ細胞群體的單核球耗盡
CN118541392A (zh) 2021-09-28 2024-08-23 准星生物医药有限公司 多种形式的分子复合物
EP4448108A1 (en) 2021-11-08 2024-10-23 Immatics Biotechnologies GmbH Adoptive cell therapy combination treatment and compositions thereof
JP2025515604A (ja) 2022-04-28 2025-05-20 イマティクス ユーエス，アイエヌシー． ドミナントネガティブＴＧＦβ受容体ポリペプチド、ＣＤ８ポリペプチド、細胞、組成物、およびその使用方法
JP2025516189A (ja) 2022-04-28 2025-05-27 イマティクス ユーエス，アイエヌシー． 膜結合型ｉｌ－１５、ｃｄ８ポリペプチド、細胞、組成物、およびそれらの使用方法
JP2025515603A (ja) 2022-04-28 2025-05-20 イマティクス ユーエス，アイエヌシー． Ｉｌ－１２ポリペプチド、ｉｌ－１５ポリペプチド、ｉｌ－１８ポリペプチド、ｃｄ８ポリペプチド、それらの組成物、およびそれらの使用方法
US20230355678A1 (en) 2022-05-05 2023-11-09 Immatics US, Inc. Methods for improving t cell efficacy
CN114657158B (zh) * 2022-05-25 2022-10-21 深圳吉诺因生物科技有限公司 Ido1相关疫苗及其应用
GB202302709D0 (en) * 2023-02-24 2023-04-12 Genome Res Ltd Method of identifying t cell recpetors of interest
WO2025096649A1 (en) 2023-11-01 2025-05-08 Immatics US, Inc. Membrane-bound il-15, cd8 polypeptides, cells, compositions, and methods of using thereof

Family Cites Families (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1575500A4 (en) * 2002-07-12 2007-01-03 Univ Johns Hopkins MESOTHELIN VACCINE AND MODEL SYSTEMS
WO2004050860A2 (en) * 2002-12-04 2004-06-17 Diadexus, Inc. Compositions, splice variants and methods relating to colon specific genes and proteins
DE102004026135A1 (de) * 2004-05-25 2006-01-05 Immatics Biotechnologies Gmbh An MHC-Moleküle bindende Tumor-assoziierte Peptide
CA2579558A1 (en) * 2004-09-08 2006-03-16 Ludwig Institute For Cancer Research Cancer-testis antigens
WO2006106912A1 (ja) * 2005-03-31 2006-10-12 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha 癌関連抗原アナログペプチド、およびその利用
ES2341802T3 (es) 2005-09-05 2010-06-28 Immatics Biotechnologies Gmbh Peptidos asociados a tumores unidos promiscuamente a moleculas del antigeno de leucocito humano (hla) de clase ii.
PL1760089T3 (pl) 2005-09-05 2010-03-31 Immatics Biotechnologies Gmbh Peptydy towarzyszące nowotworom, wiążące się z cząsteczkami klasy I i II antygenów ludzkich leukocytów (HLA) i związana z nimi szczepionka przeciwnowotworowa
CA2665568C (en) * 2006-10-04 2018-01-09 Janssen Pharmaceutica, N.V. Preparation of inactivated artificial antigen presenting cells and their use in cell therapies
US8097242B2 (en) 2006-10-05 2012-01-17 The Board Of Trustees Of The University Of Arkansas Target CA125 peptides for cancer immunotherapy
PL2565204T3 (pl) * 2007-07-27 2016-03-31 Immatics Biotechnologies Gmbh Nowe immunogenne epitopy do immunoterapii
BRPI0813621A2 (pt) * 2007-07-27 2017-05-09 Immatics Biotechnologies Gmbh imunoterapia contra tumores neuronais e cerebrais
US20100260764A1 (en) * 2007-08-29 2010-10-14 Marinkovich M Peter Compositions and methods for inhibiting squamous cell carcinoma
SI2119726T2 (en) * 2008-05-14 2018-03-30 Immatics Biotechnologies Gmbh New and powerful Class II MHC peptides derived from survivin and neurocane
PL2172211T3 (pl) * 2008-10-01 2015-05-29 Immatics Biotechnologies Gmbh Kompozycja związanych z guzem peptydów i związana z tym szczepionka przeciwrakowa do leczenia glejaka (GBM) i innych rodzajów raka
GB201004551D0 (en) * 2010-03-19 2010-05-05 Immatics Biotechnologies Gmbh NOvel immunotherapy against several tumors including gastrointestinal and gastric cancer
GB201006360D0 (en) * 2010-04-16 2010-06-02 Immatics Biotechnologies Gmbh Method for differentially quantifying naturally processed HLA-restricted peptides for cancer, autoimmune and infectious diseases immunotherapy development
WO2014011465A2 (en) * 2012-07-13 2014-01-16 Albert Einstein College Of Medicine Of Yeshiva University Aptamer-targeted antigen delivery
MY171854A (en) * 2013-03-29 2019-11-05 Sumitomo Dainippon Pharma Co Ltd Wt1 antigen peptide conjugate vaccine
TWI775117B (zh) * 2013-08-05 2022-08-21 德商伊瑪提克斯生物科技有限公司 新穎肽類，細胞及其用於治療多種腫瘤的用途，其製造方法及包含其等之醫藥組成物（二）
GB201319446D0 (en) * 2013-11-04 2013-12-18 Immatics Biotechnologies Gmbh Personalized immunotherapy against several neuronal and brain tumors
GB201505305D0 (en) * 2015-03-27 2015-05-13 Immatics Biotechnologies Gmbh Novel Peptides and combination of peptides for use in immunotherapy against various tumors
ES2983924T3 (es) * 2015-03-27 2024-10-28 Immatics Biotechnologies Gmbh Péptidos novedosos y combinación de péptidos para usarse en inmunoterapia contra diferentes tumores
GB201507030D0 (en) * 2015-04-24 2015-06-10 Immatics Biotechnologies Gmbh Immunotherapy against lung cancers, in particular NSCLC
GB201512369D0 (en) 2015-07-15 2015-08-19 Immatics Biotechnologies Gmbh Novel peptides and combination of peptides for use in immunotherapy against epithelial ovarian cancer and other cancers

Also Published As

Publication number Publication date
PH12018500005A1 (en) 2018-07-09
US10639331B2 (en) 2020-05-05
MY189596A (en) 2022-02-18
JP2020182451A (ja) 2020-11-12
AU2016293047B2 (en) 2020-09-17
EA201890027A1 (ru) 2018-06-29
IL308200A (en) 2024-01-01
CY1123505T1 (el) 2022-03-24
SG10202100295RA (en) 2021-02-25
CL2019003313A1 (es) 2020-03-13
EP3322717B1 (en) 2020-06-10
US20200000850A1 (en) 2020-01-02
US20180117085A1 (en) 2018-05-03
JP2020171283A (ja) 2020-10-22
JP6862411B2 (ja) 2021-04-21
LT3322717T (lt) 2020-08-25
CR20180027A (es) 2018-07-23
CR20200410A (es) 2020-10-12
CO2018000252A2 (es) 2018-05-31
US20200155603A1 (en) 2020-05-21
HUE049937T2 (hu) 2020-11-30
JP7074369B2 (ja) 2022-05-24
JP2021000078A (ja) 2021-01-07
US9889159B2 (en) 2018-02-13
US10869897B2 (en) 2020-12-22
WO2017009400A1 (en) 2017-01-19
US20210252064A1 (en) 2021-08-19
JP7074370B2 (ja) 2022-05-24
CN114163501A (zh) 2022-03-11
JP7074367B2 (ja) 2022-05-24
JP2020198875A (ja) 2020-12-17
GB201512369D0 (en) 2015-08-19
US10881690B2 (en) 2021-01-05
SG10202100292VA (en) 2021-02-25
JP7205919B2 (ja) 2023-01-17
DK3322717T3 (da) 2020-08-10
EP3705491A1 (en) 2020-09-09
CL2019003310A1 (es) 2020-04-24
US20210252065A1 (en) 2021-08-19
US10568909B2 (en) 2020-02-25
US10722538B2 (en) 2020-07-28
JP2020191862A (ja) 2020-12-03
BR122023024959A2 (pt) 2024-01-16
US20210260123A1 (en) 2021-08-26
US20230241106A1 (en) 2023-08-03
CR20200409A (es) 2020-10-16
AU2020256318A1 (en) 2020-11-12
US20230190813A1 (en) 2023-06-22
US10888587B2 (en) 2021-01-12
MX2023014146A (es) 2023-12-13
SG10202100296PA (en) 2021-02-25
US20170035807A1 (en) 2017-02-09
BR112017028558A2 (pt) 2018-09-04
US20230086100A1 (en) 2023-03-23
SG10202100294WA (en) 2021-02-25
US20230241107A1 (en) 2023-08-03
CA3221097A1 (en) 2017-01-19
ES2807832T3 (es) 2021-02-24
US20210106624A1 (en) 2021-04-15
PT3322717T (pt) 2020-07-27
MX2018000543A (es) 2018-05-22
US20210106623A1 (en) 2021-04-15
KR20220075451A (ko) 2022-06-08
IL256697B (en) 2022-05-01
JP2020127401A (ja) 2020-08-27
JP7239992B2 (ja) 2023-03-15
US10639332B2 (en) 2020-05-05
US20200316126A1 (en) 2020-10-08
MA42441B1 (fr) 2020-07-29
JP2020167995A (ja) 2020-10-15
HK1253574A1 (en) 2019-06-21
PE20240645A1 (es) 2024-04-04
US20200316127A1 (en) 2020-10-08
ZA201800129B (en) 2018-12-19
CL2018000124A1 (es) 2018-05-18
US11246889B2 (en) 2022-02-15
SI3322717T1 (sl) 2020-09-30
US20210260122A1 (en) 2021-08-26
AU2022200745A1 (en) 2022-02-24
SG10202100291XA (en) 2021-02-25
KR20180030506A (ko) 2018-03-23
CL2019003311A1 (es) 2020-03-13
JP2020156480A (ja) 2020-10-01
AU2020203971A1 (en) 2020-07-02
US10463696B2 (en) 2019-11-05
US20210252066A1 (en) 2021-08-19
IL256697A (en) 2018-03-29
RS60647B1 (sr) 2020-09-30
MA41717A1 (fr) 2019-05-31
CA2992506A1 (en) 2017-01-19
IL292131A (en) 2022-06-01
SG10202100298SA (en) 2021-02-25
AU2016293047A1 (en) 2018-02-08
HRP20201281T1 (hr) 2020-11-13
JP7239993B2 (ja) 2023-03-15
US20200316125A1 (en) 2020-10-08
CN107922469A (zh) 2018-04-17
CL2019003312A1 (es) 2020-03-13
US20200000849A1 (en) 2020-01-02
AU2022200745B2 (en) 2024-01-18
US20230285458A1 (en) 2023-09-14
SG10202100297QA (en) 2021-02-25
PL3322717T3 (pl) 2020-11-16
US11278571B2 (en) 2022-03-22
EP3322717A1 (en) 2018-05-23
JP2020182458A (ja) 2020-11-12
AU2020203971B2 (en) 2021-11-25
US11806366B2 (en) 2023-11-07
JP2018531581A (ja) 2018-11-01
US11071756B2 (en) 2021-07-27
ME03808B (me) 2021-04-20
PE20180693A1 (es) 2018-04-23
MA50542A (fr) 2020-09-09
US20230201259A1 (en) 2023-06-29
NZ739128A (en) 2022-04-29
US20190381103A1 (en) 2019-12-19
UA124875C2 (uk) 2021-12-08
CR20200408A (es) 2020-10-08
AU2016293047A2 (en) 2018-03-15
US11819518B2 (en) 2023-11-21
AU2016293047B9 (en) 2020-10-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7205919B2 (ja) 上皮性卵巣がんおよびその他のがんに対する免疫療法において使用するための新規ペプチドおよびペプチドの組み合わせ
MD3331900T2 (ro) Peptide și combinație de peptide pentru utilizare în imunoterapie împotriva cancerului de prostată și altor cancere
HK1253574B (en) Novel peptides and combination of peptides for use in immunotherapy against epithelial ovarian cancer and other cancers

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Patent for invention definitely lapsed due to non-payment of fees