MD3558391T2 - Imunoconjugate care țintesc ADAM9 și procedee de utilizare a acestora - Google Patents

Imunoconjugate care țintesc ADAM9 și procedee de utilizare a acestora Download PDF

Info

Publication number
MD3558391T2
MD3558391T2 MDE20191243T MDE20191243T MD3558391T2 MD 3558391 T2 MD3558391 T2 MD 3558391T2 MD E20191243 T MDE20191243 T MD E20191243T MD E20191243 T MDE20191243 T MD E20191243T MD 3558391 T2 MD3558391 T2 MD 3558391T2
Authority
MD
Moldova
Prior art keywords
seq
adam9
domain
amino acid
antibody
Prior art date
Application number
MDE20191243T
Other languages
English (en)
Inventor
Stuart William Hicks
Nicholas C Yoder
Bhaswati Barat
Ezio Bonvini
Gundo Diedrich
Leslie S Johnson
Deryk Loo
Juniper A Scribner
Original Assignee
Immunogen Inc
Macrogenics Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Immunogen Inc, Macrogenics Inc filed Critical Immunogen Inc
Publication of MD3558391T2 publication Critical patent/MD3558391T2/ro

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6871—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting an enzyme
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/68033—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a maytansine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/68035—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a pyrrolobenzodiazepine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2896—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against molecules with a "CD"-designation, not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/524—CH2 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/526—CH3 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/71—Decreased effector function due to an Fc-modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/72—Increased effector function due to an Fc-modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/77—Internalization into the cell

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

Prezenta invenţie se referă la imunoconjugaţi care cuprind un anticorp sau un fragment al acestuia capabil să se lege în mod specific la "Proteina 9 care conţine domeniul de dezintegrină şi metaloproteinază" ("ADAM9") conjugat cu cel puţin un agent farmacologic. Invenţia se referă în special la astfel de imunoconjugaţi care sunt reactivi încrucişat cu ADAM9 umană şi ADAM9 de primată non-umană (cum ar fi o maimuţă cynomolgus). Invenţia se referă în plus la toţi astfel de imunoconjugaţi care cuprind un domeniu variabil al lanţului uşor (VL) şi/sau un domeniu variabil al lanţului greu (VH) care a fost umanizat şi în mod opţional deimunizat astfel încât să prezinte o imunogenitate redusă la administrarea unor astfel de imunoconjugaţi la un subiect destinatar. Invenţia se referă, de asemenea, la compoziţii farmaceutice ce conţin oricare dintre astfel de imunoconjugaţi şi la metodele care implică utilizarea oricărora dintre aceşti imunoconjugaţi în tratamentul cancerului sau a altori boli şi condiţii.

Description

DOMENIUL INVENŢIEI
Prezenta invenţie se referă la imunoconjugaţi care cuprind un anticorp sau un fragment al acestuia capabil să se lege în mod specific la "Proteina 9 care conţine domeniul de dezintegrină şi metaloproteinază" ("ADAM9") conjugat cu cel puţin un agent farmacologic. Invenţia se referă în special la astfel de imunoconjugaţi care sunt reactivi încrucişat cu ADAM9 umană şi ADAM9 de primată non-umană (cum ar fi o maimuţă cynomolgus). Invenţia se referă în plus la toţi astfel de imunoconjugaţi care cuprind un domeniu variabil al lanţului uşor (VL) şi/sau un domeniu variabil al lanţului greu (VH) care a fost umanizat şi în mod opţional deimunizat astfel încât să prezinte o imunogenitate redusă la administrarea unor astfel de imunoconjugaţi la un subiect destinatar. Invenţia se referă, de asemenea, la compoziţii farmaceutice ce conţin oricare dintre astfel de imunoconjugaţi şi la imunoconjugaţi şi compoziţii farmaceutice pentru utilizare în tratamentul unei boli sau afecţiuni asociate cu sau caracterizate prin expresia ADAM9 (cum ar fi cancer).
BAZELE INVENŢIEI
ADAM este o familie de proteine implicate în diverse procese fiziologice şi patologice (Amendola, R.S. şi colab. (2015) "ADAM9 Disintegrin Domain Activates Human Neutrophils Through An Autocrine Circuit Involving Integrins And CXCR2," J. Leukocyte Biol. 97(5):951-962; Edwars, D.R. şi colab. (2008) "The ADAM Metalloproteases," Molec. Aspects Med. 29:258-289). Au fost identificaţi cel puţin 40 de membri genetici ai familiei şi se crede că cel puţin 21 dintre aceşti membri sunt funcţionali la om (Li, J. şi colab. (2016) "Overexpression of ADAM9 Promotes Colon Cancer Cells Invasion," J. Invest. Surg. 26(3):127-133; Duffy, M.J. şi colab. (2011) "The ADAMs Family Of Proteases: New Biomarkers And Therapeutic Targets For Cancer?," Clin. Proteomics 8:9:1-13; a se vedea, de asemenea, Publicaţia de brevet SUA nr. 2013/0045244).
Membrii familiei ADAM au o structură bine conservată, cu 8 domenii, printre care se numără un domeniu de metaloprotează şi un domeniu de legare a integrinei (dezintegrină) (Duffy, M.J. şi colab. (2009) "The Role Of ADAMs In Disease Pathophysiology," Clin. Chim. Acta 403:31-36). Domeniul de metaloprotează al ADAM acţionează ca o sheddază şi s-a raportat faptul că modulează o serie de procese biologice prin clivarea proteinelor transmembranare, care apoi pot acţiona ca liganzi solubili şi pot regla semnalizarea celulară (Amendola, R.S. şi colab. (2015) "ADAM9 Disintegrin Domain Activates Human Neutrophils Through An Autocrine Circuit Involving Integrins And CXCR2," J. Leukocyte Biol. 97(5):951-962; Ito, N. şi colab. (2004) "ADAMs, A Disintegrin And Metalloproteinases, Mediate Shedding Of Oxytocinase," Biochem. Biophys. Res. Commun. 314 (2004) 1008-1013).
ADAM9 este un membru al familiei ADAM a moleculei. Acesta este sintetizat ca o formă inactivă care este clivată proteolitic pentru a genera o enzimă activă. Procesarea la situsul din amonte este extrem de importantă pentru activarea proenzimei. ADAM9 este exprimată în fibroblaste (Zigrino, P. şi colab. (2011) "The Disintegrin-Like And Cysteine-Rich Domains Of ADAM-9 Mediate Interactions Between Melanoma Cells And Fibroblasts," J. Biol. Chem. 286:6801-6807), celulele musculare netede vasculare activate (Sun, C. şi colab. (2010) "ADAM15 Regulates Endothelial Permeability And Neutrophil Migration Via Src/ERK1/2 Signalling," Cardiovasc. Res. 87:348-355), monocite (Namba, K. şi colab. (2001) "Involvement Of ADAM9 In Multinucleated Giant Cell Formation Of Blood Monocytes," Cell. Immunol. 213:104-113), macrofagele activate (Oksala, N. şi colab. (2009) "ADAM-9, ADAM-15, And ADAM-17 Are Upregulated In Macrophages In Advanced Human Atherosclerotic Plaques In Aorta And Carotid And Femoral Arteries - Tampere Vascular Study," Ann. Med. 41:279-290). Activitatea metaloproteazei ADAM9 participă la degradarea componentelor matricei, pentru a permite astfel migrarea celulelor tumorale (Amendola, R.S. şi colab. (2015) "ADAM9 Disintegrin Domain Activates Human Neutrophils Through An Autocrine Circuit Involving Integrins And CXCR2," J. Leukocyte Biol. 97(5):951-962). Domeniul dezintegrină al său, care este puternic omolog cu multe dezintegrine de venin de şarpe, permite interacţiunea dintre ADAM9 şi integrine şi permite ADAM9 să moduleze, pozitiv sau negativ, evenimentele de adeziune celulară (Zigrino, P. şi colab. (2011) "The Disintegrin-Like And Cysteine-Rich Domains Of ADAM-9 Mediate Interactions Between Melanoma Cells And Fibroblasts," J. Biol. Chem. 286:6801-6807; Karadag, A. şi colab. (2006) "ADAM-9 (MDC-9/Meltringamma), A Member Of The A Disintegrin And Metalloproteinase Family, Regulates Myeloma-Cell-Induced Interleukin-6 Production In Osteoblasts By Direct Interaction With The Alpha(v)Beta5 Integrin," Blood 107:3271-3278; Cominetti, M.R. şi colab. (2009) "Inhibition Of Platelets And Tumor Cell Adhesion By The Disintegrin Domain Of Human ADAM9 To Collagen I Under Dynamic Flow Conditions," Biochimie, 91:1045-1052). S-a demonstrat faptul că domeniul dezintegrină al ADAM9 interacţionează cu integrinele α6β1, α6β4, αvβ5 şi α9β1. Expresia ADAM9 s-a dovedit a fi relevantă pentru boală, în special pentru cancer. S-a descoperit faptul că ADAM9 clivează şi eliberează o serie de molecule cu roluri importante în tumorigeneză şi angiogeneză, cum ar fi TEK, KDR, EPHB4, CD40, VCAM1 şi CDH5. ADAM9 este exprimată de multe tipuri de celule tumorale, inclusiv celulele tumorale ale cancerelor mamare, cancerelor de colon, cancerelor gastrice, glioamelor, cancerelor hepatice, cancerelor pulmonare cu celule non-mici, melanoamelor, mieloamelor, cancerelor pancreatice şi cancerelor de prostată (Yoshimasu, T. şi colab. (2004) "Overexpression Of ADAM9 In Non-Small Cell Lung Cancer Correlates With Brain Metastasis," Cancer Res. 64:4190-4196; Peduto, L. şi colab. (2005) "Critical Function For ADAM9 In Mouse Prostate Cancer," Cancer Res. 65:9312-9319; Zigrino, P. şi colab. (2005) "ADAM-9 Expression And Regulation In Human Skin Melanoma And Melanoma Cell Lines," Int. J. Cancer 116:853-859; Fritzsche, F.R. şi colab. (2008) "ADAM9 Is Highly Expressed In Renal Cell Cancer And Is Associated With Tumour Progression," BMC Cancer 8:179:1-9; Fry, J.L. şi colab. (2010) "Secreted And Membrane-Bound Isoforms Of Protease ADAM9 Have Opposing Effects On Breast Cancer Cell Migration," Cancer Res. 70, 8187-8198; Chang, L. şi colab. (2016) "Combined Rnai Targeting Human Stat3 And ADAM9 As Gene Therapy For Non-Small Cell Lung Cancer," Oncology Letters 11:1242-1250; Fan, X. şi colab. (2016) "ADAM9 Expression Is Associate with Glioma Tumor Grade and Histological Type, and Acts as a Prognostic Factor in Lower-Grade Gliomas," Int. J. Mol. Sci. 17:1276:1-11). În mod semnificativ, s-a descoperit faptul că expresia crescută a ADAM9 se corelează pozitiv cu malignitatea tumorală şi potenţialul metastatic (Amendola, R.S. şi colab. (2015) "ADAM9 Disintegrin Domain Activates Human Neutrophils Through An Autocrine Circuit Involving Integrins And CXCR2," J. Leukocyte Biol. 97(5):951-962; Fan, X. şi colab. (2016) "ADAM9 Expression Is Associate with Glioma Tumor Grade and Histological Type, and Acts as a Prognostic Factor in Lower-Grade Gliomas," Int. J. Mol. Sci. 17:1276:1-11; Li, J. şi colab. (2016) "Overexpression of ADAM9 Promotes Colon Cancer Cells Invasion," J. Invest. Surg. 26(3):127-133). În plus, ADAM9 şi izoforma sa solubilă secretată par a fi cruciale pentru diseminarea celulelor canceroase (Amendola, R.S. şi colab. (2015) "ADAM9 Disintegrin Domain Activates Human Neutrophils Through An Autocrine Circuit Involving Integrins And CXCR2," J. Leukocyte Biol. 97(5):951-962; Fry, J.L. şi colab. (2010) "Secreted And Membrane-Bound Isoforms Of Protease ADAM9 Have Opposing Effects On Breast Cancer Cell Migration," Cancer Res. 70, 8187-8198; Mazzocca, A. (2005) "A Secreted Form OfADAM9 Promotes Carcinoma Invasion Through Tumor-Stromal Interactions," Cancer Res. 65:4728-4738; a se vedea, de asemenea, Brevetele SUA nr. 9,150,656; 7,585,634; 7,829,277; 8,101,361; şi 8,445,198 and Publicaţia de brevet SUA nr. 2009/0023149). Prin urmare, o serie de studii au identificat ADAM9 ca ţintă potenţială pentru terapia împotriva cancerului (Peduto, L. (2009) "ADAM9 As A Potential Target Molecule In Cancer," Curr. Pharm. Des. 15:2282-2287; Duffy, M.J. şi colab. (2009) "Role Of ADAMs In Cancer Formation And Progression" Clin. Cancer Res. 15:1140-1144; Duffy, M.J. şi colab. (2011) "The ADAMs Family Of Proteases: New Biomarkers And Therapeutic Targets For Cancer?," Clin. Proteomics 8:9:1-13; Josson, S. şi colab. (2011) "Inhibition of ADAM9 Expression Induces Epithelial Phenotypic Alterations and Sensitizes Human Prostate Cancer Cells to Radiation and Chemotherapy," Prostate 71(3):232-240; a se vedea, de asemenea, Publicaţiile de brevet SUA nr. 2016/0138113, 2016/0068909, 2016/0024582, 2015/0368352, 2015/0337356, 2015/0337048, 2015/0010575, 2014/0342946, 2012/0077694, 2011/0151536, 2011/0129450, 2010/0291063, 2010/0233079, 2010/0112713, 2009/0203051, 2004/0092466, 2003/0091568 şi 2002/0068062 şi Publicaţiile PCT nr. WO 2016/077505, WO 2014/205293, WO 2014/186364, WO 2014/124326, WO 2014/108480, WO 2013/119960, WO 2013/098797, WO 2013/049704 şi WO 2011/100362). US2009/0285840A1 descrie compoziţii şi procedee care inhibă expresia produselor genetice ale Adam9, cum ar fi ARNm al ADAM9 şi/sau polipeptide ale ADAM9, ca abordare terapeutică pentru tratamentul neovascularizării patologice şi al afecţiunilor asociate cu angiogeneza. DE10337368A1 descrie diagnosticul cancerului pancreatic prin detectarea expresiei proteinei ADAM9 utilizând anticorpi specifici şi, de asemenea, utilizarea terapeutică a acestor anticorpi şi a acizilor nucleici specifici ai ADAM9. În plus, s-a constatat, de asemenea, faptul că expresia ADAM9 este relevantă pentru boala pulmonară şi inflamaţie (a se vedea, de exemplu, Publicaţiile de brevet SUA nr. 2016/0068909; 2012/0149595; 2009/0233300; 2006/0270618; şi 2009/0142301). Anticorpii care se leagă la ADAM9 sunt disponibili pe piaţă de la Abcam, Thermofisher, Sigma-Aldrich şi alte companii. Cu toate acestea, în ciuda tuturor progreselor anterioare, este încă nevoie de ADAM9 cu afinitate crescută care ţinteşte imunoconjugaţi care prezintă o legare minimă la ţesuturile normale şi sunt capabili să se lege la ADAM9 umană şi non-umană cu o afinitate crescută similară. Prezenta invenţie se adresează acestei nevoi şi nevoii de terapie îmbunătăţită pentru cancer.
REZUMATUL INVENŢIEI
Conform unui aspect al invenţiei, sunt furnizaţi imunoconjugaţi care cuprind un anticorp sau un fragment al acestuia capabil să se lege în mod specific la "Proteina 9 care conţine domeniul de dezintegrină şi metaloproteinază" ("ADAM9") conjugată cu cel puţin un agent farmacologic astfel cum este definit în revendicarea 1. Imunoconjugaţii sunt reactivi încrucişat cu ADAM9 umană şi ADAM9 de primată non-umană (o maimuţă cynomolgus). Imunoconjugaţii cuprind un domeniu variabil al lanţului uşor (VL) şi/sau un domeniu variabil al lanţului greu (VH) care a fost umanizat (şi în mod opţional deimunizat) astfel încât să prezinte o imunogenitate redusă la administrarea unor astfel de imunoconjugaţi la un subiect destinatar. Conform altor aspecte ale invenţiei, sunt furnizate o compoziţie farmaceutică astfel cum este definită în revendicarea 15 şi un imunoconjugat sau o compoziţie farmaceutică pentru utilizare în tratamentul unei boli sau afecţiuni asociate cu sau caracterizate prin expresia ADAM9 (cum ar fi cancer) astfel cum este definit în revendicările 16 şi 17.
În detaliu, prezenta invenţie furnizează un imunoconjugat care cuprinde un anticorp anti-ADAM9 umanizat sau un fragment al acestuia de legare a ADAM9 care se leagă în mod specific la ADAM9 umană şi la ADAM9 de cyno:
(I) în care anticorpul anti-ADAM9 umanizat sau fragmentul acestuia de legare a ADAM9 menţionat este conjugat cu un agent farmacologic; şi
(II) în care anticorpul anti-ADAM9 umanizat sau fragmentul acestuia de legare a ADAM9 menţionat cuprinde un domeniu variabil al lanţului uşor (VL) şi un domeniu variabil al lanţului greu (VH), în care domeniul variabil al lanţului greu menţionat cuprinde un domeniu CDRH1, un domeniu CDRH2 şi un domeniu CDRH3, iar domeniul variabil al lanţului uşor menţionat cuprinde un domeniu CDRL1, un domeniu CDRL2 şi un domeniu CDRL3, în care:
(A) domeniul CDRH1 menţionat cuprinde secvenţa de aminoacizi a SEQ ID NO:8 sau SEQ ID NO:34; şi
(B) domeniul CDRH2 menţionat cuprinde secvenţa de aminoacizi a SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO:35 sau SEQ ID NO:36; şi
(C) domeniul CDRH3 menţionat cuprinde secvenţa de aminoacizi a oricăreia dintre SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39, SEQ ID N0:40, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:45 sau SEQ ID NO:46; şi
în care:
(A) domeniul CDRL1 menţionat are secvenţa de aminoacizi a SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:63 sau SEQ ID NO:64; şi
(B) domeniul CDRL2 menţionat are secvenţa de aminoacizi a SEQ ID NO: 13; şi
(C) domeniul CDRL3 menţionat are secvenţa de aminoacizi a SEQ ID NO: 14 sau SEQ ID NO:65.
În anumite variante de realizare, domeniul variabil al lanţului greu (VH) al variantei optimizate a MAB-A este selectat din grupul constând din:
(5) hMAB-A VH(2A) (SEQ ID NO:20);
(6) hMAB-A VH(2B) (SEQ ID NO:21);
(7) hMAB-A VH(2C) (SEQ ID NO:22);
(8) hMAB-A VH(2D) (SEQ ID NO:23);
(9) hMAB-A VH(2E) (SEQ ID NO:24);
(10) hMAB-A VH(2F) (SEQ ID NO:25);
(11) hMAB-A VH(2G) (SEQ ID NO:26);
(12) hMAB-A VH(2H) (SEQ ID NO:27);
(13) hMAB-A VH(2I) (SEQ ID NO:28); şi
(14) hMAB-A VH(2J) (SEQ ID NO:29).
În anumite variante de realizare, domeniul variabil al lanţului uşor (VL) al variantei optimizate a MAB-A este selectat din grupul constând din:
(1) hMAB-A VL(1) (SEQ ID NO:54);
(2) hMAB-A VL(2) (SEQ ID NO:55);
(3) hMAB-A VL(3) (SEQ ID NO:56);
(4) hMAB-A VL(4) (SEQ ID NO:57).
În anumite variante de realizare, domeniul CDRH1 cuprinde secvenţa de aminoacizi SYWMH (SEQ ID NO:8), domeniul CDRH2 cuprinde secvenţa de aminoacizi E I I P I FGHTNYNEKFKS (SEQ ID NO:35), iar domeniul CDRH3 cuprinde secvenţa de aminoacizi GGYYYYPRQGFLDY (SEQ ID NO:45)
În anumite variante de realizare, domeniul CDRL1 cuprinde secvenţa de aminoacizi KASQSVDYSGDSYMN (SEQ ID NO:62), domeniul CDRL2 cuprinde secvenţa de aminoacizi AASDLES (SEQ ID NO:13), iar domeniul CDRL3 cuprinde secvenţa de aminoacizi QQSHEDPFT (SEQ ID NO:14). În anumite variante de realizare, imunoconjugatul cuprinde:
(A) domeniul variabil al lanţului greu (VH) al hMAB-A (2I.2) (SEQ ID NO:28); or
(B) domeniul variabil al lanţului uşor (VL) al hMAB-A (2I.2) (SEQ ID NO:55); sau
(C) domeniul variabil al lanţului greu (VH) al hMAB-A (2I.2) (SEQ ID NO:28) şi domeniul variabil al lanţului uşor (VL) al hMAB-A (2I.2) (SEQ ID NO:55)
În anumite variante de realizare, imunoconjugatul cuprinde o regiune Fc. În unele variante de realizare, regiunea Fc este o variantă de regiune Fc care cuprinde: (a) una sau mai multe modificări de aminoacizi care reduc afinitatea variantei de regiune Fc pentru un FcγR; şi/sau (b) una sau mai multe modificări de aminoacizi care introduc un rest de cisteină. În unele variante de realizare, una sau mai multe modificări de aminoacizi care reduc afinitatea variantei de regiune Fc pentru un FcγR cuprind: (A) L234A; (B) L235A; sau (C) L234A şi L235A; în care numerotarea menţionată este cea din indexul UE Kabat. În unele variante de realizare, una sau mai multe modificări de aminoacizi care introduc un rest de cisteină cuprind S442C, în care numerotarea menţionată este cea din indexul UE Kabat.
Imunoconjugatul conform prezentei invenţii cuprinde un anticorp anti-ADAM9 umanizat sau un fragment de legare a ADAM9 al acestuia care se leagă în mod specific la ADAM9 umană şi la ADAM9 de cyno, în care anticorpul anti-ADAM9 umanizat sau fragmentul de legare a ADAM9 al acestuia este conjugat cu agentul farmacologic.
În anumite variante de realizare, anticorpul anti-ADAM9 umanizat sau fragmentul de legare a ADAM9 al acestuia este optimizat pentru a avea o îmbunătăţire de cel puţin 100 de ori a afinităţii de legare la ADAM9 de cyno şi păstrează legarea cu afinitate crescută la ADAM9 umană în comparaţie cu anticorpul parental himeric sau murinic. În anumite variante de realizare, anticorpul anti-ADAM9 sau fragmentul de legare a ADAM9 al acestuia cuprinde un domeniu CDRH1, un domeniu CDRH2 şi un domeniu CDRH3 şi un domeniu CDRL1, un domeniu CDRL2 şi un domeniu CDRL3 care are secvenţele selectate din grupul constând din:
(a) SEQ ID NO: 8, 35 şi 37 şi, respectiv, SEQ ID NO: 62, 13, 14;
(b) SEQ ID NO: 8, 35 şi 38 şi, respectiv, SEQ ID NO: 62, 13, 14;
(c) SEQ ID NO: 8, 35 şi 39 şi, respectiv, SEQ ID NO: 62, 13, 14;
(d) SEQ ID NO: 8, 35 şi 40 şi, respectiv, SEQ ID NO: 62, 13, 14;
(e) SEQ ID NO: 8, 35 şi 41 şi, respectiv, SEQ ID NO: 62, 13, 14;
(f) SEQ ID NO: 8, 35 şi 42 şi, respectiv, SEQ ID NO: 62, 13, 14;
(g) SEQ ID NO: 8, 35 şi 43 şi, respectiv, SEQ ID NO: 62, 13, 14;
(h) SEQ ID NO: 8, 35 şi 44 şi, respectiv, SEQ ID NO: 62, 13, 14;
(i) SEQ ID NO: 8, 35 şi 45 şi, respectiv, SEQ ID NO: 62, 13, 14; şi
(j) SEQ ID NO: 8, 35 şi 46 şi, respectiv, SEQ ID NO: 62, 13, 14.
În anumite variante de realizare, anticorpul anti-ADAM9 umanizat sau fragmentul de legare a ADAM9 al acestuia cuprinde un domeniu variabil al lanţului greu (VH) şi un domeniu variabil al lanţului uşor (VL) care au secvenţe care sunt cel puţin 90%, cel puţin 95% sau cel puţin 99% identice cu secvenţele selectate din grupul constând din:
(a) SEQ ID NO:20 şi, respectiv, SEQ ID NO:55;
(b) SEQ ID NO:21 şi, respectiv, SEQ ID NO:55;
(c) SEQ ID NO:22 şi, respectiv, SEQ ID NO:55;
(d) SEQ ID NO:23 şi, respectiv, SEQ ID NO:55;
(e) SEQ ID NO:24 şi, respectiv, SEQ ID NO:55;
(f) SEQ ID NO:25 şi, respectiv, SEQ ID NO:55;
(g) SEQ ID NO:26 şi, respectiv, SEQ ID NO:55;
(h) SEQ ID NO:27 şi, respectiv, SEQ ID NO:55;
(i) SEQ ID NO:28 şi, respectiv, SEQ ID NO:55; şi
(j) SEQ ID NO:29 şi, respectiv, SEQ ID NO:55.
În anumite variante de realizare, anticorpul anti-ADAM9 umanizat sau fragmentul de legare a ADAM9 al acestuia cuprinde un domeniu variabil al lanţului greu (VH) şi un domeniu variabil al lanţului uşor (VL) care are secvenţele selectate din grupul constând din:
(a) SEQ ID NO:20 şi, respectiv, SEQ ID NO:55;
(b) SEQ ID NO:21 şi, respectiv, SEQ ID NO:55;
(c) SEQ ID NO:22 şi, respectiv, SEQ ID NO:55;
(d) SEQ ID NO:23 şi, respectiv, SEQ ID NO:55;
(e) SEQ ID NO:24 şi, respectiv, SEQ ID NO:55;
(f) SEQ ID NO:25 şi, respectiv, SEQ ID NO:55;
(g) SEQ ID NO:26 şi, respectiv, SEQ ID NO:55;
(h) SEQ ID NO:27 şi, respectiv, SEQ ID NO:55;
(i) SEQ ID NO:28 şi, respectiv, SEQ ID NO:55; şi
(j) SEQ ID NO:29 şi, respectiv, SEQ ID NO:55.
În anumite variante de realizare, anticorpul anti-ADAM9 umanizat este un anticorp de lungime completă care cuprinde o regiune Fc. În unele variante de realizare, regiunea Fc este o variantă de regiune Fc care cuprinde: (a) una sau mai multe modificări de aminoacizi care reduc afinitatea variantei de regiune Fc pentru un FcγR selectat din grupul constând din: L234A , L235A şi L234A şi L235A; şi/sau (b) o modificare de aminoacizi care introduce un rest de cisteină la S442, în care numerotarea menţionată este cea din indexul UE Kabat.
În unele variante de realizare, anticorpul anti-ADAM9 umanizat cuprinde un lanţ greu şi un lanţ uşor care au secvenţele selectate din grupul constând din:
(a) SEQ ID NO:51 şi, respectiv, SEQ ID NO:68; şi
(b) SEQ ID NO:52 şi, respectiv, SEQ ID NO:68.
În anumite variante de realizare, anticorpul anti-ADAM9 umanizat cuprinde un lanţ greu şi un lanţ uşor care au secvenţele selectate din grupul constând din:
(a) SEQ ID NO:141 şi, respectiv, SEQ ID NO:68;
(b) SEQ ID NO:142 şi, respectiv, SEQ ID NO:68;
(c) SEQ ID NO:143 şi, respectiv, SEQ ID NO:68;
(d) SEQ ID NO:151 şi, respectiv, SEQ ID NO:68;
(e) SEQ ID NO:152 şi, respectiv, SEQ ID NO:68;
(f) SEQ ID NO:153 şi, respectiv, SEQ ID NO:68; şi
(g) SEQ ID NO:154 şi, respectiv, SEQ ID NO:68.
În anumite variante de realizare, imunoconjugatul conform prezentei invenţii este reprezentat de următoarea formulă:
în care:
CBA este un anticorp anti-ADAM9 sau un fragment de legare a ADAM9 al acestuia astfel cum este descris în prezenta invenţie, care este legat covalent la CyL1 printr-un rest de lizină;
WL este un număr întreg de la 1 până la 20; şi
CyL1 este reprezentat de următoarea formulă:
sau o sare a acestuia acceptabilă din punct de vedere farmaceutic, în care:
linia dublă dintre N şi C reprezintă o legătură simplă sau o legătură dublă, cu condiţia ca, atunci când este o legătură dublă, X să fie absent şi Y să fie -H sau un (C1-C4)alchil; şi atunci când este o legătură simplă, X să fie -H sau o fracţiune de protecţie pentru o amină şi Y să fie -OH sau -SO3H sau o sare a acestuia acceptabilă din punct de vedere farmaceutic;
W' este -NRe',
Re' este -(CH2-CH2-O)n-Rk;
n este un număr întreg de la 2 până la 6;
Rk este -H sau -Me;
Rx3 este un (C1-C6)alchil;
L' este reprezentat de următoarea formulă:
- NR5-P-C(=O)-(CRaRb)m-C(=O)- (B1'); sau
- NR5-P-C(=O)-(CRaRb)m-S-Zs1- (B2');
R5 este -H sau un (C1-C3)alchil;
P este un rest de aminoacid sau o peptidă care conţine între 2 şi 20 resturi de aminoacizi;
Ra şi Rb, la fiecare apariţie, sunt fiecare în mod independent -H, (C1-C3)alchil sau un substituent cu sarcină sau o grupare ionizabilă Q;
m este un număr întreg de la 1 până la 6; şi
Zs1 este selectat din oricare dintre următoarele formule:
în care q este un număr întreg de la 1 până la 5.
În anumite variante de realizare, imunoconjugatul conform prezentei invenţii este reprezentat de următoarea formulă:
în care:
CBA este un anticorp anti-ADAM9 sau un fragment de legare a ADAM9 al acestuia astfel cum este descris în prezenta invenţie, care este legat covalent la CyL2 printr-un rest de lizină;
WL este un număr întreg de la 1 până la 20; şi
CyL2 este reprezentat de următoarea formulă:
sau
sau o sare a acestuia acceptabilă din punct de vedere farmaceutic, în care:
linia dublă dintre N şi C reprezintă o legătură simplă sau o legătură dublă, cu condiţia ca, atunci când este o legătură dublă, X să fie absent şi Y să fie -H sau un (C1-C4)alchil; şi atunci când este o legătură simplă, X să fie -H sau o fracţiune de protecţie pentru o amină şi Y să fie -OH sau -SO3H;
Rx1 şi Rx2 sunt în mod independent (C1-C6)alchil;
Re este -H sau un (C1-C6)alchil;
W' este -NRe',
Re' este -(CH2-CH2-O)n-Rk;
n este un număr întreg de la 2 până la 6;
Rk este -H sau -Me;
Zs1 este selectat din oricare dintre următoarele formule:
în care q este un număr întreg de la 1 până la 5.
În anumite variante de realizare, imunoconjugatul conform prezentei invenţii este reprezentat de următoarea formulă:
în care:
CBA este un anticorp anti-ADAM9 sau un fragment de legare a ADAM9 al acestuia astfel cum este descris în prezenta invenţie, care este legat covalent la CyL3 printr-un rest de lizină;
WL este un număr întreg de la 1 până la 20;
CyL3 este reprezentat de următoarea formulă:
m' este 1 sau 2;
R1 and R2, sunt fiecare în mod independent H sau un (C1-C3)alchil; şi
Zs1 este selectat din oricare dintre următoarele formule:
şi
în care q este un număr întreg de la 1 până la 5.
În anumite variante de realizare, imunoconjugatul conform prezentei invenţii cuprinde un anticorp anti-ADAM9 umanizat sau un fragment de legare a ADAM9 al acestuia legat la maitansinoidul DM4 prin N-succinimidil-4-(2-piridilditio)2-sulfo butanoat (sulfo-SPDB), în care un anticorp anti-ADAM9 umanizat sau un fragment de legare a ADAM9 al acestuia care cuprinde un domeniu CDRH1, un domeniu CDRH2 şi un domeniu CDRH3 şi un domeniu CDRL1, un domeniu CDRL2 şi un domeniu CDRL3 domain care au secvenţele SEQ ID NO: 8, 35 şi 45 şi, respectiv, SEQ ID NO: 62, 13, 14. În anumite variante de realizare, anticorpul anti-ADAM9 umanizat sau fragmentul de legare a ADAM9 al acestuia cuprinde un domeniu variabil al lanţului greu (VH) şi un domeniu variabil al lanţului uşor (VL) care au secvenţele SEQ ID NO:28 şi, respectiv, SEQ ID NO:55. În unele variante de realizare, anticorpul anti-ADAM9 umanizat cuprinde un lanţ greu şi un lanţ uşor care au secvenţele SEQ ID NO:52 şi, respectiv, SEQ ID NO:68. În unele variante de realizare, anticorpul anti-ADAM9 umanizat cuprinde un lanţ greu şi un lanţ uşor care au secvenţele SEQ ID NO: 151 şi, respectiv, SEQ ID NO:68. În unele variante de realizare, X din SEQ ID NO:52 sau SEQ ID NO:151 este lizină. În unele variante de realizare, X din SEQ ID NO:52 sau SEQ ID NO:151 este absent. În anumite variante de realizare, imunoconjugatul conform prezentei invenţii este reprezentat de următoarea formulă:
sau o sare a acestuia acceptabilă din punct de vedere farmaceutic, în care: WL este un număr întreg de la 1 până la 10;
CBA este un anticorp anti-ADAM9 umanizat sau un fragment de legare a ADAM9 al acestuia care cuprinde un domeniu CDRH1, un domeniu CDRH2 şi un domeniu CDRH3 şi un domeniu CDRL1, un domeniu CDRL2 şi un domeniu CDRL3 care au secvenţele SEQ ID NO: 8, 35 şi 45 şi, respectiv, SEQ ID NO: 62, 13, 14. În anumite variante de realizare, anticorpul anti-ADAM9 umanizat sau fragmentul de legare a ADAM9 al acestuia cuprinde un domeniu variabil al lanţului greu (VH) şi un domeniu variabil al lanţului uşor (VL) care au secvenţele SEQ ID NO:28 şi, respectiv, SEQ ID NO:55. În unele variante de realizare, anticorpul anti-ADAM9 umanizat cuprinde un lanţ greu şi un lanţ uşor care au secvenţele SEQ ID NO:52 şi, respectiv, SEQ ID NO:68. În unele variante de realizare, anticorpul anti-ADAM9 umanizat cuprinde un lanţ greu şi un lanţ uşor care au secvenţele SEQ ID NO: 151 şi, respectiv, SEQ ID NO:68. În unele variante de realizare, X din SEQ ID NO:52 sau SEQ ID NO:151 este lizină. În unele variante de realizare, X din SEQ ID NO:52 sau SEQ ID NO:151 este absent. În unele variante de realizare, valoarea DAR pentru o compoziţie (de exemplu compoziţii farmaceutice) care cuprinde imunoconjugatul este cuprinsă în intervalul de 1,0 până la 5,0, 1,0 până la 4,0, 1,0 până la 3,4, 1,0 până la 3,0, 1,5 până la 2,5, 2,0 până la 2,5 sau 1,8 până la 2,2. În unele variante de realizare, DAR este mai mic de 4,0, mai mic de 3,8, mai mic de 3,6, mai mic de 3,5, mai mic de 3,0 sau mai mic de 2,5. În anumite variante de realizare, imunoconjugatul conform prezentei invenţii este reprezentat de următoarea formulă:
în care:
CBA este un anticorp anti-ADAM9 sau un fragment de legare a ADAM9 al acestuia asfel cum este descris în prezenta invenţie, legat covalent la CyC1 printr-un rest de cisteină;
WC este 1 sau 2;
CyC1 este reprezentat de următoarea formulă:
sau
sau o sare a acestuia acceptabilă din punct de vedere farmaceutic, în care:
linia dublă dintre N şi C reprezintă o legătură simplă sau o legătură dublă, cu condiţia ca, atunci când este o legătură dublă, X să fie absent şi Y să fie -H sau un (C1-C4)alchil; şi atunci când este o legătură simplă, X să fie -H sau o fracţiune de protecţie pentru o amină, Y să fie -OH sau -SO3H sau o sare a acestuia acceptabilă din punct de vedere farmaceutic;
R5 este -H sau un (C1-C3)alchil; P este un rest de aminoacid sau o peptidă care conţine 2 până la 20 resturi de aminoacizi;
Ra and Rb, la fiecare apariţie, sunt în mod independent -H, (C1-C3)alchil sau un substituent cu sarcină sau o grupare ionizabilă Q;
W' este -NRe',
Re' este -(CH2-CH2-O)n-Rk;
n este un număr întreg de la 2 până la 6;
Rk este -H sau -Me;
Rx3 este un (C1-C6)alchil; şi
LC este reprezentat de
s1 este situsul legat covalent la CBA, iar s2 este situsul legat covalent la gruparea -C(=O)- de pe CyC1; în care: R19 şi R20, la fiecare apariţie, sunt în mod independent -H sau un (C1-C3)alchil;
m" este un număr întreg cuprins între 1 şi 10; şi
Rh este -H sau un (C1-C3)alchil.
În anumite variante de realizare, imunoconjugatul conform prezentei invenţii este reprezentat de următoarea formulă:
sau o sare a acestuia acceptabilă din punct de vedere farmaceutic, în care: linia dublă dintre N şi C reprezintă o legătură simplă sau o legătură dublă, cu condiţia ca, atunci când este o legătură dublă, X să fie absent şi Y să fie -H, iar atunci când este o legătură simplă, X să fie -H şi Y să fie -SO3H sau o sare a acestuia acceptabilă din punct de vedere farmaceutic;
CBA este un anticorp anti-ADAM9 umanizat sau un fragment de legare a ADAM9 al acestuia care cuprinde un domeniu CDRH1, un domeniu CDRH2 şi un domeniu CDRH3 şi un domeniu CDRL1, un domeniu CDRL2 şi un domeniu CDRL3 care au secvenţele SEQ ID NO: 8, 35 şi 45 şi, respectiv, SEQ ID NO: 62, 13, 14. În anumite variante de realizare, anticorpul anti-ADAM9 umanizat sau fragmentul de legare a ADAM9 al acestuia cuprinde un domeniu variabil al lanţului greu (VH) şi un domeniu variabil al lanţului uşor (VL) care au secvenţele SEQ ID NO:28 şi, respectiv, SEQ ID NO:55. În unele variante de realizare, anticorpul anti-ADAM9 umanizat cuprinde un lanţ greu şi un lanţ uşor care au secvenţele SEQ ID NO: 142 şi, respectiv, SEQ ID NO:68. În unele variante de realizare, X din SEQ ID NO:142 este lizină. În unele variante de realizare, anticorpul anti-ADAM9 umanizat cuprinde un lanţ greu şi un lanţ uşor care au secvenţele SEQ ID NO:152 şi, respectiv, SEQ ID NO:68. În unele variante de realizare, X din SEQ ID NO:142 sau SEQ ID NO:152 este lizină. În unele variante de realizare, X din SEQ ID NO:142 sau SEQ ID NO:152 este absent.
În anumite variante de realizare, imunoconjugatul este reprezentat de următoarea formulă:
în care:
CBA este un anticorp anti-ADAM9 sau un fragment de legare a ADAM9 al acestuia astfel cum este descris în prezenta invenţie, legat covalent la CyC2 printr-un rest de cisteină;
WC este 1 sau 2;
CyC2 este reprezentat de următoarea formulă:
sau
sau o sare a acestuia acceptabilă din punct de vedere farmaceutic, în care:
linia dublă dintre N şi C reprezintă o legătură simplă sau o legătură dublă, cu condiţia ca, atunci când este o legătură dublă, X să fie absent şi Y să fie -H sau un (C1-C4)alchil; şi atunci când este o legătură simplă, X să fie -H sau o fracţiune de protecţie pentru o amină, Y să fie -OH sau -SO3H sau o sare a acestuia acceptabilă din punct de vedere farmaceutic;
Rx1 este un (C1-C6)alchil;
Re este -H sau un (C1-C6)alchil;
W' este -NRe';
Re' este -(CH2-CH2-O)n-Rk;
n este un număr întreg de la 2 până la 6;
Rk este -H sau -Me;
Rx2 este un (C1-C6)alchil;
LC' este reprezentat de următoarea formulă:
în care:
s1 este situsul legat covalent la CBA şi s2 este situsul legat covalent la gruparea -S- de pe CyC2;
Z este -C(=O)-NR9-, sau -NR9-C(=O)-;
Q este -H, un substituent cu sarcină sau o grupare ionizabilă;
R9, R10, R11, R12, R13, R19, R20, R21 şi R22, la fiecare apariţie, sunt în mod independent - H sau un (C1-C3)alchil;
q şi r, la fiecare apariţie, sunt în mod independent un număr întreg cuprins între 0 şi 10;
m şi n sunt fiecare în mod independent un număr întreg cuprins între 0 şi 10;
Rh este -H sau un (C1-C3)alchil; şi
P' este un rest de aminoacid sau o peptidă care conţine 2 până la 20 de resturi de aminoacizi.
În anumite variante de realizare, imunoconjugatul conform prezentei invenţii este reprezentat de următoarea formulă:
în care:
CBA este un anticorp anti-ADAM9 sau un fragment de legare a ADAM9 al acestuia astfel cum este descris în prezenta invenţie, legat covalent la CyC3 printr-un rest de cisteină;
WC este 1 sau 2;
CyC3 este reprezentat de următoarea formulă:
în care:
m' este 1 sau 2;
R1 şi R2, sunt fiecare în mod independent -H sau un (C1-C3)alchil;
LC' este reprezentat de următoarea formulă:
în care:
s1 este situsul legat covalent la CBA şi s2 este situsul legat covalent la gruparea -S- de pe CyC3;
Z este -C(=O)-NR9-, sau -NR9-C(=O)-;
Q este H, un substituent cu sarcină sau o grupare ionizabilă;
R9, R10, R11, R12, R13, R19, R20, R21 and R22, la fiecare apariţie, sunt în mod independent - H sau un (C1-C3)alchil;
q şi r, la fiecare apariţie, sunt în mod independent un număr întreg cuprins
între 0 şi 10;
m şi n sunt fiecare în mod independent un număr întreg cuprins între 0 şi 10;
Rh este -H sau un (C1-C3)alchil; şi
P' este un rest de aminoacid sau o peptidă care conţine 2 până la 20 de resturi de aminoacizi.
În anumite variante de realizare, imunoconjugatul conform prezentei invenţii este reprezentat de următoarea formulă:
sau o sare a acestuia acceptabilă din punct de vedere farmaceutic, în care:
DM este o fracţiune medicamentoasă reprezentată de următoarea formulă:
WC este 1 sau 2;
CBA este un anticorp anti-ADAM9 umanizat sau un fragment de legare a ADAM9 al acestuia care cuprinde un domeniu CDRH1, un domeniu CDRH2 şi un domeniu CDRH3 şi un domeniu CDRL1, un domeniu CDRL2 şi un domeniu CDRL3 care au secvenţele SEQ ID NO: 8, 35 şi 45 şi, respectiv, SEQ ID NO: 62, 13, 14. În anumite variante de realizare, anticorpul anti-ADAM9 umanizat sau fragmentul de legare a ADAM9 al acestuia cuprinde un domeniu variabil al lanţului greu (VH) şi un domeniu variabil al lanţului uşor (VL) care au secvenţele SEQ ID NO:28 şi, respectiv, SEQ ID NO:55. În unele variante de realizare, anticorpul anti-ADAM9 umanizat cuprinde un lanţ greu şi un lanţ uşor care au secvenţele SEQ ID NO: 142 şi, respectiv, SEQ ID NO:68. În unele variante de realizare, anticorpul anti-ADAM9 umanizat cuprinde un lanţ greu şi un lanţ uşor care au secvenţele SEQ ID NO: 152 şi, respectiv, SEQ ID NO:68. În unele variante de realizare, X din SEQ ID NO:142 sau SEQ ID NO: 152 este lizină. În unele variante de realizare, X din SEQ ID NO:142 sau SEQ ID NO:152 este absent. În unele variante de realizare, Wc este 2.
În anumite variante de realizare, imunoconjugatul conform prezentei invenţii este reprezentat de următoarea formulă:
sau o sare a acestuia acceptabilă din punct de vedere farmaceutic, în care:
DM este o fracţiune medicamentoasă reprezentată de următoarea formulă:
CBA este un anticorp anti-ADAM9 umanizat sau un fragment de legare a ADAM9 al acestuia care cuprinde un domeniu CDRH1, un domeniu CDRH2 şi un domeniu CDRH3 şi un domeniu CDRL1, un domeniu CDRL2 şi un domeniu CDRL3 care au secvenţele SEQ ID NO: 8, 35 şi 45 şi, respectiv, SEQ ID NO: 62, 13, 14. În anumite variante de realizare, anticorpul anti-ADAM9 umanizat sau fragmentul de legare a ADAM9 al acestuia cuprinde un domeniu variabil al lanţului greu (VH) şi un domeniu variabil al lanţului uşor (VL) care au secvenţele SEQ ID NO:28 şi, respectiv, SEQ ID NO:55. În unele variante de realizare, anticorpul anti-ADAM9 umanizat cuprinde un lanţ greu şi un lanţ uşor care au secvenţele SEQ ID NO: 142 şi, respectiv, SEQ ID NO:68. În unele variante de realizare, anticorpul anti-ADAM9 umanizat cuprinde un lanţ greu şi un lanţ uşor care au secvenţele SEQ ID NO: 152 şi, respectiv, SEQ ID NO:68.; şi
Wc este 1 sau 2. În unele variante de realizare, Wc este 2.
Un alt aspect al prezentei invenţii este prezentat în revendicarea 15 şi furnizează o compoziţie farmaceutică ce cuprinde o cantitate eficientă de imunoconjugat astfel cum este descris în prezenta invenţie şi un purtător, excipient sau diluant acceptabil din punct de vedere farmaceutic.
Un alt aspect al prezentei invenţii este prezentat în revendicarea 16 şi furnizează imunoconjugatul sau compoziţia farmaceutică pentru utilizare într-un procedeu de tratare a unei boli sau afecţiuni asociate cu sau caracterizate prin expresia ADAM9 la un subiect, care cuprinde administrarea la subiectul menţionat a unei cantităţi eficiente de imunoconjugat sau compoziţie farmaceutică. În anumite variante de realizare, boala sau afecţiunea asociată cu sau caracterizată prin expresia ADAM9 este cancer. În unele variante de realizare, cancerul este selectat din grupul constând din cancer pulmonar cu celule non-mici, cancer colorectal, cancer gastric, cancer pancreatic, carcinom celular renal, cancer de prostată, cancer esofagian, cancer mamar, cancer de cap şi gât, cancer ovarian, cancer hepatic, cancer de col uterin, cancer tiroidian, cancer testicular, cancer mieloid, melanom şi cancer limfoid. În anumite variante de realizare, cancerul pulmonar cu celule non-mici este carcinom cu celule scuamoase, adenocarcinom sau carcinom nediferenţiat cu celule mari. În anumite variante de realizare, cancerul colorectal este adenocarcinom, tumori carcinoide gastrointestinale, tumori stromale gastrointestinale, limfom colorectal primar, leiomiosarcom sau carcinom cu celule scuamoase.
SCURTĂ DESCRIERE A FIGURILOR
În următoarele exemple, imunoconjugaţii care cuprind chMAB-A sau hMAB-A(2.2) sunt prezentaţi doar în scop ilustrativ şi nu fac parte din invenţia revendicată în prezentul document.
FIG. 1A-1C ilustrează rezultatele unor studii de imunohistochimie (IHC) şi ilustrează capacitatea MAB-A de a eticheta în mod specific o varietate de tipuri de cancer pulmonar cu celule non-mici (FIG. 1A), celule de cancer mamar, celule de cancer de prostată, celule de cancer gastric (FIG. 1B) şi celule de cancer de colon (FIG. 1C), în timp ce controlul izotipului nu a reuşit să eticheteze în mod specific niciunul dintre aceste tipuri de celule canceroase (FIG. 1A-1C).
FIG. 2 ilustrează rezultatele studiilor de colorare celulară şi ilustrează faptul că MAB-A se leagă la ADAM9 umană şi, într-o măsură mai mică, la ADAM9 de maimuţă cynomolgus, exprimată tranzitoriu pe suprafaţa celulelor 293-FT şi CHO-K (panoul de sus şi respectiv de jos).
FIG. 3A-3B ilustrează secvenţele de aminoacizi ale domeniului murinic anti-ADAM9-VH aliniate cu mai multe variante umanizate/optimizate de MAB-A (FIG. 3A, SEQ ID NO:7, 16, 17, 18,19, 21, 22, 23 şi 28) şi domeniul murinic anti-ADAM9-VL aliniat cu mai multe variante umanizate/optimizate de MAB-A (FIG. 3B, SEQ ID NO:11, 51, 52, 53 şi 54). Poziţiile substituite în cadrul CDR în timpul optimizării iniţiale sunt subliniate după cum urmează: situsurile potenţiale de deamidare şi izomerare sunt indicate cu o singură subliniere, resturile de lizină sunt indicate cu dublă subliniere, resturile labile suplimentare sunt indicate cu o subliniere dublă întreruptă. FIG. 4A-4B ilustrează curbele de legare ELISA ale celor zece clone hMAB-A optimizate selectate care cuprind variante de CDRH3, hMAB-A parental (2.2) şi un anticorp izotip martor. FIG. 4A ilustrează curbele de legare pentru cynoADAM9 şi FIG. 4B ilustrează curbele de legare pentru huADAM9.
FIG. 5A-5B ilustrează curbele de legare ELISA ale variantelor Fc. FIG. 5A ilustrează curbele de legare pentru cynoADAM9 şi FIG. 5B ilustrează curbele de legare pentru huADAM9.
FIG. 6A-6B ilustrează colorarea membranei ADAM9 IHC într-o micromatrice de ţesut de carcinom 20 şi, respectiv, colorarea membranei ADAM IHC şi citoplasmatică în opt indicaţii selectate.
FIG. 7A-7B ilustrează internalizarea pulsului şi internalizarea continuă a diverşilor conjugaţi ai anticorpilor anti-ADAM9.
FIG. 8A-8D ilustrează curbele de legare FACS ale anticorpilor chMAB-A, hMAB-A(2.2), hMAB-A(2C.2) şi hMAB-A(2I.2) şi imunoconjugaţii corespunzători ai acestora.
FIG. 9A-9H ilustrează citotoxicitatea in vitro a diverşilor imunoconjugaţi anti-ADAM9 (hMAB-A(2.2)-sSPDB-DM4, hMAB-A(2I.2)-sSPDB-DM4, hMAB-A(2.2)-DGN549 şi hMAB- A(2I.2)-S442C-DGN549) pe un panou larg de linii de celule tumorale pozitive ADAM9. Conjugaţii pe bază de IgG1 fără ţintire sunt incluşi ca martori negativi.
FIG. 10 ilustrează activitatea antitumorală a hMAB-A(2.2)-sSPDB-DM4 (1,25 mg/kg, 2,5 mg/kg, 5 mg/kg, în funcţie de anticorp) şi chMAB-A-DGN549 (10µg/kg, în funcţie de sarcina utilă) la modelul de xenogrefă de adenocarcinom pulmonar uman cu celule non-mici Calu-3.
FIG. 11 ilustrează activitatea antitumorală a hMAB-A(2I.2)-S442C-DGN549 (0,5µg/kg, 1µg/kg, 3µg/kg şi 10µg/kg, în funcţie de sarcina utilă) la modelul de xenogrefă de adenocarcinom pulmonar uman cu celule non-mici Calu-3.
FIG. 12 ilustrează activitatea antitumorală a hMAB-A(2.2)-sSPDB-DM4 (1,25 mg/kg, 2,5 mg/kg, 5 mg/kg, în funcţie de anticorp) la modelul de xenogrefă de carcinom cu celule scuamoase cu celule non-mici H1703.
FIG. 13 ilustrează activitatea antitumorală a chMAB-A-sSPDB-DM4 (1,25 mg/kg, 2,5 mg/kg, 5 mg/kg) la modelul de carcinom cu celule scuamoase de cap şi gât Detroit562 (volum tumoral 95,76 până la 450,83 mm3).
FIG. 14 ilustrează activitatea antitumorală a chMAB-A-sSPDB-DM4 (1,25 mg/kg şi 5 mg/kg) la modelul de carcinom cu celule scuamoase de cap şi gât Detroi562 (volum tumoral 277,51 până la 503,49 mm3).
FIG. 15 ilustrează activitatea antitumorală a huMAB-A(2I.2)-S442C-DGN549 la modelul de xenogrefă de carcinom gastric SNU-5.
FIG. 16 ilustrează activitatea antitumorală a huMAB-A(2.2)-sSPDB-DM4 la modelul de xenogrefă de carcinom gastric SNU-5.
FIG. 17 ilustrează activitatea antitumorală a huMAB-A(2I.2)-S442C-DGN549 la modelul de xenogrefă de cancer colorectal SW48.
FIG. 18 ilustrează activitatea antitumorală a huMAB-A(2.2)-sSPDB-DM4 la modelul de xenogrefă de cancer colorectal SW48.
FIG. 19A ilustrează legarea a 250nM & 1000nM huFcRn la anticorpii anti-ADAM9 capturaţi cu şi fără mutaţia YTE la pH 6,0.
FIG. 19B ilustrează legarea a 25nM & 100nM anticorpi anti-ADAM9 cu şi fără mutaţia YTE la FcRn imobilizat la pH 6,0.
FIG. 20 ilustrează datele PK conjugat anticorp-medicament pentru hMAB-A(2I.2)-sSPDB-DM4 şi hMAB-A(2I.2)-YTE-sSPDB-DM4 la maimuţa cynomolgus atât la 4mg/kg cât şi la 12 mg/kg (doză de anticorpi).
DESCRIEREA DETALIATĂ A INVENŢIEI
Prezenta invenţie se referă la imunoconjugaţi care cuprind un anticorp sau un fragment al acestuia capabil să se lege în mod specific la "Proteina 9 care conţine domeniul de dezintegrină şi metaloproteinază" ("ADAM9") conjugată cu cel puţin un agent farmacologic astfel cum este definit în revendicarea 1. Imunoconjugaţii sunt reactivi încrucişat cu ADAM9 umană şi ADAM9 de primată non-umană (o maimuţă cynomolgus). Imunoconjugaţii cuprind un domeniu variabil al lanţului uşor (VL) şi/sau un domeniu variabil al lanţului greu (VH) care a fost umanizat (şi în mod opţional deimunizat) astfel încât să prezinte o imunogenitate redusă la administrarea unor astfel de imunoconjugaţi la un subiect destinatar. Invenţia se referă, de asemenea, la compoziţii farmaceutice astfel cum sunt definite în revendicarea 15 care conţin oricare dintre astfel de imunoconjugaţi şi la imunoconjugaţi sau compoziţii farmaceutice pentru utilizare în tratamentul unei boli sau afecţiuni asociate cu sau caracterizate prin expresia ADAM9 (cum ar fi cancer) astfel cum este definit în revendicările 16 şi 17.
I. Anticorpii şi domeniile de legare ale acestora
Imunoconjugaţii conform prezentei invenţii cuprind un anticorp care se leagă la ADAM9 sau un fragment de legare a ADAM9 al acestuia. "Anticorpii" sunt molecule de imunoglobulină capabile de legarea specifică la o ţintă, cum ar fi un carbohidrat, polinucleotidă, lipidă, polipeptidă etc., prin cel puţin un situs de recunoaştere a antigenului, situat în domeniul variabil al moleculei de imunoglobulină. Astfel cum sunt utilizaţi în prezenta invenţie, termenii "anticorp" şi "anticorpi" se referă la anticorpi monoclonali, anticorpi multispecifici, anticorpi umani, anticorpi umanizaţi, anticorpi sintetici, anticorpi himerici, anticorpi policlonali, anticorpi camelizaţi, Fv cu un singur lanţ (scFv), anticorpi cu un singur lanţ, fragmente Fab, fragmente F(ab'), intracorpi şi fragmente de legare a epitopilor ale oricărora dintre cele menţionate anterior. În special, termenul "anticorp" include molecule de imunoglobulină şi fragmente active din punct de vedere imunologic de molecule de imunoglobulină, adică molecule care conţin un situs de legare a epitopilor. Moleculele de imunoglobulină pot fi de orice tip (de exemplu IgG, IgE, IgM, IgD, IgA şi IgY), clasă (de exemplu IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 şi IgA2) sau subclasă. În ultimele decenii s-a înregistrat o renaştere a interesului faţă de potenţialul terapeutic al anticorpilor, iar anticorpii au devenit una dintre clasele de top de medicamente derivate din biotehnologie (Chan, C.E. şi colab. (2009) "The Use Of Antibodies In The Treatment Of Infectious Diseases," Singapore Med. J. 50(7):663-666). Pe lângă utilizarea acestora în diagnosticare, anticorpii s-au dovedit a fi utili ca agenţi terapeutici. Peste 200 de medicamente pe bază de anticorpi au fost aprobate pentru utilizare sau sunt în curs de dezvoltare.
Anticorpii sunt capabili să se "lege imunospecific" la o polipeptidă sau o
moleculă proteică sau non-proteică datorită prezenţei pe o astfel de moleculă a unui anumit domeniu sau fracţiune sau conformaţie (un "epitop"). O moleculă care conţine un epitop poate avea activitate imunogenă, astfel încât determină un răspuns de producere de anticorpi la un animal; astfel de molecule sunt denumite "antigeni". Astfel cum este utilizat în prezenta invenţie, se spune că un anticorp se leagă "imunospecific" la o regiune a altei molecule (adică un epitop) dacă reacţionează sau se asociază mai frecvent, mai rapid, cu o durată mai mare şi/sau cu o afinitate mai mare cu acel epitop în comparaţie cu epitopii alternativi. De exemplu, un anticorp care se leagă imunospecific la un epitop viral este un anticorp care se leagă la acel epitop viral cu o afinitate, aviditate mai mare, mai uşor, şi/sau cu o durată mai mare decât se leagă imunospecific la alţi epitopi virali sau epitopi nevirali. Se înţelege, de asemenea, citind această definiţie, faptul că, de exemplu, un anticorp (sau o fracţiune sau un epitop) care se leagă imunospecific la o primă ţintă se poate lega sau nu în mod specific sau preferenţial la o a doua ţintă. Ca atare, "legarea imunospecifică" la un anumit epitop nu necesită neapărat (deşi poate include) legarea exclusivă la acel epitop. În general, dar nu neapărat, referirea la legare semnifică legare "imunospecifică". Se spune că două molecule sunt capabile să se lege una la cealaltă într-o manieră "fiziospecific", dacă o astfel de legare prezintă specificitatea cu care receptorii se leagă de liganzii respectivi ai acestora.
Termenul "anticorp monoclonal" se referă la o populaţie omogenă de anticorpi în care anticorpul monoclonal este compus din aminoacizi (care apar în mod natural sau care apar în mod nenatural) care sunt implicaţi în legarea selectivă a unui antigen. Anticorpii monoclonali sunt foarte specifici, fiind direcţionaţi împotriva unui singur epitop (sau situs antigenic). Termenul „anticorp monoclonal» cuprinde nu doar anticorpi monoclonali intacţi şi anticorpi monoclonali cu lungime completă, ci şi fragmente ale acestora (cum ar fi Fab, Fab', F(ab')2 Fv), cu un singur lanţ (scFv), mutanţi ai acestora, proteine de fuziune care cuprind o porţiune de anticorp, anticorpi monoclonali umanizaţi, anticorpi monoclonali himerici şi orice altă configuraţie modificată a moleculei de imunoglobulină care cuprinde un situs de recunoaştere a antigenului cu specificitatea necesară şi capacitatea de a se lega la un antigen. Termenul nu se intenţionează să fie limitat în ceea ce priveşte sursa anticorpului sau modul în care este produs (de exemplu prin hibridom, selecţie de fagi, expresie recombinată, animale transgenice etc.). Termenul include imunoglobuline întregi precum şi fragmentele etc. descrise anterior sub definiţia termenului "anticorp". Procedeele de producere a anticorpilor monoclonali sunt cunoscute în stadiul tehnicii. Un procedeu care poate fi utilizat este procedeul lui Kohler, G. şi colab. (1975) "Continuous Cultures Of Fused Cells Secreting Antibody Of Predefined Specificity," Nature 256:495-497 sau o modificare a acestuia. De obicei, anticorpii monoclonali sunt dezvoltaţi la şoareci, şobolani sau iepuri. Anticorpii sunt produşi prin imunizarea unui animal cu o cantitate imunogenă de celule, extracte celulare sau preparate proteice care conţin epitopul dorit. Imunogenul poate fi, dar fără a se limita la, celule primare, linii celulare cultivate, celule canceroase, proteine, peptide, acizi nucleici sau ţesut. Celulele utilizate pentru imunizare pot fi cultivate pentru o perioadă de timp (de exemplu cel puţin 24 de ore) înainte de utilizarea acestora ca imunogen. Celulele pot fi utilizate ca imunogeni singure sau în combinaţie cu un adjuvant nedenaturant, cum ar fi Ribi (a se vedea, de exemplu, Jennings, V.M. (1995) "Review of Selected Adjuvants Used in Antibody Production," ILAR J. 37(3):119-125). În general, celulele ar trebui să fie păstrate intacte şi, de preferat, viabile atunci când sunt utilizate ca imunogeni. Celulele intacte pot permite ca antigenii să fie mai bine detectaţi decât celulele rupte de către animalul imunizat. Utilizarea adjuvanţilor denaturanţi sau duri, de exemplu adjuvantul Freund, poate rupe celulele şi, prin urmare, este descurajată. Imunogenul poate fi administrat de mai multe ori la intervale periodice, cum ar fi de două ori pe săptămână sau săptămânal, sau poate fi administrat în aşa fel încât să menţină viabilitatea la animal (de exemplu într-un recombinant tisular). În mod alternativ, anticorpii monoclonali existenţi şi orice alţi anticorpi echivalenţi care sunt imunospecifici pentru un epitop patogen dorit pot fi secvenţiaţi şi produşi recombinant prin orice mijloace cunoscute în stadiul tehnicii. Într-o variantă de realizare, un astfel de anticorp este secvenţiat şi secvenţa de polinucleotide este apoi clonată într-un vector pentru expresie sau propagare. Secvenţa care codifică anticorpul de interes poate fi menţinută într-un vector într-o celulă gazdă şi celula gazdă poate fi apoi extinsă şi congelată pentru utilizare ulterioară. Secvenţa de polinucleotide a unor astfel de anticorpi poate fi utilizată pentru manipularea genetică pentru a genera o afinitate optimizată, un anticorp himeric, un anticorp umanizat şi/sau un anticorp caninizat, pentru a îmbunătăţi afinitatea sau alte caracteristici ale anticorpului, precum şi imunoconjugaţii conform invenţiei. Principiul general în umanizarea unui anticorp implică reţinerea secvenţei de bază a porţiunii de legare a antigenului a anticorpului, în timp ce se schimbă restul
non-uman al anticorpului cu secvenţe de anticorp uman.
Anticorpii naturali (cum ar fi anticorpii naturali IgG) sunt alcătuiţi din două "lanţuri uşoare" complexate cu două "lanţuri grele." Fiecare lanţ uşor conţine un domeniu variabil ("VL") şi un domeniu constant ("CL"). Fiecare lanţ greu conţine un domeniu variabil ("VH"), trei domenii constante ("CH1," "CH2" şi "CH3") şi o regiune de "articulaţie" ("H") situată între domeniile CH1 şi CH2. Spre deosebire de acestea, scFv sunt molecule cu un singur lanţ realizate prin legarea domeniilor variabile ale lanţului uşor şi greu printr-o peptidă de legătură scurtă. Prin urmare, unitatea structurală de bază a imunoglobulinelor care apar în mod natural (de exemplu IgG) este un tetramer care are două lanţuri uşoare şi două lanţuri grele, de obicei exprimate ca o glicoproteină de aproximativ 150.000 Da. Porţiunea amino-terminală ("N-terminală") a fiecărui lanţ include un domeniu variabil de aproximativ 100 până la 110 sau mai mulţi aminoacizi responsabili în primul rând pentru recunoaşterea antigenului. Porţiunea carboxi-terminală ("C-terminală") a fiecărui lanţ defineşte o regiune constantă, cu lanţuri uşoare care au un singur domeniu constant şi lanţuri grele care au de obicei trei domenii constante şi o regiune de articulaţie. Prin urmare, structura lanţurilor uşoare ale unei molecule de IgG este n-VL-CL-c, iar structura lanţurilor grele de IgG este n-VH-CH1-H-CH2-CH3-c (unde n şi c reprezintă capătul N-terminal şi, respectiv, capătul C-terminal al polipeptidei).
A. Caracteristicile domeniilor variabile ale anticorpilor
Domeniile variabile ale unei molecule de IgG constă din 1, 2 şi, cel mai frecvent, 3 regiuni de determinare a complementarităţii ("CDR", adică CDR1, CDR2 şi, respectiv, CDR3), care conţin resturile aflate în contact cu epitopul şi segmente non-CDR, denumite regiuni cadru ("FR"), care, în general, menţin structura şi determină poziţionarea regiunilor CDR astfel încât să permită o astfel de intrare în contact (deşi anumite resturi cadru pot intra în contact, de asemenea, şi cu epitopul). Prin urmare, domeniile VL şi VH au de obicei structura: n-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4-c (unde "n" desemnează capătul N-terminal şi "c" desemnează capătul C-terminal). Polipeptidele care sunt (sau pot servi ca) primul, cel de-al doilea, cel de-al treilea şi cel de-al patrulea FR al lanţului uşor al unui anticorp sunt denumite în prezenta invenţie, respectiv: domeniul FRL1, domeniul FRL2, domeniul FRL3 şi domeniul FRL4. În mod similar, polipeptidele care sunt (sau pot servi ca) primul, cel de-al doilea, cel de-al treilea şi cel de-al patrulea FR al lanţului greu al unui anticorp sunt denumite în prezenta invenţie, respectiv: domeniul FRH1, domeniul FRH2, domeniul FRH3 şi domeniul FRH4. Polipeptidele care sunt (sau pot servi ca) primul, cel de-al doilea şi cel de-al treilea CDR al lanţului uşor al unui anticorp sunt denumite în prezenta invenţie, respectiv: domeniul CDRL1, domeniul CDRL2 şi domeniul CDRL3. În mod similar, polipeptidele care sunt (sau pot servi ca) primul, cel de-al doilea şi cel de-al treilea CDR al lanţului greu al unui anticorp sunt denumite în prezenta invenţie, respectiv: domeniul CDRH1, domeniul CDRH2 şi domeniul CDRH3. Prin urmare, termenii domeniu CDRL1, domeniu CDRL2, domeniu CDRL3, domeniu CDRH1, domeniu CDRH2 şi domeniu CDRH3 sunt direcţionaţi către polipeptide care, atunci când sunt încorporate într-un anticorp, determină anticorpul să fie capabil să se lege la un anumit epitop.
În cuprinsul prezentei specificaţii, numerotarea resturilor în domeniile variabile ale lanţurilor grele şi uşoare mature de imunoglobuline sunt desemnate prin poziţia unui aminoacid în lanţ. Kabat a descris numeroase secvenţe de aminoacizi pentru anticorpi, a identificat o secvenţă consens de aminoacizi pentru fiecare subgrup şi a atribuit un număr de rest fiecărui aminoacid, iar CDR sunt identificate astfel cum sunt definite în Kabat (se va înţelege faptul că CDRH1 astfel cum este definit de Chothia, C. & Lesk, A. M. ((1987) "Canonical structures for the hypervariable regions of immunoglobulins," J. Mol. Biol. 196:901-917) începe cu cinci resturi mai devreme). Schema de numerotare Kabat se poate extinde la anticorpii care nu sunt incluşi în compendiul său prin alinierea anticorpului în cauză cu una dintre secvenţele consens din Kabat prin referire la aminoacizii conservaţi. Acest procedeu de atribuire a numerelor de resturi a devenit standard în domeniu şi identifică cu uşurinţă aminoacizii din poziţii echivalente în diverşi anticorpi, inclusiv variante himerice sau umanizate. De exemplu, un aminoacid din poziţia 50 a unui lanţ uşor de anticorp uman ocupă poziţia echivalentă cu un aminoacid din poziţia 50 a unui lanţ uşor de anticorp de şoarece. Capacitatea unui anticorp de a se lega la un epitop al unui antigen depinde de prezenţa şi secvenţa de aminoacizi a domeniilor VL şi VH ale anticorpului. Interacţiunea lanţului uşor şi lanţului greu al unui anticorp şi, în special, interacţiunea domeniilor VL şi VH ale acestuia formează unul dintre cele două situsuri de legare a epitopului ale unui anticorp natural, cum ar fi o IgG. Anticorpii naturali sunt capabili să se lege doar la o singură specie de epitop (adică sunt monospecifici), deşi se pot lega la copii multiple ale acelei specii de epitop (adică prezintă bivalenţă sau multivalenţă). În consecinţă, astfel cum este utilizat în prezenta invenţie, termenul "fragment de legare a epitopului" semnifică un fragment al unui anticorp capabil să se lege imunospecific la un epitop, iar termenul "situs de legare a epitopului" se referă la o porţiune a unei molecule care cuprinde un fragment de legare a epitopului. Un fragment de legare a epitopului poate conţine oricare 1, 2, 3, 4 sau 5 domenii CDR ale unui anticorp sau poate conţine toate cele 6 domenii CDR ale unui anticorp şi, deşi este capabil să se lege imunospecific la un astfel de epitop, poate prezenta o imunospecificitate, afinitate sau selectivitate faţă de un astfel de epitop care diferă de cea a unui astfel de anticorp. De preferat, cu toate acestea, un fragment de legare a epitopului va conţine toate cele 6 domenii CDR ale unui astfel de anticorp. Un fragment de legare a epitopului al unui anticorp poate fi un singur lanţ polipeptidic ( de exemplu un scFv) sau poate cuprinde două sau mai multe lanţuri polipeptidice, fiecare având un capăt amino terminal şi un capăt carboxi terminal ( de exemplu un fragment Fab, un fragment Fab2 etc.). Cu excepţia cazului în care este menţionat în mod specific, ordinea domeniilor moleculelor de proteine descrise în prezenta invenţie este în direcţia "capătul N-terminal către capătul C-terminal". Invenţia cuprinde, de asemenea, imunoconjugaţi care cuprind fragmente de domeniu variabil cu un singur lanţ ("scFv") care cuprind un domeniu anti-ADAM9-VL şi/sau VH conform invenţiei. Fragmentele domeniului variabil cu un singur lanţ cuprind domeniile VL şi VH care sunt legate utilizând o peptidă scurtă "linker". Astfel de linkeri pot fi modificaţi pentru a furniza funcţii suplimentare, cum ar fi pentru a permite ataşarea unui medicament sau pentru a permite ataşarea la un suport solid. Variantele cu un singur lanţ pot fi produse fie recombinant, fie sintetic. Pentru producţia sintetică de scFv, poate fi utilizat un sintetizator automat. Pentru producerea recombinantă de scFv, o plasmidă adecvată care conţine o polinucleotidă care codifică scFv poate fi introdusă într-o celulă gazdă adecvată, fie eucariotă, cum ar fi celule de drojdie, plante, insecte sau mamifere, fie procariotă, cum ar fi E. coli. Polinucleotidele care codifică scFv de interes pot fi realizate prin manipulări de rutină, cum ar fi legarea polinucleotidelor. ScFv rezultat poate fi izolat utilizând tehnici standard de purificare a proteinelor cunoscute în stadiul tehnicii. Termenul anticorp "umanizat" se referă la o moleculă himerică ce are un situs de legare a epitopului unei imunoglobuline dintr-o specie non-umană şi o structură de imunoglobulină rămasă care se bazează pe structura şi /sau secvenţa unei imunoglobuline umane. Anticorpii umanizaţi sunt în general preparaţi utilizând tehnici recombinante. Imunoconjugaţii conform prezentei invenţii pot cuprinde variante umanizate, himerice sau caninizate ale unui anticorp care este desemnat în prezenta invenţie ca "MAB-A". Secvenţele polinucleotidice care codifică domeniile variabile ale MAB-A pot fi utilizate pentru manipularea genetică pentru a genera derivaţi MAB-A care posedă caracteristici îmbunătăţite sau modificate (de exemplu afinitate, reactivitate încrucişată, specificitate etc.). Principiul general în umanizarea unui anticorp implică reţinerea secvenţei de bază a porţiunii de legare a epitopului a anticorpului, în timpul schimbării restului non-uman al anticorpului cu secvenţe de anticorpi umani. Există patru etape generale pentru umanizarea unui anticorp monoclonal. Acestea sunt: (1) determinarea nucleotidei şi a secvenţei de aminoacizi prezise a domeniului variabil uşor şi greu al anticorpului iniţial; (2) conceperea anticorpului umanizat sau a anticorpului caninizat, adică decizia regiunii cadru a anticorpului care să fie utilizată în timpul procesului de umanizare sau caninizare; (3) utilizarea metodologiilor/tehnicilor propriu-zise de umanizare sau caninizare; şi (4) transfectarea şi expresia anticorpului umanizat. A se vedea, de exemplu, Brevetele SUA nr. 4,816,567; 5,807,715; 5,866,692; şi 6,331,415. Termenul anticorp "optimizat" se referă la un anticorp care are cel puţin un aminoacid care este diferit de anticorpul părinte în cel puţin o regiune de determinare a complementarităţii (CDR) din regiunea variabilă a lanţului uşor sau greu, care conferă o afinitate de legare mai crescută, de exemplu o afinitate de legare (de 2 ori sau mai mare) mai crescută, la ADAM9 umană şi/sau ADAM9 de maimuţă cynomolgus, în comparaţie cu anticorpul parental. Se va înţelege din informaţiile furnizate în prezenta invenţie faptul că anticorpii conform invenţiei sunt umanizaţi şi în mod opţional optimizaţi. Situsul de legare a epitopului poate cuprinde fie un domeniu variabil complet fuzionat cu unul sau mai multe domenii constante, fie doar CDR ale unui astfel de domeniu variabil grefate în regiuni cadru adecvate. Situsurile de legare a epitopului pot fi de tip sălbatic sau pot fi modificate prin una sau mai multe substituţii, inserţii sau deleţii de aminoacizi. O astfel de acţiune elimină parţial sau complet capacitatea regiunii constante de a servi ca imunogen la beneficiari (de exemplu indivizi umani), cu toate acestea, posibilitatea unui răspuns imun la domeniul variabil străin rămâne (LoBuglio, A.F. şi colab. (1989) "Mouse/Human Chimeric Monoclonal Antibody In Man: Kinetics And Immune Response," Proc. Natl. Acad. Sci. (S.U.A.) 86:4220-4224). O altă abordare se concentrează nu doar pe furnizarea de regiuni constante derivate de la om, ci şi pe modificarea domeniilor variabile, precum şi pentru a le remodela cât mai aproape de o formă găsită la imunoglobulinele umane. Se ştie faptul că domeniile variabile ale lanţurilor grele şi uşoare ale anticorpilor conţin trei CDR care variază ca răspuns la antigenii în cauză şi determină capacitatea de legare, flancate de cele patru regiuni cadru, care sunt relativ conservate la o specie dată şi care se presupune că furnizează o schelă pentru CDR. Atunci când anticorpii non-umani sunt preparaţi cu privire la un anumit antigen, domeniile variabile pot fi "reformate" sau "umanizate" prin grefarea CDR derivate din anticorpi non-umani pe FR prezente în anticorpul uman care urmează să fie modificat. Aplicarea acestei abordări la diverşi anticorpi a fost raportată de Sato, K. şi colab. (1993) Cancer Res 53:851-856. Riechmann, L. şi colab. (1988) "Reshaping Human Antibodies for Therapy," Nature 332:323-327; Verhoeyen, M. şi colab. (1988) "Reshaping Human Antibodies: Grafting An Antilysozyme Activity," Science 239:1534-1536; Kettleborough, C. A. şi colab. (1991) "Humanization Of A Mouse Monoclonal Antibody By CDR-Grafting: The Importance Of Framework Residues On Loop Conformation," Protein Engineering 4:773-3783; Maeda, H. şi colab. (1991) "Construction Of Reshaped Human Antibodies With HIV-Neutralizing Activity," Human Antibodies Hybridoma 2:124-134; Gorman, S. D. şi colab. (1991) "Reshaping A Therapeutic CD4 Antibody," Proc. Natl. Acad. Sci. (S.U.A.) 88:4181-4185; Tempest, P.R. şi colab. (1991) "Reshaping A Human Monoclonal Antibody To Inhibit Human Respiratory Syncytial Virus Infection in vivo," Bio/Technology 9:266-271; Co, M. S. şi colab. (1991) "HumanizedAntibodies For Antiviral Therapy," Proc. Natl. Acad. Sci. (S.U.A.) 88:2869-2873; Carter, P. şi colab. (1992) "Humanization Of An Anti-p185her2 Antibody For Human Cancer Therapy," Proc. Natl. Acad. Sci. (S.U.A.) 89:4285-4289; şi Co, M.S. şi colab. (1992) "Chimeric And Humanized Antibodies With Specificity For The CD33 Antigen," J. Immunol. 148:1149-1154. Conform invenţiei revendicate, anticorpii umanizaţi au una sau mai multe CDR (unu, doi, trei, patru sau cinci) care diferă în ceea ce priveşte secvenţa în raport cu CDR ale anticorpului original. Au fost descrise o serie de molecule de anticorpi umanizaţi care cuprind un situs de legare a epitopului derivat dintr-o imunoglobulină non-umană, inclusiv anticorpi himerici care au un domeniu variabil de rozătoare sau modificat de rozătoare şi regiuni de determinare a complementarităţii (CDR) ale acestora asociate fuzionate cu domeniile constante umane (a se vedea, de exemplu, Winter şi colab. (1991) "Man-made Antibodies," Nature 349:293-299; Lobuglio şi colab. (1989) "Mouse/Human Chimeric Monoclonal Antibody In Man: Kinetics And Immune Response," Proc. Natl. Acad. Sci. (S.U.A.) 86:4220-4224; Shaw şi colab. (1987) "Characterization Of A Mouse/Human Chimeric Monoclonal Antibody (17-1A) To A Colon Cancer Tumor-Associated Antigen," J. Immunol. 138:4534-4538; şi Brown şi colab. (1987) "Tumor-Specific Genetically Engineered Murine/Human Chimeric Monoclonal Antibody," Cancer Res. 47:3577-3583). Alte referinţe descriu CDR de rozătoare grefate într-o regiune cadru (FR) umană de suport înainte de fuziunea cu un domeniu constant de anticorp uman adecvat (a se vedea, de exemplu, Riechmann, L. şi colab. (1988) "Reshaping Human Antibodies for Therapy," Nature 332:323-327; Verhoeyen, M. şi colab. (1988) "Reshaping Human Antibodies: Grafting An Antilysozyme Activity," Science 239:1534-1536; şi Jones şi colab. (1986) "Replacing The Complementarity-Determining Regions In A Human Antibody With Those From A Mouse," Nature 321:522-525). O altă referinţă descrie CDR de rozătoare susţinute de regiunile cadru de rozătoare placate recombinant (a se vedea, de exemplu, Publicaţia de brevet european nr. 519,596). Aceste molecule "umanizate" sunt concepute pentru a minimiza răspunsul imunologic nedorit faţă de moleculele de anticorp anti-uman de rozătoare, ceea ce limitează durata şi eficacitatea aplicaţiilor terapeutice ale acelor fracţiuni la beneficiarii umani. Alte procedee de umanizare a anticorpilor care pot fi de asemenea utilizate sunt descrise de Daugherty şi colab. (1991) "Polymerase Chain Reaction Facilitates The Cloning, CDR-Grafting, And Rapid Expression Of A Murine Monoclonal Antibody Directed Against The CD18 Component Of Leukocyte Integrins," Nucl. Acids Res. 19:2471-2476 şi în Brevetele SUA nr. 6,180,377; 6,054,297; 5,997,867; şi 5,866,692.
B. Caracteristicile domeniilor constante ale anticorpilor
În cuprinsul prezentei specificaţii, numerotarea resturilor din regiunea constantă a unui lanţ greu de IgG este cea din indexul UE din Kabat şi colab., SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST, 5th Ed. Public Health Service, NH1, MD (1991) ("Kabat"). Termenul "indexul UE astfel cum este stabilit în Kabat" se referă la numerotarea domeniilor constante ale anticorpului uman IgG1 UE furnizată în Kabat. Acest procedeu de atribuire a numerelor de resturi a devenit standard în domeniu şi identifică cu uşurinţă aminoacizii în poziţii echivalente în regiunile constante ale diverselor izotipuri de anticorpi.
1. Regiunile constante ale lanţului uşor
Astfel cum s-a indicat anterior, fiecare lanţ uşor al unui anticorp conţine un domeniu variabil ("VL") şi un domeniu constant ("CL").
Un domeniu CL preferat este un domeniu CL Kappa de IgG umană. Secvenţa de aminoacizi a unui domeniu CL Kappa uman exemplificativ este (SEQ ID NO:69): În mod alternativ, un domeniu CL exemplificativ este un domeniu CL Lambda de IgG umană. Secvenţa de aminoacizi a unui domeniu CL Lambda uman exemplificativ este (SEQ ID NO:70):
2. Regiunile constante ale lanţului greu
a. Regiuni Fc care apar în mod natural
Astfel cum este furnizat în prezenta invenţie, imunoconjugaţii conform invenţiei pot cuprinde o regiune Fc. Regiunea Fc a unor astfel de imunoconjugaţi conform invenţiei poate fi de orice izotip (de exemplu IgG1, IgG2, IgG3 sau IgG4). Imunoconjugaţii conform invenţiei pot cuprinde în plus un domeniu CH1 şi/sau o
regiune de articulaţie. Atunci când este prezent, domeniul CH1 şi/sau regiunea de
articulaţie poate fi de orice izotip (de exemplu IgG1, IgG2, IgG3 sau IgG4) şi este de
preferat de acelaşi izotip ca şi regiunea Fc dorită.
Regiunea Fc a imunoconjugaţilor care conţin regiuni Fc conform prezentei invenţii poate fi o regiune Fc completă (de exemplu o regiune Fc IgG completă) sau doar un fragment al unei regiuni Fc. În mod opţional, regiunii Fc a imunoconjugaţilor care conţin regiuni Fc conform prezentei invenţii îi lipseşte restul de aminoacid lizină C-terminal. Domeniile CH1 ale celor două lanţuri grele ale unui complex de anticorpi cu regiunea constantă "CL" a lanţului uşor al anticorpului şi sunt ataşate la domeniile CH2 ale lanţurilor grele printr-un domeniu de articulaţie intermediar.Un domeniu CH1 exemplificativ este un domeniu CH1 IgG1 uman. Secvenţa de aminoacizi a unui domeniu CH1 IgG1 uman exemplificativ este (SEQ ID NO:71): Un domeniu CH1 exemplificativ este un domeniu CH1 IgG2 uman. Secvenţa de aminoacizi a unui domeniu CH1 IgG2 uman exemplificativ este (SEQ ID NO:72): Un domeniu CH1 exemplificativ este un domeniu CH1 IgG4 uman. Secvenţa de aminoacizi a unui domeniu CH1 IgG4 uman exemplificativ este (SEQ ID NO:73): O regiune de articulaţie exemplificativă este o regiune de articulaţie IgG1 umană. Secvenţa de aminoacizi a unei regiuni de articulaţie IgG1 umană exemplificativă este (SEQ ID NO:74): EPKSCDKTHTCPPCP. O altă regiune de articulaţie exemplificativă este o regiune de articulaţie IgG2 umană. Secvenţa de aminoacizi a unei regiuni de articulaţie IgG2 umană exemplificativă este (SEQ ID NO:75): ERKCCVECPPCP.
O altă regiune de articulaţie exemplificativă este o regiune de articulaţie IgG4
umană. Secvenţa de aminoacizi a unei regiuni de articulaţie IgG4 umană exemplificativă este (SEQ ID NO:76): ESKYGPPCPSCP. Astfel cum s-a descris anterior, o regiune de articulaţie IgG4 poate cuprinde o mutaţie stabilizatoare, cum ar fi substituţia S228P. Secvenţa de aminoacizi a unei regiuni de articulaţie IgG4 stabilizată exemplificativă este (SEQ ID NO:77): ESKYGPPCPPCP.
Domeniile CH2 şi CH3 ale celor două lanţuri grele ale unui anticorp interacţionează pentru a forma o "regiune Fc," care este un domeniu care este recunoscut de "receptorii Fc celulari," inclusiv, dar fără a se limita la, receptorii gamma Fc ("FcyR"). Astfel cum este utilizat în prezenta invenţie, termenul "regiune Fc" este utilizat pentru a defini regiunea C-terminală a unui lanţ greu de IgG care cuprinde domeniile CH2 şi CH3 ale acelui lanţ. Se spune că o regiune Fc este dintr-un anumit izotip, o anumită clasă sau subclasă IgG dacă secvenţa de aminoacizi a acesteia este cea mai omoloagă cu acel izotip, în raport cu alte izotipuri IgG. Secvenţa de aminoacizi a domeniului CH2-CH3 al unei IgG1 umane exemplificative este (SEQ ID NO:1)
astfel cum este numerotat în indexul UE Kabat, în care X este o lizină (K) sau este absent.
Secvenţa de aminoacizi a domeniului CH2-CH3 al unei IgG2 umane exemplificative este (SEQ ID NO:2):
astfel cum este numerotat în indexul UE Kabat, în care X este o lizină (K) sau este absent.
Secvenţa de aminoacizi a domeniului CH2-CH3 al unei IgG3 umane exemplificative este (SEQ ID NO:3):
astfel cum este numerotat în indexul UE Kabat, în care X este o lizină (K) sau este absent.
Secvenţa de aminoacizi a domeniului CH2-CH3 al unei IgG4 umane exemplificative este (SEQ ID NO:4):
astfel cum este numerotat în indexul UE Kabat, în care X este o lizină (K) sau este absent.
Polimorfismele au fost observate la o serie de poziţii diferite în regiunile constante ale anticorpilor (de exemplu poziţiile Fc, inclusiv, dar fără a se limita la, poziţiile 270, 272, 312, 315, 356, şi 358 astfel cum este numerotat în indexul UE Kabat) şi, prin urmare, pot exista mici diferenţe între secvenţa prezentată şi secvenţele din stadiul tehnicii. Formele polimorfe ale imunoglobulinelor umane au fost bine caracterizate. În prezent, sunt cunoscute 18 alotipuri Gm: G1m (1, 2, 3, 17) or G1m (a, x, f, z), G2m (23) or G2m (n), G3m (5, 6, 10, 11, 13, 14, 15, 16, 21, 24, 26, 27, 28) or G3m (b1, c3, b3, b0, b3, b4, s, t, g1, c5, u, v, g5) (Lefranc, şi colab., "The Human IgG Subclasses: Molecular Analysis of Structure, Function And Regulation." Pergamon, Oxford, pp. 43-78 (1990); Lefranc, G. şi colab., 1979, Hum. Genet.: 50, 199-211). Se are în vedere în mod specific faptul că anticorpii conform prezentei invenţii pot încorpora orice alotip, izoalotip sau haplotip al oricărei gene de imunoglobuline şi nu se limitează la alotipul, izoalotipul sau haplotipul secvenţelor furnizate în prezenta invenţie. În plus, în unele sisteme de expresie, restul de aminoacid C-terminal (îngroşat anterior) al domeniului CH3 poate fi îndepărtat post-translaţional. În consecinţă, restul C-terminal al domeniului CH3 este un rest de aminoacid opţional în imunoconjugaţii conform invenţiei. Prezenta invenţie cuprinde în mod specific imunoconjugaţii care sunt lipsiţi de restul C-terminal al domeniului CH3. De asemenea, prezenta invenţie cuprinde în mod specific astfel de constructe care cuprind restul de lizină C-terminal al domeniului CH3.
b. Receptorii Fcγ (FcyR)
În funcţia imună tradiţională, interacţiunea complexelor anticorp-antigen cu celulele sistemului imunitar are ca rezultat o gamă largă de răspunsuri, variind de la funcţii efectoare, cum ar fi citotoxicitatea dependentă de anticorpi, degranularea mastocitelor şi fagocitoza, până la semnale imunomodulatoare, cum ar fi reglarea proliferării limfocitelor şi secreţia de anticorpi. Toate aceste interacţiuni sunt iniţiate prin legarea regiunii Fc a anticorpilor sau a complexelor imune la receptorii de suprafaţă celulară specializaţi pe celulele hematopoietice şi în special la receptori (denumiţi în mod singular "receptor gamma Fc" "FcyR" şi în mod colectiv "FcyR") găsiţi pe suprafeţele mai multor tipuri de celule ale sistemului imunitar (de exemplu limfocite B, celule dendritice foliculare, celule natural killer, macrofage, neutrofile, eozinofile, bazofile şi mastocite).
Diversitatea răspunsurilor celulare declanşate de anticorpi şi complexele imune rezultă din eterogenitatea structurală a celor trei receptori Fc: FcγRI (CD64), FcγRII (CD32) şi FcγRIII (CD16). FcγRI (CD64), FcγRIIA (CD32A) şi FcγRIII (CD16) sunt receptori de activare (adică de îmbunătăţire a sistemului imunitar); FcγRIIB (CD32B) este un receptor de inhibare (adică de amortizare a sistemului imunitar). În plus, interacţiunea cu receptorul Fc neonatal (FcRn) mediază reciclarea moleculelor de IgG de la endozom la suprafaţa celulară şi eliberarea în sânge. Secvenţele de aminoacizi ale IgG1 de tip sălbatic exemplificative (SEQ ID NO:1), IgG2 (SEQ ID NO:2), IgG3 (SEQ ID NO:3) şi IgG4 (SEQ ID NO:4) sunt prezentate anterior. Capacitatea diverselor FcγR de a media funcţii diametral opuse reflectă diferenţele structurale între diversele FcγR şi, în special, reflectă faptul dacă FcγR legat posedă un motiv de activare pe bază de tirozină imunoreceptoare ("ITAM") sau un motiv de inhibare pe bază de tirozină imunoreceptoare ("ITIM"). Recrutarea diverselor enzime citoplasmatice la aceste structuri dictează rezultatul răspunsurilor celulare mediate de FcγR. FcγR care conţin ITAM includ FcγRI, FcγRIIA, FcγRIIIA şi activează sistemul imunitar atunci când se leagă la regiunile Fc (de exemplu regiunile Fc agregate prezente într-un complex imun). FcγRIIB este singurul FcγR natural cunoscut în prezent care conţine ITIM; acţionează pentru a amortiza sau inhiba sistemul imunitar atunci când este legat la regiunile Fc agregate. Neutrofilele umane exprimă gena FcγRIIA. Gruparea FcγRIIA prin complexe imune sau reticulare cu anticorpi specifici serveşte la agregarea ITAM cu kinaze asociate receptorilor care facilitează fosforilarea ITAM. Fosforilarea ITAM serveşte ca un situs de andocare pentru kinaza Syk, a cărei activare are ca rezultat activarea substraturilor din aval (de exemplu PI3K). Activarea celulară conduce la eliberarea de mediatori proinflamatori. Gena FcγRIIB este exprimată pe limfocitele B; domeniul extracelular al acesteia este identic în proporţie de 96% cu FcγRIIA şi se leagă la complexele IgG într-o manieră care nu se poate distinge. Prezenţa unui ITIM în domeniul citoplasmatic al FcγRIIB defineşte această subclasă inhibitoare a FcγR. Recent s-a stabilit baza moleculară a acestei inhibiţii. Atunci când este co-ligat împreună cu un FcγR de activare, ITIM din FcγRIIB devine fosforilat şi atrage domeniul SH2 al inozitol polifosfat 5'-fosfatazei (SHIP), care hidrolizează mesagerii fosfoinozitol eliberaţi ca urmare a activării tirozin kinazei mediate de FcγR care conţine ITAM, împiedicând în consecinţă influxul de Ca++ intracelular. Prin urmare, reticularea FcγRIIB atenuează răspunsul de activare la ligatura FcγR şi inhibă sensibilitatea celulară. Prin urmare, activarea celulelor B, proliferarea celulelor B şi secreţia de anticorpi sunt întrerupte.
c. Variante de regiuni Fc
Modificarea regiunii Fc poate conduce la un fenotip alterat, de exemplu timp de înjumătăţire plasmatică alterat, stabilitate alterată, susceptibilitate alterată la enzimele celulare sau funcţie efectoare alterată. Prin urmare, poate fi de dorit modificarea unei molecule care conţine regiunea Fc conform prezentei invenţii în ceea ce priveşte funcţia efectoare, de exemplu astfel încât să sporească eficacitatea unei astfel de molecule în tratarea cancerului. Reducerea sau eliminarea funcţiei efectoare este de dorit în anumite cazuri, de exemplu în cazul anticorpilor al căror mecanism de acţiune implică blocarea sau antagonismul, dar nu distrugerea celulelor care poartă un antigen ţintă. Creşterea funcţiei efectoare este în general de dorit atunci când este direcţionată către celule nedorite, cum ar fi celule tumorale şi străine, unde FcγR sunt exprimate la niveluri scăzute, de exemplu celule B specifice tumorale cu niveluri scăzute de FcγRIIB (de exemplu limfom non-Hodgkin's, LLC şi limfom Burkitt). Imunoconjugaţii conform invenţiei care posedă o astfel de activitate a funcţiei efectoare conferită sau modificată sunt utili pentru tratarea şi/sau prevenirea unei boli, tulburări sau infecţii în care se doreşte o eficacitate sporită a activităţii funcţiei efectoare.
În consecinţă, în anumite variante de realizare, regiunea Fc a imunoconjugaţilor care conţin regiuni Fc conform prezentei invenţii poate fi o variantă modificată a regiunii Fc. Deşi regiunea Fc a imunoconjugaţilor conform prezentei invenţii poate avea capacitatea de a se lega la unul sau mai mulţi receptori Fc (de exemplu FcγR), mai de preferat o astfel de variantă de regiune Fc are legarea modificată la FcγRIA (CD64), FcγRIIA (CD32A) , FcγRIIB (CD32B), FcγRIIIA (CD16a) sau FcγRIIIB (CD16b) (în raport cu legarea prezentată de o regiune Fc de tip sălbatic), de exemplu, vor avea o legare îmbunătăţită la un receptor de activare şi/sau vor avea o capacitate în mod substanţial redusă sau inexistentă de a se lega la unul sau mai mulţi receptori inhibitori. Prin urmare, regiunea Fc a imunoconjugaţilor conform prezentei invenţii poate include o parte sau tot domeniul CH2 şi/sau o parte sau tot domeniul CH3 al unei regiuni Fc complete, sau poate cuprinde o variantă CH2 şi/sau o variantă de secvenţă CH3 (care poate include, de exemplu, una sau mai multe inserţii şi/sau una sau mai multe deleţii cu privire la domeniile CH2 sau CH3 ale unei regiuni Fc complete). Asemenea regiuni Fc pot cuprinde porţiuni polipeptidice non-Fc sau pot cuprinde porţiuni de regiuni Fc necomplete în mod natural sau pot cuprinde orientări nenaturale ale domeniilor CH2 şi/sau CH3 (cum ar fi, de exemplu, două domenii CH2 sau două domenii CH3 sau în direcţia capăt N-terminal către capăt C-terminal, un domeniu CH3 legat la un domeniu CH2 etc.). Modificările regiunii Fc identificate ca alterând funcţia efectoare sunt cunoscute în stadiul tehnicii, inclusiv modificări care cresc legarea la receptorii de activare (de exemplu FcγRIIA (CD16A) şi reduc legarea la receptorii de inhibare (de exemplu FcγRIIB (CD32B) (a se vedea, de exemplu, Stavenhagen, J.B. şi colab. (2007) "Fc Optimization Of Therapeutic Antibodies Enhances Their Ability To Kill Tumor Cells In Vitro And Controls Tumor Expansion In Vivo Via Low-Affinity Activating Fcgamma Receptors," Cancer Res. 57(18):8882-8890). Tabelul 1 prezintă substituţii simple, duble, triple, cvadruple şi cvintuple exemplificative (numerotarea este cea din indexul UE Kabat, iar substituţiile se referă la secvenţa de aminoacizi a SEQ ID NO:1) de modificare exemplificativă care cresc legarea la receptorii de activare şi/sau reduc legarea la receptorii de inhibare.
Tabelul 1 Variaţii ale regiunilor Fc de activare preferate Variaţii cu un singur situs F243L R292G D270E R292P Y300L P396L Variaţii cu două situsuri F243L şi R292P F243L şi Y300L F243L şi P396L R292P şi Y300L D270E şi P396L R292P şi V305I P396L şi Q419H P247L şi N421K R292P şi P396L Y300L şi P396L R255L şi P396L R292P şi P305I K392T şi P396L
Variaţii cu trei situsuri F243L, P247L şi N421K P247L, D270E şi N421K F243L, R292P şi Y300L R255L, D270E şi P396L F243L, R292P şi V305I D270E, G316D şi R416G F243L, R292P şi P396L D270E, K392T şi P396L F243L, Y300L şi P396L D270E, P396L şi Q419H V284M, R292L şi K370N R292P, Y300L şi P396L Variaţii cu patru situsuri L234F, F243L, R292P şi Y300L F243L, P247L, D270E şi N421K L234F, F243L, R292P şi Y300L F243L, R255L, D270E şi P396L L235I, F243L, R292P şi Y300L F243L, D270E, G316D şi R416G L235Q, F243L, R292P şi Y300L F243L, D270E, K392T şi P396L P247L, D270E, Y300L şi N421K F243L, R292P, Y300L şi P396L R255L, D270E, R292G şi P396L F243L, R292P, V305I şi P396L R255L, D270E, Y300L şi P396L F243L, D270E, P396L şi Q419H D270E, G316D, P396L şi R416G
Variaţii cu cinci situsuri L235V, F243L, R292P, Y300L şi P396L F243L, R292P, V305I, Y300L şi P396L L235P, F243L, R292P, Y300L şi P396L
Variante exemplificative ale regiunilor Fc IgG1 umane cu legare redusă la CD32B şi/sau cu legare crescută la CD16A conţin substituţii F243L, R292P, Y300L, V305I sau P396L, în care numerotarea este cea din indexul UE Kabat. Aceste substituţii de aminoacizi pot fi prezente într-o regiune Fc IgG1 umană în orice combinaţie. Într-o variantă de realizare, varianta de regiune Fc IgG1 umană conţine o substituţie F243L, R292P şi Y300L. Într-o altă variantă de realizare, varianta de regiune Fc IgG1 umană conţine o substituţie F243L, R292P, Y300L, V305I şi P396L.
În anumite variante de realizare, este de preferat ca regiunile Fc ale imunoconjugaţilor conform prezentei invenţii să prezinte legare redusă (sau în mod substanţial nicio legare) la FcγRIA (CD64), FcγRIIA (CD32A), FcγRIIB (CD32B), FcγRIIIA (CD16a) sau FcγRIIIB ( CD16b) (în raport cu legarea prezentată de regiunea Fc IgG1 de tip sălbatic (SEQ ID NO:1). Într-o variantă de realizare specifică, imunoconjugaţii conform prezentei invenţii cuprind o regiune Fc IgG care prezintă o funcţie efectoare a ADCC redusă. Într-o variantă de realizare preferată, domeniile CH2-CH3 ale imunoconjugaţilor includ oricare 1, 2, 3 sau 4 dintre substituţiile: L234A, L235A, D265A, N297Q şi N297G, în care numerotarea este cea din indexul UE Kabat. Într-o altă variantă de realizare, domeniile CH2-CH3 conţin o substituţie N297Q, o substituţie N297G, substituţii L234A şi L235A sau o substituţie D265A, deoarece aceste mutaţii elimină legarea FcR. În mod alternativ, este utilizat un domeniu CH2-CH3 al unei regiuni Fc care apare în mod natural care prezintă în mod inerent legare redusă (sau în mod substanţial nicio legare) la FcγRIIIA (CD16a) şi/sau funcţie efectoare redusă (în raport cu funcţia de legare şi efectoare prezentată de regiunea Fc IgG1 de tip sălbatic (SEQ ID NO:1)). Într-o variantă de realizare specifică, imunoconjugaţii conform prezentei invenţii cuprind o regiune Fc IgG2 (SEQ ID NO:2) sau o regiune Fc IgG4 (SEQ ID:NO:4). Atunci când este utilizată o regiune Fc IgG4, prezenta invenţie cuprinde, de asemenea, introducerea unei mutaţii de stabilizare, cum ar fi substituţia regiunii de articulaţie S228P descrisă anterior (a se vedea, de exemplu, SEQ ID NO:77). Deoarece substituţiile N297G, N297Q, L234A, L235A şi D265A elimină funcţia efectoare, în circumstanţe în care se doreşte funcţia efectoare, ar fi de preferat ca aceste substituţii să nu fie utilizate. O secvenţă preferată de IgG1 pentru domeniile CH2 şi CH3 ale imunoconjugaţilor care conţin regiuni Fc conform prezentei invenţii care are o funcţie efectoare redusă sau eliminată va cuprinde substituţiile L234A/L235A (ilustrate subliniate) (SEQ ID NO:78):
în care, X este o lizină (K) sau este absent.
O a doua secvenţă preferată de IgG1 pentru domeniile CH2 şi CH3 ale imunoconjugaţilor care conţin regiuni Fc conform prezentei invenţii cuprinde o substituţie S442C (ilustrată subliniată), care permite ca două domenii CH3 să fie legate covalent între ele printr-o legătură disulfurică sau conjugarea unui agent farmaceutic. Secvenţa de aminoacizi a unei astfel de molecule este (SEQ ID NO:79): în care, X este o lizină (K) sau este absent.O a treia secvenţă preferată de IgG1 pentru domeniile CH2 şi CH3 ale imunoconjugaţilor care conţin regiunea Fc conform prezentei invenţii cuprinde substituţii L234A/L235A (ilustrate subliniate) care reduc sau elimină funcţia efectoare şi substituţia S442C (ilustrată subliniată) care permite ca două domenii CH3 să fie legate covalent între ele printr-o legătură disulfurică sau conjugarea unui agent farmaceutic. Secvenţa de aminoacizi a unei astfel de molecule este (SEQ ID NO:80): în care, X este o lizină (K) sau este absent. Timpul de înjumătăţire plasmatică a proteinelor care cuprind regiunile Fc poate fi crescut prin creşterea afinităţii de legare a regiunii Fc pentru FcRn. Termenul "timp de înjumătăţire" astfel cum este utilizat în prezenta invenţie semnifică o proprietate farmacocinetică a unei molecule care este o măsură a timpului mediu de supravieţuire al moleculelor după administrarea acestora. Timpul de înjumătăţire poate fi exprimat ca timpul necesar pentru a elimina cincizeci la sută (50%) dintr-o cantitate cunoscută de moleculă din organismul unui subiect (de exemplu un pacient uman sau alt mamifer) sau un compartiment specific al acestuia, de exemplu, măsurat în ser, adică timpul de înjumătăţire circulant sau în alte ţesuturi. În general, o creştere a rezultatelor de înjumătăţire la o creştere a mediei timpului de şedere (MRT) în circulaţie în cazul moleculelor administrate. În unele variante de realizare, imunoconjugaţii conform prezentei invenţii cuprind o variantă de regiune Fc care cuprinde cel puţin o modificare a aminoacizilor în raport cu o regiunea Fc de tip sălbatic, astfel că molecula menţionată are un timp de înjumătăţire crescut (în raport cu o moleculă care cuprinde o regiune Fc de tip sălbatic). În unele variante de realizare, imunoconjugaţii conform prezentei invenţii cuprind o variantă de regiune Fc IgG, în care varianta de regiune Fc menţionată cuprinde o substituţie de aminoacizi care extinde timpul de înjumătăţire la una sau mai multe poziţii selectate din grupul constând din 238, 250, 252, 254, 256, 257, 256, 265, 272, 286, 288, 303, 305, 307, 308, 309, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424, 428, 433, 434, 435 şi 436, în care numerotarea este cea din indexul UE Kabat. Numeroase mutaţii capabile să crească timpul de înjumătăţire al unei molecule care conţine o regiune Fc sunt cunoscute în stadiul tehnicii şi includ, de exemplu, M252Y, S254T, T256E şi combinaţii ale acestora. De exemplu, a se vedea mutaţiile descrise în Brevetele SUA nr. 6,277,375, 7,083,784; 7,217,797, 8,088,376; Publicaţiile SUA nr. 2002/0147311; 2007/0148164; şi Publicaţiile PCT nr. WO 98/23289; WO 2009/058492; şi WO 2010/033279. Imunoconjugaţii cu timp de înjumătăţire crescut le includ, de asemenea, pe cele care posedă variante de regiuni Fc care cuprind substituţii la două sau mai multe dintre resturile regiunii Fc 250, 252, 254, 256, 257, 288, 307, 308, 309, 311, 378, 428, 433, 434, 435, şi 436, în care numerotarea este cea din indexul UE Kabat. În special, două sau mai multe substituţii selectate dintre: T250Q, M252Y, S254T, T256E, K288D, T307Q, V308P, A378V, M428L, N434A, H435K şi Y436I, în care numerotarea este cea din indexul UE Kabat. Într-o variantă de realizare specifică, un imunoconjugat conform prezentei invenţii posedă o variantă de regiune Fc IgG care cuprinde substituţiile:
(A) M252Y, S254T şi T256E;
(B) M252Y şi S254T;
(C) M252Y şi T256E;
(D) T250Q şi M428L;
(E) T307Q şi N434A;
(F) A378V şi N434A;
(G) N434A şi Y436I;
(H) V308P şi N434A; sau
(I) K288D şi H435K.
Într-o variantă de realizare preferată, imunoconjugatul conform prezentei invenţii posedă o variantă de regiune Fc IgG care cuprinde oricare 1, 2 sau 3 dintre substituţiile: M252Y, S254T şi T256E. Invenţia cuprinde în plus imunoconjugaţi care posedă variante de regiuni Fc care cuprind:
(A) una sau mai multe mutaţii care modifică funcţia efectoare şi/sau FcγR; şi
(B) una sau mai multe mutaţii care prelungesc timpul de înjumătăţire plasmatică.
O a patra secvenţă preferată de IgG1 pentru domeniile CH2 şi CH3 ale imunoconjugaţilor care conţin regiuni Fc conform prezentei invenţii cuprinde substituţiile M252Y, S254T şi T256E (ilustrate subliniate), astfel încât să prelungească timpul de înjumătăţire plasmatică în ser. Secvenţa de aminoacizi a unei astfel de molecule este (SEQ ID NO:147):
în care, X este o lizină (K) sau este absent.
O a cincea secvenţă preferată de IgG1 pentru domeniile CH2 şi CH3 ale imunoconjugaţilor care conţin regiuni Fc conform prezentei invenţii cuprinde substituţiile M252Y, S254T şi T256E (ilustrate subliniate), astfel încât să prelungească timpul de înjumătăţire plasmatică în ser şi substituţia S442C (ilustrată subliniată), astfel încât să permită ca două domenii CH3 să fie legate covalent unul la celălalt printr-o legătură disulfurică sau să permită conjugarea unei fracţiuni de medicament. Secvenţa de aminoacizi a unei astfel de molecule este (SEQ ID NO: 148):
în care, X este o lizină (K) sau este absent.
O a şasea secvenţă preferată de IgG1 pentru domeniile CH2 şi CH3 ale imunoconjugaţilor care conţin regiuni Fc conform prezentei invenţii cuprinde substituţiile L234A/L235A (ilustrate subliniate) care reduc sau elimină funcţia efectoare şi substituţiile M252Y, S254T şi T256E (ilustrate subliniate), astfel încât să prelungească timpul de înjumătăţire plasmatică în ser. Secvenţa de aminoacizi a unei astfel de molecule este (SEQ ID NO: 149):
în care, X este o lizină (K) sau este absent.
O a şaptea secvenţă preferată de IgG1 pentru domeniile CH2 şi CH3 ale imunoconjugaţilor care conţin regiuni Fc conform prezentei invenţii cuprinde substituţiile L234A/L235A (ilustrate subliniate) care reduc sau elimină funcţia efectoare şi substituţiile M252Y, S254T şi T256E (ilustrate subliniate), astfel încât să prelungească timpul de înjumătăţire plasmatică în ser şi substituţia S442C (ilustrată subliniată), astfel încât să permită ca două domenii CH3 să fie legate covalent unul la celălalt printr-o legătură disulfurică sau să permită conjugarea unei fracţiuni de medicament. Secvenţa de aminoacizi a unei astfel de molecule este (SEQ ID NO:150): în care, X este o lizină (K) sau este absent.
II. Anticorpi anti-ADAM9 exemplificativi
Anticorpii particulari şi fragmentele de legare a antigenului ale acestora capabile să se lege în mod specific la ADAM9 sunt utili în generarea imunoconjugaţilor conform invenţiei.
O polipeptidă ADAM9 umană reprezentativă (secvenţa NCBI NP_003807, care include o secvenţă semnal de 28 de resturi de aminoacizi, ilustrată subliniată), ilustrată doar în scopuri ilustrative şi nu conform invenţiei revendicate, are secvenţa de aminoacizi (SEQ ID NO:5):
Dintre cele 819 resturi de aminoacizi ale ADAM9 (SEQ ID NO:5), resturile 1-28 sunt o secvenţă semnal, resturile 29-697 sunt domeniul extracelular, resturile 698-718 sunt domeniul transmembranar, iar resturile 719-819 sunt domeniul intracelular. Trei domenii structurale sunt localizate în domeniul extracelular: un domeniu de metaloprotează de zinc din familia reprolizină (M12B) (aproximativ la resturile 212-406); un domeniu de dezintegrină (aproximativ la resturile 423-497); şi un domeniu asemănător EGF (aproximativ la resturile 644-697). Au fost identificate o serie de modificări şi izoforme post-translaţionale, iar proteina este clivată proteolitic în reţeaua trans-Golgi înainte de a ajunge la membrana plasmatică pentru a genera o proteină matură. Îndepărtarea pro-domeniului are loc prin clivare la două situsuri diferite. Procesat cel mai probabil de o pro-protein convertază, cum ar fi furina, la limita dintre pro-domeniu şi domeniul catalitic (Arg-205/Ala-206). Un situs suplimentar al pro-protein convertazei de clivare în amonte (Arg-56/Glu-57) are un rol important în activarea ADAM9.
O polipeptidă ADAM9 reprezentativă a maimuţei cynomolgus (secvenţa NCBI XM_005563126.2, care include o posibilă secvenţă semnal de 28 de resturi de aminoacizi, ilustrată subliniată), ilustrată doar în scopuri ilustrative şi nu conform invenţiei revendicate, are secvenţa de aminoacizi (SEQ ID NO:6):
Domeniul de metaloprotează de zinc din familia reprolizină (M12B) al proteinei se află aproximativ la resturile 212-406); domeniul de dezintegrină al proteinei se află aproximativ la resturile 423-497. În anumite variante de realizare, imunoconjugaţii care cuprind anticorpii anti-ADAM9 şi fragmentele de legare a ADAM9 ale acestora conform invenţiei sunt caracterizaţi prin oricare, două, trei, patru, cinci, şase, şapte, opt sau nouă dintre următoarele criterii:
(1) capacitatea de a se lega imunospecific la ADAM9 umană astfel cum este exprimată endogen pe suprafaţa unei celule canceroase;
(2) se leagă în mod specific la ADAM9 umană şi de primată non-umană (de exemplu ADAM9 de maimuţă cynomolgus) cu o afinitate de legare similară;
(3) se leagă în mod specific la ADAM9 umană cu o constantă de legare de echilibru (KD) de 4 nM sau mai mică;
(4) se leagă în mod specific la ADAM9 de primată non-umană cu o constantă de legare de echilibru (KD) de 4 nM sau mai mică;
(5) se leagă în mod specific la ADAM9 umană cu o rată de activare (ka) de 5 × 105 M-1min-1 sau mai mare;
(6) se leagă în mod specific la ADAM9 de primată non-umană cu o rată de activare (ka) de 1 × 106 M-1min-1 sau mai mare;
(7) se leagă în mod specific la ADAM9 umană cu o rată de oprire (kd) de 1 × 10-3 min-1 sau mai mică;
(8) se leagă în mod specific la ADAM9 de primată non-umană cu o rată de oprire (kd) de 9 × 10-4 min-1 sau mai mică.
(9) optimizaţi pentru a avea o îmbunătăţire de cel puţin 100 de ori (de exemplu o îmbunătăţire de cel puţin 100 de ori, de cel puţin 150 de ori, de cel puţin 200 de ori, de cel puţin 250 de ori, de cel puţin 300 de ori, de cel puţin 350 de ori, de cel puţin 400 de ori, de cel puţin 450 de ori, de cel puţin 500 de ori, de cel puţin 550 de ori sau de cel puţin 600 de ori) a afinităţii de legare (de exemplu măsurată prin analiza BIACORE®) la ADAM9 de cyno şi menţin legarea cu afinitate crescută la ADAM9 umană (de exemplu analiza BIACORE®) în comparaţie cu anticorpul parental himeric sau murinic.
Astfel cum sunt descrise în prezenta invenţie, constantele de legare ale unui anticorp anti-ADAM9 sau ale unui fragment de legare a ADAM9 al acestuia pot fi determinate utilizând rezonanţa plasmonului de suprafaţă, de exemplu, printr-o analiză BIACORE®. Datele de rezonanţă a plasmonilor de suprafaţă pot fi adaptate la un model de legare Langmuir 1:1 (ka kd simultan) şi o constantă de legare de echilibru KD calculată din raportul constantelor ratei kd/ka. Astfel de constante de legare pot fi determinate pentru un anticorp anti-ADAM9 monovalent sau un fragment de legare a ADAM9 al acestuia (adică o moleculă care cuprinde un singur situs de legare a epitopului ADAM9), un anticorp anti-ADAM9 bivalent sau un fragment de legare a ADAM9 al acestuia (adică un moleculă care cuprinde două situsuri de legare a epitopului ADAM9) sau anticorpi anti-ADAM9 şi fragmente de legare a ADAM9 ale acestora care au o valenţă mai mare (de exemplu o moleculă care cuprinde trei, patru sau mai multe situsuri de legare a epitopului ADAM9).
Prezenta invenţie cuprinde în special imunoconjugaţi care posedă un anticorp anti-ADAM9 sau un fragment de legare a ADAM9 al acestuia care cuprinde un domeniu variabil al lanţului uşor (VL) anti-ADAM9 şi un domeniu variabil al lanţului greu (VH) anti-ADAM9 care se leagă imunospecific la un epitop al unei polipeptide ADAM9 umane. Cu excepţia cazului în care se specifică altfel, toţi astfel de anticorpi anti-ADAM9 şi fragmentele de legare a ADAM9 ale acestora sunt capabile să se lege imunospecific la ADAM9 umană. Astfel cum sunt utilizate în prezenta invenţie, astfel de domenii variabile ale ADAM9 sunt denumite "anti-ADAM9-VL" şi, respectiv, "anti-ADAM9-VH".
A. Anticorpi murinici anti-ADAM9 umană
Un anticorp murinic anti-ADAM9 care blochează activitatea de procesare a proteinei ţintă a ADAM9, este internalizat şi a fost identificat cu activitate anti-tumorală (a se vedea, de exemplu, Brevetul SUA nr. 8,361,475). Acest anticorp, desemnat în Brevetele SUA nr. 7,674,619 şi 8,361,475 ca un anticorp "anti-KID24" produs de clona hibridom ATCC PTA-5174, este desemnat în prezenta invenţie ca "MAB-A." MAB-A prezintă o legare preferenţială puternică la tumori faţă de ţesuturile normale (a se vedea FIG. 7A-7C). MAB-A a prezentat o colorare slabă sau deloc pe un panou mare de tipuri de celule normale (Tabelul 2).
Tabelul 2 Ţesut MAB-A (1,25 µg/mL) Suprarenale Negativ Vezica urinară Negativ Măduvă osoasă Negativ Sân Negativ Cerebel Negativ Creier ND Col uterin Negativ Colon Negativ Esofag Muşchi neted +/- la 1+ (gr c) < 5% Ţesut MAB-A (1,25 µg/mL) Oviduct Negativ Cord Negativ Rinichi Negativ Ficat Negativ Plămân Negativ Ganglion limfatic Negativ Ovar Negativ Pancreas Foarte rar (posibil acinar) 1+ (c) Paratiroidă Celulele parenchimatoase epiteliale 1+ (gr c), 1% Celule (favorizează celulele principale) 2+ (m,c)5% 1+ (m,c) 10% apicale în primul rând Pituitară Celulele lobului posterior (eventual celule neuronale şi/sau pituicite 1+ (c>m) < 5% Placentă Celule de căptuşeală vasculară din placa corionică 1+ (gr c>m) Celule mezenchimale ale plăcii corionice 1-2+ (gr c), 5% Prostată Epiteliu glandular 2+ (gr c)5% şi 1+ (gr c) 5% Retină + Corp ciliar Favor negativ (strat epipigmentat 3-4+ (gr c) din cauza pigmentului necolorat) Glanda submandibulară Epiductal +/- (c) 10% Muşchi scheletic Negativ Piele Negativ Intestin subţire Negativ Măduva spinării Neuropil 1+ (gr c) < 1% Splină Negativ Stomac Negativ Testicul Tubul seminifer 1+ (gr c) < 5% Celule interstiţiale (posibil celule Leydig) 2-3+ (gr c) < 5% şi 1+ (gr c) 10% Glanda tiroidă Negativ Amigdală Endocelule 2-3+ (c,m) < 5% şi 1+ (m,c) 15% Ureter Epiteliu de tranziţie 1+ (m,c) < 5% şi 1+ (m,c) 5%; Endocelule 1+ (c) < 5% Ţesut MAB-A (1,25 µg/mL) Uter Negativ Peletă de celule A498 2-3+ (m,c), 50%, 1+ (m,c) 45%
Astfel cum este ilustrat în FIG. 2, MAB-A se leagă la ADAM9 umană cu afinitate crescută, dar se leagă la ADAM9 de primate non-umane (de exemplu maimuţa cynomolgus) într-o măsură mai mică.
Secvenţele de aminoacizi ale domeniilor VL şi VH ale MAB-A sunt furnizate mai jos în scop ilustrativ şi nu sunt conform invenţiei revendicate n. Domeniile VH şi VL ale MAB-A au fost umanizate, iar CDR au fost optimizate pentru a îmbunătăţi afinitatea şi/sau pentru a elimina potenţialele pasive de aminoacizi. CDRH3 a fost optimizat în plus pentru a îmbunătăţi legarea la ADAM9 de primată non-umană, menţinând în acelaşi timp afinitatea crescută pentru ADAM9 umană. Imunoconjugaţii preferaţi conform prezentei invenţii care cuprind 1, 2 sau toate cele 3 CDRH ale unui domeniu VH şi 1 sau 2 CDRL ale domeniului VL ale unei variante optimizate de MAB-A şi, de preferat, posedă în plus regiuni-cadru umanizate ("FR") ale domeniilor VH şi/sau VL ale MAB-A umanizat. Alţi imunoconjugaţi preferaţi conform prezentei invenţii posedă întregul domeniu VH al unei variante umanizate/optimizate de MAB-A. Invenţia se referă în special la imunoconjugaţi care cuprind:
(A)
(1) cele trei CDRL ale domeniului VL al MAB-A; şi
(2) cele patru FR ale domeniului VL al unei variante umanizate de MAB-A; sau
(B) cele trei CDRH ale domeniului VH al unei variante optimizate de MAB-A; şi cele trei CDRL ale domeniului VL al MAB-A; sau
(C)
(1) cele trei CDRH ale domeniului VH al unei variante optimizate de MAB-A; şi
(2) cele patru FR ale domeniului VH al unei variante umanizate de MAB-A; sau
(D)
(1) domeniul VH al unei variante umanizate/optimizate de MAB-A; şi
(2) domeniul VL al unei variante umanizate/optimizate de anticorp murinic MAB-A "MAB-A"
Secvenţa de aminoacizi a domeniului VH al anticorpului murinic anti-ADAM9 MAB-A este SEQ ID NO:7, ilustrată doar în scop ilustrativ şi nu conform invenţiei revendicate, (resturile CDRH sunt ilustrate subliniate):
Secvenţa de aminoacizi a domeniului CDRH1 al MAB-A este (SEQ ID NO:8): SYWMH. Secvenţa de aminoacizi a domeniului CDRH2 al MAB-A este (SEQ ID NO:9): EIIPINGHTNYNEKFKS. Secvenţa de aminoacizi a domeniului CDRH3 al MAB-A este (SEQ ID NO:10): GGYYYYGSRDYFDY. Secvenţa de aminoacizi a domeniului VL al anticorpului murinic anti-ADAM9 MAB-A este SEQ ID NO:11, ilustrată doar în scop ilustrativ şi nu conform invenţiei revendicate, (resturile CDRL sunt ilustrate subliniate):
Secvenţa de aminoacizi a domeniului CDRL1 al MAB-A este (SEQ ID NO: 12): KASQSVDYDGDSYMN. Secvenţa de aminoacizi a domeniului CDRL2 al MAB-A este (SEQ ID NO: 13): AASDLES. Secvenţa de aminoacizi a domeniului CDRL3 al MAB-A este (SEQ ID NO: 14): QQSHEDPFT.
B. Domenii VH şi VL anti-ADAM9 umanizate/optimizate exemplificative
1. Variante de domenii VH ale MAB-A
Secvenţele de aminoacizi ale anumitor domenii VH anti-ADAM9 umanizate/optimizate preferate ale MAB-A sunt variante de domeniu VH ADAM9 al MAB-A (SEQ ID NO:7).
Secvenţele de aminoacizi ale anumitor domenii VH anti-ADAM9 umanizate/optimizate preferate ale MAB-A:
hMAB-A VH(2D) (SEQ ID NO:23) hMAB-A VH(2E) (SEQ ID NO:24) hMAB-A VH(2F) (SEQ ID NO:25) hMAB-A VH(2A) (SEQ ID NO:20) hMAB-A VH(2G) (SEQ ID NO:26) hMAB-A VH(2B) (SEQ ID NO:21) hMAB-A VH(2H) (SEQ ID NO:27) hMAB-A VH(2C) (SEQ ID NO:22) hMAB-A VH(2I) (SEQ ID NO:28) şi hMAB-A VH(2J) (SEQ ID NO:29)
sunt prezentate mai jos (resturile CDRH sunt ilustrate cu o singură subliniere; diferenţele în raport cu hMAB-A VH(1) (SEQ ID NO:7) sunt ilustrate cu subliniere dublă).
Secvenţele de aminoacizi ale domeniilor VH anti-ADAM9 umanizate/optimizate ale MAB-A:
hMAB-A VH(1) (SEQ ID NO:16)
hMAB-A VH(2) (SEQ ID NO:17)
hMAB-A VH(3) (SEQ ID NO:18)
hMAB-A VH(4) (SEQ ID NO:19)
sunt de asemenea prezentate mai jos, dar secvenţele menţionate anterior nu fac parte din invenţia revendicată în prezentul document.
hMAB-A VH(1) (SEQ ID NO:16):
hMAB-A VH(2) (SEQ ID NO:17):
hMAB-A VH(3) (SEQ ID NO:18):
hMAB-A VH(4) (SEQ ID NO:19):
hMAB-A VH(2A) (SEQ ID NO:20):
hMAB-A VH(2B) (SEQ ID NO:21):
hMAB-A VH(2C) (SEQ ID NO:22):
hMAB-A VH(2D) (SEQ ID NO:23):
hMAB-A VH(2E) (SEQ ID NO:24):
hMAB-A VH(2F) (SEQ ID NO:25):
hMAB-A VH(2G) (SEQ ID NO:26):
hMAB-A VH(2H) (SEQ ID NO:27):
hMAB-A VH(2I) (SEQ ID NO:28):
hMAB-A VH(2J) (SEQ ID NO:29):
Secvenţe de aminoacizi adecvate pentru FR ale unui domeniu VH anti-ADAM9 umanizat şi/sau optimizat al MAB-A sunt:
Domeniul FRH1 (SEQ ID NO:30): EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFS
Domeniul FRH2 (SEQ ID NO:31): WVRQAPGKGLEWVG
Domeniul FRH3 (SEQ ID NO:32): RFTISLDNSKNTLYLQMGSLRAEDTAVYYCAR
Domeniul FRH4 (SEQ ID NO:33): WGQGTTVTVSS
Secvenţa de aminoacizi pentru domeniul CDRH1 al unui domeniu VH anti-ADAM9 este una dintre:
SEQ ID NO:8: SYWMH
SEQ ID NO:34: SYWIH
Secvenţa de aminoacizi pentru domeniul CDRH2 al unui domeniu VH anti-ADAM9 este una dintre:
SEQ ID NO:9: EIIPINGHTNYNEKFKS
SEQ ID NO:35: EIIPIFGHTNYNEKFKS
SEQ ID NO:36: EIIPIFGHTNYNERFQG
Secvenţa de aminoacizi pentru domeniul CDRH3 al unui domeniu VH anti-ADAM9 este una dintre:
SEQ ID NO:37: GGYYYYFNSGTLDY
SEQ ID NO:38: GGYYYYIGKGVLDY
SEQ ID NO:39: GGYYYYPRFGWLDY
SEQ ID NO:40: GGYYYYTGKGVLDY
SEQ ID NO:41: GGYYYYDSNAVLDY
SEQ ID NO:42: GGYYYYFHSGTLDY
SEQ ID NO:43: GGYYYYFNKAVLDY
SEQ ID NO:44: GGYYYYGGSGVLDY
SEQ ID NO:45: GGYYYYPRQGFLDY
SEQ ID NO:46: GGYYYYYNSGTLDY
Un prim lanţ greu IgG1 umanizat/optimizat exemplificativ al unui derivat/al unei variante de MAB-A care nu se încadrează în domeniul de aplicare al invenţiei revendicate în prezentul document conţine domeniul hMAB-A VH (2) (SEQ ID NO:17) şi are secvenţa de aminoacizi (SEQ ID NO:50):
în care X este o lizină (K) sau este absent.
Un al doilea lanţ greu IgG1 umanizat/optimizat exemplificativ al unui derivat/al unei variante de MAB-A conţine domeniul hMAB-A VH (2C) (SEQ ID NO:22) şi are secvenţa de aminoacizi (SEQ ID NO:51):
în care X este o lizină (K) sau este absent.
Un al treilea lanţ greu IgG1 umanizat/optimizat exemplificativ al unui derivat/al unei variante de MAB-A conţine domeniul hMAB-A VH (2I) (SEQ ID NO:28) şi are secvenţa de aminoacizi (SEQ ID NO:52):
în care X este o lizină (K) sau este absent.
Astfel cum este furnizat anterior, domeniile CH2-CH3 ale regiunii Fc pot fi modificate, de exemplu, pentru a reduce funcţia efectoare şi/sau pentru a introduce un situs de conjugare şi/sau pentru a prelungi timpul de înjumătăţire serică. În anumite variante de realizare, domeniile CH2-CH3 ale lanţurilor grele IgG1 umanizate/optimizate exemplificative conform invenţiei cuprind una sau mai multe substituţii selectate dintre: L234A, L235A, M252Y, S254T, T256E şi S442C.Prin urmare, un al patrulea lanţ greu IgG1 umanizat/optimizat exemplificativ al unui derivat/al unei variante de MAB-A conţine domeniul hMAB-A VH (21) (SEQ ID NO:28) şi cuprinde în plus substituţiile L234A şi L235A în domeniile CH2-CH3 ale regiunii Fc (SEQ ID NO:78) şi are secvenţa de aminoacizi (SEQ ID NO:141) în care X este o lizină (K) sau este absent. Un al cincilea lanţ greu IgG1 umanizat/optimizat exemplificativ al unui derivat/al unei variante de MAB-A conţine domeniul hMAB-A VH (2I) (SEQ ID NO:28) şi cuprinde în plus substituţia S442C în domeniile CH2-CH3 ale regiunii Fc (SEQ ID NO:79) şi are secvenţa de aminoacizi (SEQ ID NO:142):
în care X este o lizină (K) sau este absent.
Un al şaselea lanţ greu IgG1 umanizat/optimizat exemplificativ al unui derivat/al unei variante de MAB-A conţine domeniul hMAB-A VH (2I) (SEQ ID NO:28) şi cuprinde în plus substituţiile L234A, L235A şi S442C în domeniile CH2-CH3 ale regiunii Fc (SEQ ID NO:80) şi are secvenţa de aminoacizi (SEQ ID NO:143):
în care X este o lizină (K) sau este absent.
Un al şaptelea lanţ greu IgG1 umanizat/optimizat exemplificativ al unui derivat/al unei variante de MAB-A conţine domeniul hMAB-A VH (2I) (SEQ ID NO:28) şi cuprinde în plus substituţiile M252Y, S254T şi T256E în domeniile CH2-CH3 ale regiunii Fc (SEQ ID NO:147) şi are secvenţa de aminoacizi (SEQ ID NO:151):
în care X este o lizină (K) sau este absent.
Un al optulea lanţ greu IgG1 umanizat/optimizat exemplificativ al unui derivat/al unei variante de MAB-A conţine domeniul hMAB-A VH (21) (SEQ ID NO:28) şi cuprinde în plus substituţiile M252Y, S254T, T256E şi S442C în domeniile CH2-CH3 ale regiunii Fc (SEQ ID NO:148) şi are secvenţa de aminoacizi (SEQ ID NO:152): în care X este o lizină (K) sau este absent.Un al nouălea lanţ greu IgG1 umanizat/optimizat exemplificativ al unui derivat/al unei variante de MAB-A conţine domeniul hMAB-A VH (2I) (SEQ ID NO:28) şi cuprinde în plus substituţiile L234A, L235A, M252Y, S254T şi T256E în domeniile CH2-CH3 ale regiunii Fc (SEQ ID NO:149) şi are secvenţa de aminoacizi (SEQ ID NO:153): în care X este o lizină (K) sau este absent. Un al zecelea lanţ greu IgG1 umanizat/optimizat exemplificativ al unui derivat/al unei variante de MAB-A conţine domeniul hMAB-A VH (2I) (SEQ ID NO:28) şi cuprinde în plus substituţiile L234A, L235A, M252Y, S254T, T256E şi S442C în domeniile CH2-CH3 ale regiunii Fc (SEQ ID NO:150) şi are secvenţa de aminoacizi (SEQ ID NO:154):
în care X este o lizină (K) sau este absent.
2. Variante de domenii VL ale MAB-A
Secvenţele de aminoacizi ale domeniilor VL anti-ADAM9 umanizate/optimizate preferate ale MAB-A sunt variante de domeniu VL ADAM9 al MAB-A (SEQ ID NO:11).
Secvenţele de aminoacizi ale unui domeniu VL anti-ADAM9 umanizat preferat al MAB-A: hMAB-A VL(1) (SEQ ID NO:54) şi ale anumitor domenii VL anti-ADAM9 umanizate/optimizate preferate ale MAB-A: hMAB-A VL(2) (SEQ ID NO:55), hMAB-A VL(3) (SEQ ID NO:56), and hMAB-A VL(4) (SEQ ID NO:57), sunt prezentate mai jos (resturile CDRL sunt ilustrate cu o singură subliniere; diferenţele în raport cu hMAB-A VL(1) (SEQ ID NO:54) sunt ilustrate cu subliniere dublă).
hMAB-A VL(1) (SEQ ID NO:54):
hMAB-A VL(2) (SEQ ID NO:55):
hMAB-A VL(3) (SEQ ID NO:56):
hMAB-A VL(4) (SEQ ID NO:57):
În consecinţă, secvenţe de aminoacizi adecvate pentru FR ale unui domeniu VL anti-ADAM9 umanizat şi/sau optimizat al MAB-A sunt:
Domeniul FRL1 (SEQ ID NO:58): DIVMTQSPDSLAVSLGERATISC
Domeniul FRL2 (SEQ ID NO:59): WYQQKPGQPPKLLIY
Domeniul FRL3 (SEQ ID NO:60):
GIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFATYYC
Domeniul FRL4 (SEQ ID NO:61): FGQGTKLEIK
Secvenţa de aminoacizi pentru domeniul CDRL1 al unui domeniu VL anti-ADAM9 este una dintre:
SEQ ID NO:12: KASQSVDYDGDSYMN
SEQ ID NO:62: KASQSVDYSGDSYMN
SEQ ID NO:63: RASQSVDYSGDSYMN
SEQ ID NO:64: RASQSVDYSGDSYLN
Secvenţa de aminoacizi pentru domeniul CDRL3 al unui domeniu VL anti-ADAM9 este una dintre:
SEQ ID NO:14: QQSHEDPFT
SEQ ID NO:65: QQSYSTPFT
Un lanţ uşor IgG1 umanizat/optimizat exemplificativ al unui derivat/al unei variante de MAB-A conţine domeniul hMAB-A VL (2) (SEQ ID NO:55) şi are secvenţa de aminoacizi (SEQ ID NO:68):
Invenţia are în vedere în plus astfel de imunoconjugaţi care cuprind în plus oricare dintre MAB-A FRH1, FRH2, FRH3 sau FRH4, FRL1, FRL2, FRL3 sau FRL4 umanizaţi furnizaţi anterior şi în special are în vedere astfel de imunoconjugaţi care cuprind FRH1, FRH2, FRH3 şi FRH4 şi/sau care cuprind FRL1, FRL2, FRL3, FRL4 şi FRH1. În unele variante de realizare, anticorpul anti-ADAM9 umanizat/optimizat sau fragmentul de legare a ADAM9 al acestuia include un domeniu CDRH1, un domeniu CDRH2 şi un domeniu CDRH3 şi un domeniu CDRL1, un domeniu CDRL2 şi un domeniu CDRL3 care au secvenţele selectate din grupul constând din:
(a) SEQ ID NO: 8, 35 şi 37 şi, respectiv, SEQ ID NO: 62, 13, 14;
b) SEQ ID NO: 8, 35 şi 38 şi, respectiv, SEQ ID NO: 62, 13, 14;
(c) SEQ ID NO: 8, 35 şi 39 şi, respectiv, SEQ ID NO: 62, 13, 14;
(d) SEQ ID NO: 8, 35 şi 40 şi, respectiv, SEQ ID NO: 62, 13, 14;
(e) SEQ ID NO: 8, 35 şi 41 şi, respectiv, SEQ ID NO: 62, 13, 14;
(f) SEQ ID NO: 8, 35 şi 42 şi, respectiv, SEQ ID NO: 62, 13, 14;
(g) SEQ ID NO: 8, 35 şi 43 şi, respectiv, SEQ ID NO: 62, 13, 14;
(h) SEQ ID NO: 8, 35 şi 44 şi, respectiv, SEQ ID NO: 62, 13, 14;
(i) SEQ ID NO: 8, 35 şi 45 şi, respectiv, SEQ ID NO: 62, 13, 14; şi
(j) SEQ ID NO: 8, 35 şi 46 şi, respectiv, SEQ ID NO: 62, 13, 14.
În anumite variante de realizare, anticorpul anti-ADAM9 umanizat/optimizat sau fragmentul de legare a ADAM9 al acestuia include un domeniu CDRH1, un domeniu CDRH2 şi un domeniu CDRH3 şi un domeniu CDRL1, un domeniu CDRL2 şi un domeniu CDRL3 care au secvenţele SEQ ID NO: 8, 35 şi 45 şi, respectiv, SEQ ID NO: 62, 13, 14.
În unele variante de realizare, anticorpul anti-ADAM9 umanizat/optimizat sau fragmentul de legare a ADAM9 al acestuia include un domeniu variabil al lanţului greu (VH) şi un domeniu variabil al lanţului uşor (VL) care au secvenţe care sunt cel puţin 90%, cel puţin 95%, cel puţin 99% sau sunt 100% identice cu secvenţele după cum urmează:
(a) SEQ ID N0:20 şi, respectiv, SEQ ID NO:55;
(b) SEQ ID NO:21 şi, respectiv, SEQ ID NO:55;
(c) SEQ ID NO:22 şi, respectiv, SEQ ID NO:55;
(d) SEQ ID NO:23 şi, respectiv, SEQ ID NO:55;
(e) SEQ ID NO:24 şi, respectiv, SEQ ID NO:55;
(f) SEQ ID NO:25 şi, respectiv, SEQ ID NO:55;
(g) SEQ ID NO:26 şi, respectiv, SEQ ID NO:55;
(h) SEQ ID NO:27 şi, respectiv, SEQ ID NO:55;
(i) SEQ ID NO:28 şi, respectiv, SEQ ID NO:55; şi
(j) SEQ ID NO:29 şi, respectiv, SEQ ID NO:55
Prin "în mod substanţial identică" sau "identică" se înţelege o polipeptidă care prezintă cel puţin 50% identitate cu o secvenţă de aminoacizi de referinţă (de exemplu oricare dintre secvenţele de aminoacizi descrise în prezenta invenţie). De preferat, o astfel de secvenţă este cel puţin 60%, mai de preferat cel puţin 80% sau cel puţin 85% şi mai de preferat cel puţin 90%, cel puţin 95%, cel puţin 99% sau chiar 100% identică la nivel de aminoacizi sau acid nucleic cu secvenţa utilizată pentru comparaţie.
Identitatea de secvenţă este de obicei măsurată utilizând un software de analiză a secvenţelor (de exemplu pachetul Sequence Analysis Software Package de la Genetics Computer Group, Centrul de biotehnologie al Universităţii din Wisconsin, 1710 University Avenue, Madison, Wisconsin 53705, programele BLAST, BESTFIT, GAP sau PILEUP/PRETTYBOX). Un astfel de software potriveşte secvenţe identice sau similare prin atribuirea unor grade de omologie diverselor substituţii, deleţii şi/sau alte modificări. Substituţiile conservatoare includ de obicei substituţii în cadrul următoarelor grupări: glicină, alanină; valină, izoleucină, leucină; acid aspartic, acid glutamic, asparagină, glutamină; serină, treonină; lizină, arginină; şi fenilalanină, tirozină. Într-o abordare exemplificativă pentru determinarea gradului de identitate, poate fi utilizat un program BLAST, cu un scor de probabilitate între e-3 şi e-100 care indică o secvenţă strâns înrudită. În anumite variante de realizare, anticorpul anti-ADAM9 umanizat/optimizat sau fragmentul de legare a ADAM9 al acestuia include un domeniu variabil al lanţului greu (VH) şi un domeniu variabil al lanţului uşor (VL) care au secvenţe care sunt cel puţin 90%, cel puţin 95%, cel puţin 99% sau sunt 100% identice cu secvenţele SEQ ID NO:28 şi, respectiv, SEQ ID NO:55. În anumite variante de realizare, anticorpul anti-ADAM9 umanizat/optimizat cuprinde o secvenţă de lanţ greu şi o secvenţă de lanţ uşor, după cum urmează:
(a) SEQ ID NO:51 şi, respectiv, SEQ ID NO:68;
(b) SEQ ID NO:52 şi, respectiv, SEQ ID NO:68
(c) SEQ ID NO: 141 şi, respectiv, SEQ ID NO:68;
(d) SEQ ID NO:142 şi, respectiv, SEQ ID NO:68;
(e) SEQ ID NO: 143 şi, respectiv, SEQ ID NO:68;
(f) SEQ ID NO: 151 şi, respectiv, SEQ ID NO:68;
(g) SEQ ID NO: 152 şi, respectiv, SEQ ID NO:68;
(h) SEQ ID NO:153 şi, respectiv, SEQ ID NO:68; şi
(i) SEQ ID NO: 154 şi, respectiv, SEQ ID NO:68.
În anumite variante de realizare, anticorpul anti-ADAM9 umanizat/optimizat cuprinde un lanţ greu care are secvenţa SEQ ID NO:52 şi un lanţ uşor care are secvenţa SEQ ID NO:68. În alte anumite variante de realizare, anticorpul anti-ADAM9 umanizat/optimizat cuprinde un lanţ greu care are secvenţa SEQ ID NO:142 şi un lanţ uşor care are secvenţa SEQ ID NO:68. În alte variante de realizare, anticorpul anti-ADAM9 umanizat/optimizat este modificat pentru a prelungi timpul de înjumătăţire serică şi cuprinde un lanţ greu care are secvenţa SEQ ID NO:151 şi un lanţ uşor care are secvenţa SEQ ID NO:68. În alte anumite variante de realizare, anticorpul anti-ADAM9 umanizat/optimizat este modificat pentru a prelungi timpul de înjumătăţire serică şi pentru conjugarea specifică situsului şi cuprinde un lanţ greu care are secvenţa SEQ ID NO: 152 şi un lanţ uşor care are secvenţa SEQ ID NO:68.
Prezenta invenţie are în vedere, de asemenea, în mod expres imunoconjugaţi care se leagă imunospecific la un epitop al unei polipeptide ADAM9 umane şi care cuprind oricare dintre domeniile VL sau VH anti-ADAM9 MAB-A umanizate/optimizate furnizate anterior. Prezenta invenţie are în vedere în special astfel de anticorpi anti-ADAM9 şi fragmente de legare a ADAM9 ale acestora care cuprind oricare dintre următoarele combinaţii de domenii VL sau VH anti-ADAM9 umanizate/optimizate:
Combinaţii hMAB-A VH / hMAB-A VL hMAB-A VH(2D) / hMAB-A VL(1) hMAB-A VH(2D) / hMAB-A VL(2) hMAB-A VH(2D) / hMAB-A VL(3) hMAB-A VH(2D) / hMAB-A VL(4) hMAB-A VH(2E) / hMAB-A VL(1) hMAB-A VH(2E) / hMAB-A VL(2) hMAB-A VH(2E) / hMAB-A VL(3) hMAB-A VH(2E) / hMAB-A VL(4) hMAB-A VH(2F) / hMAB-A VL(1) hMAB-A VH(2F) / hMAB-A VL(2) hMAB-A VH(2F) / hMAB-A VL(3) hMAB-A VH(2F) / hMAB-A VL(4) hMAB-A VH(2G) / hMAB-A VL(1) hMAB-A VH(2G) / hMAB-A VL(2) hMAB-A VH(2G) / hMAB-A VL(3) hMAB-A VH(2G) / hMAB-A VL(4) hMAB-A VH(2A) / hMAB-A VL(1) hMAB-A VH(2H) / hMAB-A VL(1) hMAB-A VH(2A) / hMAB-A VL(2) hMAB-A VH(2H) / hMAB-A VL(2) hMAB-A VH(2A) / hMAB-A VL(3) hMAB-A VH(2H) / hMAB-A VL(3) hMAB-A VH(2A) / hMAB-A VL(4) hMAB-A VH(2H) / hMAB-A VL(4) hMAB-A VH(2B) / hMAB-A VL(1) hMAB-A VH(2I) / hMAB-A VL(1) hMAB-A VH(2B) / hMAB-A VL(2) hMAB-A VH(2I) / hMAB-A VL(2) hMAB-A VH(2B) / hMAB-A VL(3) hMAB-A VH(2I) / hMAB-A VL(3) hMAB-A VH(2B) / hMAB-A VL(4) hMAB-A VH(2I) / hMAB-A VL(4) hMAB-A VH(2C) / hMAB-A VL(1) hMAB-A VH(2J) / hMAB-A VL(1) hMAB-A VH(2C) / hMAB-A VL(2) hMAB-A VH(2J) / hMAB-A VL(2) hMAB-A VH(2C) / hMAB-A VL(3) hMAB-A VH(2J) / hMAB-A VL(3) hMAB-A VH(2C) / hMAB-A VL(4) hMAB-A VH(2J) / hMAB-A VL(4)
Prezenta invenţie cuprinde în mod specific imunoconjugaţi care cuprind un domeniu VL şi/sau VH anti-ADAM9 umanizat/optimizat, astfel cum este furnizat anterior. În anumite variante de realizare, imunoconjugaţii conform prezentei invenţii cuprind (i) un domeniu VL şi/sau VH anti-ADAM9 umanizat/optimizat astfel cum este furnizat anterior şi (ii) o regiune Fc.
Deşi anumite modificări ale domeniilor VH şi VL anti-ADAM9 sunt rezumate mai sus şi comparate în FIG. 3A-3B, nu este necesară modificarea tuturor sau a majorităţii acestor resturi atunci când se modifică un domeniu VH sau VL anti-ADAM9 umanizat şi/sau optimizat conform invenţiei. Prezenta invenţie cuprinde, de asemenea, variaţii minore ale acestor secvenţe VH şi VL care includ, de exemplu, substituţii de aminoacizi ale resturilor de aminoacizi C-terminale şi/sau N-terminale care pot fi introduse pentru a facilita subclonarea.
III. Conjugaţi medicamentoşi cu anticorpi
Definiţii
Termenul "imunoconjugat," "conjugat" sau "ADC" astfel cum este utilizat în prezenta invenţie, se referă la un compus sau un derivat al acestuia (un agent farmacologic) care este legat la sau conjugat cu un anticorp anti-ADAM9 sau un fragment de legare a ADAM9 al acestuia, astfel cum este descris în prezenta invenţie.
Un "linker" este orice fracţiune chimică ce este capabilă să se lege la un agent farmacologic descris în prezenta invenţie (de exemplu compuşi maitansinoizi sau (indolinobenzodiazepină)), la un anticorp anti-ADAM9 sau la un fragment de legare a ADAM9 al acestuia, într-un mod covalent stabil. Linkerii pot fi susceptibili sau pot fi în mod substanţial rezistenţi la clivarea indusă de acid, clivarea indusă de lumină, clivarea indusă de peptidază, clivarea indusă de esterază şi clivarea legăturii disulfurice, în condiţiile în care compusul sau anticorpul rămâne activ. Linkeri adecvaţi sunt bine cunoscuţi în domeniu şi includ, de exemplu, grupări de disulfură, grupări de tioeter, grupări labile acide, grupări fotolabile, grupări labile de peptidază şi grupări labile de esterază. Linkerii includ, de asemenea, linkeri cu sarcină şi forme hidrofile ale acestora, astfel cum este descris în prezenta invenţie şi cunoscut în stadiul tehnicii. Termenul "alchil" astfel cum este utilizat în prezenta invenţie se referă la un radical de hidrocarbură monovalent saturat cu lanţ liniar sau ramificat cu unul până la douăzeci de atomi de carbon. Exemple de alchil includ, dar fără a se limita la, metil, etil, 1-propil, 2-propil, 1-butil, 2-metil-1-propil, -CH2CH(CH3)2), 2-butil, 2-metil-2-propil, 1-pentil, 2-pentil 3-pentil, 2-metil-2-butil, 3-metil-2-butil, 3-metil-1-butil, 2-metil-1-butil, 1-hexil), 2-hexil, 3-hexil, 2-metil-2-pentil, 3-metil-2-pentil, 4-metil-2-pentil, 3-metil-3-pentil, 2-metil-3-pentil, 2,3-dimetil-2-butil, 3,3-dimetil-2-butil, 1-heptil, 1-octil şi altele asemenea. De preferinţă, alchilul are unul până la zece atomi de carbon. Mai de preferat, alchilul are unul până la patru atomi de carbon. Numărul de atomi de carbon dintr-o grupare poate fi specificat aici prin prefixul "Cx-xx", în care x şi xx sunt numere întregi. De exemplu, "C1-4alchil" este o grupare alchil care are de la 1 până la 4 atomi de carbon. Termenii "compus" sau "compus citotoxic" sau "agent citotoxic" sunt utilizaţi în mod interschimbabil. Se intenţionează ca aceştia să includă compuşi pentru care a fost dezvăluită în prezenta invenţie o structură sau o formulă sau pentru care a fost încorporat/ă prin referinţă o structură sau o formulă sau orice derivat al acestora. Termenul include, de asemenea, stereoizomeri, izomeri geometrici, tautomeri, solvaţi, metaboliţi şi săruri (de exemplu săruri acceptabile din punct de vedere farmaceutic) ale unui compus cu toate formulele dezvăluite în prezenta invenţie. Termenul include, de asemenea, orice solvaţi, hidraţi şi polimorfi ai oricăruia dintre cei menţionaţi anterior. Menţionarea specifică a "stereoizomerilor," "izomerilor geometrici," "tautomerilor," "solvaţilor," "metaboliţilor," "sărurilor", "conjugaţilor," "sărurilor conjugaţilor," "solvaţilor," "hidraţilor" sau "polimorfilor" în anumite aspecte ale invenţiei descrise în prezenta cerere, nu trebuie interpretată ca o omisiune intenţionată a acestor forme în alte aspecte ale invenţiei, atunci când termenul "compus" se utilizează fără menţionarea acestor alte forme. Termenul "chiral" se referă la molecule care au proprietatea de non-superimpozabilitate a imaginii în oglindă a partenerului, în timp ce termenul "achiral" se referă la molecule care sunt superimpozabile cu imaginea în oglindă a partenerului acestora. Termenul "stereoizomer" se referă la compuşi care au o constituţie chimică şi conectivitate identică, însă orientări diferite în spaţiu ale atomilor acestora care nu pot fi interconvertite prin rotaţie în jurul unei legături unice. "Diastereomer" se referă la un stereoizomer cu doi sau mai mulţi centri de chiralitate şi ale cărui molecule nu sunt imaginea în oglindă una a celeilalte. Diastereomerii au proprietăţi fizice diferite, de exemplu puncte de topire, puncte de fierbere, proprietăţi spectrale şi reactivităţi. Amestecurile de diastereoizomeri se pot separa prin procedee analitice de înaltă rezoluţie, cum ar fi cristalizarea, electroforeza şi cromatografia. "Enantiomeri" se referă la doi stereoizomeri ai unui compus care sunt imagini în oglindă non-superimpozabile unul a celuilalt. Definiţiile şi convenţiile stereochimice utilizate în prezenta invenţie respectă, în general S. P. Parker, Ed., McGraw-Hill, Dictionary of Chemical Terms (1984) McGraw-Hill Book Company, New York; şi Eliel, E. and Wilen, S., Stereochemistry of Organic Compounds, John Wiley & Sons, Inc., New York, 1994. Compuşii conform invenţiei pot conţine centri asimetrici sau chirali şi, prin urmare, există sub diverse forme stereoizomerice. Se intenţionează ca toate formele stereoizomerice ale compuşilor conform invenţiei, care includ diastereoizomeri, enantiomeri şi atropizomeri, precum şi amestecuri ale acestora, cum ar fi amestecurile racemice, să facă parte din prezenta invenţie. Mulţi compuşi organici există în forme active din punct de vedere optic, adică aceştia au capacitatea de a roti planul luminii polarizate în plan. În descrierea unui compus activ din punct de vedere optic, prefixele D şi L sau R şi S, sunt utilizate pentru a indica configuraţia absolută a moleculei în jurul centrului sau centrilor chiral(i) al(ai) acestuia(ora). Prefixele d şi I sau (+) şi (-) sunt utilizate pentru a desemna semnul de rotaţie al planului luminii polarizate de către compus, (-) sau 1 însemnând faptul că respectivul compus este levorotator. Un compus cu prefixul cu (+) sau d este dextrorotator. Pentru o structură chimică dată, aceşti stereoizomeri sunt identici, cu excepţia cazului în care reprezintă imagini în oglindă unul a celuilalt. Un stereoizomer specific poate fi denumit, de asemenea, enantiomer, iar un amestec de astfel de izomeri este adesea denumit amestec enantiomeric. Un amestec 50:50 de enantiomeri este denumit un amestec racemic sau un racemat, care poate apărea acolo unde nu a existat o stereoselecţie sau stereospecificitate într-o reacţie sau procedeu chimic. Termenii "amestec racemic" şi "racemat" se referă la un amestec echimolar format din două specii enantiomerice, lipsit de activitate optică. Termenul "tautomer" sau "formă tautomerică" se referă la izomeri structurali cu energii diferite care sunt interconvertibili printr-o barieră energetică scăzută. De exemplu, tautomerii protonici (cunoscuţi şi sub denumirea de tautomeri prototropici) includ interconversii prin migrarea unui proton, cum ar fi izomerizări ceto-enolice şi imino-enaminice. Tautomerii de valenţă includ interconversii prin reorganizarea unora dintre electronii de legare. Termenul "reactiv la imină" se referă la un reactiv care este capabil să reacţioneze cu o grupare iminică. Exemple de reactiv la imină includ sulfiţi (H2SO3, H2SO2 sau o sare a HSO3-, SO32- sau HSO2-formată cu un cation), metabisulfit (H2S2O5 sau o sare a S2O52-formată cu un cation), mono, di, tri şi tetra- tiofosfaţi (PO3SH3, PO2S2H3, POS3H3, PS4H3 sau o sare a PO3S3-, PO2S23-, POS33- sau PS43- formată cu un cation), esteri ai tiofosfaţilor ((RiO)2PS(ORi), RiSH, RiSOH, RiSO2H, RiSO3H), diverse amine (hidroxilamină (de exemplu NH2OH), hidrazină (de exemplu NH2NH2), NH2O-Ri, Ri'NH-Ri, NH2-Ri), NH2-CO-NH2, NH2-C(=S)-NH2' tiosulfat (H2S2O3 sau o sare a S2O32- formată cu un cation), ditionit (H2S2O4 sau o sare a S2O42- formată cu un cation), fosforoditioat (P(=S)(ORk)(SH)(OH) sau o sare a acestuia formată cu un cation), acid hidroxamic (RkC(=O)NHOH sau o sare formată cu un cation), hidrazidă (RkCONHNH2), sulfoxilat de formaldehidă (HOCH2SO2H sau o sare a HOCH2SO2- formată cu un cation, cum ar fi HOCH2SO2-Na+), nucleotidă glicată (cum ar fi GDP-manoză), fludarabină sau un amestec al acestora, în care Ri şi Ri' sunt fiecare în mod independent un alchil liniar sau ramificat care are 1 până la 10 atomi de carbon şi sunt substituiţi cu cel puţin un substituent selectat dintre -N(Rj)2, -CO2H, -SO3H şi -PO3H; Ri şi Ri' pot fi în mod opţional substituiţi suplimentar cu un substituent pentru un alchil descris în prezenta invenţie; Rj este un alchil liniar sau ramificat care are 1 până la 6 atomi de carbon; şi Rk este un alchil, alchenil sau alchinil liniar, ramificat sau ciclic care are 1 până la 10 atomi de carbon, aril, heterociclil sau heteroaril (de preferat, Rk este un alchil liniar sau ramificat care are 1 până la 4 atomi de carbon; mai de preferat, Rk este metil, etil sau propil). De preferat, cationul este un cation monovalent, cum ar fi Na+ or K+. De preferat, reactivul imin-reactiv este selectat dintre sulfiţi, hidroxilamină, uree şi hidrazină. Mai de preferat, reactivul la imină este NaHSO3 sau KHSO3. Termenul "cation" se referă la un ion cu sarcină pozitivă. Cationul poate fi monovalent (de exemplu Na+, K+, NH4+ etc.), bivalent (de exemplu Ca2+, Mg2+ etc.) sau multivalent (de exemplu A13+ etc.). De preferat, cationul este monovalent. Termenul "sare acceptabilă din punct de vedere farmaceutic" astfel cum este utilizat în prezenta invenţie, se referă la săruri organice sau anorganice acceptabile din punct de vedere farmaceutic ale unui compus conform invenţiei. Exemple de săruri includ sulfat, citrat, acetat, oxalat, clorură, bromură, iodură, azotat, bisulfat, fosfat, fosfat acid, izonicotinat, lactat, salicilat, citrat acid, tartrat, oleat, tanat, pantotenat, bitartrat, ascorbat, succinat, maleat, gentisinat, fumarat, gluconat, glucuronat, zaharat, format, benzoat, glutamat, metansulfonat "mesilat", etansulfonat, benzensulfonat, p-toluensulfonat, săruri de pamoat (adică 1,1'-metilen-bis-(2-hidroxi-3)-naftoat)), săruri de metale alcaline (de exemplu sodiu şi potasiu), săruri de metale alcalino-pământoase (de exemplu magneziu) şi săruri de amoniu. O sare acceptabilă din punct de vedere farmaceutic poate implica includerea unei alte molecule, cum ar fi un ion de acetat, un ion de succinat sau alt contra-ion. Contra-ionul poate fi orice fragment organic sau anorganic ce stabilizează sarcina de pe compusul părinte. În plus, o sare acceptabilă farmaceutic poate avea în structura sa mai mult de un atom cu sarcină. În cazuri în care din sarea acceptabilă farmaceutic fac parte mai mulţi atomi cu sarcină, pot exista mai mulţi contra-ioni. Prin urmare, o sare acceptabilă din punct de vedere farmaceutic poate avea unul sau mai mulţi atomi cu sarcină şi/sau unul sau mai mulţi contra-ioni. În cazul în care compusul este o bază, sarea acceptabilă din punct de vedere farmaceutic dorită poate fi preparată prin orice procedeu adecvat disponibil în stadiul tehnicii, de exemplu, tratarea bazei libere cu un acid anorganic, cum ar fi acid clorhidric, acid bromhidric, acid sulfuric, acid azotic, acid metansulfonic, acid fosforic şi altele asemenea sau cu un acid organic, cum ar fi acid acetic, acid maleic, acid succinic, acid mandelic, acid fumaric, acid malonic, acid piruvic, acid oxalic, acid glicolic, acid salicilic, un acid piranozidilic, cum ar fi acid glucuronic sau acid galacturonic, un alfa-hidroxi-acid, cum ar fi acid citric sau acid tartric, un aminoacid, cum ar fi acid aspartic sau acid glutamic, un acid aromatic, cum ar fi acid benzoic sau acid cinamic, un acid sulfonic, cum ar fi acid p-toluensulfonic sau acid etansulfonic sau altele asemenea. În cazul în care compusul este un acid, sarea acceptabilă din punct de vedere farmaceutic dorită poate fi preparată prin orice procedeu adecvat, de exemplu tratarea acidului liber cu o bază anorganică sau organică, cum ar fi o amină (primară, secundară sau terţiară), un hidroxid de metal alcalin sau hidroxid de metal alcalino-pământos sau altele asemenea. Exemple ilustrative de săruri adecvate includ săruri organice derivate din aminoacizi, cum ar fi glicină şi arginină, amoniac, amine primare, secundare şi terţiare şi amine ciclice, cum ar fi piperidină, morfolină şi piperazină şi săruri anorganice derivate din sodiu, calciu, potasiu, magneziu, mangan, fier, cupru, zinc, aluminiu şi litiu. Astfel cum este utilizat în prezenta invenţie, termenul "solvat" semnifică un compus care include suplimentar o cantitate stoichiometrică sau non-stoichiometrică de solvent cum ar fi apă, izopropanol, acetonă, etanol, metanol, DMSO, acetat de etil, acid acetic şi etanolamină diclorometan, 2-propanol sau altele asemenea, legate prin forţe intermoleculare necovalente. Solvaţii sau hidraţii compuşilor sunt preparaţi uşor prin adăugarea a cel puţin unui echivalent molar al unui solvent hidroxilic cum ar fi metanol, etanol, 1-propanol, 2-propanol sau apă la compus pentru a rezulta solvatarea sau hidratarea fracţiunii de imină. Un "metabolit" sau "catabolit" este un produs, produs prin metabolizarea sau catabolizarea în organism a unui compus specificat, a unui derivat al acestuia sau a unui conjugat al acestuia sau a sării acestuia. Metaboliţii unui compus, un derivat al acestuia sau un conjugat al acestuia, pot fi identificaţi utilizând tehnici de rutină cunoscute în stadiul tehnicii şi activităţile acestora pot fi determinate utilizând teste cum ar fi cele descrise în prezenta invenţie. Astfel de produse pot rezulta, de exemplu, din oxidarea, hidroxilarea, reducerea, hidroliza, amidarea, deamidarea, esterificarea, deesterificarea, clivajul enzimatic şi altele asemenea ale compusului administrat. Termenul "acceptabil din punct de vedere farmaceutic" indică faptul că substanţa sau compoziţia trebuie să fie compatibilă din punct de vedere chimic şi/sau toxicologic, cu celelalte ingrediente cuprinse într-o formulare şi/sau cu mamiferul tratat cu aceasta. Termenul "grupare protectoare" sau "fracţiune protectoare" se referă la un substituent care se utilizează de obicei pentru a bloca sau a proteja o anumită funcţionalitate în timpul reacţiei altor grupări funcţionale de pe compus, un derivat al acestuia sau un conjugat al acestuia. De exemplu, o "grupare amino-protectoare" sau o "fracţiune amino-protectoare" este un substituent ataşat la o grupare amino care blochează sau protejează funcţionalitatea amino din compus. Astfel de grupări sunt bine cunoscute în stadiul tehnicii (a se vedea, de exemplu, P. Wuts şi T. Greene, 2007, Protective Groups in Organic Synthesis, Capitolul 7, J. Wiley & Sons, NJ) şi sunt exemplificate prin carbamaţi cum ar fi carbamat de metil şi etil, FMOC, carbamaţi de etil substituiţi, carbamaţi clivaţi prin eliminarea 1,6-β (denumită, de asemenea, "auto-imolativă"), uree, amide, peptide, alchil şi derivaţi ai arilului. Grupări amino-protectoare adecvate includ acetil, trifluoroacetil, t-butoxicarbonil (BOC), benziloxicarbonil (CBZ) şi 9-fluorenilmetilenoxicarbonil (Fmoc). Pentru o descriere generală a grupărilor protectoare şi a utilizării acestora, a se vedea P. G.M. Wuts & T. W. Greene, Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley & Sons, New York, 2007. Termenul "aminoacid" se referă la aminoacizi care apar în mod natural sau aminoacizi care apar în mod nenatural. Într-o variantă de realizare, aminoacidul este reprezentat de NH2-C(Raa'Raa)-C(=O)OH, în care Raa şi Raa' sunt fiecare în mod independent H, un alchil, alchenil sau alchinil liniar, ramificat sau ciclic în mod opţional substituit, care are 1 până la 10 atomi de carbon, un aril, heteroaril sau heterociclil sau Raa şi atomul de azot N-terminal pot forma împreună un inel heterociclic (de exemplu ca în prolină). Termenul "rest de aminoacid" se referă la restul corespunzător atunci când este îndepărtat un atom de hidrogen din capătul de amină şi/sau carboxi al aminoacidului, cum ar fi -NH-C(Raa'Raa)-C(=O)O-. Termenul "peptidă" se referă la lanţuri scurte de monomeri de aminoacizi legaţi prin legături peptidice (amidice). În unele variante de realizare, peptidele conţin 2 până la 20 de resturi de aminoacizi. În alte variante de realizare, peptidele conţin 2 până la 10 de resturi de aminoacizi. În alte variante de realizare, peptidele conţin 2 până la 5 de resturi de aminoacizi. Astfel cum este utilizat în prezenta invenţie, atunci când o peptidă este o porţiune a unui agent citotoxic sau atunci când un linker descris în prezenta invenţie este reprezentat de o anumită secvenţă de aminoacizi, peptida poate fi conectată la restul de agent citotoxic sau la linker în ambele direcţii. De exemplu, o dipeptidă XI-X2 include XI-X2 şi X2-X1. În mod similar, o tripeptidă X1-X2-X3 include X1-X2-X3 şi X3-X2-X1 şi o tetrapeptidă X1-X2-X3-X4 include X1-X2-X3-X4 şi X4-X2-X3-X1. X1, X¬2, X3 şi X4 reprezintă un rest de aminoacid. Termenul "grupare esterică reactivă" se referă la o grupare esterică ce poate reacţiona cu uşurinţă cu o grupare amino pentru a forma o legătură amidică. Grupări esterice reactive exemplificative includ esteri de N-hidroxisuccinimidă, esteri de N-hidroxiftalimidă, esteri de N-hidroxi sulfo-succinimidă, esteri de para-nitrofenil, esteri de dinitrofenil, esteri de pentafluorofenil şi derivaţii acestora, în care derivaţii menţionaţi facilitează formarea legăturii amidice. În anumite variante de realizare, gruparea esterică reactivă este un ester de N-hidroxisuccinimidă sau un ester de N-hidroxi sulfo-succinimidă. Termenul "grupare reactivă la amină" se referă la o grupare care poate reacţiona cu o grupare amino pentru a forma o legătură covalentă. Grupări reactive la amină exemplificative includ grupări esterice reactive, halogenuri de acil, halogenură de sulfonil, imidoester sau o grupare tioesterică reactivă. În anumite variante de realizare, gruparea reactivă la amină este o grupare esterică reactivă. Într-o variantă de realizare, gruparea reactivă la amină este un ester de N-hidroxisuccinimidă sau un ester de N-hidroxi sulfo-succinimidă. Termenul "grupare reactivă la tiol" se referă la o grupare care poate reacţiona cu o grupare tiol (-SH) pentru a forma o legătură covalentă. Grupări reactive la tiol exemplificative includ maleimidă, haloacetil, aloacetamidă, vinil sulfonă, vinil sulfonamidă sau vinil piridină. Într-o variantă de realizare, gruparea reactivă la tiol este maleimidă. Astfel cum sunt utilizate în prezenta dezvăluire şi în revendicări, formele de singular "un", "o" şi "respectivul/respectiva" includ formele de plural, cu excepţia cazului în care contextul dictează în mod clar altfel. Se înţelege faptul că ori de câte ori sunt descrise în prezenta invenţie variante de realizare cu termenul "care cuprind," sunt furnizate de asemenea şi variante de realizare analoage descrise cu termenii "constând din" şi/sau " "constând în esenţă din".
A. Imunoconjugaţi exemplificativi
Prezenta invenţie se referă la imunoconjugaţi care cuprind un anticorp anti-ADAM9 sau un fragment de legare a ADAM9 al acestuia (astfel cum este definit în prezenta invenţie) conjugat cu cel puţin un agent farmacologic. Agenţii farmacologici includ, dar fără a se limita la, citotoxine, (de exemplu un agent citostatic sau citocid), agenţi terapeutici şi ioni metalici radioactivi, de exemplu emiţători alfa. Citotoxinele sau agenţii citotoxici includ orice agent care este dăunător celulelor, cum ar fi, de exemplu, exotoxina Pseudomonas, toxina Diptheria, o toxină botulinică A până la F, ricin abrină, saporină şi fragmente citotoxice ale unor astfel de agenţi. Agenţii terapeutici includ orice agent care are un efect terapeutic pentru a trata din punct de vedere profilactic sau terapeutic o tulburare. Astfel de agenţi terapeutici pot fi agenţi terapeutici chimici, agenţi terapeutici proteici sau polipeptidici şi includ agenţi terapeutici care posedă o activitate biologică dorită şi/sau care modifică un răspuns biologic dat. Exemple de agenţi terapeutici includ agenţi de alchilare, inhibitori de angiogeneză, agenţi anti-mitotici, agenţi de terapie hormonală şi anticorpi utili pentru tratamentul tulburărilor proliferative celulare. În anumite variante de realizare, agenţii terapeutici sunt compuşi maitansinoizi, cum ar fi cei descrişi în Brevetele SUA nr. 5,208,020 şi 7,276,497. În anumite variante de realizare, agenţii terapeutici sunt compuşi benzodiazepinici, cum ar fi pirolobenzodiazepină (PBD) (cum ar fi cei descrişi în WO2010/043880, WO2011/130616, WO2009/016516, WO 2013/177481 şi WO 2012/112708) şi compuşi indolinobenzodiazepinici (IGN) (cum ar fi cei descrişi în WO/2010/091150 şi WO 2012/128868 şi Cererea SUA nr. 15/195,269, depusă în data de 28 iunie 2016, intitulată "CONJUGAŢI AI ANTICORPILOR MODIFICAŢI CU CISTEINĂ").
Astfel cum este utilizat în prezenta invenţie, un compus "pirolobenzodiazepinic" (PBD) este un compus care are o structură de nucleu pirolobenzodiazepinic. Pirolobenzodiazepina poate fi substituită sau nesubstituită. Acesta include, de asemenea, un compus care are două nuclee pirolobenzodiazepinice legate printr-un linker. Funcţionalitatea iminică (-C=N-) ca parte a nucleului indolinobenzodiazepinic poate fi redusă. În anumite variante de realizare, compusul pirolobenzodiazepinic cuprinde o structură de nucleu reprezentată prin
care poate fi în mod opţional substituit.
În anumite variante de realizare, compusul pirolobenzodiazepinic cuprinde o structură de nucleu reprezentată prin
care poate fi în mod opţional substituit.
Astfel cum este utilizat în prezenta invenţie, un compus "indolinobenzodiazepinic" (IGN) este un compus care are o structură de nucleu indolinobenzodiazepinic. Indolinobenzodiazepina poate fi substituită sau nesubstituită. Acesta include, de asemenea, un compus care are două nuclee indolinobenzodiazepinice legate printr-un linker. Funcţionalitatea iminică (-C=N-) ca parte a nucleului indolinobenzodiazepinic poate fi redusă. În anumite variante de realizare, compusul indolinobenzodiazepinic cuprinde o structură de nucleu reprezentată prin
care poate fi în mod opţional substituit.
În anumite variante de realizare, compusul indolinobenzodiazepinic cuprinde o structură de nucleu reprezentată prin
care poate fi substituit în plus.
Agentul farmacologic poate fi cuplat sau conjugat fie direct cu anticorpul anti-ADAM9 sau cu fragmentul de legare a ADAM9 al acestuia, fie indirect, printr-un linker utilizând tehnici cunoscute în stadiul tehnicii pentru a produce un "imunoconjugat," "conjugat" sau "ADC." Într-o primă variantă de realizare, imunoconjugatul conform prezentei invenţii cuprinde un anticorp anti-ADAM9 sau un fragment de legare a ADAM9 al acestuia descris în prezenta invenţie, legat covalent la un agent farmacologic descris în prezenta invenţie prin gruparea ε-amino a unuia sau mai multor resturi de lizină situate pe anticorpul anti-ADAM9 sau un fragment de legare a ADAM9 al acestuia. Într-o primă variantă de realizare specifică a primei variante de realizare, imunoconjugatul conform prezentei invenţii este reprezentat de următoarea formulă:
în care:
CBA este un anticorp anti-ADAM9 sau un fragment de legare a ADAM9 al acestuia
descris anterior în prezenta invenţie, care este legat covalent la CyL1 printr-un rest de lizină;
WL este un număr întreg de la 1 până la 20; şi
CyL1 este un compus citotoxic reprezentat de următoarea formulă:
sau
sau o sare acceptabilă din punct de vedere farmaceutic a acestuia, în care:
linia dublă dintre N şi C reprezintă o legătură simplă sau o legătură dublă, cu condiţia ca, atunci când este o legătură dublă, X să fie absent şi Y să fie -H sau un (C1-C4)alchil; şi atunci când este o legătură simplă, X să fie -H sau o fracţiune protectoare pentru o amină şi Y să fie -OH sau -SO3H sau o sare acceptabilă din punct de vedere farmaceutic a acestuia;
W' este -NRe',
Re' este -(CH2-CH2-O)n-Rk;
n este un număr întreg de la 2 până la 6;
Rk este -H sau -Me;
Rx3 este un (C1-C6)alchil;
L' este reprezentat de următoarea formulă:
- NR5-P-C(=O)-(CRaRb)m-C(=O)- (B1'); sau
- NR5-P-C(=O)-(CRaRb)m-S-Zs1- (B2');
R5 este -H sau un (C1-C3)alchil;
P este un rest de aminoacid sau o peptidă care conţine între 2 şi 20 de resturi de aminoacizi;
Ra şi Rb, la fiecare apariţie, sunt fiecare în mod independent -H, (C1-C3)alchil sau un substituent cu sarcină sau o grupare ionizabilă Q;
m este un număr întreg de la 1 până la 6; şi
Zs1 este selectat din oricare dintre următoarele formule:
şi
în care q este un număr întreg de la 1 până la 5.
Într-o a 2a variantă de realizare specifică a conjugaţilor cu formula (L1), CyL1 este reprezentat de formula (L1a) sau (L1a1); şi variabilele rămase sunt astfel cum au fost descrise anterior în prima variantă de realizare specifică. Într-o a 3a variantă de realizare specifică a conjugaţilor cu formula (L1), CyL1 este reprezentat de formula (L1b) sau (L1b1); şi variabilele rămase sunt astfel cum au fost descrise anterior în prima variantă de realizare specifică. Mai precis, Rx3 este un (C2-C4)alchil. Într-o a 4a variantă de realizare specifică a conjugaţilor cu formula (L1), CyL1
este reprezentat de formula (L1a); Ra şi Rb sunt ambii H; R5 este H sau Me şi variabilele rămase sunt astfel cum au fost descrise anterior în prima variantă de realizare specifică.
Într-o a 5a variantă de realizare specifică, P este o peptidă care conţine 2 până la 5 resturi de aminoacizi; şi variabilele rămase sunt descrise anterior în prima, cea de-a 2a sau cea de-a 4a variantă de realizare specifică. Într-o variantă de realizare mai specifică, P este selectată din grupul constând din Gly-Gly-Gly, Ala-Val, Val-Ala, Val-Cit, Val-Lys, Phe-Lys, Lys-Lys, Ala-Lys, Phe-Cit, Leu-Cit, Ile-Cit, Trp, Cit, Phe-Ala, Phe-N9-tosyl-Arg, Phe-N9-nitro-Arg, Phe-Phe-Lys, D-Phe-Phe-Lys, Gly-Phe-Lys, Leu-Ala-Leu, Ile-Ala-Leu, Val-Ala-Val, Ala-Leu-Ala-Leu (SEQ ID NO:144, β-Ala-Leu-Ala-Leu (SEQ ID NO:145), Gly-Phe-Leu-Gly (SEQ ID NO:146), Val-Arg, Arg-Val, Arg-Arg, Val-D-Cit, Val-D-Lys, Val-D-Arg, D-Val-Cit, D-Val-Lys, D-Val-Arg, D-Val-D-Cit, D-Val-D-Lys, D-Val-D-Arg, D-Arg-D-Arg, Ala-Ala, Ala-D-Ala, D-Ala-Ala, D-Ala-D-Ala, Ala-Met, Met-Ala, Gln-Val, Asn-Ala, Gln-Phe şi Gln-Ala. Mai precis, P este Gly-Gly-Gly, Ala-Val, Ala-Ala, Ala-D-Ala, D-Ala-Ala sau D-Ala-D-Ala. Într-o a 6a variantă de realizare specifică, Q este -SO3H sau o sare acceptabilă din punct de vedere farmaceutic a acestuia; şi variabilele rămase sunt astfel cum au fost descrise anterior în prima, cea de-a 2a, cea de-a 4a sau cea de-a 5a variantă de realizare specifică sau oricare alte variante de realizare specifice descrise în prezenta invenţie. Într-o a 7a variantă de realizare specifică, imunoconjugatul primei variante de realizare este reprezentat de următoarea formulă:
sau
sau o sare acceptabilă din punct de vedere farmaceutic a acestuia, în care WL este un număr întreg de la 1 până la 10; linia dublă dintre N şi C reprezintă o legătură simplă sau o legătură dublă, cu condiţia ca, atunci când este o legătură dublă, X să fie absent şi Y să fie -H; şi atunci când este o legătură simplă, X să fie -H şi Y să fie -OH sau -SO3H sau o sare acceptabilă din punct de vedere farmaceutic a acestuia. Într-o variantă de realizare mai specifică, linia dublă dintre N şi C reprezintă o legătură dublă, X este absent şi Y este -H. Într-o altă variantă de realizare mai specifică, linia dublă dintre N şi C reprezintă o legătură simplă, X este -H şi Y este -SO3H sau o sare acceptabilă din punct de vedere farmaceutic a acestuia.
Într-o a 8a variantă de realizare specifică, imunoconjugatul primei variante de realizare este reprezentat de următoarea formulă:
în care:
CBA este un anticorp anti-ADAM9 sau un fragment de legare a ADAM9 al acestuia descris anterior în prezenta invenţie, care este legat covalent la CyL2 printr-un rest de lizină;
WL este un număr întreg de la 1 până la 20; şi
CyL2 este un compus citotoxic reprezentat de următoarea formulă:
sau o sare acceptabilă din punct de vedere farmaceutic a acestuia, în care:
linia dublă dintre N şi C reprezintă o legătură simplă sau o legătură dublă, cu condiţia ca, atunci când este o legătură dublă, X să fie absent şi Y să fie -H sau un (C1-C4)alchil; şi atunci când este o legătură simplă, X să fie -H sau o fracţiune protectoare pentru o amină, şi Y să fie -OH sau -SO3H sau o sare acceptabilă din punct de vedere farmaceutic a acestuia;
Rx1 şi Rx2 sunt în mod independent (C1-C6)alchil;
Re este -H sau un (C1-C6)alchil;
W' este -NRe',
Re' este -(CH2-CH2-O)n-Rk;
n este un număr întreg de la 2 până la 6;
Rk este -H sau -Me;
Zs1 este selectat din oricare dintre următoarele formule:
şi
în care q este un număr întreg de la 1 până la 5.
Într-o a 9a variantă de realizare specifică a imunoconjugaţilor cu formula (L2), CyL2 este reprezentat de formula (L2a) sau (L2a1); şi variabilele rămase sunt astfel cum au fost descrise anterior în cea de-a 8a variantă de realizare specifică. Într-o a 10a variantă de realizare specifică a imunoconjugaţilor cu formula (L2), CyL2 este reprezentat de formula (L2b) sau (L2b1); şi variabilele rămase sunt astfel cum au fost descrise anterior în cea de-a 8a variantă de realizare specifică. Într-o a 11a variantă de realizare specifică a imunoconjugaţilor cu formula (L2), Re este H sau Me; Rx1 şi Rx2 sunt în mod independent -(CH2)p-(CRfRg)-, în care Rf şi Rg sunt fiecare în mod independent -H sau un (C1-C4)alchil; şi p este 0, 1, 2 sau 3; şi variabilele rămase sunt astfel cum au fost descrise anterior în cea de-a 8a, a 9a sau a 10a variantă de realizare specifică. Mai precis, Rf şi Rg sunt identici sau diferiţi, şi sunt selectaţi dintre -H şi -Me. Într-o a 12a variantă de realizare specifică, imunoconjugatul primei variante de
realizare este reprezentat de următoarea formulă:
sau
sau o sare acceptabilă din punct de vedere farmaceutic a acestuia, în care WL este un număr întreg de la 1 până la 10; linia dublă dintre N şi C reprezintă o legătură simplă sau o legătură dublă, cu condiţia ca, atunci când este o legătură dublă, X să fie absent şi Y să fie -H; şi atunci când este o legătură simplă, X să fie -H şi Y să fie -OH sau -SO3H sau o sare acceptabilă din punct de vedere farmaceutic a acestuia. Într-o altă variantă de realizare mai specifică, linia dublă dintre N şi C reprezintă o legătură dublă. Într-o altă variantă de realizare mai specifică, linia dublă dintre N şi C reprezintă o legătură simplă, X este -H şi Y este -SO3H sau o sare acceptabilă din punct de vedere farmaceutic a acestuia.
Într-o a 13a variantă de realizare specifică, imunoconjugatul primei variante de realizare este reprezentat de următoarea formulă:
în care:
CBA este un anticorp anti-ADAM9 sau un fragment de legare a ADAM9 al acestuia descris anterior în prezenta invenţie, care este legat covalent la CyL3 printr-un rest de Lys;
WL este un număr întreg de la 1 până la 20;
CyL3 este reprezentat de următoarea formulă:
m' este 1 sau 2;
R1 şi R2, sunt fiecare în mod independent H sau un (C1-C3)alchil; şi
Zs1 este selectat din oricare dintre următoarele formule:
şi
în care q este un număr întreg de la 1 până la 5;
Într-o a 14a variantă de realizare specifică a imunoconjugaţilor cu formula (L3), m' este 1, iar R1 şi R2 sunt ambii H; şi variabilele rămase sunt astfel cum au fost descrise anterior în cea de-a 13a variantă de realizare specifică. Într-o a 15a variantă de realizare specifică a imunoconjugaţilor cu formula (L3), m' este 2, iar R1 şi R2 sunt ambii Me; şi variabilele rămase sunt astfel cum au fost descrise anterior în cea de-a 13a variantă de realizare specifică. Într-o a 16a variantă de realizare specifică, imunoconjugatul primei variante de realizare este reprezentat de următoarea formulă:
sau
sau o sare acceptabilă din punct de vedere farmaceutic a acestuia, în care WL este un număr întreg de la 1 până la 10.
Într-o a 17a variantă de realizare specifică a imunoconjugaţilor primei variante de realizare, Y este -SO3H, --SO3Na sau -SO3K; şi variabilele rămase sunt astfel cum au fost descrise anterior în oricare dintre prima până la cea de-a 16a variantă de realizare specifică sau oricare variantă de realizare mai specifică descrisă în prezenta invenţie. Într-o variantă de realizare, Y este --SO3Na.
În anumite variante de realizare a compoziţiilor (de exemplu compoziţii farmaceutice) care cuprind imunoconjugaţi ai primei variante de realizare, prima, cea de-a 2a, a 3a, a 4a, a 5a, a 6a, a 7a, a 8a, a 9a, a 10a, a 11a, a 12a, a 13a, a 14a, a 15a, a 16a sau a 17a variantă de realizare specifică, cantitatea medie de agent citotoxic per moleculă de anticorp (adică valoarea medie a wL), cunoscut şi sub denumirea de Raportul Medicament-Anticorpi (DAR) din compoziţie este cuprins în intervalul de la 1,0 până la 8,0. În unele variante de realizare, DAR este cuprins în intervalul de la 1,0 până la 5,0, 1,0 până la 4,0, 1,0 până la 3,4, 1,0 până la 3,0, 1,5 până la 2,5, 2,0 până la 2,5 sau 1,8 până la 2,2. În unele variante de realizare, DAR este mai puţin de 4,0, mai puţin de 3,8, mai puţin de 3,6, mai puţin de 3,5, mai puţin de 3,0 sau mai puţin de 2,5. Într-o a doua variantă de realizare, imunoconjugaţii conform prezentei invenţii cuprind un anticorp anti-ADAM9 sau un fragment de legare a ADAM9 al acestuia descris anterior, legat covalent la un agent citotoxic descris în prezenta invenţie prin gruparea tiol (-SH) a unuia sau mai multor resturi de cisteină localizate pe anticorpul anti-ADAM9 sau un fragment de legare a ADAM9 al acestuia. Într-o primă variantă de realizare specifică, imunoconjugatul celei de-a doua variante de realizare este reprezentat de următoarea formulă:
în care:
CBA este un anticorp anti-ADAM9 sau un fragment de legare a ADAM9 al acestuia descris în prezenta invenţie, legat covalent la CyC1 printr-un rest de cisteină;
WC este 1 sau 2;
CyC1 este reprezentat de următoarea formulă:
sau
sau o sare acceptabilă din punct de vedere farmaceutic a acestuia, în care:
linia dublă dintre N şi C reprezintă o legătură simplă sau o legătură dublă, cu condiţia ca, atunci când este o legătură dublă, X să fie absent şi Y să fie -H sau un (C1-C4)alchil; şi atunci când este o legătură simplă, X să fie -H sau o fracţiune protectoare pentru o amină, şi Y să fie -OH sau -SO3H sau o sare acceptabilă din punct de vedere farmaceutic a acestuia;
R5 este -H sau un (C1-C3)alchil;
P este un rest de aminoacid sau o peptidă care conţine 2 până la 20 de resturi de aminoacizi;
Ra şi Rb, la fiecare apariţie, sunt în mod independent -H, (C1-C3)alchil sau un substituent cu sarcină sau o grupare ionizabilă Q;
W' este -NRe',
Re' este -(CH2-CH2-O)n-Rk;
n este un număr întreg de la 2 până la 6;
Rk este -H sau -Me;
Rx3 este un (C1-C6)alchil; şi
LC este reprezentat de:
în care s1 este situsul legat covalent la CBA şi s2 este situsul legat covalent la gruparea -C(=O)- de pe CyC1; în care:
R19 şi R20, la fiecare apariţie, sunt în mod independent -H sau un (C1-C3)alchil;
m" este un număr întreg cuprins între 1 şi 10; şi
Rh este -H sau un (C1-C3)alchil.
Într-o a 2a variantă de realizare specifică a imunoconjugatului cu formula (C1), CyC1 este reprezentat de formula (C1a) sau (C1a1); şi variabilele rămase sunt astfel cum au fost descrise anterior în prima variantă de realizare specifică a celei de-a doua variante de realizare.
Într-o a 3a variantă de realizare specifică a imunoconjugatului cu formula (C1), CyC1 este reprezentat de formula (C1b) sau (C1b1); şi variabilele rămase sunt astfel cum au fost descrise anterior în prima variantă de realizare specifică a celei de-a doua variante de realizare. Într-o a 4a variantă de realizare specifică a imunoconjugatului cu formula (C1), CyC1 este reprezentat de formula (C1a) sau (C1a1); Ra şi Rb sunt ambii H; şi R5 este H sau Me; şi variabilele rămase sunt astfel cum au fost descrise anterior în prima sau cea de-a 2a variantă de realizare specifică a celei de-a doua variante de realizare. Într-o a 5a variantă de realizare specifică a imunoconjugatului cu formula (C1), P este o peptidă care conţine 2 până la 5 resturi de aminoacizi; şi variabilele rămase sunt astfel cum au fost descrise anterior în prima, cea de-a 2a sau cea de-a 4a variantă de realizare specifică a celei de-a doua variante de realizare. Într-o variantă de realizare mai specifică, P este selectat dintre Gly-Gly-Gly, Ala-Val, Val-Ala, Val-Cit, Val-Lys, Phe-Lys, Lys-Lys, Ala-Lys, Phe-Cit, Leu-Cit, Ile-Cit, Trp, Cit, Phe-Ala, Phe-N9-tosyl-Arg, Phe-N9-nitro-Arg, Phe-Phe-Lys, D-Phe-Phe-Lys, Gly-Phe-Lys, Leu-Ala-Leu, Ile-Ala-Leu, Val-Ala-Val, Ala-Leu-Ala-Leu (SEQ ID NO: 144), β-Ala-Leu-Ala-Leu (SEQ ID NO: 145), Gly-Phe-Leu-Gly (SEQ ID NO:146), Val-Arg, Arg-Val, Arg-Arg, Val-D-Cit, Val-D-Lys, Val-D-Arg, D-Val-Cit, D-Val-Lys, D-Val-Arg, D-Val-D-Cit, D-Val-D-Lys, D-Val-D-Arg, D-Arg-D-Arg, Ala-Ala, Ala-D-Ala, D-Ala-Ala, D-Ala-D-Ala, Ala-Met, Met-Ala, Gln-Val, Asn-Ala, Gln-Phe şi Gln-Ala. Într-o altă variantă de realizare mai specifică, P este Gly-Gly-Gly, Ala-Val, Ala-Ala, Ala-D-Ala, D-Ala-Ala sau D-Ala-D-Ala. Într-o a 6a variantă de realizare specifică a imunoconjugaţilor cu formula (C1), Q este -SO3H sau o sare acceptabilă din punct de vedere farmaceutic a acestuia; şi variabilele rămase sunt astfel cum au fost descrise anterior în prima, cea de-a 2a, cea de-a 4a sau cea de-a 5a variantă de realizare specifică a celei de-a doua variante de realizare sau oricare variante de realizare mai specifice descrise în prezenta invenţie. Într-o a 7a variantă de realizare specifică a imunoconjugaţilor cu formula (C1), R19 şi R20 sunt ambii H; şi m" este un număr întreg de la 1 până la 6; şi variabilele rămase sunt astfel cum au fost descrise anterior în prima, cea de-a 2a, cea de-a 3a, cea de-a 4a, cea de-a 5a sau cea de-a 6a variantă de realizare specifică a celei de-a doua variante de realizare sau oricare variante de realizare mai specifice descrise în prezenta invenţie. Într-o a 8a variantă de realizare specifică a imunoconjugaţilor cu formula (C1), -L-Lc- este reprezentat de următoarea formulă:
şi variabilele rămase sunt astfel cum au fost descrise anterior în prima, cea de-a 2a, cea de-a 3a, cea de-a 4a, cea de-a 5a, cea de-a 6a sau cea de-a 7a variantă de realizare specifică a celei de-a doua variante de realizare sau oricare variante de realizare mai specifice descrise în prezenta invenţie.
Într-o a 9a variantă de realizare specifică, imunoconjugatul celei de-a doua variante de realizare este reprezentat de următoarea formulă:
sau
sau o sare acceptabilă din punct de vedere farmaceutic a acestuia, în care linia dublă dintre N şi C reprezintă o legătură simplă sau o legătură dublă, cu condiţia ca, atunci când este o legătură dublă, X să fie absent şi Y să fie -H şi atunci când este o legătură simplă, X să fie -H şi Y să fie -OH sau -SO3H sau o sare acceptabilă din punct de vedere farmaceutic a acestuia. Într-o variantă de realizare mai specifică, linia dublă dintre N şi C reprezintă o legătură dublă, X este absent şi Y este -H. Într-o altă variantă de realizare mai specifică, linia dublă dintre N şi C reprezintă o legătură simplă, X este -H şi Y este -SO3H sau o sare acceptabilă din punct de vedere farmaceutic a acestuia.
Într-o a 10a variantă de realizare specifică, imunoconjugatul celei de-a doua variante de realizare este reprezentat de următoarea formulă:
în care:
CBA este un anticorp anti-ADAM9 sau un fragment de legare a ADAM9 al acestuia descris în prezenta invenţie, legat covalent la CyC2 printr-un rest de cisteină;
WC este 1 sau 2;
CyC2 este reprezentat de următoarea formulă:
sau o sare acceptabilă din punct de vedere farmaceutic a acestuia, în care:
linia dublă dintre N şi C reprezintă o legătură simplă sau o legătură dublă, cu condiţia ca, atunci când este o legătură dublă, X să fie absent şi Y să fie -H sau un (C1-C4)alchil; şi atunci când este o legătură simplă, X să fie -H sau o fracţiune protectoare pentru o amină şi Y să fie -OH sau -SO3H sau o sare acceptabilă din punct de vedere farmaceutic a acestuia;
Rx1 este un (C1-C6)alchil;
Re este -H sau un (C1-C6)alchil;
W' este -NRe';
Re' este -(CH2-CH2-O)n-Rk;
n este un număr întreg de la 2 până la 6;
Rk este -H sau -Me;
R x2 este un (C1-C6)alchil;
LC' este reprezentat de următoarea formulă:
sau
în care:
s1 este situsul legat covalent la CBA şi s2 este situsul legat covalent la gruparea -S- de pe CyC2;
Z este -C(=O)-NR9- sau -NR9-C(=O)-;
Q este -H, un substituent cu sarcină sau o grupare ionizabilă;
R9, R10, R11, R12, R13, R19, R20, R21 şi R22, la fiecare apariţie, sunt în mod independent -H sau un (C1-C3)alchil;
q şi r, la fiecare apariţie, sunt în mod independent un număr întreg cuprins între 0 şi 10;
m şi n sunt fiecare în mod independent un număr întreg cuprins între 0 şi 10;
Rh este -H sau un (C1-C3)alchil; şi
P' este un rest de aminoacid sau o peptidă care conţine 2 până la 20 de resturi de aminoacizi.
Într-o variantă de realizare mai specifică, q şi r sunt fiecare în mod independent un număr întreg cuprins între 1 şi 6, mai precis, un număr întreg cuprins între 1 şi 3. Şi mai precis, R10, R11, R12 şi R13 sunt toţi H.
Într-o altă variantă de realizare mai specifică, m şi n sunt fiecare în mod independent un număr întreg cuprins între 1 şi 6, mai precis, un număr întreg cuprins între 1 şi 3. Şi mai precis, R19, R20, R21 şi R22 sunt toţi H. Într-o a 11a variantă de realizare specifică a imunoconjugaţilor cu formula (C2), CyC2 este reprezentat de formula (C2a) or (C2a1); şi variabilele rămase sunt astfel cum au fost descrise anterior în cea de-a 10a variantă de realizare specifică a celei de-a doua variante de realizare sau oricare variante de realizare mai specifice descrise în prezenta invenţie. Într-o a 12a variantă de realizare specifică a imunoconjugaţilor cu formula (C2), CyC2 este reprezentat de formula (C2b) sau (C2b1); şi variabilele rămase sunt astfel cum au fost descrise anterior în cea de-a 10a variantă de realizare specifică a celei de-a doua variante de realizare. Într-o a 13a variantă de realizare specifică a imunoconjugaţilor cu formula (C2), P' este o peptidă care conţine 2 până la 5 resturi de aminoacizi; ); şi variabilele rămase sunt astfel cum au fost descrise anterior în cea de-a 10a, cea de-a 11a sau cea de-a 12a variantă de realizare specifică a celei de-a doua variante de realizare sau oricare variante de realizare mai specifice descrise în prezenta invenţie. Într-o variantă de realizare mai specifică, P' este selectat dintre Gly-Gly-Gly, Ala-Val, Val-Ala, Val-Cit, Val-Lys, Phe-Lys, Lys-Lys, Ala-Lys, Phe-Cit, Leu-Cit, Ile-Cit, Trp, Cit, Phe-Ala, Phe-N9-tosyl-Arg, Phe-N9-nitro-Arg, Phe-Phe-Lys, D-Phe-Phe-Lys, Gly-Phe-Lys, Leu-Ala-Leu, Ile-Ala-Leu, Val-Ala-Val, Ala-Leu-Ala-Leu (SEQ ID NO:144), β-Ala-Leu-Ala-Leu (SEQ ID NO: 145), Gly-Phe-Leu-Gly (SEQ ID NO: 146), Val-Arg, Arg-Val, Arg-Arg, Val-D-Cit, Val-D-Lys, Val-D-Arg, D-Val-Cit, D-Val-Lys, D-Val-Arg, D-Val-D-Cit, D-Val-D-Lys, D-Val-D-Arg, D-Arg-D-Arg, Ala-Ala, Ala-D-Ala, D-Ala-Ala, D-Ala-D-Ala, Ala-Met, Met-Ala, Gln-Val, Asn-Ala, Gln-Phe şi Gln-Ala. Într-o altă variantă de realizare mai specifică, P' este Gly-Gly-Gly, Ala-Val, Ala-Ala, Ala-D-Ala, D-Ala-Ala sau D-Ala-D-Ala. Într-o a 14a variantă de realizare specifică a imunoconjugaţilor cu formula (C2), -Lc'- este reprezentat de următoarea formulă:
sau
Într-o a 15a variantă de realizare specifică a imunoconjugaţilor cu formula (C2), Re este H sau Me; Rx1 este -(CH2)p-(CRfRg)- şi Rx2 este -(CH2)p-(CRfRg)-, în care Rf şi Rg sunt fiecare în mod independent -H sau un (C1-C4)alchil; şi p este 0, 1, 2 sau 3; şi variabilele rămase sunt astfel cum au fost descrise anterior în cea de-a 10a, cea de-a 11a, cea de-a 12a, cea de-a 13a sau cea de-a 14a variantă de realizare specifică a celei de-a doua variante de realizare. Mai precis, Rf şi Rg sunt identici sau diferiţi şi sunt selectaţi dintre -H şi -Me.
Într-o a 16a variantă de realizare specifică, imunoconjugatul celei de-a doua variante de realizare este reprezentat de următoarea formulă:
sau o sare acceptabilă din punct de vedere farmaceutic a acestuia, în care linia dublă dintre N şi C reprezintă o legătură simplă sau o legătură dublă, cu condiţia ca, atunci când este o legătură dublă, X să fie absent şi Y să fie -H şi atunci când este o legătură simplă, X să fie -H şi Y să fie -OH sau -SO3H sau o sare acceptabilă din punct de vedere farmaceutic a acestuia. Într-o variantă de realizare mai specifică, linia dublă dintre N şi C reprezintă o legătură dublă, X este absent şi Y este -H. Într-o altă variantă de realizare specifică, linia dublă dintre N şi C reprezintă o legătură simplă, X este -H şi Y este -SO3H sau o sare acceptabilă din punct de
vedere farmaceutic a acestuia.
Într-o a 17a variantă de realizare specifică, imunoconjugatul celei de-a doua variante de realizare este reprezentat de următoarea formulă:
în care:
CBA este un anticorp anti-ADAM9 sau un fragment de legare a ADAM9 al acestuia descris în prezenta invenţie, legat covalent la CyC3 printr-un rest de cisteină;
WC este 1 sau 2;
CyC3 este reprezentat de următoarea formulă:
în care:
m' este 1 sau 2;
R1 şi R2, sunt fiecare în mod independent -H sau un (C1-C3)alchil;
LC' este reprezentat de următoarea formulă:
în care:
s1 este situsul legat covalent la CBA şi s2 este situsul legat covalent la gruparea -S- de pe CyC3;
Z este -C(=O)-NR9- sau -NR9-C(=O)-;
Q este H, un substituent cu sarcină sau o grupare ionizabilă;
R9, R10, R11, R12, R13, R19, R20, R21 şi R22, la fiecare apariţie, sunt în mod
independent -H sau un (C1-C3)alchil;
q şi r, la fiecare apariţie, sunt în mod independent un număr întreg cuprins între 0 şi 10;
m şi n sunt fiecare în mod independent un număr întreg cuprins între 0 şi 10;
Rh este -H sau un (C1-C3)alchil; şi
P' este un rest de aminoacid sau o peptidă care conţine 2 până la 20 de resturi de aminoacizi.
Într-o variantă de realizare mai specifică, q şi r sunt fiecare în mod independent un număr întreg cuprins între 1 şi 6, mai precis, un număr întreg de la 1 până la 3. Şi mai precis, R10, R11, R12 şi R13 sunt toţi H.
Într-o altă variantă de realizare mai specifică, m şi n sunt fiecare în mod independent un număr întreg cuprins între 1 şi 6, mai precis, un număr întreg de la 1 până la 3. Şi mai precis, R19, R20, R21 şi R22 sunt toţi H. Într-o a 18a variantă de realizare specifică a imunoconjugaţilor cu formula (C3), P' este o peptidă care conţine 2 până la 5 resturi de aminoacizi; şi variabilele rămase sunt astfel cum au fost descrise anterior în cea de-a 17a variantă de realizare specifică a celei de-a doua variante de realizare sau oricare variante de realizare mai specifice descrise în prezenta invenţie. Într-o variantă de realizare mai specifică, P' este selectat dintre Gly-Gly-Gly, Ala-Val, Val-Ala, Val-Cit, Val-Lys, Phe-Lys, Lys-Lys, Ala-Lys, Phe-Cit, Leu-Cit, Ile-Cit, Trp, Cit, Phe-Ala, Phe-N9-tosyl-Arg, Phe-N9-nitro-Arg, Phe-Phe-Lys, D-Phe-Phe-Lys, Gly-Phe-Lys, Leu-Ala-Leu, Ile-Ala-Leu, Val-Ala-Val, Ala-Leu-Ala-Leu (SEQ ID NO:144), β-Ala-Leu-Ala-Leu (SEQ ID NO: 145), Gly-Phe-Leu-Gly (SEQ ID NO: 146), Val-Arg, Arg-Val, Arg-Arg, Val-D-Cit, Val-D-Lys, Val-D-Arg, D-Val-Cit, D-Val-Lys, D-Val-Arg, D-Val-D-Cit, D-Val-D-Lys, D-Val-D-Arg, D-Arg-D-Arg, Ala-Ala, Ala-D-Ala, D-Ala-Ala, D-Ala-D-Ala, Ala-Met, Met-Ala, Gln-Val, Asn-Ala, Gln-Phe şi Gln-Ala. Într-o altă variantă de realizare mai specifică, P' este Gly-Gly-Gly, Ala-Val, Ala-Ala, Ala-D-Ala, D-Ala-Ala sau D-Ala-D-Ala. Într-o a 19a variantă de realizare specifică a imunoconjugaţilor cu formula (C3), -Lc'- este reprezentat de următoarea formulă:
sau
în care M este H+ sau un cation; şi variabilele rămase sunt astfel cum au fost descrise anterior în cea de-a 17a sau a 18a variantă de realizare specifică a celei de-a doua variante de realizare sau oricare variante de realizare mai specifice descrise în prezenta invenţie.
Într-o a 20a variantă de realizare specifică a imunoconjugaţilor cu formula (C3), m' este 1 şi R1 şi R2 sunt ambii H; şi variabilele rămase sunt astfel cum au fost descrise anterior în cea de-a 17a, a 18a sau a 19a variantă de realizare specifică a celei de-a doua variante de realizare sau oricare variante de realizare mai specifice descrise în prezenta invenţie. Într-o a 21a variantă de realizare specifică a imunoconjugaţilor cu formula (C3), m' este 2 şi R1 şi R2 sunt ambii Me; şi variabilele rămase sunt astfel cum au fost descrise anterior în cea de-a 17a, a 18a sau a 19a variantă de realizare specifică a celei de-a doua variante de realizare sau oricare variante de realizare mai specifice descrise în prezenta invenţie. Într-o a 22a variantă de realizare specifică, imunoconjugatul celei de-a doua variante de realizare este reprezentat de următoarea formulă:
sau
sau o sare acceptabilă din punct de vedere farmaceutic a acestuia, în care DM este o fracţiune medicamentoasă reprezentată de următoarea formulă:
Într-o a 23a variantă de realizare specifică a imunoconjugaţilor celei de-a doua variante de realizare, Y este -SO3H, -SO3Na sau -SO3K; şi variabilele rămase sunt astfel cum au fost descrise anterior în oricare dintre prima până la cea de-a 22a variantă de realizare specifică a celei de-a doua variantă de realizare sau oricare variante de realizare mai specifice descrise în prezenta invenţie. Într-o variantă de realizare, Y este -SO3Na.
C. Molecule de linker exemplificative
Orice linker adecvat cunoscut în stadiul tehnicii poate fi utilizat în prepararea imunoconjugaţilor conform prezentei invenţii. În anumite variante de realizare, linkerii sunt linkeri bifuncţionali. Astfel cum este utilizat în prezenta invenţie, termenul "linker bifuncţional" se referă la agenţi modificatori care posedă două grupări reactive; dintre care una este capabilă să reacţioneze cu un agent de legare celulară, în timp ce cealaltă reacţionează cu compusul citotoxic pentru a lega cele două fracţiuni. Astfel de agenţi de reticulare bifuncţionali sunt bine cunoscuţi în stadiul tehnicii (a se vedea, de exemplu, Isalm and Dent in Bioconjugation capitolul 5, p218-363, Groves Dictionaries Inc. New York, 1999). De exemplu, agenţi de reticulare bifuncţionali care permit legarea printr-o legătură tioeterică includ N-succinimidil-4-(N-maleimidometil)-ciclohexan-1-carboxilat (SMCC) pentru a introduce grupări maleimido sau cu N-succinimidil-4-(iodoacetil)-aminobenzoat (SIAB) pentru a introduce grupări iodoacetil. Alţi agenţi de reticulare bifuncţionali care introduc grupări maleimido sau grupări haloacetil pe un agent de legare celulară sunt bine cunoscuţi în stadiul tehnicii (a se vedea Cererile de brevet SUA nr. 2008/0050310, 20050169933, disponibili de la Pierce Biotechnology Inc. P.O. Box 117, Rockland, IL 61105, USA) şi includ bis-maleimidopolietilenglicol (BMPEO), BM(PEO)2, BM(PEO)3, ester N-(β-maleimidopropiloxi)succinimidic (BMPS), ester N-succinimidic al acidului γ-maleimidobutiric (GMBS), ester N-hidroxisuccinimidic al acidului ε-maleimidocaproic (EMCS), acid 5-maleimidovaleric NHS, HBVS, N-succinimidil-4-(N-maleimidometil)-ciclohexan-1-carboxi-(6-amidocaproat), care este un analog cu "lanţ lung" al SMCC (LC-SMCC), ester m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimidic (MBS), hidrazida sau sarea HCl a acidului 4-(4-N-maleimidofenil)-butiric (MPBH), 3-(bromoacetamido)propionat de N-succinimidil (SBAP), iodoacetat de N-succinimidil (SIA), ester N-succinimidic al acidului κ-maleimidoundecanoic (KMUA), 4-(p-maleimidofenil)-butirat de N-succinimidil (SMPB), succinimidil-6-(β-maleimidopropionamido)hexanoat (SMPH), succinimidil-(4-vinilsulfonil)benzoat (SVSB), ditiobis-maleimidoetan (DTME), 1,4-bis-maleimidobutan (BMB), 1,4-bismaleimidil-2,3-dihidroxibutan (BMDB), bis-maleimidohexan (BMH), bis-maleimidoetan (BMOE), 4-(N-maleimido-metil)ciclohexan-1-carboxilat sulfosuccinimidilic (sulfo-SMCC), sulfosuccinimidil(4-iodo-acetil)aminobenzoat (sulfo-SIAB), ester m-maleimidobenzoil-N-hidroxisulfosuccinimidic (sulfo-MBS), ester N-(y-maleimidobutriloxi)sulfosuccinimidic (sulfo-GMBS), ester N-(ε-maleimidocaproiloxi)sulfosuccimidic (sulfo-EMCS), ester N-(k-maleimidoundecanoiloxi)sulfosuccinimidic (sulfo-KMUS) şi 4-(p-maleimidofenil)butirat de sulfosuccinimidil (sulfo-SMPB).
Agenţii de reticulare heterobifuncţionali sunt agenţi de reticulare bifuncţionali care au două grupări reactive diferite. Agenţii de reticulare heterobifuncţionali care conţin atât o grupare N-hidroxisuccinimidică reactivă la amină (grupare NHS) cât şi o grupare hidrazină reactivă la carbonil pot fi utilizaţi, de asemenea, pentru a lega compuşii citotoxici descrişi în prezentul document la un agent de legare celulară (de exemplu anticorp). Exemple de astfel de agenţi de reticulare heterobifuncţionali disponibili pe piaţă includ hidrazonă de acetonă de succinimidil 6-hidrazinonicotinamidă (SANH), clorhidrat de succinimidil 4-hidrazidotereftalat (SHTH) şi clorhidrat de nicotinat de succinimidil hidraziniu (SHNH). Conjugaţii care poartă o legătură labilă la acid pot fi preparaţi, de asemenea, utilizând un derivat de benzodiazepină purtător de hidrazină conform prezentei invenţii. Exemplele de agenţi de reticulare bifuncţionali care pot fi utilizaţi includ benzoat de succinimidil-p-formil (SFB) şi p-formilfenoxiacetatul de succinimidil (SFPA). Agenţii de reticulare bifuncţionali care permit legarea agentului de legare celulară la compuşi citotoxici prin legături disulfurice sunt cunoscuţi în stadiul tehnicii şi includ N-succinimidil-3-(2-piridilditio)propionat (SPDP), N-succinimidil-4-(2-piridilditio)pentanoat (SPP), N-succinimidil-4-(2-piridilditio)butanoat (SPDB), N-succinimidil-4-(2-piridilditio)2-sulfobutanoat (sulfo-SPDB) pentru a introduce grupări ditiopiridil. Alţi agenţi de reticulare bifuncţionali care pot fi utilizaţi pentru a introduce grupări disulfurice sunt cunoscuţi în stadiul tehnicii şi sunt dezvăluiţi în Brevetele SUA 6,913,748, 6,716,821 şi Publicaţiile de brevete SUA 20090274713 şi 20100129314. În mod alternativ, pot fi utilizaţi de asemenea agenţi de reticulare cum ar fi 2-iminotiolan, tiolactonă de homocisteină sau anhidridă S-acetilsuccinică, ce introduc grupări tiol. În anumite variante de realizare, linkerii bifuncţionali sunt reprezentaţi de oricare dintre formulele (a1L) - (a10L) descrise mai jos.
D. Agenţi farmacologici exemplificativi
1. Maitansinoid
În anumite variante de realizare, agentul farmacologic este un compus maitansinoidic, cum ar fi cei descrişi în Brevetele SUA nr. 5,208,020 şi 7,276,497. În anumite variante de realizare, compusul maitansinoidic este reprezentat de următoarea formulă:
în care variabilele sunt astfel cum au fost descrise anterior în oricare dintre cea de-a 13a până la a 17a variantă de realizare specifică a primei variante de realizare anterioare şi în oricare variante de realizare mai specifice descrise în prezenta invenţie.
Într-o variantă de realizare mai specifică, compusul maitansinoidic este DM4:
Într-o altă variantă de realizare, compusul maitansinoidic este DM1:
2. Benzodiazepină
În anumite variante de realizare, agentul farmacologic este un compus benzodiazepinic, cum ar fi pirolobenzodiazepină (PBD) (cum ar fi cei descrişi în WO2010/043880, WO2011/130616, WO2009/016516, WO 2013/177481 şi WO 2012/112708) şi compuşi indolinobenzodiazepinici (IGN) (cum ar fi cei descrişi în WO/2010/091150 şi WO 2012/128868 şi Cererea SUA nr. 15/195,269, depusă în data de 28 iunie 2016, intitulată "CONJUGAŢI AI ANTICORPILOR MODIFICAŢI CU CISTEINĂ". Astfel cum este utilizat în prezenta invenţie, un compus "benzodiazepinic" este un compus care are o structură de nucleu benzodiazepinic. Nucleul benzodiazepinic poate fi substituit sau nesubstituit şi/sau poate fi fuzionat cu una sau mai multe structuri inelare. De asemenea, acesta include un compus care are două nuclee benzodiazepinice legate printr-un linker. Funcţionalitatea iminică (-C=N-) ca parte a nucleului benzodiazepinic poate fi redusă.
Astfel cum este utilizat în prezenta invenţie, un compus "pirolobenzodiazepinic" (PBD) este un compus care are o structură de nucleu pirolobenzodiazepinic. Pirolobenzodiazepina poate fi substituită sau nesubstituită. De asemenea, aceasta include un compus care are două nuclee pirolobenzodiazepinice legate printr-un linker. Funcţionalitatea iminică (-C=N-) ca parte a nucleului indolinobenzodiazepinic poate fi redusă. În anumite variante de realizare, agentul farmacologic este un compus indolinobenzodiazepinic reprezentat prin următoarea formulă:
sau
sau o sare acceptabilă din punct de vedere farmaceutic a acestuia, în care:
Lc' este reprezentat de următoarea formulă:
- NR5-P-C(=0)-(CRaRb)m-C(=O)E (B1); sau
- NR5-P-C(=O)-(CRaRb)m-S-Zs (B2)
C(=O)E este o grupare esterică reactivă, cum ar fi ester N-hidroxisuccinimdic, ester N-hidroxi sulfosuccinimidic, ester nitrofenil (de exemplu 2 sau 4-nitrofenilic), ester dinitrofenil (de exemplu 2,4-dinitrofenilic), ester sulfo-tetraflurofenilic (de exemplu 4-sulfo-2,3,5,6-tetrafluorofenilic) sau ester pentafluorofenilic, de preferat ester N-hidroxisuccinimidic;
Zs este reprezentat de următoarea formulă:
şi
în care:
q este un număr întreg de la 1 până la 5; şi
U este -H sau SO3H sau o sare acceptabilă din punct de vedere farmaceutic a acestuia; şi variabilele rămase sunt astfel cum au fost descrise în oricare dintre prima până la cea de-a 12a şi a 17a variantă de realizare specifică a primei variante de realizare descrise anterior sau oricare variante de realizare mai specifice descrise în prezenta invenţie.
În anumite variante de realizare, agentul farmacologic este un compus
indolinobenzodiazepinic reprezentat de următoarea formulă:
sau
sau o sare acceptabilă din punct de vedere farmaceutic a acestuia, în care:
―LC c pentru formulele (C1a'), (C1a'1), (C1b') şi (C1b'1) este reprezentat de următoarea formulă:
în care variabilele sunt astfel cum au fost descrise anterior în oricare dintre prima până la cea de-a 9a şi a 23a variantă de realizare specifică a celei de-a doua variante de realizare sau oricare variante de realizare mai specifice descrise în prezenta invenţie; şi
LC c' pentru formulele (C2a"), (C2a"1), (C2b") şi (C2b"1) este reprezentat de următoarea formulă:
sau
în care variabilele sunt astfel cum au fost descrise anterior în oricare dintre cea de-a 10a până la a 16a şi a 23a variantă de realizare specifică a celei de-a doua variante de realizare sau oricare variante de realizare mai specifice descrise în prezenta invenţie.
În anumite variante de realizare, agentul farmacologic este un compus indolinobenzodiazepinic al oricăreia dintre următoarele sau o sare acceptabilă din punct de vedere farmaceutic a acestuia:
Nr. compus Structură D1 sD1 D2 sD2 DGN462 sDGN462 D3 sD3 D4 sD4 D5 sD5 D5' sD5' D6 sD6 D7 sD7
Compuşii D1, sD1, D2, sD2, DGN462, sDGN462, D3 şi sD3 ilustraţi anterior
pot fi preparaţi conform procedurilor descrise în Brevetele SUA nr. 9,381,256, 8,765,740, 8,426,402 şi 9,353,127 şi Publicaţia de cerere SUA US2016/0082114.
În anumite variante de realizare, sarea acceptabilă din punct de vedere farmaceutic a compuşilor ilustraţi anterior (de exemplu sD1, sD2, sD4, sDGN462, sD3, sD4, sD5, sD5', sD6 sau sD7) este o sare de sodiu sau potasiu. Mai precis, sarea acceptabilă din punct de vedere farmaceutic este o sare de sodiu. Într-o variantă de realizare specifică, agentul farmacologic este reprezentat de următoarea formulă:
sau
sau o sare acceptabilă din punct de vedere farmaceutic a acestuia. Într-o variantă de realizare specifică, sarea acceptabilă din punct de vedere farmaceutic este o sare de sodiu sau potasiu.
Într-o altă variantă de realizare specifică, agentul farmacologic este reprezentat de următoarea formulă:
IV. Procedee de producţie
Anticorpii anti-ADAM9 şi fragmentele de legare a ADAM9 ale acestora conform prezentei invenţii sunt cel mai de preferat produşi prin expresia recombinantă a moleculelor de acid nucleic care codifică astfel de polipeptide, astfel cum este bine cunoscut în stadiul tehnicii.
Polipeptidele conform invenţiei pot fi preparate în mod convenabil utilizând sinteza peptidelor în fază solidă (Merrifield, B. (1986) "Solid Phase Synthesis," Science 232(4748):341-347; Houghten, R.A. (1985) "General Method For The Rapid Solid-Phase Synthesis Of Large Numbers Of Peptides: Specificity Of Antigen-Antibody Interaction At The Level Of Individual Amino Acids," Proc. Natl. Acad. Sci. (S.U.A..) 82(15):5131-5135; Ganesan, A. (2006) "Solid-Phase Synthesis In The Twenty-First Century," Mini Rev. Med. Chem. 6(1):3-10). Într-o alternativă, anticorpii pot fi obţinuţi recombinant şi exprimaţi utilizând orice procedeu cunoscut în stadiul tehnicii. Anticorpii pot fi obţinuţi recombinant prin izolarea mai întâi a anticorpilor obţinuţi de la animale gazdă, obţinerea secvenţei genetice şi utilizarea secvenţei genetice pentru a exprima anticorpul recombinant în celulele gazdă (de exemplu celule CHO). Un alt procedeu care poate fi utilizat este exprimarea secvenţei de anticorpi în plante {de exemplu tutun) sau lapte transgenic. Au fost dezvăluite procedee adecvate pentru exprimarea recombinantă a anticorpilor în plante sau lapte (a se vedea, de exemplu, Peeters şi colab. (2001) "Production Of Antibodies And Antibody Fragments In Plants," Vaccine 19:2756; Lonberg, N. şi colab. (1995) "Human Antibodies From Transgenic Mice," Int. Rev. Immunol 13:65-93; and Pollock şi colab. (1999) "Transgenic Milk As A Method For The Production Of Recombinant Antibodies," J. Immunol Methods 231:147-157). Suitable methods for making derivatives of antibodies, e.g., humanized, single-chain, etc. are known in the art, and have been described above. Într-o altă alternativă, anticorpii pot fi obţinuţi recombinant prin tehnologia de afişare a fagilor (a se vedea, de exemplu, Brevetele SUA nr. 5,565,332; 5,580,717; 5,733,743; 6,265,150; şi Winter, G. şi colab. (1994) "Making Antibodies By Phage Display Technology," Annu. Rev. Immunol. 12.433-455). Vectorii care conţin polinucleotide de interes (de exemplu polinucleotide care codifică lanţurile polipeptidice ale anticorpilor anti-ADAM9 şi fragmentele de legare a ADAM9 ale acestora conform prezentei invenţii) pot fi introduşi în celula gazdă prin oricare dintre o serie de mijloace adecvate, inclusiv electroporare, transfecţie utilizând clorură de calciu, clorură de rubidiu, fosfat de calciu, DEAE-dextran sau alte substanţe; bombardament cu microproiectile; lipofecţie; şi infecţie (de exemplu în cazul în care vectorul este un agent infecţios cum ar fi virusul vaccinia). Alegerea introducerii vectorilor sau polinucleotidelor va depinde adesea de caracteristicile celulei gazdă. Orice celulă gazdă capabilă să supraexprime ADN-uri heteroloage poate fi utilizată în scopul exprimării unei polipeptide sau proteine de interes. Exemple nelimitative de celule gazdă de mamifer adecvate includ, dar fără a se limita la, celule COS, HeLa şi CHO. Invenţia include imunoconjugaţi care cuprind o secvenţă de aminoacizi a unui anticorp anti-ADAM9 sau fragment de legare a ADAM9 al acestuia conform prezentei invenţii. Polipeptidele conform prezentei invenţii pot fi produse prin procedee cunoscute în stadiul tehnicii. Polipeptidele pot fi produse prin degradarea proteolitică sau de altă natură a anticorpilor, prin procedee recombinante (adică polipeptide simple sau de fuziune) astfel cum este descris anterior sau prin sinteză chimică. Polipeptidele anticorpilor, în special polipeptidele mai scurte până la aproximativ 50 de aminoacizi, sunt obţinute în mod convenabil prin sinteză chimică. Procedeele de sinteză chimică sunt cunoscute în stadiul tehnicii şi sunt disponibile pe piaţă. Modificarea polipeptidelor este o practică de rutină în stadiul tehnicii şi nu trebuie descrisă în detaliu în prezenta invenţie. Exemple de polipeptide modificate includ polipeptide cu substituţii conservatoare ale resturilor de aminoacizi, una sau mai multe deleţii sau adaosuri de aminoacizi care nu modifică în mod semnificativ activitatea funcţională sau utilizarea analogilor chimici. Resturile de aminoacizi care pot fi înlocuite conservator unele cu altele includ: glicină/alanină; serină/treonină; valină/izoleucină/leucină; asparagină/glutamină; acid aspartic/acid glutamic; lizină/arginină; şi nd fenilalanină/tirozină. Aceste polipeptide includ, de asemenea, polipeptide glicozilate şi neglicozilate, precum şi polipeptide cu alte modificări post-translaţionale, cum ar fi, de exemplu, glicozilare cu diverse zaharuri, acetilare şi fosforilare. De preferat, substituţiile de aminoacizi ar fi conservatoare, adică aminoacidul substituit ar poseda proprietăţi chimice similare cu cele ale aminoacidului original. Astfel de substituţii conservatoare sunt cunoscute în stadiul tehnicii şi exemplele au fost furnizate anterior. Modificările aminoacizilor pot varia de la schimbarea sau modificarea unuia sau mai multor aminoacizi până la reconceperea completă a unei regiuni, cum ar fi domeniul variabil. Modificările în domeniul variabil pot modifica afinitatea de legare şi/sau specificitatea. Alte procedee de modificare includ utilizarea tehnicilor de cuplare cunoscute în stadiul tehnicii, inclusiv mijloace enzimatice, substituţie oxidativă şi chelare. Modificările pot fi utilizate, de exemplu, pentru ataşarea marcajelor pentru imunotestare, cum ar fi ataşarea fracţiunilor radioactive pentru radioimunotestare. Polipeptidele modificate sunt produse utilizând proceduri stabilite în stadiul tehnicii şi pot fi analizate utilizând teste standard cunoscute în stadiul tehnicii. Invenţia cuprinde imunoconjugaţi care cuprind proteine de fuziune care posedă unul sau mai multe dintre VL şi/sau VH anti-ADAM9 conform prezentei invenţii. Într-o variantă de realizare, este furnizată o polipeptidă de fuziune care cuprinde un lanţ uşor, un lanţ greu sau atât un lanţ uşor, cât şi un lanţ greu. Într-o altă variantă de realizare, polipeptida de fuziune conţine o regiune constantă de imunoglobulină heteroloagă. Într-o altă variantă de realizare, polipeptida de fuziune conţine un domeniu variabil al lanţului uşor şi un domeniu variabil al lanţului greu al unui anticorp produs dintr-un hibridom depus public. În scopul prezentei invenţii, o proteină de fuziune a anticorpului conţine unul sau mai multe domenii polipeptidice care se leagă în mod specific la ADAM9 şi o altă secvenţă de aminoacizi la care nu este ataşată în molecula nativă, de exemplu, o secvenţă heteroloagă sau o secvenţă omoloagă dintr-o altă regiune.
V. Conjugarea medicamentelor
Imunoconjugaţii care cuprind un anticorp anti-ADAM9 sau un fragment de legare a ADAM9 al acestuia legat covalent la un agent farmacologic prin gruparea ε-amino a unuia sau mai multor resturi de lizină situate pe anticorpul anti-ADAM9 sau un fragment de legare a ADAM9 al acestuia, astfel cum este descris în prima variantă de realizare anterioară sau oricare variante de realizare specifice descrise în prezenta invenţie pot fi preparaţi conform oricăror procedee cunoscute în stadiul tehnicii, a se vedea, de exemplu, WO 2012/128868 şi WO2012/112687.
În anumite variante de realizare, imunoconjugaţii conform primei variante de realizare pot fi preparaţi printr-un prim procedeu care cuprinde etapele de reacţionare a CBA cu un agent citotoxic care are o grupare reactivă la amină. Într-o variantă de realizare, pentru primul procedeu descris anterior, reacţia poate fi efectuată în prezenţa unui reactiv la imină, cum ar fi NaHSO3. Într-o variantă de realizare, pentru primul procedeu descris anterior, agentul citotoxic care are o grupare reactivă la imină este reprezentat de următoarea formulă:
sau
sau o sare acceptabilă din punct de vedere farmaceutic a acestuia, în care definiţiile pentru variabile sunt descrise anterior pentru formulele (L1a'), (L1a'1), (L1b') şi (L1b'1).
În anumite variante de realizare, imunoconjugaţii conform primei variante de realizare pot fi preparaţi printr-un al doilea procedeu care cuprinde următoarele etape:
(a) reacţionarea unui agent citotoxic cu un compus linker care are o grupare reactivă la amină şi o grupare reactivă la tiol pentru a forma un compus agent citotoxic-linker care are gruparea reactivă la amină legată la acesta; şi
(b) reacţionarea CBA cu compusul agent citotoxic-linker.
Într-o variantă de realizare, pentru cel de-al doilea procedeu descris anterior, reacţia din etapa (a) este efectuată în prezenţa unui reactiv la imină (de exemplu NaHSO3).
Într-o variantă de realizare, pentru cel de-al doilea procedeu descris anterior, compusul agent citotoxic-linker poate fi reacţionat cu CBA fără purificare. În mod alternativ, compusul agent citotoxic-linker poate fi purificat înainte de reacţionarea cu CBA. În anumite variante de realizare, imunoconjugaţii conform primei variante de realizare pot fi preparaţi printr-un al treilea procedeu care cuprinde următoarele etape:
(a) reacţionarea CBA cu un compus linker care are o grupare reactivă la amină şi o grupare reactivă la tiol pentru a forma un CBA modificat care are o grupare reactivă la tiol legată la acesta; şi
(b) reacţionarea CBA modificat cu agentul citotoxic.
Într-o variantă de realizare, pentru cel de-al treilea procedeu descris anterior, reacţia din etapa (b) este efectuată în prezenţa unui reactiv la imină (de exemplu NaHSO3).
În anumite variante de realizare, imunoconjugaţii conform primei variante de realizare pot fi preparaţi printr-un al patrulea procedeu care cuprinde etapele de reacţionare a CBA, un compus citotoxic şi un compus linker care are o grupare reactivă la amină şi o grupare reactivă la tiol. Într-o variantă de realizare, pentru cel de-al patrulea procedeu, reacţia este efectuată în prezenţa unui agent reactiv la imină (e.g., NaHSO3). În anumite variante de realizare, pentru cel de-al doilea, al treilea sau al patrulea procedeu descris anterior, compusul linker care are o grupare reactivă la amină şi o grupare reactivă la tiol este reprezentat de următoarea formulă:
şi
în care X este halogen; JD -SH, -SSRd sau -SC(=O)Rg; Rd este fenil, nitrofenil, dinitrofenil, carboxinitrofenil, piridil sau nitropiridil; Rg este un alchil; şi variabilele rămase sunt astfel cum au fost descrise anterior pentru formula (a1) - (a10); şi agentul citotoxic este reprezentat de următoarea formulă:
sau
sau o sare acceptabilă din punct de vedere farmaceutic a acestuia, în care variabilele sunt astfel cum au fost descrise anterior pentru formulele (L1a'), (L1a'1), (L1b'), (L1b'1), (L2a'), (L2a'1), (L2b') şi (L2b'1).
În anumite variante de realizare, pentru cel de-al doilea, al treilea sau al patrulea procedeu descris anterior, compusul linker care are o grupare reactivă la amină şi o grupare reactivă la tiol este reprezentat de oricare dintre formulele (a1L) - (a10L) şi agentul citotoxic este reprezentat de următoarea formulă:
în care variabilele sunt astfel cum au fost descrise anterior în oricare dintre cea de-a 13a până la a 17a variantă de realizare specifică a primei variante de realizare descrise anterior şi oricare variante de realizare mai specifice descrise în prezenta invenţie.
Într-o variantă de realizare specifică, pentru cel de-al doilea, al treilea sau al patrulea procedeu descris anterior, linkerul este sulfo-SPDB, agentul citotoxic este DM4 şi imunoconjugatul este reprezentat de următoarea formulă:
sau o sare acceptabilă din punct de vedere farmaceutic a acestuia, în care WL este un număr întreg de la 1 până la 10.
Imunoconjugaţii care cuprind un anticorp anti-ADAM9 sau un fragment de legare a ADAM9 al acestuia legat covalent la un agent citotoxic prin gruparea tiol (-SH) a unuia sau mai multor resturi de cisteină situate pe anticorpul anti-ADAM9 sau un fragment de legare a ADAM9 al acestuia astfel cum este descris în cea de-a doua variantă de realizare anterioară (de exemplu imunoconjugaţii conform oricăreia dintre 1-a până la cea de-a 23-a variantă de realizare specifică sau oricare variante de realizare specifice descrise în prezenta invenţie) pot fi preparaţi prin reacţionarea CBA care are una sau mai multe cisteine libere cu un agent citotoxic care are o grupare reactivă la tiol descrisă în prezenta invenţie. Într-o variantă de realizare preferată, imunoconjugaţii conform prezentei invenţii posedă o variantă de regiune Fc IgG care cuprinde un rest de cisteină suplimentar, astfel încât să permită conjugarea unui agent farmacologic cu o astfel de moleculă (de exemplu SEQ ID NO: 79 şi 80). Într-o variantă de realizare, agentul citotoxic care are o grupare reactivă la tiol este reprezentat de următoarea formulă:
sau
sau o sare acceptabilă din punct de vedere farmaceutic a acestuia, în care ―LC c este reprezentat de următoarea formulă:
în care variabilele sunt astfel cum au fost descrise anterior în oricare dintre prima până la cea de-a 9a şi a 23a variantă de realizare specifică a celei de-a doua variante de realizare sau oricare variante de realizare mai specifice descrise în prezenta invenţie.
Într-o altă variantă de realizare, agentul citotoxic care are o grupare reactivă la tiol este reprezentat de următoarea formulă:
sau o sare acceptabilă din punct de vedere farmaceutic a acestuia, în care LC c' este reprezentat de următoarea formulă:
sau
în care variabilele sunt astfel cum au fost descrise anterior în oricare dintre cea de-a 10a până la a 16a şi a 23a variantă de realizare specifică a celei de-a doua variante de realizare sau oricare variante de realizare mai specifice descrise în prezenta invenţie.
Într-o altă variantă de realizare, agentul citotoxic care are o grupare reactivă la tiol este reprezentat de următoarea formulă:
sau o sare acceptabilă din punct de vedere farmaceutic a acestuia, în care LC c, este descris anterior şi variabilele rămase sunt astfel cum au fost descrise anterior în oricare dintre cea de-a 17a până la a 23a variantă de realizare specifică a celei de-a doua variante de realizare sau oricare variante de realizare mai specifice descrise în prezenta invenţie.
Într-o variantă de realizare specifică, agentul citotoxic care are o grupare reactivă la tiol este reprezentat de următoarea formulă:
sau o sare acceptabilă din punct de vedere farmaceutic a acestuia.
Într-o altă variantă de realizare specifică, agentul citotoxic care are o grupare reactivă la tiol este reprezentat de următoarea formulă:
sau o sare acceptabilă din punct de vedere farmaceutic a acestuia.
În anumite variante de realizare, în reacţia CBA cu agentul citotoxic se pot utiliza solvenţi organici pentru a solubiliza agentul citotoxic. Solvenţi organici exemplificativi includ, dar fără a se limita la, dimetilacetamidă (DMA), propilenglicol etc. Într-o variantă de realizare, reacţia CBA cu agentul citotoxic este efectuată în prezenţa DMA şi propilenglicolului. Într-o variantă de realizare specifică, agentul citotoxic reprezentat de următoarea formulă:
sau o sare acceptabilă din punct de vedere farmaceutic a acestuia, este reacţionat cu un CBA (de exemplu un anticorp anti-ADAM9 sau un fragment de legare a ADAM9 al acestuia) pentru a forma imunoconjugatul reprezentat de următoarea formulă:
sau o sare acceptabilă din punct de vedere farmaceutic a acestuia, în care: linia dublă dintre N şi C reprezintă o legătură simplă sau o legătură dublă, cu condiţia ca, atunci când este o legătură dublă, X să fie absent şi Y să fie -H şi atunci când este o legătură simplă, X să fie -H şi Y să fie -SO3H sau o sare acceptabilă din punct de vedere farmaceutic a acestuia; şi WC să fie 1 sau 2. Într-o variantă de realizare mai specifică, linia dublă dintre N şi C reprezintă o legătură dublă, X este absent şi Y este -H. Într-o altă variantă de realizare mai specifică, linia dublă dintre N şi C reprezintă o legătură simplă, X este -H şi Y este -SO3H sau o sare acceptabilă din punct de vedere farmaceutic a acestuia. Şi mai precis, sarea acceptabilă din punct de vedere farmaceutic este o sare de sodiu sau potasiu.
În anumite variante de realizare, atunci când Y este ―SO3H sau o sare acceptabilă din punct de vedere farmaceutic a acestuia, imunoconjugaţii pot fi preparaţi prin (a) reacţionarea fracţiunii iminice din agentul citotoxic care conţine imină care are o grupare reactivă la tiol descrisă anterior (adică formula (C1a'), (C1a'1), (C1b'), (C1b'1), (C2a"), (C2a"1), (C2b") sau (C2b"1), în care linia dublă dintre N şi C reprezintă o legătură dublă, X este absent şi Y este -H) cu un dioxid de sulf, sare de bisulfit sau o sare de metabisulfit într-o soluţie apoasă la un pH de 1,9 până la 5,0 pentru a forma un agent citotoxic modificat care cuprinde o fracţiune iminică modificată reprezentată prin următoarea formulă:
sau o sare acceptabilă din punct de vedere farmaceutic a acestuia; şi (b) reacţionarea agentului citotoxic modificat cu anticorpul anti-ADAM9 sau cu un fragment de legare a ADAM9 al acestuia descris în prezenta invenţie pentru a forma imunoconjugatul.
Într-un prim aspect, pentru procedeul descris anterior, reacţia din etapa (a) este efectuată la un pH de 1,9 până la 5,0. Mai precis, pH-ul este 2,5 până la 4,9, 1,9 până la 4,8, 2,0 până la 4,8, 2,5 până la 4,5, 2,9 până la 4,5, 2,9 până la 4,0, 2,9 până la 3,7, 3,1 până la 3,5 sau 3,2 până la 3,4. Într-o altă variantă de realizare specifică, reacţia din etapa (a) este efectuată la un pH de 1,9, 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3,0, 3,1, 3,2, 3,3 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4,0, 4,1, 4,2, 4,3, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9 sau 5,0. Într-o altă variantă de realizare specifică, reacţia din etapa (a) este efectuată la un pH de 3,3. Astfel cum este utilizată în prezenta invenţie, o valoare specifică a pH-ului semnifică valoarea specifică ± 0,05. În unele variante de realizare, reacţia din etapa (a) este efectuată în prezenţa unei soluţii tampon. Orice soluţie tampon adecvată cunoscută în stadiul tehnicii poate fi utilizată în procedeele conform prezentei invenţii. Soluţii tampon adecvate includ, de exemplu, un tampon citrat, un tampon acetat, un tampon succinat, un tampon fosfat, un tampon care conţine glicină (de exemplu tampon glicină-HCl), un tampon ftalat (de exemplu o soluţie tampon care cuprinde sodiu sau ftalat acid de potasiu) şi o combinaţie a acestora. În unele variante de realizare, soluţia tampon este un tampon succinat. În unele variante de realizare, soluţia tampon este un tampon fosfat. În unele variante de realizare, tamponul este un tampon citrat-fosfat. În unele variante de realizare, tamponul este un tampon citrat-fosfat care cuprinde acid citric şi Na2HPO4. În alte variante de realizare, tamponul este un tampon citrat-fosfat care cuprinde acid citric şi K2HPO4. În unele variante de realizare, concentraţia de soluţie tampon descrisă anterior poate fi cuprinsă în intervalul 10 până la 250 mM, 10 până la 200 mM, 10 până la 150 mM, 10 până la 100 mM, 25 până la 100 mM, 25 până la 75 mM, 10 până la 50 mM sau 20 până la 50 mM.Într-un al 2lea aspect, reacţia din etapa (a) este efectuată în absenţa unei soluţii tampon (de exemplu tampoanele descrise în primul aspect). În unele variante de realizare, prezentul procedeu cuprinde următoarele etape: (a) reacţionarea fracţiunii iminice din agentul citotoxic care conţine imină care are o grupare reactivă la tiol descrisă anterior (adică formula (C1a'), (C1a'1), (C1b'), (C1b'1), (C2a"), (C2a"1), (C2b") sau (C2b"1), în care linia dublă dintre N şi C reprezintă o legătură dublă, X este absent şi Y este -H) cu un dioxid de sulf, sare de bisulfit sau o sare de metabisulfit într-o soluţie apoasă pentru a forma un agent citotoxic modificat care cuprinde o fracţiune iminică modificată reprezentată prin următoarea formulă:
sau o sare acceptabilă din punct de vedere farmaceutic a acestuia, în care soluţia apoasă nu cuprinde un tampon; şi (b) reacţionarea agentului citotoxic modificat cu anticorpul anti-ADAM9 sau cu un fragment de legare a ADAM9 al acestuia descris în prezenta invenţie pentru a forma imunoconjugatul. În unele variante de realizare, reacţia din etapa (a) este efectuată într-un amestec de solvent organic şi apă. Mai precis, reacţia din etapa (a) este efectuată într-un amestec de dimetilacetamidă (DMA) şi apă. În unele variante de realizare, amestecul de DMA şi apă cuprinde mai puţin de 60% DMA în volum. Şi mai precis, raportul de volum dintre DMA şi apă este 1:1.
Într-un al 3lea aspect, pentru procedeele descrise anterior sau în primul sau cel de-al 2lea aspect, se utilizează 0,5 până la 5,0 echivalenţi de sare de bisulfit sau 0,25 sau 2,5 echivalenţi de sare de metabisulfit pentru fiecare 1 echivalent de agent citotoxic care conţine imină în reacţia din etapa (a). În unele variante de realizare, se utilizează 0,5 până la 4,5, 0,5 până la 4,0, 0,5 până la 3,5, 0,5 până la 4,0, 0,5 până la 3,5, 0,5 până la 3,0, 0,5 până la 2,5, 0,8 până la 2,0, 0,9 până la 1,8, 1,0 până la 1,7, 1,1 până la 1,6, 1,2 până la 1,5 echivalenţi de sare de bisulfit sau 0,25 până la 2,25, 0,25 până la 2,0, 0,25 până la 1,75, 0,25 până la 2,0, 0,25 până la 1,75, 0,25 până la 1,5, 0,25 până la 1,25, 0,4 până la 1,0, 0,45 până la 0,9, 0,5 până la 0,85, 0,55 până la 0,8 sau 0,6 până la 0,75 echivalenţi de sare de metabisulfit pentru fiecare echivalent de agent citotoxic care conţine imină. În alte variante de realizare, se utilizează 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3,0, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 4,0, 4,5 sau 5,0 echivalenţi de sare de bisulfit sau 0,25, 0,3, 0,35, 0,4, 0,45, 0,5, 0,55, 0,6, 0,65, 0,7, 0,75, 0,8, 0,85, 0,9, 0,95, 1,0, 1,05, 1,1, 1,15, 1,2, 1,25, 1,3, 1,35, 1,4, 1,45, 1,5, 1,55, 1,6, 1,65, 1,7, 1,75, 2,0, 2,25 sau 2,5 echivalenţi de sare de metabisulfit pentru fiecare echivalent de agent citotoxic care conţine imină. În alte variante de realizare, se utilizează 1,4 echivalenţi de sare de bisulfit sau 0,7 echivalenţi de sare de metabisulfit pentru fiecare echivalent de agent citotoxic care conţine imină. În alte variante de realizare, se utilizează 1,2 echivalenţi de sare de bisulfit sau 0,6 echivalenţi de sare de metabisulfit pentru fiecare echivalent de agent citotoxic care conţine imină.
Astfel cum este utilizat în prezenta invenţie, un echivalent specific semnifică valoarea specifică ± 0,05. Într-un al 4lea aspect, pentru procedeele descrise anterior, reacţia din etapa (a) este efectuată la un pH de 2,9 până la 3,7 şi 1,0 până la 1,8 echivalenţi de sare de bisulfit sau 0,5 până la 0,9 echivalenţi de sare de metabisulfit reacţionează cu 1 echivalent de agent citotoxic care conţine imină. În unele variante de realizare, reacţia din etapa (a) este efectuată la un pH de 3,1 până la 3,5 şi 1,1 până la 1,6 echivalenţi de sare de bisulfit sau 0,55 până la 0,8 echivalenţi de sare de metabisulfit reacţionează cu 1 echivalent de agent citotoxic care conţine imină. În alte variante de realizare, reacţia din etapa (a) este efectuată la un pH de 3,2 până la 3,4 şi 1,3 până la 1,5 echivalenţi de sare de bisulfit sau 0,65 până la 0,75 echivalenţi de sare de metabisulfit reacţionează cu 1 echivalent de agent citotoxic care conţine imină. În alte variante de realizare, reacţia din etapa (a) este efectuată la un pH de 3,3 şi 1,4 echivalenţi de sare de bisulfit sau 0,7 echivalenţi de sare de metabisulfit reacţionează cu 1 echivalent de agent citotoxic care conţine imină. În alte variante de realizare, reacţia din etapa (a) este efectuată la un pH de 3,3 şi 1,4 echivalenţi de bisulfit de sodiu reacţionează cu 1 echivalent de agent citotoxic care conţine imină. Într-un al 5lea aspect, pentru procedeele descrise anterior sau în primul, cel de-al 2lea, al 3lea sau al 4lea aspect, reacţia din etapa (a) este efectuată într-un amestec de solvent organic şi apă. Poate fi utilizat orice solvent organic adecvat. Exemple de solvenţi organici includ alcooli (de exemplu metanol, etanol, propanol etc.), dimetilformamidă (DMF), dimetilsulfoxid (DMSO), acetonitril, acetonă, clorură de metilen etc. În unele variante de realizare, solventul organic este miscibil cu apa. În alte variante de realizare, solventul organic nu este miscibil cu apa, adică reacţia din etapa (a) este efectuată într-o soluţie bifazică. În unele variante de realizare, solventul organic este dimetilacetamidă (DMA). Solventul organic (de exemplu DMA) poate fi prezent în cantitate de 1%-99%, 1-95%, 10-80%, 20-70%, 30-70%, 1-60%, 5-60%, 10-60%, 20-60%, 30-60%, 40-60%, 45-55%, 10-50% sau 20-40%, în volum din volumul total de apă şi solventul organic. În unele variante de realizare, reacţia din etapa (a) este efectuată într-un amestec de DMA şi apă, în care raportul de volum dintre DMA şi apă este 1:1. Într-un al 6lea aspect, pentru procedeele descrise anterior sau în primul, cel de-al 2lea, al 3lea, al 4lea sau al 5lea aspect, reacţia din etapa (a) poate fi efectuată la orice temperatură adecvată. În unele variante de realizare, reacţia este efectuată la o temperatură de la 0 °C până la 50 °C, de la 10 °C până la 50 °C, de la 10 °C până la 40 °C sau de la 10 °C până la 30 °C. În alte variante de realizare, reacţia este efectuată la o temperatură de la 15 °C până la 30 °C, de la 20 °C până la 30 °C, de la 15 °C până la 25 °C, de la 16 °C până la 24 °C, de la 17 °C până la 23 °C, de la 18 °C până la 22 °C sau de la 19 °C până la 21 °C. În alte variante de realizare, reacţia poate fi efectuată la 15 °C, 16 °C, 17 °C, 18 °C, 19 °C, 20 °C, 21 °C, 22 °C, 23 °C, 24 °C sau 25 °C. În unele variante de realizare, reacţia poate fi efectuată de la 0 °C până la 15 °C, de la 0 °C până la 10 °C, de la 1 °C până la 10 °C, de la 5 °C până la 15 °C sau de la 5 °C până la 10 °C. Într-un al 7lea aspect, pentru procedeele descrise anterior sau în primul, cel de-al 2lea, al 3lea, al 4lea, al 5lea sau al 6lea aspect, reacţia din etapa (a) este efectuată timp de 1 minut până la 48 ore, 5 minute până la 36 ore, 10 minute până la 24 ore, 30 minute până la 24 ore, 30 minute până la 20 ore, 1 oră până la 20 ore, 1 oră până la 15 ore, 1 oră până la 10 ore, 2 ore până la 10 ore, 3 ore până la 9 ore, 3 ore până la 8 ore, 4 ore până la 6 ore sau 1 oră până la 4 ore. În unele variante de realizare, reacţia este lăsată să continue timp de 4 până la 6 ore. În alte variante de realizare, reacţia este lăsată să continue timp de 10 minute, 15 minute, 20 minute, 30 minute, 1 oră, 2 ore, 3 ore, 4 ore, 5 ore, 6 ore, 7 ore, 8 ore, 9 ore, 10 ore, 11 ore, 12 ore, 13 ore, 14 ore, 15 ore etc. În alte variante de realizare, reacţia este lăsată să continue timp de 4 ore. În alte variante de realizare, reacţia este lăsată să continue timp de 2 ore. Într-un al 8lea aspect, pentru procedeele conform prezentei invenţii descrise în prezenta invenţie sau în primul, cel de-al 2lea, al 3lea, al 4lea, al 5lea, al 6lea sau al 7lea aspect, reacţia din etapa (b) este efectuată la un pH de 4 până la 9. În unele variante de realizare, reacţia din etapa (b) este efectuată la un pH de 4,5 până la 8,5, 5 până la 8,5, 5 până la 8, 5 până la 7,5, 5 până la 7, 5 până la 6,5 sau 5,5 până la 6,5. În alte variante de realizare, reacţia din etapa (b) este efectuată la pH 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9 sau 8,0. În unele variante de realizare, pentru procedeele descrise anterior sau în primul, cel de-al 2lea, al 3lea, al 4lea, al 5lea, al 6lea, al 7lea sau al 8lea aspect, reacţia din etapa (b) este efectuată într-o soluţie apoasă care cuprinde un amestec de apă şi un solvent organic. Poate fi utilizat orice solvent organic adecvat descris anterior. Mai precis, solventul organic este DMA. În unele variante de realizare, soluţia apoasă cuprinde mai puţin decât 50%, mai puţin decât 40%, mai puţin decât 30%, mai puţin decât 25%, mai puţin decât 20%, mai puţin decât 15%, mai puţin decât 10%, mai puţin decât 5%, mai puţin decât 3%, mai puţin decât 2%, sau mai puţin decât 1% solvent organic (de exemplu DMA) din volum. În unele variante de realizare, pentru procedeele descrise anterior sau în primul, cel de-al 2lea, al 3lea, al 4lea, al 5lea, al 6lea, al 7lea sau al 8lea aspect, sarea de bisulfit este bisulfit de sodiu sau potasiu, iar sarea de metabisulfit este metabisulfit de sodiu sau potasiu. Într-o variantă de realizare specifică, sarea de bisulfit este bisulfit de sodiu, iar sarea de metabisulfit este metabisulfit de sodiu. În unele variante de realizare, pentru procedeele descrise anterior sau în primul, cel de-al 2lea, al 3lea, al 4lea, al 5lea, al 6lea, al 7lea sau al 8lea aspect, agentul citotoxic modificat nu este purificat înainte de a reacţiona cu agentul de legare celular în etapa (b). În mod alternativ, agentul citotoxic modificat este purificat înainte de a reacţiona cu agentul de legare celular în etapa (b). Orice procedeu adecvat descrisă în prezenta invenţie poate fi utilizat pentru a purifica agentul citotoxic modificat. În unele variante de realizare, pentru procedeele descrise anterior, reacţia din etapa (a) nu are ca rezultat o sulfonare substanţială a grupării maleimidice. În unele variante de realizare, mai puţin de 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% sau 1% din gruparea maleimidică este sulfonată. Procentul de sulfonare a maleimidei este egal cu cantitatea totală de agent citotoxic maleimid-sulfonat (agentul citotoxic care are sulfonare doar pe maleimidă) şi agent citotoxic disulfonat (agentul citotoxic care are sulfonare atât pe fracţiunile maleimidice, cât şi pe cele iminice) împărţită la cantitatea iniţială de agent citotoxic care conţine imină înainte de reacţionarea acestuia cu sarea de bisulfit sau cu sarea de metabisulfit. În unele variante de realizare, imunoconjugaţii preparaţi prin orice procedee descrise anterior sunt supuşi unei etape de purificare. În acest sens, imunoconjugatul poate fi purificat din celelalte componente ale amestecului utilizând filtrare în flux tangenţial (TFF), cromatografie neadsorbtivă, cromatografia adsorbtivă, filtrare adsorbtivă, precipitare selectivă sau orice alt proces de purificare adecvat, precum şi combinaţii ale acestora. În unele variante de realizare, imunoconjugatul este purificat utilizând o singură etapă de purificare (de exemplu TFF). De preferat, conjugatul este purificat şi schimbat în formularea adecvată utilizând o singură etapă de purificare (de exemplu TFF). În alte variante de realizare a invenţiei, imunoconjugatul este purificat utilizând două etape de purificare secvenţiale. De exemplu, imunoconjugatul poate fi mai întâi purificat prin precipitare selectivă, filtrare adsorbtivă, cromatografie absorbtivă sau cromatografie neabsorbtivă, urmată de purificare prin TFF. Un specialist în domeniu va aprecia faptul că purificarea imunoconjugatului permite izolarea unui conjugat stabil care cuprinde agentul de legare celulară cuplat din punct de vedere chimic cu agentul citotoxic. Orice sisteme TFF adecvate pot fi utilizate pentru purificare, inclusiv un sistem de tip Pellicon (Millipore, Billerica, Mass.), un sistem Sartocon Cassette (Sartorius AG, Edgewood, NY) şi un sistem de tip Centrasette (Pall Corp., East Hills, NY) Orice răşină de cromatografie adsorbtivă adecvată poate fi utilizată pentru purificare. Răşinile de cromatografie adsorbtivă preferate includ cromatografia cu hidroxiapatită, cromatografia de inducere a sarcinii hidrofobe (HCIC), cromatografia de interacţiune hidrofobă (HIC), cromatografia cu schimb de ioni, cromatografia cu schimb de ioni în mod mixt, cromatografia de afinitate cu metal imobilizat (IMAC), cromatografia cu ligand colorant, cromatografia de afinitate, cromatografia cu fază inversă şi combinaţii ale acestora. Exemple de răşini de hidroxiapatită adecvate includ hidroxiapatită ceramică (CHT Tip I şi Tip II, Bio-Rad Laboratories, Hercules, California), hidroxiapatită HA Ultrogel (Pall Corp., East Hills, NY) şi fluoroapatită ceramică (CFT Tip I şi Tip II, Bio-Rad Laboratories, Hercules, California). Un exemplu de răşină HCIC adecvată este răşina MEP Hypercel (Pall Corp., East Hills, NY). Exemple de răşini HIC adecvate includ răşini butil-sefaroză, hexil-sefaroză, fenil-sefaroză şi octil-sefaroză (toate de la GE Healthcare, Piscataway, NJ), precum şi răşini Macro-prep Metil şi Macro-Prep t-Butil (Biorad Laboratories, Hercules, California). Exemple de răşini cu schimb de ioni adecvate includ răşini SP-Sepharose, CM-Sepharose şi Q-Sepharose (toate de la GE Healthcare, Piscataway, NJ) şi răşină Unosphere S (Bio-Rad Laboratories, Hercules, California). Exemple de schimbătoare de ioni în mod mixt adecvate includ răşina Bakerbond ABx (JT Baker, Phillipsburg NJ). Exemple de răşini IMAC adecvate includ răşina Chelating Sepharose (GE Healthcare, Piscataway, NJ) şi răşina IMAC Profinity (Bio-Rad Laboratories, Hercules, California). Exemple de răşini ligand colorante adecvate includ răşina Blue Sepharose (GE Healthcare, Piscataway, NJ) şi răşina Affi-gel Blue (Bio-Rad Laboratories, Hercules, California). Exemple de răşini de afinitate adecvate includ răşină Protein A Sepharose (de exemplu MabSelect, GE Healthcare, Piscataway, NJ), unde agentul de legare celulară este un anticorp şi răşini de afinitate pentru lectină, de exemplu răşină Lentil Lectin Sepharose (GE Healthcare, Piscataway, NJ), unde agentul de legare celulară poartă situsuri de legare a lectinei adecvate. În mod alternativ, poate fi utilizat un anticorp specific pentru agentul de legare celulară. Un astfel de anticorp poate fi imobilizat la, de exemplu, răşina Sepharose 4 Fast Flow (GE Healthcare, Piscataway, NJ). Exemple de răşini cu fază inversă adecvate includ răşini C4, C8 şi C18 (Grace Vydac, Hesperia, California). Orice răşină de cromatografie non-adsorbtivă adecvată poate fi utilizată pentru purificare. Exemple de răşini de cromatografie non-adsorbtivă adecvate includ răşini SEPHADEXTM G-25, G-50, G-100, SEPHACRYLTM (de exemplu S-200 şi S-300), răşini SUPERDEXTM (de exemplu SUPERDEXTM 75 şi SUPERDEXTM 200), răşini BIO-GEL® (de exemplu P-6, P-10, P-30, P-60 şi P-100) şi altele cunoscute specialiştilor în domeniu.
VI. Utilizări ale imunoconjugaţilor conform prezentei invenţii
Prezenta invenţie cuprinde compoziţii farmaceutice care cuprind imunoconjugaţii conform prezentei invenţii.
Astfel cum este furnizat în prezenta invenţie, imunoconjugaţii conform prezentei invenţii, care cuprind domeniile VL şi/sau VH anti-ADAM9 umanizate/optimizate furnizate în prezenta invenţie, au capacitatea de a se lega la ADAM9 prezentă pe suprafaţa unei celule şi de a media distrugerea celulelor. În special, imunoconjugaţii conform prezentei invenţii care cuprind un agent farmacologic, sunt internalizaţi şi mediază distrugerea celulelor prin activitatea agentului farmacologic. O astfel de activitate de distrugere a celulelor poate fi sporită de imunoconjugatul care induce citotoxicitatea mediată de celule dependentă de anticorpi (ADCC) şi/sau citotoxicitatea dependentă de complement (CDC) Prin urmare, imunoconjugaţii conform prezentei invenţii, care cuprind domeniile VL şi/sau VH anti-ADAM9 umanizate/optimizate furnizate în prezenta invenţie, au capacitatea de a trata orice boală sau afecţiune asociată cu sau caracterizată prin expresia ADAM9. Astfel cum s-a discutat anterior, ADAM9 este un antigen oncoembrionar exprimat în numeroase afecţiuni maligne sanguine şi solide care este asociat cu tumori de grad înalt care prezintă o morfologie mai puţin diferenţiată şi este corelat cu rezultate clinice slabe. Prin urmare, fără limitare, imunoconjugaţii conform prezentei invenţii pot fi utilizaţi în tratamentul cancerului, în special al unui cancer caracterizat prin expresia ADAM9. În alte anumite variante de realizare, imunoconjugaţii conform prezentei invenţii pot fi utili în tratamentul cancerului pulmonar (de exemplu cancer pulmonar cu celule non-mici), cancerului colorectal, cancerului vezicii urinare, cancerului gastric, cancerului pancreatic, carcinomului cu celule renale, cancerului de prostată, cancerului esofagian, cancerului mamar, cancerului de cap şi gât, cancerului uterin, cancerului ovarian, cancerului hepatic, cancerului de col uterin, cancerului tiroidian, cancerului testicular, cancerului mieloid, melanomului şi cancerului limfoid. În alte variante de realizare, imunoconjugaţii conform prezentei invenţii pot fi utili în tratamentul cancerului pulmonar cu celule non-mici (celule scuamoase, adenocarcinom sau carcinom nediferenţiat cu celule mari) şi al cancerului colorectal (adenocarcinom, tumori carcinoide gastrointestinale, tumori stromale gastrointestinale, limfom colorectal primar, leiomiosarcom sau carcinom cu celule scuamoase). Pe lângă utilitatea acestora în terapie, imunoconjugaţii conform prezentei invenţii pot fi marcaţi în mod detectabil şi utilizaţi în diagnosticul cancerului sau în imagistica tumorilor şi celulelor tumorale.
VII. Compoziţii farmaceutice
Compoziţiile conform invenţiei includ compoziţii de medicamente în vrac utile în fabricarea compoziţiilor farmaceutice (de exemplu compoziţii impure sau nesterile) şi a compoziţiilor farmaceutice (adică compoziţii care sunt adecvate pentru administrare la un subiect sau pacient) care pot fi utilizate în prepararea formelor de dozare unitară. Astfel de compoziţii cuprind o cantitate eficientă din punct de vedere profilactic sau terapeutic din imunoconjugaţii conform prezentei invenţii sau o combinaţie de astfel de agenţi şi un purtător acceptabil din punct de vedere farmaceutic. De preferat, compoziţiile conform invenţiei cuprind o cantitate eficientă din punct de vedere profilactic sau terapeutic din imunoconjugaţii conform prezentei invenţii şi un purtător acceptabil din punct de vedere farmaceutic. Invenţia cuprinde, de asemenea, astfel de compoziţii farmaceutice care includ în plus un al doilea anticorp terapeutic (de exemplu anticorp monoclonal specific tumoral) care este specific pentru un anumit antigen canceros şi un purtător acceptabil din punct de vedere farmaceutic.
Într-o variantă de realizare specifică, termenul "acceptabil din punct de vedere farmaceutic" semnifică aprobat de o agenţie de reglementare a guvernului federal sau de stat sau listat în Farmacopeea SUA sau altă farmacopee general recunoscută pentru utilizare la animale şi mai în special la oameni. Termenul "purtător" se referă la un diluant, adjuvant (de exemplu adjuvant Freund (complet şi incomplet), excipient sau vehicul cu care este administrat medicamentul. În general, ingredientele compoziţiilor conform invenţiei sunt furnizate fie separat, fie amestecate împreună în formă de dozare unitară, de exemplu sub formă de pulbere liofilizată uscată sau concentrat fără apă într-un recipient închis ermetic, cum ar fi o fiolă sau un pliculeţ care indică cantitatea de agent activ. Acolo unde compoziţia urmează să fie administrată prin perfuzie, aceasta poate fi eliberată cu o sticlă de perfuzie care conţine apă sterilă de calitate farmaceutică sau ser fiziologic. Acolo unde compoziţia este administrată prin injectare, poate fi furnizată o fiolă cu apă sterilă pentru injectare sau o soluţie salină, astfel încât ingredientele să poată fi amestecate înainte de administrare. Invenţia furnizează, de asemenea, un pachet sau un kit farmaceutic care cuprinde unul sau mai multe recipiente umplute cu imunoconjugaţi conform prezentei invenţii, singure sau cu un astfel de purtător acceptabil din punct de vedere farmaceutic. În plus, unul sau mai mulţi alţi agenţi profilactici sau terapeutici utili pentru tratamentul unei boli pot fi de asemenea incluşi în pachetul sau kitul farmaceutic. Invenţia furnizează, de asemenea, un pachet sau un kit farmaceutic care cuprinde unul sau mai multe recipiente umplute cu unul sau mai multe dintre ingredientele compoziţiilor farmaceutice conform invenţiei. În mod opţional asociat cu un astfel de recipient poate fi o notificare în forma prescrisă de o agenţie guvernamentală care reglementează fabricarea, utilizarea sau vânzarea produselor farmaceutice sau a produselor biologice, notificare care reflectă aprobarea de către agenţia de fabricare, utilizare sau vânzare pentru administrare la oameni. Prezenta invenţie furnizează kituri care pot fi utilizate în procedeele menţionate anterior. Un kit poate cuprinde oricare dintre imunoconjugaţii conform prezentei invenţii. Kitul poate cuprinde în plus unul sau mai mulţi alţi agenţi profilactici şi/sau terapeutici utili pentru tratamentul cancerului, în unul sau mai multe recipiente.
VIII. Procedee de administrare
Compoziţiile conform prezentei invenţii pot fi furnizate pentru utilizare în tratamentul, profilaxia şi ameliorarea unuia sau mai multor simptome asociate cu o boală, tulburare prin administrarea la un subiect a unei cantităţi eficiente de imunoconjugat conform invenţiei. Într-un aspect preferat, astfel de compoziţii sunt în mod substanţial purificate (adică în mod substanţial lipsite de substanţe care le limitează efectul sau produc efecte secundare nedorite). Într-o variantă de realizare specifică, subiectul este un animal, de preferat un mamifer, cum ar fi non-primat (de exemplu bovin, ecvin, felin, canin, rozător etc.) sau primat (de exemplu maimuţă, cum ar fi o maimuţă cynomolgus, un omul etc.). Într-o variantă de realizare preferată, subiectul este un om.
Diverse sisteme de administrare sunt cunoscute şi pot fi utilizate pentru a administra compoziţiile, de exemplu încapsulare în lipozomi, microparticule, microcapsule, celule recombinante capabile să exprime anticorpul sau proteina de fuziune, endocitoză mediată de receptor (a se vedea, de exemplu, Wu şi colab. (1987) "Receptor-Mediated In Vitro Gene Transformation By A Soluble DNA Carrier System, " J. Biol. Chem. 262:4429-4432), construcţia unui acid nucleic ca parte a unui vector retroviral sau alt vector etc. Procedeele de administrare a imunoconjugaţilor pentru utilizare conform invenţiei includ administrarea parenterală (de exemplu intradermică, intramusculară, intraperitoneală, intravenoasă şi subcutanată), epidurală şi mucoasă (de exemplu căile intranazale şi orale). Într-o variantă de realizare specifică, imunoconjugaţii pentru utilizare conform prezentei invenţii sunt administraţi intramuscular, intravenos sau subcutanat. Compoziţiile pot fi administrate pe orice cale convenabilă, de exemplu prin perfuzie sau injectare în bolus, şi pot fi administrate împreună cu alţi agenţi activi din punct de vedere biologic. Administrarea poate fi sistemică sau locală. Invenţia furnizează, de asemenea, faptul că preparatele de imunoconjugaţi conform prezentei invenţii sunt ambalate într-un recipient închis ermetic, cum ar fi o fiolă sau un pliculeţ care indică cantitatea de moleculă. Într-o variantă de realizare, astfel de molecule sunt furnizate sub formă de pulbere liofilizată uscată sterilizată sau concentrat fără apă într-un recipient închis ermetic şi pot fi reconstituite, de exemplu cu apă sau soluţie salină la concentraţia adecvată pentru administrare la un subiect. De preferat, imunoconjugaţii conform prezentei invenţii sunt furnizaţi sub formă de pulbere liofilizată sterilă uscată într-un recipient închis ermetic. Preparatele liofilizate de imunoconjugaţi conform prezentei invenţii trebuie păstrate la o temperatură cuprinsă între 2 °C şi 8 °C în recipientul original al acestora, iar moleculele trebuie administrate în decurs de 12 ore, de preferat 6 ore, 5 ore, 3 ore sau 1 oră după reconstituire. Într-o variantă de realizare alternativă, astfel de molecule sunt furnizate sub formă lichidă într-un recipient închis ermetic care indică cantitatea şi concentraţia de moleculă, proteină de fuziune sau moleculă conjugată. De preferat, astfel de imunoconjugaţi, atunci când sunt furnizaţi sub formă lichidă, sunt furnizaţi într-un recipient închis ermetic. Astfel cum este utilizată în prezenta invenţie, o "cantitate eficientă" dintr-o compoziţie farmaceutică este o cantitate suficientă pentru a obţine rezultate benefice sau dorite, inclusiv rezultate clinice, cum ar fi scăderea simptomelor rezultate din boală, atenuarea unui simptom de infecţie (de exemplu încărcătură virală, febră, durere, sepsis etc.) sau a unui simptom de cancer (de exemplu proliferarea celulelor canceroase, prezenţa tumorii, metastaze tumorale etc.), crescând astfel calitatea vieţii celor care suferă de boală, reducând doza de alte medicamente necesare pentru a trata boala, sporind efectul unui alt medicament, cum ar fi prin ţintirea şi/sau internalizarea, întârzierea progresiei bolii şi/sau prelungirea supravieţuirii indivizilor. O cantitate eficientă poate fi administrată în una sau mai multe administrări. În scopul prezentei invenţii, o cantitate eficientă de medicament, compus sau compoziţie farmaceutică este o cantitate suficientă: pentru a distruge şi/sau reduce proliferarea celulelor canceroase şi/sau pentru a elimina, reduce şi/sau întârzia dezvoltarea metastazelor dintr-un situs primar al cancerului. În unele variante de realizare, o cantitate eficientă dintr-un medicament, compus sau compoziţie farmaceutică poate sau poate să nu fie obţinută împreună cu un alt medicament, compus sau compoziţie farmaceutică. Prin urmare, o "cantitate eficientă" poate fi luată în considerare în contextul administrării unuia sau mai multor agenţi chimioterapeutici şi un singur agent poate fi considerat a fi administrat într-o cantitate eficientă dacă, împreună cu unul sau mai mulţi alţi agenţi, poate fi obţinut sau se obţine un rezultat dorit. Pentru imunoconjugaţii pentru utilizare conform invenţiei, doza administrată la un pacient este de preferat determinată pe baza greutăţii corporale (kg) a subiectului beneficiar. Doza şi frecvenţa de administrare a unui imunoconjugat pentru utilizare conform prezentei invenţii pot fi reduse sau modificate prin creşterea absorbţiei şi penetrării tisulare a moleculei prin modificări cum ar fi, de exemplu, lipidarea. Doza de imunoconjugat pentru utilizare conform invenţiei administrată la un pacient poate fi calculată pentru utilizare ca terapie cu un singur agent. În mod alternativ, molecula poate fi utilizată în combinaţie cu alte compoziţii terapeutice şi doza administrată la un pacient este mai mică decât atunci când moleculele menţionate sunt utilizate ca terapie cu un singur agent. Compoziţiile farmaceutice pentru utilizare conform invenţiei pot fi administrate local în zona care necesită tratament; aceasta poate fi realizată, de exemplu, prin perfuzie locală, prin injectare sau prin intermediul unui implant, implantul menţionat fiind dintr-un material poros, neporos sau gelatinos, care include membrane, cum ar fi membrane sialastice sau fibre. De preferat, atunci când se administrează un imunoconjugat pentru utilizare conform invenţiei, trebuie avut grijă să se utilizeze materiale pe care molecula nu le absoarbe. Compoziţiile pentru utilizare conform invenţiei pot fi eliberate într-o veziculă, în special un lipozom (a se vedea Langer (1990) "New Methods Of Drug Delivery," Science 249: 1527-1533); Treat et al., in LIPOSOMES IN THE THERAPY OF INFECTIOUS DISEASE AND CANCER, Lopez-Berestein and Fidler (eds.), Liss, New York, pp. 353- 365 (1989); Lopez-Berestein, ibid., pp. 3 17-327). Tratamentul unui subiect cu o cantitate eficientă din punct de vedere terapeutic sau profilactic dintr-un imunoconjugat conform prezentei invenţii poate include un singur tratament sau, de preferat, poate include o serie de tratamente. Se va aprecia, de asemenea, faptul că doza eficientă de molecule utilizate pentru tratament poate creşte sau scădea pe parcursul unui anumit tratament.
EXEMPLE
După ce acum a fost descrisă în general invenţia, aceasta va fi mai uşor de înţeles prin referire la următoarele Exemple. Următoarele exemple ilustrează diverse procedee pentru compoziţii în procedeele de diagnostic sau tratament conform invenţiei. Exemplele sunt destinate să ilustreze, dar în niciun caz să limiteze, domeniul de aplicare al invenţiei.
Exemplul 1.
Specificitatea celulelor tumorale ale anticorpului anti-ADAM9 MAB-A
S-a identificat un anticorp murinic anti-ADAM9 (denumit în prezenta invenţie MAB-A) care: (1) blochează activitatea de procesare a proteinei ţintă a ADAM9; (2) este internalizat; şi (3) are activitate anti-tumorală (a se vedea, de exemplu, Brevetul SUA nr. 8361475). S-a investigat specificitatea celulelor tumorale ale MAB-A prin IHC. S-a pus în contact ţesut tumoral cu MAB-A (0,4 µg/mL) sau un martor izotip (0,4 µg/mL) şi s-a vizualizat gradul de colorare. S-a descoperit faptul că MAB-A marchează puternic o varietate de tipuri de celule canceroase pulmonare de carcinom cu celule mari, carcinom cu celule scuamoase şi adenocarcinom cu celule non-mici (FIG. 1A), celule canceroase mamare, celule canceroase de prostată, celule canceroase gastrice (FIG. 1B), precum şi probe de cancer de colon (FIG. 1C). S-a pus în contact ţesut normal cu MAB-A (1,25 µg/mL) şi s-a vizualizat gradul de colorare. Astfel cum s-a rezumat anterior în Tabelul 2, MAB-A a prezentat puţină colorare sau deloc a unei game largi de ţesuturi normale. Se va observa faptul că concentraţia de MAB-A utilizată în aceste studii a fost de aproape 3 ori mai mare decât cea utilizată pentru colorarea celulelor tumorale. Rezultatele acestor studii IHC indică faptul că MAB-A prezintă o legare preferenţială puternică la celulele tumorale faţă de celulele normale.
Exemplul 2.
Reactivitate încrucişată a speciilor
S-a examinat legarea MAB-A la ADAM9 umană (huADAM9) şi la ADAM9 de maimuţă cynomolgus (cynoADAM9). Pe scurt, celulele 293-FT şi CHO-K care exprimă tranzitoriu huADAM9, cynoADAM9, un antigen neînrudit sau celulele parentale netransfectate au fost incubate cu MAB-A urmat de anticorp secundar de capră anti-murinic-PE şi au fost analizate prin FACS. Astfel cum este ilustrat în FIG. 2, MAB-A prezintă o legare puternică la huADAM9 exprimată tranzitoriu pe ambele tipuri de celule. MAB-A prezintă o legare slabă la cynoADAM9. MAB-A nu s-a legat la celulele parentale sau la celulele care exprimă un antigen irelevant. Niveluri scăzute similare de legare la cynoADAM au fost observate în testele ELISA.
Exemplul 3
Umanizare şi optimizare iniţială
Umanizarea MAB-A a produs un domeniu VH umanizat, denumit în prezenta invenţie "hMAB-A VH(1)" şi un domeniu VL umanizat denumit în prezenta invenţie "hMAB-A VL(1)." Domeniile variabile umanizate au fost apoi optimizate pentru a spori activitatea de legare şi/sau pentru a îndepărta resturile de aminoacizi potenţial labile astfel cum este descris în detaliu mai jos. Această primă rundă de optimizare a produs trei domenii VH umanizate suplimentare, denumite în prezenta invenţie "hMAB-A VH(2)," "hMAB-A VH(3)" şi "hMAB-A VH(4)" şi alte trei domenii VL umanizate denumite în prezenta invenţie "hMAB-A VL(2)," "hMAB-A VL(3)" şi "hMAB-A VL(4)." În plus, a fost generată o versiune himerică a MAB-A ("chMAB-A") care are domeniile VH şi VL murinice şi regiuni constante umane. Secvenţele de aminoacizi ale domeniilor VH şi VL murinice şi umanizate/optimizate sunt furnizate anterior, o aliniere este furnizată în FIG. 3A şi 3B. Secvenţa de consens a acestor domenii VH şi VL umanizate/optimizate este furnizată anterior. Acolo unde s-au generat mai multe domenii variabile umanizate, domeniile variabile umanizate ale lanţului greu şi uşor ale unui anumit anticorp anti-ADAM9 (de exemplu MAB-A) pot fi utilizate în orice combinaţie şi se face referire la anumite combinaţii de lanţuri umanizate prin referire la domeniile VH/VL specifice, de exemplu un anticorp care cuprinde hMAB-A VH(1) şi hMAB-A VL(2) este denumit în mod specific "hMAB-A (1.2)."
În următoarele exemple, orice imunoconjugat care cuprinde următoarele domenii VH este ilustrat doar în scopuri ilustrative şi nu face parte din invenţia revendicată în prezentul document:
hMAB-A VH (1) hMAB-A VH (2) hMAB-A VH (3) hMAB-A VH (4).
În următoarele exemple, orice imunoconjugat care cuprinde versiunea himerică a MAB-A (chMAB-A) este ilustrat doar în scopuri ilustrative şi nu face parte din invenţia revendicată în prezentul document. hMAB-A VH(1) a fost generat având regiuni cadru derivate din liniile germinale umane VH3-21 şi VH3-64 şi hMAB-A VL(1) a fost generat având regiuni cadru derivate din liniile germinale umane B3 şi L6. CDR murinice au fost reţinute în aceste domenii variabile umanizate. Un potenţial situs de deamidare a fost identificat în CDRH2 (ilustrat cu o singură subliniere în FIG. 3A) şi un potenţial situs de izomerizare a acidului aspartic a fost identificat în CDRL1 (ilustrat cu o singură subliniere în FIG. 3B). Substituţiile de aminoacizi la aceste poziţii au fost examinate pentru a identifica substituţii pentru a elimina aceste situsuri menţinând în acelaşi timp afinitatea de legare. S-a selectat o substituţie a fenilalaninei la poziţia 54 (N54F) a CDRH2 (prezentă în hMAB-A VH(2)) şi la serină la poziţia 28 (D28S) a CDRL1 (prezentă în hMAB-A VL(2)), în care numerotarea este în conformitate cu Kabat. Substituţiile identificate pot fi utilizate separat sau în combinaţie. În mod surprinzător, s-a descoperit faptul că anticorpii care cuprind substituţia N54F prezintă o creştere de aproximativ 2 ori a afinităţii pentru ADAM9 umană (a se vedea, de exemplu, Tabelul 3 de mai jos) şi o legare uşor îmbunătăţită la ADAM9 de cynomolgus. Au fost generate variante suplimentare, optimizate pentru a minimiza numărul de resturi de lizină prezente în CDR. Două resturi de lizină sunt prezente în CDRH2 (indicate cu o subliniere dublă în FIG. 3A) şi o lizină este prezentă în CDRL1 (indicată cu o subliniere dublă în FIG. 3B). Substituţiile de aminoacizi la aceste poziţii au fost examinate pentru a identifica substituţiile care au menţinut afinitatea de legare. Substituţiile argininei la poziţia 62 (K62R), a glutaminei la poziţia 64 (K64Q) şi a serinei la poziţia 65 (S65G) au fost selectate pentru CDRH2 (prezentă în hMAB-A VH(3)), în care numerotarea este în conformitate cu Kabat. O substituţie a unei arginine la poziţia 24 (K24R) a fost selectată pentru CDRL1 (prezentă în hMAB-A VL(3)). Substituţiile identificate pot fi utilizate separat sau în combinaţie. Au fost identificate alte resturi potenţial labile prezente în CDR (indicate cu o subliniere punctată în FIG. 3A-3B), un rest de metionină în CDRH1 la poziţia 34 (M34), un rest de metionină în CDRL1 la poziţia 33 (M33), şi resturi de histidină, acid glutamic şi acid aspartic la poziţiile 92 (H93), 93 (E93) şi 94 (D94), în CDRL3, în care numerotarea este în conformitate cu Kabat. Substituţiile de aminoacizi la aceste poziţii au fost examinate pentru a identifica substituţiile care au menţinut afinitatea de legare. Substituţia izoleucinei la poziţia 34 (M34I) a fost selectată pentru CDRH1 şi substituţiile de leucină, tirozină, serină şi treonină au fost selectate pentru poziţiile 33 (M33L), 92 (H93Y), 93 (E93S) şi 94 (D94T) ale CDRL3, în care numerotarea este conform Kabat. Fiecare dintre aceste poziţii ar putea fi înlocuită cu uşurinţă în combinaţie cu toate substituţiile detaliate anterior pentru a produce hMAB-A VH(4) şi hMAB-A VL(4), care, atunci când sunt asociate împreună, generează un anticorp care a reţinut o mică îmbunătăţire a afinităţii în comparaţie cu anticorpul murinic parental şi care are un potenţial mult redus de deamidare sau oxidare şi fără resturi de lizină în CDR. Afinitatea de legare relativă a anticorpilor hMAB-A (1.1), hMAB-A (2.2), hMAB-A (2.3), hMAB-A (3.3), hMAB-A (4.4) umanizaţi/optimizaţi şi a chMAB-A himeric (care are domeniile VH/VL murinice) la huADAM a fost investigată utilizând analiza BIACORE®, în care ADAM9 umană solubilă marcată cu His ("shADAM9-His," care conţine o porţiune extracelulară de ADAM9 umană fuzionată cu o proteină care conţine histidină) a fost trecută pe o suprafaţă acoperită cu anticorp imobilizat. Pe scurt, fiecare anticorp a fost capturat pe o suprafaţă Fab2 de capră anti-Fc umană şi apoi a fost incubat în prezenţa diverselor concentraţii (6,25-100 nM) de proteină shADAM9-His. Cinetica de legare a fost determinată prin legarea analizei BIACORE® (normalizată 1:1 model de legare Langmuir). ka, kd şi KD calculate din aceste studii sunt prezentate în Tabelul 3. Legarea la cynoADAM9 a fost examinată prin FACS astfel cum este descris anterior şi prin ELISA.
Tabelul 3.
Anticorp pI huADAM9 ka (x106) kd (x10-3) KD (nM) chMAB-A 6,61 1,3 4,7 3,6 hMAB-A (1.1) 6,44 1,5 5,2 3,5 hMAB-A (2.2) 6,58 1,1 1,5 1,4 hMAB-A (2.3) 6,58 1,3 1,7 1,3 hMAB-A (3.3) 6,44 1,1 1,5 1,4 hMAB-A (4.4) 6,73 1,0 2,0 2,0
Rezultatele acestor studii demonstrează faptul că anticorpii umanizaţi/optimizaţi au aceeaşi afinitate de legare la ADAM9 umană sau mai mare decât anticorpul murinic parental. În special, s-a observat faptul că introducerea mutaţiei N54F în anticorpii umanizaţi a condus la o legare îmbunătăţită la huADAM9 (adică hMAB-A (2.2), hMAB-A (2.3) şi hMAB-A (3.3)). Această mutaţie a furnizat, de asemenea, o uşoară îmbunătăţire a legării la cynoADAM9, astfel cum s-a determinat prin FACS şi ELISA, cu toate acestea, aceşti anticorpi au continuat să prezinte legare slabă la cynoADAM9. Aceste studii au identificat, de asemenea, substituţii suplimentare care ar putea fi introduse pentru a elimina resturile de lizină din CDR fără a reduce afinitatea. Au fost identificate substituţii suplimentare pentru a elimina alte resturi potenţial labile, cu un impact minim asupra afinităţii.
Exemplul 4.
Optimizarea legării la ADAM9 de primate non-umane
Mutageneza aleatorie a fost utilizată pentru a introduce substituţii în domeniul CDRH2 al lanţului greu (poziţiile Kabat 53-58) şi CDRH3 (poziţiile Kabat 95-100 şi 100a-100f) ale hMAB-A (2.2). Mutanţii au fost testaţi pentru a identifica clonele care au o legare îmbunătăţită la ADAM9 de primate non-umane (de exemplu cynoADAM9) şi care au păstrat legarea cu afinitate crescută la huADAM9. 48 de clone au fost selectate din două testări independente ale mutaţiilor din CDRH3 (poziţiile Kabat 100a-100f). Tabelul 4 furnizează o aliniere a secvenţei de aminoacizi a resturilor 100a-f ale CDRH3 Kabat din clonele hMAB-A (2.2) selectate pentru legarea îmbunătăţită la cynoADAM9 din două testări independente. Aliniamentele suplimentare ale clonelor sunt furnizate în Tabelul 5. Astfel cum este indicat în astfel de Tabele, clone similare au apărut în fiecare experiment, care au căzut în modele de substituţie discrete.
Tabelul 4 Substituţii în cadrul subdomeniului lanţului greu CDRH3 al MAB-A (poziţiile Kabat 100a-100f) Testare 1 Testare 2 ID clonă SEQ ID NO Secvenţa subdomeniului CDRH3 Clone ID SEQ ID NO Secvenţa subdomeniului CDRH3 MAB-A 81 GSRDYF MAB-A 81 GSRDYF 1 82 DGEGVM 1 112 DGKAVL 2 82 DGEGVM 2 113 FNKAVL 3 83 FHSGLL 3 84 FNSATL 4 84 FNSATL 4 114 FNSGTW 5 85 FNSGTL 5 115 FNTGVF 6 86 FNSSTL 6 116 GKSRFH 7 87 GKSKWL 7 91 IGKGVF 8 88 GMGGTL 8 92 IGKGVL 9 89 HAKGGM 9 117 IGKNVY 10 90 IGEAVL 10 118 MGKGVM 11 91 IGKGVF 11 119 NGESVF 12 91 IGKGVF 12 120 PDFGWM 13 92 IGKGVL 13 121 PGSGVM 14 93 KHDSVL 14 122 PKDAWL 15 94 LNTAVM 15 99 PKFGWK 16 95 NGEGTL 16 99 PKFGWK 17 96 NGKNTL 17 123 PKFGWL 18 97 NSAGIL 18 124 PKIGWH 19 98 PKEGWM 19 124 PKIGWH 20 99 PKFGWK 20 124 PKIGWH 21 100 PKMGWV 21 125 PKMGWA 22 101 PRLGHL 22 126 PKMGWM 23 102 PSFGWA 23 126 PKMGWM 24 103 QAKGTM 24 126 PKMGWM 25 104 RGMGVM 25 126 PKMGWM 26 105 RKEGWM 26 127 PQMGWL 27 106 TGKGVL 27 128 PRFGWL 28 107 TGMGTL 28 128 PRFGWL 29 108 TGNGVM 29 128 PRFGWL 30 108 TGNGVM 30 129 PRMGFL 31 109 WNAGTF 31 130 PRMGFM 32 110 YHHTPL 32 131 PSFGWM 33 110 YHHTPL 33 132 RREGWM 34 111 YQSATL 34 133 SGEGVL 35 134 SGNGVM 36 135 VGKAVL
Tabelul 5 Substituţii în cadrul subdomeniului lanţului greu CDRH3 al MAB-A (poziţiile Kabat 100a-100f) ID Clonă SEQ ID NO Secvenţa subdomeniului CDRH3 MAB-A VH (2A) 85 FNSGTL MAB-A VH (2B) 92 IGKGVL MAB-A VH (2C) 128 PRFGWL MAB-A VH (2D) 106 TGKGVL MAB-A VH (2E) 136 DSNAVL MAB-A VH (2F) 137 FHSGTL MAB-A VH (2G) 113 FNKAVL MAB-A VH (2H) 138 GGSGVL MAB-A VH (2I) 139 PRQGFL MAB-A VH (2J) 140 YNSGTL
Pentru toate clonele examinate, Gly şi Ala sunt resturile de aminoacizi preferate în poziţia 4 (P4) şi Leu, Met şi Phe sunt resturile de aminoacizi preferate în poziţia 6 (P6). Resturile de aminoacizi preferate din alte poziţii (de exemplu poziţia 2 (P2), poziţia 3 (P3) şi poziţia 5 (P5)) depind de restul de aminoacid găsit la P1. Pentru clonele care au un rest de Pro la poziţia 1 (PI), Lys şi Arg au fost preferate la P2, Phe şi Met la P3, Gly la P4 şi Trp sau Phe la P5. Pentru clonele care au Phe, Tyr sau Trp la P1, Asn şi His au fost preferate la P2, Ser şi His la P3 şi Leu la P6. Pentru clonele care au Ile, Leu sau Val la P1, Gly a fost preferat la P2, Lys la P3, Val la P5 şi hidrofob la P6. În plus, astfel cum se poate observa în Tabelul 4, pentru clonele care au un rest de Thr la P1, Gly a fost preferat la P2, Lys, Met şi Asn au fost preferate la P3, Gly a fost preferat la P4, Val sau Thr au fost preferate la P5 iar Leu şi Met la P6. Clonele suplimentare care au un rest de Asp, Gly, Arg, His sau Ser la P1 au fost de asemenea identificate la frecvenţe inferioare (a se vedea Tabelul 4 şi Tabelul 5).
Domeniul VH al celor zece clone ilustrate în Tabelul 5 a fost utilizat pentru a genera variante optimizate suplimentare ale hMAB-A (2.2) denumite hMAB-A (2A.2)-(2J.2). Legarea clonelor selectate a fost examinată prin testul ELISA. Pe scurt, anticorpii care se leagă la peptidele care conţin histidină şi care au fost acoperiţi pe plăci de microtitrare au fost utilizaţi pentru a captura cynoADAM9 solubil marcat cu peptida His ("cynoADAM9-His") (1 µg/mL) sau huADAM9 solubil marcat cu peptida His (1 µg/mL) şi a fost examinată legarea diluţiilor în serie ale hMAB-A parental (2.2) şi cele zece variante de CDRH3 hMAB-A (2A.2). Curbele de legare la cynoADAM9 şi huADAM9 sunt ilustrate în FIG. 4A şi, respectiv, FIG. 4B,. Variantele hMAB-A (2A.2) care cuprind fiecare dintre domeniile VH selectate au prezentat o legare îmbunătăţită la cynoADAM9 cu MAB-A VH(2B), MAB-A VH(2C), MAB-A VH(2D) şi MAB-A VH(2I), prezentând cea mai mare îmbunătăţire a legării la cynoADAM9, menţinând în acelaşi timp o legare similară la huADAM9 ca şi anticorpul parental hMAB-A (2.2). Afinitatea de legare relativă a anticorpilor umanizaţi/optimizaţi suplimentar MAB-A VH(2B.2), MAB-A VH(2C.2), MAB-A VH(2D.2) şi MAB-A VH(2I.2) şi hMAB-A parental (2.2), la huADAM9-His şi cynoADAM9-His a fost investigată utilizând analiza BIACORE® în esenţă astfel cum este descris anterior. ka, kd şi KD calculate din aceste studii sunt prezentate în Tabelul 6.
Tabelul 6 Anticorp huADAM9 cynoADAM9 ka (x105 ) (M-1s-1) kd (x10-4) (s-1) KD (nM) ka (x105) (M-1s-1) kd (x10-4) (s-1) KD (nM) hMAB-A (2.2) 9,0 5,5 0,6 2,0 220 110 hMAB-A (2B.2) 6,1 3,9 0,6 3,4 0,66 0,2 hMAB-A (2C.2) 5,9 8,1 1,4 3,5 <0,1 <0,3 hMAB-A (2D.2) 6,9 5,8 0,8 4,2 3,0 0,7 hMAB-A (2I.2) 6,6 2,3 0,4 4,0 0,85 0,2
Studiile de legare demonstrează faptul că cele patru clone de top au prezentat o îmbunătăţire între 150-550 de ori în afinitatea de legare la cynoADAM9, menţinând în acelaşi timp aceeaşi legare de mare afinitate la huADAM9 ca şi anticorpul parental. hMAB-A (2C.2) şi hMAB-A (21.2) au fost selectate pentru studii suplimentare.
Exemplul 5.
Studiul imunohistochimic al anticorpului hMAB-A (2I.2)
Specificitatea celulară a hMAB-A (21.2) a fost investigată prin IHC. Celulele martor pozitive şi negative şi ţesuturile normale umane şi de maimuţă cynomolgus au fost puse în contact cu hMAB-A (21.2) (2,5. µg/mL) sau un martor izotip (2,5 µg/mL) iar gradul de colorare a fost vizualizat. Rezultatele studiului sunt rezumate în Tabelul 7.
Tabelul 7 Celulă/Ţesut hMAB-A (2I.2) (2,5µg/ml) Martor negativ IgG1 (2,5 µg/ml) Celulele parentale Cho-K - - Expresie medie Cho-K/huADAM9 P:1 2-4+ (gr c > m) rar până la ocazional şi 1+ (gr c > m) ocazional - Expresie crescută Cho-K/huADAM9 2-4+ (gr c > m) frecvent - Clona Cho-K/cynoADAM9 2 2-4+ (gr c > m) frecvent - Clona Cho-K/cynoADAM9 #16 2-4+ (gr c > m) frecvent - Celule A498 2-4+ (gr c > m) rar până la ocazional şi 1+ (gr c > m) ocazional până la frecvent - Colon MG06-CHTN-96 B - numeroase 2-4+ (gr c) celule compatibile cu macrofage Plămân MG06-CHtN-162B1 A - ocazional 2-4+ (gr c) celule compatibile cu macrofage Ficat ILS11103 B - hepatocite 1+ (gr c) rar până la ocazional Pancreas ILS10266 - - Moştenirea vieţii cardiace 0910035D - celule musculare cardiace cu numeroase 1-3+ focare mici de (gr c) compatibile cu pigmentul de lipofuscină Rinichi ILS10241 B - epi tubul 1+ (gr c) rar Vezica urinară ILSD8011 J - ocazional 2-4+ (gr c) celule compatibile cu macrofage Colon Cyno #1 - epi mucoasă (luminal m) 2-4+ rar până la ocazional şi 1+ rar până la ocazional; numeroase 2-3+ (gr c) celule compatibile cu macrofagele predominant în LP Plămân Cyno #1 - foarte rar 2-4+ (gr c) celule compatibile cu macrofage Ficat Cyno #1 - - Pancreas Cyno #1 - - Cord Cyno #1 - - Rinichi Cyno #070368M - epi tubul 2+ (gr c) rar şi 1+ (gr c) rar până la ocazional Vezica Urinară Cyno #1 epi celule tranziţionale ± (gr c) rar rar 1-4+ (gr c) celule compatibile cu macrofage Plămân CA ILS10108 Scorul H 150 tu - Plămân CA ILS7223 Scorul H 180 tu - Plămân CA ILS2156 A Scorul H 80 tu - Plămân CA ILS7295 A Scorul H 60 tu -
Studiile IHC au fost, de asemenea, efectuate pentru a evalua legarea hMAB-A (21.2) umanizat/optimizat la o concentraţie de 12,5 µg/mL (5x concentraţia optimă de colorare). În acest studiu au fost utilizate celule martor pozitive şi negative şi ţesuturi normale umane şi de maimuţă cynomolgus. Rezultatele studiului sunt rezumate în Tabelul 8.
Tabelul 8 Cell/Tissue hMAB-A (2I.2) (12,5 µg/ml) Martor negativ IgG1 (12,5 µg/ml) Celule parentale Cho-K - - Expresie medie Cho-K/huADAM9 P:1 2-4+ (gr c > m) ocazional până la frecvent - Expresie crescută Cho-K/huADAM9 3-4+ (gr c > m) ocazional până la frecvent - Clonă Cho-K/cynoADAM9 2 3-4+ (gr c > m) frecvent - Clonă Cho-K/cynoADAM9 #16 3-4+ (gr c > m) frecvent - Celule A498 2-4+ (gr c > m) ocazional până la frecvent - Colon MG06-CHTN-96 B epi ± - 1+ rar până la ocazional numeroase 2-4+ (gr c) celule compatibile cu macrofage predominant în LP în articolul de testat şi martorul negativ Plămân MG06-CHtN-162B1 A celule alveolare (favorizează pneumocitele) 2-3+ (gr c > m) rar, 1+ (gr c > m) rar până la ocazional; EC 2-4+ (c,m) rar, 1+ (c,m) rar ocazional celule risipite 2-4+ (gr c) compatibile cu macrofage în articolul de testat şi martorul negativ Ficat ILS11103 B - ocazional celule risipite 2-4+ (gr c) compatibile cu macrofage în articolul de testat şi martorul negativ Pancreas ILS10266 epi ductal 1+ (gr c > m) foarte rar celule (favorizează celulele acinare) 1+ (gr c) foarte rar; ocazional celule risipite 2-4+ (gr c) compatibile cu macrofage în articolul de testat şi martorul negativ Moştenirea vieţii cardiace 0910035D - numeroase focare mici 1-3+ colorare granulară cu celule musculare cardiace compatibile cu pigmentul de lipofuscină compatibile cu artefactul în articolul de testat şi martorul negativ Rinichi ILS10241 B epi tubul 1+ (gr c) rar până la ocazional epi tubul ± (gr c) rar Vezica urinară ILSD8011 J epi celule tranziţionale 1+ (gr c) rar rar 2-4+ (gr c) celule copatibile cu macrofage în articolul de testat şi martorul negativ Colon Cyno #1 - epi mucoasă (luminal m) 2-4+ ocazional si 1+ rar până la ocazional Plămân Cyno #1 epi bronşic 1+ (gr c > m) rar până la ocazional şi ± (gr c > m) ocazional până la frecvent - Ficat Cyno #1 - - Pancreas Cyno #1 - - Cord Cyno #1 - - Rinichi Cyno #070368M - epi tubul 1+ (gr c) rar şi ± (gr c) rar Vezica urinară #1 epi celule tranziţionale 2+ (gr c > m) rar şi 1+ (gr c > m) rar până la ocazional - Plămân CA ILS10108 Scorul H 180 tu - Plămân CA ILS7223 Scorul H 180 tu - Plămân CA ILS2156 A Scorul H 115 tu - Plămân CA ILS7295 A Scorul H 115 tu -
A fost efectuat un studiu IHC comparativ pentru a evalua diferenţele în legarea hMAB-A (2.2), hMAB-A (2.3), hMAB-A (2C.2) şi hMAB-A (2I.2) la 2,5 µg/mL sau 5 µg/mL. În acest studiu au fost utilizate celule martor pozitive şi negative şi ţesuturi normale umane şi de maimuţă cynomolgus. Rezultatele studiului sunt rezumate în Tabelul 9.
Tabelul 9 Ţesut hMAB-A (2,3) 5ug/mL hMAB-A (2,2) 2,5µg/mL hMAB-A (2C.2) 2,5 µg/mL hMAB-A (2I.2) 2,5 µg/mL Martor izotip 5 µg/mL Cho-K parental P:3 - - - - - Expresie medie Cho-K/hu ADAM9.2 P:1 1+ (c) ocazional 2-4+ (gr c > m) rar şi 1+ (gr c > m) rar până la ocazional 2-4+ (gr c > m) rar până la ocazional şi 1+ (gr c > m) rar până la ocazional 2-4+ (gr c > m) rar până la ocazional şi 1+ (gr c > m) ocazional - Expresie crescută Cho-K/hu ADAM9.18 P:1 3+ (m,c) frecvent 2-4+ (gr c > m) ocazional până la frecvent şi 1+ (gr c > m) ocazional 2-4+ (gr c > m) ocazional până la frecvent şi 1+ (gr c > m) ocazional 2-4+ (gr c > m) frecvent - Cho-K Cyno #2 1+(c) ocazional - 3-4+ (gr c > m) frecvent 2-4+ (gr c > m) frecvent - Cho-K Cyno #16 2+ (c,m) ocazional până la frecvent 2-4+ (gr c > m) rar şi 1+ (gr c > m) rar până la ocazional 3-4+ (gr c > m) frecvent 2-4+ (gr c > m) frecvent - A498 072210 3-4+ (c,m) frecvent 2-4+ (gr c > m) rar şi 1+ (gr c > m) ocazional până la frecvent 2-4+ (gr c > m) rar şi 1+ (gr c > m) ocazional 2-4+ (gr c > m) rar până la ocazional şi 1+ (gr c > m) ocazional până la frecvent - Plămân CA ILS10108 Scorul IHC 3 Scorul H 55 Scorul H 17 Scorul H 150 - Plămân CA ILS7223 Scorul IHC 3 Scorul H 205 Scorul H 160 Scorul H 180 - Plămân CA ILS2156 A Scorul IHC 1 Scorul H 5 Scorul H 0 Scorul H 80 - Plămân CA ILS7295 A Scorul IHC 1 Scorul H 1 Scorul H 0 Scorul H 60 -
A fost efectuat un studiu IHC comparativ pentru a evalua diferenţele în legarea hMAB-A (2.2), hMAB-A (2.3), hMAB-A (2C.2) şi hMAB-A (21.2) şi MAB-A murinic la 2,5 µg/mL, 5 µg/mL sau 12,5 µg/mL. În acest studiu au fost utilizate celule martor pozitive şi negative şi ţesuturi normale umane şi de maimuţă cynomolgus. Rezultatele studiului sunt rezumate în Tabelul 10.
Tabelul 10. Ţesut hMAB-A (2.3) 5 ug/mL hMAB-A (2.2) 2,5 µg/mL hMAB-A (2C.2) 2,5 µg/mL hMAB-A (2I.2) 12,5 µg/ml MAB-A 5 µg/mL Colon MG06-CHTN-96 B epi 1+ (c,m) rar; sm negativ - - epi ± - 1+ rar până la ocazional Epiteliu 1-3+ [m, c] (ocazional până la frecvent); Altele (Neg) Plămân MG06-CHtN-162B1 A pneumocite/macrofage 2+ (c,m) ocazional - - celule alveolare (favorizează pneumocitele) 2-3+ (gr c > m) rar, 1+ (gr c > m) rar până la ocazional; EC 2-4+ (c,m) rar, 1+ (c,m) rar Monocite 1+ [c] (rar până la ocazional); Altele (Neg) Ficat ILS11103 B hepatocite 1+ (c) rar până la ocazional hepatocite 1+ (gr c) frecvent hepatocite 2+ (gr c) rar şi 1+ (gr c) frecvent - celule Kupffer 3+ [c] (ocazional); Altele (Neg) Pancreas ILS 10266 epi 1+ (c) rar; celule insulare 1+ (c) foarte rar - - epi ductal 1+ (gr c > m) foarte rar Epiteliul ductal 1-2+ [c, m] (rar până la ocazional); Fibrilă 2+ (rar); Altele (Neg) Moştenirea vieţii cardiace0910035D ± - - - Neg Rinichi ILS10241 B epi 2-3+ (c,m) frecvent epi tubul 2+ (gr c) rar până la ocazional şi 1+ (gr c) ocazional până la frecvent epi tubul 2+ (gr c) rar până la ocazional şi 1+ (gr c) ocazional până la frecvent epi tubul 1+ (gr c) rar până la ocazional Epiteliu 1+ [c] (rar); Altele (Neg) Vezica urinară ILSD8011 J epi tranziţional 1+ (c) rar până la ocazional - - epi celular tranziţional 1+ (gr c) rar Epiteliu tranziţional 2+ [c, m] (ocazional până la frecvent); Celule stromale 3+ [c] (rar); Altele (Neg) Colon Cyno #1 epi 1+ (c,m) rar - - - Plămân Cyno #1 Macrofage şi pneumocite 1+ (c) foarte rar - epi bronşic 3-4+ (gr c) rar, 2+ (gr c) ocazional şi 1+ (gr c) ocazional epi bronşic 1+ (gr c > m) rar până la ocazional şi ± (gr c > m) ocazional până la frecvent - Ficat Cyno #1 hepatocite 1+ (c) frecvent hepatocite 2+ (gr c) rar până la ocazional şi 1+ (gr c) rar până la ocazional hepatocite 2+ (gr c) rar până la ocazional şi 1+ (gr c) ocazional; epi ductal 1+ (gr c) ocazional - - Pancreas Cyno #1 epi şi celule insulare 1+ (c) foarte rar - celule insulare ± (gr c) frecvent; epi ductal 1+ (gr c) rar până la ocazional - pozitiv Cord Cyno #1 miocard 1+ (c) frecvent - - - - Rinichi Cyno #070368M epi 2+ (c) frecvent epi tubul 2+ (gr c) rar până la ocazional şi 1+ (gr c) rar până la ocazional epi tubul 2+ (gr c) rar până la ocazional şi 1+ (gr c) ocazional până la frecvent - pozitiv Vezica urinară Cyno #1 epi tranziţional ± (c); macrofage foarte rar - epi celular tranziţional 2-3+ (gr c > m) rar şi 1+ (gr c > m) ocazional epi celular tranziţional 2+ (gr c > m) rar şi 1+ (gr c > m) rar până la ocazional
Rezultatele demonstrează astfel că hMAB-A (2.2) a prezentat o colorare globală redusă a hepatocitelor umane şi a tubulilor renali la concentraţie optimă, cu o intensitate/frecvenţă de colorare mai redusă a reactivităţii în hepatocite şi tubulii renali observate la martorul negativ. hMAB-A (2.2) a prezentat o colorare similară la nivel scăzut a hepatocitelor de cyno şi a tubulilor renali la concentraţie optimă, cu o intensitate/frecvenţă de colorare mai redusă a reactivităţii în tubulii renali observate la martorul negativ.
Rezultatele demonstrează, de asemenea, faptul că hMAB-A (2C.2) a prezentat o colorare generală redusă a hepatocitelor umane şi a tubulilor renali la concentraţie optimă, cu o intensitate/frecvenţă de colorare mai redusă a reactivităţii în hepatocite şi tubulii renali observate la martorul negativ. hMAB-A (2C.2) a prezentat o colorare similară la nivel scăzut în hepatocitele de cyno şi tubulii renali la concentraţie optimă. Constatări minime suplimentare în epiteliul pulmonar, celulele insulare pancreatice/epiteliul şi epiteliul vezicii urinare de cyno pentru hMAB-A (2C.2) nu au fost observate în ţesutul uman corespunzător; o intensitate/frecvenţă de colorare mai redusă a reactivităţii a fost observată în epiteliul pulmonar, tubulii renali, epiteliul vezicii urinare la martorul negativ. Rezultatele demonstrează, de asemenea, faptul că hMAB-A (21.2) nu a prezentat nicio colorare a ţesuturilor umane sau de cyno la concentraţie optimă, cu o colorare rară +/- a epiteliului celular tranziţional al vezicii urinare. hMAB-A (21.2) a prezentat, de asemenea, o colorare generală la nivel şi la frecvenţă scăzute a celulelor alveolare pulmonare umane, a epiteliului ductal pancreatic, a tubului renal, a epiteliului celular tranziţional al vezicii urinare la de 5x concentraţia optimă şi o colorare generală la nivel scăzut a epiteliului bronşic de cyno şi a epiteliului celular tranziţional al vezicii urinare la de 5x concentraţia optimă. hMAB-A (21.2) prezintă un profil IHC general favorabil pe ţesuturile umane normale testate şi un profil similar pe ţesuturile corespunzătoare de maimuţă cynomolgus.
Exemplul 6
Variante de regiuni Fc care cuprind hMAB-A (21.2)
hMAB-A (21.2) cuprinde un lanţ uşor (SEQ ID NO:68) care are o regiune constantă a lanţului uşor kappa şi un lanţ greu (SEQ ID NO:52) care are regiuni constante ale lanţului greu de IgG de tip sălbatic. Variantele Fc au fost generate prin introducerea următoarelor substituţii în regiunea Fc: L234A/L235A (a se vedea, de exemplu, SEQ ID NO: 78) desemnat hMAB-A (2I.2)(AA); S442C (a se vedea, de exemplu, SEQ ID NO: 79) desemnat hMAB-A (2I.2)(C); şi L234A/L235A/S442C (a se vedea, de exemplu, SEQ ID NO: 80) desemnat hMAB-A (2I.2)(AA/C). Legarea fiecărei variante de Fc la huADAM9-His şi cynoADAM9-His a fost examinată prin testul ELISA. Pe scurt, anticorpii care se leagă la peptidele care conţin histidină şi care au fost acoperiţi pe plăci de microtitrare au fost utilizaţi pentru a captura cynoADAM9 solubil marcat cu peptida His sau huADAM9 solubil marcat cu peptida His (0,5 µg/mL) şi a fost examinată legarea diluţiilor în serie ale hMAB-A parental (2.2) şi a variantelor de Fc. Curbele de legare huADAM9 şi cynoADAM9 sunt ilustrate în FIG. 5A şi, respectiv, FIG. 5B, şi ilustrează faptul că fiecare dintre variantele de Fc a reţinut afinitatea de legare a hMAB-A (21.2) care are o regiune Fc de tip sălbatic.
Exemplul 7.
Analiza expresiei ţintă
Pentru a evalua expresia ADAM9 în diverse indicaţii, o micromatrice de ţesut (TMA) cu 20 de tipuri diferite de tumori a fost evaluată mai întâi utilizând un test ADAM9 IHC dezvoltat la ImmunoGen pentru utilizare în cercetarea preliminară.
Toate probele analizate au fost probe FFPE (fixate pe formol şi încorporate în parafină). TMA cu 500 de nuclee 20 de carcinom a fost achiziţionat de la Folio Biosciences (Cat# ARY-HH0212). NSCLC TMA cu 80 de nuclee pentru adenocarcinom şi 80 de nuclee pentru carcinom cu celule scuamoase a fost achiziţionat de la US Biomax (Cat# LC1921A). TMA pentru cancer colorectal cu 80 de nuclee pentru adenocarcinom a fost achiziţionat de la Pantomics Inc. (Cat# COC1261). Probele de cancer gastric au fost achiziţionate de la Avaden Biosciences. Colorarea imunohistochimică pentru ADAM9 a fost efectuată utilizând autostainerul Ventana Discovery Ultra. Anticorpul primar pentru ADAM9 a fost un anticorp monoclonal de iepure disponibil pe piaţă. Toate probele au fost evaluate şi punctate de un patolog certificat de consiliu, instruit în algoritmul de punctare. Prezenţa a cel puţin 100 de celule tumorale viabile a fost necesară pentru punctare. Intensitatea colorării a fost punctată pe o scară semi-cantitativă între 0 şi 3, cu 0 reprezentând nicio colorare, 1 reprezentând colorare slabă, 2 reprezentând colorare moderată şi 3 reprezentând colorare puternică. S-a înregistrat procentul de celule colorate pozitiv la fiecare nivel de intensitate. Punctarea s-a bazat pe localizarea Adam9 doar pe membrana celulară, precum şi pe evaluarea localizării atât la citoplasmă, cât şi la membrană. Rezultatele colorării au fost analizate prin punctajul H, care combină componentele intensităţii colorării cu procentul de celule pozitive. Acesta are o valoare între 0 şi 300 şi este definit astfel:
TMA cu 500 de nuclee 20 de carcinom cu 5 martori tisulari normali pentru fiecare tip de tumoare a fost colorat şi punctat în două moduri diferite: (1) pe baza colorării membranei singure sau (2) pe baza colorării membranei şi citoplasmei. Tabelul 11 de mai jos şi FIG. 6A rezumă prevalenţa ADAM9 pe baza colorării membranei pentru toate cele douăzeci de indicaţii şi Tabelul 12 şi FIG. 6B rezumă rezultatele colorării membranei şi citoplasmei pentru opt indicaţii selectate.
Pe baza rezultatelor din TMA multicarcinom, au fost alese trei indicaţii pentru o analiză extinsă a prevalenţei: cancer pulmonar cu celule non-mici (NSCLC), cancer colorectal (CRC) şi cancer gastric. Pentru NSCLC, un TMA cu 80 de nuclee pentru adenocarcinom şi 80 de nuclee pentru carcinom cu celule scuamoase a fost colorat şi evaluat. Pentru CRC, a fost analizat un TMA cu 80 de nuclee pentru adenocarcinom, dintre care 78 au fost evaluabile. Pentru cancer gastric, au fost analizate 15 secţiuni tisulare integrale de adenocarcinom. Toate aceste probe au fost punctate pentru colorarea membranei şi citoplasmei, iar rezultatele sunt rezumate în Tabelul 13. Rezultatele acestor studii preliminare arată faptul că ADAM9 este exprimat într-o gamă largă de cancere solide şi sprijină utilizarea conjugaţilor medicamentoşi anti-ADAM9 în multe tumori solide care exprimă ADAM9.
Tabelul 11: Prevalenţa ADAM9 în 20 de indicaţii diferite bazate pe colorarea membranei
Tip de tumoare % Pozitiv (scorul H >=1) Scorul H: 1-100 Scorul H: 101-200 Pancreas (n=17) 95% 24% 71% Uter (n=18) 89% 67% 22% Glanda tiroida (n=17) 88% 88% 0% Rinichi (n=17) 88% 59% 29% Testicul (n=17) 83% 65% 18% Prostată (n=20) 80% 45% 35% Colon (n=16) 76% 38% 38% Vezica urinară (n=16) 76% 63% 13% Sân (n=20) 75% 65% 10% Creier (n=19) 68% 63% 5% Stomac (n=17) 59% 24% 35% Plămân (n=19) 58% 58% 0% Esofag (n=19) 43% 32% 11% Col uterin (n=20) 40% 40% 0% Ovar (n=18) 39% 33% 6% Cap şi gât (n=20) 35% 30% 2% Ficat (n=19) 32% 32% 0% Piele (n=20) 10% 10% 0% Ţesut moale (n=20) 0% 0% 0% Limfom (n=20) 0% 0% 0%
Tabelul 12: Prevalenţa ADAM9 în 8 indicaţii selectate pe baza colorării membranei şi citoplasmei
Tip de tumoare % Pozitiv (Scorul H >=1) Scorul H: 1-100 Scorul H: 101-200 Scorul H: 201-300 Colon 100% 31% 63% 6% Plămân 100% 58% 42% 0% Pancreas 100% 18% 76% 6% Prostată 95% 25% 55% 15% Esofag 95% 58% 37% 0% Stomac 94% 18% 71% 6% Sân 70% 50% 20% 0% Ovar 61% 44% 17% 0%
Tabelul 13: Prevalenţa ADAM9 în probe suplimentare pentru NSCLC, CRC şi cancer gastric pe baza colorării membranei şi citoplasmei
Tip de tumoare Număr de probe % pozitiv (Scorul H >=1) Distribuţia scorului H 1-100 101-200 201-300 Adenocarcinom NSCLC 80 90% 46% 39% 5% NSCLC scuamos 80 81% 65% 13% 3% Adenocarcinom CRC 78 91% 51% 41% 0% Adenocarcinom gastric 15 100% 27% 53% 20%
Exemplul 8
Studii de internalizare a anticorpilor anti-ADAM9
Pentru a evalua internalizarea anticorpilor anti-ADAM9 conform invenţiei, au fost efectuate experimente de internalizare bazate pe citometrie de flux pe anticorpi hMAB-A(2.2), hMAB-A(21.2) şi hMAB-A(2I.2)-S442C conjugaţi către Alexa Fluor 488.
Conjugaţii de anticorpi anti-ADAM9 Alexa488 pentru hMAB-A(2.2), hMAB-A(21.2), hMAB-A(2I.2)-S442C au fost generaţi utilizând esterul tetrafluorfenilic Alexa Fluor 488 conform instrucţiunilor producătorului (Thermofisher). Conjugaţii au fost eluaţi în PBS fără azidă de sodiu, pH 7,2 pentru a permite testele de internalizare. Concentraţia şi gradul de marcare au fost calculate din măsurătorile de absorbţie la 280 nm şi 494 nm. Au fost efectuate teste de legare FACS pentru a se asigura faptul că marcarea Alexa488 nu a afectat negativ legarea ţintei. Internalizarea conjugaţilor anti-ADAM9-Alexa488 a fost determinată atât în urma expunerii continue cât şi cu impulsuri la conjugaţii fluorescenţi. Pentru experimente continue, celulele NCI-HI703 au fost tratate cu o concentraţie saturată de anticorp indicat marcat Alexa488 pe gheaţă sau la 37 °C pentru tot timpul indicat. În timp ce pentru experimentele cu impulsuri, conjugaţii anti-ADAM9-Alexa488 au fost legaţi în prealabil la celule pe gheaţă, iar excesul de conjugat a fost spălat înainte de a trece la 37 °C şi de a monitoriza internalizarea. La momentele indicate, după expunerea fie continuă, fie cu impulsuri, celulele au fost crescute cu versene (Thermofisher) şi au fost spălate cu PBS cu gheaţă de două ori, iar godeurile replicate au fost resuspendate în PBS cu gheaţă fără (probe nestinse) sau cu 300 nM anticorp anti-A488 (probe stinse). Toate probele au fost incubate timp de 30 de minute pe gheaţă. Celulele au fost apoi peletizate, au fost fixate în 1% paraformaldehidă şi au fost analizate prin citometrie în flux. Fluorescenţa celulelor incubate pe gheaţă timp de 30 de minute şi apoi incubate cu anticorp anti-Alexa488 reprezintă fracţia fluorescentă nestinsă şi a fost scăzută din toate celelalte probe înainte de calcularea internalizării. Procentul de internalizare a fost calculat ca fluorescenţă a probelor stinse corectate pentru stingerea incompletă de suprafaţă (fluorescenţă intracelulară) împărţită la cea a celulelor nestinse (fluorescenţă totală). Internalizarea conjugaţilor de anticorpi anti-ADAM9 a fost reprezentată grafic şi datele au fost ajustate utilizând o ecuaţie de dezintegrare exponenţială cu o singură fază (GraphPad Prism, ver. 5.01). Internalizarea anticorpilor anti-ADAM9 marcaţi cu Alexa488 legaţi la suprafaţă a fost evaluată atât după tratamentul cu impulsuri, cât şi după tratamentul continuu în celulele NCI-HI703. Toţi cei trei conjugaţi anti-ADAM9-Alexa488 testaţi au arătat o internalizare rapidă, cu ~39% dintre conjugaţi internalizaţi în primele 15 minute şi un total de ~77% internalizaţi după 6 ore (FIG. 7A). Interesant, după expunere continuă timp de 24 de ore, semnalul fluorescent internalizat a fost de ~7 ori mai mare decât semnalul fluorescent iniţial total legat la suprafaţa celulară după 30 de minute (FIG. 7B). Prin urmare, ADAM9 este probabil alimentat la suprafaţa celulară intr-un bazin intracelular în timpul incubaţiilor la 37 °C, permiţând mai multe runde de internalizare a conjugatului de anticorp anti-ADAM9. Eficacitatea imunoconjugaţilor anti-ADAM9 se bazează pe internalizarea, traficul intracelular şi degradarea imunoconjugaţilor. Potenţa imunoconjugaţilor anti-ADAM9 poate fi explicată parţial prin internalizarea crescută a imunoconjugaţilor anti-ADAM9, care conduce probabil la generarea de cantităţi mari de cataboliţi citotoxici.
Exemplul 9
Studii de procesare celulară cu anticorpi anti-ADAM9
Pentru a evalua legarea ţintă pe celulă, absorbţia şi degradarea lizozomală a chMAB-A, a fost utilizat un procedeu de procesare a anticorpilor marcaţi cu 3H-propionamidă descris anterior (Lai şi colab., Pharm Res. 2015 Nov; 32(11):3593-603). Utilizând acest procedeu, anticorpul chMAB-A care ţinteşte ADAM9 a fost marcat în urmă cu propionat tritiat prin resturi de lizină. S-a demonstrat anterior faptul că la legarea celulară, absorbţia şi traficul la lizozom, Ab marcat cu [3H]propionat (3H-Ab) este degradat şi lizina-[3H]propionamida este eliberată în mediul de creştere celulară. Adăugarea de solvent organic precipită anticorpul intact, marcat şi lasă lizina-[3H]propinoamida în soluţie, permiţând măsurarea convenabilă şi precisă a gradului de procesare a anticorpilor.
chMAB-A a fost marcat cu [3H]-propionat astfel cum a fost descris anterior. Linia NSCLC, NCI-H1703, şi linia CRC, DLD-1, au fost tratate cu 10 nM anticorpi 3H-chMAB-A după determinarea saturaţiei cu antigen prin curba de legare. Unele probe celulare au fost tratate cu anticorpul martor izotip tritiat, fără ţintire, 3H-chKTI, în timp ce altele au fost netratate. Celulele au fost placate şi cultivate peste noapte în plăci cu 6 godeuri şi apoi tratate cu impulsuri cu reactiv(i) astfel cum s-a descris anterior. Pe scurt, celulele au fost incubate fie cu anticorp 3H-chMAB-A, fie cu 3H-chKTI timp de 20 de minute înainte de spălare de 3 ori în mediu proaspăt. Celulele au fost incubate peste noapte la 37 °C cu 5% CO2. După o incubare de 20-24 ore, celulele au fost recoltate şi proteinele au fost precipitate cu 4:3 volum acetonă: medie/amestec celular. Probele au fost congelate la -80 °C timp de minim 1 oră înainte de decongelare şi separare prin centrifugare. Peletele au fost tratate pentru a solubiliza proteina înainte de numărare timp de 5 minute într-un contor de scintilaţie lichidă Tri-Carb (LSC). Conform protocolului producătorului, 1 mL de SOLVABLE (Perkin Elmer) a fost adăugat la fiecare probă de pelete şi s-a incubat într-o baie de apă la 50 °C peste noapte. Probele au fost îndepărtate din baia de apă, au fost transferate în flacoane de sticlă cu scintilaţie de 20 mL şi EDTA şi H2O2 au fost adăugate la probe urmate de o incubare suplimentară de 1 oră la 50 °C. Probele au fost stinse cu HCl, s-au adăugat 15 mL de fluid de scintilaţie lichid Optima Gold (Perkin Elmer) şi probele au fost agitate bine în vortex. Probele au fost ţinute la întuneric timp de minim 4 ore înainte de numărare prin LSC. Probele de extract de acetonă fără proteine au fost uscate până la volume < 1 mL în vid şi au fost procesate utilizând Solvable astfel cum s-a descris anterior înainte de LSC. Cantitatea de anticorp marcat legat, degradat şi intact a fost calculată din valorile CPM ale probei rezultate. Nivelul de procesare a anticorpului 3H-chMAB-A a fost determinat după tratamentul cu impulsuri şi incubarea peste noapte la 37 °C. Celulele NCI-HI703 au prezentat 93% din 3H-chMAB-A procesat în 24 de ore, iar celulele DLD-1 au prezentat 92% din 3H-chMAB-A procesat în aceeaşi perioadă de timp. Legarea şi procesarea 3H-chKTI a fost neglijabilă (>100 de ori CPM total mai mic decât pentru anticorpul ţintit). Valorile de procesare pentru aceste linii celulare sunt crescute, în special în comparaţie cu valorile de procesare cu impulsuri în 24 de ore raportate anterior pentru alte ţinte ADC/anticorpi, susţinând anticorpii anti-ADAM9 descrişi în prezenta invenţie în calitate de conjugaţi medicamentoşi eficienţi.
Exemplul 10
Studii de afinitate de legare a anticorpilor anti-ADAM9 umanizaţi/optimizaţi şi conjugaţi medicamentoşi
Pentru a evalua consecinţele conjugării asupra legării antigenului, afinitatea de legare relativă a fiecărui imunoconjugat anti-ADAM9 şi respectivul anticorp neconjugat la ADAM9 a fost determinată prin analiza FACS pe 300-19 celule care exprimă ectopic fie ADAM9 umană, fie ADAM9 de cynomolgus. Pe scurt, celulele 300-19 care exprimă ADAM9 au fost incubate cu serii de diluţii de anticorpi anti-ADAM9 sau imunoconjugaţi timp de 30 de minute @ 4 °C în tampon FACS (PBS, 0,1% BSA, 0,01% NaN3). Probele au fost apoi spălate şi incubate cu anticorp secundar marcat fluorescent timp de 30 de minute la 4 °C. Media normalizată a intensităţii fluorescenţei la fiecare concentraţie a fost reprezentată grafic şi EC50 de legare a fost calculată utilizând o analiză de regresie neliniară (GraphPad Prims 4.0). Rezultatele acestui studiu sunt rezumate în Tabelul 14.
Toţi anticorpii şi imunoconjugaţii anti-ADAM9 testaţi s-au legat cu afinitate similară la ADAM9 umană cu o EC50 de aproximativ 1,4 nM măsurată prin citometrie în flux, indicând faptul că conjugarea nu a modificat în mod apreciabil afinitatea de legare a anticorpilor (a se vedea, FIG. 8A-8D). În timp ce umanizarea a îmbunătăţit legarea la ADAM9 de cynomolgus în raport cu anticorpul himeric (chMAB-A), variantele optimizate în plus (hMAB-A(2C.2), hMAB-A(21.2) şi hMAB-A(2I.2) S442C) şi imunoconjugaţii acestora au prezentat o legare în mod semnificativ îmbunătăţită la ADAM9 de cynomolgus. Îmbunătăţirea semnificativă a legării la ADAM9 de cynomolgus facilitează studiile de toxicologie şi siguranţă pentru a valida utilizarea imunoconjugaţior ADAM9 ca terapii medicamentoase.
Exemplul 11
Sinteza N-(2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirol-1-il)etil)-11-(3-((((S)-8-metoxi-6-oxo-11,12,12a,13-tetrahidro-6H-benzo[5,6][1,4]diazepino[1,2-a]indol-9-il)oxi)metil)-5-((((S)-8-metoxi-6-oxo-12a,13-dihidro-6H-benzo[5,6][1,4]diazepino[1,2-a]indol-9-il)oxi)metil)fenil)-13,13-dimetil-2,5,8-trioxa-14,15-ditia-11-azanonadecan-19-amidei, Compusul D6
Etapa 1: La o soluţie de tiol liber DGN462 (40 mg, 0,042 mmoli) şi 4-(2-piridilditio)butanat de NHS (35 mg, 80% puritate, 0,085 mmoli) în diclorometan anhidru (0,5 mL) s-a adăugat diizopropiletilamină anhidră (0,015 mL, 0,085 mmoli) şi s-a agitat la temperatura camerei timp de 16 ore. Amestecul de reacţie s-a stins cu clorură de amoniu saturată şi s-a diluat cu diclorometan. Amestecul obţinut s-a separat Într-o pâlnie de separare. Stratul organic s-a spălat cu soluţie salină, s-a uscat pe sulfat de sodiu anhidru, s-a filtrat şi s-a stripat sub presiune redusă. Restul s-a purificat prin HPLC semi-preparativă cu fază inversă (coloană CI8, CH3CN/H2O). Fracţiile care au conţinut produsul pur s-au combinat, congelat şi liofilizat pentru a rezulta esterul de NHS dorit, compusul 6a (29,7 mg, randament 60%). CLSM = 9,1 minute (procedeul de 15 minute) SM (m/z): 1157,3 (M + 1)+
Etapa 2: La o soluţie de ester de NHS, compusul 6a (12,3 mg, 0,011 mmoli) şi clorhidrat de N-(2-aminoetil)maleimidă (2,0 mg, 0,011 mmoli) în diclorometan anhidru (0,3 mL) s-a adăugat DIPEA (0,0022 mL, 0,013 mmoli). Amestecul s-a agitat la temperatura camerei timp de 3 ore apoi s-a stripat sub presiune redusă. Restul s-a purificat prin HPLC semi-preparativă cu fază inversă (coloană CI8, CH3CN/H2O). Fracţiile care au conţinut produsul pur s-au combinat, congelat şi liofilizat pentru a rezulta maleimida dorită, compusul D6 (10 mg, randament 80%). CLSM = 8,3 minute (procedeul de 15 minute) SM (m/z): 1181,8 (M + 1)+
Exemplul 12
Sinteza N1-(2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirol-1-il)etil)-N6-((S)-1-(((S)-1-((3-((((S)-8-metoxi-6-oxo-11,12,12a,13-tetrahidro-6H-benzo[5,6][1,4]diazepino[1,2-a]indol-9-il)oxi)metil)-5-((((S)-8-metoxi-6-oxo-12a,13-dihidro-6H-benzo[5,6][1,4]diazepino[1,2-a]indol-9-il)oxi)metil)fenil)amino)-1-oxopropan-2-il)amino)-1-oxopropan-2-il)adipamidei, compusul D5
Ester de NHS, compusul 5a (8,2 mg, 7,6 µmoli) şi clorhidrat de 1-(2-aminoetil)-1H-pirol-2,5-dionă (2,2 mg, 0,011 mmoli) s-au dizolvat, la temperatura camerei, în diclorometan anhidru (305 µL). S-a adăugat DIPEA (2,66 µL, 0,015mmoli) şi reacţia şi s-a agitat timp de 3,5 ore. Produsul brut s-a concentrat şi s-a purificat prin RPHPLC (coloană C18, CH3CN/H2O, gradient, 35% până la 55%). Fracţiile de produs dorit s-au îngheţat şi s-au liofilizat pentru a rezulta maleimida, compusul D5 sub formă de pulbere albă solidă (5,3 mg, randament 58%). CLSM = 5,11 minute (procedeul de 8 minute) SM (m/z): 1100,6 (M + 1)+
Exemplul 13
Sinteza acidului 1-((2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirol-1-il)etil)amino)-4-((5-((3-((((S)-8-metoxi-6-oxo-11,12,12a,13-tetrahidro-6H-benzo[5,6][1,4]diazepino[1,2-a]indol-9-il)oxi)metil)-5-((((S)-8-metoxi-6-oxo-12a,13-dihidro-6H-benzo[5,6][1,4]diazepino[1,2-a]indol-9-il)oxi)metil)fenil)amino)-2-metil-5-oxopentan-2-il)disulfanil)-1-oxobutan-2-sulfonic, compusul D4
La o suspensie de tiol liber, D1 (88 mg, 0,105 mmoli) şi acid 1-((2,5-dioxopirolidin-1-il)oxi)-1-oxo-4-(piridin-2-ildisulfanil)butan-2-sulfonic (sulfo-SPDB) (64,0 mg, 0,158 mmoli) în diclorometan anhidru (2,10 mL) s-a adăugat DIPEA (55,0 µL, 0,315 mmoli) la temperatura camerei sub azot. Amestecul s-a agitat timp de 16 ore şi apoi s-au adăugat clorhidrat 1-(2-aminoetil)-1H-pirol-2,5-dionă (55,6 mg, 0,315 mmoli), diclorometan anhidru (1,0 mL) şi DIPEA (0,055 mL, 0,315 mmoli). Amestecul s-a agitat timp de încă 5 ore la temperatura camerei după care reacţia s-a concentrat în vid. Restul rezultat s-a purificat prin RP-HPLC (Ci8, CH3CN/H2O). Fracţiile care au conţinut produsul dorit s-au congelat şi s-au liofilizat pentru a rezulta maleimida, D4 (20 mg, randament 16%) sub forma unui solid alb. CLSM = 4,92 minute (procedeul de 8 minute) SM (m/z): 1158,6 (M + 1)+
Exemplul 14
Sinteza N-(2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirol-1-il)etil)-11-(3-((((S)-8-metoxi-6-oxo-11,12,12a,13-tetrahidro-6H-benzo[5,6][1,4]diazepino[1,2-a]indol-9-il)oxi)metil)-5-((((S)-8-metoxi-6-oxo-12a,13-dihidro-6H-benzo[5,6][1,4]diazepino[1,2-a]indol-9-il)oxi)metil)fenil)-2,5,8-trioxa-11-azapentadecan-15-amidei, compusul D7
La o soluţie de ester de NHS, 7a (5 mg, 4,82 µmoli) şi clorhidrat de 1-(2-aminoetil)-1H-pirol-2,5-dionă (1,7 mg, 9,64 µmoli) în diclorometan anhidru (200 µL) s-a adăugat, sub azot, DIPEA (1,512 µL, 8,68 µmoli). Amestecul s-a agitat la temperatura camerei timp de 4 ore şi apoi s-a concentrat în vid. Restul rezultat s-a purificat prin RP-HPLC (C18, CH3CN / H2O). Fracţiile care au conţinut produsul dorit s-au congelat şi s-au liofilizat pentru a rezulta maleimida, compusul D7 (3,5 mg, randament 68%). CLSM = 4,61 minute (procedeul de 15 minute) SM (m/z): 1062,8 (M + 1)+
Exemplul 15
Prepararea conjugatului specific situsului de cisteină al anticorpului anti-ADAM9 hMAB-A(2I.2)-S442C-DGN549
hMAB-A(2I.2)-S442C este un anticorp umanizat/optimizat cu o secvenţă de lanţ uşor a SEQ ID NO:68 (care cuprinde o secvenţă VL a SEQ ID NO:55) şi o secvenţă de lanţ greu a SEQ ID NO:142 (care cuprinde o secvenţă VH a SEQ ID NO:28), care include o Cys modificată care corespunde celui de-al 6lea până la ultimul rest al SEQ ID NO:142, atunci când X este o lizină, sau care corespunde celui de-al 5lea până la ultimul rest al SEQ ID NO: 142, atunci când X este absent.
Cele două resturi de cisteină nepereche din anticorpul hMAB-A(2I.2)-S442C au fost reduse utilizând proceduri standard. La o soluţie de acest intermediar în soluţie salină tamponată cu fosfat (PBS), 5 mM acid N,N,N',N'-etilendiaminetetracetic (EDTA) pH 6,0 s-a adăugat N,N-dimetilacetamidă (DMA), propilenglicol şi 10 echivalenţi molari de DGN549-C (compusul D5) ca o soluţie în stoc în DMA pentru a rezulta un amestec de reacţie cu o compoziţie finală a solventului de 2% v/v DMA şi 38% v/v propilenglicol în PBS 5 mM EDTA pH 6,0 şi reacţia a fost lăsată să se desfăşoare peste noapte la 25 °C.
Conjugatul s-a purificat în 20 mM succinat, 8,5% sucroză, 0,01% Tween-20, 50 µM bisulfit de sodiu, pH 4,2 utilizând un sistem de cromatografie lichidă rapidă a proteinelor (FPLC) echipat cu coloane de desalinizare Sephadex G-25 Fine cu rata de flux stabilită la 5 mL/min. Conjugatul a fost apoi filtrat printr-un filtru de seringă de 0,22 µm. S-a descoperit faptul că conjugatul are o medie de 1,9 moli DGN549/mol anticorp prin UV-vis, 97,6% monomer prin SEC şi 0,8% DGN549 neconjugat prin SEC/RP-UPLC în tandem. CL-SM a conjugatului deglicozilat nu este ilustrată.
Exemplul 16.
Prepararea conjugaţilor IGN legaţi la lizină ai anticorpilor anti-ADAM9
a. Prepararea hMAB-A(2I.2)-DGN549
hMAB-A(2I.2) este un anticorp umanizat/optimizat cu o secvenţă de lanţ uşor a SEQ ID NO:68 şi o secvenţă de lanţ greu a SEQ ID NO:52. La o soluţie care conţine anticorpul hMAB-A(2I.2) tamponat la pH 8,5 cu 15 mM acid 2-[4-(hidroxietil)piperzin-1-il]etansulfonic (HEPES), s-a adăugat N,N-dimetilacetamidă (DMA) împreună cu 4,8 echivalenţi de DGN549-L (compusul D2) ca soluţie în stoc în DMA, astfel încât compoziţia finală de solvent a fost de 10% (v/v) DMA şi 90% (v/v) tampon apos. Reacţia a fost lăsată să se desfăşoare timp de 4 de ore la 25 °C.
Conjugatul s-a purificat în 20 mM succinat, 8,5% sucroză, 0,01% Tween-20, 50 µM bisulfit de sodiu, pH 5,2 pe coloane de desalinizare Sephadex G-25, s-a dializat faţă de acest tampon utilizând o membrană cu o limită de greutate moleculară de 10 kDa şi s-a filtrat printr-un filtru de seringă de 0,22 µm. Conjugatul a avut o medie de 2,8 moli DGN549/mol anticorp prin UV-vis, 98,6% monomer prin SEC şi < 0,5% DGN549 neconjugat prin SEC/RP-UPLC în tandem. CL-SM a conjugatului deglicozilat nu este ilustrată.
b. Prepararea hMAB-A(2.2)-DGN549
hMAB-A(2.2) este un anticorp umanizat cu o secvenţă de lanţ uşor a SEQ ID NO:68 şi o secvenţă de lanţ greu a SEQ ID NO:50. Anticorpul hMAB-A(2.2) a fost conjugat la DGN549 utilizând aceleaşi condiţii ca cele descrise pentru hMAB-A(2I.2)-DGN549, cu excepţia faptului că s-au adăugat la reacţie 4,4 echivalenţi de DGN549-L (compusul D2). hMAB-A(2.2)-DGN549 a fost purificat în acelaşi mod ca cel descris pentru hMAB-A(2I.2)-DGN549.
hMAB-A(2.2)-DGN549 purificat a avut o medie de 2,7 moli DGN549/mol anticorp prin UV-vis, 95,6% monomer prin SEC şi 0,6% DGN549 neconjugat prin SEC/RP-UPLC în tandem. CL-SM a conjugatului deglicozilat nu este ilustrată.
c. Prepararea hMAB-A(2C.2)-DGN549
hMAB-A(2C.2) este un anticorp umanizat/optimizat cu o secvenţă de lanţ uşor a SEQ ID NO:68 şi o secvenţă de lanţ greu a SEQ ID NO:51.
Anticorpul hMAB-A(2C.2) a fost conjugat la DGN549 utilizând aceleaşi condiţii ca cele descrise pentru hMAB-A(2I.2)-DGN549, cu excepţia faptului că s-au adăugat la reacţie 4,9 echivalenţi de DGN549-L (compusul D2). hMAB-A(2C.2)-DGN549 a fost purificat în acelaşi mod ca cel descris pentru hMAB-A(2I.2)-DGN549. hMAB-A(2C.2)-DGN549 purificat a avut o medie de 2,8 moli DGN549/mol anticorp prin UV-vis, 98,6% monomer prin SEC şi < 0,6% DGN549 neconjugat prin SEC/RP-UPLC în tandem. CL-SM a conjugatului deglicozilat nu este ilustrată.
d. Prepararea chMAB-A-DGN549, chMAB-A-sSPDB-IGN137, chMAB-A-IGN23 şi chMAB-A-sSPDB-DGN462
Anticorpul chMAB-A a fost conjugat cu DGN549 utilizând aceleaşi condiţii ca cele descrise pentru hMAB-A(2I.2)-DGN549, cu excepţia faptului că s-au adăugat la reacţie 3,4 echivalenţi de DGN549-L (compusul D2). chMAB-A-DGN549 a fost purificat în acelaşi mod ca cel descris pentru hMAB-A(2I.2)-DGN549, cu excepţia faptului că conjugatul a fost purificat în 20 mM histidină, 50 mM clorură de sodiu, 8,5% sucroză, 0,01% Tween-20, 50 µM bisulfit de sodiu, pH 6,2. chMAB-A-DGN549 purificat a avut o medie de 2,7 moli DGN549/mol anticorp prin UV-vis, 94,4% monomer prin SEC şi < 0,4% DGN549 neconjugat prin SEC/RP-UPLC în tandem. CL-SM a conjugatului deglicozilat nu este ilustrată.
Anticorpul chMAB-A a fost conjugat cu IGN137 (compusul D1) prin intermediul linker-ului sulfo-SPDB astfel cum s-a descris anterior în Brevetul SUA nr. 9,381,256. Conjugatul a fost purificat în acelaşi mod ca cel descris pentru hMAB-A(2I.2)-DGN549, cu excepţia faptului că conjugatul a fost purificat în 20 mM histidină, 50 mM clorură de sodiu, 8,5% sucroză, 0,01% Tween-20, 50 µM bisulfit de sodiu, pH 6,2. Conjugatul a avut o medie de 2,9 moli IGN137/mol anticorp prin UV-vis, 88,4% monomer prin SEC şi ≤0,4% IGN137 neconjugat prin SEC/RP-UPLC în tandem. CL-SM a conjugatului deglicozilat nu este ilustrată. Anticorpul chMAB-A a fost conjugat cu IGN23 (compusul D3) astfel cum s-a descris anterior în Brevetul SUA nr. 8,426,402. Conjugatul a fost purificat în acelaşi mod ca cel descris pentru hMAB-A(2I.2)-DGN549, cu excepţia faptului că conjugatul a fost purificat în 20 mM histidină, 50 mM clorură de sodiu, 8,5% sucroză, 0,01% Tween-20, 50 µM bisulfit de sodiu, pH 6,2 şi nu s-a efectuat dializă. Conjugatul a avut o medie de 3,2 moli IGN23/mol anticorp prin UV-vis, 97,9% monomer prin SEC şi 1,2% IGN23 neconjugat prin analiza HPLC în fază inversă. CL-SM a conjugatului deglicozilat nu este ilustrată. Anticorpul chMAB-A a fost conjugat cu DGN462 prin sulfo-SPDB astfel cum s-a descris anterior în Brevetul SUA nr. 8765740. Conjugatul a fost purificat în acelaşi mod ca cel descris pentru hMAB-A(2I.2)-DGN549, cu excepţia faptului că conjugatul a fost purificat în 20 mM histidină, 50 mM clorură de sodiu, 8,5% sucroză, 0,01% Tween-20, 50 µM bisulfit de sodiu, pH 6,2 şi nu s-a efectuat dializă. Conjugatul a avut o medie de 2,8 moli DGN462/mol anticorp prin UV-vis, 95,6% monomer prin SEC şi 0,5% DGN462 neconjugat prin analiză HPLC în fază inversă. CL-SM a conjugatului deglicozilat nu este ilustrată.
Exemplul 17.
Prepararea conjugaţilor DM legaţi la lizină ai anticorpilor anti-ADAM9
a. Prepararea hMAB-A(2I.2)-sSPDB-DM4
hMAB-A(2I.2) este un anticorp umanizat/optimizat cu o secvenţă de lanţ uşor a SEQ ID NO:68 şi o secvenţă de lanţ greu a SEQ ID NO:52.
Pentru a prepara conjugatul hMAB-A(2I.2)-sSPDB-DM4, s-au efectuat adaosuri de sulfo-SPDB (sSPDB) şi DM4 într-un mod treptat. Mai întâi, o soluţie care conţine anticorp hMAB-A(2I.2) tamponat la pH 8,1 cu 50 mM acid 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinpropansulfonic (EPPS), 50 mM clorură de sodiu a fost amestecată cu DMA şi 11,5 echivalenţi de sSPDB dintr-o soluţie de stoc de DMA astfel încât compoziţia finală de solvent să fie de 10% (v/v) DMA şi 90% (v/v) tampon apos. După ce prima etapă de reacţie s-a desfăşurat timp de 4 ore la 25 °C, 17,3 echivalenţi de DM4 dintr-o soluţie de stoc de DMA, DMA şi 500 mM EPPS/500 mM tampon de clorură de sodiu pH 8,1 s-au adăugat la amestecul de reacţie astfel încât compoziţia finală de solvent de 10% (v/v) DMA şi 90% (v/v) tampon apos să fie menţinută din prima etapă de reacţie. Cea de-a doua etapă de reacţie a fost lăsată să se desfăşoare peste noapte la 25°C. Conjugatul s-a purificat în 10 mM succinat, 250 mM glicină, 0.5% sucroză, 0.01% Tween-20, pH 5,5 pe coloane de desalinizare Sephadex G-25, s-a dializat faţă de acest tampon utilizând o membrană cu o limită de greutate moleculară de 10 kDa şi s-a filtrat printr-un filtru de seringă de 0,22 µm. Conjugatul a avut o medie de 3,5 moli DM4/mol anticorp prin UV-vis, 99,2% monomer prin SEC şi ≤ 1,7% DM4 neconjugat prin HPLC în mod mixt. CL-SM a conjugatului deglicozilat nu este ilustrată.
b. Prepararea hMAB-A(2C.2)-sSPDB-DM4
hMAB-A(2C.2) este un anticorp umanizat/optimizat cu o secvenţă de lanţ uşor a SEQ ID NO:68 şi o secvenţă de lanţ greu a SEQ ID NO:51.
Anticorpul hMAB-A(2C.2) a fost conjugat cu DM4 prin linkerul sSPDB utilizând acelaşi procedeu ca cel descris pentru hMAB-A(2I.2)-sSPDB-DM4. Conjugatul a fost purificat în acelaşi mod ca cel descris pentru hMAB-A(2I.2)-sSPDB-DM4. Conjugatul a avut o medie de 3,2 moli DM4/mol anticorp prin UV-vis, 98,9% monomer prin SEC şi 2,6% DM4 neconjugat prin HPLC în mod mixt. CL-SM a conjugatului deglicozilat nu este ilustrată.
c. Prepararea hMAB-A(2.2)-sSPDB-DM4
hMAB-A(2.2) este un anticorp umanizat cu o secvenţă de lanţ uşor a SEQ ID NO:68 şi o secvenţă de lanţ greu a SEQ ID NO:50.
Anticorpul hMAB-A(2.2) a fost conjugat cu DM4 prin linkerul sSPDB utilizând acelaşi procedeu ca cel descris pentru hMAB-A(2I.2)-sSPDB-DM4. Conjugatul s-a purificat în 10 mM succinat, 250 mM glicină, 0.5% sucroză, 0.01% Tween-20, pH 5,5 utilizând un sistem de cromatografie lichidă rapidă a proteinelor (FPLC) echipat cu coloane de desalinizare Sephadex G-25 Fine şi apoi s-a filtrat printr-un filtru de seringă de 0,22 µm Conjugatul a avut o medie de 3,2 moli DM4/mol anticorp prin UV-vis, 97,4% monomer prin SEC şi ≤ 1,1% DM4 neconjugat prin HPLC în mod mixt. CL-SM a conjugatului deglicozilat nu este ilustrată.
d. Prepararea chMAB-A-sSPDB-DM4 şi chMAB-A-SMCC-DM1
Anticorpul chMAB-A a fost conjugat cu DM4 prin linkerul sulfo-SPDB utilizând acelaşi procedeu ca cel descris pentru hMAB-A(2I.2)-sSPDB-DM4, cu excepţia faptului că 6,4 echivalenţi de sSPDB şi 9,6 echivalenţi de DM4 s-au utilizat în respectivele etape de reacţie. Conjugatul a fost purificat în acelaşi mod ca cel descris pentru hMAB-A(2I.2)-sSPDB-DM4, cu excepţia faptului că nu s-a efectuat dializă. Conjugatul a avut o medie de 3,4 moli DM4/mol anticorp prin UV-vis, 97,0% monomer prin SEC şi 4,7% DM4 neconjugat prin HPLC în mod mixt. CL-SM a conjugatului deglicozilat nu este ilustrată.
Anticorpul chMAB-A a fost conjugat cu DM1 prin linkerul SMCC utilizând procedee descrise anterior în Brevetul SUA nr. 8624003. Conjugatul a fost purificat în acelaşi mod ca cel descris pentru hMAB-A(2I.2)-sSPDB-DM4, cu excepţia faptului că nu s-a efectuat dializă. Conjugatul a avut o medie de 3,9 moli DM1/mol anticorp prin UV-vis, 99,7% monomer prin SEC şi 4,9% DM1 neconjugat prin HPLC în mod mixt. CL-SM a conjugatului deglicozilat nu este ilustrată.
Exemplul 18
Citotoxicitatea in vitro a conjugaţilor medicamentoşi cu anticorpi anti-ADAM9
Citotoxicitatea in vitro a diverşilor imunoconjugaţi de anticorpi anti-ADAM9 împotriva unui panou de linii celulare care exprimă ADAM9 a fost comparată cu conjugaţii IgG1 fără ţintire. Mai precis, de la 500 până la 2000 celule/godeu au fost placate în plăci cu 96 de godeuri cu 24 de ore înainte de tratament. Conjugaţii s-au diluat în mediul de cultură utilizând serii de diluţie de 3 ori şi s-au adăugat 100 µL per godeu. În fiecare placă de testare s-au inclus godeuri martor care conţin celule, dar care nu conţin conjugaţi, precum şi godeuri care conţin doar mediu. Analizele au fost efectuate în triplicat pentru fiecare punct de date. Plăcile s-au incubat la 37 °C într-un incubator umidificat 5% cu CO2 timp de 4 până la 5 zile. Apoi, s-a determinat numărul relativ de celule viabile din fiecare godeu utilizând kit-8 de contorizare celulară bazat pe WST-8 (Dojindo Molecular Technologies). S-a calculat fracţiunea aparent supravieţuitoare a celulelor din fiecare godeu mai întâi prin corectarea pentru absorbanţa medie a fundalului şi apoi prin împărţirea fiecărei valori la media valorilor din godeurile martor (celule netratate). Procentul de celule supravieţuitoare a fost reprezentat grafic în funcţie de concentraţia de conjugat şi EC50 a activităţii a fost calculată utilizând o analiză de regresie neliniară (GraphPad Prims 4.0).
Aceste rezultate arată faptul că imunoconjugaţii anti-ADAM9 pot distruge un panou larg de linii de celule tumorale pozitive la ADAM9 care includ linii de celule tumorale pulmonare, pancreatice, renale, de prostată şi de colon (a se vedea FIG. 9A-9H). În fiecare caz testat, se observă o fereastră de specificitate bună, ceea ce sugerează faptul că citotoxicitatea este rezultatul legării anticorpului specific anti-ADAM9 la celulele ţintă. În special, conjugaţii anti-ADAM9-DGN549 (hMAB-A(2.2)-DGN549 şi hMAB-A(2I.2)-S442C-DGN549) au fost extrem de puternici, cu valori ale IC50 cuprinse între 1 şi 115 pM şi au fost de ~3 ori mai active decât un conjugat IgG1 fără ţintire (a se vedea Tabelul 15).
Exemplul 19
Activitatea antitumorală a conjugaţilor medicamentoşi cu anticorpi anti-ADAM9 la şoareci SCID purtători de xenogrefe de adenocarcinom pulmonar uman cu celule non-mici Calu3
Activitatea antitumorală a diverselor doze de hMAB-A(2.2)-sSPDB-DM4 şi o doză unică de conjugaţi chMAB-A-DGN549 a fost evaluată la şoareci SCID femele purtătoare de celule Calu3, un model de xenogrefă subcutanată de adenocarcinom pulmonar uman.
Celulele Calu3 au fost recoltate pentru inoculare, cu o viabilitate de 99% determinată prin excluderea albastrului tripan. Şoarecilor le-au fost inoculate 5 x 106 celule Calu3 în 0,2 ml mediu liber 50% matrigel/50% ser prin injectare subcutanată în zona flancului posterior drept. Optzeci şi patru de şoareci SCID femele (în vârstă de 6 săptămâni) au fost achiziţionate de la Charles River Laboratories. La primire, animalele au fost observate timp de 9 zile înainte de începerea studiului. Animalele nu au prezentat semne de boală sau îmbolnăvire la sosire sau înainte de tratament.
Optzeci şi patru de şoareci au fost randomizaţi în 8 grupuri (8 şoareci per grup) în funcţie de volumul tumoral. Volumul tumoral a variat de la 74,09 până la 150,21 (106,41 ± 18,69, medie ± SD) mm3. Şoarecii au fost măsuraţi şi randomizaţi pe baza volumului tumoral în ziua 6 post implantare. Şoarecii au fost dozaţi în ziua 7 post implantare. Greutatea corporală a şoarecilor a variat de la 16,05 până la 21,72 (18,64 ± 1,03, medie ± SD) grame. Şoarecii din fiecare grup au fost identificaţi prin metoda pumnului. Administrarea agenţilor de testat şi a vehiculului s-a efectuat intravenos utilizând o seringă de 1,0 ml prevăzută cu un ac de 1⁄2 inch de calibrul 27. Grupurile au inclus: un grup martor dozat cu vehicul (PBS), chKTI-sSPDB-DM4 la 5 mg/kg, qdx1, hMAB-A(2,2)-sSPDB-DM4 la 1,25 mg/kg (în funcţie de anticorp), qdx1, hMAB-A(2,2)-sSPDB-DM4 la 2,5 mg/kg (în funcţie de anticorp), qdx1, hMAB-A(2,2)-sSPDB-DM4 la 5 mg/kg (în funcţie de anticorp), qdx1 şi chMAB-A-DGN549 la 10µg/kg (în funcţie de sarcină utilă; 0,6 mg/kg în funcţie de anticorp), qdx1. Dimensiunea tumorală a fost măsurată de două ori pe săptămână în trei dimensiuni utilizând un etrier. Volumul tumoral a fost exprimat în mm3 utilizând formula V = Lungime x Lăţime x Înălţime x 1⁄2. Un şoarece a fost considerat a avea o regresie parţială (PR) atunci când volumul tumoral a fost redus cu 50% sau mai mult, regresie tumorală completă (CR) atunci când nu a putut fi detectată nicio tumoare palpabilă, iar supravieţuitorii fără tumori (TFS) reprezintă mulţimea de şoareci fără tumori la finalul studiului. Volumul tumoral şi greutatea corporală au fost determinate cu software-ul StudyLog. Log10 distrugerea celulelor (LCK) a fost calculată cu formula LCK = (T - C) / Td x 3,32, unde (T - C) sau întârzierea creşterii tumorale (TGD), este timpul mediu (în zile) pentru ca tumorile grupului de tratament şi grupului martor să atingă o dimensiune predeterminată de 815 mm3 (supravieţuitorii fără tumori sunt excluşi) 1, Td este timpul de dublare a tumorii la şoareci (estimat din potrivirea curbei exponenţiale neliniare a mediei zilnice a creşterii tumorale martor) şi x este numărul de dublări celulare per log de creştere celulară. %T/C (inhibarea creşterii tumorale) este raportul dintre volumul tumoral (TV) mediu al grupului de tratament la un moment predeterminat (adică momentul în care TV mediu pentru tumorile martor atinge volumul tumoral maxim, adică TV@ ~1000mm3 sau atunci când tumorile au devenit necrotice, astfel că acesta este momentul în care toţi şoarecii din grupul martor au ieşit din studiu) şi TV mediu al martorilor la punctul final pentru martori. Greutatea corporală a tuturor şoarecilor a fost măsurată de două ori pe săptămână ca indice aproximativ al toxicităţii medicamentului. Greutăţile corporale (BW) ale şoarecilor au fost exprimate ca modificare procentuală a greutăţii corporale faţă de greutatea corporală anterioară tratamentului, după cum urmează: % modificare BW = [(BW post / BW pre) - 1] x 100, unde BW post reprezintă greutatea după tratament şi BW pre reprezintă greutatea corporală iniţială înainte de tratament. Pierderea procentuală în greutate corporală (BWL) a fost exprimată ca modificarea medie a greutăţii corporale după tratament. Animalele au fost sacrificate atunci când volumul tumoral a fost mai mare de 1000 mm3 sau necrozat, sau dacă greutatea corporală a scăzut cu 20% mai mult în orice moment al studiului. Rezultatele studiului sunt ilustrate în FIG. 10. Conjugatul hMAB-A(2.2)-sSPDB-DM4 a fost activ la toate dozele testate. Conjugatul hMAB-A(2.2)-sSPDB-DM4 a avut o valoare a inhibării creşterii tumorale (T/C) de 39%, o valoare T-C de 17 şi o valoare LCK de 0,5 la o doză de 1,25mg/kg (cu 3 regresii parţiale din 8 şoareci şi regresii complete); o valoare T/C de 25%, o valoare T-C de 22 şi o valoare LCK de 0,7 la 2,5mg/kg (cu 3 regresii parţiale din 8 şoareci şi fără regresii complete) şi o valoare T/C de 14%, o valoare T-C de 36 şi o valoare LCK de 1,1 la o doză de 5mg/kg (cu 4 regresii parţiale din 8 şoareci şi 1 regresie completă din 8 şoareci). chMAB-A-DGN549 a fost foarte activ la 10µg/kg (în funcţie de sarcina utilă; 0,6 mg/kg în funcţie de anticorp) cu 8 regresii complete din 8 şoareci. Nu s-a observat nicio pierdere semnificativă în greutate corporală nici cu hMAB-A(2.2)-sSPDB-DM4, nici cu chMAB-DGN549 sau cu conjugaţii chKTI-sSPDB-DM4 la dozele indicate şi, prin urmare, toţi cei trei conjugaţi au fost bine toleraţi la şoareci la dozele indicate în prezentul studiu. Rezultatele arată faptul că conjugatul hMAB-A(2.2)-sSPDB-DM4 este activ la doze diferite la acest model. Rezultatele arată, de asemenea, faptul că chMAB-A-DGN549 este puternic activ la 10 µg/kg (în funcţie de sarcina utilă; 0,6 mg/kg în funcţie de anticorp). Activitatea antitumorală a diverselor doze de hMAB-A(2I.2)-S442C-DGN549 ca doză unică iv a fost, de asemenea, evaluată la şoareci SCID femele purtătoare de xenogrefe tumorale Calu-3, un model NSCLC. La şase zile post inoculare, şoarecii au fost randomizaţi în 8 grupuri (n=8 per grup) în funcţie de volumul tumoral. Grupurile de tratament au inclus un grup martor dozat cu vehicul (PBS), conjugat hMAB-A(2I.2)-S442C-DGN549 dozat la 0,5 (în funcţie de sarcina utilă; 0,04 mg/kg în funcţie de anticorp), 1 (în funcţie de sarcina utilă; 0,08 mg/kg în funcţie de anticorp), 3 (în funcţie de sarcina utilă; 0,25 mg/kg în funcţie de anticorp) şi 10µg/kg (în funcţie de sarcina utilă; 0,8 mg/kg în funcţie de anticorp) ca o doză unică iv, precum şi martor fără ţintire al conjugatului huKTI-S442C-DGN549 dozat la 1 (în funcţie de sarcina utilă; 0,08 mg/kg în funcţie de anticorp), 3 (în funcţie de sarcina utilă; 0,25 mg/kg în funcţie de anticorp) şi 10µg/kg (în funcţie de sarcina utilă; 0,8 mg/kg în funcţie de anticorp) ca o doză unică iv. Volumele tumorale şi greutăţile corporale au fost măsurate astfel cum este descris anterior şi rezultatele sunt ilustrate în FIG. 11. Pe scurt, hMAB-A(2I.2)-S442C-DGN549 a fost puternic activ chiar şi la cea mai mică doză de 0,5µg/kg (în funcţie de sarcina utilă; 0,04 mg/kg în funcţie de anticorp) şi activitate puternică a fost observată la doze de 1 (în funcţie de sarcina utilă; 0,08 mg/kg în funcţie de anticorp), 3 (în funcţie de sarcina utilă; 0,25 mg/kg în funcţie de anticorp), 10µg/kg (în funcţie de sarcina utilă; 0,8 mg/kg în funcţie de anticorp). Martor fără ţintire, huKTI-S442C-DGN549 a fost inactiv la acest model la toate cele trei doze testate, adică 1 (în funcţie de sarcina utilă; 0,08 mg/kg în funcţie de anticorp), 3 (în funcţie de sarcina utilă; 0,25 mg/kg în funcţie de anticorp) şi 10ug/kg (în funcţie de sarcina utilă; 0,8 mg/kg în funcţie de anticorp). hMAB-A(2I.2)-S442C-DGN549 la 0,5µg/kg (în funcţie de sarcina utilă; 0,04 mg/kg în funcţie de anticorp) a avut o T/C din 7 %, cu 7/8 PR şi 0/8 CR la punctul final al studiului. hMAB-A(2I.2)-S442C-DGN549 la 1µg/kg (în funcţie de sarcina utilă; 0,08 mg/kg în funcţie de anticorp) a avut o T/C din 2 %, cu 8/8 PR şi 2/8 CR la punctul final al studiului. hMAB-A(2I.2)-S442C-DGN549 la 3µg/kg (în funcţie de sarcina utilă; 0,25 mg/kg în funcţie de anticorp) a avut o T/C de 0 %, cu 8/8 PR şi 8/8 CR la punctul final al studiului şi hMAB-A(2I.2)-S442C-DGN549 la 10µg/kg (în funcţie de sarcina utilă; 0,8 mg/kg în funcţie de anticorp) a avut o T/C de 0 %, cu 8/8 PR şi 8/8 CR la punctul final al studiului. Atât hMAB-A(2I.2)-S442C-DGN549 (la 0,5, 1, 3, 10µg/kg, în funcţie de sarcina utilă) cât şi huKTI-S442C-DGN549 (la 1, 3, 10µg/kg, în funcţie de sarcina utilă) au fost bine tolerate la şoareci la toate dozele indicate în prezentul studiu. Nu s-a observat nicio pierdere semnificativă în greutate corporală cu niciunul dintre cei doi conjugaţi la dozele indicate. Rezultatele prezentului studiu sugerează faptul că conjugatul hMAB-A(21.2)-S442C-DGN549 a demonstrat o activitate antitumorală convingătoare şi este foarte eficient la modelul de xenogrefă tumorală canceroasă pulmonară cu celule non-mici Calu-3.
Exemplul 20
Activitatea antitumorală a conjugaţilor medicamentoşi cu anticorpi anti-ADAM9 la şoareci SCID purtători de xenogrefe de carcinom pulmonar cu celule scuamoase cu celule non-mici H1703
Activitatea antitumorală a diverselor doze de conjugat hMAB-A(2.2)-sSPDB-DM4 a fost evaluată la şoareci SCID femele purtătoare de celule H1703, un model de xenogrefă de carcinom cu celule scuamoase NSCLC.
Celulele H1703 au fost recoltate pentru inoculare, cu o viabilitate de 100% determinată prin excluderea albastrului tripan. Şoarecilor le-au fost inoculate 5 x 106 celule H1703 în 0,2 ml mediu liber 50% matrigel/50% ser prin injectare subcutanată în zona flancului posterior drept. Şaptezeci şi doi de şoareci nuzi femele (în vârstă de 6 săptămâni) au fost achiziţionate de la Charles River Laboratories 3/24/16. La primire, animalele au fost observate timp de 8 zile înainte de începerea studiului. Animalele nu au prezentat semne de boală sau îmbolnăvire la sosire sau înainte de tratament. Optzeci şi patru de şoareci au fost randomizaţi în 8 grupuri (6 şoareci per grup) în funcţie de volumul tumoral. Volumul tumoral a variat de la 76,18 până la 159,00 (115,19 ± 22,08, medie ± SD) mm3. Şoarecii au fost măsuraţi şi randomizaţi pe baza volumului tumoral în ziua 19 post implantare. Şoarecii au fost dozaţi în ziua 20 post implantare (4/21/16). Greutatea corporală a şoarecilor a variat de la 20,20 până la 29,15 (23,88 ± 1,95, medie ± SD) grame. Şoarecii din fiecare grup au fost identificaţi prin metoda pumnului. Administrarea agenţilor de testat şi a vehiculului s-a efectuat intravenos utilizând o seringă de 1,0 ml prevăzută cu un ac de 1⁄2 inch de calibrul 27. Grupurile au inclus: un grup martor dozat cu vehicul (PBS) la 150µL/şoarece, qdx1, chKTI-sSPDB-DM4 la 5 mg/kg, qdx1, hMAB-A(2.2)-sSPDB-DM4 la 1,25 mg/kg, qdx1, hMAB-A(2.2)-sSPDB-DM4 la 2,5 mg/kg, qdx1 şi hMAB-A(2.2)-sSPDB-DM4 la 5 mg/kg, qdx1. Măsurătorile dimensiunii tumorale şi ale greutăţii corporale au fost determinate astfel cum este descris în Exemplul 19. Rezultatele studiului sunt ilustrate în FIG. 12. hMAB-A(2,2)-sSPDB-DM4 a fost puternic activ la o doză mică de 2,5 mg/kg cu T/C de 6%, T-C de 28 şi LCK de 1,4 (cu 3 regresii parţiale din 6 şoareci şi fără regresii complete) şi puternic activ la doze de 5mg/kg cu un T/C de 1%, T-C de 63 şi LCK de 3,2 (cu 6 regresii parţiale din 6 şoareci, 3 regresii complete din 6 şoareci şi 1 supravieţuitor fără tumoare). Conjugatul hMAB-A(2,2)-sSPDB-DM4 a fost inactiv la o doză de 1,25mg/kg şi a avut o inhibare a creşterii tumorale (T/C) de 79%, T-C de 4 şi LCK de 0,2 (cu 1 regresie parţială din 6 şoareci şi fără regresii complete). Nu s-a observat nicio pierdere semnificativă în greutate corporală nici cu hMAB-A(2.2)-sSPDB-DM4, nici cu conjugaţii chKTI-sSPDB-DM4 la dozele indicate şi, prin urmare, ambii conjugaţi au fost bine toleraţi la şoareci la dozele indicate în prezentul studiu. Rezultatele arată faptul că conjugatul hMAB-A(2.2)-sSPDB-DM4 este puternic activ la doze mici de 2,5 mg/kg la acest model.
Exemplul 21
Activitatea antitumorală a conjugaţilor medicamentoşi cu anticorpi anti-ADAM9 la şoarecii SCID purtători de carcinom cu celule scuamoase Detroit562 al xenogrefelor de cap şi gât
Activitatea antitumorală a diverselor doze de conjugaţi chMAB-A-sSPDB-DM4 a fost evaluată la şoareci femele cu imunodeficienţă CD-1 purtătoare de celule Detroit562, un model de xenogrefă de carcinom faringian.
Şoarecii (în vârstă de 6 săptămâni) au fost achiziţionaţi de la Charles River Laboratories 7/1/14. La primire, animalele au fost observate timp de 15 zile înainte de începerea studiului. Animalele nu au prezentat semne de boală sau îmbolnăvire la sosire sau înainte de începerea studiului. Celulele Detroit562 au fost recoltate pentru inoculare, cu o viabilitate mai mare de 90% determinată prin excluderea albastrului tripan. Şoarecilor le-au fost inoculate 5 x 106 celule Detroit562 în 0,2 ml mediu liber 50% matrigel/50% ser prin injectare subcutanată în zona flancului posterior drept. Patruzeci şi doi de şoareci au fost randomizaţi în 6 grupuri (7 şoareci per grup) în funcţie de volumul tumoral. Volumul tumoral a variat de la 95,76 până la 450,83 mm3. Şoarecii au fost măsuraţi şi randomizaţi pe baza volumului tumoral în ziua 26 post implantare. Administrarea agenţilor de testat şi a vehiculului s-a efectuat în ziua următoare randomizării (Zi de studiu 0) prin injecţie intraperitoneală utilizând o seringă de 1,0 ml prevăzută cu un ac de 1⁄2 inch de calibrul 27. Grupurile au inclus: un grup martor dozat cu vehicul (PBS), chKTI-sSPDB-DM4 la 5 mg/kg, qdx1, chKTI-sSPDB-DM4 la 2,5 mg/kg, qdx1, chMAB-A-sSPDB-DM4 la 5 mg/kg, qdx1, chMAB-A-sSPDB-DM4 la 2,5 mg/kg, qdx1, chMAB-A-sSPDB-DM4 la 1,25 mg/kg, qdx1. Măsurătorile dimensiunii tumorale şi ale greutăţii corporale au fost determinate astfel cum este descris în Exemplul 19. Rezultatele studiului sunt ilustrate în FIG. 13. Pe scurt, chMAB-A-sSPDB-DM4 a fost activ la toate cele 3 niveluri de doză testate (5, 2,5 şi 1,25 mg/kg) pe parcursul studiului. chMAB-A-sSPDB-DM4 la 5 mg/kg a avut o T/C de 32%, şi 6/7 PR şi 1/7 CR la punctul final al studiului. chMAB-A-sSPDB-DM4 la 2,5 mg/kg a avut o T/C de 27%, şi 6/7 PR şi 2/7 CR la punctul final al studiului. chMAB-A-sSPDB-DM4 la 1,25 mg/kg a avut o T/C de 37% şi 5/7 PR şi 0/7 CR la punctul final al studiului. chKTI-sSPDB-DM4 la 5 mg/kg a avut o T/C de 89% şi 3/7 PR şi 0/7 CR la punctul final al studiului. chKTI-sSPDB-DM4 la 5 mg/kg a avut o T/C de 80% şi 3/7 PR şi 1/7 CR la punctul final al studiului. chMAB-A-sSPDB-DM4 a fost bine tolerat la şoareci la toate dozele examinate în prezentul studiu. Nu s-a observat o pierdere semnificativă în greutate corporală la dozele indicate. Rezultatele prezentului studiu sugerează faptul că conjugatul chMAB-A-sSPDB-DM4 demonstrează activitate antitumorală şi este eficient la modelul de xenogrefă tumorală de carcinom faringian Detroit562. Într-un al doilea studiu, activitatea antitumorală a diverselor doze de conjugaţi
chMAB-A-sSPDB-DM4 a fost evaluată la şoareci femele cu imunodeficienţă CD-1 purtătoare de xenogrefe tumorale Detroit562 de volum mai mare.
Şoarecii (în vârstă de 5 săptămâni) au fost achiziţionaţi de la Charles River Laboratories 9/17/14. La primire, animalele au fost observate timp de 7 zile înainte de începerea studiului. Animalele nu au prezentat semne de boală sau îmbolnăvire la sosire sau înainte de începerea studiului. Celulele Detroit562 au fost recoltate pentru inoculare, cu o viabilitate mai mare de 90% determinată prin excluderea albastrului tripan. Şoarecilor le-au fost inoculate 5 x 106 celule Detroit562 în 0,2 ml mediu liber 50% matrigel/50% ser prin injectare subcutanată în zona flancului posterior drept.
Optsprezece şoareci au fost randomizaţi în 3 grupuri (6 şoareci per grup) în funcţie de volumul tumoral. Volumul tumoral a fost cuprins între 277,51 şi 503,49 mm3. Şoarecii au fost măsuraţi şi randomizaţi pe baza volumului tumoral în ziua 35 post implantare. Administrarea agenţilor de testat şi a vehiculului s-a efectuat în ziua următoare randomizării (Zi de studiu 1) prin injecţie intraperitoneală utilizând o seringă de 1,0 ml prevăzută cu un ac de 1⁄2 inch de calibrul 27. Grupurile au inclus: un grup martor dozat cu vehicul (PBS), chMAB-A-sSPDB-DM4 la 5 mg/kg, qdx1 şi chMAB-A-sSPDB-DM4 la 1,25 mg/kg, qdx1. Măsurătorile dimensiunii tumorale şi ale greutăţii corporale au fost determinate astfel cum este descris în Exemplul 19. Rezultatele studiului sunt ilustrate în FIG. 14. Pe scurt, chMAB-A-sSPDB-DM4 a fost activ la cele 2 niveluri de doză testate (5 şi 1,25 mg/kg) pe parcursul studiului. chMAB-A-sSPDB-DM4 la 5 mg/kg a avut o T/C de 3%, şi 6/6 PR şi 1/7 CR la punctul final al studiului. chMAB-A-sSPDB-DM4 la 1,25 mg/kg a avut o T/C de 14%, şi 6/6 PR şi 0/7 CR la punctul final al studiului. chMAB-A-sSPDB-DM4 a fost bine tolerat de şoareci la ambele doze examinate în prezentul studiu. Nu s-a observat o pierdere semnificativă în greutate corporală la dozele indicate. Rezultatele prezentului studiu sugerează faptul că conjugatul chMAB-A-sSPDB-DM4 demonstrează activitate antitumorală şi este eficient la modelul de xenogrefă tumorală de carcinom faringian Detroit562 cu volum mai mare.
Exemplul 22
Activitatea antitumorală a conjugaţilor medicamentoşi cu anticorpi anti-ADAM9 la şoareci nuzi purtători de xenogrefe de carcinom gastric SNU-5
Activitatea antitumorală a diverselor doze de huMAB-A(2.2)-sSPDB-DM4 şi o doză unică de conjugaţi huMAB-A(2I.2)-S442C-DGN549 a fost evaluată la şoareci femele nude purtătoare de celule Snu-5, un model de xenogrefă de carcinom gastric uman.
Celulele Snu-5 au fost recoltate pentru inoculare, cu o viabilitate de 100% determinată prin excluderea albastrului tripan. Şoarecilor le-au fost inoculate 5 x 106 celule Snu-5 în 0,1 ml mediu liber 50% matrigel/50% ser prin injectare subcutanată în zona flancului posterior drept. Cincizeci şi şase de şoareci nude femele (în vârstă de 6 săptămâni) au fost achiziţionate de la Charles River Laboratories 1/25/17. La primire, animalele au fost observate timp de 8 zile înainte de începerea studiului. Animalele nu au prezentat semne de boală sau îmbolnăvire la sosire sau înainte de tratament. Cincizeci şi şase de şoareci au fost randomizaţi în 7 grupuri (8 şoareci per grup) în funcţie de volumul tumoral. Volumul tumoral a variat de la 76,29 până la 129,12 (130,58 ± 13,28, medie ± SD) mm3. Şoarecii au fost măsuraţi şi randomizaţi pe baza volumului tumoral în ziua 13 post implantare. Şoarecii au fost dozaţi în ziua 14 post implantare (2/17/17). Greutatea corporală a şoarecilor a variat de la 19,50 până la 26,35 (22,69 ± 1,40, medie ± SD) grame. Şoarecii din fiecare grup au fost identificaţi prin metoda pumnului. Administrarea agenţilor de testat şi a vehiculului s-a efectuat intravenos utilizând o seringă de 1,0 ml prevăzută cu un ac de 1⁄2 inch de calibrul 27. Grupurile au inclus: un grup martor dozat cu vehicul (PBS), chKTI-sSPDB-DM4 la 5 mg/kg, huMAB-A(2.2)-sSPDB-DM4 la 2,5 mg/kg, huMAB-A(2.2)-sSPDB-DM4 la 5 mg/kg, huKTI-S442C-DGN549 la 10µg/kg, huMAB-A(2I.2)-S442C-DGN549 la 3µg/kg şi huMAB-A(2I.2)-S442C-DGN549 la 10µg/kg. Dimensiunea tumorală a fost măsurată de două ori pe săptămână în trei dimensiuni utilizând un etrier. Volumul tumoral a fost exprimat în mm3 utilizând formula V = Lungime x Lăţime x Înălţime x 1⁄2. Un şoarece a fost considerat a avea o regresie parţială (PR) atunci când volumul tumoral a fost redus cu 50% sau mai mult, regresie tumorală completă (CR) atunci când nu a putut fi detectată nicio tumoare palpabilă, iar supravieţuitorii fără tumori (TFS) reprezintă mulţimea de şoareci fără tumori la finalul studiului. Volumul tumoral şi greutatea corporală au fost determinate cu software-ul StudyLog. Log10 distrugerea celulelor (LCK) a fost calculată cu formula LCK = (T - C) / Td x 3,32, unde (T - C) sau întârzierea creşterii tumorale (TGD), este timpul mediu (în zile) pentru ca tumorile grupului de tratament şi grupului martor să atingă o dimensiune predeterminată de 798 mm3 (supravieţuitorii fără tumori sunt excluşi) 1, Td este timpul de dublare a tumorii la şoareci (estimat din potrivirea curbei exponenţiale neliniare a mediei zilnice a creşterii tumorale martor) şi x este numărul de dublări celulare per log de creştere celulară. %T/C (inhibarea creşterii tumorale) este raportul dintre volumul tumoral (TV) mediu al grupului de tratament la un moment predeterminat (adică momentul în care TV mediu pentru tumorile martor atinge volumul tumoral maxim, adică TV@ ~1000mm3 sau atunci când tumorile au devenit necrotice, astfel că acesta este momentul în care toţi şoarecii din grupul martor au ieşit din studiu) şi TV mediu al martorilor la punctul final pentru martori. Greutatea corporală a tuturor şoarecilor a fost măsurată de două ori pe săptămână ca indice aproximativ al toxicităţii medicamentului. Greutăţile corporale (BW) ale şoarecilor au fost exprimate ca modificare procentuală a greutăţii corporale faţă de greutatea corporală anterioară tratamentului, după cum urmează: % modificare BW = [(BW post / BW pre) - 1] x 100, unde BW post reprezintă greutatea după tratament şi BW pre reprezintă greutatea corporală iniţială înainte de tratament. Pierderea procentuală în greutate corporală (BWL) a fost exprimată ca modificarea medie a greutăţii corporale după tratament. Animalele au fost sacrificate atunci când volumul tumoral a fost mai mare de 1000 mm3 sau necrozat, sau dacă greutatea corporală a scăzut cu 20% mai mult în orice moment al studiului. Rezultatele studiului sunt ilustrate în FIG. 15 şi FIG. 16. Conjugatul huMAB-A(2.2)-sSPDB-DM4 a fost puternic activ la ambele doze testate. Conjugatul huMAB-A(2.2)-sSPDB-DM4 a avut o valoare a inhibării creşterii tumorale (T/C) de 5%, la doza de 2,5 mg/kg (cu 8 regresii parţiale din 8 şoareci şi 2 regresii complete); o valoare T/C de 1%, 5 mg/kg (cu 8 regresii parţiale din 8 şoareci şi 6 regresii complete). huMAB-A(2I.2)-S442C-DGN549 a fost puternic activ la ambele doze testate. Conjugatul huMAB-A(2I.2)-S442C-DGN549 a avut o valoare (T/C) de 7%, la o doză de 3 μg/kg (cu 8 regresii parţiale din 8 şoareci şi 4 regresii complete); o valoare T/C de 4%, 5 mg/kg (cu 8 regresii parţiale din 8 şoareci şi 5 regresii complete). Nu s-a observat nicio pierdere semnificativă în greutate corporală nici cu huMAB-A(2.2)-sSPDB-DM4, nici cu huMAB-A(2I.2)-S442C-DGN549 sau cu conjugaţii chKTI-sSPDB-DM4 sau huKTI-S442C-DGN549 la dozele indicate şi, prin urmare, toţi conjugaţii au fost bine toleraţi la şoareci la dozele indicate în prezentul studiu.
Exemplul 23
Activitatea antitumorală a conjugaţilor medicamentoşi cu anticorpi anti-ADAM9 la şoareci purtători de xenogrefe de linie celulară de cancer colorectal SW48
Activitatea antitumorală a diverselor doze de conjugaţi hMAB-A(2.2)-sSPDB-DM4 şi huMAB-A(2I.2)-S442C-DGN649 a fost evaluată la şoareci femele nude purtătoare de celule SW48, un model de xenogrefă de linie celulară de cancer colorectal.
Celulele SW48 au fost recoltate pentru inoculare. Şoarecii au fost inoculaţi cu celule SW48 prin injectare subcutanată în zona flancului posterior drept. Animalele nu au prezentat semne de boală sau îmbolnăvire la sosire din laboratoare sau înainte de tratament. Patruzeci şi doi de şoareci au fost randomizaţi în 7 grupuri (6 şoareci per grup) în funcţie de volumul tumoral. Volumul tumoral a variat de la 89 până la 169 mm3. Şoarecii au fost măsuraţi, randomizaţi şi dozaţi pe baza volumului tumoral în ziua 17 post implantare. Şoarecii din fiecare grup au fost identificaţi prin crotalii. Administrarea agenţilor de testat şi a vehiculului a fost efectuată intravenos. Grupurile au inclus: un grup martor dozat cu vehicul (PBS), chKTI-sSPDB-DM4 la 10 mg/kg, huMAB-A(2.2)-sSPDB-DM4 la 5 mg/kg, huMAB-A(2.2)-sSPDB- DM4 la 10 mg/kg, huKTI-S442C-DGN549 la 5µg/kg, huMAB-A(2I.2)-S442C-DGN549 la 2,5 µg/kg şi huMAB-A(2I.2)-S442C-DGN549 la 5µg/kg. Măsurătorile dimensiunii tumorale şi ale greutăţii corporale au fost determinate astfel cum este descris în Exemplul 22. Rezultatele studiului sunt ilustrate în FIG. 17 şi FIG. 18. Conjugatul huMAB-A(2.2)-sSPDB-DM4 a fost activ la ambele doze testate. Conjugatul huMAB-A(2.2)-sSPDB-DM4 a avut o valoare a inhibării creşterii tumorale (T/C) de 13%, la o doză de 5mg/kg (fără regresii parţiale sau complete); o valoare a T/C de 5%, 10mg/kg (cu 6 regresii parţiale din 6 şoareci). huMAB-A(2I.2)-S442C-DGN549 a fost activ la o doză de 5µg/kg şi inactiv la o doză de 2,5µg/kg testată. Conjugatul huMAB-A(2I.2)-S442C-DGN549 a avut o valoare a (T/C) de 92%, la o doză de 2,5µg/kg; o valoare a T/C de 41%, 5µg/kg (cu 2 regresii parţiale din 6 şoareci). Nu s-a observat nicio pierdere semnificativă în greutate corporală nici cu huMAB-A(2.2)-sSPDB-DM4, nici cu huMAB-A(2I.2)-S442C-DGN549 sau cu conjugaţii chKTI-sSPDB-DM4 sau huKTI-S442C-DGN549 la dozele indicate şi, prin urmare, toţi conjugaţii au fost bine toleraţi la şoareci la dozele indicate în prezentul studiu (necesită confirmare cu MGNX).
Exemplul 24
Extinderea expunerii conjugaţilor maitansinoizi cu anticorpi anti-ADAM9 prin îmbunătăţirea legării FcRn
Pentru a maximiza potenţialul conjugaţilor maitansinoizi cu anticorpi anti-ADAM9 de a determina eficacitatea, au fost introduse substituţii M252Y, S254T şi T256E ("mutaţia YTE") în regiunea Fc a anticorpilor anti-ADAM9, hMAB-A(2I.2) şi hMAB-A(2I.2)-S442C, pentru a extinde expunerea conjugaţilor medicamentoşi cu anticorpi prin îmbunătăţirea legării FcRn. FcRn joacă un rol major în menţinerea nivelurilor serice de IgG. IgG care sunt endocitate nespecific se leagă la FcRn în endozom datorită unei interacţiuni dependente de pH. IgG legată la FcRn este apoi sortată în endozomi de reciclare şi transportată înapoi la suprafaţa celulară unde IgG este eliberată datorită pH-ului neutru. Îmbunătăţirea legării FcRn poate îmbunătăţi sortarea şi farmacocinetica.
Conjugatul hMAB-A(2I.2)-YTE-sSPDB-DM4 a fost preparat astfel cum este detaliat în Exemplul 17a. Conjugatul hMAB-A(2I.2)-S442C-YTE-sSPDB-DM4 a fost preparat astfel cum s-a descris anterior în Publicaţia PCT nr. WO2017/004025. Astfel cum se observă în Figurile 19A şi 19B, mutaţia YTE a crescut afinitatea de legare şi aviditatea anticorpului hMAB-A(2I.2) la FcRn uman şi de cyno. În plus, conjugatul hMAB-A(2I.2)-YTE-sSPDB-DM4 a prezentat activitate similară in vitro şi in vivo în NCI-H1703, SNU5 şi Calu3 ca şi în conjugatul parental hMAB-A(2I.2)-sSPDB-DM4. PK de cynomolgus şi studii de tolerabilitate au fost efectuate pentru a caracteriza tolerabilitatea şi profilul farmacocinetic al conjugatului hMAB-A(2I.2)-YTE-sSPDB-DM4 în comparaţie cu conjugatul parental hMAB-A(2I.2)-sSPDB-DM4. Ambii conjugaţi au fost administraţi sub formă de perfuzii IV de 10 minute la masculi de maimuţă cynomolgus în doze de 4 şi 12 mg/kg (doză de anticorpi) pentru a evalua atât profilul PK, cât şi tolerabilitatea acută. În plus, anticorpii nuzi, hMAB-A(2I.2) şi hMAB-A(2I.2)-YTE, au fost administraţi masculilor de maimuţe cynomolgus în doză de 4 mg/kg pentru a aborda efectele potenţiale ale conjugării asupra parametrilor PK. Sângele a fost recoltat pe parcursul a 28 de zile pentru a permite măsurarea concentraţiilor ADC, a anticorpilor totali şi a încărcăturii libere. Tolerabilitatea a fost determinată pe baza supravieţuirii, observaţiilor clinice, greutăţii corporale şi patologiei clinice. Astfel cum se observă în Figurile 20, datele PK de cynomolgus ale conjugatului hMAB-A(2I.2)-YTE-sSPDB-DM4 în comparaţie cu conjugatul parental au arătat faptul că mutaţia YTE a crescut expunerea în comparaţie cu conjugatul parental. În plus, datele PK de cynomolgus ale anticorpului nud hMAB-A(2I.2) şi anticorpului hMAB-A(2I.2)-YTE au arătat faptul că conjugarea are un efect minim asupra parametrilor PK şi că mutaţia YTE îmbunătăţeşte atât anticorpul nud, cât şi parametrii PK ai conjugatului. În plus, conjugaţii hMAB-A(2I.2)-sSPDB-DM4 şi hMAB-A(2I.2)-YTE-sSPDB-DM4 au fost bine toleraţi până la o doză de 12 mg/kg cu observaţii clinice cutanate minime şi efecte dependente de doză asupra parametrilor hematologici. Deşi invenţia a fost descrisă în legătură cu variante specifice de realizare a acesteia, se va înţelege faptul că aceasta poate suporta modificări suplimentare care se încadrează în domeniul de aplicare al revendicărilor anexate.
LISTĂ DE SECVENŢE
<110> IMMUNOGEN, INC. MACROGENICS, INC.
<120> IMUNOCONJUGAŢI CARE ŢINTESC ADAM9 ŞI PROCEDEE DE UTILIZARE A ACESTORA
<130> 121162-03920
<140> <141>
<150> 62/480.201 <151> 2017-03-31
<150> 62/438.488 <151> 2016-12-23
<160> 154
<170> PatentIn versiune 3.5
<210> 1 <211> 217 <212> PRT <213> Homo sapiens
<220> <221> VARIANTĂĂ <222> (217)..(217) <223> /înlocuire=" "
<220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(217) <223> /notă="Variantele de resturi din secvenţă nu au preferinţă în raport cu cele din adnotările pentru variantele de poziţii"
<400> 1
<210> 2 <211> 216 <212> PRT <213> Homo sapiens
<220> <221> VARIANTĂĂ <222> (216)..(216) <223> /înlocuire=" "
<220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(216) <223> /notă="Variantele de resturi din secvenţă nu au preferinţă în raport cu cele din adnotările pentru variantele de poziţii"
<400> 2
<210> 3 <211> 217 <212> PRT <213> Homo sapiens
<220> <221> VARIANTĂĂ <222> (217)..(217) <223> /înlocuire=" "
<220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(217) <223> /notă="Variantele de resturi din secvenţă nu au preferinţă în raport cu cele din adnotările pentru variantele de poziţii"
<400> 3
<210> 4 <211> 217 <212> PRT <213> Homo sapiens
<220> <221> VARIANTĂĂ <222> (217)..(217) <223> /înlocuire=" "
<220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(217) <223> /notă="Variantele de resturi din secvenţă nu au preferinţă în raport cu cele din adnotările pentru variantele de poziţii"
<400> 4
<210> 5 <211> 819 <212> PRT <213> Homo sapiens
<400> 5
<210> 6 <211> 819 <212> PRT <213> Macaca fascicularis
<400> 6
<210> 7 <211> 123 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <221> sursă <223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Polipeptidă sintetică"
<400> 7
<210> 8 <211> 5 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <221> sursă <223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 8 Ser Tyr Trp Met His 1 5
<210> 9 <211> 17 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <221> sursă <223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 9
<210> 10 <211> 14 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <221> sursă <223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 10 Gly Gly Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Ser Arg Asp Tyr Phe Asp Tyr 1 5 10
<210> 11 <211> 111 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <221> sursă <223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Polipeptidă sintetică"
<400> 11
<210> 12 <211> 15 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <221> sursă <223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 12 Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp Gly Asp Ser Tyr Met Asn 1 5 10 15
<210> 13 <211> 7 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <221> sursă <223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 13 Ala Ala Ser Asp Leu Glu Ser 1 5
<210> 14 <211> 9 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <221> sursă <223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 14 Gln Gln Ser His Glu Asp Pro Phe Thr 1 5
<210> 15 <211> 123 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <221> sursă <223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Polipeptidă sintetică"
<220> <221> VARIANTĂ <222> (34)..(34) <223> /înlocuire="Ile"
<220> <221> VARIANTĂ <222> (55)..(55) <223> /înlocuire="Phe"
<220> <221> VARIANTĂ <222> (63)..(63) <223> /înlocuire="Arg"
<220> <221> VARIANTĂ <222> (65)..(65) <223> /înlocuire="Gln"
<220> <221> VARIANTĂ <222> (66)..(66) <223> /înlocuire="Gly"
<220> <221> VARIANTĂ <222> (105)..(105) <223> /înlocuire="Phe" sau "Tyr" sau "Trp" sau "Ile" sau "Leu" "Val" sau "Thr" sau "Gly" sau "Asp"
<220> <221> VARIANTĂ <222> (106)..(106) <223> /înlocuire="Arg" sau "Asn" sau "His" sau "Gly" sau "Ser"
<220> <221> VARIANTĂ <222> (107)..(107) <223> /înlocuire="Met" sau "Ser" sau "Lys" sau "Asn"
<220> <221> VARIANTĂ <222> (108)..(108) <223> /înlocuire="Ala"
<220> <221> VARIANTĂ <222> (109)..(109) <223> /înlocuire="Phe" sau "Thr" sau "Val"
<220> <221> VARIANTĂ <222> (110)..(110) <223> /înlocuire="Leu" sau "Lys"
<220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(123) <223> /notă="Variantele de resturi din secvenţă nu au preferinţă în raport cu cele din adnotările pentru variantele de poziţii"
<220> <221> sursă <223> /notă="A se vedea specificaţia astfel cum este depusă pentru descrierea detaliată a substituţiilor şi a variantelor de realizare preferate"
<400> 15
<210> 16 <211> 123 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <221> sursă <223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Polipeptidă sintetică"
<400> 16
<210> 17 <211> 123 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <221> sursă <223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Polipeptidă sintetică"
<400> 17
<210> 18 <211> 123 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <221> sursă <223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Polipeptidă sintetică"
<400> 18
<210> 19 <211> 123 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <221> sursă <223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Polipeptidă sintetică"
<400> 19
<210> 20 <211> 123 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <221> sursă <223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Polipeptidă sintetică"
<400> 20
<210> 21 <211> 123 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <221> sursă <223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Polipeptidă sintetică"
<400> 21
<210> 22 <211> 123 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <221> sursă <223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Polipeptidă sintetică"
<400> 22
<210> 23 <211> 123 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <221> sursă <223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Polipeptidă sintetică"
<400> 23
<210> 24 <211> 123 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <221> sursă <223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Polipeptidă sintetică"
<400> 24
<210> 25 <211> 123 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <221> sursă <223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Polipeptidă sintetică"
<400> 25
<210> 26 <211> 123 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <221> sursă <223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Polipeptidă sintetică"
<400> 26
<210> 27 <211> 123 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <221> sursă <223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Polipeptidă sintetică"
<400> 27
<210> 28 <211> 123 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <221> sursă <223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Polipeptidă sintetică"
<400> 28
<210> 29 <211> 123 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <221> sursă <223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Polipeptidă sintetică"
<400> 29
<210> 30 <211> 30 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <221> sursă <223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Polipeptidă sintetică"
<400> 30
<210> 31 <211> 14 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <221> sursă <223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 31
<210> 32 <211> 32 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <221> sursă <223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Polipeptidă sintetică"
<400> 32
<210> 33 <211> 11 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <221> sursă <223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 33
<210> 34 <211> 5 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <221> sursă <223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 34 Ser Tyr Trp Ile His 1 5
<210> 35 <211> 17 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <221> sursă <223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 35
<210> 36 <211> 17 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <221> sursă <223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 36
<210> 37 <211> 14 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <221> sursă <223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 37
<210> 38 <211> 14 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <221> sursă <223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 38
<210> 39 <211> 14 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <221> sursă <223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 39
<210> 40 <211> 14 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <221> sursă <223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 40
<210> 41 <211> 14 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <221> sursă <223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 41
<210> 42 <211> 14 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <221> sursă <223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 42
<210> 43 <211> 14 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <221> sursă <223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 43
<210> 44 <211> 14 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <221> sursă <223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 44
<210> 45 <211> 14 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <221> sursă <223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 45
<210> 46 <211> 14 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <221> sursă <223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 46
<210> 47 <211> 5 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <221> sursă <223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<220> <221> VARIANTĂ <222> (4)..(4) <223> /înlocuire="Ile"
<220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(5) <223> /notă="Variantele de resturi din secvenţă nu au preferinţă în raport cu cele din adnotările pentru variantele de poziţii"
<400> 47 Ser Tyr Trp Met His 1 5
<210> 48 <211> 17 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <221> sursă <223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<220> <221> VARIANTĂ <222> (6)..(6) <223> /înlocuire="Phe"
<220> <221> VARIANTĂ <222> (14)..(14) <223> /înlocuire="Arg"
<220> <221> VARIANTĂ <222> (16)..(16) <223> /înlocuire="Gln"
<220> <221> VARIANTĂ <222> (17)..(17) <223> /înlocuire="Gly"
<220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(17) <223> /notă="Variantele de resturi din secvenţă nu au preferinţă în raport cu cele din adnotările pentru variantele de poziţii"
<400> 48
Ser
<210> 49 <211> 14 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <221> sursă <223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<220> <221> VARIANTĂ <222> (7)..(7) <223> /înlocuire="Phe" sau "Tyr" sau "Trp" sau "Ile" sau "Leu" "Val" sau "Thr" sau "Gly" sau "Asp"
<220> <221> VARIANTĂ <222> (8)..(8) <223> /înlocuire="Arg" sau "Asn" sau "His" sau "Gly" sau "Ser"
<220> <221> VARIANTĂ <222> (9)..(9) <223> /înlocuire="Met" sau "Ser" sau "Lys" sau Asn"
<220> <221> VARIANTĂ <222> (10)..(10) <223> /înlocuire="Ala"
<220> <221> VARIANTĂ <222> (11)..(11) <223> /înlocuire="Phe" sau "Thr" sau "Val"
<220> <221> VARIANTĂ <222> (12)..(12) <223> /înlocuire="Leu" sau "Lys"
<220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(14) <223> /notă="Variantele de resturi din secvenţă nu au preferinţă în raport cu cele din adnotările pentru variantele de poziţii"
<220> <221> sursă <223> /notă="A se vedea specificaţia astfel cum este depusă pentru descrierea detaliată a substituţiilor şi a variantelor de realizare preferate"
<400> 49
<210> 50 <211> 453 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <221> sursă <223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Polipeptidă sintetică"
<220> <221> VARIANTĂ <222> (453)..(453) <223> /înlocuire=" "
<220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(453) <223> /notă="Variantele de resturi din secvenţă nu au preferinţă în raport cu cele din adnotările pentru variantele de poziţii"
<400> 50
<210> 51 <211> 453 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <221> sursă <223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Polipeptidă sintetică"
<220> <221> VARIANTĂ <222> (453)..(453) <223> /înlocuire=" "
<220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(453) <223> /notă="Variantele de resturi din secvenţă nu au preferinţă în raport cu cele din adnotările pentru variantele de poziţii"
<400> 51
<210> 52 <211> 453 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <221> sursă <223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Polipeptidă sintetică"
<220> <221> VARIANTĂ <222> (453)..(453) <223> /înlocuire="
<220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(453) <223> /notă="Variantele de resturi din secvenţă nu au preferinţă în raport cu cele din adnotările pentru variantele de poziţii"
<400> 52
<210> 53 <211> 111 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <221> sursă <223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Polipeptidă sintetică"
<220> <221> VARIANTĂ <222> (24)..(24) <223> /înlocuire="Arg"
<220> <221> VARIANTĂ <222> (32)..(32) <223> /înlocuire="Ser"
<220> <221> VARIANTĂ <222> (37)..(37) <223> /înlocuire="Leu"
<220> <221> VARIANTĂ <222> (96)..(96) <223> /înlocuire="Tyr"
<220> <221> VARIANTĂ <222> (97)..(97) <223> /înlocuire="Ser"
<220> <221> VARIANTĂ <222> (98)..(98) <223> /înlocuire="Thr"
<220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(111) <223> /notă="Variantele de resturi din secvenţă nu au preferinţă în raport cu cele din adnotările pentru variantele de poziţii"
<400> 53
<210> 54 <211> 111 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <221> sursă <223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Polipeptidă sintetică"
<400> 54
<210> 55 <211> 111 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <221> sursă <223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Polipeptidă sintetică"
<400> 55
<210> 56 <211> 111 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <221> sursă <223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Polipeptidă sintetică"
<400> 56
<210> 57 <211> 111 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <221> sursă <223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Polipeptidă sintetică"
<400> 57
<210> 58 <211> 23 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <221> sursă <223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 58
<210> 59 <211> 15 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <221> sursă <223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 59
<210> 60 <211> 32 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <221> sursă <223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Polipeptidă sintetică"
<400> 60
<210> 61 <211> 10 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <221> sursă <223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 61
<210> 62 <211> 15 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <221> sursă <223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 62
<210> 63 <211> 15 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <221> sursă <223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 63
<210> 64 <211> 15 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <221> sursă <223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 64
<210> 65 <211> 9 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <221> sursă <223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 65 Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Phe Thr 1 5
<210> 66 <211> 15 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <221> sursă <223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<220> <221> VARIANTĂ <222> (1)..(1) <223> /înlocuire="Arg"
<220> <221> VARIANTĂ <222> (9)..(9) <223> /înlocuire="Ser"
<220> <221> VARIANTĂ <222> (14)..(14) <223> /înlocuire="Leu"
<220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(15) <223> /notă="Variantele de resturi din secvenţă nu au preferinţă în raport cu cele din adnotările pentru variantele de poziţii"
<400> 66
<210> 67 <211> 9 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <221> sursă <223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<220> <221> VARIANTĂ <222> (4)..(4) <223> /înlocuire="Tyr"
<220> <221> VARIANTĂ <222> (5)..(5) <223> /înlocuire="Ser"
<220> <221> VARIANTĂ <222> (6)..(6) <223> /înlocuire="Thr"
<220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(9) <223> /notă="Variantele de resturi din secvenţă nu au preferinţă în raport cu cele din adnotările pentru variantele de poziţii"
<400> 67
<210> 68 <211> 218 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <221> sursă <223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Polipeptidă sintetică"
<400> 68
<210> 69 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens
<400> 69
<210> 70 <211> 104 <212> PRT <213> Homo sapiens
<400> 70
<210> 71 <211> 98 <212> PRT <213> Homo sapiens
<400> 71
<210> 72 <211> 98 <212> PRT <213> Homo sapiens
<400> 72
<210> 73 <211> 98 <212> PRT <213> Homo sapiens
<400> 73
<210> 74 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens
<400> 74
<210> 75 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens
<400> 75
<210> 76 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens
<400> 76
<210> 77 <211> 12 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <221> sursă <223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 77
<210> 78 <211> 217 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <221> sursă <223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Polipeptidă sintetică"
<220> <221> VARIANTĂ <222> (217)..(217) <223> /înlocuire=" "
<220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(217) <223> /notă="Variantele de resturi din secvenţă nu au preferinţă în raport cu cele din adnotările pentru variantele de poziţii"
<400> 78
<210> 79 <211> 217 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <221> sursă <223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Polipeptidă sintetică"
<220> <221> VARIANTĂ <222> (217)..(217) <223> /înlocuire=" "
<220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(217) <223> /notă="Variantele de resturi din secvenţă nu au preferinţă în raport cu cele din adnotările pentru variantele de poziţii"
<400> 79
<210> 80 <211> 217 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <221> sursă <223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Polipeptidă sintetică"
<220> <221> VARIANTĂ <222> (217)..(217) <223> /înlocuire=" "
<220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(217) <223> /notă="Variantele de resturi din secvenţă nu au preferinţă în raport cu cele din adnotările pentru variantele de poziţii"
<400> 80
<210> 81 <211> 6 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <221> sursă <223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(6) <223> /notă="Variantele de resturi din secvenţă nu au preferinţă în raport cu cele din adnotările pentru variantele de poziţii"
<400> 81 Gly Ser Arg Asp Tyr Phe 1 5
<210> 82 <211> 6 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <221> sursă <223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 82
<210> 83 <211> 6 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <221> sursă <223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 83
<210> 84 <211> 6 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <221> sursă <223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 84
<210> 85 <211> 6 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <221> sursă <223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 85
<210> 86 <211> 6 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <221> sursă <223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 86
<210> 87 <211> 6 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <221> sursă <223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 87
<210> 88 <211> 6 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <221> sursă <223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 88
<210> 89 <211> 6 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <221> sursă <223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 89
<210> 90 <211> 6 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <221> sursă <223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 90
<210> 91 <211> 6 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <221> sursă <223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 91
<210> 92 <211> 6 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <221> sursă <223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 92
<210> 93 <211> 6 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <221> sursă <223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 93
<210> 94 <211> 6 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <221> sursă <223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 94
<210> 95 <211> 6 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <221> sursă <223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 95
<210> 96 <211> 6 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <221> sursă <223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 96
<210> 97 <211> 6 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <221> sursă <223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 97
<210> 98 <211> 6 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <221> sursă <223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 98
<210> 99 <211> 6 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <221> sursă <223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 99
<210> 100 <211> 6 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <221> sursă <223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 100
<210> 101 <211> 6 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <221> sursă <223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 101
<210> 102 <211> 6 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <221> sursă <223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 102
<210> 103 <211> 6 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <221> sursă <223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 103
<210> 104 <211> 6 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <221> sursă <223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 104
<210> 105 <211> 6 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <221> sursă <223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 105
<210> 106 <211> 6 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <221> sursă <223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 106
<210> 107 <211> 6 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <221> sursă <223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 107
<210> 108 <211> 6 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <221> sursă <223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 108
<210> 109 <211> 6 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <221> sursă <223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 109
<210> 110 <211> 6 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <221> sursă <223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 110
<210> 111 <211> 6 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <221> sursă <223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 111
<210> 112 <211> 6 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <221> sursă <223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 112
<210> 113 <211> 6 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <221> sursă <223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 113
<210> 114 <211> 6 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <221> sursă <223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 114
<210> 115 <211> 6 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <221> sursă <223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 115
<210> 116 <211> 6 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <221> sursă <223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 116
<210> 117 <211> 6 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <221> sursă <223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 117
<210> 118 <211> 6 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <221> sursă <223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 118
<210> 119 <211> 6 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <221> sursă <223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 119
<210> 120 <211> 6 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <221> sursă <223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 120
<210> 121 <211> 6 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <221> sursă <223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 121
<210> 122 <211> 6 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <221> sursă <223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 122
<210> 123 <211> 6 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <221> sursă <223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 123
<210> 124 <211> 6 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <221> sursă <223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 124
<210> 125 <211> 6 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <221> sursă <223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 125
<210> 126 <211> 6 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <221> sursă <223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 126
<210> 127 <211> 6 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <221> sursă <223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 127
<210> 128 <211> 6 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <221> sursă <223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 128
<210> 129 <211> 6 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <221> sursă <223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 129
<210> 130 <211> 6 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <221> sursă <223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 130
<210> 131 <211> 6 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <221> sursă <223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 131
<210> 132 <211> 6 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <221> sursă <223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 132
<210> 133 <211> 6 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <221> sursă <223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 133
<210> 134 <211> 6 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <221> sursă <223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 134
<210> 135 <211> 6 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <221> sursă <223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 135
<210> 136 <211> 6 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <221> sursă <223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 136
<210> 137 <211> 6 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <221> sursă <223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 137
<210> 138 <211> 6 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <221> sursă <223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 138
<210> 139 <211> 6 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <221> sursă <223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 139
<210> 140 <211> 6 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <221> sursă <223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 140
<210> 141 <211> 453 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <221> sursă <223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<220> <221> VARIANTĂ <222> (453)..(453) <223> /înlocuire=" "
<220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(453) <223> /notă="Variantele de resturi din secvenţă nu au preferinţă în raport cu cele din adnotările pentru variantele de poziţii"
<400> 141
<210> 142 <211> 453 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <221> sursă <223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Polipeptidă sintetică"
<220> <221> VARIANTĂ <222> (453)..(453) <223> /înlocuire=" "
<220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(453) <223> /notă="Variantele de resturi din secvenţă nu au preferinţă în raport cu cele din adnotările pentru variantele de poziţii"
<400> 142
<210> 143 <211> 453 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <221> sursă <223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Polipeptidă sintetică"
<220> <221> VARIANTĂ <222> (453)..(453) <223> /înlocuire=" "
<220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(453) <223> /notă="Variantele de resturi din secvenţă nu au preferinţă în raport cu cele din adnotările pentru variantele de poziţii"
<400> 143
<210> 144 <211> 4 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <221> sursă <223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 144 Ala Leu Ala Leu
1
<210> 145 <211> 4 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <221> sursă <223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> Beta-Ala
<400> 145 Ala Leu Ala Leu
1
<210> 146 <211> 4 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <221> sursă <223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 146
<210> 147 <211> 217 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <221> sursă <223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Polipeptidă sintetică"
<220> <221> VARIANTĂ <222> (217)..(217) <223> /înlocuire=" "
<220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(217) <223> /notă="Variantele de resturi din secvenţă nu au preferinţă în raport cu cele din adnotările pentru variantele de poziţii"
<400> 147
<210> 148 <211> 217 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <221> sursă <223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Polipeptidă sintetică"
<220> <221> VARIANTĂ <222> (217)..(217) <223> /înlocuire=" "
<220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(217) <223> /notă="Variantele de resturi din secvenţă nu au preferinţă în raport cu cele din adnotările pentru variantele de poziţii"
<400> 148
<210> 149 <211> 217 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <221> sursă <223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Polipeptidă sintetică"
<220> <221> VARIANTĂ <222> (217)..(217) <223> /înlocuire=" "
<220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(217) <223> /notă="Variantele de resturi din secvenţă nu au preferinţă în raport cu cele din adnotările pentru variantele de poziţii"
<400> 149
<210> 150 <211> 217 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <221> sursă <223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Polieptidă sintetică"
<220> <221> VARIANTĂ <222> (217)..(217) <223> /înlocuire=" "
<220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(217) <223> /notă="Variantele de resturi din secvenţă nu au preferinţă în raport cu cele din adnotările pentru variantele de poziţii"
<400> 150
<210> 151 <211> 453 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <221> sursă <223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Polipeptidă sintetică"
<220> <221> VARIANTĂ <222> (453)..(453) <223> /înlocuire=" "
<220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(453) <223> /notă="Variantele de resturi din secvenţă nu au preferinţă în raport cu cele din adnotările pentru variantele de poziţii"
<400> 151
<210> 152 <211> 453 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <221> sursă <223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Polipeptidă sintetică"
<220> <221> VARIANTĂ <222> (453)..(453) <223> /înlocuire=" "
<220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(453) <223> /notă="Variantele de resturi din secvenţă nu au preferinţă în raport cu cele din adnotările pentru variantele de poziţii"
<400> 152
<210> 153 <211> 453 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <221> sursă <223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Polipeptidă sintetică"
<220> <221> VARIANTĂ <222> (453)..(453) <223> /înlocuire=" "
<220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(453) <223> /notă="Variantele de resturi din secvenţă nu au preferinţă în raport cu cele din adnotările pentru variantele de poziţii"
<400> 153
<210> 154 <211> 453 <212> PRT <213> Secvenţă artificială
<220> <221> sursă <223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Polipeptidă sintetică"
<220> <221> VARIANTĂ <222> (453)..(453) <223> /înlocuire="
<220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(453) <223> /notă="Variantele de resturi din secvenţă nu au preferinţă în raport cu cele din adnotările pentru variantele de poziţii"
<400> 154

Claims (17)

1. Imunoconjugat care cuprinde un anticorp anti-ADAM9 umanizat sau un fragment de legare a ADAM9 al acestuia care se leagă în mod specific la ADAM9 umană şi ADAM9 de cyno: (I) în care anticorpul anti-ADAM9 umanizat menţionat sau fragmentul de legare a ADAM9 al acestuia este conjugat cu un agent farmacologic; şi (II) în care anticorpul anti-ADAM9 umanizat menţionat sau fragmentul de legare a ADAM9 al acestuia cuprinde un domeniu variabil al lanţului uşor (VL) şi un domeniu variabil al lanţului greu (VH), în care domeniul variabil al lanţului greu menţionat cuprinde un domeniu CDRH1, un domeniu CDRH2 şi un domeniu CDRH3 şi domeniul variabil al lanţului uşor menţionat cuprinde un domeniu CDRL1, un domeniu CDRL2 şi un domeniu CDRL3, în care: (A) domeniul CDRH1 menţionat cuprinde secvenţa de aminoacizi a SEQ ID NO:8 sau SEQ ID NO:34; şi (B) domeniul CDRH2 menţionat cuprinde secvenţa de aminoacizi a SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO:35 sau SEQ ID NO:36; şi (C) domeniul CDRH3 menţionat cuprinde secvenţa de aminoacizi a oricăreia dintre SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:45 sau SEQ ID NO:46; şi în care: (A) domeniul CDRL1 menţionat are secvenţa de aminoacizi a SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:63 sau SEQ ID NO:64; şi (B) domeniul CDRL2 menţionat are secvenţa de aminoacizi a SEQ ID NO:13; şi (C) domeniul CDRL3 menţionat are secvenţa de aminoacizi a SEQ ID NO:14 sau SEQ ID NO:65.
2. Imunoconjugat conform revendicării 1, în care anticorpul anti-ADAM9 umanizat menţionat sau fragmentul de legare a ADAM9 al acestuia cuprinde un domeniu CDRH1, un domeniu CDRH2 şi un domeniu CDRH3 şi un domeniu CDRL1, un domeniu CDRL2 şi un domeniu CDRL3 care au secvenţele selectate din grupul constând din: (a) SEQ ID NO: 8, 35 şi 45 şi, respectiv, SEQ ID NO: 62, 13, 14; (b) SEQ ID NO: 8, 35 şi 38 şi, respectiv, SEQ ID NO: 62, 13, 14; (c) SEQ ID NO: 8, 35 şi 39 şi, respectiv, SEQ ID NO: 62, 13, 14; (d) SEQ ID NO: 8, 35 şi 40 şi, respectiv, SEQ ID NO: 62, 13, 14; (e) SEQ ID NO: 8, 35 şi 41 şi, respectiv, SEQ ID NO: 62, 13, 14; (f) SEQ ID NO: 8, 35 şi 42 şi, respectiv, SEQ ID NO: 62, 13, 14; (g) SEQ ID NO: 8, 35 şi 43 şi, respectiv, SEQ ID NO: 62, 13, 14; (h) SEQ ID NO: 8, 35 şi 44 şi, respectiv, SEQ ID NO: 62, 13, 14; (i) SEQ ID NO: 8, 35 şi 37 şi, respectiv, SEQ ID NO: 62, 13, 14; şi (j) SEQ ID NO: 8, 35 şi 46 şi, respectiv, SEQ ID NO: 62, 13, 14.
3. Imunoconjugat conform revendicării 1 sau 2, în care: (A) domeniul VH menţionat cuprinde SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28 sau SEQ ID NO:29; şi (B) domeniul VL menţionat cuprinde SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:56 sau SEQ ID NO:57.
4. Imunoconjugat conform revendicării 1, în care domeniul CDRH1 menţionat cuprinde secvenţa de aminoacizi SYWMH (SEQ ID NO:8), domeniul CDRH2 menţionat cuprinde secvenţa de aminoacizi EIIPIFGHTNYNEKFKS (SEQ ID NO:35), domeniul CDRH3 menţionat cuprinde secvenţa de aminoacizi GGYYYYPRQGFLDY (SEQ ID NO:45), domeniul CDRL1 menţionat cuprinde secvenţa de aminoacizi KASQSVDYSGDSYMN (SEQ ID NO:62), domeniul CDRL2 menţionat cuprinde secvenţa de aminoacizi AASDLES (SEQ ID NO:13) şi domeniul CDRL3 menţionat cuprinde secvenţa de aminoacizi QQSHEDPFT (SEQ ID NO:14).
5. Imunoconjugat conform revendicării 4, în care imunoconjugatul menţionat cuprinde: (A) domeniul variabil al lanţului greu (VH) al hMAB-A (2I.2) (SEQ ID NO:28); şi/sau (B) domeniul variabil al lanţului uşor (VL) al hMAB-A (2I.2) (SEQ ID NO:55); şi/sau (C) domeniul variabil al lanţului greu (VH) al hMAB-A (2I.2) (SEQ ID NO:28) şi domeniul variabil al lanţului uşor (VL) al hMAB-A (2I.2) (SEQ ID NO:55).
6. Imunoconjugat conform oricăreia dintre revendicările 1-5, în care imunoconjugatul menţionat cuprinde o regiune Fc, în mod opţional în care regiunea Fc menţionată este o variantă de regiune Fc care cuprinde: (a) una sau mai multe modificări de aminoacizi care reduc afinitatea variantei de regiune Fc pentru un FcyR; şi/sau (b) una sau mai multe modificări de aminoacizi care introduc un rest de cisteină; şi/sau (c) una sau mai multe modificări de aminoacizi care prelungesc timpul de înjumătăţire serică.
7. Imunoconjugat conform revendicării 6, în care (I) una sau mai multe modificări de aminoacizi menţionate care reduc afinitatea variantei de regiune Fc pentru un FcyR cuprind: (A) L234A; (B) L235A; sau (C) L234A şi L235A; şi (II) una sau mai multe modificări de aminoacizi menţionate care introduc un rest de cisteină cuprind S442C; şi (III) una sau mai multe modificări de aminoacizi menţionate care prelungesc timpul de înjumătăţire serică cuprind: (A) M252Y; (B) M252Y şi S254T; (C) M252Y şi T256E; (D) M252Y, S254T şi T256E; sau (E) K288D şi H435K; şi în care numerotarea menţionată este cea din indicele UE Kabat.
8. Imunoconjugat conform oricăreia dintre revendicările 1-7, în care anticorpul anti-ADAM9 umanizat menţionat cuprinde un lanţ greu şi un lanţ uşor care au secvenţele selectate din grupul constând din: (a) SEQ ID NO:152 şi, respectiv, SEQ ID NO:68; (b) SEQ ID NO:141 şi, respectiv, SEQ ID NO:68; (c) SEQ ID NO:142 şi, respectiv, SEQ ID NO:68; (d) SEQ ID NO:143 şi, respectiv, SEQ ID NO:68; (e) SEQ ID NO:151 şi, respectiv, SEQ ID NO:68; (f) SEQ ID NO:52 şi, respectiv, SEQ ID NO:68; (g) SEQ ID NO:153 şi, respectiv, SEQ ID NO:68; şi (h) SEQ ID NO:154 şi, respectiv, SEQ ID NO:68.
9. Imunoconjugat conform revendicării 8, în care X din SEQ ID NO:141, SEQ ID NO:142, SEQ ID NO:143, SEQ ID NO:151, SEQ ID NO:152, SEQ ID NO:153 sau SEQ ID NO:154 este absent.
10. Imunoconjugat conform oricăreia dintre revendicările 1-9, în care anticorpul anti-ADAM9 umanizat menţionat cuprinde un lanţ greu şi un lanţ uşor care au secvenţele SEQ ID NO:152 şi, respectiv, SEQ ID NO:68.
11. Imunoconjugat conform revendicării 1, în care anticorpul anti-ADAM9 umanizat menţionat sau fragmentul de legare a ADAM9 al acestuia cuprinde un domeniu variabil al lanţului greu (VH) şi un domeniu variabil al lanţului uşor (VL) care au secvenţele SEQ ID NO:28 şi, respectiv, SEQ ID NO:55.
12. Imunoconjugat conform oricăreia dintre revendicările 1-11, în care agentul farmacologic menţionat este un compus maitansinoidic, un compus pirolobenzodiazepinic sau un compus indolinobenzodiazepinic.
13. Imunoconjugat conform revendicării 12, în care agentul farmacologic menţionat este un compus maitansinoidic.
14. Imunoconjugat conform oricăreia dintre revendicările 1-13, în care imunoconjugatul este reprezentat de o formulă selectată din grupul constând din: (I) în care: CBA este un anticorp anti-ADAM9 umanizat menţionat sau un fragment de legare a ADAM9 al acestuia care este legat covalent la CyL1 printr-un rest de lizină; WL este un număr întreg de la 1 până la 20; şi CyL1 este reprezentat de următoarea formulă:
sau o sare acceptabilă din punct de vedere farmaceutic a acestuia, în care: linia dublă dintre N şi C reprezintă o legătură simplă sau o legătură dublă, cu condiţia ca, atunci când este o legătură dublă, X să fie absent şi Y să fie -H sau un (C1-C4)alchil; şi atunci când este o legătură simplă, X să fie -H sau o fracţiune protectoare pentru o amină, şi Y să fie -OH sau -SO3H sau o sare acceptabilă din punct de vedere farmaceutic a acestuia; W' este -NRe', Re' este -(CH2-CH2-O)n-Rk ; n este un număr întreg de la 2 până la 6; Rk este -H sau -Me; Rx3 este un (C1-C6)alchil; L' este reprezentat de următoarea formulă: - NR5-P-C(=O)-(CRaRb)m-C(=O)- (B1'); sau - NR5-P-C(=O)-(CRaRb)m-S-Zs1- (B2'); R5 este -H sau un (C1-C3)alchil; P este un rest de aminoacid sau o peptidă care conţine între 2 şi 20 de resturi de aminoacizi; Ra şi Rb, la fiecare apariţie, sunt fiecare în mod independent -H, (C1-C3)alchil sau un substituent cu sarcină sau o grupare ionizabilă Q; m este un număr întreg de la 1 până la 6; şi Zs1 este selectat din oricare dintre următoarele formule: şi în care q este un număr întreg de la 1 până la 5 şi, în mod opţional, în care sarea acceptabilă din punct de vedere farmaceutic este o sare de sodiu sau potasiu; în care: CBA este un anticorp anti-ADAM9 umanizat menţionat sau un fragment de legare a ADAM9 al acestuia care este legat covalent la CyL2 printr-un rest de lizină; WL este un număr întreg de la 1 până la 20; şi CyL2 este reprezentat de următoarea formulă: sau sau o sare acceptabilă din punct de vedere farmaceutic a acestuia, în care: linia dublă dintre N şi C reprezintă o legătură simplă sau o legătură dublă, cu condiţia ca, atunci când este o legătură dublă, X să fie absent şi Y să fie -H sau un (C1-C4)alchil; şi atunci când este o legătură simplă, X să fie -H sau o fracţiune protectoare pentru o amină şi Y să fie -OH sau -SO3H; Rx1 şi Rx2 sunt în mod independent (C1-C6)alchil; Re este -H sau un (C1-C6)alchil; W' este -NRe', Re' este -(CH2-CH2-O)n-Rk; n este un număr întreg de la 2 până la 6; Rk este -H sau -Me; Zs1 este selectat din oricare dintre următoarele formule: şi în care q este un număr întreg de la 1 până la 5 şi, în mod opţional, în care sarea acceptabilă din punct de vedere farmaceutic este o sare de sodiu sau potasiu; în care: CBA este un anticorp anti-ADAM9 umanizat menţionat sau un fragment de legare a ADAM9 al acestuia care este legat covalent la CyL3 printr-un rest de lizină; WL este un număr întreg de la 1 până la 20; CyL3 este reprezentat de următoarea formulă: m' este 1 sau 2; R1 şi R2, sunt fiecare în mod independent H sau un (C1-C3)alchil; şi Zs1 este selectat din oricare dintre următoarele formule: şi în care q este un număr întreg de la 1 până la 5 şi, în mod opţional, în care sarea acceptabilă din punct de vedere farmaceutic este o sare de sodiu sau potasiu; în care: CBA este un anticorp anti-ADAM9 umanizat menţionat sau un fragment de legare a ADAM9 al acestuia care este legat covalent la CyC1 printr-un rest de cisteină; WC este 1 sau 2; CyC1 este reprezentat de următoarea formulă:
sau o sare acceptabilă din punct de vedere farmaceutic a acestuia, în care: linia dublă -- dintre N şi C reprezintă o legătură simplă sau o legătură dublă, cu condiţia ca, atunci când este o legătură dublă, X să fie absent şi Y să fie -H sau un (C1-C4)alchil; şi atunci când este o legătură simplă, X să fie -H sau o fracţiune protectoare pentru o amină şi Y să fie -OH sau -SO3H sau o sare acceptabilă din punct de vedere farmaceutic a acestuia; R5 este -H sau un (C1-C3)alchil; P este un rest de aminoacid sau o peptidă care conţine 2 până la 20 de resturi de aminoacizi; Ra şi Rb, la fiecare apariţie, sunt în mod independent -H, (C1-C3)alchil sau un substituent cu sarcină sau o grupare ionizabilă Q; W' este -NRe', Re este -(CH2-CH2-O)n-Rk; n este un număr întreg de la 2 până la 6; Rk este -H sau -Me; Rx3 este un (C1-C6)alchil; şi LC este reprezentat de s1 este situsul legat covalent la CBA şi s2 este situsul legat covalent la gruparea -C(=O)- de pe CyC1; în care: R19 şi R20, la fiecare apariţie, sunt în mod independent -H sau un (C1-C3)alchil; m" este un număr întreg cuprins între 1 şi 10; şi Rh este -H sau un (C1-C3)alchil şi în mod opţional în care sarea acceptabilă din punct de vedere farmaceutic este o sare de sodiu sau potasiu; în care: CBA este un anticorp anti-ADAM9 umanizat menţionat sau un fragment de legare a ADAM9 al acestuia care este legat covalent la CyC2 printr-un rest de cisteină; WC este 1 sau 2; CyC2 este reprezentat de următoarea formulă: sau sau o sare acceptabilă din punct de vedere farmaceutic a acestuia, în care: linia dublă dintre N şi C reprezintă o legătură simplă sau o legătură dublă, cu condiţia ca, atunci când este o legătură dublă, X să fie absent şi Y să fie -H sau un (C1-C4)alchil; şi atunci când este o legătură simplă, X să fie -H sau o fracţiune protectoare pentru o amină şi Y să fie -OH sau -SO3H sau o sare acceptabilă din punct de vedere farmaceutic a acestuia; Rx1 este un (C1-C6)alchil; Re este -H sau un (C1-C6)alchil; W' este -NRe'; Re' este -(CH2-CH2-O)n-Rk; n este un număr întreg de la 2 până la 6; Rk este -H sau -Me; Rx2 este un (C1-C6)alchil; LC' este reprezentat de următoarea formulă: în care: s1 este locul legat covalent la CBA şi s2 este locul legat covalent la gruparea -S- pe CyC2; Z este -C(=O)-NR9-,sau -NR9-C(=O)-; Q este -H, un substituent cu sarcină sau o grupare ionizabilă; R9, R10, R11, R12, R13, R19, R20, R21 and R22, la fiecare apariţie, sunt în mod independent -H sau un (C1-C3)alchil; q şi r, la fiecare apariţie, sunt în mod independent un număr întreg cuprins între 0 şi 10; m şi n sunt fiecare în mod independent un număr întreg cuprins între 0 şi 10; Rh este -H sau un (C1-C3)alchil; şi P' este un rest de aminoacid sau o peptidă care conţine 2 până la 20 de resturi de aminoacizi şi, în mod opţional, în care sarea acceptabilă din punct de vedere farmaceutic este o sare de sodiu sau potasiu; şi în care: CBA este un anticorp anti-ADAM9 umanizat menţionat sau un fragment de legare a ADAM9 al acestuia care este legat covalent la CyC3 printr-un rest de cisteină; WC este 1 sau 2; CyC3 este reprezentat de următoarea formulă: în care: m' este 1 sau 2; R1 şi R2, sunt fiecare în mod independent -H sau un (C1-C3)alchil; LC' este reprezentat de următoarea formulă: în care: s1 este locul legat covalent la CBA şi s2 este locul legat covalent la gruparea -S- de pe CyC3; Z este -C(=O)-NR9-, sau -NR9-C(=O)-; Q este H, un substituent cu sarcină sau o grupare ionizabilă; R9, R10, R11, R12, R13, R19, R20, R21 and R22, la fiecare apariţie, sunt în mod independent -H sau un (C1-C3)alchil; q şi r, la fiecare apariţie, sunt în mod independent un număr întreg cuprins între 0 şi 10; m şi n sunt fiecare în mod independent un număr întreg cuprins între 0 şi 10; Rh este -H sau un (C1-C3)alchil; P' este un rest de aminoacid sau o peptidă care conţine 2 până la 20 de resturi de aminoacizi şi, în mod opţional, în care sarea acceptabilă din punct de vedere farmaceutic este o sare de sodiu sau potasiu.
15. Compoziţie farmaceutică ce cuprinde o cantitate eficientă de conjugat conform oricăreia dintre revendicările 1-14 şi un purtător, excipient sau diluant acceptabil din punct de vedere farmaceutic.
16. Imunoconjugat conform oricăreia dintre revendicările 1-14 sau compoziţie farmaceutică conform revendicării 15 pentru utilizare în tratamentul unei boli sau afecţiuni asociate cu sau caracterizate prin expresia ADAM9.
17. Imunoconjugat sau compoziţie farmaceutică pentru utilizare conform revendicării 16, în care boala sau afecţiunea menţionată asociată cu sau caracterizată prin expresia ADAM9 este cancer, în mod opţional în care cancerul menţionat este selectat din grupul constând din cancer pulmonar cu celule non-mici, cancer colorectal, cancer de vezică urinară, cancer gastric, cancer pancreatic, carcinom celular renal, cancer de prostată, cancer esofagian, cancer mamar, cancer de cap şi gât, cancer uterin, cancer ovarian, cancer hepatic, cancer de col uterin, cancer tiroidian, cancer testicular, cancer mieloid, melanom şi cancer limfoid.
MDE20191243T 2016-12-23 2017-12-21 Imunoconjugate care țintesc ADAM9 și procedee de utilizare a acestora MD3558391T2 (ro)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201662438488P 2016-12-23 2016-12-23
US201762480201P 2017-03-31 2017-03-31
PCT/US2017/067823 WO2018119196A1 (en) 2016-12-23 2017-12-21 Immunoconjugates targeting adam9 and methods of use thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
MD3558391T2 true MD3558391T2 (ro) 2022-05-31

Family

ID=61025051

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
MDE20191243T MD3558391T2 (ro) 2016-12-23 2017-12-21 Imunoconjugate care țintesc ADAM9 și procedee de utilizare a acestora

Country Status (18)

Country Link
US (1) US20210388102A1 (ro)
EP (1) EP3558391B1 (ro)
JP (1) JP7170642B2 (ro)
CN (1) CN110267685B (ro)
CY (1) CY1125181T1 (ro)
DK (1) DK3558391T3 (ro)
ES (1) ES2912266T3 (ro)
HR (1) HRP20220550T1 (ro)
HU (1) HUE058664T2 (ro)
LT (1) LT3558391T (ro)
MD (1) MD3558391T2 (ro)
PL (1) PL3558391T3 (ro)
PT (1) PT3558391T (ro)
RS (1) RS63154B1 (ro)
SI (1) SI3558391T1 (ro)
SM (1) SMT202200182T1 (ro)
TW (1) TWI783957B (ro)
WO (1) WO2018119196A1 (ro)

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11274121B2 (en) 2018-01-12 2022-03-15 Immunogen, Inc. Methods for antibody drug conjugation, purification, and formulation
MX2020013466A (es) * 2018-06-26 2021-04-19 Immunogen Inc Inmunoconjugados dirigidos a adam9 y métodos para usarlos.
KR20220022112A (ko) * 2019-03-21 2022-02-24 이뮤노젠 아이엔씨 세포-결합 제제-약물 콘쥬게이트를 준비하는 방법
CN113661172A (zh) 2019-03-29 2021-11-16 伊缪诺金公司 用于抑制异常细胞生长或治疗增生性疾病的细胞毒性双苯并二氮杂䓬衍生物及其与细胞结合剂的缀合物
SG11202110922QA (en) 2019-04-26 2021-10-28 Immunogen Inc Camptothecin derivatives
CN110713983B (zh) * 2019-11-04 2022-06-10 深圳市体内生物医药科技有限公司 一种表达透明质酸酶的免疫细胞及其应用
JP2023525581A (ja) * 2020-05-15 2023-06-16 アレクシオン ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド 補体の活性化を検出するための細胞外小胞の使用方法、並びに補体性疾患の処置を評価及び／又は監視するためのその使用
TW202302155A (zh) 2021-03-08 2023-01-16 美商伊繆諾金公司 用於增加靶向ａｄａｍ９之免疫結合物治療癌症之功效的方法
WO2024193692A1 (zh) 2023-03-22 2024-09-26 映恩生物制药（苏州）有限公司 连接子及其在配体药物偶联物中的应用
TW202438113A (zh) 2023-03-24 2024-10-01 大陸商映恩生物製藥（蘇州）有限公司 標靶ａｄａｍ９的人源化抗體、其抗體藥物偶聯物及其應用
WO2025094146A1 (en) 2023-11-02 2025-05-08 Immunogen Switzerland Gmbh Vasconstrictors for reducing ocular toxicity of antibody-maytansinoid conjugates
CN120058950A (zh) * 2023-11-28 2025-05-30 昆山新蕴达生物科技有限公司 抗adam9的抗体及其用途
TW202540201A (zh) * 2023-12-14 2025-10-16 大陸商四川科倫博泰生物醫藥股份有限公司 Adam9結合蛋白及其用途

Family Cites Families (70)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US5807715A (en) 1984-08-27 1998-09-15 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods and transformed mammalian lymphocyte cells for producing functional antigen-binding protein including chimeric immunoglobulin
US5208020A (en) 1989-10-25 1993-05-04 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
EP0519596B1 (en) 1991-05-17 2005-02-23 Merck & Co. Inc. A method for reducing the immunogenicity of antibody variable domains
WO1994004679A1 (en) 1991-06-14 1994-03-03 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
GB9115364D0 (en) 1991-07-16 1991-08-28 Wellcome Found Antibody
AU669124B2 (en) 1991-09-18 1996-05-30 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Process for producing humanized chimera antibody
US5565332A (en) 1991-09-23 1996-10-15 Medical Research Council Production of chimeric antibodies - a combinatorial approach
US5733743A (en) 1992-03-24 1998-03-31 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
US6180377B1 (en) 1993-06-16 2001-01-30 Celltech Therapeutics Limited Humanized antibodies
US6265150B1 (en) 1995-06-07 2001-07-24 Becton Dickinson & Company Phage antibodies
WO1998023289A1 (en) 1996-11-27 1998-06-04 The General Hospital Corporation MODULATION OF IgG BINDING TO FcRn
US6277375B1 (en) 1997-03-03 2001-08-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobulin-like domains with increased half-lives
HUP0204475A2 (en) 2000-02-11 2003-04-28 Merck Patent Gmbh Enhancing the circulating half-life of antibody-based fusion proteins
US20030091568A1 (en) 2000-04-07 2003-05-15 Jurgen Frey Inhibitors for the formation of soluble human CD23
EP1142910A1 (en) 2000-04-07 2001-10-10 Jürgen Prof. Dr. Frey Inhibitors for the formation of soluble human CD23
US7083784B2 (en) 2000-12-12 2006-08-01 Medimmune, Inc. Molecules with extended half-lives, compositions and uses thereof
EP1455813B1 (en) 2001-12-18 2015-07-15 mondoBIOTECH AG Interferon gamma in combination with a diagnostic array for use in the improved treatment of idiopathic pulmonary fibrosis
US6716821B2 (en) 2001-12-21 2004-04-06 Immunogen Inc. Cytotoxic agents bearing a reactive polyethylene glycol moiety, cytotoxic conjugates comprising polyethylene glycol linking groups, and methods of making and using the same
US20040092466A1 (en) 2002-11-11 2004-05-13 Isis Pharmaceuticals Inc. Modulation of ADAM9 expression
DE60336149D1 (de) 2002-08-16 2011-04-07 Immunogen Inc Vernetzer mit hoher reaktivität und löslichkeit und ihre verwendung bei der herstellung von konjugaten für die gezielte abgabe von kleinmolekularen arzneimitteln
US7217797B2 (en) 2002-10-15 2007-05-15 Pdl Biopharma, Inc. Alteration of FcRn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis
US8088387B2 (en) 2003-10-10 2012-01-03 Immunogen Inc. Method of targeting specific cell populations using cell-binding agent maytansinoid conjugates linked via a non-cleavable linker, said conjugates, and methods of making said conjugates
US7276497B2 (en) 2003-05-20 2007-10-02 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising new maytansinoids
DE10337368A1 (de) * 2003-08-08 2005-03-03 Technische Universität Dresden Verfahren und Mittel zur Diagnose und Behandlung von Pankreastumoren
WO2005047327A2 (en) 2003-11-12 2005-05-26 Biogen Idec Ma Inc. NEONATAL Fc RECEPTOR (FcRn)-BINDING POLYPEPTIDE VARIANTS, DIMERIC Fc BINDING PROTEINS AND METHODS RELATED THERETO
US7829277B2 (en) 2004-03-01 2010-11-09 The Regents Of The University Of California Methods for identifying compounds that suppress chemically-induced carcinogenesis
US8802820B2 (en) 2004-11-12 2014-08-12 Xencor, Inc. Fc variants with altered binding to FcRn
US8367805B2 (en) 2004-11-12 2013-02-05 Xencor, Inc. Fc variants with altered binding to FcRn
WO2006084075A2 (en) 2005-02-02 2006-08-10 Raven Biotechnologies, Inc. Adam-9 modulators
US8445198B2 (en) 2005-12-01 2013-05-21 Medical Prognosis Institute Methods, kits and devices for identifying biomarkers of treatment response and use thereof to predict treatment efficacy
EP2032606B1 (en) 2006-05-30 2013-11-27 Genentech, Inc. Antibodies and immunoconjugates and uses therefor
WO2007143752A2 (en) 2006-06-09 2007-12-13 The Regents Of The University Of California Targets in breast cancer for prognosis or therapy
KR101443214B1 (ko) 2007-01-09 2014-09-24 삼성전자주식회사 폐암 환자 또는 폐암 치료를 받은 폐암 환자의 폐암 재발 위험을 진단하기 위한 조성물, 키트 및 마이크로어레이
SI2019104T1 (sl) 2007-07-19 2013-12-31 Sanofi Citotoksična sredstva, ki obsegajo nove tomaimicinske derivate, in njihova terapevtska uporaba
GB2453589A (en) 2007-10-12 2009-04-15 King S College London Protease inhibition
US8101361B2 (en) 2008-03-10 2012-01-24 National Jewish Health Markers for diagnosis of pulmonary inflammation and methods related thereto
CA2716738A1 (en) 2008-04-07 2009-10-15 Zymogenetics, Inc. Thrombin activator compositions and methods of making and using the same
US20090285840A1 (en) 2008-04-29 2009-11-19 New York Society For The Ruptured And Crippled Maintaining The Hospital For Special Surgery Methods for treating pathological neovascularization
SG189817A1 (en) 2008-04-30 2013-05-31 Immunogen Inc Potent conjugates and hydrophilic linkers
NZ610239A (en) 2008-04-30 2014-11-28 Immunogen Inc Cross-linkers and their uses
US20110081347A1 (en) 2008-06-04 2011-04-07 Macrogenics, Inc. Antibodies with Altered Binding to FcRn and Methods of Using Same
US20110129450A1 (en) 2008-08-01 2011-06-02 Orly Lazarov Method of promoting neurogenesis by modulating secretase activities
GB0819095D0 (en) 2008-10-17 2008-11-26 Spirogen Ltd Pyrrolobenzodiazepines
WO2010053539A2 (en) 2008-11-05 2010-05-14 The Texas A&M University System Methods for detecting colorectal diseases and disorders
RU2011127198A (ru) 2008-12-04 2013-01-10 Эбботт Лэборетриз Иммуноглобулины с двойными вариабельными доменами и их применение
RU2683325C2 (ru) 2009-02-05 2019-03-28 Иммьюноджен, Инк. Новые производные бензодиазепина
SG10201810743WA (en) 2009-06-03 2018-12-28 Immunogen Inc Conjugation methods
EP2534171A4 (en) 2010-02-11 2013-07-17 Univ Southern California MODIFIED ADAM DISINTEGRIN DOMAIN POLYPEPTIDES AND USES THEREOF
EP2542256B1 (en) 2010-03-04 2019-05-22 MacroGenics, Inc. Antibodies reactive with b7-h3, immunologically active fragments thereof and uses thereof
JP5875083B2 (ja) 2010-04-15 2016-03-02 メディミューン リミテッド 増殖性疾患治療用ピロロベンゾジアゼピン
JP5826863B2 (ja) 2011-02-15 2015-12-02 イミュノジェン・インコーポレーテッド 細胞傷害性ベンゾジアゼピン誘導体
UA116189C2 (uk) * 2011-05-02 2018-02-26 Мілленніум Фармасьютікалз, Інк. КОМПОЗИЦІЯ АНТИ-α4β7 АНТИТІЛА
US20130058947A1 (en) 2011-09-02 2013-03-07 Stem Centrx, Inc Novel Modulators and Methods of Use
US20130130355A1 (en) 2011-09-28 2013-05-23 Armune Biosciences, Inc. Method and system of particle-phage epitope complex
US20140342946A1 (en) 2011-12-31 2014-11-20 Moni Abraham Kuriakose Diagnostic tests for predicting prognosis, recurrence, resistance or sensitivity to therapy and metastatic status in cancer
US9534058B2 (en) 2012-02-08 2017-01-03 Abbvie Stemcentrx Llc Anti-CD324 monoclonal antibodies and uses thereof
WO2013177481A1 (en) 2012-05-25 2013-11-28 Immunogen, Inc. Benzodiazepines and conjugates thereof
WO2014108480A1 (en) 2013-01-09 2014-07-17 Friedrich-Alexander-Universitaet Erlangen-Nuernberg Method for in vitro detection and monitoring of a disease by measuring disease-associated protease activity in extracellular vesicles
US10047163B2 (en) 2013-02-08 2018-08-14 Abbvie Stemcentrx Llc Multispecific constructs
JPWO2014168154A1 (ja) 2013-04-08 2017-02-16 三菱レイヨン株式会社 眼疾患を評価するためのマイクロアレイ及び眼疾患の評価方法
EP2996721B1 (en) 2013-05-13 2021-10-06 Tufts University Compositions for treatment of adam8-expressing cancer
US20160138113A1 (en) 2013-06-19 2016-05-19 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Methods and compositions for the diagnosis, prognosis and treatment of brain metastasis
US9567641B2 (en) 2013-07-03 2017-02-14 Samsung Electronics Co., Ltd. Combination therapy for the treatment of cancer using an anti-C-met antibody
WO2016036804A1 (en) 2014-09-03 2016-03-10 Immunogen, Inc. Cytotoxic benzodiazepine derivatives
AU2015311987B2 (en) 2014-09-03 2020-06-04 Immunogen, Inc. Cytotoxic benzodiazepine derivatives
KR102508023B1 (ko) * 2014-09-03 2023-03-10 이뮤노젠 아이엔씨 세포-결합제 및 세포독성 약물을 포함하는 콘주게이트
MX2017006016A (es) 2014-11-11 2017-06-19 Amunix Operating Inc Composiciones conjugadas de xten direccionadas y metodos para producir las mismas.
SMT202000614T1 (it) 2015-06-29 2021-01-05 Immunogen Inc Coniugati di anticorpi ingegnerizzati con cisteina

Also Published As

Publication number Publication date
HUE058664T2 (hu) 2022-09-28
TW201822821A (zh) 2018-07-01
DK3558391T3 (da) 2022-05-09
SMT202200182T1 (it) 2022-05-12
ES2912266T3 (es) 2022-05-25
CN110267685B (zh) 2023-06-20
PL3558391T3 (pl) 2022-05-16
EP3558391B1 (en) 2022-02-02
LT3558391T (lt) 2022-07-11
CY1125181T1 (el) 2024-12-13
SI3558391T1 (sl) 2022-06-30
US20210388102A1 (en) 2021-12-16
HRP20220550T1 (hr) 2022-06-10
WO2018119196A8 (en) 2019-06-20
EP3558391A1 (en) 2019-10-30
JP2020504607A (ja) 2020-02-13
TWI783957B (zh) 2022-11-21
RS63154B1 (sr) 2022-05-31
CN110267685A (zh) 2019-09-20
JP7170642B2 (ja) 2022-11-14
WO2018119196A1 (en) 2018-06-28
PT3558391T (pt) 2022-05-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP3558391B1 (en) Immunoconjugates targeting adam9 and methods of use thereof
TWI897855B (zh) Ｅ ｐ Ｃ Ａ Ｍ 抗體、可活化抗體及免疫偶聯物以及其用途
TWI831797B (zh) 靶向adam9之免疫接合物及其使用方法
IL263600B2 (en) Antibodies against b7–h3 and drug-antibody conjugates
US20180230218A1 (en) Met antibodies and immunoconjugates and uses thereof
JP2025524628A (ja) Ｅｐｃａｍイムノコンジュゲート及びその使用
HK40015128A (en) Immunoconjugates targeting adam9 and methods of use thereof
HK40015128B (en) Immunoconjugates targeting adam9 and methods of use thereof