MD4384C1 - Celulă gazdă şi procedeu de expresie recombinantă a interferonului solubil - Google Patents

Abstract

Invenţia se referă la biotehnologie, în special la o celulă gazdă şi la un procedeu de expresie recombinantă a interferonului solubil.Conform invenţiei, se revendică o celulă gazdă pentru expresia recombinantă a unei proteine de interferon provenite de la mamifere, unde celula menţionată cuprinde: (a) o genă endogenă funcţională trxB şi (b) o genă endogenă inactivată gor, de asemenea invenţia se referă la utilizarea celulelor gazdă pentru expresia recombinantă a unei proteine de interferon şi la un procedeu de expresie recombinantă a unui interferon solubil într-o celulă gazdă.

Description

Prezenta invenţie se referă la biotehnologie, în special la o celulă şi la un procedeu de expresie recombinantă a interferonului solubil.

Interferonii reprezintă o grupă de glicoproteine secretate de către celulele de mamifere ca răspuns la diverşi stimuli, cum ar fi infecţia virală sau bacteriană. Interferonii posedă diverse caracteristici terapeutice utile, cum ar fi imunostimulatoare, antiproliferative şi activităţi antivirale. În mod corespunzător, aceste proteine se aplică pe larg în tratamentul numeroaselor boli şi tulburări, inclusiv a infecţiilor virale şi a unor forme de cancer, cum ar fi mielomul multiplu, leucemia, carcinomul renal şi altele. După originea lor celulară şi antigenicitate, interferonii umani se clasifică în trei grupe. La fiinţele umane, interferonii alfa sunt produşi de leucocite, interferonii beta de fibroblaste şi interferonii gamma de celulele B.

Iniţial interferonii erau obţinuţi prin purificarea proteinelor din surse naturale, de ex. din leucocite şi fibroblaste ale sângelui. Apariţia tehnologiei ADN-ului recombinant a făcut posibilă producerea interferonilor şi la scară industrială, de ex. prin expresia recombinantă a proteinelor de interferon în celulele gazdă bacteriene. Escherichia coli este unul dintre cele mai des folosite organisme gazdă bacteriene pentru expresia recombinantă a proteinelor heterologe datorită capacităţii de creştere rapidă până la densităţi mari ale celulelor, disponibilităţii unui număr vast de vectori de clonare şi uşurinţei de introducere a unor asemenea vectori în celule pentru expresia ulterioară. Majoritatea interferonilor care sunt disponibili astăzi pentru utilizarea în medicina umană au fost produşi în sistemele de expresie E. coli. Pe de altă parte, după cum se cunoaşte, expresia proteinelor heterologe în E. coli este asociată cu anumite limitări, fapt ce creează probleme pentru producerea cantităţilor mari de proteine farmaceutic active. O problemă des întâlnită în sistemele de expresie E. coli reprezintă incapacitatea celulei gazdă de a produce cantităţi considerabile de proteine recombinante în formă solubilă şi activă. În schimb, cea mai mare parte a proteinei este păstrată în formă de corpusculi de incluziune, adică în agregatele proteinelor denaturate. Cauza principală a incapacităţii de creare a proteinelor recombinante solubile constă în faptul că citoplasma E. coli reprezintă un mediu reducător, care împiedică formarea legăturilor disulfurice. Pentru separarea proteinei active din corpusculii de incluziune este nevoie de replierea proteinelor cu ajutorul agenţilor reducători, cum ar fi ditiotreitolul şi β-mercaptoetanolul, sau agenţilor de denaturare, cum ar fi guanidina-HCl şi ureea, care adesea este ineficientă şi asociată cu pierderi inacceptabile ale produsului.

Pentru depăşirea acestor neajunsuri au fost elaborate celule gazdă, în care anumite gene reductaze au fost inactivate pentru a crea un mediu mai oxidativ care să permită formarea legăturilor disulfurice. Aceste celule gazdă modificate au mutaţii în gene care codifică reductaza tioredoxin (trxB) şi oxidoreductaza glutation (gor). Prin intermediul acestor mutaţii, devine posibilă formarea legăturilor disulfurice în citoplasmă şi este sporit randamentul produsului solubil. Celulele gazdă cu o deficienţă în genele trxB şi gor sunt disponibile, de ex., sub denumirile comerciale Origami™ (Novagen) sau SHuffle™ (NEB). S-a demonstrat că celulele trxB-/gor- Origami™ B (DE3) (numite în continuare Origami (DE3); Novagen) pot fi folosite cu succes pentru expresia interferonului recombinant α2b după cum este descris în cererea publicată SUA 2009/0258394.

În ciuda acestor îmbunătăţiri, totuşi există necesitatea de sisteme de expresie mai eficiente, care ar putea fi utilizate pentru producerea sigură a proteinelor de interferoni, îndeosebi a proteinelor de interferoni umani. Sistemele noi de expresie trebuie să permită producerea cantităţilor mari de proteine de interferoni solubili, în acelaşi timp reducând la minimum porţiunea de proteină denaturată. În mod ideal, sistemele de expresie ar trebui să fie uşor de manipulat şi să permită producerea citokinelor, cum ar fi interferonii, la preţuri reduse.

Prezenta invenţie propune celule gazdă noi care sunt în special potrivite pentru expresia recombinantă a proteinelor de interferon provenite de la mamifere. S-a stabilit că celulele gazdă îmbunătăţite pentru expresia proteinelor de interferon pot fi obţinute prin inactivarea genei endogene gor a celulei gazdă şi menţinerea simultană a genei endogene funcţionale trxB. În mod neaşteptat, menţinerea unei gene endogene funcţionale trxB în celula gazdă a dus la randamente sporite semnificativ ale proteinelor recombinante de interferon. Se poate presupune că produsul genă trxB participă în diferite căi regulatoare, care au un impact asupra randamentului produsului de expresie.

Prin utilizarea celulelor gazdă noi pentru producerea recombinantă a interferonului se obţin cantităţi mari de proteine solubile fără formarea substanţială a corpusculilor de incluziune. După cum este indicat în exemplele de mai jos, celulele gazdă din invenţie produc cantităţi semnificativ mai mari de interferon solubil decât celulele corespunzătoare care au mutaţii în genele gor şi trxB. Astfel, celulele gazdă noi reprezintă o îmbunătăţire semnificativă a nivelului cunoscut al tehnicii, deoarece ele simplifică producerea proteinelor de interferon şi reduc în acelaşi timp cheltuielile de producere.

Într-un prim aspect, prezenta invenţie se referă astfel la o celulă gazdă care este potrivită pentru expresia recombinantă a proteinei de interferon, unde celula gazdă menţionată cuprinde (a) o genă endogenă funcţională trxB şi (b) o genă endogenă inactivată gor. Expresia recombinantă semnifică faptul că expresia proteinei dorite este efectuată de un acid nucleic obţinut prin metoda ingineriei genetice. De preferinţă, o celulă gazdă prevăzută cu un vector de expresie ce include o succesiune de polinucleotide, care codifică o proteină de interferon este cultivată în condiţii potrivite pentru expresia interferonului. Invenţia se mai referă la utilizarea unor asemenea celule gazdă pentru expresia recombinantă a unei proteine de interferon.

Conform invenţiei, poate fi utilizată orice celulă care este cunoscută în domeniul dat ca fiind potrivită în calitate de gazdă pentru expresia proteinelor heterologe şi care a fost modificată prin inactivarea genei endogene gor. Celula poate fi de origine eucariotă sau procariotă. Într-o variantă de executare, celula gazdă este o celulă de mamifere, de ex., o celulă primară sau o linie de celule obţinută de la un şoarece, şobolan, hamster, câine sau primat, altul decât cel uman. Celulele de mamifere care s-au dovedit a fi utile pentru expresia heterologă a proteinelor includ celule primare (de ex. celule din măduva osoasă a şoarecilor, celule stem hematopoietice, limfocite de şoareci, celule de muşchi, hepatocite şi altele) şi linii de celule stabilite (de ex. celule de ovar de hamster chinezesc (CHO), celule de rinichi de maimuţă (COS), celule de rinichi de pui de hamster (BHK), celule de rinichi de maimuţă africană verde (Vero), celule de rinichi canin Madin Darby (DCK) şi altele).

Într-o variantă ulterioară de executare, celula gazdă din invenţie este o celulă de drojdie. De ex., celulele de drojdie, care au fost obţinute din speciile Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Yarrowia lipolytica, Kluyveromyces lactis şi Pichia pastoris, s-au dovedit a fi utile pentru expresia proteinelor de interferon (Skoko ş.a., (2003) Biotechnol. Appl. Biochem. 38 (Pt3) : 257-65). Într-o altă variantă de executare, celula gazdă conform invenţiei poate fi obţinută, de asemenea, din celule de insecte, cum ar fi din celulele speciilor de insecte Aedes aegypti, Autographa californica, Bombyx mori, Spodoptera frugiperda sau Trichoplusia ni.

În prezenta invenţie se preferă în special utilizarea celulelor gazdă bacteriene în vederea uşurinţei manipulării şi creşterii rapide a celulelor. Celulele bacteriene de la numeroase specii sunt folosite în domeniul dat pentru expresia proteinelor heterologe. Celulele gazdă folosite pe larg conţin tulpini de Escherichia coli, Corynebacterium glutamicum şi Bacillus subtilis. Într-o variantă preferenţială de executare, celula gazdă bacteriană este o celulă E.coli, cum ar fi o celulă care a fost obţinută din tulpina BL21 E.coli.

Conform invenţiei, celula gazdă examinată pentru expresia proteinelor de interferon a fost manipulată genetic pentru inactivarea genei endogene gor, adică a genei care codifică oxidoreductaza glutation nativă a celulei gazdă. Gena care codifică oxidoreductaza glutation a fost detectată în câteva organisme diferite şi este descrisă în literatură. În calitate de exemplu, secvenţa de nucleotide a genei gor a E. coli K12 este prezentată aici ca SEQ ID NO:5. În baza secvenţei de nucleotide a genei gor, specialistul va putea să inactiveze uşor gena menţionată prin metode genetice standard, cum ar fi mutageneza dirijată. Inactivarea genei gor va fi astfel încât în celula gazdă să nu fie sau în fond să nu fie nicio expresie a enzimei biologic active de oxidoreductază glutation. În prezenta invenţie, gena gor se consideră inactivată, dacă manipularea genetică reduce cantitatea de enzimă funcţională de oxidoreductază glutation cu, cel puţin, 90%, de preferinţă 95% sau mai mult în comparaţie cu celula gazdă nemodificată.

Inactivarea poate fi realizată prin ştergerea unei părţi sau a întregii secvenţe de codificare a genei gor în celula gazdă. În mod alternativ, este, de asemenea, posibil de a introduce o substituire a unei nucleotide în secvenţa de codificare a genei, cu condiţia că această substituire are loc într-un triplet care codifică un reziduu esenţial al enzimei de oxidoreductază. Se poate de introdus, de asemenea, una sau mai multe nucleotide în porţiunea de codificare pentru a modifica cadrul de citire a genei gor. În altă variantă preferenţială de executare a invenţiei, gena gor este inactivată prin introducerea şi excizia unui alt polinucleotid, de ex., a unei gene ce conferă rezistenţă faţă de un antibiotic care poate fi folosit pentru selecţie. Metodele care pot fi folosite pentru inactivarea genelor în celulele bacteriene, de mamifere şi de drojdie sunt bine cunoscute unui specialist în domeniul dat. De exemplu, numeroase metode pentru inactivarea unei gene bacteriene sunt descrise în literatură. Pe lângă aceasta, seturile pentru mutageneza dirijată sunt disponibile în vânzare, de ex., setul pentru mutageneză Quick-Change de la compania Stratagene, setul pentru mutageneză Transformer de la compania Clontech, sistemul de mutageneză GenTaylor de la compania Invitrogen, setul pentru mutageneza in vitro Altered Sites II de la compania Promega şi setul pentru recombinare Red/ET de la compania Gene Bridges.

Inventatorii au depistat că inactivarea genei endogene gor a celulei gazdă este avantajoasă pentru obţinerea cantităţilor mari de interferoni solubili exprimaţi recombinant. În mod surprinzător, celulele gazdă în care doar gena endogenă gor a fost inactivată produc cantităţi semnificativ mai mari de proteine de interferon în comparaţie cu celulele corespunzătoare care au genotipul trxB-/gor- (a se vedea Exemplul 6 de mai jos). Prin urmare, celulele gazdă examinate în prezenta invenţie conţin o genă endogenă funcţională trxB, adică o genă trxB care este nativă celulei gazdă şi produce reductaza tioredoxină enzimatic activă. Drept rezultat, celula gazdă conform invenţiei este capabilă să producă o enzimă funcţională nativă de reductază tioredoxină.

Este necesar de remarcat că tulpinile dublu inactivate trxB-/gor- sunt viabile, doar dacă ele prezintă o mutaţie în genă care codifică reductaza alchilhidroperoxid (ahpC*). A se vedea Faulkner şi alţii (2008), PNAS, 105 (18) : 6735-40. Atât tulpina RHB-T7Agor/trx descrisă în invenţie, cât şi tulpina Origami (DE3) conţin astfel o mutaţie supresoare ahpC*. În schimb, tulpinile care conţin doar o mutaţie gor inactivatoare sunt viabile fără o mutaţie ahpC*, deoarece inactivarea genei gor ca atare nu are nici un efect letal. Astfel, tulpina RHB-T7Agor preparată în Exemplul 2 de mai jos nu conţine o mutaţie supresoare ahpC*.

În mod corespunzător, se preferă ca celulele gazdă examinate în prezenta invenţie să cuprindă o genă endogenă, nemodificată, funcţională ahpC, adică o genă ahpC care este nativă celulei gazdă, nu conţine o mutaţie supresoare şi este capabilă să producă reductaza alchilhidroperoxid enzimatic activă.

Pentru a spori nivelul expresiei proteinei de interferon ce urmează a fi exprimată, celula gazdă din invenţie poate cuprinde ARN-polimeraza dintr-un bacteriofag, cum ar fi polimeraza T7 ARN. Polimeraza T7 ARN asigură o expresie puternică şi controlată a unei secvenţe de polinucleotide care se conţine într-un vector de expresie şi precedată de un promotor T7. Gena polimerazei T7 ARN poate fi amplasată în celula gazdă în formă de un vector de expresie. Vectorul de expresie care conţine gena polimerazei T7 ARN poate fi identic sau diferit de vectorul care include secvenţa interferonului pentru expresie. Se preferă, totuşi, ca secvenţa care conţine gena polimerazei T7 ARN să fie introdusă în genomul celulei gazdă, de ex., în cromozomul bacterian. De exemplu, gena polimerazei T7 ARN poate fi introdusă în genomul unei celule-gazde E. coli, iar polinucleotidul care codifică proteina de interferon, cum ar fi IFN-α2a, este exprimat dintr-un vector de expresie care permite expresia în celulele E. coli. O casetă corespunzătoare de gene care include gena polimerazei T7 ARN poate fi introdusă în genomul unei celule gazdă bacteriene, de ex. prin recombinarea omologă descrisă în exemplele aduse mai jos. Pe lângă aceasta, celulele gazdă E. coli care cuprind gena polimerazei T7 ARN sunt, de asemenea, disponibile în vânzare, de exemplu, de la compania New England Biolabs (Frankfurt, Germania), a se vedea de exemplu NEB Cat# C2566, C3016, C3010, C3013, şi vectorii din seria SHUffle, cum ar fi C3026, C3027, C3029 şi C3030. De preferinţă, gena polimerazei T7 ARN este utilizată în combinaţie cu un polinucleotid de interferon, care a fost codon-optimizat pentru a fi exprimat într-un microorganism procariotic, cum ar fi o celulă E. coli.

Celula gazdă care a fost supusă manipulării în modul descris mai sus va fi prevăzută apoi cu o secvenţă de polinucleotide care codifică o proteină exogenă de interferon, de preferinţă o genă de interferon uman. Termenul „exogen” se referă la faptul că celula gazdă, care este selectată pentru expresia interferonului nu include în mod natural polinucleotidul, care codifică interferonul. Polinucleotidul poate fi introdus în celula gazdă, de ex., prin transformare sau transfecţie. De preferinţă, secvenţa de polinucleotide ce codifică proteina de interferon care urmează a fi exprimată este inclusă într-un vector de expresie. Selectarea vectorului de expresie depinde mai ales de natura celulei gazdă.

De exemplu, dacă celula gazdă este o celulă de mamifere, cum ar fi celula CHO sau Vero, vectorul de expresie poate fi, de exemplu, un vector de expresie viral sau neviral util pentru introducerea în celulă a unui polinucleotid ce codifică interferonul pentru expresia ulterioară a proteinei de interferon codificată de polinucleotidul dat. Vectorul de expresie poate fi un vector epizomal, adică unul care este capabil de a se automultiplica în mod autonom în celula gazdă, sau un vector integrator, adică vectorul care se încorporează stabil în genomul celulei de mamifere.

Un vector de expresie al unui mamifer conţine în mod normal un promotor, care este legat din punct de vedere funcţional cu polinucleotidul care codifică interferonul. Promotorii potriviţi includ, dar nu se limitează la promotorul imediat precoce al citomegalovirusului (CMV-IE), promotorul U3 al virusului necrozei splinei şi promotorul adenoviral major întârziat (Ad MLP). În calitate de component opţional, vectorul de expresie al unui mamifer poate include un amplificator potrivit pentru creşterea nivelului de expresie. Drept exemplu poate fi menţionat amplificatorul precoce al genelor SV40 (Dijkema şi alţii (1985) EMBO J. 4: 761) şi amplificatorul repetiţiei terminale îndelungate (LTR) a virusului Sarcoma Rous (Gorman şi alţii (1982b) Proc. Natl. Acad. Sci. 79: 6777). Vectorul de expresie conţine, de asemenea, opţional secvenţe de terminare a transcripţiei şi secvenţe de poliadenilare pentru îmbunătăţirea expresiei proteinei de interferon. Semnale potrivite ale terminatorului transcripţiei şi ale poliadenilării pot, de ex., rezulta din SV40 (Sambrook şi alţii (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual). Orice alt element, cunoscut în domeniul dat pentru sprijinirea expresiei eficiente, poate fi adăugat la vectorul de expresie, cum ar fi elementul post-transcripţional de reglare a hepatitei Woodchuck (wPRE).

Într-un aspect deosebit de preferenţial, vectorul de expresie este un vector de expresie viral. Vectorii virali care pot fi utilizaţi în prezenta invenţie conţin în mod obişnuit un genom viral, în care o porţiune de secvenţă nativă este ştearsă pentru a introduce un polinucleotid heterogen fără a distruge infectivitatea virusului. Datorită interacţiunii specifice între componentele virusului şi receptorii celulelor gazdă, vectorii virali sunt foarte potriviţi pentru transferul eficient al genelor în celulele ţintă. Vectorii virali potriviţi pentru facilitarea transferului de gene într-o celulă de mamifere sunt bine cunoscuţi în domeniul dat şi pot fi obţinuţi din diverse tipuri de viruşi, de ex., dintr-un retrovirus, adenovirus şi virusul adeno-asociat (AAV), ortomixovirus, paramixovirus, papovavirus, picornavirus sau alfavirus. O prezentare generală a diverselor sisteme de vectori virali poate fi vizualizată la Nienhuis şi alţii, Hematology, Vol. 16: Viruses and Bone Marrow, N.S. Young (ed.), 353-414 (1993).

Pe de altă parte, dacă celula gazdă este o celulă bacteriană, cum ar fi o celulă E. coli, vectorul de expresie va fi adaptat la expresia proteinei într-un mediu al celulei procariotice. Un număr vast de vectori de expresie este descris pentru E. coli şi alte celule gazdă bacteriene. Exemple de vectori potriviţi pentru expresia proteinei în celulele E. coli includ, de ex., vectori din seria pBluescript, vectori din seria pUC, de ex., pUC18, pUC19, pBR322, pBR329, pQE70, pQE60, pQE-9, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A, ptrc99a, pKK233-3, pDR540, pRIT5, pLG338, pKC30, pHSG299, pHSG399, pACYC177, pACYC184, pRSFlOlO, pBW22 şi alţii. Un vector preferat este acel ce aparţine grupului de vectori pET. Vectorii pET conţin, de obicei, o genă lacl care poartă informaţii despre proteina represoare lac, un promotor T7, care este specific polimerazei T7 ARN, o secvenţă a terminaţiei transcrierii, un operator lac care poate bloca transcrierea, un polilincher pentru clonare, o sursă de replicare fl, o genă de rezistenţă la ampicilină sau kanamicină şi o sursă de replicare ColEl. Vectorii pET potriviţi pentru folosirea în procedeele prezentei invenţii includ, dar nu se limitează la pET-21a(+), pET-24a(+), pET-28a(+), pET-29a(+), pET-30a(+), pET-41a(+), pET-44a(+), pET-21b(+), pET-24b(+), pET-26b(+), pET-28b(+), pET-29b(+), pET-30b(+), pET-42b (+), pET-44b (+). Se preferă îndeosebi vectorii care se bazează pe stroma pET-26b(+). Exemple ulterioare de vectori potriviţi sunt descrişi, de ex., în publicaţia "Vectori de clonare" (Pouwels şi alţii (eds.) Elsevier, Amsterdam New York Oxford, 1985).

Un vector de expresie pentru utilizarea în celulele bacteriene poate fi transformat în celula gazdă prin orice metodă potrivită. De exemplu, un vector de expresie pentru utilizarea în E. coli poate fi introdus în celula gazdă, de ex., prin electroporaţie sau prin metode chimice, cum ar fi transformarea mediată cu fosfat de calciu, precum este descrisă în Maniatis şi alţii, 1982, Clonarea Moleculară, Manual de laborator, Cold Spring Harbor Laboratory.

Celulele gazdă şi procedeele revendicate sunt utile pentru expresia recombinantă a cantităţilor mari de proteine de interferon solubil. Tipul interferonului nu este limitat în mod special. În general, proteinele de interferon selectate pentru expresia în celulele gazdă ale invenţiei pot fi de origine umană sau non-umană. Polipeptidele de interferon de origine non-umană includ, de ex., interferoni de bovine, cabaline, porcine şi şoareci, precum şi proteinele respective de la câini, pisici, iepuri şi oi. Alte tipuri de interferoni non-umani includ acei ce pot fi găsiţi în primate, cum ar fi cimpanzei şi gorile. Într-o variantă preferenţială de executare, proteinele de interferon selectate pentru expresia în celulele gazdă ale invenţiei sunt interferoni umani, adică interferoni care se găsesc în mod natural în fiinţele umane, inclusiv variante alelice.

Proteinele de interferon pot aparţine oricărei subclase de interferoni care este cunoscută în domeniul dat. În special, proteina de interferon pentru expresia în celula gazdă a invenţiei poate fi un interferon-alfa (IFN-α), un interferon-beta (IFN-β) sau un interferon-gamma (IFN-γ). Într-o variantă de executare îndeosebi preferenţială, proteina de interferon pentru expresie este IFN-α, IFN-β sau IFN-γ uman sau un fragment biologic activ al acestuia. Procedeele, conform invenţiei, pot fi utile ulterior pentru expresia variantelor sau fragmentelor biologic active ale proteinelor IFN-α, IFN-β sau IFN-γ, precum este descris mai sus.

Într-o variantă de executare a invenţiei, IFN exprimat în celulele gazdă ale invenţiei este proteina matură nativă umană IFN-α. Cu toate acestea, prezenta invenţie cuprinde, de asemenea, expresia variantelor şi a fragmentelor biologic active ale IFN-α, care sunt descrise. IFN-α uman se întâlneşte ca o familie din, cel puţin, 25 de proteine puternic omoloage din 166 de aminoacizi, care sunt codificaţi de gene diferite. Proteinele IFN-α inhibă replicarea virală şi proliferarea celulară şi modulează anumite reacţii imune. IFN-α recombinant este utilizat în prezent în tratamentul hepatitei B şi C şi, de asemenea, în tratamentul leucemiei, melanomului malign şi sarcomului Kaposi asociat cu SIDA. Printre IFN-α preferaţi pentru expresia conform invenţiei se numără IFN-α2a, IFN-α2b şi IFN-α2c. Secvenţa de aminoacizi a IFN-α2a matur nativ uman este descrisă în SEQ ID NO:l.

Într-o altă variantă de executare, IFN exprimat în celulele gazdă ale invenţiei este proteina matură nativă umană de IFN-β sau o variantă, sau un fragment de IFN-β biologic activ, precum este descris mai jos. IFN-β uman este o glicoproteină care are o greutate moleculară de circa 20 kd. La fel ca IFN-α, acesta demonstrează o activitate antivirală puternică şi, după cum se ştie, inhibă proliferarea celulară. Forma matură a IFN-β uman are 166 de aminoacizi. IFN-β matur uman este arătat în SEQ ID NO:2. S-a depistat că IFN-β se leagă cu aceiaşi receptori ca şi IFN-α.

Într-o altă variantă de executare a invenţiei, IFN exprimat în celulele gazdă ale invenţiei este proteina matură nativă umană de IFN-γ. Cu toate acestea, prezenta invenţie cuprinde, de asemenea, expresia variantelor şi a fragmentelor biologic active ale IFN-γ, care sunt descrise. IFN-γ este o glicoproteină care îndeplineşte câteva funcţii de reglementare în sistemul imunitar. De exemplu, eliberarea IFN-γ accelerează diferenţierea celulelor B şi stimulează producerea TNF-α. Pe lângă aceasta, s-a depistat că IFN-γ activează celulele epiteliale şi endoteliale, fibroblastele şi macrofagii pentru a elimina patogenii intracelulari. Efectele IFN-γ sunt mediate prin legarea proteinei de reglementare cu diverse forme de receptori pe suprafaţa celulelor receptive la IFN-γ. În forma sa matură, IFN-γ monomeric uman cuprinde 143 de aminoacizi şi are o greutate moleculară de circa 17 kd. Secvenţa de aminoacizi a IFN-γ matur nativ uman este descrisă în SEQ ID NO:3.

Desigur, este posibil, de asemenea, de a utiliza celulele gazdă şi procedeele descrise în prezenta invenţie pentru producerea variantelor de interferon, care diferă într-o anumită măsură de proteinele de interferon sus-menţionate, şi, în special, acele prezentate în SEQ ID NOs:1-3. Aceste variante fiind, de obicei, variante biologic active, adică ele păstrează, cel puţin, o parte din activitatea biologică a interferonului în stare naturală, de ex., abilitatea de a se lega cu moleculele receptorilor respectivi. Analize potrivite pentru determinarea legării unei variante cu receptorul de interferon de tip I sunt descrise, de ex., în brevetul SUA nr. 5766864. În mod alternativ, activitatea biologică a unei variante de interferon poate fi determinată prin măsurarea activităţilor sale antiproliferative sau antivirale descrise, de ex., în brevetele SUA 5770191 şi 5690925. De preferinţă, o variantă a interferonului menţine o parte considerabilă a activităţii biologice a proteinei de interferon din care acesta este obţinut, de ex., cel puţin, circa 50% din activitate, mai preferabil 60%, 70%, 80%, 90%, 95% sau mai mult.

Variantele includ proteine ce se găsesc în stare naturală şi produse în mod recombinant, care diferă de secvenţa de aminoacizi iniţială de referinţă prin una sau mai multe înlocuiri, deleţii sau completări ale aminoacizilor. De exemplu, o variantă de interferon uman α2a poate avea o secvenţă de aminoacizi care diferă prin 2, 3, 4, 5, 6 sau până la 10, 20, 30 sau mai multe poziţii de secvenţele interferonului uman nativ α2a descris în SEQ ID NO:l. Se preferă ca înlocuirile să fie conservative, adică înlocuiri ale unuia sau mai multor reziduuri aminoacide de aceeaşi polaritate, care acţionează ca un echivalent funcţional. De preferinţă, reziduul de aminoacizi folosit în calitate de înlocuitor este selectat din aceeaşi grupă de aminoacizi ca şi reziduul de aminoacizi ce urmează să fie înlocuit. De exemplu, un reziduu hidrofobic poate fi înlocuit cu un alt reziduu hidrofobic sau un reziduu polar poate fi înlocuit cu un alt reziduu polar care are aceeaşi sarcină. Aminoacizii funcţional omologi care pot fi folosiţi pentru o înlocuire conservativă includ, de ex., aminoacizi nepolari, cum ar fi glicina, valina, alanina, izoleucina, leucina, metionina, prolina, fenilalanina şi triptofanul. Exemple de aminoacizi polari neîncărcaţi includ serina, treonina, glutamina, asparagina, tirozina şi cisteina. Exemple de aminoacizi (de bază) polari încărcaţi includ histidina, arginina şi lizina. Exemple de aminoacizi (acizi) polari încărcaţi includ acidul aspartic şi acidul glutamic.

De asemenea, în calitate de variante de interferoni sunt examinate proteinele care diferă de interferonul iniţial prin unul sau mai mulţi (de ex. 2, 3, 4, 5, 10, sau 15) aminoacizi adiţionali. Aceşti aminoacizi adiţionali pot fi prezenţi în secvenţa de aminoacizi a proteinelor de interferoni iniţiali (adică ca o inserţie) sau pot fi adăugaţi la unul sau la ambele capete ale proteinei. În esenţă, inserţiile pot avea loc la orice poziţie cu condiţia că adăugarea aminoacizilor nu dăunează capacităţii proteinei de a exercita, cel puţin, o parte din activitatea biologică a proteinei de interferon ce se găseşte în stare naturală. Mai mult decât atât, variantele includ, de asemenea, acele proteine în care, spre deosebire de proteina iniţială, lipsesc unul sau mai mulţi aminoacizi. Asemenea deleţii pot fi făcute în privinţa oricărei poziţii a aminoacizilor cu condiţia că ele nu dăunează capacităţii unei asemenea variante să exercite, cel puţin, o parte din activitatea biologică exercitată de proteina de interferon ce se găseşte în stare naturală.

Variantele proteinelor de interferon cuprind, de asemenea, proteine cu modificări structurale în raport cu proteinele care se găsesc în stare naturală, cum ar fi aminoacizii modificaţi. Conform invenţiei, aminoacizii modificaţi sunt aminoacizi care au fost modificaţi fie prin procese naturale, cum ar fi modificările de prelucrare sau post-translaţionale, fie prin procese chimice. Modificările aminoacizilor care pot fi întâlnite în variantele de interferon obţinute conform invenţiei pot include fosforilare, glicozilare, acetilare, acilare, ramificare, ribozilare ADF, reticulare, formarea punţii disulfurice, formilare, hidroxilare, carboxilare, metilare, demetilare, amidare, ciclizare şi/sau formarea legăturilor covalente sau necovalente cu fosfatidilinozitol, derivatele flavinei, acizii lipoteiconici, acizii graşi sau lipidele. Asemenea modificări au fost descrise pe larg în literatură, de ex., în publicaţia: Proteine: Structura şi proprietăţile moleculare, T. Creighton, 2nd edition. H. Freeman and Company, New York (1993).

Variantele de interferon menţionate în prezenta invenţie prezintă, de preferinţă, o identitate semnificativă a secvenţei de aminoacizi în comparaţie cu proteina de interferon iniţială. De preferinţă, identitatea aminoacizilor constituie circa 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, şi mai preferabil mai mult de 96%, 97%, 98%, sau 99%. În domeniul dat sunt bine cunoscute metode şi programe de calculator pentru determinarea omologiei aminoacizilor. În prezenta invenţie, identitatea secvenţei este determinată cu ajutorul algoritmului de căutare a omologiei Smith-Waterman (Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. (1981), 2:482-489).

Variante biologic active de proteine umane de interferon sunt descrise în domeniul dat. Variante de IFN-α uman pot fi găsite, de exemplu, în brevetul SUA 5676942, care oferă, de asemenea, informaţii cu privire la reziduurile şi regiunile proteinei IFN-α care pot fi modificate fără pierderea activităţii biologice. Variante de IFN-γ uman sunt descrise, de ex., în brevetele SUA 5690925 şi 6046034.

Celulele gazdă şi procedeele propuse de prezenta invenţie, de asemenea, pot fi utile pentru expresia fragmentelor biologic active ale proteinelor neprocesate de interferon sau ale variantelor acestora definite mai sus. După cum este utilizat în prezenta invenţie, un fragment de proteină de interferon este o proteină, polipeptid sai peptid, care diferă de proteina corespunzătoare de interferon prin lipsa unuia sau mai multor aminoacizi la terminaţia-N şi/sau terminaţia-C, unde cel puţin o parte din activitatea biologică a moleculei de interferon de referinţă, de ex., proprietăţile sale de legare cu receptorii sau activitatea sa antivirală sau antiproliferativă, se păstrează. Se preferă ca fragmentele biologic active ale proteinelor de interferon ce se găsesc în stare naturală sau fragmentele variantelor corespunzătoare de interferon să păstreze, cel puţin circa 50%, cel puţin circa 75%, de preferinţă cel puţin circa 80%, cel puţin circa 85%, cel puţin circa 90% sau chiar cel puţin până la circa 99% din activitatea biologică a interferonului de referinţă.

Fragmentele biologic active ale interferonilor umani au fost descrise anterior. De exemplu, fragmentele de IFN-γ sunt cunoscute din brevetul SUA nr. 5770191, în care sunt descrise fragmente ce cuprind aminoacizii 95-134 ale IFN-γ uman neprocesat. Fragmentele exercită activitatea biologică a IFN-γ matur. În EP 0306870 sunt descrise fragmente de IFN-γ uman care au o deleţie a aminoacizilor 7-11 la terminaţia-C. Fragmentele demonstrează o activitate sporită semnificativ în comparaţie cu IFN-γ uman neprocesat.

În timpul clonării unei secvenţe de polinucleotide, care codifică una dintre proteinele de interferon sus-menţionate sau o variantă, sau un fragment biologic activ al acestora într-un vector bacterian de expresie, este necesar de a lua în considerare faptul că ar putea fi util de a modifica secvenţa de polinucleotide ce codifică interferonul în scopul adaptării ei la expresia procariotică. Metode de optimizare a utilizării-codon a unei secvenţe de polinucleotide ce urmează să fie exprimată în scopul de a o face potrivită pentru expresia în celulele gazdă bacteriene, cum ar fi E. coli, sunt bine cunoscute în domeniul dat şi sunt descrise, de ex., în Maertens şi alţii (2010), Protein Science, 19: 1312-1326.

Pe scurt, secvenţa de polinucleotide care codifică proteina de interferon ce urmează a fi exprimată în celulele gazdă este manipulată prin adaptarea utilizării-codon la deplasarea-codon a E. coli. Segmentele cu un conţinut foarte mare (> 80%) şi foarte redus (< 30%) de GC nu au fost folosite după posibilitate. De asemenea, nu au fost folosite fragmente ale secvenţei cis-activatoare, cum ar fi TATA-boxe interioare, chi-saituri şi saituri de intrare ribozomale, secvenţe repetate, structuri secundare ARN şi secţiuni AT-bogate sau GC-bogate ale secvenţei. Optimizarea secvenţelor de gene, cum ar fi secvenţele umane de gene, pentru expresia în celulele gazdă bacteriene, precum celulele E. coli este, de asemenea, realizată de către furnizori precum Geneart (Regensburg, Germania).

O secvenţă de polinucleotide ce codifică IFN-α2a uman, care a fost optimizată pentru expresia în E. coli este prezentată în SEQ ID NO:4.

Invenţia se referă, de asemenea, la un procedeu de expresie recombinantă a unui interferon solubil, în care se foloseşte o celulă gazdă descrisă mai detaliat mai sus. Procedeul cuprinde etapele de

(a) oferire a unei celule gazdă care cuprinde o genă endogenă funcţională trxB, o genă endogenă inactivată gor şi o secvenţă de polinucleotide care codifică o proteină exogenă de interferon;

(b) cultivare a celulei gazdă în condiţii care permit expresia proteinei de interferon; şi

(c) obţinere a proteinei de interferon solubil din celula gazdă.

Celula gazdă conţine, de preferinţă, o copie a unei polimeraze ARN a bacteriofagului integrată în genomul său, de ex., polimeraza T7 ARN, şi este transformată cu un construct de expresie epizomal, de ex., un vector de expresie ce include o secvenţă de polinucleotide care poartă informaţiile unei proteine exogene de interferon. Gazda utilizată în metoda de expresie recombinantă a unui interferon solubil poate fi, în general, orice tip de celulă eucariotă sau procariotă, precum este descris în prezenta invenţie. De preferinţă, celula gazdă este o celulă bacteriană, mai preferabil, o celulă E. coli.

Conform metodei propuse de prezenta invenţie, celulele gazdă sunt cultivate în condiţii care permit expresia proteinei de interferon. Condiţiile specifice vor depinde de alegerea sistemului specific de expresie şi, de asemenea, de astfel de factori, precum natura celulei gazdă, natura promotorului inducibil şi alţi factori. Specialistul va putea selecta şi optimiza cu uşurinţă condiţiile necesare pentru expresia eficientă a proteinei de interferon în cultura celulară fără efort inventiv.

De exemplu, cultivarea celulelor gazdă E. coli care exprimă o proteină de interferon poate fi efectuată conform procedeelor standard de fermentare. De obicei, celulele E. coli pot fi cultivate printr-un procedeu periodic sau cu aprovizionare continuă (fed-batch). Procedeele de cultivare ale celulelor gazdă bacteriene sunt, în general, descrise în Encyclopedia of Bioprocess Technology: Fermentation, Biocatalysis, and Bio-separation, Volumes 1-5, Flickinger, M.C., Drew, S.W. (eds.), 1999 John Wiley & Sons. Condiţiile tipice de temperatură pot varia între 20°C şi 42°C, mai obişnuit între 30°C şi 40°C şi de preferinţă între 35°C şi 38°C. Mediul de cultură va avea, de regulă, un pH cuprins între 6,5 şi 9,0, mai specific între 7,0 şi 8,0, de ex. 7,5. Fermentarea culturii va continua pe parcursul unei perioade variind de la câteva ore până la câteva zile. În special, dacă cultivarea este efectuată printr-un procedeu periodic, timpul de cultivare variază, de obicei, între 12 ore şi 36 de ore. În cazul utilizării unui procedeu continuu, perioadele de fermentare ar putea dura până la 21 de zile sau mai mult.

În ultima etapă a procedeului, proteina de interferon solubil este obţinută din celula gazdă. De regulă, proteina este izolată din citozolul celulelor gazdă. Celulele pot fi distruse, de ex., cu o presă franceză, prin cicluri repetate de congelare şi decongelare, sau prin prelucrarea cu ultrasunete. Fragmentele celulare pot fi înlăturate uşor din fracţiunea proteică prin centrifugare. Proteinele de interferon solubil pot fi, apoi, purificate de alte componente proteice sau neproteice prin metode standard de cromatografie, inclusiv, de exemplu, cromatografia de excludere dimensională şi/sau cromatografia cu transfer de ioni. De asemenea, pot fi utilizate şi alte metode care sunt, de obicei, aplicate pentru purificarea proteinelor, cum ar fi precipitarea cu sulfat de amoniu şi filtrarea şi/sau dializa. Proteina de interferon exprimată de celula gazdă a invenţiei poate fi purificată, de asemenea, prin purificarea afină cu ajutorul, de ex., a anticorpilor monoclonali sau policlonali ai interferonilor.

Pentru a simplifica purificarea, interferonul obţinut conform procedeului invenţiei poate fi exprimat ca o proteină de fuziune, care cuprinde un marcaj de afinitate ce facilitează legătura proteinei de fuziune printr-un compus ce demonstrează afinitatea de legătură cu marcajul. De ex., marcajul de afinitate poate fi un marcaj de polihistidină ce cuprinde 6-12 reziduuri de histidină care interacţionează în mod specific cu o matriţă chelatică din nichel şi ioni. În mod alternativ, marcajul poate fi glutation-S-transferaza care permite efectuarea purificării pe o matriţă de glutation. Alte marcaje de afinitate sunt bine cunoscute în domeniul dat. Exemple nelimitative de perechi de marcaj de afinitate şi ligand de afinitate includ următoarele: proteina de legare a maltozei (PLM) şi maltoza; avidina şi biotina; Streptag şi streptavidina; epitopul myc şi anticorpul. Dacă marcajul de afinitate este o peptidă sau polipeptidă, un asemenea marcaj poate fi exprimat uşor împreună cu proteina de interferon ca un produs unic al expresiei. Dacă marcajul de afinitate nu este de origine proteică, acesta poate fi ataşat prin reacţii chimice de cuplare. De exemplu, biotina poate fi cuplată chimic cu proteina de fuziune.

De preferinţă, cel puţin 50% de interferon obţinut conform procedeului invenţiei este interferon activ. Mai preferabil, cel puţin 60%, cel puţin 70%, cel puţin 80%, cel puţin 90% sau cel puţin 95% de interferon obţinut conform procedeului invenţiei este interferon activ.

Invenţia se explică cu ajutorul fig. 1-4, care reprezintă:

- fig.1, o comparaţie a nivelurilor de proteine IFNα2a în RHB-T7/pET26b (+) . IFNα2a şi RHB-T7Δgor/pET26b (+). IFNα2a conform determinării cu ajutorul electroforezei în gel de poliacrilamidă în prezenţa dodecilsulfatului de sodiu (SDS-PAGE) până la (t0) şi 3 ore după inducţia cu ajutorul IPTG (t3). Se poate vedea că ambele clone exprimă IFNα2a în cantităţi similare;

- fig. 2, rezultatele unei analize SDS-PAGE a fracţiunilor de proteine solubile şi insolubile de RHB-T7/pET26b (+) . IFNα2a şi RHB-T7Δgor/pET26b (+) . IFNα2a 3 ore după inducţia cu ajutorul IPTG (t3). În timp ce cultura RHB-T7/pET26b (+) . IFNα2a a produs în special interferon insolubil (a treia bandă în panoul din stânga), RHB-T7Δgor/pET26b (+) . IFNα2a a oferit un produs de proteină predominant solubil (a doua bandă în panoul din dreapta);

- fig. 3, comparaţia expresiei IFNα2a în tulpinile RHB-T7Δgor, RHB-T7Δgor/trx şi Origami (DE3), care au fost toate transformate anterior cu vectorul de expresie pET26b (+) . IFNα2a. În panoul A sunt arătate rezultatele după analiza SDS-PAGE. În panoul B sunt arătate rezultatele imunoblotingului şi detectării cu ajutorul chemoluminescenţei. t0: neindusă; t4: indusă timp de 4 ore cu ajutorul IPTG; I; corpuscul de incluziune sau fracţiune insolubilă; C: citozol sau fracţiune solubilă; Ctrl: IFNα2a recombinant (Roferon®); LM: markerul masei moleculare Invitrogen);

- fig. 4, secvenţa de nucleotide care poartă informaţii despre IFNα2a uman care a fost optimizată cu privire la utilizarea-codon pentru expresia recombinantă într-o celulă gazdă E. coli.

EXEMPLE

Invenţia va fi ilustrată în continuare prin următoarele Exemple care sunt prezentate doar pentru exemplificare. În mod specific, Exemplele descriu prepararea unei celule gazdă E. coli cu o genă exogenă de polimerază T7 ARN şi o genă endogenă gor care a fost inactivată prin recombinarea omologă. Exemplele descriu, de asemenea, expresia recombinantă a interferonului uman alfa, beta şi gamma în celula gazdă menţionată E. coli.

Exemplul 1: Prepararea unei tulpini E. coli controlate de T7

O tulpină producătoare E. coli ce conţine o genă genomică de polimerază T7 ARN sub controlul represorului lacI a fost preparată cu ajutorul tehnologiei Red/ET pentru recombinarea omologă (Gene Bridges, Heidelberg, Germania) pornind de la tulpina BL21. Prepararea tulpinii producătoare a inclus următoarele etape:

a) Amplificarea şi clonarea unei casete genetice T7

ADN-ul genomic al BL21-DE3 E. coli (Novagen) a fost preparat cu ajutorul unui set standard (Qiagen, Hilden, Germania). Caseta genetică 4.44 kb la-CUV5-T7 a BL21-DE3 a fost amplificată de reacţia RLP. Caseta ADN-ului conţinea gena lacI, domenii de reglare a operonului lac, o genă parţială lacZ şi gena 1 a fagului T7 E. coli care codifică polimeraza ARN T7. Amestecurile reacţiei RLP conţineau tamponul polimerazei ADN KOD Hot Start, 2 mmoli de MgS04, 200 µmoli dNTPs, polimeraza ADN 1 U KOD Hot Start (Novagen), 10 µmoli de primer direct (λint1), 10 µmoli de primer inversat (λint2) şi 50 ng de matriţă ADN. A fost folosit un amplificator Mastercycler gradient (Eppendorf) cu următoarele setări: denaturare timp de 2 min la 98°C, urmată de 34 cicluri a câte 30 s la 98°C, 30 s la temperatura de hibridare de 60,5°C, şi 2 min de elongaţie la 72°C. Elongaţia finală a fost efectuată timp de 7 min la 72°C.

Au fost utilizaţi următorii primeri:

λint1: GTCCGACTTATGCCCGAGAAGATGTTGAGCAAACTTATCGCTTATC

(SEQ ID NO:6);

λint2: TGCAAAGAGATTCTTGGCGGAGAAACCATAATTGCATCTACTCG

(SEQ ID NO:7);

Produsul obţinut al RLP a fost folosit ulterior în calitate de matriţă pentru reamplificarea în aceleaşi condiţii RLP pentru crearea sait-urilor de restricţionare pentru PstI şi SalI pentru caseta T7. Următorii primeri au fost folosiţi pentru reamplificarea RLP:

PstI-direct: GGAAGCGGGCCTGCAGCGGACACCATCGAATGGCGC (SEQ ID NO:8); şi

SalI -inversat: GGGGGGGGGGGTCGACGGAGTCGTATTGATTTGGCG (SEQ ID NO:9).

În urma analizei de restricţionare şi eluării fragmentului obţinut din gelul de agaroză cu ajutorul setului de extragere a gelului QIAquick (Qiagen, Hilden, Germania) s-a efectuat o reacţie de ligatură (set de ligatură rapidă ADN, Roche) cu o plasmidă pIBD5 dezintegrată cu PstI/SalI (care include un promotor T5, inducibil de IPTG). 100 µl de celule K12 DH10B E. coli au fost transformate prin electroporaţie, după cum este descris în invenţie, plasate pe plăci de geloză LB care conţin kanamicină (Kan) şi cultivate la 37 °C timp de o noapte. O clonă a fost cultivată pe plăci pentru prepararea plasmidei ADN (setul Qiaprep Spin Miniprep; Qiagen), dezintegrată cu PstI/SalI şi inserarea corectă a casetei de polimerază T7-ARN (RNAP) a fost verificată cu electroforeza cu gel de agaroză. Vectorul nou proiectat a fost numit pSI. Gena T7 RNAP în pSI a fost supusă secvenţionării (GATC Biotech AG). Plasmida pSI aprobată a fost utilizată în calitate de matriţă pentru crearea ADN-ului linear pentru etapa de recombinare conform protocolului tehnic al producătorului (Gene Bridges).

b) Prepararea ADN-ului linear pentru recombinarea omologă

Pentru crearea ADN-ului linear pentru recombinare, caseta T7 şi gena de rezistenţă la kanamicină din pSI au fost amplificate cu ajutorul RLP, prin adăugarea braţelor omoloage pe oricare dintre feţele care constituie fragmente de secvenţionare ADN omoloage ADN-ului locusului dorit de integrare genomică, adică locusul recA a E. coli. Amestecurile reacţiei RLP conţineau tamponul polimerazei ADN KOD Hot Start, 2 mmoli MgS04, 200 µmoli dNTPs, 1 U de polimerază ADN KOD Hot Start (Novagen), 10 µmoli de primer direct (5'harecA), 10 µmoli de primer inversat (3'harecA) şi 50 ng de matriţă ADN. A fost folosit un amplificator Mastercycler gradient (Eppendorf) cu următoarele setări: denaturare timp de 2 min la 98°C, urmată de 35 cicluri a câte 30 s la 98°C, 30 s la temperatura de hibridare de 65,5°C, şi 2 min de elongaţie la 72 °C. Elongaţia finală a fost efectuată timp de 7 min la 72 °C. Au fost utilizaţi următorii primeri

5'harecA:

TCGCTATCATCTACAGAGAAATCCGGCGTTGAGTTCGGGTTGCTCAGCAGCTAGATGCATGCTCGAGCGG (SEQ ID NO:10);

3'harecA:

GTAAAGGCTCCATCATGCGCCTGGGTGAAGACCGTTCCATGGATGTGGAACTCTGCTGAAGCCAGTTACC (SEQ ID NO:11).

Produsele RLP au fost purificate cu ajutorul unui set de purificare a RLP QIAquick (Qiagen) şi dezintegrate cu ajutorul a 10 unităţi de DpnI timp de 30 min la temperatura de 37°C.

c) Transformarea celulelor E. coli competente

Celulele E. coli au fost transformate cu ajutorul plasmidei pRed/ET prin electroporaţia celulelor BL21 (Novagen). Aşadar, 1 µl de plasmidă ADN pRed/ET a fost adăugat la o parte alicotă de 50 µl de celule electrocompetente, transferat într-o chiuvetă pentru electroporaţie de 1 mm şi electroporat cu 1350 V cu ajutorul electroporatorului #2510 (Eppendorf). Timpul constant trebuie să fie între 5,0 şi 5,4 ms. S-a adăugat 1 ml de mediu LB răcit în prealabil (1% peptonă de soia, 0,5% extract de drojdii, 1% NaCl, pH 7,0), mostra a fost transferată într-un tub de 1,5 ml şi incubată într-un termoamplificator timp de 1 oră la 30°C şi 800 rpm. 100 µl de suspensie celulară a fost plasată pe geloză LB plus tetraciclină (3 pg/ml), plăcile au fost incubate timp de o noapte la 30°C. O singură colonie a fost luată de pe plăcile de electroporaţie pRed/ET şi a fost incubată timp de o noapte în 1 ml de mediu LB plus tetraciclină la 30°C, prin agitare la 800 rpm. 30 µl din cultura dată s-au transferat în două tuburi ce conţineau 1,4 ml de mediu LB plus antibiotic. Celulele au fost crescute timp de circa 2 ore la 30°C, până când ele au atins densitatea optică (DO) de 0,3. O cultură a fost indusă prin adăugarea a 50 µl de L-arabinoză de 10%, iar cealaltă a fost lăsată neindusă pentru utilizarea în calitate de control negativ. Ambele culturi au fost incubate la 37 °C, 800 rpm, timp de circa 1 oră. Pentru a obţine celule competente, ambele culturi au fost centrifugate la 4°C, 13000 rpm, spălate de două ori cu 1 ml de glicerină de 10% răcită în prealabil şi resuspendate în circa 50 µl de glicerină de 10%.

Aceste culturi au fost apoi transformate cu ajutorul ADN-ului linear (a se vedea mai sus) care conţine T7 şi gena de rezistenţă la kanamicină din pSI, precum şi braţele omologice pentru reombinare. 400…800 ng de fragment linear RLP au fost adăugate atât la celulele induse, cât şi la cele neinduse şi suspensia a fost electroporată la tensiunea de 1350 V. S-a atras atenţia ca volumul mostrei de ADN să nu depăşească 4 µl. S-a adăugat 1 ml de mediu LB rece ca gheaţa şi celulele au fost incubate timp de 3 ore la 37 °C, 800 rpm. După centrifugare celulele au fost suspendate din nou în 100 µl de mediu LB, plasate pe geloză LB plus antibioticul selectat în concentraţia recomandată şi incubate timp de o noapte la 37°C. Au fost identificate două clone. Recombinarea reuşită a casetei în locusul recA în BL21 în aceste clone a fost confirmată de colonia RLP. În urma analizei întregii secvenţe integrate (lacI, ΔlacZ şi gena polimerazei T7 ADN) s-a depistat identitatea absolută cu secvenţa iniţială a acestei regiuni în BL21-DE3. Tulpina nouă a fost desemnată RHB-T7 Kahr.

d) Eliminarea genei de rezistenţă la kanamicină

După cum s-a descris mai sus, tulpina nouă RHB-T7 Kanr conţine o genă de rezistenţă la kanamicină în genomul bacterian. Dat fiind că celulele create prin procesele de recombinare erau destinate utilizării cu vectorii pET, era necesară optimizarea ulterioară pentru evitarea rezistenţei duble (genomică şi episomală). Astfel, gena genomică de rezistenţă la kanamicină a fost distrusă prin inserarea în locusul kanamicinei a unei casete de rezistenţă la cloramfenicol flancată cu FRT prin recombinarea omologă. Ulterior, un alt proces de recombinare controlat de proteina flp a dus la deleţia a circa 60% din gena de rezistenţă la kanamicină. Acest mutant inactivat permite selectarea transformanţilor pET datorită genei epizomale (Kan) de rezistenţă la kanamicină.

Gena de rezistenţă la kanamicină a fost înlăturată din genom după cum urmează: Un produs linear RLP al casetei de rezistenţă la cloramfenicol flancată cu FRT cu fragmente de secvenţionare ADN 5' şi 3' omoloage părţilor genei de rezistenţă la kanamicină, a fost integrat în locusul genomic al kanamicinei în tulpina RHB-T7 Kanr prin recombinarea omologă. În acest scop, a fost utilizată tehnologia Red/ET pentru recombinarea omologă (Gene Bridges, Heidelberg, Germania). Pe scurt, celulele electrocompetente RHB-T7 Kanr au fost transformate cu plasmida pRed/ET conform protocolului producătorului (a se vedea mai sus). Selectarea a fost efectuată pe plăcile de tetraciclină şi clonele pozitive au fost transformate cu ajutorul unui fragment linear RLP care conţinea braţe omologice 5' şi 3' ale secvenţei genetice Kanr şi ale genei de rezistenţă la Cm flancată cu FRT. Transformanţii au fost verificaţi prin analiza RLP pentru a verifica genomul modificat. Şapte clone unice au fost analizate prin metoda coloniei RLP cu privire la inserţia corectă în locusul kanamicinei a RHB-T7 Kanr . Toate cele şapte clone analizate au fost pozitive. Una dintre aceste clone a fost transformată cu ajutorul plasmidei pFLP707 furnizată de compania Gene Bridges. Această plasmidă poartă gena flp a recombinazei sub controlul transcripţional al unui promotor termosensibil, al unei surse termosensibile a replicii şi al genei de rezistenţă la tetraciclină pentru selectarea transformanţilor.

O singură clonă a acestei transformări a fost cultivată la 30°C. O deviere a temperaturii până la 37 °C a indus atât expresia proteinei flp a recombinazei, cât şi pierderea plasmidei pFLP707, inclusiv rezistenţa la tetraciclină. Celulele au fost plasate pe geloză LB şi clonele separate au fost analizate prin colonia RLP cu privire la procesele recombinării pozitive flp.

Trei colonii care poartă caseta de rezistenţă la cloramfenicol flancată cu FRT au fost cultivate într-un microtub cu 1,0 ml de mediu LB şi 15 µg/ml de cloramfenicol. O gaură a fost perforată în capac pentru alimentarea cu aer. Cultura a fost incubată timp de o noapte la temperatura de 37 °C prin agitare la 800 rpm. Un microtub cu 1,4 ml de mediu LB şi 15 µg de cloramfenicol a fost inoculat cu 30 µl de cultură proaspătă nocturnă, incubată timp de 2…3 ore la 37 °C prin agitare la 900 rpm. Celulele au fost centrifugate timp de 30 s la 11 000 rpm într-un microtub răcit, iar supernatantul a fost eliminat prin descărcare. Precipitatul a fost resuspendat în 1 ml de Н2О dd răcită. Centrifugarea şi resuspensia a fost repetată încă o dată. După centrifugare supernatantul a fost descărcat încă o dată şi 20…30 µl au fost lăsate în tub cu precipitatul. Celulele au fost resuspendate şi menţinute permanent pe gheaţă. Electroporaţia a fost efectuată cu 1 µl ADN pFLP707. După incubaţia nocturnă pe plăci de tetraciclină la 30°C, s-a inoculat 1 ml de mediu LB într-o colonie şi s-a incubat la 30 °C timp de 2…3 ore. Temperatura a fost schimbată până la 37 °C şi cultura a fost incubată timp de o noapte. O picătură de suspensie celulară a fost plasată pe geloză LB. După incubarea timp de o noapte la temperatura de 37 °C coloniile unice au fost analizate prin intermediul RLP cu privire la eliminarea cu succes a markerului de selectare cloramfenicol. Suplimentar, coloniile au fost reimprimate atât pe geloză LB, cât şi geloză LB condiţionată cu 15 µg/ml cloramfenicol pentru selectarea clonelor pozitive. Două clone pozitive au fost identificate după pierderea rezistenţei la cloramfenicol. Aceste clone au fost confirmate prin analiza secvenţei zonei genomice respective. Tulpina nouă a fost numită RHB-T7.

Exemplul 2: Distrugerea genei gor

Pentru prepararea celulelor electrocompetente, 20 ml de mediu LB au fost inoculate într-o cultură nocturnă de RHB-T7 pentru a atinge densitatea optică de pornire OD600 de circa 0,1. Celulele au fost crescute la 37 °C până la densitatea optică OD600 de circa 0,6. Cultura a fost centrifugată la 4°C timp de 10 min şi 4600 rpm. Supernatantul a fost eliminat, iar precipitatul a fost resuspendat în 14 ml de glicerină de 10% rece ca gheaţa. După centrifugare (aceleaşi condiţii ca şi cele menţionate mai sus), etapa de spălare a fost repetată. În cele din urmă, precipitatul a fost resuspendat în 700 µl de glicerină de 10%, şi alicote de 50 µl ale suspensiei celulare au fost congelate imediat în azot lichid.

1 µl de plasmidă ADN pRed/ET s-a adăugat la o alicotă de 50 µl a celulelor electocompetente. După amestecare, proba a fost păstrată pe gheaţă. Proba pentru transformare a fost transferată într-o chiuvetă de electroporaţie de 1 mm şi electroporată la 1350 V cu ajutorul electroporatorului #2510 de la compania Eppendorf cu un timp constant între 5,0 şi 5,4 ms. S-a adăugat 1 ml de mediu LB răcit în prealabil, proba a fost transferată într-un tub de 1,5 ml şi incubată într-un termoamplificator timp de 1 oră la 30°C şi 800 rpm. 100 µl de suspensie celulară au fost plasaţi pe geloză LB plus tetraciclină (3 µg/ml) şi plăcile au fost incubate timp de o noapte la 30°C.

O singură colonie a fost luată de pe plăcile de electroporaţie a plasmidei pRed/ET şi incubată timp de o noapte în 1 ml de mediu LB plus tetraciclină la 30°C, prin agitare la 800 rpm. 30 µl din cultura respectivă au fost transferaţi în două tuburi care conţineau 1,4 ml de mediu LB plus antibiotic. Celulele au fost crescute timp de aproximativ 2 ore la 30 °C până la atingerea unei densităţi optice de circa 0,3. O cultură a fost indusă prin adăugarea a 50 µl de L-arabinoză de 10%, iar cealaltă a fost lăsată neindusă şi folosită în calitate de control negativ. Ambele culturi au fost incubate la 37°C, 800 rpm timp de circa o oră. Pentru a obţine celule competente, ambele culturi au fost centrifugate la 4°C, 13 000 rpm, spălate de două ori cu 1 ml de glicerină de 10% răcită în prealabil şi resupendate în circa 50 µl de glicerină de 10%. Aceste celule au fost utilizate pentru transformarea cu un fragment linear RLP ce conţine braţe omoloage 5' şi 3' ale secvenţei genei gor.

Caseta de rezistenţă FRT-Cm-FRT de la compania Gene Bridges (Heidelberg, Germania) a fost folosită ca matriţă pentru distrugerea genei cromozomice gor în RHB-T7 obţinută în Exemplul 1. Reacţiile RLP au fost efectuate cu ajutorul unui amplificator Mastercycler gradient de la compania Eppendorf cu următoarele setări: denaturare iniţială timp de 2 min la 98°C, urmată de 34 cicluri a câte 30 s la 98°C, 30 s la 60°C - temperatura de hibridare, şi 1,5 min de elongaţie la 72 °C. Elongaţia finală a fost efectuată timp de 7 min la 72 °C şi păstrarea a avut loc la 4°C. A fost folosită polimeraza ADN KOD Hot Start (Novagen) şi următorii primeri:

5 ' hagor :

AACGTGCTCGGTAAAAATAACGTTGATGTAATCAAAGGCTTTGCCCGCTTAATTAACCCTCACTAAAGGGCGG (SEQ ID NO:12);

3 'hagor:

GATCGGCCGTGATGGTTTCGCCGTTTACCTCCAGCGTTTTGGCATCAACGTAATACGACTCACTATAGGGCTCG (SEQ ID NO: 13);

Astfel, s-a obţinut 1,5 kb de produs RLP ce conţinea gena de rezistenţă la cloramfenicol flancată de site-urile FRT şi 50 perechi de bază (p.b.) de braţe omoloage gor. Produsele RLP au fost purificate cu un set de purificare QIAquick (Qiagen). 400…800 ng de fragment linear RLP, care conţinea braţe omoloage 5' şi 3' ale secvenţei genei gor şi ale genei de rezistenţă la Cm flacată cu FRT, au fost adăugate atât la celulele induse, cât şi la cele neinduse precum au fost preparate mai sus şi suspensia a fost electroporată cu 1350 V.

Produsul purificat RLP a fost folosit pentru electroporaţia RHB-T7 transformat cu vectorul pRed/ET (Gene-Bridges) şi astfel preparat pentru recombinarea omologă. Procesul de recombinare a dus la integrarea exactă a casetei markerului de rezistenţă în locusul gor al genomului RHB-T7. Distrugerea cu succes a genei gor a fost confirmată prin RLP. S-a atras atenţie la faptul ca volumul probei ADN să nu depăşească 4 µl. S-a adăugat 1 ml de mediu LB rece ca gheaţa şi celulele au fost incubate timp de 3 ore la 37 °C, 800 rpm. După centrifugare, celulele au fost resuspendate în 100 µl de mediu LB, plasate pe geloză LB cu cloramfenicol şi incubate timp de o noapte la 37 °C. Recombinarea cu succes în genom a fost verificată cu ajutorul coloniei RLP. Aceste reacţii RLP, precum şi rezultatele experimentelor de reimprimare au demonstrat că caseta markerului de rezistenţă a fost integrată cu succes. Clonele pozitive au fost transformate cu plasmida pFLP707 (Gene Bridges), precum este descris în Exemplul 1, pentru a iniţia eliminarea markerului de rezistenţă. Pierderea markerului de rezistenţă a fost confirmată prin RLP şi reimprimarea coloniilor.

Integrarea şi fliping-ul au dus la distrugerea cadrului deschis de citire gor şi astfel au creat o tulpină mutantă cu deficienţă de gor. Acest fapt a fost verificat prin analiza de secvenţionare. Cadrul deschis de citire gor în RHB-T7 gor- oferă o proteină trunchiată cu oprirea translaţiei la TAA în poziţia 364-366 (116 triplet al proteinei de tip sălbatic). Secvenţa promotorului T3, site-ul ţintei de recombinare a flipazei (FRT) şi secvenţa promotorului T7 rămân în cromozom după procesul de fliping şi astfel provoacă distrugerea cadrului de citire. Tulpina nouă a fost numită RHB-T7Δgror.

Exemplul 3: Construcţia pET26b(+).IFNα2a

Construcţia vectorului de expresie pET26b(+)IFNα2a s-a efectuat după electroforeza pe gel de agaroză şi eluarea gelului a fragmentului de plasmidă (Invitrogen) Nde/Sal-dezintegrat pET26b(+), precum şi a fragmentului de inserţie IFNα2a Nde/Sal-dezintegrat şi codon-optimizat (pMA0813119, GeneArt). În baza acestor două fragmente izolate de ADN (setul Qiagen minelute pentru extragerea gelului) s-a efectuat o reacţie de ligatură cu ajutorul setului Roche Rapid pentru ligatura ADN. După transformarea celulelor chimic competente DH10B E. coli cu o parte alicotă a amestecului de ligatură, au fost luate colonii separate de pe plăcile LB ce conţineau kanamicină şi au fost cultivate timp de o noapte la 37°C în mediu LB lichid ce conţinea 50 µg/ml de marker selectat. După aceasta, ADN-ul plasmidei a fost izolat din fiecare clonă şi dezintegrat cu ajutorul enzimelor de restricţionare Nde/Sal. Dezintegrarea a dus la obţinerea fragmentului Nde/Sal de circa 550 p.b. în două clone cu un fragment al vectorului de mărime corectă >5000 p.b. Pentru a confirma faptul că clonele cuprind vectorul corect de exprimare pET26b (+)IFNα2a, clona 1 a fost supusă unei dezintegrări mai specifice cu ajutorul diferitor enzime de restricţionare, cum ar fi PstI, BglII, BspHI şi SspI. Rezultatul dezintegrării de restricţionare şi electroforeza cu gelul de agaroză au confirmat numărul şi mărimile corecte ale fragmentelor ADN. Astfel, vectorul de expresie pET26b (+)IFNα2a a fost transformat în celulele competente RHB-T7Δgor şi a dus la obţinerea coloniilor rezistente la kanamicină, dintre care au fost alese cinci la întâmplare pentru inocularea a 3 ml de culturi lichide ce conţineau kanamicină şi pentru păstrarea criomaterialelor corespunzătoare la -80°C.

Exemplul 4: Analiza expresiei IFNα2a

Celulele E. coli din tulpinile RHB-T7 şi RHB-T7Δgor descrise mai sus au fost cultivate până la faza creşterii logaritmice medii. Celulele au fost centrifugate (1 min/16 100 x g/0°C) şi resuspendate în glicerină de 10% rece ca gheaţa şi centrifugate din nou (1 min/16 100 x g/0°C). Această etapă de spălare a fost repetată o singură dată. După a doua spălare celulele au fost resuspendate în 50 µl de glicerină de 10% rece ca gheaţa şi suspensia a fost transferată într-o chiuvetă pentru electroporaţie răcită în prealabil (Spaţiu: 2 mm). În chiuvetă s-a adăugat o alicotă a vectorului de expresie pET26b(+) . IFNα2a şi eletroporaţia s-a efectuat cu un electroporator (Eppendorf AG, Germania) prin aplicarea a 1350 V. După electroporaţie, s-a adăugat 1 ml de mediu LB răcit în prealabil şi suspensia celulară a fost transferată într-un tub proaspăt. După incubarea timp de o oră la 37 °C prin agitare (250 rpm) o alicotă de 50 µl a fost distribuită pe o placă de geloză LB, completată cu 50 µg/ml de kanamicină şi incubată timp de o noapte la 37 °C. Coloniile unice de pe plăcile de transformare au fost preluate şi utilizate pentru inocularea a 3 ml de culturi (mediu LB, completat cu 50 µg/ml de kanamicină). După incubarea timp de o noapte (37°C/250 rpm) materialele primare pentru criopăstrare au fost preparate în felul următor: 1 ml de probă de cultură a fost amestecată cu 0,5 ml de glicerină sterilă rece ca gheaţa de 30% într-un criotub (concentraţia finală a glicerinei de 10%). După îngheţarea materialului în azot lichid (LN2) tuburile au fost păstrate la -80°C.

Clonele obţinute prin transformarea RHB-T7 şi RHB-T7Δgor cu ajutorul vectorului de expresie pET26b (+ ). IFNα2a au fost desemnate ca RHB-T7/pET26b (+) . IFNα2a şi RHB-T7Δgor/pET26b ( + ).IFNα2a, respectiv. Identitatea şi integritatea vectorului de expresie pET26b (+ ) . IFNα2a în diferite clone obţinute prin transformare a fost confirmată prin analiza fragmentării ADN cu ajutorul enzimelor de restricţionare BglII, BspHI, NdeI, PstI, SalI şi SspI.

Cultivarea RHB-T7/pET26b ( + ) .IFNα2a şi RHB-T7Δgor/pET-26b (+).IFNα2a pentru obţinerea IFN s-a început prin inocularea a 3 ml de mediu complex [veg.] (27,0 g/L peptonă vegetală, 14,0 g/L extract de drojdii, 5,0 g/L NaCl, 0,5 g/L MnS04*H20, 25,0 g/L (m/v) glicerină, 8,65 g/L K2HP04, 6,85 g/L KH2PO4; pH 7,0 ±0,1) din criomateriale. La mediu s-a adăugat 50 µg/ml de kanamicină. Culturile au fost incubate la 37 °C, 250 rpm timp de o noapte. 15 ml de culturi de expresie au fost iniţiate cu ajutorul alicotelor de 3 ml de culturi nocturne pentru a atinge densitatea optică de pornire DO600 0,1 în 15 ml de mediu complex [veg.] fără antibiotice într-un flacon vibrator cu despărţituri la 37°C, 250 rpm. După atingerea fazei creşterii logaritmice medii cu densitatea optică OD600 0,5 - 0,8, s-a adăugat IPTG (concentraţia finală de 1 mm) şi culturile au fost cultivate încă 3 ore. 1 ml de probe de culturi au fost preluate imediat înainte de (t0) şi 3 ore după (t3) inducţia IPTG.

Probe de culturi de 1 µl au fost centrifugate (1 min/16 100 x g/0°C). Reziduurile celulare au fost resuspendate în 4 ml de tampon Tris-EDTA (pH 7,4), transferate într-un tub de sticlă (diametrul interior de 22 mm) şi plasate într-o baie cu gheaţă. Fracţionarea celulelor s-a efectuat cu ajutorul dispozitivului cu ultrasunete UP 400S (Hielscher Ultrasonic GmbH; caracteristicile: 400W, 24 kHz) echipat cu sonda H3. Setările tehnice: adâncimea scufundării: aprox. 15 mm; capacitatea: 75%; ciclu: 30 s, distrugere cu ultrasunet - 30 s întrerupere; perioada totală de prelucrare: 10 min. După aceasta, proba a fost transferată într-un tub de 15 ml de tip Falcon şi centrifugată (30 min/4080 x g/4°C). Fracţiunea proteinei insolubile a format un reziduu. Supernatantul ce conţinea proteine solubile a fost transferat într-un tub de 15 ml de tip Falcon, la care s-au adăugat 600 µl de acid tricloracetic de 100% (concentraţia finală: 15%) şi s-a incubat timp de o oră la 4°C înainte de centrifugare (30 min/4 080 x g/4°C). Reziduul din etapa dată reprezintă fracţiunea proteinei solubile. Ambele reziduuri au fost solubilizate şi ajustate până la o densitate optică de DO600 = 10 prin adăugarea tamponului IB (8 moli uree, 50 mmoli DTT, 100 mmoli Tris-HCl; pH 8,0). O etapă de standardizare până la densitatea optică de DO600 = 10 a făcut posibilă compararea directă a cantităţilor relative de proteine în diferite benzi de curgere a gelului. Pentru estimarea indicilor de producere a proteinelor era necesar de luat în considerare DO600 măsurată eficient a culturii analizate.

Proteina totală celulară (TCP) şi fracţiunile proteinelor solubile şi insolubile au fost supuse SDS-PAGE cu colorarea cumasi. Pentru toate curgerile de gel SDS-PAGE au fost utilizate geluri pre-turnate NuPAGE® Novex® 12% Bis-Tris (Invitrogen, Karlsruhe, Germania) în combinaţie cu sistemul corespunzător XCell SureLock Mini-Cells (Invitrogen). Conform mărimii IFNα2a recombinant (19 kDa), a fost aplicat un sistem de tampon MES (Invitrogen) pentru a atinge cea mai bună dizolvare a gelului. Toate probele au fost dizolvate în 0,25 vol. de tampon LDS (Invitrogen), substituit cu 0,1 vol. de agent reducător Sample Reducing Agent (Invitrogen), şi au fost încălzite timp de 10 min până la 95 °C înainte de a fi încărcate pe gel. Pentru colorarea cumasi s-a folosit sistemul Bio-Safe Coomassie Stain (Bio-Rad, Munich, Germania) conform recomandărilor furnizorului. Probele pentru analiză cu ajutorul staţiei de electroforeză (Experion, Bio-Rad Laboratories, Hercules, SUA) au fost prelucrate conform instrucţiunii producătorului pentru condiţiile reducătoare (Instrucţiuni de utilizare la setul de analiză Experion Pro260) şi încărcate pe un chip Experion Pro260 (Bio-Rad). Înregistrarea şi analiza ulterioară a datelor a fost efectuată cu ajutorul instrumentului de lucru cu sistemul Softul Experion şi analiza datelor (Bio-Rad, Versiunea 3.0.226.0).

Rezultatele: 3 ore după inducţie atât RHB-T7/pET26b(+).IFNα2a, cât şi RHB-T7Δgor/pET2 6b(+).IFNα2a au demonstrat benzi proeminente de proteine aprox. de 19 kDa în analiza SDS-PAGE (masa moleculară aşteptată a IFNα2a uman este aprox. de 18,8 kDa). Banda de proteine a fost detectată exclusiv în culturile induse cu IPTG, ceea ce denotă că expresia în ambele clone este intens controlată (a se vedea fig. 1). Analiza imunoblotului cu ajutorul unui anticorp faţă de IFNα2a a confirmat că bandă de proteină supravegheată în SDS-PAGE era IFNα2a (datele nu sunt arătate). O comparaţie a intensităţilor benzilor de proteine în SDS-PAGE RHB-T7/pET26b (+).IFNα2a şi RHB-T7Δgor/pET2 6b(+).IFNα2a a arătat că ambele clone exprimă proteina de interferon în cantităţi similare (a se vedea fig. 1).

În timpul analizei fracţiunilor proteinelor solubile şi insolubile ale clonelor, s-a constatat că în RHB-T7/pET26b (+).IFNα2a, IFNα2a recombinant este aproape complet prezent în corpusculii de incluziune. În mod contrar, în RHB-T7Δgor/pET26b(+).IFNα2a, IFNα2a produs era aproape complet solubil (a se vedea fig. 2).

Exemplul 5: Analiza expresiei IFN-β şi IFN-γ

Conform metodelor descrise în Exemplele 3-4, IFN-β uman şi IFN-γ uman au fost clonaţi într-un vector de expresie pET26b(+). Plasmidele rezultate pET26b(+).IFN-β şi pET26b(+).IFN-γ au fost transformate în tulpinile RHB-T7Δgor şi RHB-T7.

Rezultatele: Similar rezultatelor observate mai sus în cazul IFNα2a, se poate arăta că în RHB-T7 atât IFN-β uman, cât şi IFN-γ uman au fost produşi, în principal, în formă de corpusculi de incluziune, pe când în RHB-T7Δgor, cel puţin circa 90% de proteină recombinantă a fost exprimată în formă solubilă (datele nu sunt arătate).

Exemplul 6: Analiza expresiei comparative a IFNα2a

Tulpina RHB-T7Δgor preparată conform Exemplului 2 a fost apoi utilizată pentru a crea o tulpină dublă inactivată trxB-/gor-. Mutaţia inactivatoare în gena trxB a fost obţinută esenţial după cum s-a discutat mai sus în Exemplul 2 în legătură cu gena gor. Următorii primeri au fost utilizaţi pentru inactivarea genei trxB:

5' hatrx:

5'- CACCAAGTTTGAAACTGAGATCATTTTTGATCATATCAACAAGGTGGATCAATTAA CCCTCACTAAAGGGCGG-3' (SEQ ID NO:14);

3' hatrx:

5'-GCAAGTGTATTCGCCGTTATCGCCATTCAGACGGAACGGACGGTTTTGCATAATACGA CTCACTATAGGGCTCG-3' (SEQ ID NO:15);

Tulpina rezultată a fost desemnată RHB-T7Δgor/trx. După cum s-a explicat mai sus, tulpinile dublu inactivate trxB-/gor- pot creşte doar dacă ele prezintă o mutaţie în ahpC*. De aceea, în RHB-T7Δgor/trx descris în prezenta invenţie, mutaţia supresoare ahpC* a fost atinsă prin recombinarea omologă. O asemenea mutaţie nu a fost necesară în tulpina RHB-T7Δgor.

Atât RHB-T7Δgor, cât şi RHB-T7Δgor/trx au fost transformate cu ajutorul a 100 ng ADN pET26b(+)IFNα2a, ceea ce a dus la obţinerea tulpinilor RHB-T7Δgor/pET26b(+).IFNα2a şi, respectiv, RHB-T7Δgor/trx-pET26b(+).IFNα2a.

În mod similar, celulele competente Origami(DE3) (Novagen) au fost transformate cu ajutorul a 100 ng ADN pET26b(+)IFNα2a şi incubate timp de o noapte la 37 °C pe plăci selective de geloză LB, fie cu 50 µg/ml sau 150 µg/ml kanamicină. Pe placa cu 150 µg/ml au fost găsite 20 de colonii, în timp ce pe placa cu 50 µg/ml au crescut ≥500 colonii. Prepararea ADN-ului plasmidei (setul Qiagen miniprep) şi dezintegrarea ulterioară de restricţionare a trei clone independente luate de pe placa cu 150 µg/ml a arătat că toate trei clone purtau vectorul de expresie pET26(+).IFNα2a. O clonă a fost selectată pentru următoarele experimente de expresie (Origami (DE3)/pET26b(+)IFNα2a.

Analiza de expresie şi etapele ulterioare de fracţionare, SDS-PAGE a proteinei recombinante IFNα2a şi de detectare imunoblot au fost efectuate conform metodelor descrise în exemplele 3-4.

Rezultatele: S-a observat că în toate tulpinile testate cea mai mare parte a proteinei exprimate recombinant IFNα2a a fost produsă în fracţiunea solubilă. Doar cantităţi mici de proteină au fost detectate în corpusculii de incluziune. În mod interesant, cantităţile de proteină solubilă IFN-α2a erau semnificativ mai mari în RHB-T7Δgor-pET26b(+).IFNα2a în comparaţie cu RHB-T7Δgor/trx-pET26b (+) . IFNα2a sau Origami (DE3)/pET26b (+).IFNα2a. Cantităţile detectate în RHB-T7Δgor/trx-pET26b (+) . IFNα2a erau mai mari decât în Origami (DE3) /pET26b (+).IFNα2a (a se vedea fig. 3).

LISTA SUCCESIUNII

<110> Richter-Helm BioTech GmbH & Co. KG

<120> EXPRESIA RECOMBINANTĂ A INTERFERONULUI SOLUBIL

<130> P 87785

<160> 15

<170> Patent In version 3.3

<210> 1

<211> 166

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 1

Met Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu

1 5 10 15

Met Leu Leu Ala Gln Met Arg Lys Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys

20 25 30

Asp Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe

35 40 45

Gln Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Ile

50 55 60

Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr

65 70 75 80

Leu Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu

85 90 95

Glu Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val Thr Glu Thr Pro Leu Met

100 105 110

Lys Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr

115 120 125

Leu Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val

130 135 140

Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu

145 150 155 160

Ser Leu Arg Ser Lys Glu

165

<210> 2

<211> 187

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 2

Met Thr Asn Lys Cys Leu Leu Gln Ile Ala Leu Leu Leu Cys Phe Ser

1 5 10 15

Thr Thr Ala Leu Ser Met Ser Tyr Asn Leu Leu Gly Phe Leu Gln Arg

20 25 30

Ser Ser Asn Phe Gln Cys Gln Lys Leu Leu Trp Gln Leu Asn Gly Arg

35 40 45

Leu Glu Tyr Cys Leu Lys Asp Arg Met Asn Phe Asp Ile Pro Glu Glu

50 55 60

Ile Lys Gln Leu Gln Gln Phe Gln Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr Ile

65 70 75 80

Tyr Glu Met Leu Gln Asn Ile Phe Ala Ile Phe Arg Gln Asp Ser Ser

85 90 95

Ser Thr Gly Trp Asn Glu Thr Ile Val Glu Asn Leu Leu Ala Asn Val

100 105 110

Tyr His Gln Ile Asn His Leu Lys Thr Val Leu Glu Glu Lys Leu Glu

115 120 125

Lys Glu Asp Phe Thr Arg Gly Lys Leu Met Ser Ser Leu His Leu Lys

130 135 140

Arg Tyr Tyr Gly Arg Ile Leu His Tyr Leu Lys Ala Lys Glu Tyr Ser

145 150 155 160

His Cys Ala Trp Thr Ile Val Arg Val Glu Ile Leu Arg Asn Phe Tyr

165 170 175

Phe Ile Asn Arg Leu Thr Gly Tyr Leu Arg Asn

180 185

<210> 3

<211> 166

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 3

Met Lys Tyr Thr Ser Tyr Ile Leu Ala Phe Gln Leu Cys Ile Val Leu

1 5 10 15

Gly Ser Leu Gly Cys Tyr Cys Gln Asp Pro Tyr Val Lys Glu Ala Glu

20 25 30

Asn Leu Lys Lys Tyr Phe Asn Ala Gly His Ser Asp Val Ala Asp Asn

35 40 45

Gly Thr Leu Phe Leu Gly Ile Leu Lys Asn Trp Lys Glu Glu Ser Asp

50 55 60

Arg Lys Ile Met Gln Ser Gln Ile Val Ser Phe Tyr Phe Lys Leu Phe

65 70 75 80

Lys Asn Phe Lys Asp Asp Gln Ser Ile Gln Lys Ser Val Glu Thr Ile

85 90 95

Lys Glu Asp Met Asn Val Lys Phe Phe Asn Ser Asn Lys Lys Lys Arg

100 105 110

Asp Asp Phe Glu Lys Leu Thr Asn Tyr Ser Val Thr Asp Leu Asn Val

115 120 125

Gln Arg Lys Ala Ile His Glu Leu Ile Gln Val Met Ala Glu Leu Ser

130 135 140

Pro Ala Ala Lys Thr Gly Lys Arg Lys Arg Ser Gln Met Leu Phe Arg

145 150 155 160

Gly Arg Arg Ala Ser Gln

165

<210> 4

<211> 504

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 4

atgtgcgatc tgccgcagac ccatagcctg ggcagccgtc gtaccctgat gctgctggcc 60

cagatgcgta aaattagcct gtttagctgc ctgaaagatc gtcatgattt tggctttccg 120

caggaagaat ttggcaacca gtttcagaaa gcggaaacca ttccggtgct gcatgaaatg 180

attcagcaga tcttcaacct gtttagcacc aaagatagca gcgcggcgtg ggatgaaacc 240

ctgctggata aattctatac cgaactgtat cagcagctga acgatctgga agcgtgcgtg 300

attcagggcg tgggcgtgac cgaaaccccg ctgatgaaag aagatagcat tctggccgtg 360

cgtaaatatt ttcagcgcat caccctgtat ctgaaagaaa aaaaatatag cccgtgcgcg 420

tgggaagtgg tgcgtgcgga aattatgcgt agctttagcc tgagcaccaa cctgcaggaa 480

agcctgcgta gcaaagaata ataa 504

<210> 5

<211> 1353

<212> DNA

<213> Escherichia coli

<400> 5

atgactaaac actatgatta catcgccatc ggcggcggca gcggcggtat cgcctccatc 60

aaccgcgcgg ctatgtacgg ccagaaatgt gcgctgattg aagccaaaga gctgggcggc 120

acctgcgtaa atgttggctg tgtgccgaaa aaagtgatgt ggcacgcggc gcaaatccgt 180

gaagcgatcc atatgtacgg cccggattat ggttttgata ccactatcaa taaattcaac 240

tgggaaacgt tgatcgccag ccgtaccgcc tatatcgacc gtattcatac ttcctatgaa 300

aacgtgctcg gtaaaaataa cgttgatgta atcaaaggct ttgcccgctt cgttgatgcc 360

aaaacgctgg aggtaaacgg cgaaaccatc acggccgatc atattctgat cgccacaggc 420

ggtcgtccga gccacccgga tattccgggc gtggaatacg gtattgattc tgatggcttc 480

ttcgcccttc ctgctttgcc agagcgcgtg gcggttgttg gcgcgggtta catcgccgtt 540

gagctggcgg gcgtgattaa cggcctcggc gcgaaaacgc atctgtttgt gcgtaaacat 600

gcgccgctgc gcagcttcga cccgatgatt tccgaaacgc tggtcgaagt gatgaacgcc 660

gaaggcccgc agctgcacac caacgccatc ccgaaagcgg tagtgaaaaa taccgatggt 720

agcctgacgc tggagctgga agatggtcgc agtgaaacgg tggattgcct gatttgggcg 780

attggtcgcg agcctgccaa tgacaacatc aacctggaag ccgctggcgt taaaactaac 840

gaaaaaggct atatcgtcgt cgataaatat caaaacacca atattgaagg tatttacgcg 900

gtgggcgata acacgggtgc agtggagctg acaccggtgg cagttgcagc gggtcgccgt 960

ctctctgaac gcctgtttaa taacaagccg gatgagcatc tggattacag caacattccg 1020

accgtggtct tcagccatcc gccgattggt actgttggtt taacggaacc gcaggcgcgc 1080

gagcagtatg gcgacgatca ggtgaaagtg tataaatcct ctttcaccgc gatgtatacc 1140

gccgtcacca ctcaccgcca gccgtgccgc atgaagctgg tgtgcgttgg atcggaagag 1200

aagattgtcg gtattcacgg cattggcttt ggtatggacg aaatgttgca gggcttcgcg 1260

gtggcgctga agatgggggc aaccaaaaaa gacttcgaca ataccgtcgc cattcaccca 1320

acggcggcag aagagttcgt gacaatgcgt taa 1353

<210> 6

<211> 46

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> primer

<400> 6

gtccgactta tgcccgagaa gatgttgagc aaacttatcg cttatc 46

<210> 7

<211> 44

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> primer

<400> 7

tgcaaagaga ttcttggcgg agaaaccata attgcatcta ctcg 44

<210> 8

<211> 36

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> primer

<400> 8

ggaagcgggc ctgcagcgga caccatcgaa tggcgc 36

<210> 9

<211> 36

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> primer

<400> 9

gggggggggg gtcgacggag tcgtattgat ttggcg 36

<210> 10

<211> 70

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> primer

<400> 10

tcgctatcat ctacagagaa atccggcgtt gagttcgggt tgctcagcag ctagatgcat 60

gctcgagcgg 70

<210> 11

<211> 70

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> primer

<400> 11

gtaaaggctc catcatgcgc ctgggtgaag accgttccat ggatgtggaa ctctgctgaa 60

gccagttacc 70

<210> 12

<211> 73

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> primer

<400> 12

aacgtgctcg gtaaaaataa cgttgatgta atcaaaggct ttgcccgctt aattaaccct 60

cactaaaggg cgg 73

<210> 13

<211> 74

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> primer

<400> 13

gatcggccgt gatggtttcg ccgtttacct ccagcgtttt ggcatcaacg taatacgact 60

cactataggg ctcg 74

<210> 14

<211> 73

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> primer

<400> 14

caccaagttt gaaactgaga tcatttttga tcatatcaac aaggtggatc aattaaccct 60

cactaaaggg cgg 73

<210> 15

<211> 74

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> primer

<400> 15

gcaagtgtat tcgccgttat cgccattcag acggaacgga cggttttgca taatacgact 60

cactataggg ctcg 74

1. Barbara Maertens, Anne Spriestersbach, Uritza von Groll, Udo Roth, Jan Kubicek, Michael Gerrits, Marcus Graf, Michael Liss, Daniela Daubert, Ralf Wagner and Frank Schafer. Gene optimization mechanisms: A multi-gene study reveals a high success rate of full-length human proteins expressed in Escherichia coli. Protein Sci., 2010, p. 1312-1326

Claims (14)

1. Celulă gazdă pentru expresia recombinantă a unei proteine de interferon provenite de la mamifere, unde celula menţionată cuprinde o genă endogenă funcţională trxB, o genă endogenă inactivată gor şi o secvenţă de polinucleotide care codifică o proteină exogenă de interferon.

2. Celulă gazdă conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că secvenţa de polinucleotide menţionată este inclusă într-un vector de expresie.

3. Celulă gazdă conform revendicării 1 sau 2, caracterizată prin aceea că interferonul menţionat este selectat din grupul ce constă din interferonul alfa, interferonul beta şi interferonul gamma sau dintr-un fragment activ al acestora.

4. Celulă gazdă conform revendicării 3, caracterizată prin aceea că proteina de interferon menţionată este o proteină a interferonului uman sau un fragment biologic activ al acesteia.

5. Celulă gazdă conform revendicării 4, caracterizată prin aceea că proteina de interferon menţionată este interferonul uman α2a sau un fragment biologic activ al acestuia.

6. Celulă gazdă conform revendicărilor 1-5, caracterizată prin aceea că celula gazdă menţionată reprezintă o celulă bacteriană.

7. Celulă gazdă conform revendicării 6, caracterizată prin aceea că celula bacteriană menţionată reprezintă o celulă de Escherichia coli.

8. Celulă gazdă conform revendicării 7, caracterizată prin aceea că celula bacteriană menţionată de Escherichia coli a fost obţinută din tulpina BL21Escherichia coli.

9. Celulă gazdă conform revendicărilor 1-8, caracterizată prin aceea că celula bacteriană menţionată cuprinde gena polimerazei T7 ARN.

10. Celulă gazdă conform revendicării 9, caracterizată prin aceea că gena polimerazei T7 ARN este inserată în genomul celulei gazdă.

11. Procedeu de expresie recombinantă a unui interferon solubil într-o celulă gazdă ce cuprinde: (a) oferirea unei celule gazdă conform oricărei dintre revendicările 1-10; (b) cultivarea celulei gazdă în condiţii ce permit expresia proteinei de interferon; (c) obţinerea proteinei solubile de interferon din celula gazdă.

12. Procedeu conform revendicării 11, caracterizat prin aceea că etapa (c) cuprinde dezagregarea celulelor gazdă.

13. Procedeu conform revendicării 12, caracterizat prin aceea că etapa (c) cuprinde suplimentar purificarea proteinei prin cromatografie.

14. Utilizarea unei celule gazdă conform oricărei dintre revendicările 1-10 pentru expresia recombinantă a unui interferon solubil.