MD4626C1

MD4626C1 - Derivaţi de tamoxifen pentru tratamentul afecţiunilor neoplazice, în special cu nivel înalt de proteină HER2

Info

Publication number: MD4626C1
Application number: MD20150117A
Authority: MD
Inventors: Jan Štursa; Lukáš Werner; Jiří Neužil
Original assignee: Smart Brain Sro; Biotechnologicky Ustav Av Cr V V I; Neuzil Jiri; Kkcg Ag
Priority date: 2013-04-24
Filing date: 2014-04-07
Publication date: 2019-11-30
Also published as: US9896466B2; CA2909994C; PL2989110T3; MD4626B1; JP6375091B2; HUE042239T2; ES2699099T3; GEP20186868B; AU2014256546A1; HRP20181872T1; GEAP201813996A; JP2016522179A; DK2989110T3; CN105452265B; PT2989110T; WO2014173374A1; EP2989110B1; MD20150117A2; EP2989110A1; EA029881B1

Abstract

Prezenta invenţie se referă la noi izomeri E/Z direcţionaţi mitocondrial ai derivaţilor de trifenilfosfoniu alifatic ai tamoxifenului, în care lanţul alifatic este alchil sau alchenil, şi la sărurile aminice terţiare corespunzătoare ale acestora, şi/sau la amestecurile acestora (MitoTax). Derivaţii de alchil trifenilfosfoniu ai tamoxifenului au formula generală (I):I,în care n = 8…12 şi Z este selectat dintr-o grupă de săruri organice sau anorganice.Derivaţii de alchenil trifenilfosfoniu ai tamoxifenului au formula generală IA:IA,în care n = 6…10 şi Z are semnificaţiile definite mai sus.Aceşti compuşi sunt aplicabili pentru tratamentul bolilor neoplazice, în special al celor cu niveluri înalte de proteină HER2. Medicamentul pentru tratamentul bolilor neoplazice, conform prezentei invenţii, conţine cel puţin un izomer E/Z al derivaţilor de trifenilfosfoniu alifatic ai tamoxifenului cu formula generală (I) şi/sau IA, sau sărurile lor corespunzătoare ale aminelor terţiare.

Description

Invenţia se referă la noi derivaţi ai tamoxifenului direcţionaţi mitocondrial pentru tratamentul bolilor neoplazice, în special al tumorilor cu nivel înalt de proteină HER2 (receptorul 2 al factorului de creştere epidermal uman), care influenţează divizionarea spontană a celulelor şi creşterea tumorilor.

Progresele recente în medicina moleculară au condus la anumite îmbunătăţiri în diagnosticul şi tratamentul bolilor neoplazice. În pofida acestui succes parţial, aceste patologii rămân o provocare considerabilă. Pentru anumite tipuri de cancer, terapia curentă în unele cazuri nu se poate realiza dintr-o serie de motive. Pe de o parte, aceasta este rezistenţa inerentă a celulelor tumorale, abilitatea lor de mutaţie constantă şi eschivarea de la tratament, pe de altă parte, este, de asemenea, eterogenitatea mediului tumorii (Douglas Hanahan şi Robert A. Weinberg. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell, 2011, vol. 144, p. 646-674). A fost demonstrat, că la subiecţi individuali tumorile de acelaşi tip sunt extrem de diferite din punctul de vedere al profilului lor genomic (Jones S et al. Core signaling pathways in human pancreatic cancers revealed by global genomic analyses. Science, 2008, vol. 321, p. 1801-1806; Parsons DW et al. An integrated genomic analysis of human glioblastoma multiforme. Science, 2008, vol. 321, p. 1807-1812), ceea ce indică necesitatea unei aşa-numite terapii "personale". Anume o problemă mai mare este eterogenitatea mutaţiilor în aceeaşi tumoare, aşa cum a fost demonstrat recent pentru tumorile renale (Marco Gerlinger et al. Intratumor Heterogeneity and Branched Evolution Revealed by Multiregion Sequencing. The New England Journal of Medicine, 2012, vol. 366, p. 883-892) şi această situaţie poate fi aşteptată, de asemenea, pentru alte tipuri de tumori. Din acest motiv, este necesar pentru a căuta noi abordări şi a unui punct(e) invariabil(e) de intervenţie comună pentru toate sau pentru cele mai multe dintre celulele maligne din tumori şi care, de preferinţă, afectează funcţiile esenţiale ale celulelor canceroase. Se pare că un astfel de punct de intervenţie ar putea fi mitocondriile, adică organele care sunt fundamentale pentru generarea de energie necesară pentru toate procesele fiziologice, precum şi patofiziologice, în celule. Deşi celulele tumorale utilizează, în mare parte, aşa-numita glicoliză aerobă pentru generarea de energie, respiraţia mitocondrială (de exemplu, consumul de oxigen legat de formarea ATP) este inerentă în majoritatea (dacă nu în toate) tipurile de tumori (Stephen J. Ralph et al. The causes of cancer revisited: “Mitochondrial malignancy” and ROS-induced oncogenic transformation - Why mitochondria are targets for cancer therapy. Molecular Aspects of Medicine. 2010, vol. 31, nr. 2, p. 145-170).

O grupă de substanţe cu activitate anticanceroasă a fost definită ca "mitocan" (derivat de la "mitocondrii şi cancer") (Jiri Neuzil et al. Molecular mechanism of 'mitocan'‐induced apoptosis in cancer cells epitomizes the multiple roles of reactive oxygen species and Bcl‐2 family proteins. FEBS Letters, 2006, vol. 580, p. 5125-5129; Jiri Neuzil et al. Classification of mitocans, anti-cancer drugs acting on mitochondria. Mitochondrion, 2013, vol. 13, p. 199-208). Aceste substanţe sunt împărţite în mai multe grupe în funcţie de mecanismul molecular al activităţii lor. Acestea sunt: (1) inhibitori de hexokinază; (2) agenţi de ţintire a proteinelor din familia Bcl-2; (3) agenţi de reducere-oxidare activi, care acţionează ca inhibitori de tiol; (4) agenţi de ţintire a proteinelor VDAC şi ANT; (5) agenţi de ţintire a lanţului de reducere-oxidare de electroni; (6) agenţi lipofilici de ţintire a membranei mitocondriale interne; (7) agenţi de ţintire a ciclului Krebs; (8) agenţi de ţintire a ADN mitocondrial; (9) agenţi care nu aparţin nici unei dintre aceste grupe. Exemple de astfel de agenţi şi ţinte ale acestora sunt prezentate în fig. 1.

Cancerul mamar este o boala neoplazică, tratamentul căreia este foarte dificil şi care este în prezent diagnosticat la una din opt femei pe parcursul vieţii. Tratamentul cancerului mamar, de obicei, se bazează pe terapia cu tamoxifen (TAX). Aproximativ 30% dintre pacientele cu cancer mamar sunt diagnosticate cu un nivel înalt de proteină HER2, care face parte din grupa receptorului tirozinkinazelor şi care sporeşte capacitatea proliferativă a celulelor, crescând potenţialul lor malign (Arteaga CL et al. Treatment of HER2-positive breast cancer: current status and future perspectives. Nat Rev Clin Oncol, 2011, vol. 9, p. 16-32). Terapia stabilită (în cazul, în care medicamentul principal utilizat este TAX) este ineficientă, deoarece tumorile, oferind un nivel ridicat de HER2, sunt destul de rezistente la această terapie. TAX afectează receptorii de estrogen din membrana plasmatică a celulelor canceroase de sân, prin care inhibă procesele importante legate de capacitatea de proliferare a celulelor canceroase. În publicaţii recente s-a comunicat, că în concentraţii mai mari TAX acţionează nu numai prin intermediul receptorului de estrogen, dar, de asemenea, se mută la membrana mitocondrială internă, unde interacţionează cu complexul I al lanţului respirator [1]. Aceasta se produce, totuşi, la doze care nu sunt uşor realizabile din punct de vedere farmacologic. În plus, este posibil de a aştepta o toxicitate crescută a TAX în cazul unor astfel de doze mari.

În prezent cancerul mamar cu conţinut înalt de proteină HER2 este tratat cu "trastuzumab" anticorp umanizat, care inhibă activitatea HER2. Aceasta terapie este din punct de vedere economic extrem de exigentă şi are o toxicitate secundară; în plus un procent mare de subiecţi cu un nivel înalt de proteină HER2 sunt rezistenţi la trastuzumab (se estimează a fi de aproximativ 30%). Mai degrabă o provocare este, de asemenea, introducerea recentă a medicamentului lapatinib, care inhibă receptorul tirozinkinazelor (Ewer MS, Ewer SM. Cardiotoxicity of anticancer treatments: what the cardiologist needs to know. Nat Rev Cardiol, 2010, vol. 7, p. 564-575; Lin SX et al. Molecular therapy of breast cancer: progress and future directions. Nat Rev Endocrinol, 2010, vol. 6, p. 485-493; Ahn ER et al. ls the improved efficacy of trastuzumab and lapatinib combination worth the added toxicity? Breast Cancer, 2012, vol. 6, p. 191-207). O problemă în acest context este că lapatinibul nu este un inhibitor HER2 specific, ceea ce poate conduce, de asemenea, la inhibarea altui receptor de tirozinkinaze şi la o toxicitatea secundară, şi aceasta posibil, de asemenea, să anticipeze dezvoltarea rezistenţei la aceasta terapie (Wetterskog D et al. Identification of novel determinants of resistance to lapatinib in ERBB2-amplified cancers. Oncogene, 2013, p. 1-11).

Din motivele menţionate a fost proiectată şi sintetizată o grupă de agenţi eficienţi împotriva tumorilor cu un nivel înalt de proteină HER2, care vizează în mod direct mitocondriile şi care poate depăşi complicaţiile menţionate. Aceste dezavantaje asociate cu tamoxifenul (TAX) sunt eliminate prin unirea cu un trifenilfosfoniu printr-un lanţ alifatic (denumit în continuare MitoTAX), în care lanţul este alchil sau alchenil şi sărurile amine terţiare corespunzătoare ale acestora sunt selectate din grupa de săruri organice, cum ar fi de citrat, acetat, lactat, tartrat, oxalat, ascorbat, mesilat, tosilat sau de săruri anorganice, cum ar fi de sulfat, halogenură, fosfat şi/sau amestecuri ale acestora, derivaţi de alchil trifenilfosfoniu ai tamoxifenului cu formula generală I,

în care n = 8 până la 12 şi în care Z este selectat din grupa de săruri organice, cum ar fi de citrat, acetat, lactat, tartrat, oxalat, ascorbat, mesilat, tosilat sau de săruri anorganice, cum ar fi, de exemplu, de sulfat, halogenură, fosfat şi în care legătura dublă a trecut în formula generală I, situată în fragmentul TAX, indicând că legătura dublă poate avea configuraţia E şi/sau Z,

şi derivaţii de alchenil trifenilfosfoniu ai tamoxifenului au formula generală IA,

IA

în care n = 6 până la 10 şi în care Z are semnificaţia, definită mai sus, şi în care legătura dublă a trecut în formula generală IA, situată în catena laterală, indicând că legătura dublă poate avea configuraţia E şi/sau Z.

Metoda de preparare a derivaţilor de alchil trifenilfosfoniu ai tamoxifenului cu formula generală I se bazează pe o reacţie de ilidă generată de tert-butildimetilsilil-oxi-alchil-trifenilfosfoniu cu formula generală II,

în care n = 5 până la 9

şi X reprezintă I, Br, Cl sau mesil,

prin tratarea unei baze organice (de preferinţă, butil litiu) în tetrahidrofuran (THF) într-o atmosferă de argon la temperatura de -78°C şi condensarea ulterioară cu aldehidă cu formula III,

rezultând un derivat sililat cu formula generală IV,

în care n = 5 până la 9.

Derivatul sililat cu formula generală IV este tratat cu fluorură de tetrabutilamoniu, se obţine alchenol cu formula generală V,

în care n = 5 până la 9,

care este redus într-o atmosferă de hidrogen în prezenţa unui catalizator până la alcoolul cu formula generală VI,

în care n = 5 până la 9,

alcoolul cu formula generală VI este substituit până la derivatul corespunzător cu formula generală VII,

în care n = 5 până la 9

şi X reprezintă I, Br, Cl sau mesil,

care este transformat în derivatul de alchil-trifenilfosfoniu al tamoxifenului, direcţionat mitocondrial, cu formula generală I, prin încălzirea împreună cu trifenilfosfină.

Alchenolul cu formula generală V poate fi preparat, de asemenea, direct din aldehida III prin reacţia cu o bromură de (hidroxialchil)trifenilfosfoniu corespunzătoare prin tratare cu bază (este potrivit litiu-hexametildisilazanul) la temperatura camerei şi într-un amestec de THF şi dimetilsulfoxid (DMSO), care măreşte solubilitatea bromurii de (hidroxialchil)trifenilfosfoniu. Aceasta accelerează şi reduce considerabil costul sintezei.

Când alchenolul cu formula generală V este utilizat sub forma unei sări terţiare de azot, este posibilă creşterea randamentului alcoolului cu formula generală VI, obţinut prin metoda menţionată mai sus, obţinându-se sarea de amină terţiară a derivatului de trifenilfosfoniu al tamoxifenului cu formula generală I, fără izolarea compusului cu formula VII generală.

Metoda de preparare a derivaţilor de alchenil trifenilfosfoniu ai tamoxifenului cu formula generală IA se bazează pe prepararea ilidei generate de alchil bis (trifenilfosfoniu) cu formula generală VIII

în care n = 7 până la 11

şi X reprezintă I, Br, Cl sau mesil sau o combinaţie a acestora,

în amestec de tetrahidrofuran (THF) şi dimetilsulfoxid (DMSO) într-o atmosferă de argon la temperatura camerei prin tratare cu o bază organică (fiind potrivit litiu hexametildisilazanul) şi condensare ulterioară cu aldehida cu formula III.

Alchil bis (trifenilfosfoniu) cu formula generală VIII este preparat printr-o reacţie a alchilului corespunzător cu trifenilfosfină la o temperatură înaltă.

Grupa de trifenilfosfoniu cationic (TPP+) permite interacţiunea derivatului de alchil sau alchenil trifenilfosfoniu al TAX - agentul cu formula generală I sau IA - cu mitocondriile. Aceşti compuşi s-au preparat prin adiţia grupei cationice de alchil-TPP + la molecula de TAX. În mediul biologic încărcătura pozitivă pe fosforul din grupa TPP+ este delocalizată, ceea ce înseamnă că substanţa se comportă neutru. Singura excepţie sunt structurile celulare cu potenţial negativ, care reprezintă suprafaţa internă a membranei plasmatice şi, în special, membrana mitocondrială interioară. În acest mediu încărcătura este localizată pe fosfor şi grupa TPP+ încărcată pozitiv acţionează ca o ancoră, provocând concentraţie considerabilă de derivaţi de alchil sau alchenil TPP+ ai TAX cu formula generală I sau IA (MitoTAX) la interfaza dintre matricea mitocondrială şi membrana mitocondrială interioară.

Molecula MitoTAX este orientată în aşa fel, încât partea acesteia cu grupa TPP+ este poziţionată în interiorul matricei mitocondriale şi partea biologic activă este în membrana mitocondrială internă, în care este locaţia ţintei moleculare a MitoTAX, care este reprezentată de complexul mitocondrial I. Pentru interacţiunea fizică a părţii biologic active a MitoTAX cu complexul mitocondrial I, o componentă a membranei mitocondriale interioare, este necesar ca o catenă alifatică de o anumită lungime să fie situată între partea biologic activă a MitoTAX şi grupa TPP+, şi se pare că nu este esenţial dacă catena alifatică este alchil sau alchenil (Exemplul 24). Din punctul de vedere al proprietăţilor biologice şi fizico-chimice ale membranei mitocondriale, se pare că o lungime ideală pentru lanţul alifatic este de 8 până la 12 atomi de carbon.

MitoTAX este semnificativ mai eficient în uciderea celulelor de cancer mamar, decât TAX original. Un alt rezultat foarte important este că MitoTAX ucide celulele de cancer mamar mai eficient în cazul celulelor cu expresie înaltă a proteinei HER2, decât în cazul celulelor cu expresia redusă a proteinei HER2. Cu toate acestea, este contrar pentru TAX şi din acest motiv TAX este clinic ineficient împotriva cancerului mamar cu expresie înaltă de HER2. Motivul pentru creşterea sensibilităţii celulelor de cancer mamar cu un nivel înalt de proteine HER2 la MitoTAX este determinat, probabil, de localizarea proteinei HER2, de asemenea, în mitocondrii şi pentru celulele cu expresie redusă sau foarte redusă de HER2 această oncoproteină este localizată în membrana plasmatică a celulelor tumorale.

Substanţa cunoscută ca trastuzumab (Herceptin), care este folosită ca terapie pentru cancerul mamar cu nivel înalt de proteină HER2 este ineficientă într-un număr de cazuri. Un posibil motiv este acela că, în cazul nivelului înalt de proteină HER2 porţiunea sa semnificativă este localizată în mitocondrii şi în timpul acţiunii trastuzumabului asupra celulelor tumorale transferul de proteine HER2 în mitocondrii este intensificat în continuare. Celulele canceroase astfel "ascund" HER2 de trastuzumab, care este un inhibitor al activităţii acestora. Asocierea mitocondrială a HER2 modifică, de asemenea, metabolismul mitocondrial în aşa fel, încât celulele canceroase se direcţionează spre glicoliză şi supravieţuiesc bine într-un mediu care este sărac în oxigen şi substanţe nutritive.

Spre deosebire de trastuzumab, MitoTAX intră în celulă şi se acumulează în mitocondrii pe baza potenţialului negativ pe suprafaţa internă a membranei mitocondriale interioare. Celulele de cancer mamar cu nivel înalt de proteină HER2, în multe cazuri rezistente la trastuzumab, sunt mai sensibile la MitoTAX.

O proprietate importantă a MitoTAX este inhibarea eficientă a creşterii spontane a cancerului mamar cu nivel înalt de proteină HER2 într-un model cu şoareci în cazul, în care creşterea este inhibată până la 90%, iar eficienţa TAX este de aproximativ 20 până la 30 de ori mai joasă. Mai mult decât atât, MitoTAX nu este toxic pentru şoareci.

Cancerele mamare sunt eterogene din punctul de vedere al expresiei proteinei HER2. Este posibil că doar o parte a tumorii va răspunde la terapia cu trastuzumab, în timp ce MitoTAX va fi eficient, deoarece ucide celulele atât cu o expresie joasă, cât şi înaltă de proteină HER2.

Succinatul de vitamină E a fost descris ca un “mitocan”, care afectează complexul mitocondrial II (Dong LF et al. a-Tocopheryl succinate induces apoptosis by targeting ubiquinone-binding sites in mitochondrial respiratory complex II. Oncogene, 2008, vol. 27, p. 4324-4335; Dong LF et al. Suppression of tumour growth in vivo by the mitocan octocopheryl succinate requires respiratory complex II. Clin Cancer Res, 2009, vol. 15, p. 1593-1600). Destul de recent a fost preparată şi testată o substanţă care a apărut prin adiţia grupei TPP+ la succinatul de vitamina E. Această substanţă nouă este ţintită în acelaşi locus molecular, activitatea ei fiind, totuşi, mai înaltă, decât activitatea succinatului de vitamina E administrată parental, datorită concentraţiei înalte de această substanţă la interfaza dintre membrana mitocondrială interioară şi matricea mitocondrială (Dong LF et al. Mitochondrial targeting of vitamin E succinate enhances its proapoptotic and anti-cancer activity via mitochondrial complex II. J Biol Chem, 2011, vol. 286, p. 3717-3728; Dong LF et al. Mitochondrial targeting of a-tocopheryl succinate enhances its pro-apoptotic efficacy: A new paradigm of efficient anti-cancer therapy. Free Radic Biol Med, 2011, vol. 50, p. 1546-1555; Rohlena J et al. Mitochondrially targeted a-tocopheryl succinate is antiangiogenic: Potential benefit against tumour angiogenesis but caution against wound healing. Antiox Redox Signal, 2011, vol. 15, p. 2923-2935). Într-un mod similar cu adiţia succinatului de vitamina E la grupa TPP+, MitoTAX se acumulează în mare măsură la interfaza dintre membrana mitocondrială interioară şi matricea mitocondrială. Cu toate acestea, MitoTAX afectează, conform prezentei invenţii, complexul mitocondrial I, prin care o schimbare apare în spectrul său de efecte, comparativ cu TAX, care afectează preponderent receptorii de estrogen din membrana plasmatică a celulelor de cancer mamar şi, astfel, inhibând activitatea importantă pentru proprietăţile proliferative ale celulelor canceroase.

MitoTAX se acumulează în mitocondrii, declanşează moartea celulară selectiv în celulele canceroase, a căror mitocondrii dispun de un potenţial negativ mai mare, comparativ cu mitocondriile celulelor normale. Ucide, într-un mod foarte eficient, celulele de cancer mamar cu nivel înalt de HER2 şi este eficient împotriva cancerului mamar cu nivel înalt de HER2, în care locusul ţintă pentru MitoTAX este complexul mitocondrial I (fig. 1).

MitoTAX poate fi utilizat pentru prepararea medicamentelor pentru tratamentul bolilor neoplazice, în special al carcinoamelor, sarcoamelor, limfoamelor şi leucemiilor, adică al bolilor selectate din grupa, care include astrocitom, neuroblastom, glioblastom, mezoteliom, cancer de prostată, cancer pulmonar cu celule non-mici, cancer de col uterin, osteosarcom, cancer colorectal, carcinom hepatocelular, leucemie.

Lista abrevierilor

DCM - diclormetan

DMSO - dimetilsulfoxid

ERa - receptor-a de estrogen

ESI MS - spectrometrie de masă cu ionizare prin electrospray

HER2 - receptorul 2 al factorului de creştere epidermal uman

IBX - acid 2-iodoxibenzoic

LiHMDS - litiu hexametildisilazan

MitoTAX - tamoxifen ţintit mitocondrial

MitoVES - succinat de vitamina E ţintită mitocondrial

RMN - rezonanţă magnetică nucleară

TAX - tamoxifen

TBAF - fluorură de tetrabutilamoniu

THF - tetrahidrofuran

CSS - cromatografie în strat subţire

Invenţia se explică prin desenele din fig. 1 - fig. 18, care reprezintă:

fig. 1, clasificarea grupelor individuale de “mitocan”, substanţe potenţial anticanceroase care acţionează pe mitocondrii;

fig. 2, prepararea subliniilor de cancer mamar uman MCF7;

fig. 3, efectele MitoTAX şi TAX asupra creşterii tumorilor experimentale cu expresie înaltă de HER2;

fig. 4, apoptoza indusă de MitoTAX şi TAX în linii celulare diferite;

fig. 5, inducerea dependentă de concentraţie a apoptozei cu MitoTAX în diverse linii de celule de cancer mamar cu nivel înalt de HER2;

fig. 6, modul în care MitoTAX în diferite concentraţii afectează respiraţia prin complexul mitocondrial I şi II în celulele tumorale;

fig. 7, compararea formării radicalilor de oxigen în celulele de cancer mamar expuse la MitoTAX şi TAX;

fig. 8, descreşterea potenţialului mitocondrial ca răspuns la MitoTAX şi TAX;

fig. 9, HER2 care este localizată preponderent în mitocondriile celulelor de cancer mamar cu expresie înaltă a HER2;

fig. 10, efectul nivelului înalt de proteină HER2 pe lungimea mitocondriei;

fig. 11, influenţa nivelul de proteină HER2 asupra formării lactatului şi respiraţiei mitocondriale;

fig. 12, celulele cu nivel înalt de proteină HER2 pentru care este caracteristică o asimilare crescută de glucoză;

fig. 13, MitoTAX, dar nu TAX, reduce expresia receptorului de estrogen ERoc;

fig. 14, proteina HER2 localizată în mitocondriile celulelor canceroase în tumorile spontane cu nivel ridicat de HER2;

fig. 15, zonele individuale de cancer al glandei mamare în FVB/N c-neu transgenică murină diferă după expresia genelor importante pentru dezvoltarea şi tratamentul cancerului mamar (HER2, ERa, GATA3, Ki67);

fig. 16, secţiuni ale zonelor individuale de cancer mamar colorate folosind metoda cu eozină-hematoxilină pentru a dezvălui morfologia tumorii în secţiuni;

fig. 17, secţiuni de părţi individuale ale aceleaşi tumori cu niveluri semnificativ diferite de proteine HER2;

fig. 18, nivelul de apoptoză în celulele MCF7 (A) şi MCF7 HER2 + (B) expuse la diferiţi derivaţi de MitoTAX.

Exemple

Aldehida cu formula III, care a fost preparată prin metoda descrisă în 2003 (Pierre E. Tessier, Andrea J. Penwell. Fabio E. S. Souza and Alex G. Fallis*. ORGANIC LETTERS, 2003, vol. 5, nr. 17, p. 2989-2992), s-a folosit ca materie primă pentru prepararea derivaţilor de alchil trifenilfosfoniu ai tamoxifenului cu formula generală I şi/sau IA (MitoTAX),

Aldehidă III iniţială, cum autorii prezentei invenţii au aflat, poate fi preparată prin utilizarea unui alt agent de oxidare, decât cel utilizat în publicaţia menţionată. S-a constatat, că aplicarea acidului 2-iodbenzoic (IBX), în loc de agenţii Dess-Martin, formează doar un izomer cu legătură dublă. Randamentul este comparabil.

IBX (12.460 g, 44.498 mmol) şi alcoolul alilic de pornire (5.54 g, 14.833 mmol) (în publicaţia menţionată) a fost dizolvat în acetat de etil (120 ml). Suspensia a fost refluxată timp de 3 ore sub o agitare constantă. Amestecul de reacţie a fost răcit până la temperatura camerei, diluat cu eter dietilic (1 l) şi spălat cu soluţie saturată de carbonat de sodiu (3 x 100 ml). Straturile apoase combinate au fost o singură dată reextrase cu acetat de etil (3 x 80 ml). Straturile de acetat de etil combinate au fost uscate deasupra sulfatului de magneziu. Agentul deshidratant s-a filtrat şi soluţia a fost concentrată sub presiune redusă, s-au obţinut 4.850 g (88%) de aldehidă III sub formă de substanţă solidă maronie.

Exemplul 1

Bromura de (9-((terţ-butildimetilsilil)oxi)nonil)trifenilfosfoniu (634 mg, 1.057 mmol) a fost dizolvată în tetrahidrofuran uscat (THF) (6 ml), acoperit cu atmosferă de argon şi răcit până la -78°C. La amestecul de reacţie sub atmosferă de argon s-a adăugat lent prin picurare butil litiu (1,2 ml, 0,9 M soluţie în THF). Soluţia a fost lăsată să se încălzească până la 0°C, culoarea schimbându-se până la roşu închis, apoi s-a răcit până la -78°C şi s-a adăugat prin picurare aldehidă cu formula III (160 mg, 0.430 mmol) dizolvată în THF uscat (3 ml). Apoi amestecul de reacţie a fost lăsat să se încălzească până la temperatura de laborator şi s-a agitat timp de 16 ore sub atmosferă de argon. Evoluţia reacţiei a fost monitorizată prin cromatografie în strat subţire (CSS) în amestec de cloroform - metanol (10:1). Apoi la amestecul de reacţie s-a adăugat soluţie saturată de clorură de amoniu şi apă şi s-a extras cu acetat de etil. Stratul de acetat de etil s-a spălat cu o soluţie salină saturată şi s-a uscat deasupra sulfatului de magneziu. Soluţia a fost filtrată şi concentrată sub presiune redusă. Cromatografia concentratului pe coloana de silicagel în sistemul de diclormetan (DCM)/metanol (gradient 0 până la 10% metanol) a rezultat cu 147 mg de produs cu formula 4 (randamentul 56%).

1H RMN (500 MHz, CDCI3) δ 7,42-7,36 (m, 5H), 7.18 - 7.28 (m, 5H), 6.94 (d, J = 8.7, 2H), 6,73 (d, J = 8.7, 2H), 6.19 (d, J = 11.5, 1H), 5,47 (dt, J = 11.5, 7.4, 1H), 4,09 (t, J = 5.8, 2H), 3,72 (t, J = 6.6, 2H), 2,80 ( t, J = 5.8, 2H), 2,42 (s, 6H), 1.69 - 1.57 (m, 4H), 1.48 - 1.13 (m, 10H), 1,03 (s, 9H), 0,18 (s, 6H). Spectrometria de masă cu ionizare prin electrospray (ESI MS): 612.

Bromura de (9-((terţ-butildimetilsilil)oxi)nonil)trifenilfosfoniu a fost preparată, conform metodei publicate în literatura de specialitate (Tetrahedron Letters, 2010, vol. 51, nr. 49, p. 6426-6428).

Exemplul 2

Derivatul sililat cu formula 4 (147 mg, 2.240 mmol) a fost dizolvat în THF (5 ml), apoi acoperit cu atmosferă de argon şi în picături s-a adăugat fluorură de tetrabutilamoniu (TBAF) (260 µl, soluţie 1M în THF) la o temperatură de 0°C cu agitare. Apoi amestecul de reacţie a fost lăsat să se încălzească până la temperatura de laborator şi s-a agitat timp de încă 6 ore. Evoluţia reacţiei a fost monitorizată cu CSS în amestec de cloroform - metanol (10:1). Apoi s-a adăugat apă şi amestecul a fost extras cu acetat de etil. Stratul de acetat de etil s-a spălat cu soluţie saturată de sodă şi cu soluţie salină saturată şi s-a uscat deasupra sulfatului de magneziu. Agentul deshidratant s-a filtrat şi soluţia a fost concentrată sub presiune redusă. Concentratul a fost purificat prin cromatografie pe coloană cu silicagel în sistemul cloroform/metanol (gradient 0 până la 10% metanol), s-au obţinut 115 mg (randamentul 96%) de alchenol necesar cu formula 5.

1H RMN (500 MHz, CDCI3) δ 7.43 - 7.14 (m, 5H), 6.94 (d, J = 8.5, 2H), 6,72 (d, J = 8.5, 2H), 6,20 (d, J = 11.5, 1H ), 5.48 (dt, J = 11.5, 7.4, 1H), 4,12 (t, J = 5.9, 2H), 3,72 (t, J = 6.6, 2H), 2,86 (t, J = 5.9, 2H), 2,46 ( s, 6H), 1.71 - 1.58 (m, 4H), 1,51 -1.10 (m, 10H). ESI MS: 498.

Exemplul 3

Alchenolul derivat cu formula 5 (115 mg, 0.231 mmol) a fost dizolvat în etanol absolut (6 ml) şi acoperit cu atmosferă de argon. La amestec s-a adăugat 10% Pd/C (10 mg) şi balonul cu suspensia de reacţie a fost evacuat şi acoperit cu atmosferă de hidrogen în mod repetat de câteva ori. Apoi amestecul de reacţie s-a agitat la temperatura de laborator sub atmosferă de hidrogen timp de 24 ore. Evoluţia reacţiei a fost monitorizată prin CSS în amestec de cloroform - metanol (10:1). Amestecul a fost filtrat printr-un strat de Celite şi spălat de câteva ori cu etanol. Etanolul a fost evaporat cu formarea a 101 mg (randamentul 87%) de alcoolul necesar cu formula 6, care se utilizează fără purificare suplimentară în etapa următoare a sintezei.

1H RMN (500 MHz, CD3OD) δ 7.40 - 7.01 (m, 10H), 6,85 (d, J = 8.1, 2H), 6,68 (d, J = 8.1, 2H), 4,20 (s, 2H), 3,55 ( t, J = 6.4, 2H), 3,46 (s, 2H), 2,89 (s, 6H), 2,42 (t, J = 7.8, 2H), 1.57 - 1.48 (m, 2H), 1.38 - 1.11 (m, 12H ). ESI MS: 500.

Exemplul 4

Alcoolul cu formula 6 (230 mg, 0,460 mmol) a fost dizolvat în DCM (10 ml). La amestec la temperatura de laborator sub atmosferă de argon s-a adăugat CBr4 (480 mg, 1.447 mmol), apoi s-a adăugat în picături trifenilfosfină (400 mg, 1.525 mmol) dizolvată în DCM (3 ml). Amestecul a fost agitat la temperatura de laborator timp de 2 ore şi apoi concentrat sub presiune redusă. Evoluţia reacţiei a fost monitorizată prin CSS în amestec de cloroform - metanol (10:1). Cromatografia concentratului pe coloana de silicagel în sistemul DCM/metanol (gradient 0-10%) rezultă cu 273 mg (randamentul 92%) de bromură necesară cu formula 7. Bromura s-a utilizat în reacţia următoare fără orice stocare de lungă durată.

1H-RMN (400 MHz, CDCI3) δ 7.46 - 6.96 (m, 10H), 6,78 (d, J = 8,9 Hz, 2H), 6,53 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 4,29 (t, J = 6.6 Hz 2H), 3.47 - 3.28 (m, 4H), 2,82 (s, 6H), 2,38 (t, J = 7,8 Hz, 2H), 1,80 (q, J = 7,8 Hz, 2H), 1.46 - 0.98 (m, 14H). ESI MS: 561.

Exemplul 5

Alcoolul cu formula 6 (102 mg, 0.204 mmol) a fost dizolvat în DCM (6 ml). La amestec la temperatura de laborator s-a adăugat trifenilfosfină (83 mg, 0.316 mmol) şi imidazol (27 mg, 0.397 mmol) şi amestecul de reacţie a fost răcit într-o baie de gheaţă până la 4°C. La amestecul de reacţie răcit s-a adăugat iod (76 mg, 0.302) şi s-a agitat la temperatura de laborator timp de 4 ore. Evoluţia reacţiei a fost monitorizată prin CSS în amestec de cloroform - metanol (10:1). Amestecul de reacţie a fost diluat cu diclormetan şi extras cu tiosulfat. Faza organică a fost spălată suplimentar cu soluţie saturată de sodă şi soluţie salină saturată şi uscată deasupra sulfatului de magneziu. Cromatografia concentratului pe coloana de silicagel în sistemul DCM/metanol (gradient 0 până la 10%) rezultă cu 100 mg (randamentul 80%) de iodură necesară cu formula 8. Iodura s-a utilizat în reacţia următoare fără orice depozitare de lungă durată.

1H-RMN (400 MHz, CDCI3) δ 7.40 - 7.32 (m, 2H), 7.31 - 7.22 (m, 4H), 7.22 - 7.08 (m, 4H), 6,78 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 6,57 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 3,95 (t, J = 5.8 Hz, 2H), 3,19 (t, J = 7,0 Hz, 2H), 2,68 (t, J = 5.8 Hz, 2H), 2.47 - 2.37 (m, 2H), 2,31 (s, 6H), 1,81 (q, J = 7,0 Hz, 2H), 1.52 - 1.00 (m, 14H). ESI MS: 610.

Exemplul 6

Trifenilfosfina (300 mg, 1.144 mmol) a fost adăugată la bromura cu formula 7 (273 mg, 0.425 mmol), iar amestecul a fost agitat la temperatura de 85°C sub atmosferă de argon timp de 12 ore. Evoluţia reacţiei a fost monitorizată prin CSS în amestecul de cloroform - metanol (10:1). Amestecul de reacţie a fost răcit până la temperatura de laborator, dizolvat într-o cantitate minimă de DCM şi adăugat prin picurare la soluţia de hexan (50 ml) sub o agitare constantă la temperatura de 0°C. Precipitatul format a fost filtrat, iarăşi dizolvat într-o cantitate minimă de DCM şi s-a adăugat prin picurare la soluţia de eter dietilic (50 ml) cu o agitare constantă la temperatura de 0°C. Precipitatul a fost filtrat şi uscat sub vid cu obţinerea a 281 mg (randamentul 73%) de compus necesar cu formula 9 în formă de pulbere gălbuie.

1H RMN (500 MHz, CD3OD) δ 7.89 - 7.74 (m, 15H), 7.37 - 7.05 (m, 10H), 6,85 (d, J = 8.7, 2H), 6,71 (d, J = 8.7, 2H), 4.24 (t, J = 5.0, 2H), 3,57 (t, J = 5.0, 2H), 3,43 (m, 2H), 2,97 (s, 6H), 2,40 (t, J = 7.9, 2H), 1.74 - 1.60 (m, 2H), 1.59 - 1.49 (m, 2H), 1.36 - 1.05 (m, 12H). ESI MS: 744.

Exemplul 7

Aplicarea unei metode similare celei prevăzute în exemplul 6 permite de a obţine compusul cu formula 10 din iodura cu formula 8.

Exemplul 21

Compusul cu formula 5 poate fi obţinut direct din aldehida cu formula III prin reacţia cu bromură de (9-hidroxinonil)trifenilfosfoniu în loc de bromură de (9 - ((terţ-butildimetilsilil) oxi)nonil)trifenilfosfoniu. O astfel de sinteză este mai scurtă şi mai eficientă după cost. Principala modificare este utilizarea amestecului THF şi DMSO pentru a spori solubilitatea şi reacţia poate fi realizată direct cu bromură de (9-hidroxinonil) trifenilfosfoniu, ceea ce era imposibil în THF actual. Reacţia este condusă la temperatura camerei, în loc de -78°C. Această metodă conduce, de asemenea, la o reducere semnificativă a timpului total de preparare a compusului necesar.

Prepararea compusului cu formula 5

Bromura de (9-hidroxinonil)trifenilfosfoniu (3.920 g, 8.082 mmol) a fost dizolvată în DMSO (10 ml) şi apoi s-a adăugat THF (30 ml). La amestecul de reacţie timp de 3 minute s-a adăugat prin picurare soluţie de LiHMDS (14.800 ml, 1M în THF). Culoarea amestecului de reacţie s-a modificat în portocaliu strălucitor. Apoi la amestecul de reacţie s-a adăugat în picături soluţia de aldehidă cu formula III (1.000 g, 2.694 mmol) în THF (15 ml) şi reacţia s-a agitat timp de încă zece minute la temperatura laboratorului. Evoluţia reacţiei a fost monitorizată prin CSS în amestec de cloroform - metanol (10:1). Amestecul de reacţie a fost turnat în soluţia rece saturată de clorură de amoniu (100 ml) şi s-a extras cu eter dietilic (5 x 100 ml). Straturile organice combinate au fost uscate deasupra sulfatului de magneziu. Agentul deshidratant s-a filtrat şi produsul s-a concentrat sub vid. Materialul brut s-a dizolvat în eter dietilic (10 ml) şi s-a adăugat în picături soluţie de eter saturată a HCI (5 ml). Produsul precipitat s-a filtrat şi s-a extras cu soluţie de NaOH (5 ml, 1M) şi eter dietilic (25 ml). Stratul organic a fost uscat deasupra sulfatului de magneziu. Agentul deshidratant s-a filtrat şi produsul s-a concentrat sub vid pentru a se obţine 1,102 g (82%) de produs cu formula 5 în formă de ulei slab gălbui, care este gata pentru reacţiile ulterioare.

Exemplul 22

Din compusul cu formula 6 este posibilă prepararea compusului cu formula 9a (hidroclorură de amină terţiară) fără necesitatea de a izola compusul 7. Timpul de pregătire este redus şi randamentul este mai înalt.

Prepararea compusului cu formula 9a

Soluţia de eter saturată a HCI (6 ml) s-a adăugat la alcoolul cu formula 6 (300 mg, 0.600 mmol) dizolvat în eter dietilic (6 ml). Amestecul a fost concentrat în vid şi dizolvat în DCM (6 ml). La amestecul de reacţie s-a adăugat CBr4 (298 mg, 0.901 mmol) şi după dizolvarea completă a acestuia s-a adăugat trifenilfosfină (252 mg, 960 mmol). Reacţia a fost stinsă după 5 minute prin adiţie de metanol (1 ml) şi soluţie de eter saturată a HCI (3 ml). Soluţia a fost concentrată în vid şi s-a adăugat trifenilfosfină (2.000 g, 7.625 mmol). Amestecul de reacţie a fost amestecat peste noapte la temperatura de 100°C. Amestecul a fost răcit până la temperatura camerei şi apoi a fost dizolvat în DCM (10 ml). Amestecul a fost apoi răcit până la temperatura camerei, dizolvat în DCM (10 ml) şi s-a adăugat prin picurare la eterul dietilic rece şi agitat puternic (100 ml). Precipitatul s-a filtrat şi uscat în vid, s-au obţinut 334 mg (74%) de produs cu formula 9a sub formă de substanţă solidă albă, uşor uleioasă. Produsul poate fi purificat repetat prin dizolvare recurentă în DCM (2 ml) şi ulterior precipitat în eter dietilic (20 ml).

Exemplul 23

Prepararea compusului cu formula 11 - derivatului de alchenil trifenilfosfoniu izomeric al tamoxifenului

Bromura de nonan-1,9-diilbis(trifenilfosfoniu) s-a preparat din 1,9-dibromnonan şi amestec de trifenilfosfină agitată în soluţie de dimetilformamidă la temperatura de 100°C timp de 16 ore şi cristalizată ulterior din acetat de etil.

Bromura de nonan-1,9-diilbis (trifenilfosfoniu) (545 mg, 674 mmol) a fost dizolvată în DMSO (1 ml) şi apoi s-a adăugat THF (3 ml). La amestecul de reacţie timp de 3 minute s-a adăugat prin picurare o soluţie de LiHMDS (670 µl, 1M în THF). Culoarea amestecului de reacţie s-a schimbat în portocaliu strălucitor. Apoi la amestecul de reacţie s-a adăugat prin picurare o soluţie de aldehidă cu formula III (100 mg, 0.269 mmol) în THF (1 ml) şi reacţia a fost agitată timp de încă zece minute la temperatura camerei. Evoluţia reacţiei a fost monitorizată prin CSS în amestec de cloroform - metanol (10:1). Amestecul de reacţie s-a turnat într-o soluţie rece saturată de clorură de amoniu (10 ml) şi s-a extras cu diclormetan (5 x 20 ml). Straturile organice combinate au fost uscate deasupra sulfatului de magneziu. Agentul deshidratant s-a filtrat şi produsul s-a concentrat în vid. Cromatografia concentratului pe coloană de silicagel în sistemul cloroform/metanol (gradient 0-10%) rezultă cu 56 mg (30%) de produs dezirabil cu formula 11.

1 H-RMN (400 MHz, CDCI3) δ 8.00 - 7.52 (m, 15H), 7.25 - 7.11 (m, 6H), 7.11 - 6.96 (m, 4H), 6,72 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 6,53 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 6,00 (d, J = 11,5 Hz, 1H), 5,26 (dt, J = 11.5, 7.4 Hz, 1H), 4,02 (t, J = 4.8 Hz, 1H), 3,80 - 3.53 (m, 2H), 2,88 (t, J = 5.3 Hz, 2H), 2,42 (s, 6H), 2.06 - 1.79 (m, 2H), 1.64 - 1.36 (m, 4H), 1.38 - 1.05 (m , 4H), 1.06 - 0,73 (m, 4H). ESI SM: 742.

Teste biologice cu derivatul de alchil trifenilfosfoniu al tamoxifenului ţintit mitocondrial (MitoTAX), studiul comparativ cu tamoxifen (TAX)

Următoarele exemple 8-20 au fost realizate cu substanţa MitoTAX cu formula generală I, în care n = 10.

Exemplul 8

MitoTAX preparat, conform exemplului 6, a fost testat pentru efectele sale asupra liniilor celulare de cancer mamar. S-au utilizat linii cu niveluri diferite de expresie a proteinei HER2 şi de receptor-a de estrogen. (ERa). Linia celulară MCF7 are o expresie relativ joasă de proteină HER2. Pentru testarea uciderii celulelor de cancer mamar cu diferite niveluri de proteină HER2 cu MitoTAX, au fost preparate celule HER2- şi HER+ MCF7. Celulele MCF7 au fost transfectate cu vectorul cu o secvenţă "nesilenţioasă" (NS), cu o secvenţă sub formă de "agrafă scurtă" care atenuează expresia HER2 (sh) şi cu vectorul cu o genă pentru HER2. În fig. 2 este prezentată expresia proteinei HER2 în diferite sublinii folosind metoda Western blot. În lucrarea ulterioară s-au utilizat subliniile NS, Sh1 26 (clona 26) şi +11 (clona 11).

Exemplul 9

S-au evaluat valorile IC50 pentru TAX şi MitoTAX în diferite linii de celule de cancer mamar. Valorile individuale au fost determinate din curbele de supravieţuire ale celulelor la diferite concentraţii de ambele medicamente folosind metoda cu cristal violet. S-au folosit linii celulare cu diferite niveluri de proteină HER2 şi ERa ERa+/HER2redus (MCF7par), ERa +/HER2+ (MCF7HER2+, BT474, NeuTL - linie murină de cancer al glandei mamare), ERa+/HER2-(MCF7HER2-, T47D, ZR75-1), ERa-/HER2+ (SK-BR-3), ERa-/HER- (MDA-MB-231, MDA-MB-453, MDA-MB-436). Din tabelul 1 se relevă, că valoarea IC50 este semnificativ mai mică pentru MitoTAX, aproximativ de un ordin de magitude. Cea mai sensibilă este sublinia MCF7HER2+ cu genotipul ERa+/HER2-. Pentru liniile corespunzătoare cu genotipul ERa+/HER2- (MCF7HER2-) şi ERa+/HER2redus (MCF7par) sunt caracteristice valorile IC50, care sunt aproximativ de două ori mai înalte, ceea ce indică că nivelul crescut de proteină HER2 conduce la o creştere a sensibilităţii la MitoTAX. Pe de altă parte, şi în contrariu cu MitoTAX, sensibilitatea celulelor cu expresie înaltă de HER2 pentru TAX se reduce. Aceasta indică o proprietate unica a MitoTAX, care (din cele mai bune cunoştinţe ale noastre) nu a fost raportată pentru orice altă substanţă anticanceroasă.

Tabelul 1.

Valorile IC50 (µM) pentru liniile celulare de cancer mamar cu diferite expresii de proteină HER2 şi ERa.

Exemplul 10

De asemenea s-a studiat posibilitatea suprimării creşterii tumorilor de către MitoTAX. Eficacitatea anticanceroasă a MitoTAX a fost testată folosind tulpina FVB/N c-neu de şoarece transgenic, care se naşte fără tumori şi adultul se caracterizează prin creşterea expresiei proteinei HER2 datorită acţiunii estrogenului (Guy CT et al. Expression of the neu proto-oncogene in the mammary epithelium of transgenic mice induces metastatic disease. Proc Natl Acad Sci USA, 1992, vol. 89, p. 10578-10582). Aceşti şoareci dezvoltă displazie şi apoi hiperplazie în regiunea glandei mamare la 3 până la 4 luni după naştere şi formează tumori palpabile peste 6 luni. Foarte important, aceasta se întâmplă în contextul sistemului imun funcţional. Acest model de cancer mamar (glandă mamară) este o aproximare foarte bună a cancerului mamar uman cu un nivel înalt de proteină HER2 de tip "ductal in situ". Rezultatele înregistrate (fig. 3) indică o eficacitate foarte bună a MitoTAX asupra creşterii acestor tumori. La şoareci s-au administrat doze de 3 µmοl de TAX şi 0,5 µmοl de MitoTAX de două ori pe săptămână timp de două săptămâni. Volumul tumorilor a fost cuantificat folosind imagistica cu ultrasunete, care poate vizualiza tumori cu mare precizie şi în mod neinvaziv, inclusiv a părţilor integrate. Este clar, că MitoTAX este de aproximativ 20 până la 30 de ori mai eficient, decât TAX, şi diferenţele dintre acţiunea ambelor medicamente sunt extrem de semnificativă. Simbolul "*" indică diferenţele semnificative între animalele tratate şi animalele de referinţă, simbolul "**" indică diferenţele semnificative între animalele tratate cu TAX şi cele tratate cu MitoTAX. La animalele experimentale nu s-a observat toxicitate aparentă. Fotografiile mai jos de grafic arată tumorile reprezentative din grupuri individuale de animale.

Exemplul 11

Un aspect important al MitoTAX este o creştere mai înaltă a activităţii sale de suprimare în ceea ce priveşte liniile cu exprimare crescută a oncogenei HER2. Aceasta este arătat în fig. 4, care, de asemenea, atestă că linia cu expresia redusă de oncogenă HER2 (clona 26) este mai puţin sensibilă la MitoTAX, în timp ce se remarcă efect opus pentru TAX. Pentru aceste experimente, de asemenea, a fost preparată o sublinie MCF7 rezistentă la TAX cu expunere de lungă durată a celulelor MCF7 parentale la escaladarea dozelor de TAX. Este posibil să vedem că aceste celule, rezistente la TAX, sunt sensibile la MitoTAX (fig. 4). Rezultatele din fig. 4 ilustrează supravieţuirea subliniilor de cancer mamar derivate din celulele MCF7 cu diverse genotipuri (ERa+/HER2redus, MCF7par; ERa+/HER2+, MCF7HER2+ - clona 26; ERa+/HER2-, MCF7HER2- - clona 11; ERa+/HER2redus, MCF7TAX-R). Rezultatele au fost obţinute folosind metoda cu cristal violet, care este posibilă la discriminarea celulelor vii şi moarte în prezenţa a diferite concentraţii de MitoTAX şi TAX.

Exemplul 12

O caracteristică importantă a substanţelor anticanceroase, care cauzează moartea celulelor canceroase, este modul de moarte a celulelor. Din aceste considerente s-a testat posibilitatea provocării de către MitoTAX a apoptozei, a morţii celulare programate, adică atunci când o celulă moare într-un mod controlat şi organele sale reziduale apoptotice sunt eliminate din ţesut de celulele fagocitare fără reacţii inflamatorii. În fig. 5 se arată că agentul într-adevăr cauzează apoptoza. Apoptoza a fost evaluată pe baza estimării procentului de celule cu anexină V în partea exterioară a membranei plasmatice prin citometria în flux. Încă o dată, rezultatele atestă creşterea eficacităţii MitoTAX în celulele cu nivel înalt de proteină HER2, în timp ce celulele cu un nivel redus de proteină HER2 sunt mai rezistente (deşi încă în curs de apoptoză).

Exemplul 13

Publicarea anterioară (Moreira PI et al. Tamoxifen and estradiol interact with the flavin mononucleotide site of complex I leading to mitochondrial failure. J Biol Chem, 2006, vol. 281, p. 10143-10152) indică, că obiectivul pentru TAX în mitocondrii este, la un nivel înalt de agent, complexul I. S-a constatat, că acest lucru este, de asemenea, valabil pentru MitoTAX, care este prezentat în fig. 6. De asemenea, aceasta se atestă în efectul inhibitor al TAX (pe stânga) şi al MitoTAX (pe dreapta) asupra respiraţiei, prin complexele mitocondriale I şi II. Este posibil să vedem, că TAX inhibă preponderent complexul l până la complexul II în concentraţii care depăşesc 20 µM. MitoTAX, de asemenea, inhibă complexul I de preferinţă până la complexul II, dar în concentraţii semnificativ mai mici de aproximativ 1 până la 2 µM. Pentru aceste teste celulele MCF7 au fost plasate în camera instrumentului Oxygraf şi respiraţia a fost determinată la doze înalte de TAX (pe stânga) şi de MitoTAX (pe dreapta). Respiraţia (consumul de oxigen legat cu formarea de ATP) este raportată la 106 celule şi este prezentată ca o valoare relativă cu nivelul începutului respiraţiei marcat cu valoarea relativă 1.

Exemplul 14

O proprietate de obicei asociată cu un număr de “mitocani” este capacitatea lor de a creşte stresul oxidativ (formarea de specii de oxigen reactive, ROS) selectiv în celulele de cancer, în special asociată cu acţiunea lor asupra complecşilor mitocondriali participanţi cu fosforilarea oxidativă. Aceasta, de obicei, se asociază cu o reducere a potenţialului mitocondrial (Neuzil J. et al. Classification of mitocans, anti-cancer drugs acting on mitochondria. Mitochondrion, 2013, vol. 13, p. 199-208; Kluckova K et al. Mitochondrial complex II, a novel intriguing target for anticancer agents. Biochim Biophys Acta, 2013, vol. 1827, p. 552-564. S-a testat formarea de ROS, de asemenea, pentru MitoTAX. În fig. 7 se prezintă generarea de ROS pentru subliniile MCF7 cu diferite niveluri de HER2 peste 1 oră de expunere la TAX sau MitoTAX (ambii câte 5 µM). Este posibil să vedem, că TAX este semnificativ mai puţin eficace în aceeaşi concentraţie, comparativ cu MitoTAX. Un alt rezultat important este că MitoTAX induce formarea de mai multe ROS în celulele cu un nivel înalt de HER2, în timp ce o producere mai mică de ROS apare în celulele cu un nivel redus de HER2. TAX nu urmează această tendinţă. În toate cazurile, decuplatorul respiraţiei mitocondriale (CCCP) reduce potenţialul mitocondrial până la valoarea sa bazală. Fig. 8 arată, că MitoTAX (dar nu TAX) reduce riscul potenţial mitocondrial deja la concentraţia de 5 µM şi timp de 1 oră.

Exemplul 15

În celulele de cancer mamar cu nivel înalt de proteină HER2, proteina este localizată preponderent în mitocondrii. Aceasta este arătat în fig. 9, în care este prezentat western blot-ul liniei originale MCF7, precum şi a subliniilor HER2+ MCF7 (clona 11), HER2- MCF7 (clona 26), şi în care se observă că subliniile reale sunt rezistente la TAX (clona TAM-R). Este posibil să se vadă, că celulele de clona 11 se caracterizează prin expresie crescută a proteinei HER2 (marcată cu o săgeată) în fracţiunile mitocondriale, citoplasmatice (ea conţine membrana plasmatică), precum şi nucleare. Imaginea de mai sus arată fracţiunea mitocondrială, când membrana a fost expusă pentru o perioadă mai lungă de timp, astfel încât să poată fi clar că în mitocondrii, deşi la un nivel semnificativ mai jos, proteina HER2 este prezentă, de asemenea, în celulele MCF7 parentale şi în celulele rezistente la TAX, dar nu şi în celulele cu nivel redus de HER2 (clona 26). Acest rezultat surprinzător este în conformitate cu publicaţia recentă (Ding Y et al. Receptor tyrosine kinase ErbB2 translocates into mitochondria and regulates cellular metabolism. Nat Commun, 2012, vol. 3, p. 1271). Această publicaţie relatează, de asemenea, că celulele de cancer mamar cu expresie înaltă de proteină HER2, localizată preponderent în mitocondrii, sunt rezistente la trastuzumab. În timpul aplicării trastuzumabului la celulele canceroase mai multă proteină HER2 a fost mobilizată în mitocondrii (Ding Y et al. Receptor tyrosine kinase ErbB2 translocates into mitochondria and regulates cellular metabolism. Nat Commun, 2012, vol. 3, p. 1271). Este posibil că celulele de cancer mamar mobilizează proteina HER2 departe de suprafaţa (membrana plasmatică) lor, astfel încât proteina nu poate fi afectată de trastuzumab. Unul dintre rezultatele inhibării HER2 este activarea proteinei p27, care este un inhibitor al ciclului celular, reducând natura maligna a celulelor (Yang HY, Shao R, Hung MC, Lee MH. p27 Kip1 inhibits HER2/neu-mediated cell growth and tumorigenesis. Oncogene, 2001, vol. 20, p. 3695-3702). Aceasta are un impact negativ asupra celulelor canceroase cu un nivel înalt de proteină HER2, deoarece celulele canceroase sunt evolutiv programate pentru a menţine statutul proliferativ înalt (Hanahan D, Weinberg RA. The hallmarks of cancer. Cell, 2000, vol. 100, p. 57-70). Prin urmare, putem presupune că, din moment ce proteina HER2, ţinta trastuzumabului, nu este prezentă în membrană la o scară majoră, celula va dobândi rezistenţă la trastuzumab. Cu toate acestea, în timpul acestui proces va creşte sensibilitatea la MitoTAX, care este capabil să pătrundă în mitocondrii, ceea ce evidenţiază şi mai mult natura sa excepţională.

Exemplul 16

Una dintre condiţiile pentru o sensibilitate crescută a celulelor de cancer mamar cu nivel înalt de proteină HER2 este modificarea bioenergeticii şi morfologiei lor mitocondriale. Nivelul înalt de proteină HER2 in mitocondrii modifică morfologia, precum şi funcţia lor. Fig. 10 arată, că mitocondriile în celulele HER2+ (clona 11) sunt de aproximativ de două ori mai scurte, decât cele din celulele HER2- (clona 26). Lungimea mitocondrială a fost estimată prin microscopia confocală a liniilor celulare transfectate cu proteina GFP ţintită mitocondrial (care vizualizează mitocondriile cu fluorescenţă verde). Lungimea a fost determinată prin analiza mitocondriilor în 50 celule selectate la întâmplare utilizând software Fuji Freehand Lines Measurement Tools. Aceasta este legată de respiraţia mitocondrial redusă şi este asociată cu reducerea producţiei înalte şi potenţial mitocondriale de lactat (un simptom de schimbare, comparativ cu metabolismul glicolitic aerob) (fig. 11). Se arată că în acest caz celulele cu niveluri înalte de proteină HER2 produc aproximativ de două ori mai mult lactat, decât celulele parentale şi celulele cu un nivel redus de proteină HER2. În cazul respiraţiei, efectul este exact opus. Celulele cu niveluri crescute de proteine HER2 respiră mai puţin (producerea de ATP este asociată cu un consum mai mic de oxigen). O pondere mai mare a glicolizei în generaţia ATP pentru celulele, pentru care este caracteristic un nivel înalt de proteină HER2, se asociază, de asemenea, cu asimilarea lor crescută de glucoză (fig. 12).

Exemplul 17

Un alt motiv posibil pentru o sensibilitate crescută a celulelor HER2+ cu un nivel înalt de proteină HER2 la MitoTAX este efectul acestui agent asupra receptorilor de estrogen ERa, având efecte anti-apoptotice (Thomas C, Gustaffson J. The different roles of ER subtypes in cancer biology and therapy. Nat Rev Cancer, 2011, vol. 11, p. 597-608; Deblois D, Giguere V. Oestrogen-related receptors in breast cancer: control of cellular metabolism and beyond. Nat Rev Cancer, 2013, vol. 13, p. 27-36). Aceasta se arată în fig. 13, în care este posibil să vedem că MitoTAX reduce expresia ERa aproximativ de trei ori deja într-o concentraţie de 1 µM, în timp ce TAX este ineficient. Aceste rezultate au fost obţinute folosind metodologia RPL în timp real.

Exemplul 18

Eficienţa înaltă menţionată a MitoTAX împotriva tumorilor cu expresia înaltă a proteinei HER2 în tulpinile murine FVB/N c-neu este de mare importanţă. Această tumoare, care corespunde tumorilor umane cu expresia înaltă a proteinei HER2, a fost analizată pentru expresia proteinei HER2 şi multor altor gene. Fig. 14 prezintă o FVB/N c-neu murină reprezentativă cu o tumoare (figura de sus din stânga) şi, de asemenea, o tumoare excizată (figura în colţul din stânga jos). Rezultatele analizei tumorii prin Western blot atestă, că tumoarea conţine un nivel înalt de proteină HER2, care este aproape nedetectabil în ţesutul normal al glandei mamare. Figura prezintă, de asemenea, rezultatele analizei fracţiunilor mitocondriale (Mito) şi citosolice (Cito). Anticorpii împotriva proteinelor specifice sunt utilizate ca marcheri pentru fracţiunea mitocondrială. Este clar, că majoritatea absolută de proteină HER2 este localizată în mitocondrii. Aceste rezultate obţinute dintr-o tumoare experimentală corespund rezultatelor din celulele de cancer mamar cu expresie înaltă a HER2.

Exemplul 19

Recent s-a constatat în tumorile renale, că aceleaşi tumori conţin zone care diferă după profilul mutaţiei lor (Gerlinger M et al. Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing. N Engl J Med, 2012, vol. 366, p. 883-892), eterogenitatea tumorii (Stingl J, Caldas C. Molecular heterogeneity of breast carcinomas and the cancer stem cell hypothesis. Nat Rev Cancer, 2007, vol. 7, p. 791-799) şi acest fenomen, de asemenea, a fost identificat în cazul carcinoamelor mamare. Aceasta corelează, interesant, cu constatarea că tumorile spontane ale glandei mamare în FVB/N c-neu transgenică murină conţin zone cu expresie diferită de mai multe gene importante la nivel de ARNm, care pot afecta în mod considerabil tratamentul cancerului mamar. Aceasta se referă la genele ERa, HER2, Ki67, un marcher de proliferare, care este mai mare în cazul nivelurilor înalte de HER2) şi GATA3 (activator de transcriere, care afectează pozitiv expresia HER2). Aceasta se arată în fig. 15. În acest experiment două tumori au fost împărţite în mai multe părţi, care au fost analizate cu ajutorul RPL în timp real pentru exprimarea genelor menţionate mai sus. Rezultatele ilustrează o expresie foarte diferită a genelor în zone individuale ale tumorii, variind până la 5 ori. O altă dovadă a expresiei diferite a genei HER2 în părţi individuale ale tumorii în FVB/N c-neu murină experimentală este prezentată în următoarele figuri, în care este posibil să se vadă morfologia tumorii pe baza colorării cu hematoxilină şi eozina (fig. 16), precum şi o analiză imunohistochimică a expresiei proteinei HER2 (fig. 17). Aceste diferenţe neechivoce corespund unei expresii diferite a HER2 în părţi individuale ale tumorii la nivel de ARNm şi sunt în concordanţă cu datele publicate privind eterogenitatea intratumorală (Gerlinger M et al. Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing. N Engl J Med, 2012, vol. 366, p. 883-892; Stingl J, Caldas C. Molecular heterogeneity of breast carcinomas and the cancer stem cell hypothesis. Nat Rev Cancer, 2007, vol. 7, p. 791-799). Fig. 17 arată că există diferenţe foarte mari de expresie a proteinei HER2 între partea exterioară a tumorii (partea 1a), partea de mijloc (partea 1b) şi partea internă (parte 1c). Aceasta înseamnă că unele zone tumorale vor fi rezistente la terapia cu TAX (zone cu expresie înaltă de proteină HER2), altele vor fi rezistente la terapia cu trastuzumab (zone cu un nivel redus de proteină HER2). Mai mult decât atât, este posibil ca acţiunea trastuzumabului să fie însoţită de un transfer mai mare de proteină HER2 în mitocondrii, în acest fel zonele tumorale cu expresie înaltă de proteină HER2 dobândesc rezistenţă la acest tip de terapie. Pe de altă parte, MitoTAX, care acţionează asupra mitocondriilor şi ucide celulele care conţin un nivel înalt de proteină HER2 mult mai eficient, decât celulele cu expresia redusă a acestei proteine, este capabil să facă faţă în zonele tumorilor rezistente la trastuzumab.

Exemplul 20

MitoTAX, care ucide eficient celulele canceroase mamare, este eficient şi împotriva altor tipuri de celule canceroase. Aceasta se arată în tabelul 2, în care este posibil de a vedea valorile IC50 pentru MitoTAX şi TAX pentru uciderea celulelor de diferite tipuri de cancer, inclusiv de carcinoame, sarcoame şi leucemii. În toate cazurile valorile IC50 au fost mai mici pentru MitoTAX, decât pentru TAX.

Tabelul 2

Exemplul 24

Fig. 18 arată inducerea apoptozei în celulele de cancer mamar MCF7 (A) şi sublinia de celule MCF7 cu nivel înalt de proteină HER2 (B) la acţiunea derivaţilor de alchil şi alchenil trifenilfosfoniu ai MitoTAX, aşa cum este prezentat în tabelul 3. Procentul de celule apoptotice a fost determinat utilizând eseul de apoptoză specific, bazat pe evaluarea nivelului de exteriorizare a anexinei V prin citometria de flux. Celulele MCF7 şi MCF7 HER2+ au fost expuse la derivaţi de MitoTAX individuali în concentraţie de 2 µM timp de 24 ore. Coloana "CTRL" indică procentul de celule apoptotice din populaţia de celule fără adaos de substanţe testate şi, astfel, aceasta corespunde cu nivelul de bază al apoptozei. Toţi derivaţii testaţi de MitoTAX induc apoptoza.

Tabelul 3

În concluzie, se poate rezuma că au fost preparaţi compuşi noi, care se bazează pe TAX, care este un medicament frecvent utilizat pentru tratamentul cancerului mamar, unei boli cu o incidenţă în creştere (DeSantis C et al. Breast cancer statistics, 2011. CA Cancer J Clin, 2011, vol. 1, p. 409-418). Derivaţii, descrişi mai sus, de alchil şi alchenil trifenilfosfoniu ai tamoxifenului (MitoTAX), conform prezentei invenţii, sunt preponderent acumulaţi în mitocondrii, în care se află locusul lor ţintă, complexul mitocondrial I. Interacţiunea MitoTAX cu complexul I va avea drept rezultat o întrerupere a fluxului de electroni, care apoi interacţionează cu oxigenul molecular. Aceasta conduce la formarea sporită de ROS care, la rândul său, declanşează moartea celulară. MitoTAX este eficient în cancerul mamar atât cu niveluri reduse, cât şi înalte de proteină HER2, care complică considerabil metodele existente de tratament. Astfel, MitoTAX poate completa sau înlocui atât TAX, cât şi trastuzumabul în terapiile cancerului.

Utilizarea invenţiei

Derivaţii noi de tamoxifen cu formula generală I şi IA, conform prezentei invenţii, sunt aplicabili pentru tratamentul cancerului în condiţii clinice şi în industria farmaceutică pentru prepararea medicamentelor pentru tratarea eficientă a cancerului.

1. Paula I. Moreira et al. Tamoxifen and Estradiol Interact with the Flavin Mononucleotide Site of Complex I Leading to Mitochondrial Failure. The Journal of Biological Chemistry, 2006, vol. 281, nr. 15, p. 10143-10152 (regăsit în internet la 2018.12.03 URL: <<http://www.jbc.org/content/281/15/10143>>)

Claims

1. Izomeri E şi/sau Z ai derivaţilor de trifenilfosfoniu alifatic ai tamoxifenului, direcţionaţi mitocondrial, în care lanţul alifatic este alchil sau alchenil şi sărurile amine terţiare corespunzătoare, selectate din grupa de săruri organice, cum ar fi citrat, acetat, lactat, tartrat, oxalat, ascorbat, mesilat, tosilat sau de săruri anorganice, cum ar fi sulfat, halogenură, fosfat şi/sau amestecuri ale acestora, derivaţi de alchil trifenilfosfoniu ai tamoxifenului cu formula generală I: I, în care n = 8…12 şi Z este selectat dintr-o grupă de săruri organice, cum ar fi citrat, acetat, lactat, tartrat, oxalat, ascorbat, mesilat, tosilat, sau anorganice, cum ar fi sulfat, halogenură, fosfat şi în care legătura dublă încrucişată în formula generală I, situată în fragmentul tamoxifenului, indică la aceea că legătura dublă poate avea configuraţia E şi/sau Z, şi derivaţi de alchenil trifenilfosfoniu ai tamoxifenului cu formula generală IA: IA, în care n = 6…10 şi Z are semnificaţia, definită mai sus şi în care legătura dublă încrucişată în formula generală IA, situată în catena laterală, indică la aceea că legătura dublă poate avea configuraţia E şi/sau Z.

2. Metodă de preparare a derivaţilor de alchil trifenilfosfoniu ai tamoxifenului cu formula generală I, conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că ilida generată de tert-butildimetilsilil-oxi-alchil-trifenilfosfoniu cu formula generală II:

în care n = 5…9, şi X reprezintă I, Br, Cl sau mesil, prin tratarea unei baze organice în tetrahidrofuran într-o atmosferă de argon la temperatura de -78°C, se condensează cu aldehida cu formula III:

rezultând un derivat sililat cu formula generală IV:

în care n = 5…9, şi derivatul sililat cu formula generală IV se tratează cu fluorură de tetrabutilamoniu, se obţine alchenol cu formula generală V:

în care n = 5…9, care se reduce într-o atmosferă de hidrogen în prezenţa unui catalizator până la alcoolul cu formula generală VI:

în care n = 5…9, alcoolul cu formula generală VI se substituie până la derivatul corespunzător cu formula generală VII:

în care n = 5…9, şi X reprezintă I, Br, Cl sau mesil, care se transformă în derivatul de alchil trifenilfosfoniu al tamoxifenului, direcţionat mitocondrial, cu formula generală I, prin încălzire împreună cu trifenilfosfină.

3. Metodă de preparare a derivaţilor de alchil trifenilfosfoniu ai tamoxifenului cu formula generală I, conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că bromura de (hidroxialchil)trifenilfosfoniu se tratează cu o bază şi se condensează cu aldehida cu formula III la temperatura camerei în amestec de tetrahidrofuran şi dimetilsulfoxid, se obţine alchenolul cu formula generală V, din care derivatul de alchil trifenilfosfoniu al tamoxifenului cu formula generală I se obţine prin utilizarea metodei, conform revendicării 2.

4. Metodă de preparare a derivatului de alchenil trifenilfosfoniu al tamoxifenului cu formula generală IA, conform revendicării 1, caracterizată prin aceea, că ilida generată din alchil bis(trifenilfosfoniu) cu formula generală XII:

în care n = 7…11, şi X reprezintă I, Br, Cl sau mesil sau o combinaţie a acestora, în amestec de tetrahidrofuran şi dimetilsulfoxid într-o atmosferă de argon la temperatura camerei se tratează cu o bază organică, ulterior se condensează cu aldehida cu formula III cu formare de derivaţi de alchenil trifenilfosfoniu ai tamoxifenului cu formula generală IA.

5. Izomeri E şi/sau Z ai derivaţilor de trifenilfosfoniu alifatic ai tamoxifenului, direcţionaţi mitocondrial, sau amestecului acestora cu formula generală I şi/sau IA pentru utilizare în tratamentul bolilor neoplazice.

6. Izomeri E şi/sau Z, pentru utilizare, conform revendicării 5, în tratamentul carcinomului, sarcomului, limfomului şi leucemiei.

7. Izomeri E şi/sau Z, pentru utilizare, conform revendicării 5, în tratamentul bolilor neoplazice care includ: astrocitom, neuroblastom, glioblastom, mezoteliom, cancer mamar, cancer de prostată, cancer pulmonar cu celule non-mici, cancer de col uterin, osteosarcom, cancer colorectal, carcinom hepatocelular, leucemie.

8. Izomeri E şi/sau Z ai derivaţilor de trifenilfosfoniu alifatic ai tamoxifenului, direcţionaţi mitocondrial, sau amestecului acestora cu formula generală I şi/sau IA pentru utilizare în uciderea celulelor canceroase în diverse regiuni ale tumorilor de glandă mamară, indiferent de nivelurile diferite ale expresiei proteinei HER2, ERα, GATA3 sau Ki67.

9. Izomeri E şi/sau Z ai derivaţilor de trifenilfosfoniu alifatic ai tamoxifenului, direcţionaţi mitocondrial, sau amestecului acestora cu formula generală I şi/sau IA pentru utilizare în suprimarea receptorului de estrogen ERα.

10. Izomeri E şi/sau Z ai derivaţilor de trifenilfosfoniu alifatic ai tamoxifenului, direcţionaţi mitocondrial, sau amestecului acestora cu formula generală I şi/sau IA pentru utilizare în inhibarea respiraţiei prin complexul mitocondrial I.

11. Medicament pentru tratamentul bolilor neoplazice caracterizat prin aceea, că acesta conţine cel puţin un izomer E/Z al derivatului de trifenilfosfoniu alifatic al tamoxifenului cu formula generală I şi/sau IA, conform revendicării 1.

12. Medicament, conform revendicării 11, caracterizat prin aceea, că bolile neoplazice reprezintă cancer mamar cu niveluri înalte de proteină HER2.

13. Medicament, conform revendicării 11, caracterizat prin aceea, că bolile neoplazice reprezintă cancer mamar cu niveluri reduse de proteină HER2.

14. Medicament, conform revendicării 11, caracterizat prin aceea, că este eficient împotriva altor boli neoplazice, decât cancerul mamar cu niveluri reduse, cât şi înalte de proteină HER2.