MD4803C1 - Aplicarea compusului coordinativ diaqua-nitrato-(2,4,6-tris(2-piridil)-s-triazină)-mangan(II) nitrat în calitate de stimulator al activităţii proteolitice la tulpina Fusarium gibbosum CNMN FD 12 - Google Patents

Abstract

Invenţia se referă la chimia coordinativă şi biotehnologie, în particular la un compus coordinativ al manganului(II) cu ligandul - 2,4,6-tris(2-piridil)-s-triazină, care posedă proprietăţi pronunţate de stimulator al sintezei proteazelor exocelulare la tulpina de fungi miceliali Fusarium gibbosum CNMN FD 12 şi poate găsi aplicare în calitate de stimulator în diferite procese biotehnologice. Conform invenţiei, se revendică aplicarea compusului coordinativ diaqua-nitrato-(2,4,6-tris(2-piridil)-s-triazină)-mangan(II) nitrat cu formula [Mn(NO3)(tpt)(H2O)2](NO3) în calitate de stimulator al activităţii proteolitice la tulpina Fusarium gibbosum CNMN FD 12.

Description

Invenţia se referă la chimia coordinativă şi biotehnologie, şi anume, la compusul coordinativ al manganului(II) în baza ligandului - (2,4,6-tris-(2-piridil)-s-triazină), care posedă proprietăţi pronunţate de stimulator al sintezei proteazelor exocelulare la tulpina de fungi miceliali Fusarium gibbosum CNMN FD 12 - producător cu semnificaţie biotehnologică.

Pentru cultivarea submersă a tulpinii Fusarium gibbosum CNMN FD 12 este cunoscut mediul nutritiv cu compoziţia, %: făină de porumb - 2,0; făină de soia - 1,0; CaCO3 - 0,2; (NH4)2SO4 -0,1; restul apă potabilă până la 1L (Brevet de invenţie MD 4186 C1 din 2013.06.30. Tulpină de fungi Fusarium gibbosum CNMN FD 12-producătoare de proteaze acide şi neutre, xilanaze şi β-glucozidaze. Deseatnic-Ciloci A., Tiurina J., Lupaşcu G., Clapco S., Labliuc S., Stratan M., Dvornina E., Saşco E.).

În ultimele decenii în scopul sporirii biosintezei enzimelor la micromicete intensiv se studiază compuşii coordinativi ai elementelor 3d din care unii s-au manifestat promiţător în soluţionarea problemei de biosinteză a proteazelor.

Pentru cultivarea tulpinii Fusarium gibbosum CNMN FD 12 este cunoscut mediul nutritiv, care implică un compus coordinativ, cu compoziţia, %: făină de porumb - 2,0; făină de soia - 1,0; CaCO3 - 0,2; (NH4)2SO4 -0,1; restul apă potabilă până la 1L şi în calitate de biostimulator compusul coordinativ [Co(DH)2(Thio)2]F[PF6]·nH2O în concentraţie de 0,0010… 0,0015, pH-ul iniţial al mediului 6,25 [1].

Dezavantajul acestui mediu nutritiv constă în faptul că compusul coordinativ aplicat sporeşte numai proteazele neutre din complexul proteolitic sintetizat de tulpină ce poate fi determinat de compoziţia compusului integru, dar şi a ligandului în parte.

Este cunoscut că ligandul (2,4,6-tris-(2-piridil)-s-triazină) (tpt) conţine atomi de azot, iar aceştia manifestă diferite activităţi farmacologice de tipul antivirale, antitumorale, analgezice, antioxidante, antidepresive şi antibacteriene ( R.Kumar, N. Lumar, R.K. Roy, A. Singh. Triazines-A coprehensive review of their synthses and diverse biological importance. Current Medical and Drug Research, 2017, 1(1), 1 - 12, Article ID173). În plus, posedă activităţi catalitice în unele procese de polimerizare şi oxidare şi este utilizat ca reactiv analitic în determinarea spectrofotometrică şi farmaceutică. Utilizarea compuşilor coordinativi cu acest ligand în calitate de biostimulatori nu este descrisă în literatura de specialitate.

Cea mai apropiată soluţie de invenţia propusă pot fi consideraţi compuşii coordinativi ai Fe(III) cu liganzii pe baza izo- şi nicotinoilhidrazonelor: azotat de (2,3-butandionă-bis((izonicotinoilhidrazonă)-tris-aqua) Fe(III) dihidrat cu formula [Fe(H2L1)(H2O)3](NO3)3·2H2O şi azotat de (2,3-butandionă-bis(nicotinoilhidrazonă)-tris-aqua) Fe(III) dihidrat cu formula [Fe(H2L2)(H2O)3](NO3)3·2H2O, care sporesc activitatea proteolitică la tulpina de fungi miceliali Fusarium gibbosum CNMN FD 12 [2].

Dezavantajul compuşilor menţionaţi constă în faptul că concentraţia maximă admisibilă de aplicare a compuşilor pentru tulpina producător nu asigură realizarea maximă de biosinteză a proteazelor acide şi neutre.

Problema tehnică pe care o soluţionează prezenta invenţie constă în diversificarea preparatelor proteolitice prin aplicarea compusului coordinativ diaqua-nitrato-(2,4,6-tris(2-piridil)-s-triazină)-mangan(II) nitrat cu formula [Mn(NO3)(tpt)(H2O)2](NO3) în calitate de stimulator al activităţii proteolitice la tulpina Fusarium gibbosum CNMN FD 12- producător cu semnificaţie biotehnologică.

Conform invenţiei, se revendică aplicarea compusului mononuclear cu formula [Mn(NO3)(tpt)(H2O)2](NO3) în calitate de biostimulator al activităţii proteolitice la tulpina Fusarium gibbosum CNMN FD 12 .

Rezultatul tehnic al invenţiei constă în aplicarea compusului [Mn(NO3)(tpt)(H2O)2](NO3) în calitate de stimulator al activităţii proteolitice la tulpina Fusarium gibbosum CNMN FD 12, creşterea producerii de proteaze şi diversificarea preparatelor proteolitice după ponderea componentelor complexului enzimatic (proteaze acide, neutre şi alcaline), în funcţie de cerinţele specifice ale domeniului de aplicare.

Compusul mononuclear cationic [Mn(NO3)(tpt)(H2O)2](NO3) se obţine la interacţiunea pivalatului de Mn(II, III) cu 2,4,6-tris(2-piridil)-s-triazină în prezenţa nitratului de disprosiu(III) în etanol. Procedeul de obţinere al acestui compus este simplu în executare, substanţele iniţiale accesibile, randamentul constituind 80% faţă de cel teoretic calculat. Compusul este stabil în contact cu aerul, puţin solubil în etanol, bine solubil în apă, dimetilformamidă şi dimetilsulfoxidă. Obţinerea compusului diaqua-nitrato-(2,4,6-tris(2-piridil)-s-triazină)-mangan(II) nitrat, [Mn(NO3)(tpt)(H2O)2](NO3) este descrisă în sursa (Darii M., Kravtsov V., Baca S. Mn(II) coordination complexes based on 2,4,6-tris(2-pyridyl)-s-triazine. Conferinţa “New trends and strategies in the chemistry of advanced materials with relevance in biological systems, technique and environmental protection”, Timişoara, România, 2017, p.43).

Procedeul de obţinere a diaqua-nitrato-(2,4,6-tris(2-piridil)-s-triazină)-mangan(II) nitrat, [Mn(NO3)(tpt)(H2O)2](NO3) constă din următoarele etape:

S-a adăugat pivalat de Mn(II,III), [Mn6O2((CH3)3CCO2)10((CH3)3CCO2H)4], (0,02 g, 0,01 mmoli), nitrat de disprosiu(III) (0,04 g, 0,09 mmoli) şi 2,4,6-tris-(2-piridil)-s-triazină (0,007 g, 0,022 mmoli) în 8 ml etanol. În continuare, amestecul reactant se refluxează timp de 30 minute, utilizând un refrigerent ascendent. Soluţia obţinută a fost filtrată şi lăsată într-un flacon acoperit. La răcire şi evaporarea lentă în soluţie se depun cristale de culoare cafenie, aciforme, care se filtrează, se spală cu etanol şi se usucă în aer.

S-a determinat, %: C-40,68; H-3,22; N-21,59. Pentru [Mn(NO3)(tpt)(H2O)2](NO3), C18H16MnN8O8, s-a calculat, %: C-40,99; H-3,06; N-21,25. Spectrul infraroşu pentru compusul revendicat: FT/IR (ν, cm-1): 3731 br/m, 3405 br/m, 3073 m, 2962 br/m, 2909 m, 2821 w, 1662 sh, 1572 v/s, 1545 s, 1532 v/s, 1474 s, 1428 v/s, 1388 v/s, 1377 v/s, 1294 s, 1260 m, 1159 w, 1103 s, 1035 m, 1021 m, 1005 m, 927 w, 859 w, 850 w, 778 m, 679 w, 667 w.

Structura moleculară şi cristalină a [Mn(NO3)(tpt)(H2O)2](NO3) a fost determinată, aplicând difracţia razelor X şi este prezentată în figură şi tabelul 1.

Tabelul 1

Datele cristalografice şi parametrii de structură a compusului coordinativ [Mn(NO3)(tpt)(H2O)2](NO3) (I)

I Formula C18H16MnN8O8 Mr 527,33 Dimensiunea cristal, mm3 0.400 x 0.200 x 0.120 Temperatura, K 293(2) Singonia monoclinic Grupul spaţial C 2/c a, (Å) 20,4359(8) b, (Å) 13,3612(4) c, (Å) 16,7266(6) α, grad 90 β, grad 107,782(4) γ, grad 90 V, (Å3) 4348,9(3) Z 8 Dcalc (g/cm-3) 1,611 µ, mm-1 0,672 F(000) 2152 Numărul reflexelor colectate 7918 Date / restricţii / parametri 4029 / 0 / 332 R1, wR2 [I>2σ(I)] 0,0455, 0,0999 R1, wR2 (pentru toate datele) 0,0719, 0,1118

Compusul [Mn(NO3)(tpt)(H2O)2](NO3) se cristalizează în grupul spaţial monoclinic C2/c, având parametrii a = 20,436(1), b = 13,361(1), c = 16,727(1) Å, β = 107,782(4)°, Z = 8, V = 4348,9(3) Å3.

În complex molecula de 2,4,6-tris(2-piridil)-s-triazină serveşte ca un ligand tridentat NNN care formează două metalocicluri cu distanţele Mn-N de 2,231 - 2,379 Å. Adiţional, atomul de mangan coordinează cu anionul NO3 - şi două molecule de apă, rezultând o bipiramidă pentagonală în jurul atomului de metal. În complex anionii NO3 - au o coordonare bidentată cu distanţele Mn-O de 2,269 şi 2,412 Å. Distanţele Mn-O se disting cu moleculele de apă în poziţie apicală egale cu 2,139 şi 2,193 Å.

Compusul coordinativ diaqua-nitrato-(2,4,6-tris(2-piridil)-s-triazină)-mangan(II) nitrat cu formula [Mn(NO3)(tpt)(H2O)2](NO3) posedă proprietăţi pronunţate de stimulator al procesului de enzimogeneză la microorganisme fapt stabilit prin testarea efectului exercitat asupra sintezei proteazelor exocelulare la tulpina de fungi miceliali Fusarium gibbosum CNMN FD 12.

Exemplu de realizare a invenţiei

Tulpina Fusarium gibbosum CNMN FD 12 se cultivă în baloane Erlenmeyer cu capacitatea de 0,75 L, care conţin 0,2 L mediu nutritiv cu următoarea compoziţie, %: făină de porumb - 2,0; făină de soia - 1,0; CaCO3 - 0,2; (NH4)2SO4 - 0,1; [Mn(NO3)(tpt)(H2O)2](NO3)- 0,0005-0,0015; restul apă potabilă până la 1L; pH-ul iniţial al mediului 6,25. Mediul nutritiv se însămânţează cu suspensie de spori şi miceliu în cantitate de 5% v/v, obţinută prin spălare cu apă distilată sterilă a culturii de 12-14 zile, crescută pe suprafeţe înclinate de malţ-agar. Soluţia apoasă a compusului biostimulator [Mn(NO3)(tpt)(H2O)2](NO3) cu o concentraţie bine determinată, reieşind din intervalul revendicat 0,0005...0,0015 %, nemijlocit înainte de utilizare, se agită discret timp de 2...5 min pe baie de apă cu ultrasunet de tip DA-968 DADI, după care se adaugă la mediul nutritiv concomitent cu materialul semincer. Cultivarea se realizează în condiţii de agitare continuă (200 rot/min), timp de 144 ore, la temperatura de 28ºC.

Activitatea proteazelor acide (pH 3,6) determinată în lichidul cultural prin metoda Anson (Грачева И.М. и др. Лабораторный практикум по технологии ферментных препаратов. М., Лёгкая и пищ. пром., 1982, с. 41-43), după acţiunea asupra cazeinatului de sodiu în ziua a 5-a de cultivare (ziua manifestării maximei de biosinteză în varianta martor) a constituit 63,69…41,48 U/mL în funcţie de concentraţia aplicată a compusului coordinativ [Mn(NO3)(tpt)(H2O)2](NO3) cu manifestarea maximei (63,69 U/mL) la concentraţia de 0,0005 % faţă de 51,16 U/mL în varianta poxim, la concentraţia de 0,0010%, cu un spor de 24,5%.

Maxima activităţii proteazelor neutre (рН 7,4) determinată similar în variantele experimentale cu aplicarea biostimulatorului [Mn(NO3)(tpt)(H2O)2](NO3) s-a marcat în ziua a 5-a, constituind 25,52…67,47 U/ml faţă de 60,22 U/mL în varianta proxim, marcând sporul de 12 % la concentraţia biostimulatorului 0,0010% (tabelul 2).

Tabelul 2

Modificarea activităţii proteolitice a micromicetei Fusarium gibbosum CNMN FD 12 sub influenţa compusului coordinativ diaqua-nitrato-(2,4,6-tris(2-piridil)-s-triazină)-mangan(II) nitrat [Mn(NO3)(tpt)(H2O)2](NO3) (I)

Comp. coord. Conţ., % Proteaze acide (рН 3,6) Proteaze neutre (рН 7,4) 5 zi 5 zi 6 zi U/mL % U/mL % U/mL % I 0,0005 63,69 124,5 25,52 43,38 25,52 77,3 0,0010 43,85 89,1 67,47 112.0 33,01 100,0 0,0015 41,48 81,1 56,51 93,8,2 36,04 109,2 Proxim 0,0010 51,16 60,22 25,88

Proxim - cea mai apropiată soluţie [2], compusul II

Datorită proprietăţilor biologice pe care le manifestă compusul coordinativ diaqua-nitrato-(2,4,6-tris(2-piridil)-s-triazină)-mangan(II) nitrat cu formula [Mn(NO3)(tpt)(H2O)2](NO3), prezintă interes pentru industria producătoare de produse biotehnologice în calitate de biostimulator al proceselor de enzimogeneză la cultivarea tulpinii de fungi miceliali Fusarium gibbosum CNMN FD 12.

1. MD 4234 B1 2013.06.30

2. MD 4509 B1 2017.08.31

Claims (1)

1. Aplicarea compusului coordinativ diaqua-nitrato-(2,4,6-tris(2-piridil)-s-triazină)-mangan(II) nitrat cu formula [Mn(NO3)(tpt)(H2O)2](NO3) în calitate de stimulator al activităţii proteolitice la tulpina Fusarium gibbosum CNMN FD 12.