ME00126B

ME00126B - Himerni infektivni dnk klonovi, himerni cirko virusi svinje i njihova upotreba

Info

Publication number: ME00126B
Application number: MEP-2008-177A
Authority: ME
Inventors: Xiang Jin Meng; Martijn Fenaux; Patrick G Halbur
Original assignee: Virginia Tech Intellectual Properties Inc; Univ Iowa State Res Found Inc
Priority date: 2001-12-12
Filing date: 2002-12-11
Publication date: 2010-10-10
Also published as: BRPI0214919B1; FR11C0014I2; HUS2100036I1; EP2264050B1; CO5590938A2; KR20040086243A; PT2264050T; MEP17708A; RS51288B; EP1487483A4; WO2003049703A2; HUP1300097A2; PL374382A1; WO2003049703A3; DE122011100001I1; HRP20140002B1; HRP20140002A2; US20030170270A1; BR0214919A; FR11C0014I1

Description

Oblast pronalaska

Ovaj pronalazak je iz oblasti infektivnih svinjskih DNK klonova cirkovirusa tipa-1 (SCV1) i tipa-2 (SCV2), i odnosi se na himeme SCV1-2 infektivne DNK klonove i žive himeme viruse koji su dobijeni od himemih DNK klonova, koji se mogu koristiti kao vakcine.

Stanje tehnike

Svinjski eirkovirus (SCV) je prvobitno izolovan kao kontaminant ćelijske kulture svinjske bubrežne ćelijske linije PK-15 (I. Tischer et al., “A very small porcine virus with circular single-stranded DNA”, Nature 295: 64-66 (1982); I. Tischer et al., “Characterization of papovavirus and picomavirus-like particles in permanent pig kidney cell lines”, Zentralbl. Bakteriol. Hyg. Otg. A. 226(2): 153-167 (1974)). SCV je mali ikozahedralni virus bez omotača koji sadrži jednolančani cirkulami DNK genom od oko 1. 76 kb. Scv je klasifikovan u familiju Circoviridae, koja se sastoji od tri životinjska cirkovirusa ((virus anemije pileta (chicken anemia vims-CAV), psittacine virus obolenja kljuna i perija, (psittacine beak and feather disease virus-PBFDV), i nedavno pronađen eirkovirus golubova, columbid circovirus (CoCV) kod kolubova)) i tri biljna cirkovirusa (banana bunchy top virus, coconat foliar decay virus i subterranean clover stunt virus) (M. R. Bassami et al., “Psittacine beak and featrher disease virus nucleotide sequence analysis and its relationship to porcine circovirus, plant circovirus and chicken anemia virus”, Virology 249: 453-459 (1998); J. Mankertz et al., “Transcription analysis of porcine circovirus (PCV)”, Virus Genes 16: 267-276 (1998); A. Mankertz et al., “Cloning and sequencing of columbid circovirus (CoCV), a new circovirus from pigeons”, Arch Virol. 145: 2469-2479 (2000); B. M. Meehan et al., “ Sequencing of porcine circovirus DNA: affmities with plant circoviruses” J. Gen. Virol. 78: 221-227 (1997); B. M. Meehan et al., “Characterization of novel circovirus DNAs associated with wasting syndromes in pigs” J. gen. Virol. 79: 2171-2179 (1998); D. Todd et al. „ “Comparasion of three animal viruses with circular single-stranded DNA genomes”, Arch. Virol. 117: 129-135 (1991)). Članovi tri ranije priznata životinjska cirkovirusa (SCV, CAV, i PBFDV) međusobno ne dele homologiju nukleotidnih sekvenci niiti antigene determinante (M. R. Bassami et al., 1998, supra; D. Todd et al., 1991, supra). Genom novo identifikovanog CoCV pokazuje oko 40% identičnosti u nukleotidnoj sekvenci sa sekvencom SCV (A. Menkertz et al., “Cloning and sequencing of columbid circovirus (CoCV), a new circovirus from pigeons”, Arch. Vuirol. 145: 2469-2479 (2000)). Nedavno je identifikovan novi humani cirko virus sa cirkulamim genomom, koji je nazvan virus prenosiv transfuzijom (transfusion transmitted virus ili TT virus (TTV)), koji je izolovan iz individua koje su imale post-transfuzioni hepatitis (H. Miyata et al., “Identification of novel GC-rich 113-nucleotide region to complete the circular, single stranded DNA genome of the TT virus, the first human circovirus” J. Virol. 73: 3582-3586 (1999); T. Nischizavva et al., “ A novel DNA virus (TTV) associated with elevated transaminase levels in posttransfiision hepatitis of unknown etiology”, Biochem. Biophys. Res. Commun. 241: 92-97 (1997)). Dodatno, identifikovan je humani TTV-u sličan mini virus (human TTV-lije mini virus (TLMV)) koji je izolovan iz krvi normalnih davaoca krvi (P. Biagini et al., “Genetic analysis of full-length genomes and subgenomic sequences of TT virus -like mini virus human isolates” J. Gen. Virol. 82: 379-383 (2001); K. Takahashi te la., “Identification of a new human DNA virus (TTV-like mini virus, TLMV) intermediately related to TT virus and chicken anemia virus” Arch. Virol. 145: 979-93 (2000)) i terći novi humani cirkovirus, poznat kao SEN virus (SENV) takođe je otkriven kod ljudi sa posttrnasfuzionim hepatitisom (T. Umemura et al., “SEN virus infection and its relationship to transfusion associated hepatitis”, Hepathology 33: 1303-1311 (2001)). Organizacija genoma i humanog TTV i TMLV je slična organizaciji genoma CAV (P. Biagini et al., 2001, supra; H. Miyata te al., 1999, supra; K. Takahashi et al., 2000, supra). Iako su antitela na SCV pronađena kod različitih životinjskih vrsta uključujući ljude, miševe, stoku i svinje (G. M. Allan et al., “Production, preliminary characterization and applications of monoclonal antibodies to porcine circovirus” Vet. Immunol. Immunopathol. 43: 357-371 (1994); G. C. Dulac and A. Afshar, “Porcine circovirus antigens in PK-15 cell line (ATCCCCL-33) and evidence of antibodies to circovirus in Canadian pigs”, Can. J. Vet. Res. 53: 431-433 (1989); S. Edwards and J. J. Sands, “Evidence of circular infection in British pigs”, Vet. Rec. 134: 680-1 (1994); J. C. Harding and E. G. Clark, “Recognizing and diagnosing postv/eaning multisystemic v/asting syndrome (PMWS)”, Swine Health and Production 5: 201-203 (1997); R. K. Hines and P. D. Lukert, “Porcine circovirus: a serological survey of swine in the United States, ” Swine Health and Production 3: 71-73 (1995); G. P. Nayar et al., “Evidence for circovirus in cattle with respiratory disease and from aborted bovine fetuses”, Can. Vet. J. 40: 277-278 (1999; I. Tischer te al., “Distribution of antibodies to porcine circovirus in swine populations of different breeding farms”, Arch. Virol. 140: 737-743 (1995); I Tischer et al., “Presence of antibodies reacting with porcine circovirus in sera of humans, miče, and cattle” Arch. Virol. 140: 1427-1439 (1995)) jako malo se zna o ptogenezi SCV u ovim životinjskim vrstama. Eksperimentalno inficiranje svinja sa SCV dobijenim iz PK-15 ćelija nije dovelo do nastanka kliničke slike bolesti i tako se ovaj virus ne svrstava u patogene za svinje (G. M. Allan et al, “Pathogenesis of porcine circovirus; experimental infections of colostrum deprived piglets and examinatiom of pig foetal material”, Vet. Microbioi. 44: 49-64 (1995); I. Tischer et al., “Studies on epidemio! ogy and pathogenicity of porcine circovirus, ” Arch. Virol. 91: 271-276 (1986)). Nepatogeni SCV koji je dobijen iz kontaminirane PK-15 ćelijske linije označen je kao svinjski cirkovirus tipa 1 ili SCV1.

Sindrom kržljavosti odbijene prasadi (Postv/eaning multisystemic wasting syndrom-PMWS), prvi put opisan 1991 (j. C. Harding i E. G. Clark, 1997, supra), je složeno obolenje prasića koji ne sisaju-odbijeni od sise (weaning), koje se ubrzano širi. Pošto preti da ima ozbiljan ekonomski uticaj na industriju svinja, postalo je hitno da se razvije vakcina protiv SCV2, primami uzročni agens PMWS. PMWS uglavnom deluje na prasiće starosti 5-18 nedelja. Klinički znakovi PMSW uključuju progresivan gubitak težine, dispneu, tahipneu, anemiju, dijareju, i žuticu. Stopa mortaliteta može da varira od 1% do 2% i do 40% u nekim komplikovanim slučajevima u Velikoj Britaniji (M. Muirhead, “Source of information on PMWS/PDNS, ” VET. REC. 150: 456 (2002)). Mikroskopske lezije koje su karakteristične za PMSW uključuju granulomatoznu intersticijalnu upalu pluća limfadenopatiju, hepatitis, i nefritis (G. M. Allan i J. A. Ellis, “porcine circoviruses: a review” J. Vet. Diagn. Invest. 12: 3-14 (2000); J. C. Harding and E. G. Clark, 1997, supra). PMWS sada je priznat kod svinja u Kanadi, Sjedinjenim Američkim Državama (G: M. Allan et al., “Novel porcine circoviruses ffom pigs with wasting disease syndromes, ” Vet. Rec. 142: 467-468 (1998); G. M. Allan et al., “Isolation of porcine circovirus-like viruses from pigs with a wasting disease in the USA and Europe”, J. Vet. Diag. Invest. 10: 3-10 (1998); G. M.

Allan and J. A. Ellis, 2000, supra; J. Ellis et al., “Isolation of circovirus from lesions of pigs with postweaning multisystemic wasting syndrome” Can. Vet. j 39; 44-5i; a. L. Hamel et al., Nucleotide sequence of porcine circovirus associated with postweaning multisystemic wasting syndrome in pigs” J. Virol. 72: 5262-5267 (1998); M. Kiupei et al., “Circovirus-like viral associated disease in vveaned pigs in Indiana, “ Vet. Pathol. 35: 303-307 (1998); R. Larochelle et al., “Identification and incidence of porcine circovirus in routine field cases in Quebea as determined by PCR, ” Vet. Rec. 145: 140-142 (1999); B. M. meehan et al., 1998, supra; I Morozov et al., “Detection of a novel strain of porcine circovirus in pigs with postweaning multisystemic v/asting syndrome” J. Clin. Microbiol. 36: 2535-2541 (1998)), većini evropskih zemalja (G. M Allan et al., “Isolation of porcine circovirus-like viruses from pigs with a wasting disease in the USA and Europe” J. Vet. Diagn. Invest. 10: 3-10 (1998), G. M. Allan and J. A. Ellis, 2000, supra; S. Kennedy et al., “Porcine circovirus infection in Northern Ireland, ” Vet. Rec. 142: 495-496 (1998); A. Mankertz et al., “Characterization of PCV-2 isolates from Spain, Germany and France” Virus Res. 66: 65-77 (2000); C. Rosell et al., “Identification of porcine circovirus in tissue of pigs with porcine dermatitis and nephropathy syndrome” Vet. Rec. 146: 40-43 (2000); P Spillane t al., “Porcine circovirus infection in Republic of Ireland” vet. Rec. 143: 511-512 (1998); G. J. Wellenberg et al., “Isolation and characterization of porcine circovirus type 2 from pigs shovving signs of post- postweaning multisystemic wasting syndrome in the Netherlands”, Vet. Quart. 22: 167-72 (2000) i u nekim zemljama u aziji (C. Choi et al., “Porcine postv/eaning multisystemic wasting syndrome in korean pig: detection of porcine circovirus 2 infection by immunohistochemistry and polinerase chain reaction” J. Vet. Diagn. Invest. 12: 151-153 (2000); A. Onuki et al., “Detection of porcine circovirus from lesions of a pig with vvasting disease in Japan, ” J. Vet. Med. Sci. 61: 1119-1123 (1999)). PMWS potencijalno ima ozbiljan ekonomski uticaj na industriju svinja u čitavom svetu.

Primami uzročni agens PMWS je patogeni soj SCV koji je određen kao svinjski cirkovirus tipa 2 ili SCV2 (G. M. Allan et al., “Novel porcine circovirus from pigs with wasting disease syndrome” Vet. Rec. 142: 467-468 (1998); G. M. Allan et al., “Isolation of porcine circovirus-like viruses from pigs with wasting disease syndrome in the USA and Europe” J. Vet. Diagn. Invest. 10: 3-10 (1998); G. M. Allan et al., “Isolation and characterization of porcine circovirus from pigs with postv/eaning wasting syndrome in Spain, Denmark and Northern Ireland” Vet. Microbiol. 66: 115-23 (1999); G. M. Allan and J. A. Ellis, 2000, supra; J. A. Ellis et al., 1998, supra; A. L. Hamel et al., 1998, supra; B. M. Meehan et al., 1998, supra; I. Morozov et al., 1998, supra). Kompletna genomska sekvenca PMSWS-povezanog SCV2 je određena (M. Fenaux te al., “Genetic characterization of type 2 porcine circovims (PCV-2) from pigs with postweaning multisystemic vvasting syndrome in different geografic regions of North America and development of a differential PCR-restriction fragment length polimorphism assay to detect and differentiate between infections with PCV-1 and PCV-2” J. Clin. Microbiol. 38: 2494-503 (2000): A. L. Hamel et al., 1998, supra; J. Mankertz et al., 1998, supra; B. M. Meehan et al., 1997, supra; B. M. Meehan et al., 1998, supra; I. Morozov et al., 1998, supra).

SCV1 je ubiquitous kod svinja ali ne predstavlja patogena za njih. Za razliku od njega, gentski srodan SCV2 je patogen i izaziva PMWS kod svinja. Analiza skevenci je otkrila da PMWS-povezan SCV2 deli samo oko 75% identičnosti u nukleotidnoj sekvenci sa nepatogenim SCV1. ORF2 gen oba nepatogena SCV1 i patogenog SCV2 kodiraju za glavni inmunogeni viralni protein kapsida (P. Nawagitgul et al, "Modified indirect porcine circovims (PCV) type 2-based and recombinant capsid protein (ORF2)-based ELISA for the detection of antibodies to PCV, " Immunol. Clin. Diagn. Lab Immunol. 1: 33-40 (2002); P. Nawagitgul et al, "Open reading frame 2 of porcine circovirus type 2 encodes a major capsid protein, " J. Gen. Virol. 81: 2281-2287 (2000)).

Inicijalni pokušaji da se reprodukuju klinički PMWS u konvencionalnim svinjama pomoću inokulacije nisu dali rezultate (M. Balasch et al., "Experimental inoculation of conventional pigs with tissue homogenates from pigs with post-weaning multisystemic wasting syndrome, " J. Comp. Pathol. 121: 139-148 (1999); M. Fenaux et al., "Cloned Genomic DNA of Type 2 Porcine Circovirus (PCV-2) Is Infectious When Injected Directly into the Liver and Lymph Nodes of SPF Pigs: Characterization of Clinical Disease, Virus Distribution, and Pathologic Lesions, " J. Virol. 76: 541-551 (2002)). Eksperimentalna reprodukcija kliničkog PMWS kod gnotobiotskih svinja i konvencionalnih svinja sa tkivnim homogenatima iz svinja kod kojih prirodno se javlja PMSW i sa ćelijskom kulturom propagiranom sa SCV2 davali su mešane rezultate. Klinički PMWS je reprodukovan kod gnotobiotskih (SBP) svinja uskraćenih za kolostrum i svinja dobijenih carskim rezom koje su koinficirane sa SCV2 i i svinjskim parvovirusom (SPV) (G. M. Allan et al., "Experimental reproduction of severe vvasting disease by co-infection of pigs with porcine circovirus and porcine in gnotobiotic swine by coinfection with porcine circovirus 2 and porcine parvovirus, " Vet. Pathol. 37: 254-263 (2000)), and in PCV2-inoculated gnotobiotic pigs when their immune system was activated by keyhole hemocyanin in incomplete Freund parvovirus, " J. Comp. Pathol. 121: 1-11 (1999); S. Krakowka et al., "Viral wasting syndrome of swine: experimental reproduction of postweaning multisystemic wasting syndrome 's adjuvant (S. Krakowka et al., "Activation of the immune system is the pivotal event in the production of wasting disease in pigs infected with porcine circovirus-2 (PCV-2), " Vet. Pathol. 38: 31-42 (2001)).

Klinički PMWS takođe je reprodukovan kod carskim rezom dobijenih /uskraćenih za kolostrum svinja (CD/CD) koje su inokulisane samo sa SCV2 (P. A. Harms et al., "Experimental reproduction of severe disease in GD/CD pigs concurrently infected with type 2 porcine circovirus and porcine reproductive and respiratory syndrome virus, " Vet. Pathol. 38: 528-539 (2001)) i kod konvencionalnih svinja koje su koinficirane sa SCV2 i sa ili svinjskim parvovirusom (SPV) ili svinjskim virusom reproduktivnog i respiratornog sindroma (SRRSV) (A. Rivora et al., "Experimental inoculation of conventional pigs with porcine reproductive and respiratory syndrome virus and porcine circovirus 2, " J. Virol. 76: 3232-3239 (2002)). U slučajevima SRRSV/SCV2 koinfekcija, karakteristični patološki znaci vezani za PMWS kao stoje limfoidno raspadanje, granu lomatozna upala i nekrotični hepatitis su indukovani SCV2-om a ne SRRSV (P. A. Harms et al., 2001, supra). Međutim, klinički PMWS nije reprodukovan kod gnotobiotskih svinja koje su inficirane samo sa SCV2 (G. M. Allan et al., "Experimental infection of colostrums deprived piglets with porcine circovirus 2 (PCV2) and porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) potentiates PCV2 replication, " Arch. Virol. 145: 2421-2429 (2000); G. M. Allan et al, "A sequential study of experimental infection of pigs with porcine circovirus and porcine parvovirus: immunostaining of cryostat sections and virus isolation, J. Vet. Med. 47: 81-94 (2000); G. M. Allan et al, "Experimental reproduction of severe wasting disease by co-infection of pigs with porcine circovirus and porcine parvovirus, " J. Comp. Pathol. 121: 1-11 (1999); M. Balasch et al, 1999, supra; J. Ellis et al, "Reproduction of lesions of postweaning multisystemic vvasting syndrome in gnotobiotic piglets, " J. Vet. Diagn. Invest. 11: 3-14 (1999); S. Kennedy et al, "Reproduction of lesions of postweaning multisystemic wasting syndrome by infection of conventional pigs with porcine circovirus type 2 alone or in combination with porcine parvovirus" J. Comp. Pathol. 122: 9-24 (2000); S. Krakowka et al, 2001, supra; S. Krakowka et al, 2000, supra; R. M. Pogranichnyy et al, "Characterization of immune response of young pigs to porcine circovirus type 2 infection, " Viral. Immunol. 13: 143-153 (2000)). Inokulumi virusa koji su upotrebljavani u ovim studijama su bili ili homogenati tkiva iz svinja kod kojih se prirodno može javiti PMWS, ili virusi propagirani u PK-15 ćelijskim kulturama (G. M. Allan et al, "Experimental infection of colostrums deprived piglets with porcine circovirus 2 (PCV2) and porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) potentiates PCV2 replication, " Arch. Virol. 145: 2421-2429 (2000); G. M. Allan et al, "A sequential study of experimental infection of pigs with porcine circovirus and porcine parvovirus: immunostaining of cryostat sections and virus isolation, J. Vet. Med. 47: 81-94 (2000); G. M. Allan et al, "Experimental reproduction of severe vvasting disease by co-infection of pigs with porcine circovirus and porcine parvovirus, " J. Comp. Pathol. 121: 1-11 (1999); M. Balasch et al, 1999, supra; J. Ellis et al, 1999, supra; S. Kennedy et al, 2000, supra; S. Krakowka et al, 2001, supra; S. Krakowka et al, 2000, supra; R. M. Pogranichnyy et al, 2000, supra). Kako ovi tkivni homogenati mogu da sadrže druge rasprostranjene svinjske agense kao PPV (SPV) i svinjski virus reproduktivnog i respiratornog sindroma (SRRSV) G. M. Allan et al, "Experimental infection of colostrums deprived piglets with porcine circovirus 2 (PCV2) and porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) potentiates PCV2 replication, " Arch. Virol. 145: 2421-2429 (2000); G. M. Allan et al, "Experimental reproduction of severe wasting disease by co-infection of pigs with porcine circovirus and porcine parvovirus, " J. Comp. Pathol. 121: 1-11 (1999); G. M. Allan and J. A. Ellis, 2000, supra; J. A. Ellis et al, "Coinfection by porcine circoviruses and porcine parvovirus in pigs with naturally acquired postweaning multisystemic wasting syndrome," J. Vet. Diagn. Invest. 12:21-27 (2000); C. Rosell et al., 2000, suprd), i kako je ATCC PK-15 ćelijska linija koja se koristi za propagiranje SCV2 perzistentno inficirana sa SCV1 (G. C. Dulac and A. Afshar, 1989, supra), klinička bolest i patološke lezije reprodukovane u ovim studijama ne moraju biti uzrokovane samo SCV2 infekcijom (G. M. Allan et al, "Experimental infection of colostrums deprived piglets with porcine circovirus 2 (PCV2) and porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) potentiates PCV2 replication," Arch. Virol. 145:2421-2429 (2000); G. M. Allan et al, "A sequential study of experimental infection of pigs with porcine circovirus and porcine parvovirus: immunostaining of cryostat sections and virus isolation, J. Vet. Med. 47:81-94 (2000); G. M. Allan et al, "Experimental reproduction of severe wasting disease by co-infection of pigs with porcine circovirus and porcine parvovirus," J. Comp. Pathol. 121:1-11 (1999); G. M. Allan and J. A. Ellis, 2000, supra; J. A. Ellis et al, 2000, supra).

Klinički PMWS takođe je reprodukovan kod CDCD svinja inokulisanih sa SCV2 kada su vakcinisane sa Mycoplasma hyopneumoniae (G. M. Allan et al, "Immunostimulation, PCV-2 and PMWS," Vet. Rec. 147:171-172 (2000)). U dve skorašnje studije od strane G. M Allan et al., "Neonatal vaccination for MycopIasma hyopneumoniae and postweaning mu!tisystemic v/asting syndrome: a field trial," Pig J. 48:34-41 (2001), and S. C. Kyriakis et al, "The effects of immuno-modulation on the clinical and pathological expression of postweaning multisystemic vvasting syndrome," J. Comp. Pathol. 126:38-46 (2002), testiran je efekta imuno-modulacije vakcine Mycoplasma hyopneumoniae na razvoj PMWS kod endemičnih krda, i pokazan je značajan pad u broju PMWS slučajeva kod nevakcinisane grupe kada su upoređene sa vakcinisanim životinjama. Međutim, u još jednoj skorašnjoj studiji u kojoj su korišćeni konvencionalni SBP prasići u kontrolisanim laboratorijskim uslovima nije bilo moguće reprodukovati ovakav efekat, što je ukazalo na to da vakcinacija sa Mycoplasma hyopneumoniae možeda potencijalno utiče na razvoj kliničkog PMWS ali jasno je da ima sekundarnu ulogu pored SCV2 infekcije. Bazirano na ovoj i drugim studijama, SCV2 se nedvosmisleno smatra primamim ali ne i ekskluizvnim uzročnim agensom PMWS.

Nedostatak stoka infektivnog virusa biološki čiste forme SCV2 je otežao razumevanje SCV2 patogeneze i etiološke uloge SCV2 u PMWS. Vakcinacije portiv PPV i verovatno SRRSV nisu se pokazale da uvek sprečavaju nastanak PMWS kod svinja inficiranih sa SCV2. Kao posledica toga jako je otežano pronalaženje sa jedne strane sigurne a sa druge strane potentne vakcine koja specifično cilja PMWS. Postoji definitivna prepoznata u veterini potreba za proizvodnjom efikasne, sigurne vakcine protiv SCV2 infekcija i PMWS.

U.S. Patent No. 6,287,856 (Poet et al.) i WO 99/459 odnose se na nuklinske kiseline iz ptičijeg virusa obolenja kljuna i pera- psittacine beak and feather disease virus (BFDV), cirkovirusa koji inficira ptičije vrste, i iz svinjskog virkovirusa (SCV). Patent predlaže kompozicije vakcina koje sadrže golu DNK ili IRNK i otkriva nukleokiselinski vektor za tranzijentnu ekspresiju SCV u eukariotskoj ćeliji koja obuhvata cis delujuće transkripcione ili translacione regulatome sekvence dobijene iz humanog citomegalovirusnog momentalnog ili ranoggenskog enhensera (pojačivač) ili promotora funkcionalno povezanog za nukleinsku kiselinu te sekvence. Međutim, kako je SCV DNK dobijena samo od PK-15 ćelijske linije, normalno je da se obuhvati i nepatogeni SCV1 koji je otkriven skoro pre 30 godina od strane I. Tischer et al., 1974, supra, i samim tim nije verovatno da je efikasan u izazivanju imune reakcije na SCV2 ili infekciju izizvanu sa SCV2. Subjedinične (subunit) vakcine rekombinantnih proteina napravljene od vektora koji obuhvataju otvorene okvire čitanja takođe se predlažu u patentu ači otvoreni okviri čitanja iz SCV nisu dobro okarakterisani niti se međusobno mogu razlikovati. Kako su izvor SCV DNK PK-15 ćelije, proteini proizvedeni iz tih vektora koji obuhvataju otvorene okvire čitanja SCV1 ne bi posedobali pouzdane imunogene osobine, ako bi ih uopšte imali, protiv SCV2.

U. S. Patent No. 6, 217, 883 (Allan et al) and French Patent No. 2, 781, 159B odnose se na izolaciju pet SCV sojeva iz plućnih ili ganglijskih uzoraka uzetih iz svinja koje su inficirane sa PMWS u Kanadi, Kalifomiji i Francuskoj (Brittany), i njihovu upotrebu u imunogenoj kompoziciji u kombinaciji sa makar jednim svinjskim parvovorusnim antigenom. Proteini koje kodiraju otvoreni okviri čitanja (open reading frame-ORF) koji se sastoji od ORF1 i ORF3 detaljno su opisani u patentu međutim ne postoji tumačenje nijednog specifičnog proteina koji pokazuje imunogene osobine. Patent dalje otkriva vektore koji se sastoje od DNK plazmida, linearnih DNK molekula i rekombinantnih virusa koji sadrže i eksprimiraju in vivo molekul nukleinske kiseline koji kodira SCV antigen, nekoliko drugih referenci, na primer U. S. Patent No. 6, 391, 314 BI; U. S. Patent No. 6, 368, 601 BI; French Patent No. 2, 769, 321; French Patent No. 2, 769, 322; WO 01/96377 A2; WO 00/01409; WO 99/18214; WO 00/77216 A2; WO 01/16330 A2; WO 99/29871; itd., takođe opisuju dostavljanje SCV1 ili SCV2 polipeptida ili nukleinskih kiselina koje kodiraju polipeptide različitih sojeva. Naročito W099/29871 i WO00/77188 opisuju zaštićene svinje od izazivanja sa patogenim SCV, posle DNK imunizacije

Međutim, nepatogeni SCV1 neće biti od koristi protiv SCV infekcije i patogeni SCV2 sojevi koji su opisani u nauci, čak i atenuirani, vrlo verovatno će biti ograničene vrednosti zbog tendencije živog virusa da se vraća u svoje virulentno stanje. Zato, i dalje postoji dugoročna potreba u ovoj oblasti nauke za živim infektivni, nepatogenim antigenom za inokulaciju svinja protiv ozbiljne infekcije ili PMWS koje izaziva SCV2, i koji je efikasan i ostaje siguran u veterinarskim vakcinama. Ovi cilejvi su zadovoljeni konstrukcijom živog himemog svinjskog cirkovirusa koji je ovde opisan, i koji se bazira na genomskoj osnovi nepatogenog SCV1 koga je izolovao I. Tischer et al., skoro pre 30 godina. Novi himemi svinjski cirkovirus iz ovog pronalaska je sposoban da zadovolji dugoročnu potrebu tako što jedinstveno i sa prednošću zadržava nepatogeni fenotip SCV1 ali izaziva specifični imuni odgovor protiv patogenog SCV2.

KRATAK SADRŽAJ PRONALASKA

Prikazani pronalazak se odnosi na infektivni himerni molekul nukleinske kiseline svinjskog cirkovirusa (SCV1-2) karakterisan sa molekulom nukleinske kiseline koji kodira infektivni, nepatogeni SCV1 koji sadrži imunogenski otvoreni okvir čitanja 2 (ORF2) gena patogenog SCV2 na mesti ORF2 gena SCV1 molekula nukleinske kiseline. Prema jednom izvođenju himemi molekul nukleinske kiseline ima nukleinsku sekvencu prikazanu na slici 9, njen komplementarni lanac ili nukleotidnu sekvencu koja je bar 95% homologa sa nukleotidnom sekvencom na slici 9.

Prikazani pronalazak se takođe odnosi na biološki funkcionalni plazmid ili virusni vektor koji sadrži himerni molekul nukleinske kiseline prema pronalasku i izolovanu ćeliju domaćina transfektovanu sa vektorm koji je karakterisan time što sadrži himemi molekul nukleinske kiseline prema pronalsku.

Prikazani pronalazak se dalje odnosi na avirulentni, infektivni himemi svinjski cirkovirus koji se dobija iz ćelija koje sadrže himemi molekul nukleinske kiseline prema pronalasku.

Prikazani pronalazak se takođe odnosi na postupak dobijanja imunogenog polipeptidnog proizvoda, a pomenuti postupakje karakterisan: rastom, pod pogodnim nutritivnim uslovima, prokariotskih ili eukariotskih ćelija domaćina transfektovanih sa himemim molekulom nukleinske kiseline prema pronalasku na način koji omogućava ekspresiju pomenutog polipeptidnog proizvoda i izolovanje željenog polipeptidnog proizvoda ekspresije pomenutog molekula nukleinske kiseline.

Prikazani pronalazak se dalje odnosi na vakcinu koja štiti svinju od virusne infekcije ili sindroma kržljavosti odbijene prasadi (PMWS) izazvane sa SCV2 koja sadrži netoksični, fiziološki prihvatljivi nosač i imunogenu količinu člana odabranog iz grupe koju čine:

(a) himemi molekul nukleinske kiseline koji ima nukleotidnu sekvencu prikazanu na slici 9, njegov komplemetami lanac ili nukleotidnu sekvencu koja je najmanje 95% homologa sa nukleotidnom sekvencom na slici 9;

(b) biološki funkcionalnoi plazmid ili viralni vektor koji sadrži himemi molekul nukleinske kiseline, komplemetami lanac ili nukleotidnu sekvencu koja je najmanje 95% homologa sa nukleotidnom sekvencom na slici 9;

(c) avirulentni infektivni himemi svinjski cirkovirus dobijen iz himemog molekula nukleinske kiseline SCV1-2, gde je ORF2 kapsidni gen SCV1 zamenjen sa OFR2 kapsidnim genom SCV2.

Prikazani pronalazak se takođe odnosi na viralnu vakcionu prema pronalasku za upotrebu u zaštiti svinje protiv virusne infekcije ili sindroma kržljavosti odbijene prasadi (PMWS) izazvanog sa SCV2 i upotrebu vakcine prema pronalasku u proizvodnji leka za zaštitu svinja protiv virusne infekcije ili sindroma kržljavosti odbijene prasadai (PMWS) izazvanog sa SCV2.

Prikazani pronalazak se takođe odnosi na postupak dobijanja infektivnih himemih molekula nukleinske kiseline SCV1-2 prema pronalasku, koji obuhvata uklanjanje otvomog okvira čitanja 2 (ORF2) gena molekula nukleinske kiseline koji kodira infektivni, nepatogeni SCV1; zamenu položaja ORF2 gena SCV1 sa imunogenim ORF2 genom iz patogene SCV2 i oporavak himemog molekula nukleinske kiseline.

Prikazani pronalazak se takođe odnosi na infektivni recipročni himemi molekul nukleinske kiseline SCV2-1 koji sadrži molekul nukleinske kiseline koj kodira infektivni, patogeni SCV2 koji ima imunogeni ORF2 gen iz nepatogenog SCV1 na mestu ORF2 gena SCV2 molekula nukleinske kiseline.

Ovaj pronalazak se prema tome tiče infektivnih himemih DNK klonova svinjskog cirkovirusa (SCV) i živih himemih virusa dobijenih iz DNK klonova koji se mogu koristiti kao vakcine.

Novi živi himemi, genetski avirulentni virusi se prave od nepatogene SCV genomske strukture u kome gen za imunogenost patogenog SCV2 soja zamenjuje gen iz SCV1, na istoj odgovarajućoj poziciji. Pronalazak obuhvata biološki funkcionalne plazmide, virusne vektore i slične koji sadrže nove rekombinantne molekule nukleinskih kiselina koji su ovde opisani, pogodne ćelije domaćine transfektovane vektorima koji sadrže DNK i postupak za dobijanje imunogenih polipeptidnih proizvoda. Takođe ovom prijavom je obuhvaćena virusna vakcina i njena upotreba u zaštiti svinja od infekcije ili sindroma kržljavosti odbijene prasadi (postweaning multisystemic wasting-PMWS) koga izaziva SCV2 .

Ovaj pronalazak dalje obezbeđuje recipročne himerae DNK klonove SCV koji su našli upotrebu kao eksperimentalni modeli za dobijanje ili karakterizaciju novih avirulentnih viralnih vakcina.

KRATAK OPIS SLIKA

Istorijat pronalaska i njegovo udaljavanje od nauke biće dalje opisano u tekstu koji sledi sa referencama koje su priložene uz slike naznačeno time da:

Slika 1 predstavlja konstrukciju molekularnog DNK klona infektivnog SCV2. Relativne pozicije para prajmera koji su upotrebljeni za umnožavanje kompletnog SCV2 genoma označeni s strelicama (reverzni prajmer PCVSAC2, forward prajmer PCVSAC2). SCV2 genomska DNK koja je umnožena PCR-om (lančana reakcija polimeraze) isečena je sa Sadi restrikcionim enzimom, i zatim prečišćena. Prečišćena i isečena sa SacII genomska DNK je ligirana da bi formirala konkatemere (concatemers). Ligirani konkatemeri se razdvajaju elektroforezom na gelu, tandem genomski dimer SCV2 se prečišćava i klonita u pSK vektor koji je već isečen sa SacII enzimom u cilju dobijanja molekularnog SCV2 DNK klona.

Slike 2A i 2B pokazuju da je klonirana SCV2 plazmidna DNK infektivna kada se transfektije in vitro u PK-15 ćelije. Slika 2A prikazuje detekciju SCV2 antigena pomoću eseja imunoflorescencije (IFE) u PK-15 ćelijama koje su transfektovane sa kloniranom SCV2 plazmidnom DNK. Intenzivno imuno bojenje SCV2 antigena vidi se u jedru, i nešto manje u citoplazmi transfektovanih ćelija. Slika 2B pokazuje lažno-transfektovane PK-15 ćelije.

Slika 3 A prikazuje pluća svinje koja je inokulisana intralimfoidnim putem sa SCV2 DNK pri 21 DPI. Pluća su poput gume, ne mogu da kolabiraju (coliapse) i išarana smeđe-crveno. Traheobronhijalni limfni čvorovi su vidno uvećani i smeđi (strelice). Slika 3B predstavlja mikroskopski preparat (isečak) nirmalnog plućnog krila iz kontrolne svinje (25X). Slika 3C predstavlja mikroskopski isečak pluća iz svinje sa slike 3A. Obratiti pažnju na peribronhionalnnu limfohistiocitičnu upalu i blago nekrotični bronhiolitis (25X). Slika 3D je ilustracija imunohistohemijskog bojenja pluća sa slike 3A. Obtratiti pažnju na SCV2 antigen u makrofazima (strelice) i fibrobiastima sličnim ćelijama (samo glave strelica) u disajnim putevima (64X).

Slika 4A prikazuje normalni limfni čvor iz kontrolne svinje. Obratiti pažnju na dobro defmisane limfoidne folikule (strelice) (25X). Slika 4B predstavlja mikroskopski presek traheobranhijalnog limfnog čvora svinje sa slike 3A koja je inokulisana 21 dana ranije intralimfoidnim putem sa kloniranom SVC2 genomskom DNK. Limfoidni folikuli su slabo definisani, postoji blago do umereno limfno raspadanje (depletion), i blaga multifokalna granulomatozna upala (25X). Slika 4C predstavlja mikroskopski isečak limfnog čvora sa slike 4B na većem uveličanju i to fokusiran je na jedan folikul. Zapaziti slabo defmisane folikule sa makrofazima i gigantskim ćelijama (strelice) koje zamenjuju folikulame limfocite (64X). Slika 4D prikazuje

imunohistohemijsku detekciju SCV2 antigena u istom limfnom čvoru kao što je onaj na slici 4B u makrofazima (sterlice) i gigantskim ćelijama (male strelice), i dendričnim ćelijama slične ćelije (velike glave sterlica) u

folikulima (64X).

Slika 5 prikazuje konstruisanje himemog SCV1-2 (SCV1/SCV2) DNK klona sa nepatogenim SCV1 genomom koji nosi imunogeni ORF2 gen kapsida patogenog SCV2. Dimerizovani DNK klon se upotrebljava za in vitro transfekciju PK-15 ćelija da bi se proizveo živi himerni virus koji eksprimira ORF2 protein iz SCV2, i za in vivo životinjske eksperimente da bi se potvrdila aktivnost.

Slika 6 predstavlja konstrukciju i organizaciju infektivnih SCV1, SCV2, himemih SCV1-2 i recipročno himernih SCV2-1 molekularnih DNK klonova. SCV DNK klon je konstruisan ligiranjem dva kompletna linearna SCV2 genoma u tandemu u Bluescript SK vektor (pSK) pomoću opšte poznatih postupaka ranije već opisanih (M. Fenaux et ah, 2002, supra). SCV1 DNK klon je konstruisan ligiranjem dva kompletna linearna SCV1 genoma u tandemu u pSK vektor. Himerni SCV 1-2 DNK kolon konstruisanje zamenom ORF2 kapsidnog gena iz SCV1 sa istim iz SCV2 u nepatogenoj SCV1 genomskoj osovini (backbone) u pSK vektor. Recipročni SCV2-1 DNK klon konstruisanje zamenom ORF2 kapsidnog gena patogenog SCV2 sa onim iz nepatogenog SCV1 u patogenoj SCV2 genomskoj osovini (backbone) u pSK vektoru. Oba himema klona su dimeri u pSK vektoru. Strelice predstavljaju relativne pozicije PCR prajmera za detekciju SCV1, SCV2, SCV 1-2 i SCV2-1 viremija u inokulisanim životinjama.

Slike 7A-7J pokazuju da su SCV1, SCV2, himerni SCV 1-2 i recipročno himerni SCV2-1 DNK kolonovi infektivni i eksprimiraju odgovarajuće viralne antigene kada se transfektuju in vitro u PK-15 ćelije. Levi panel (7A, 7C, 7E, 7G i 71) je obojen sa monoklonalnim antitelima protiv SCV1 ORF2. desni panel (7B, 7D, 7F, 7H i 7J) obojen je sa antitelima protiv SCV2. Paneli 7A i 7B su lažno transfektovane PK-15 ćelije. Paneli 7C i 7D su PK-15 ćelije transfektovane sa SCV1 DNK klonom. Paneli 7E i 7F su PK-15 ćelije transfektovane sa SCV2 DNK klonom. Paneli 7G i 7H su PK-15 ćelije transfektovane sa himemim SCV1-2 DNK klonom. Paneli 71 i 7J su PK-15 ćelije transfektovane sa recipročnim SCV2-1 DNK klonom.

Slika 8 predstavlja celokupnu DNK sekvencu klonirane SCV2 molekularne DNK (koja odgovara SEQID NO: 1).

Slika 9 predstavlja celokupnu DNK sekvencu klonirane himeme SCV1-2 DNK (koja odgovara SEQ ID NO:2).

Slika 10 predstavlja DNK sekvencu imunogenog ORF2 kapsidnog gena klonirane himeme SCV1-2 DNK (koja odgovara SEQ ID NO:3).

Slika 11 predstavlja pretpostavljenu amino kiselinsku transleciju imunogenog ORF2 kapsidnog gena himeme SCV1-2 DNK (koja odgovara SEQ ID NO:4).

DETALJAN OPIS PRONALASKA

U skladu sa ovim pronalaskom, obezbeđeni su infektivni molekulski i himemi molekuli nukleinskih kiselina svinjskog cirkovirusa (SCV), živi himemi virusi koji su proizvedeni od himemog molekula nukleinske kiseline i veterinarskih vakcina u cilju zaštite svinja od viralne infekcije ili sindroma kržljavosti odbijene prasadi (postweaning multisystemic wasting syndrom-PMWS) koji izaziva SCV2. Ovaj pronalazak dalje obezbeđuje imunogene polipeptidba ekspresione produkte koji se mogu iskoristiti kao vakcine.

Novi avirulentni infektivni himemi DNK molekul SCV (SCV 1-2) oduhvata molekul nukleinske kiseline koji kodira infektivni, nepatogeni SCV1 koji sadrži imunogeni otvoreni okvir čitanja (ORF) gen patogenog SCV2 umesto ORF gena u SCV1 genomu. Infektivni himemi SCV1-2 klon poželjno je da sadrži imunogeni gen kapsida (ORF2) iz SCV2 DNK kloniran u gebomsku osovinu (backbone) infektivnog nepatogenog SCV1 DNK klona. Kapsidni gen iz SCV2 DNK zamenjuje ORF gen SCV1 DNK u nepatogenoj SCV1 genomskoj strukturi, a putem genetičkog inžinjerstva se konstruišu različite pozicijske permutacije i tako su dobijeni opisani avirulentni ili atenuirani himemi DNK klonovi. Recipročni himemi infektivni SCV2-1 DNK klon između SCV1 i SCV2 je stavljen kao kontrola da bi se analizirao himemi SCV1-2 klon iz ovog pronalaska i konstruisan je tako što je zamenjen kapsidni gen iz SCV2 sa istim iz SCV1 u osovini patogenog SCV2 infektivnog DNK klona. Pored toga što se koristi kao eksperimentalni model, recipročni himemi infektivni SCV2-1DNK klon može naći primenu u specifično skrojenim vakcinama.

Za kloniranu genomsku DNK SCV2 koja je ovde opisana pokazano je da su i in vitro i in vivo infektvni kada se transfektuju u PK-15 ćelije i daju se svinajma. Infektivni SCV2 DNK klon proizvodi patološke lezije koje su karakteristične za PMWS kod svinja i tako omogućava poboljšanu karakterizaciju kliničke bolesti i razumevanju distribucije virusa u ćelijama tkiva. Ovaj novi pripravni reproduktivan patogeni agens pruža mogućnost za razvoj pogodnnog programa vakcinacije u cilju prevencije PMWS kod svinja.

Novi himemi SCV1-2 DNK klon takođe je infektivan i u in vitro transfekciji PK-15 ćelija i u in vivo dostavljanju svinjama. U transfektovanim PK-15 ćelijama himemi SCV1-2 DNK eksprimira SCV2 kapsidni antigen (imunogeni kapsidni protein iz SCV2) dok recipročni himemi SCV2-1 DNK klon eksprimira SCV1 kapsidni antigen, koji je deminstriran putem eseja imuno fluorescencije (IFE) pomoću antitela specifičnih za SCV1 ili SCV2 kapsidni antigen. Serokonverzija u SCV2-specifično antitelo detektovana je kod svinja koje su inokulisane sa infektivnim SCV2 kolonom kao i sa himemim SCV1-2 klonom. Detektovanje serokonverzije u SCV2-specifično antitelo pokazuje da himemi SCV1-2 DNK klon indukuje SCV2-specifično antitelo kod inficiranih svinja i kao posledica toga ima ulogu u zaštiti svinja od infekcije sa SCV2.

Primeri koji slede detaljnije opisuju procenu imunogenosti i patogenosti himemih DNK klonova kod inokulisanih svinja. U osnovi, serokonverzija u antitela protiv SCV2 ORJF2 antigena detektovana su kod svinja koje su inokulisane sa SCV2 DNK klonom (grupa 3), i himemim SCV1-2 DNK klonom (grupa 4). Sve svinje inokulisane sa SCV1 klonom i recipročnim himemim SCV2-1 DNK klonom (grupe 2 i 5) podležu serokonverziji u SCV1 antitelo. Virusi koji su izvađeni iz selektovanih svinja u svakoj grupi delimično su sekvencirani i potvrđeno je da su autentični odgovarajući infektivni DNK klonovi koji su korišćeni u inokulaciji. Krupne i mikroskopske lezije u različitim tkivima životinja koje su inokulisane sa SCV2 DNK klonom značajno su teže i ozbiljnije nego one pronađene kod svinja inokulisanih sa SCV1, himemim SCV1-2 i recipročnim himemim SCV2-1 DNK klonovima.

Iznenađujuće i korisno, himemi SCV1-2 DNK klon koji poseduje imunogeni kapsidni gen (ORF2) patogenog SCV2 kloniranog u nepatogenu SCV1 genomsku kičmu (backbone) indukuje specifični odgovor antitelima na patogeni SCV2 kapsidni antigen, dok isključivo zadržava nepatogenu prirodu SCV1 kod svinja. Životinje inokulisane sa himernim SCV1-2 DNK klonom razvijaju umerenu infekciju koja podseća na onu koja se javlja kod životinja koje su inokulisane sa SCV1 dok podležu serokonverziji u antitela protiv ORF2 kapsidnog proteina patogenog SCV2. Prosečna dužina viremije primećene kod životinja inokulisanih sa SCV1 i himemim SCV1-2 je kraća, 0.625 nedelja i 1 nedelju, respektivno u odnosu na životinje inokulisane sa patogenim SCV2 kod kojih je oko 2.12 nedelja. Odsustvo detektibilne himeme SCV1-2 viremije kod nekih inokulisanih životinja nema uticaja na serokonverziju u antitela protiv SCV2 ORF2 kapsidnog proteina kod svinja inokulisanih sa SCV1-2 (grupa 4). Ovi rezultati ukazuju na to da iako je viremija sa himemim SCV1-2 kratka ili nedetektabilna kod nekih inolkulisanih životinja, himemi SCV1-2 virus je sposoban da indukuje odgovor antitelima protiv SCV2 ORF2 kapsidnog proteina. Posebna sposobnost himemog SCV1-2 infektivnog DNK klona da indukuje imuni odgovor koji je specifičan na patogeni SCV2 imunogeni ORF kapsidni protein a pri tome ostaje nepatogen za svinje čini himemi SCV1-2 klon povoljnim u smislu genetski napravljene žive-atenuirane vakcine i za druge tipove vakcina.

Novi, prečišćeni i izolovani molekuli nukleinskih kiselina iz ovog pronalaska obuhvataju celokupnu DNK sekvecnu klonirane DNK himemog SCV1-2 prikazanu u SEQ ID NO:2, prikazana na slici 9, i deponovana u American Type Culture Collection pod određenima patentnim brojem za deponovanje (Patent Deposit Designation) PTA-3912; njen komplementarni lanac (i.e., reverzni i naspramni bazni parovi) ili nukleotidne sekvence koje su najmanje 95% homologe sa himernom nukleotidnom sekvencom (i. e., značajno aktivan deo čitavog gena). Konvencionalne metode koje su u nauci poznatee mogu se koristiti za pravljenje komplementarnog lanca ili nukleotidne sekvence koje imaju visoku homologiju, na primer, pomoću poznatih metode hibridizacije (standardna ili “high stringency”). Prečišćeni i izolovani molekul nukleinske kiseline koji sadrži DNK sekvencu imunogenog kapsidnog gena klonirane himeme SCV1-2 DNK takođe je prikazana u SEQ ID NO:3 i slici 10.

Pogodne ćelije koje sadrže himemi molekul nukelinske kiseline jedinstveno proizvode žive, infektivne himeme svinjske cirkoviruse. Živi, infektivni himemi virus dobijen je iz himemog DNK klona putem transfekcije PK-15 ćelija in vivo i in vitro transfekcijama na način koji je ovde ilustrovan. Poželjni primer klonirane DNK himemog SCV1-2 je nukleotidna sekvenca koja je prikazana u SEQ ID NO:2 i slici 9. Ovaj pronalazak dalje predviđa to da je himemi virus dobijen od komplementarnog lanca ili nukleotidne sekvence koja poseduje visoku homologiju, najmanje 95% je homologa sa himemom nukleotidnom sekvencom.

Takođe su u okviru ovog pronalaska uključeni biološki funkcionalni plazmidi, viralni vektori i slični koji sadrže nove rekombinantne molekule nukleinskih kiselina koje su ovde opisane, pogodne ćelije domećine koje su transfektovane vektorima koji obuhvataju himeme i molekularne DNK klonove i proizvode koji eksprimiraju imunogene polipeptie. Posebno poželjan imunogeni protein ima amino kiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO:4 i na slici 11. Njegove biološki aktivne varijante dalje su obuhvaćene ovim pacijentom. Obična osoba iz ove oblasti nauke znala bi bez napora da modifikuje, zameni, deletira...amino kislein(e) iz polipeptidne sekvence i da proizvede biološki aktivne varijante koje zadržavaju istu, ili u suštini istu aktivnost kao i kao i roditeljska sekvenca.

U cilju proizvodnje ovde opisanih imunogenih polpipeptidnih proizvoda, proces može da obuhvati sledeće korake: gajenje, u odgovarajućim nutritivnim uslovima, prokariotskih ili eukariotskih domaćinskih ćelija koje su transfektovane sa novim rekombinantnim molekulima nukelinske kiseline koji su ovde opinasani na način koji omogućava ekspresiju pomenutih polipeptidnih proizvoda, i izolaciju željenih polipeptidnih proizvoda koji su produkti ekspresije pomenutih molekula nukleinskih kiselina standardnim postupcima koje se koriste u nauci. Spekuliše se da se imunogeni proteini mogu pripremiti drugim tehnikama kao na primer, biohemijska sinteza i slične.

Vakcine himemih i molekularnih DNK klonova, i metode za njihovo korišćenje takođe su uključene u polje ovog pronalaska. Inokulisane svinje su zaštićene od ozbiljne viralne infekcije i PMWS koga izaziva SCV2. Nov postupak štiti svinje koje zahtevaju zaštitu od viralne infekcije ili PMWS putem dostavljanja svinji imunološki efektivne količine vakcine na osnovu ovog pronalaska, kao na primer, vakcine koja obuhvata imunogenu količinu himeme SCV1-2 DNK, kloniran himemi virus, plazmid ili viralni vektor koji sadrži himemu DNK iz SCV1-2. Drugi antigeni kao PRRSV, PPV, drugi svinjski infektivni agensi i imuno stimulanti mogu se davati konkurentno svinji da bi se obezbedio širok spektar protekcije od viralnih infekcija.

Vakcine obuhvataju na primer, infektivnu himemu SCV1-2 DNK, kloniranu SCV himemu genomsku DNK u pogodnom plazmidu ili vektoru kao što je na primer, pSk vektor, avirulentni, živi himemi virus, inaktivirani himemi virus itd u kombinaciji sa netoksičnim, fiziološki prihvatljivim nosačem i opcionalno, jednim ili više adjuvanata. Infektivna himema SCV 1-2 DNK, plazmidna DNK koja sadrži infektivni himemi viralni genom i živi himemi virus su poželjni dok je najpoželjniji živi himemi virus. Avirulenma, živa viralna vakcina iz ovog pronalaska obezbeđuje prodnost u odnosu na tradicionalne viralne vakcine u kojima se koriste ili atenuirani živi virusi kod kojih postoji opasnost da revertiraju u virulentni oblik, ili ubijene kulture ćelija propagirane sa celim virusom koji ne mora da indukuje dovoljan imuni odgovor sa antitelima za zaštitu od viralnog obolenja.

Adjuvant, koji se može dostavljati u konjunkciji sa vakcinom iz ovog pšomalaska, je substanca koja povećava imunološki odgovor svinje na vakcinu. Adjuvan se može odstavljati u isto vreme i na isto mesto kao vakcina li u različito vreme na primer kao “booster”. Adjuvanti mogu se takođe sa prednošću dostavljati svinji na način ili na mesto koje je raličito od načina i mesta na koje se dostavlja vakcina. pogodni adjuvati uključuju, ali nisu limitirani samo na njih, aluminijum hidroksid (alum), imunostimulirajući kompleks (ISKOMS), ne jonski blok polimeri ili kopolimeri, citokini (kao IL-1, IL-, IL-7, IFN-a, IFN-bb, IFN-y, itd), saponini, monofosforil lipid A (MLA), miramil dipeptiddi (MDP) i slični. Drugi pogodni adjuvanti uključuju na primer, aluminijum kalijum sulfat, toplotno labilni ili toplotno stabilni enterotoksin izolovan iz Escherichia coli, kolera toksin ili njegova B subjedinica, toksin difterije, teteanus toksin, pertusi (veliki kašalj) toksin, Freund-ov nekompletni ili kompletni adjuvant, itd. Adjuvanti bazirani na toksinu, kao toksin difterije, teetnusa i pertusis toksin mogu se inaktivirati pre upotrebe na primer tretmanom sa formaldehidom.

Vakcine mogu dalje da sadrže dodatne antigene da bi potpomogle imunološku aktivnost infektivnih himernih SCV DNK klonova kao na primer, virus svinjskog reproduktivnog i respiratornog sindroma (PRRSV), svinjski parvovirus (SPV), drugi svinjski agensi i imunostimulanti.

Nove vakcine iz ovog pronalaska ne moraju se pripremati samo na neki poseban način. Klonirane viralne vakcine uključuju ali nisu njima limitirane infektivne DNK vakcine (na pr upotrebom plazmida, vektora ili drugih konvencionalnih nosača da se direktno injecira DNK u svinje), žive vakcine, modifikovane žive vakcine, inaktivisane vakcine, atenuirane vakcine, genetski konstruisane vakcine, itd. Ove vakcine se pripremaju standardnim postupcima poznatim u nauci.

Živa viralna vakcina generalno je najpoželjnija vakcina u smislu da se svi kompletni imuni odgovori aktiviraju u recipijentu koji dobije vakcinu, uključujući sistemski, lokalni, humoralni i ćelijski posredovani imuni odgovori. Ubijena vakcina, sa druge strane može da indukuje humoralni imuni odgovor. Iako najpoželjnije međutim žive viralne vakcine imaju nekoliko nedostataka, kao potencijalni rizik od kontaminacije sa živim slučajnim viralnim agensoma ili rizik da virus može da revertira u virulentni oblik na terenu. Ono što je interesantno, jedinstvena SCV1-2 himema SCV DNK iz ovog pronalaskaprevazilazi ove probleme. Upotrebom samo imunogenih gena patogenog SCV2, himema DNK konstruktisana je od živog, replikativnog himernog virusa koji je nepatogen ali izaziva kompletne povoljne imune odgovore od žive viralne vakcine protiv patogenog SCV2 virusa. Žiav viralna vakcina bazirana na himernom virusu imaće male šanse, ako ih uopšte bude imala, za reverziju u patogeni fenotip. Zato, novi himerni virus baziran na strukturi nepatogenog SCV1 ima veliku prednost u odnosu na bilo koji rekombinanatni SCV DNK virus, bilo koju živu, atenuiranu SCV2 vakcinu ili bilo koji drugi tip vakcine zasnovanoj samo na SCV2 za imunitet protiv SCV2 infekcija.

Iako je živa viralna vakcina najpoželjnija, drugi tipovi vakcina mogu se iskoristiti za inokulaciju svinja sa novim himernim virusom i drugim antigenima koji su ovde opisani. Da bi se pripremile inaktivisane virusne vakcine, na primer, propagacija virusa iz infektivnog DNK klona izvodi se postupcima poznatim u nauci ili pomoću onih koje su opisane ovde u pronalasku. Srijska inaktivacija virusa se zatim optimizuje protokolima koji su generalno poznati onima koji se bave ovim delom nauke.

Ianktivisane virusne vakcine mogu se pripremati tretiranjem himernih virusa dobijenih od klonirane SCV DNK sa agensima za inaktivaciju kao što su formalin ili hidrofobni rastvarači, kiseline itd., zračenjem sa ultravioletnim svetlom ili X zracima, zagrevanjem itd. Inaktivacija se izvodi na način koji razumeju osobe koje se ovom oblašću bave. Na primer, u hemijskoj inaktivaciji, pogodan uzorak virusa ili uzorak seruma koji sadrži virus tretira se dovoljno dugo sa dovoljnom količinom ili koncentracijom inaktivišućeg agensa pro dovoljno visokoj (ili niskoj, u zavisnosti od inaktivišućeg agensa) temperaturi ili pH da bi se inaktivirao virus. Inaktivacija zračenjem se izvodi pomoću talasne dužine svetlosti ili drugog izvora energije u vremenskom periodu dovoljno dugom da se inaktivira virus. Virus se smatra inaktiviranim ako nije u stanju da inficira ćeliju podložnu infekciji.

Da bi se pripremile atenuirane vakcine iz patogenih klonova, živi patogeni klonovi adaptirani na kulturu tkiva se prvo atenuiraju (pretvaraju se u nepatogeni ili bezopasni oblik) postupcima koji su poznati u nauci, tipično se prave serijski pasaži kroz ćelijske kulture. Ateuacija patogenih klonova može se takođe izvesti putwm delecije gena ili mutacijama gena proizvedenim u virusu. Zatim se atenuirani SCV2 virusi mogu koristiti za konstruisanje dodatnih himernih SCV 1-2 virusa koji zadržavaju nepatogeni fenotip SCV1 ali se mogu razlikovati u jačini imunogenih osobina koje su odabrane iz genoma SCV2 pomoću tehnologije rekombinantne DNK.

Najpoželjnija vakcina sadrži živi himerni virusni DNK klon, koji sadrži imunogene gene SCV2 klonirane u kičmu (backbone) nepatogenog SCV1 kao što je defmisano u patentnim zahtevima. Korisno je to što živi himerni virus, koji je prirodno avirulentan kada se konstruiše pomoću genetičkog inžinjerstva, ne zahteva vremenski duge procedure za atenuaciju. Virus isključivo služi kao živi ali nepatogeni replicirajući virus koji proizvodi imunogene proteine protiv SCV2 tokom replikacije virusa, koji zatim mogu sa izazovu čitav dijapazon imunih odgovora na patogeni SCV2.

Kao buduća koorist, poželjni živi himemi virus iz ovog pronalaska obezbeđuje genetski stabilnu vakcinu koja se lakše proizvodi, čuva i dostavlja u odnosu na druge tipove atenuiranih vakcina. Avirulentne ili atenuirane vakcine koje se baziraju na himemim virusima smatraju se sigurnim kao, ako ne i sigurnijim od, tradicionalno modifikovane žive vakcine (J. Arroyo et al, "Molecular basis for attenuation of neurovirulence of a yellow fever Virus/Japanese encephalitis virus chimera vaccine (ChimeriVax-JE)," J. Virol. 75(2):934-942 (2001); F. Guirakhoo et al, "Recombinant chimeric yellow fever-dengue type 2 virus is immunogenic and protective in nonhuman primates," J. Virol. 74(12):5477-5485 (2000); S. Tang et al, "Toward a poliovirus-based simian immunodeficiency virus vaccine: correlation between genetic stability and immunogenicity," J. Virol. 71(10):7841-7850 (1997)). Na primer, ChimeriVax-JE vakcina protiv Japanskog encefalitis virusa (JEV), koji je konstruisan genetskim inžinjerstvom i predtsvalja derivat virusa žute groznice YFV17D u kome su geni koji kodiraju struktum proteine prM i E iz YFV17D zamenjeni sa odgovarajućim genima iz atenuiranog soja JEV SA 14-14-2, pokazano je daje getetski stabilan nakon produženih pasaža kao in vitro tako i in vivo (J. Arroyo et al., 2001, supra). Za još jednu vakcinu sa himemim virusom ChimeriVax-D2 protiv Dengue virusa tipa 2, koji predstavlja atenuirani himemi virus žute groznice (YF)-dengue tip 2, takođe je pokazano da je genetski stabilna; piokazano je da se njegova sekvenca ne menja nakon 18 pasaža u Vero ćelijama (F. Guirakhoo et al, 2000, supra).

Još jedna poželjna vakcina iz ovog pronalaska koristi pogodne plazmide z adostavljanje nepatogenog himemog DNK klona svinjama. Za razliku od tradicionalne vakcine koja koristi žive ili ubijene ćelijske kulture propagirane celim virusom, ovaj pronalazak obezbeđuje direktnu inokulaciju svinja sa plazmidnom DNK koja sadrži infektivni himemi viralni genom.

Dodatne genetski konstruisane vakcine, koje su poželjne u ovom pronalasku, proizvode se tehnikama poznatim u ovoj oblati nauke. Ovakve tehnike obuhvataju ali nisu limitirane samo na njih, dalje manipulecije sa rekombinanatnom DNK, modifikaciju ili zamene u amino kiselinske sekvence rekombinanatnih proteina i slične.

Genetski konstruisane vakcine bazirane na tehnologiji rekombinanatne DNK se prave na primer, identifikacijom alternativnih delova viralnog gea koji kodiraju proteine odgovorne za indukciju jačeg imunog ili protektivnog odgovora u svinjama (na pr. proteini izvedeni iz ORF3, ORF4 itd). Ovakvi identifikovani geni ili imuno-dominantni fragmenti mogu se klonirati u standame vektore za ekspresiju proteina, kao bakulovirusni vektor, i upotrebiti za inficiranje odgovarajućeh domaćinskih ćelija (videti na primer 0'Reilly et al., "Baculovirus Expression Vectors: A Lab Manual," Freeman & Co., 1992). Domaćinske ćelije se kultivišu, i tako eksprimiraju željene proteine vakcine, koji se mogu prečistiti do željenog nivoa i dalje se mogu formulisati u pogodnu finalnu vakcinu.

Ako u klonovima ostane neka nepoželjna prirodna osobina koja izaziva bolest, takođe je moguće da se promene nukleotidne sekvence u viralnom genomu koje su odgovorne za virulentnost, i genetski konstruisati avirulentni virus putem na primer “site directed” mutageneze. Pomoću “site directeđ” mutageneze moguće je dodati, deletirati ili promeniti jedan ili više nukleotida (videti na primer Zoller et al., DNA 3:479-488, 1984). Sintetisan je oligonukleotid koji sadrži željenu mutaciju i vezan (annealing) je za deo jednolancane viralne DNK. Hibridni molekul, koji nastaje u proceduri, koristi se za transformaciju bakterija. Dvolančana DNK, koja je izolovana i sadrži odgovarajuću mutaciju, koristi se za dobijanje DNK kompletne dužine putem ligacije sa restrikcionoim fragmentom gore pomenutog viursa koji se zatim transfekuje u pogodnu ćelijsku kulturu. Ligacija genoma u pogodan vektor za transfer može se postići pomoću standardne tehnike pozante osobama koje se bave ovom oblašću nauke. Transfekcija vektora u ćelije domaćine da bi se proizvela potomstvo virusa može se izvesti pomoću bilo koje od konvencionalnih postupaka kao što je kalcijum fosfatna ili posredovana DEAE-dekstranom transfekcija, elektroporacija, fuzija protoplasta i druge već poznate tehnike (e.g., Sambrook et ai, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual," Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Klonirani virus tada pokazuje željenu mutacijku. Alternativno, mogu se sintetisati dva oligonukleotida koji sadrže odgovarajuću mutaciju. Oni se mogu vezati za dvolančanu DNK koja se može ubaciti u viralnu DNK da bi se dobila DNK kompletne dužine.

Proteini konstruisani tehnikama genetičkog inžinjerstva, koji su korisni za vakcine, na primer, mogu biti eksprimirani u ćelijama insekata, ćelijama kvasca ili sisarskim ćelijama. Proteini konstruisani tehnikama genetičkog inžinjerstva, koji mogu biti prečišćeni ili izolovani konvencionalnim postupcima, mogu biti direktno inokulisani u svinje da bi se potvrdila zaštita od viralne infekcije ili sindroma kržljavosti odbijene prasadi (postv/eaning vvasting syndrom-PMWS) koga izaziva SCV2.

r

Celijska linija insekta (kao HI-FIVE) može se transfromisati sa transfer vektorom koji sadrži molekule nukleinske kiseline dobijene iz virusa ili kopirane iz viralnog genoma koji kodiraju jedan ili više imuno-dominantnih proteina iz virusa. Transfer vektor uključuje, na primer, linearizovau DNK bakulovirusa i plazmid koji sadrži željene polinukleotide. Domaćinska ćelisjska linija može biti ko-transfektovana sa linearizovanom DNK bakulovirusa i plazmidom koji sadrži željene polinukleotide.

Altrenativno, DNK iz svinje koja pati od PMWS, koja kodira jedan ili više kapsidnih proteina, infektivni SCV2 molekularni DNK klon ili kloniran SCV himemi DNK genom mogu se ubaciti u žive vektore, kao poxvirus ili adenovirus i tako upotrebiti kao vakcina.

Imunološki efikasna količina vakcina iz ovog pronalaska dostavlja se svinji koja ima potrebu za zaštitom od viralne infekcije ili PMWS. Imunološki efikasna količina ili imonogena količina kojom se inokuliše svinja može se lako odrediti ili lako titirirati rutinskim testiranjem. Efikasna količina je ona u kojoj se postigne dovoljni imunološki odgovor na vakcinu u cilju zaštite svinje koja je izložena virusu koji izaziva PMWS. Poželjno je da se svinja zaštiti do nivoa gde su značajno redukovani, poboljšani ili potpuno sprečeni jedan ili svi nepoželjni štetni fiziološki simptomi ili efekti viralnog obolenja.

Vakcina se može dostaviti kao pojedinačna doza ili u ponovljenim dozama. Doziranja mogu varirati u opsegu na primer od 1 do 1000 mikrograma plazmidne DNK koja sdrži infektvni himemi DNK genom ( u zavisnosti od koncentracije imunoaktivne komponente, ali ne bi trebalo da sadrži količinu antigena koji je izazvan virusom koja može dovesti do nastanka štetnih reakscinoih ili fizioloških simptoma viralne infekcije. U nauci su poznati postupci za determinaciju ili titriranje pogodnih doza aktivnog antigenog agensa koji se baziraju na težini svinje, koncentraciji antigena i drugim tipičnim faktorima. Poželjno je da se infektivni himemi DNK klon koristi kao vakcina, ili se živi infektivni himemi virus može dobiti in vitro i zatim se tada živi himemi virus korsiti kao vakcina. U tom slučaju, Svinji se može dati 100-200 miligrama klonirane himerne SCV DNK ili oko 10,000 50% infektivne doe kulture tkiva (IDKT50) živog himemiog virusa.

Poželjno je da se vakcina dostavlja svinji koja nije još izložena SCV virusu. Vakcina koja sadrži himemi SCV 1-2 infektivni DNK klon ili druge njegove antigene forme može se jednostavno dostaviti intranazalno, transdermalno (na pr naneseno na kožu ili na površnu kožee za sistemsku absorbciju), parenteralno...itd. Parenteralni put dostavljanja uključuje ali nije samo na njih limitiran, intramuskulame, intravenske, intraperitonealne, intradermalnoe (i.e., injeciranje ili na neki drugi način naneseno na kožu) puteve i slično. Kako su intramuskulami i intradermalni putevi inokulacije bili uspešno izvedeni u drugim studijama koji se bave viralnim infektivnim DNK klonovima E. E. Sparger et al, "Infection of cats by injection with DNA of feline immunodeficiency virus molecular đone," Virology 238:157-160 (1997); L. Willems et al, "In vivo transfection of bovine leukemia provirus into sheep," Virology 189:775-777 (1992) ovi puitevi su i najpoželjniji, pored praktičnog intranazalnog puta dostavljanja. Iako je manje zgodno razmatra se takođe da se vakcina daje svinji putemintralimfoidnog puta inokulacije Jedinstven i izuzetno poželjan postupak dostavljanja uključuje direktno injeciranje plasmidne dNK koja sadrži SCV 1-2 himeru u svinju intramuskulamo, intradermalno, intralimfoidno itd..

Kada se dostavlja u obliku tečnosti, vakcina iz ovog pronalaska može se pripremiti u formi vodenog rastvora, sirupa, eliksira i sličnih. Ovakve formulacije već su pozante u nauci i tipično se pripremajurastvaranjem antigena i drugih tipičnih aditiva u odgovarajućem nosaču ili sistemu za rastvaranje. Pogodni nosači ili rastvarači uključuju, ali nisu limitirani samo na njih, vodu, fiziološki rastvor, etanol, etilen glikol, glicerol itd. Tipični aditivi su na primer, sertifikovane boje, dodaci za ukus, zasladivači i antimikrobijalni

prezervativi kao timerosal (natrijum etilmerkuritiosalicilat). Ovakvi rastvori mogu biti stabilizovani na primer, dodavanjem delimično hidroziiovanog želatina, sorbitola ili medijuma za ćelijsku kulturu, i mogu biti puferisani konvencionalnim postupcima pomoću reagensa koji su već poznati u nauci, kao što je natrijum hidrogen fosfat, natrijum dihidrogen fosfat, kalijum hidrogen fosfat, njihova mešavina, i slični.

Tečne formulacije takođe mogu da uključe suspenzije i emulzije koje sadrže agense za rastvaranje ili emulzifikaciju u kombinaciji sa drugim standardnim ko-formulantima. Ovi tipovi tečnih formulacija mogu se pripremiti konvencionalnim postupcima. Suspenzije se na primer, mogu pripremiti upotrebom koloidne vodenice (mili). Emulzije se, na primer mogu pripremiti pomoću homogenizatora.

Parenteralne formulacije, koje su dizejnirane za injeciranje u sistem telesnih tečnosti, zahtevaju da telesnih tečnosti svinje imaju odgovarajuću izotoničnost i da budu pH puferisane do odgovarajućih nivoa. Izotoničnost se može podestiti na odgovarajući način sa natrijum hloridom i drugim solima u zavisnosti od potrebe. Pogodni rastvarači, kao stoje etanol ili propilen glikol, mogu se upotrebiti za povećanje rastvorljnivosti sastojaka u formulaciji i za stabilnost tečnog pripremljenog preparata. Dodatni aditivi koji se mogu koristiti u vakcini zi ovog proinalaska uključuju ali nisu limitirani samo na njih, dekstrozu, konvencionalne antioksidante i konvencionalne redukujuće (chelating) agense kao etilendiamin tetrasirćetna kiselina (EDTA). Parenteralnoe forme doziranja moraju se takođe sterilisati pre upotrebe.

Još jedno ostvarenje ovog pronalaska uključuje novi postupak za pripremu infektivnog, nepatogenog himemog molekula nukleinske kiseline SCV1-2, koji obuhvata uklanjanje otvorenog okvira čitanja (ORF, open reading frame) gena molekula nukleinske kiseline koja kodira infektivno nepatogeni SCV1, zamenjujući istu poziciju sa imunogenim ORF genom nukleinske kisleine koja kodira infektivni patogeni SCV2 i oporavak himernog molekula nukleinske kiseline. Molekul nukleinske kiseline tipično je DNK. Poželjan postupak zamenjuje ORF2 kapsidni gen nepatogenog SCV1 DNA sa inunogenim ORF kapsidni genom infektivnog patogenog molekularnog DNK SCV2 koji je ovde opisan. Druge pozicije ORF ili njihovih imunogenih fragmenata mogu razmeniti između SCV1 i SCV2 DNK da bi se konstruisali atenuirani infehtivni himemi DNK klonovi na osnovu postupaka koji su ovde opisani.

Rekombinantni molekul nukelinske kiseline se zatim koristi za konstruisanje živog, infektivnog, replicirajućeg virusa iz ovog pronalaska koji korisno zadržava nepatogenu prirodu SCV1 ali i eksprimira imunogeni ORF protein patogenog SCV2 i izaziva kompletan imuni dosgovor na patogeni SCV2. Poželjno je da SCV1-2 klon služi kao genetski konstruisana avirulentna, živa vakcina protiv SCV2 infekcije i PMWS kod svinja.

Konstruisanje infektivni DNK klon SCV2, kao stoje odved opisano, tako da se može dobiti biološki čist i homogeni infektivni stok virusa za studije patogeneze i razvoj nepatogenih himemih vakcina. Razvoj bolesti, distribucija virusa i petološke lezije koje su povezane sa SCV2 infekcijom mnogo su bolje okarakterisane upotrebom DNK klona i biološki čistog i homogenog infektivnog stoka SCV2 virusa koji je dobijen iz molekualmog DNK klona koji je primećen u prošlosti, koji sam po sebi dovodi do razvoja željenog proizvoda vakcine iz ovog pronalaska.

SCV2 molekularni klon je generisan ligacijom dve kopije kompletnog SCV2 genoma u tandemu u pSK vektor. Nasuprot jednoj kopiji genoma koja je objavljena u ovoj oblasti, infektivni DNK SCV2 klon napravljen pomoću postupaka koji su ovde opisani sadrži dve kompletne kopije SCV2 genoma koji su ligirani kao tandemski ponovci. Ligacija dve kopije genoma u tandemu obezbeđuje sličan cirkulami genom koji podražava uobičajeni cirkulami gmom SCV2. Prednost posedovanja dve kopije genoma u tandemu u infektivnom DNK SCV2 klonu je u tome što se povećava do maksimuma replikacija kada se infektivni DNK klon transfektuje in vitro i in vivo. Zato, klon funkcioniše mnogo efikasnije nego prethodni genom koji je zastupljen u jednoj kopiji.

Inficiranje životinja sa molekularnim viralnim klonom je izuzetno korisno za poručavanje genetskih determinanti viralne replikacije i virulentnosti u domaćinu. Cirkovirus tipa 2 kod svinje (SCV2) je determinisan kao agens koji izaziva sindrom kržljavosti odbijene prasadi (postweaning multisystemic wasting syndrom-PMWS). PMWS je kompleksan sindrom tj obolenje kod svinaj i različiti faktori mogu biti uključeni u kliničkom ispoljavanju PMWS. Međutim, teškoća proizvodnje biološki čiste forme SCV2 usled prisustva drugih agenasa koji se nalaze kod svinja u homogenatu tkiva zaraženih svinja otežala je definitivnu karakterizaciju kliničke slike bolesti i patoloških lezija za koje je odgovorna samo SCV2 infekcija. Ovo je prvi put da je infektivni molekularni DNK klon SCV2 konstruisan i upotrebljen za karakterizaciju obolenja i patoloških lezija koje su povezane sa SCV2 putem infekcije direktnom in vivo transfekcijom svinja sa molekularnim klonom.

Za homogeni SCV2 stok živih virusa dobijenih iz molekualmog klona pokazano je da je infektivan in vitro kada se transfektuje u PK-15 ćelije. Klonirana SCV2 genomska DNK takođe je infektivna kada se direktno injecira u jetre i superficijalne butne limfne čvorove specifičnih-bez patogena-(SBP) svinja. Životinje koje su injecirane sa kloniamom SCV2 plazmidnom

DNK rzavijaju infekciju i bolest koja podseća na onu koja je indukoavna intranazalnom inokulacijom sa homogenim infektivnim virusnim stokom SCV2. serokonverzija u SCV2-specifična natitela detektovana je kod većine svinja iz inokulisanih grupa 35 dana posle inokulacije (DPI).

Početak i trajanje viremije u svinjama koje su inokulisane sa himemoim SCV1-2 DNK klonom slični su onima koji se javljaju kod svinaj koje su inokulisane sa nepatogenim SCV1 DNK klonom, dok viremija kod svinja koje su inokulisane sa SCV2 klonom izgleda da traje duže. Kod većine SCV2 inokulisanih životinja početak viremije se detektuje 14 DPI i traje oko 2-4 nedelje. Slično većina inokulisanih svinaj kojima je urađena nekropsija 35 DPI je podleglo serokonverzijai u SCV2 antitela. SCV2 antigen je detektovan u različitim tkivima i organima kod inokulisanih svinja. Krupne leizje su limitirane na pluća i limfne čvorove, i karakteriše ih sistemski generisan smeđe obojeni limfni čvorovi, pluća koja ne uspevaju da koplabiraju (collapse), i blago multifokalni smeđe obojeni foci konsolidacije Krupne lezije koje napadaju limfne čvorove i kod svinja inokulisanih sa nepatogenim SCV1 i svinja inokulisanih sa himemim SCV1-2 su blage i ograničene samo na nekoliko životinja, dok svinje inokulisane sa patogenim SCV2 imaju umerenedo teška “welling” i diskoloraciju limfnog tkiva (tabela 9). Statistička analiza otkriva da vrednosti gross lezija u limfnim čvorovima svinja inokulisanih sa himemim SCV1-2 su slične onima zabeleženim kod svinja inokulisanim sa nepatogenim SCV1. 21 DPI, svinej inokulisane sa SCV2 imaju gross leizje koje su statistički mnogo ozbiljnije nego one kod svinja inokulisanih sa SCV1 i himemim SCV1-2. Histopatološke lezije i SCV2-specifični antigen su detektovane u mnogobrojnima tkivima i organima uključujući mozak, pluća, srce, bubreg, krajnik, limfne čvorove, slezinu, ileum i jetru kod inokulisanih (inficiranih) svinaj. Histopatološke lezije kod mnogobrojnih tkiva i organa slične onima koje se javljaju kod PMWS su dobijene sa SCV2 molekularnim DNK klonom kao i sa infektivnim virusom pripremljenima in vitro iz molekularnog DNK klona. Mikroskopski i 21 i 49 DPI životinje inokulisane sa himemim SCV1-2 imaju statistički manje mikroskopske lezije nego životinje inokulisane sa SCV2. Vrednosti mikroskopskih lezija u limfnim čvorovima svinja inokulisanih sa himemim SCV1-2 slične su onima dobojenim sa nepatogenim SCV1, recipročnim SCV2-1 i neinokulisanim kontrolnim životinjama. Umerene do teške mikroskopske lezije pronađene su u više tkiva kod životinja inokulisanim sa patogenim SCV2 uključujući tkiva pluća, jetre, limfnog tkiva, slezine, mozga, srca, bubrega i krajnika. Međutim, kod životinja inokulisanih himemim SCV1-2, blage do umerene mikroskopske lezije su ograničene samo na tkivo jetre, limfnih čvorova i bubrega (videti tabelu 10).

Kod kontrolnih i bilo kojih drugih inokulisani svinja ne postoje značajni klinički znaci PMWS. Iako nisu primećeni karakteristični klinički simptomi PMWS sa kloniranom SCV2 plazmidnom DNK (infektivni SCV2 klon) niti sa biološki čistim živim stokom virusa infektivnih SCV2, SCV2 je očigledno odgovoran za PMWS-u slične histopatološke lezije koje su dobijene u primerima koji slede koji su ilustrativni. Generalno se veruje da je SCV2 primami ali ne i jedini patogeni agens koji je odgovoran za početak kliničke slike PMWS.

Ovaj pronalazak omogućava konačnu karakterizaciju kliničkog toka i patoloških lezija isključivo uzrokovanih SCV2 infekcijom. Sadašnji podaci u ilustartivnim primerima koji slede ukazuju na to daje spremna reprodukovana klonirana SCV2 genomska DNK dostupna da zameni infektivni virus za SCV2 patogenezu i studije imunizaciej. Dok SCV2 se pokazao kao esencijalan za razvoj PMWS, možda su drugi faktori ili agensi kao PRRSV, PPV itd potrebni da bi se indukovao kompletan spektar kliničkih znakova i lezija koje su povezane sa slučajevima već uznapredovalog PMWS. Međutim, sa spoznajom da je SCV2 ključni faktor, novi, infektivni, replicirajući klon može se dalje modifikovati ili genetski konstruisati da bi se postigao željeni optimalni imunogeni efekat pomoću postupaka koji su poznati onima koji se bave imunologijom i molekularnom genetikom.

Dostupnost infektivnog DNK klona SCV2 koji je opisan u ovom pronalasku omogućava da se razvije genetski konstruisana atenuirana vakcina za sprečavanje SCV2 infekcije i PMWS kod svinja. Poznato je da SCV2 replicira u limfnim čvorovima, plućima i jetri tokom prirodne infekcije, i jedan od glavnih patogenih efekata je nefimkcionisanje inumog sistema usled degradacije limfoidnih struktura (S. Krakowka et al, 2001, supra', G. M. Allan and J. A. Ellis, 2000, supra; S. Kennedy et al, 2000, supra-, G. J. Wellenberg et al., 2000, supra\ G. M. Allan et al, "Experimental reproduction of severe wasting disease by co-infection of pigs with porcine circovirus and porcine parvovirus," J. Comp. Pathol. 121:1-11 (1999); J. Ellis et al, "Reproduction of lesions of postv/eaning multisystemic vvasting syndrome in gnotobiotic piglets," J. Vet. Diagn. Invest. 11:3-14 (1999); J. C. Harding and E.G. Clark, 1997, supra). Upotrebom ovog novog infektivnog SCV2 molekularnog DNK klona, kliničko obolenje, patološke lezije i distribucija virusa bili su isključivo posledica SCV2 infekcije i mnogo bolje okarakterisani.

Strukturni i funksionalni odnosi SCV2 gena bolje se razumeju ako se sagledava dostupnost SCV2, SCV1 i himemih SCV1-2, i reciporčnih himemih SCV2-1 infektivnih DNK klonova koji su ovde opisani. Will et al, "Cloned HBV DNA causes hepatitis in chimpanzees," Nature 299:740-742 (1982), prvi su demonstrirali mogućnost upotrebe klonirane hepatitis B virusne DNK za inficiranje šimpanzi direktnom in vivo injekcijom. Ovaj pristup se od tada primenjuje za proučavanje viralne replikacije i patogeneze nekoliko drugih virusa(T. W. Dubensky et al, "Direct transfection of viral and plasmid DNA into the liver or spleen of miče," Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:7529-7533 (1984); R. Girones et al, "Complete nucleotide sequence of a molecular clone of vvoodchuck hepatitis virus that is infectious in the natural host," Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1846-1849 (1989); N. L. Letvin et al., "Risks of handling HIV," Nature 349:573 (1991); C. Seeger et al, "The cloned genome of ground squirrel hepatitis virus is infectious in the animal. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 81:5849-5852 (1984); E. E. Sparger et al, "Infection of cats by injection with DNA of feline immunodeficiency virus molecular clone," Virology 238:157-160 (1997); R. Sprengel et al, "Homologous recombination betvveen hepadnaviral genomes follovving in vivo DNA transfection: implications for studies of viral infectivity," Virology 159:454-456 (1987); H. Will et al, 1982, supra; L. Willems et al, "In vivo transfection of bovine leukemia provirus into sheep," Virology 189:775-777 (1992)).

Konstruisanje infektivnog SCV2 molekularnog DNK klona, i demonstriranje infekcije direktnim injeciranjem klonirane SCV2 plazmidne DNK u jetru i limfne čvorove svinja su korisni za SCV2 studije. Ovaj in vivo sistem transfekcije će pojačati studiju strukturnog i funkcionalnog odnosa SCV2 gena upotrebom rekombinantnih plazmida konstruisanih in vitro za testiranje različitih regiona ili gena SCV2 i njihovih uloga u replikaciji virusa i patogenezi domaćina. Replikacija i patogeneza SCV2 može se proučavati in vivo bez potrebe za proizvodnjom stokova infektivnih virusa putem propagacije SCV2 u ćelijskim kulturama. Ovo je advantegous kako se serijski pasaži mogu odabrati za viralne varijante. Još jedna prednost upotrebe klonirane SCV2 genomske DNK, umesto živog virusa, za životinjske studije je relativno lako određivanje količine inokulacione doze. Količina klonirane

SCV2 DNK koja se koristi za inokulaciju životinja može se lako odrediti spektrofotometrom, gde doza živog SCV2 virusa zahteva infektivnu titraciju u ćelijskim kulturama i potvrdu infekcije sa IFE. Direktno injeciranje životinja sa kloniranom SCV2 plazmidnom DNK eliminiše probleme koji su povezani sa prisustvom drugih prirodnih svinjskih agenasa u inokulumu homogenata tkiva u životinjskim studijama.

U ovom pronalasku, imunogeni ORF2 kapsidni gen se zamenjuje između patogenog SCV2 i nepatogenog SCV1 da bi se proizvela jedinstvena struktura himemog SCV1-2 infektivnog DNK klona. Iznenađujuće i korisno, himemi SCV1-2 infektivni klon je replikovao, eksprimirao imunogeni ORF2 kapsidni antigen in vitro i in vivo, i indukovao je specifičan odgovor antitelima protiv SCV2 ORF2 ali je zadržao nepatogenu prirodu SCV1. Himemi SCV1-2 infektivni DNK klon ima sposobnost da indukuje jak imuni odgovor protiv SCV2 dok indukuje samo ograničenu infekciju sa blagim patološkim lezijama sličnim onima koje izaizva nepatogeni SCV1. Za razvoj vakcine, relativno lako čuvanje i stabilnost klonirane DNK i ekonomičnost proizvodnje na velikoj skali rekombinantne SCV2 plazmidne DNK kao i himemog SCV1-2 DNK klona obezbeđuje atraktivne načine dostavljanja svinjama žive, infektivne, viralne DNK vakcine ili genetski konstruisane, atenuirane viralne vakcine. Zato, himerni SCV1-2 infektivni DNK klonkoji se opisuje u ovom pronalasku predstavlja korisnog kandidata za vakcinu protiv SCV2 infekcije i PMWS.

Treba shvatiti da svi naučni i tehnološki izrazi koji se ovde koriste imaju ista značenja kao i izrazi koji se normalno koriste u ovoj oblasti nauke od strane ljudi koji se ovom problematikom bave. Za potrebe ovog pronalaska izraz “infektivni” znači da virus replikuje u svinjama bez obzira dali ili ne virus izaziva bilo koje obolenje. “SBP” se odnosi na Specifične-bez-patogena (SBP) svinje. “Gnotobiotske” svinje znače svinje bez mikroba. Izrazi “SCV2 plazmidna DNK”, “SCV2 genomska DNK” i “SCV2 molekulama DNK” koriste se interchangeable da bi se odnosili na istu kloniranu nukleotidnu sekvencu.

Infektivni SCV1/SCV2 himemi DNK klon (soj označen kao “SCV1-2 himera), infektivni SCV2 molekularni DNK klon (soj označen kao “SCV klon”) i biološki čist i homogen stok SCV2 dobijen iz Iowa uzorka SCV2 koji je izolovan iz svinje sa teškim PMWS i identifikovan kao izolat broj 40895 (dodelje broj soju “SCV2#40895”) su deponovani pod uslovima koji dobili mandat od strane 37 C.F.R. § 1.808 i ostaju u saglasnosti sa Sporazumu iz Budimpešte u American Type Culture Collection (ATCC), 10801 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110-2209, U.S.A. Sekvence DNK koje su opvde opisane se sadrže u okviru 6,490 bp plazmida klonirani u pBluescriptSK(+) vektor (pSK) (Stratagene Ine., La Jolla, CA) i transformisane su u Ecsherichia coli DH5a kompetentne ćelije. Plazmidi koji sadrže infektivni himerni SCV 1-2 DNK klon (identifikovan kao “himemi svinjski cirkovirus tipa 1 (SCV1) i tipa 2 (SCV2) infektivni DNK klon) i infektivni SCV2 molekularni DNK klon (identifikovan kao “infektivni DNK klon tipa 2 svinjskog cirkovirusa (SCV2)”) deponovani su u ATCC 7. Decembra, 2001 i dodeljen im je ATCC broj za deponovanje patenta (ATCC Patent Deposit Designation) PTA-3912 i PTA-3913. Treba shvati da se drugi plazmidi mogu lako konstruisati pomoću “site direeted” mutageneze i tehnika koje su ovde opisane. Biološki čist i i homogen SCV2 uzorak izolata broj 40895 (identifikovan kao “tip 2 svinjski cirkovirus(SCV2)”) takođe je deponovan u ATCC, 7. decembra 2001 i dodeljen mu je broj za deponovanje patenta PTA-3914. genomska (nukleotidna) sekvenca SCV2 iozlata broj 40895 deponovana je u Genbank banci podataka i dostupna je javnosti od 23 jula 2000. pod brojem za pristup (acession number) AF264042.

Primeri koji slede deminstriraju određene aspekte ovog pronalaska. Međutim, treba razumeti da ovi primeri su samo za ilustraciju i nemaju za cilj da budu isključivo i u potpunosti definitivne kao uslovi i oblast ovog pronalaska. Treba shvatiti da kada su dati tipični uslovi reakcija (e.g. temperatura, vreme reakcije, itd), uslovi iznad i ispod specifičnog opsega takođe se mogu koristiti, iako su generalno manje pogodni, priemri su izvođeni na sobnoj temperaturi (oko 23C do oko 28C) i pri atmosferskom pritisku. Svi delovi i procenti na koje se ovde odnosi su na bazi težine i sve temperature su izražene u stepenima ukoliko nije drugačije specificirano.

Dalje razumevanje ovog pronalaska može se postići pomoću nelimitirajućih primera koji slede dalje u tekstu.

PRIMER 1 (samo kao ilustracija)

Pobijanje PK-1S ćelijske linije koja nema SCV1 kontaminaciju

Izvor SCV2 izolata bio je uzorak tkiva slezine svinje kod koje se priridno javlja PMWS (SCV2 serijski identifikacioni broj 40895, koji se koristi kao “izolat 40895” (M. Fenaux et al., 2000, supra). Imunohistohemijsko bojenje (IHH) sa SCV2 specifičnim antitelom potrvdilo je prisustvo SCV2 antigena u tkivu. Tkiva slezine su čuvana na -80°C do upotrebe.

PK-15 ćelijska linija kupljena od Americane Type Culture Collection (ATCC broj za pristup CCL-33) perzistentno je inficirana sa SCV1 G. C. Dulac and A. Afshar, 1989, supra).. Kako je samo subpopulacija PK-15 ćelija perzistentno inficirana (id.), PK-15 ćelijska linija je bila bez SCV1 kontaminacije kada je napravljeno krajnje razblaženje.

PK-15 ćelijska linija kupljena od American type Culture Collection (ATCC broj pristupa CCL-33) perzistentno je inficirana sa SCV1 (G. C. Dulac and A. Afshar, 1989, supra). Kako je samo subpopulacija PK-15 ćelija perzistentno inficirana, generisna je dilucijama do kraja (end-point dilution) PK-15 ćelijska linija koja nema SCV1 kontaminaciju. Protokol je izvrešen na sledeći način: PK-15 ćelije su gajene u MEM sa Earle solima i L-glutaminom Life Technologies, Ine., Grand Island, NY) sa dodatkom 10% fetalnog seruma govečeta (FBS, foetal bovine serum) i IX antibiotikom (Life Technologies Ine.) Konfluentni pojedinačni slojevi ćelija su tripsinizovani i zatim su ćelije izbrojane i urađene su serijske dilucije do kraja od jedne ćelije na 0.2 ml. Krajnje razređenje je bilo naneseno na ploču sa 96 bunarčića i dozvoljeno im je da rastu i monoslojevija iz pojedinačne ćelije, ćelije iz svakog bunarčića su testirane za SCV1 DNK pomoću PCR-RFLP eseja koji može da detektuje i razlikuje SCV1 i SCV2(M. Fenaux et al, 2000, supra). PK-15 ćelije iz bunarčića koje su bile negativne za SCV1 dalje su proširene. PK-15 ćelijska linija koja nema SCV1 bila je je subkultivisana kroz pet dodatnih pasaža i opet je bila negativna sa SCV1 DNK u PCR-u koji je urađen za svaki pasaž.

Četiri ćelijske linije koje su bile negativne za SCV1 kontaminaciju proizvedene su pomoću dilucija do kraja perzistentno inficiranih PK-15 ćelija iz ATCC. Ćelijske linije su ostale negativne za SCV1 u PCR-u nakon pet dodatnih pasaža. Jedna od ćelijskeih linija bila je dodatno proširena i pokazala je da može da podrži replikaciju SCV2 kada su ćelije transfektovane sa SCV2 molekularnim DNK klonom (S1.2) i inficirane sa SCV2 virusom. Klonirane ćelije su dalje upotrebljene za in vitro transfekciju SCV2 molekularnog DNK klona da bi se dobile biološki čisti SCV2 infektivni virusni stok za eksperimente inokulisanja životinja.

PRIMER 2 (samo kao ilustracija)

Konstruisanje SCV2 infektivnog DNK klona

Da bi se konstruisao SCV2 molekularni klon, dizajniranje par prajmera za PCR na osnovu objavljene sekvence SCV2 izolata 40895 (M. Fenaux et al., 2000, supra): “forward” prajmer F-PCVSAC2 (5’-

GAACCGCGGGCTGGCTGAACTTTTGAAAGT-3’), prikazan u SEQ ID NO: 5, i reverzni prajmer R-PCVSAC2 (5’-GCACCGCGGAAATTTCTGACAAACGTTACA-3’), prikazan u SEQ ID NO: 6. Ovaj par prajmera amplifikuje kompletan genom SCV2 sa preklapajući regionom koji sdarži jedinstveno Sadi restrikciono mesto (SLI). DNK je izolovana pomoću QIAamp DNA Minikit (Qiagen, Ine., Valencia, CA) iz uzorka tkiva slezine svinje kod koje se prirodno javlja PMWS (izolat 40895) (M. Fenaux et al, 2000, supra). Izolovana DNK je umnožena u PCR reakciji sa AmpliTaq Gold polimeraze (Perkin-Elmer, Norvvalk, CT). PCR reakcija se sastojala od inicijalno koraka inicijacije enzima na 95°C tokom 9 minuta, zatim je sledilo 35 ciklusa denaturacije na 94°C tokom 1 minuta, vezuvanje prajmera za matricu (annealing) na 48°C 1 minut i ekstenzije na 72°C tokom 3 minuta, i finalne ekstenzije na 72°C tokom 7 minuta. PCR proizvod očekivane dužine odvojen je elektroforezom na gelu i prečišćen pomoću “glassmilk” procedure sa Geneclean kitom (Bio 101, Ine., La Jolla, CA).

Da bi se konstruisao molekularni DNK klon koji sadrži tandem dimere SCV2 genoma, PCR porizvod koji sadrži kompletan SCV2 genom prvo je ligiran u advanTAge plazmidni vektor(CIontech, Palo Alto, CA). E. Coli DH5a kompetentne ćelije su transformisane. Rekombinantni plazmidi su potvrđeni sečenjem pomoću restrikcionog enzima. SCV2 genomska DNK kompletne dužine je izvađena iz advanTAge vektora disegtijom sa Sadi restrikdonim enzimom. Isečena SCV2 genomska DNK ligirana je sa T4 DNK ligazom na 37°C tokom samo 10 minuta, što je favorizovalo proizvodnju tandemskih dimera. Tandemski dimeri su na kraju klonirani u pBluescript SK(+) vektor (pSK) (Stratagene Ine., La Jolla, CA) (SI. 1). Rekombinantni plazmidi koji sadrže tandem dimere SCV2 genoma (ovde označeni kao SCV2 molekularni DNK klon) potvrđeni su PCR reakcijom, sečenjem sa restrikcionim enzimom, i sekvenciranjeu DNK. Koncentracija DNK rekombinantnih plazmida određena je spektrofotometrom.

Specifično, kompoletan genom SCV2 (izolat 40895) umnožen je PCR reakcijom da bi se konstruisao infektivni SCV2 molekularni DNK klon. Dve kolije kompletnog SCV2 genoma ligirane su u tandemu u pSK vektor da bi se proizveo SCV2 molekularni DNK klon (SI. 1). Infektivnost SCV2 molekularnog DNK klona određena je in vitro transfekcijom PK-15 ćelija. IFE sa SCV2- specifičnim antitelom potrvdila je daje molekularni DNK klon infektivan in vitro i da je oko 10-15% PK-15 ćelija bilo transfektovano. SCV2-specifični antigen je vizualizovan pomoću IFE u jedru, i u nešto manjoj meri u citoplazmi transfektovanih ćelija (SI.2). Ćelije lažno-transfektovane sa praznim pSK vektorom ostale su negativne za SCV2 antigen.

PRIMER 3 (samo kao ilustracija)

In vitro transfekcija sa SCV2 molekularnim DNK klonom i stvaranje biološki čistog i homogenog stoka virusa infektivnog SCV2

Da bi se testirala infektivnost molekularnog DNK klona in vitro, PKČ15 ćelije bez kontaminacije su gajene u LabTek komorama sa osam bunarčića. Kada su PK-15 ćelije dostigle oko 85% konfluentnosti, ćelije su transfektovane sa molekularnim DNK klonom upotrebom Lipofectamine Plus reagensima na osnovu protokola koji je preporučio proizvođač (Life Technologies, Ine). Lažno-transfektovane ćelije sa praznim pSK vektorom uključene su kao kontrole. Tri dana nakon transfekcije, ćelije su fiksirane sa rastvorom koji sadrži 80% aceton i 20% metanol na 4°C tokom 20 minuta, i izveden je esej imunofluorescencije upotrebom SCV2-specifičnog zečijeg poliklonalnog antitseruma da bi se odredila in vitro infektivnost molekularnog DNK klona (videti dalje u tekstu).

Da bi se dobio biološki čist i homogen stok virusa infektivnog SCV2 za eksperiment inokulacije životinja, PK-15 ćelije bez kontaminacije gajene su u T-25 flaskovima i transfektovane sa SCV2 molekularnim DNK klonom. PK-15 ćelije su gajene do oko 85% konfluentnosti u T-25 flaskovima. Pre transfekcije elije su jednaput isprane sa sterilnim PBS puferom. Za svaku reakciju transfekcije u T-25 flasku, 12 pg SCV2 plazmidne DNK je pomešano sa 16 pl Plus reagensa u 0.35 ml MEM medijuma. Flask sa lažno-transfektovanim ćelijama sa praznim pSK vektorom uključen je kao negativna kontrola. Nakon inkubacije na sobnoj temperaturi tokom 15 minuta, 50 pl Lipofectamine reagensa koji je razblažen u 0.35 ml MEM medijuma dodat je u mešavinu i inkubirano je sve na sobnoj temperaturi tokom još 15 minuta.. Mešavina za transfekciju je zatim doodata u T-25 flask sa PKĆ15 ćelijama koje sdarže 2.5 ml svežeg MEM. Posle inkubacije na 37°C tokom 3 sata, medijum je zamenjen sa svežim MEM medijumom koji sdarži 2% FBS i IX antibiotike. Transfektovane ćelije su pokupljene nakon 3 dana posle transfekcije i čuavne na -80°C do upotrebe. Infektivni titar virusanog stoka određen je sa IFE (videti dalje u tekstu).

U osnovi, biološki čist i homogen stok virusa infektivnog SCV2 dobijen je transfekcijom PK-15 ćelija sa SCV2 molekularnim DNK klonom. SCv2 viorioni koji su dobijeni in vitro transfekcijom bili su infektivni jer su transfektovani ćelijski lizati uspešno iskorušćeni za inficiranje PK-15 ćelija. Zato je SCV2 molekularni DNK klon sposoban da proizvede infektivne SCV2 virione kada se in vitro transfektuje. Infektivni titar homogenog SCV2 virusnog stoka koji je pripremljen iz transfektovanih ćelija određen je da je lxl04'5 TCIDso/ml. Ovaj stok virusa upotrebljen je za inokulaciju svinja u grupi 2. Lizati ćelija lažno transfektovanih sa praznim pSK vektorm nisu bile u stanju sa inficiraju PK-15 ćelije.

PRIMER 4 (samo kao ilustracija)

Titracija virusa pomoću eseja imunofluorescencije (IFE)

Da bi se odredio infektivni titar homogenog SCV2 virusnog stoka, PK-25 ćelije su gajene u LAB-Tek komorama sa osam bunarčića. Stok virusa je serijski diluioran 10 puta u MEM, i svaka dilucija je inokulisana u 10 bunarčića sa jednim slojem PK-15 ćelija koje su gajene na LabTek komorama (Chamber slides). Bunarčići sa neinokulisanim ćelijama uključeni su kao negativna kontrola. Inficirane ćelije su fiksirane 3 dana nakon inokulacije sa rastvorom koji sadrži 80% aceton i 20% metanol na 4°C tokom 20 minuta. Posle ispiranja ćelija sa PBS puferom, inficirane ćelije su inkubirane sa 1:1,000 diluiranim SCV2-specifičnim začijim poliklonalnim antitelima S. D. Sorden et al., "Development of a polyclonal-antibody-based immunohistochemical method for the detection of type 2 porcine circovirus in formalin-fixed, paraffin-embedded tissue, " J. Vet. Diagn. Invest. 11:528-530 (1999)) na 37°C tokom 1

r

sata.. Ćelije su zatim tri puta oprane sa PBS puferom, i inkubirane sa sekundarnim FITC-obeleženim kozijim anti-zečijim IgG (Kirkegaard & Perry Laboratories Ine, Gaithersburg, MD) na 37°C tokom 45 minuta. Posle ispiranja slajdova tri puta sa PBS puferom, slajdovi su napunjeni sa flormont-G, stavljena su pokrovna stakla i preparat je pregledan pod fluorescentnim mikroskopom. Izračunata je 50% infektivna doza kulture tkiva po ml (IDKT50/ml). Inicijalno, ćelije su transfektovane sa plazmidnim konstruktom koji sadrži jednu kopiju SCV2 genoma ali je infektivni SCV2 titar iz pojedinačnog genomskog konstrukta bio mnogo niži nego onaj kodonoga što sadrži tandem genoma. Zato je za in vitro i in vivo eksperimente transfekcije korišćen plazmidni konstrukt koji sadrži dimemu formu SCV2 genoma.

PRIMER 5 (samo kao ilustracija)

In vivo transfekcija svinja sa SCV2 molekularnim DNK klonom i eksperimentalna inokulacija svinja sa homogenim SCV2 infektivnim

stokom virusa

Četrdeset specifičnih bez patogena (SBP) svinja starih 4 nedelje nasumično su smeštene u 4 prostorije sa po deset svinja u svakoj. Pre inokulacije, SPB svinje su testirane za antitela na SCV, SRRSV, SPV i svinjski hepatitis E virus. Svinje iz grupe 1 nisu inokulisane i služile su kao negativne kontrole. Svinje iz grupe 2 su svaka ponaosob inokulisane intranazalno sa oko 1.9xl05 IDKT50 SCV2 infektivnim stokom virusa koji je dobijen od SCV2 molekularnog DNK klona. Svinje iz grupe 3 su primile direktnu intrehepatitičnu inekciju rekombinantne plazmidne DNK PCV2 molekulskog klona. Svaka svinja je injecirana sa ukupno 200 pg rekombinantne plazmidne DNK (klonirane SCV2 plazmidne DNK), kroz tehnike usmeravanja pomoću ultrazvuka, u 6 različitih mesta u okviru jetre. Svinje iz grupe 4 su svaka ponaosob injecirane sa ukupno 200 pg rekombinantne SCV2 plazmidne DNK direktno u superficijalne butne limfne čvorove, i svaki limfni čvor je primio dve odvojene injekcije. Životinje su posmatrane na dnevnoj bazi za kliničke znake obolenja. Uzorci seruma su sakupljani iz svake životinje 0, 7, 14, 21, 28 i 35 dana posle inokulisanja (DPI). 21. DPI, pet svinja je nasumice odabrano iz svake grupe i urađena im je nekropsija. Ostalim pet životinjama iz svake grupe nekropsija je urađena 35

DPI. Sakuplejni su različita tkiva i organi tokom nekropsije i procesovani su za histološke preglede i imunohistohemijsko bojenje (videti dalje u tekstu).

Rezultati su prikazani u tabeli 1 dalje u tekstu. Sve inokulisane svinje iz grupa 2, 3, i 4 bile su negativne za SCV2 antitela 0 DPI. Dve svinje u neinokulisanoj kontrolnoj grupi 1 imale su detektibilna SCV2 majčinska antitela 0. DPI. Majčinsko antitelo u ova dva praseta je iščezlo do 7. DPI. Nikakva serokonverzija u SCV2 nije detektovana ni u jednoj od 10 neinokulisanih kontrolnih svinja. U grupi 2 svinja intranazalno inokulisanih sa SCV2 infektivnim virusom, 1 prase je imalo serokonverziju u SCV2 antitelo 21. DPI. Do 35.DPI, 4 od 5 svinja koji su ostali iz grupe 2 imala su serokonverziju. Serokonverzija u transfektovanim životinjama iz grupa 3 i 4 prvi put se pojavila 28. DPI. Dpo 35. DPI 5 od 5 svinja koje su ostale u grupi 3 i 3 od 5 preostalih u grupi 4 imale su serokonverziju u SCV2 antitelo SPV antitela testirana su 3. i 21. DPI za sve svinje, i 35. DPI za ostatak svinja. Majčinska antitela na raznovrsni SPV agense kod svinja detektovana su u SBP prasićima. Titri SPV HI antitela u svim prasićima osim kod jednog opadala suznačajno od 3. DPI (prosečan titar 1.2,665) do 21. DPI (prosečan titar 1:246), što je ukazivalo na to da su antitela koja su detektovana kod ovih prasića bil pasivno dobijena. Jedno prase je imalo malo povećanje SPV HI titra od 1:32 3 DPI do 1:64 21 DPI stoje verovatno usled varijacije testiranja. Uzorci seruka koji su sakupljeni od svih svinja 0, 21 i 35 DPI su dalje testirani na SPV DNK pomoću već objavljenog PCR eseja (J. M. Soucie et al, "Investigation of porcine parvovirus among persons with hemophilia receiving Hyate: C porcine factor VIII concentrate," Transfusion 40:708-711 (2000)). Nikakva SPV viremija nije detektovana u svinjama bilo kog DPI, što je dalje ukazivalo na to da svinje nisu bile inficirane sa SPV.

PRIMER 6 (samo kao ilustracija) PCR-RFLP analize

Da bi se izmerila SCV2 viremija u svinjama koje su transfektovane sa SCV2 molekularnim DNK klonom i u svinjama inficiranim sa SCV2 infektivnim stokom virusa, uzorci seruma sakupljeni pri različitim DPI testirani su na prisustvo SCV2 DNK opšte poznatim postupcima PCR-RFLP eseja koji je ranije već opisan (M. Fenaux et al, 2000, supra). Urađena je ekstrakcije viralne DNK iz 50 pl svakog uzorka seruma uz pomoć DNAzol® reagensa na osnovu protokola koji preporučuje proizvođač (Molecular Research Center, Cincinnati, OH). Izolovana DNK je resuspendovana u vodi bez DN-aze, RN-aze i proteinaze i testirana na SCV2 DNK putem PCR-RFPL (id.). Produkti PCR-a iz odabranih životinja su sekvencirani da bi se potvrdilo poreklo virusa u inficiranim svinjama.

Uzorci seruma su sakupljeni iz svik kontrolnih i inokulisanih životinja pri 0, 7, 14, 21, 28 i 35 DPI i urađeni su eseji za SCV2 viremiju detekcijom SCV2 DNK (id.) rezultati su prikazani u tabeli 2. SCV2 DNK nije detektovana u grupi 1 inokulisanih kontrolnih svinja ni u jednom DPI. Viremija je detektovana u 7/10 svinja iz grupe 2, 14 DPI i 8/10, 35 DPI. Viremija je trajala samo nekoliko nedelja kako SCV2 DNK nije detektovana 28 DPI i 35 DPI kod svih 5 preostalih svinja iz grupe 2. U grupi 3 svinja koje su injecirane intrahepatično sa SCV2 molekularnim DNK klonom, 8/10 svinja su imale viremiju 14 DPI i 9/10 svinja je imalo detektibilnu viremiju 35 DPI. Grupa 4 svinja je inokulisana sa SCV2 molekularnim DNK klonom direktno u limfne čvorove. Dve od 10 svinja 14 DPI i 8 od 10 svinj 21 DPI iz grupe 4 imale su viremiju. Rezultati pokazuju da je SCV2 molekularni DNK klon infektivan kada se injecira direktno u jetru i površinske iliačne limfne čvorove SPF svinja. PCR proizvodi koji su umnoženi iz selektovanih životinja su sekvencirani. Sekvenca PCR proizvoda koji su umnoženi iz odabranih životinja bila je identična sa odgovarajućim regionom SCV2 molekularnog DNK klona.

tabela 2. Detekcija viremije (SCV2 DNK) pomoću PCR u serumu inokulisanih i kontrolnih svinja

PRIMER 7 (samo kao ilustracija)

Klinička procena

Svinje su izmerene 0 DPI i u vreme nekropsije. Vrednosti rektalnih temperatura i vrednosti kliničkog respiratornog obolenja, bili su u opsegu 0 do 6 (0=normalno, 6=ozbiljna) (P. G. Halbur et al, "Comparison of the pathogenicity of two U.S. porcine reproductive and respiratory syndrome virus isolates with that of the Lelystad virus," Vet. Pathol. 32:648-660 (1995)), beležene su svakog dana od 0 do 35 DPI. Klinička zapažanja uključujući dokaz obolenja centralnog nervnog sistema, obolenje jetre

(ikterus), muskuloskeletno obolenje i promene stanja organizma takoDe su beležene na dnevnoj bazi.

Da bi se procenila krupna patologija i histopatologija, pet svinja iz svake grupe nasumice je odabrano za nekropsiju 21 i 35 DPI. Tim za nekropsiju nije bio obavešten o statusu infekcije svinja kod kojih je rađena nekropsija. Kompletna nekropsija je izvedena na svim svinjama. Procenjen postotak pluća sa jasno vidljivom upalom pluća je zabeležen za svaku svinju i bazirao se na ranije opisanom sistemu za vrednovanje (id.) Sistem vrednovanja se bazira na približnoj zapremini koje svako plućni režanj doprinosi celim plućima:desni kranijalni režanj, desni središnji režanj, kranijalni deo levog kranijalnog režnja, i repni (kaudalni) deo levog kranijalnog režnja, svaki ponaosob doprinosi sa 10% u ukupnoj zapremini pluća, pomoćni režanj doprinosi sa 5% i desni i levi kaudalni režnjevi doprinose 27.5%. Druge lezije kao što je uvećanje limfnih čvorova odvojeno je praćeno. Isečci za histopatološki pregled uzimani su iz nosne školjke, pluća sedam isečaka (id.), srca, mozga, limfnih čvorova (traheobranhijalnih, butni, mezenteričnih, sublingvalnih) krajnika, timusa, jetre, bešike, slezine, zglobova, tankog creva, debelog creva, pankreas i bubrega. Tkiva su pregledana bez prethodnih informacija o njima, i ocenjeni su subjektivnim vrednostima za težinu stanja lezija pluća, limfnih čvorova, i lezija jetre. Vrednost za pluća bile su u opsegu od 0 (normalna) do 3 (teška limfohistiocitična intresticijalna upala pluća). Vrednost za jetru bile su u opsegu od 0 (normalna) do 3 (težak limfohistiocitični hepatitis). Vrednosti za limfne čvorove bile su za procenjenu količinu limfoidnog raspadanja folikula i bili su u opsegu od 0 (normalno nema limfoidnog raspadanja) do 3 (teško limfoidno raspadanje i histocitična zamena folikula).

Serološki protokol uključuje sakupljanje krvi kada pristigne od 11 do 12 dana starih subjekata, i iz svih svinja 0, 7, 14, 21 i 35. DPI. Urađeni su eseji za antitela na PRRSV pomoću Herd Check PRRSV ELISA (IDEXX Laboratories, Westbrook, MA). Antitela na PPV u serumu detektovana su esejom inhibicije hemaglutinacije (HI) esej(H. S. Joo et al, "A standardized haemagglutination inhibition test for porcine parvovirus antibody," Aust. Vet. J. 52:422-424 (1976)). Antitela na SCV2 u serumu detektovana su modifikovanim indirektnim ELISA testom koji se bazira na rekombinantnom ORE proteinu SCV2 (P. Navvagitgul et al., "Modified indirect porcine circovirus (PCV) type 2-based and recombinant capsid protein (ORF2)-based ELISA for the detection of antibodies to PCV," Immunol. Clin. Diagn. Lab Immunol. 1:33-40 (2002)). Delimično prečišćen SCV2 antigen pripremljen je iz Hi Five ćelija (Invitrogen, Carlsbad, CA) koje su inficirane sa rekombinantnim bakulovirusom koji sadrži glavni kapsidni ORF2 protein SCV2 (P. Navvagitgul et al., "Open reading frame 2 of porcine circovirus type 2 encodes a major capsid protein," J. Gen. Virol. 81:2281-2287 (2000)). Celijski lizati Hi Five ćelija koje su inficirane sa divljim tipom bakulovirusa pripremljene su na sličan način i služile su kao negativni kontrolni antigen. Immulon 2 HB polisterinske mikrotitar ploče Dynex Technologies Ine, Chantilly, VA) su obložene sa optimalnim koncentracijama pozitivnih i negativnih antigena na 4°C tokom 36 sati. Stotinu ml svakog uzorka seruma diluiranog 1:100 u 5% mlečnom diluentu (Kirkegaard & Perry Laboratories, Ine.) je bilo dodato u svaki bunarčić. Uzorci seruma su testirani u kvadruplikatu: 2 bunarčića za negativni kontrolni antigen i dva paralelna bunarčića sa SCV2 antigen. Pozitivni i negativni kontrolni serumi uključeni su u svakoj ploči. Serumi su inkubirani na 37°C tokom 30 minuta i zatim oprani 5 puta sa 0.1 M PBS puferom koji sadrži 0.1% Tween-20. Sekundarni Anti-svinjski IgG obeležen sa peroksidazom (Sigma Co, St. Louis, MO) inkubiran je na 37°C tokom 30 minuta. Ploče su ponovo isprane i inkubirane sa 2,2’-azino-di-(3-etilbenztiazolin-6-sulfonatom (Kirkegaard & Perry Laboratories Ine) na 37°C tokom 15 minuta za razvoj boje. Optička gustina (optic density-OD) je čitana na 405 nm. Izračunat je korigovan OD za svaki testirani i kontrolni serum oduzimanjem srednje vrednosti bunarčića koji sadrži negativni antigen od onog u paralelnom bunarčiću koji sadrži SCV2 antigen. Podaci su normalizovani deljenjem korigovane vrednosti OD testiranog uzorka seruma (S) sa onom od pozitivnog kontrolnog seruma (P) i prikazanje kao odnosi S/P. Uzorci sa S/P odnosima </=0.12, 1.12 do 0.2, i >0.2 uzeti su kao negativni, dvosmisleni (ekvivokalni) i pozitivni.

U rezultatima dobijenim iz kliničke procene, nijedna od kontrola i inokulisanih svinja nije pokazivala očigledne znakove obolenja koji su potsećali sa one od kliničkog PMWS. Nije bilo razlike u dobijanju na težini ili u srednjim rektalnim temperaturama izmežu bilo kojih od četiri grupe. Kontrolne svinje iz grupe 1 su ostale normalne rokom eksperimenta. Postojala je blaga tranzijentna respiratorna bolest koja je detektovana kod većine svinja u grupi transfektovanoj sa SCV2 DNK i grupi inficiranoj sa virusom SCV2 od 8. do 14. DPI. Ovo stanje je karakterisala blaga dispnea (kliničke respiratorne vrednosti 1 do 2) koja je trajala jedan do dva dana u pojedinačnim svinjama i 5-6 dana za grupu.

Nije bilo krupnih lezija u kontrolnim svinjama kad im je rađena nekropsija. Svinje u tri inokulisane grupe imale su krupne lezije koje su bile limitirane na pluća i limfne čvorove (videt tabelu 3). Lezije su bile slične između svinja u grupi transfektovanoj sa SCV2 DNK i grupi inficiranoj sa virusom SCV2. pluća nisu uspela da kolabiraju (colapse) i imala su nasumične, multifokalne, umerene, jasno ograničene površine smeđe do purpurne konsolidacije (consolidation) koje pokrivaju 0-2% pluća (slika 3) 21. DPI i 1-13% pluća 35. DPI. Limfni čvorovi su bili sistematično uvećani 2

do 5 puta u odnosu na normalnu veličinu, čvrsti, i smeđi (slika 3) i 21. i 35 DPI kod većine svinja iz sve tri grupe koje su inokulisane sa SCV2.

Mikroskopskim pregledom nisu otkrivene lezije u bilo kom tkivu kod kontrolnih svinja osim u tkivu jetre. Osam od deset kontrolnih svinja je imalo blagu multifokalnu limfoplazmatičnu inflaminaciju predomianantno u periportalnim regionima jetre što se često javlja kod nirmalnih svinja i uzima se kao normalna pozadina (background) (P. G. Halbur et al, 2001, suprd).

Svinje iz dve grupe koje su transfektovane sa SCV2 plazmidnom DNK (intrahepatična i intralimfoidna grupa) i grupa inficirana sa SCV2 (intranazalna) imle su slične lezije u mozgu, plućima, srcu, bubregu, limfoidnom tkivu (krajnik, limfni čvorovi, slezina), ileum, i jetri (videti tabelu 4). Lezije na mozgu opažene su u 23/30 svinja iz tri inokulisane grupe i okarakterisane su kao blage do umerene multifokalne limfoplazmacitične meningoencefalitične sa perivaskulami “cuffing” i “gliosis”. Plućne lezije su opažene u 23/30 svinja iz tri inokulisane grupe i okarakterisane su kao blage do umerene peribronhiolame limfo-plazmacitične i histiocitične bronhointersticijalne upale pluća (sl.3C). Jedna svinja iz grupe 2 inficiranih sa SCV2 virusom kojoj je nekropsija urađena 21. DPI, i po jedna svinja zi dve grupe koje su transfektovane sa SCV2 plazmidnom DNK kojima je urađena nekropsija 35. DPI imale su ulceravtivni (kao čir) i proliferativni bronhiolitis sa fibriplazijom i granulomatoznu inflaminaciju (upalu) u lamnia propria i peribronhijalnim regionima bronhija. Blagi limfoplazmacitični miokarditis takođe je primećen kod 18/30 svinja inokulisanih sa SCV2. Kod 14/30 svinja inokulisanih sa SCV2, primećen je blag do umeren multifokalni limfoplazmicitični intersticijalni nefritis. U timusima nisu registrovane nikakve lezije. Blago do umereno limfoidno raspadanje (slika 4B) i histiocitična zamena folikula registrovane su u krajniku 8/38, u slezini 7/30 i

lmfnim čvorovima 26/30 svinja inokulisanih sa SCV2. Umereni granulomatozni limfadenitis u gigantskim ćelijama (si. 4C) uočen je 21. DPI kod tri svinje inokulisane intranazalno sa SCV2 virusom, i kod jedne svinje 35. DPI u svakoj grupi koja je transfektovana sa SCV2 plazmidnom DNK. Blagi limfoplazmacitični i histocitični enterokolitis je primećen kod 3/5 svinja u grupi inokulisanoj sa SCV2 virusom, kod 3/5 svinja u grupi intrahepatitično transfektovanoj sa SCV2 plazmidnom DNK, i 1/5 svinja u grupi intralimfoidno transfektovanoj sa SCV2 plazmidnom DNK 35. DPI. Jedna svinja u svakoj od grupa transfektovanoj sa SCV2 plazmidnom DNK imala je blago limfoidno raspadanje sa histocitičnom zamenom i niskim brojem gigantskih ćelija u “Peyer’s patches”. Blagi do umereni limfoplazmacitični hepatitis uočen je kod 29/30 od tri svinje inokulisane sa SCV2. uočen je nizak broj široko razbacanih individualnih hepacitocita koje su okružene inflaminacijom kod jedne svinje u svakoj grupi transfektovanoj sa SCV2 plazmidnom DNK 21. DPI. Lezije u drugim tkivima nisu bile vidljive.

Mikroskopske lezije u plućima, jetri i limfnim čvorovima su vrednovane na osnovu objavljenih vrednosnih sistema (tabela 4) (P. G. Halbur et al, 2001, supra; P. G. Halbur et a!., 1995, supra). Za druga tkiva i organe nije postojao odgovarajući sistem za vrednovanje (ocenjivanja). Prosečni rezultati za lezije u plućima i limfnim čvorovima kod svinja iz tri grupe koje su inokulisane sa SCV2 bile su statistički različite od onih iz kontrolnih svinja grupe 1. Prosečne vrednosti za lezije jetre kod svinja iz tri grupe koje su inokulisane sa SCV2 nisu statistički bile različite od onih kod kontrolnih svinja.

PRIMER 8 (samo kao ilustracija)

Imimohistohemiia

Detekcija imunohistohemijom (IHH) SCV2-specifičnog antigena izvedena je na tkivima sakupljenim tokom nekropsije DPI 21 i 35. Zečija poliklonalni SCV2 specifični antiserum upotrebljen je za IHH, i opšte procedure su već ranije objavljene (S. D. Sorden etal, 1999, supra).

Za detekciju i distribuciju u tkivu SCV2 antigena, IHH bojenje SCV2 antigena izvedeno je na mozgu, plićima, usnoj školjci, srcu, krajniku, limfnim čvorovima, slezini, timusu, ileumu, jetri, bešice i pankreasu kod svih svinja koje su podvrgnute nekropciji 21 i 35 DPI. Sva tkiva iz kontrolnih svinja bila su negativna za SCV2 antigen. Distribucija u tkivu SCV2 antigena u tri SCV2-inokulisane grupe bila je slična (videti tabelu 5). U mozgu, SCV2 sntigen predominantno je pronađen u mononukleamim ćelijama, ćelijama sličnim fibroblastima, i endotelijalnim ćelijama meninge (moždane opne-membrane) i horoidnog pleksusa i rede u endotelijalnim ćelijama i perivaskulamim mononukleamim ćelijama velikog i malog mozga. U plućima, SCV2 antigen je detektovan u alveolarnim i septalnim makrofazima i ćelijama sličnim fibroblastu u lamina propria disajnih puteva (sl.3D). U srcu, SCV2 antigen je pronađen u široko rasutim makrofazima i endotelijalnim ćelijama. U bubrezima SCV2 antige je detektovan u okvim tubulamih epitelijalnih ćelija i mononukleamih ćelija u intersticijumu. U limfnom tkivu (limfni čvorovi, slezina, krajnik, “Peyer’s patches”) SCV2 antigen je primamo detektovan u makrofazima i ćelijama sličnim denričnim ćelijam i gigantskim ćelijama u folikulima (sl.4D). SCV2 antigen je takođe detektovan u makrofazima lamina propria tankog creva. U jetri SCV2 antigen je pronađen u mononukleamim ćelijama i Kupferovim ćelijama. SCV2 nije detektovan u školjci, timusu niti bešici.

PRIMER 9 (samo kao ilustracija) Konstruisanje nepatogenog infektivnog SCV2 DNK klona

Procedura koja je korišćena za konstruisanje SCV1 infektivnog DNK klona je u suštini ista kao ona opisana ovde u pomalasku za SCV2. Par prajmera za PCR, KPNPCV1. U prikazan u SEQ ID NO:7 i KPNPCV1.L prikazan u SEQ ID NO:8 (videti tabelu 6), je dizajniran na osnovu objavljene sekvence SCV1. Ovaj par prajmera umnožava kompletan genom SCV1 sa preklapajućim regionom koji ima jedinstveno Kpnl restrikciono mesto. DNK od SCV1 virusa izolovana je iz kontaminirane ćelijske linije ATCC PK-15 nabavljene od American Type Culture Collection (ATCC broj pristupa CCL-33). SCV1 DNK je izolovana iz ATCC PK-15 ćelija koje su perzistentno inficirane sa SCV1, pomoću QIAmp DNA minikit (Qiagen, Inc.,Valencia, CA.). Izolovana DNK je umnožena u PCR reakciji sa AmpliTaq Gold polimerazom (Perkin-Elmer, Nonvalk, CT). PCR ciklusi su se sastojali od inicijalnog koraka na 95°C tokom 10 minuta, zatim je sledilo 35 ciklusa denaturacije na 94°C tokom 1 minuta, vezuvanje prajmera za matricu (annealing) na 48°C 1 minut i ekstenzije na 72°C tokom 2 minuta, i finalne ekstenzije na 72°C tokom 7 minuta. PCR proizvod očekivane dužine odvojen je elektroforezom na gelu i prečišćen pomoću “glassmilk” procedure sa Geneclean kitom (Bio 101, Ine., La Jolla, CA). Prečišćeni PCR proizvod koji sadrži kompletni SCV1 genom prvo je ligiran u advanTAge plazmidni vektorv(Clontech, Palo Alto, CA). E. Coli DH5oc kompetentne ćelije su korišćene za transformaciju.

Rekombinanatni plazmidi su potvrđeni digestijom sa restrikcionim enzimaima. SCV1 geomska DNK kompletne dužine je isečena iz advanTAge vektora sečenjem sa Kpnl restrikcionim enzimom.. SCVl geomska DNK kompletne dužine je ligirana u pBluescriptSK(+) vektor (pSK) (Stratagene

Ine., La Jolla, CA) sa T4 ligazom na 37°C preko noći. Rekombinanatni plazmidi koji sadrže SCV1 geomska DNK kompletne dužine izolovane su sa Qiagen kitom za mini prep (izolovanje plazmida na maloj skali) (Qiagen, Valencia, CA) i potvrđeni su sečenjem sa restrikcionim enzimima i sekvenciranjem DNK. SCV1 geomska DNK kompletne dužine je isečena iz pSK vektora sa Kpnl restriktivnim enzimom, i dimerizovana da bi se napravio infektivni DNK klon kao stoje opisano u primeru 2 za SCV2 infektivni klon. Ovi tandem dimeri su napravljeni jer je za dimerizovane tandem DNK klonove pokazano da su efikasniji u transfekciji ćelija i proizvodnji infektivnih viriona. Da bi se napravio tandemski dimer SCV1 DNK, isečena SCV1 genomska DNK je ligirana sa T4 DNK ligazom na 37C samo 10 min., što favorizuje stvaranje tandem dimera. Tandem dimeri su zatim klonirani u pBluescriptSK(+) vektor (pSK) (Stratagene Ine., La Jolla, CA).

Rekombinanatni plazmidi koji sadrže tandemske dimere SCV1 genoma (ovde su ozbnačeni kao “SCV1 DNK klon”) su potvrđeni pomoću PCR postupka, digestije restrikcionim enzimima i sekvenciranjem DNK. Koncentracija DNK rekombinanatnih plazmida određena je na spektrofotometru.

PRIMER 10 (samo kao ilustracija)

Procena infektivnosti SCV1 DNK klona kada se transfektuie u PK-15 ćelije bez kontaminacije virusom

Infektivnost SCV1 molekularnog DNK klona određena je in vitro transfekcijom PK-15 ćelija. IFE sa SCvl specifičnim monoklonalnim antitelima (poklon od Dr. Gordon Allan, Belfast, U. K.) potvrdila su da je SCV1 molekularni DNK klon infEv/ktivan u PK-15 ćelijama. SCV1-specifični antigen je vizualizovan pomoću IFE u jedru, i u manjem obimu u citoplazmi transfektovanih ćelija. Ćelije koje su lažno transfektovane sa praznim pSK vektorom ostale su negativne za SCV1 antigen.

PRIMER 11

Konstruisanie himernog SCV1-2 viralnog DNK klona

Himemi virus je konstruisan između nepatogenog SCV1 i SCV2 koji je povezan sa PMWS upotrebom infektivnog DNK klona SCV1 i SCV2. Da bi se konstruisao himemi SCV1-2 DNK klon, ORF2 kapsidni gen nepatogenog SCV1 je uklonjen iz SCV1 infektivnog DNK klona, i zamenjen sa imunogenim ORF2 kapsidnim genom iz patogenog SCV2 u kičmi genoma SCV1 (videti slike 5 i 6). Dizajnirana su dva para prajmera za PCR. Prvi prajmerski par za SCV2 ORF2, Psi 1-5 prikazan u SEQ ID NO: 11 i Acl 1-6 prikazan u SEQ ID NO: 12, dizajnirani su sa tačkastim mutacijama na 5’ krajevima prajmera da bi se napravila restrikciona mesta AclI i Psil u cilju umnožavanja ORF2 gena iz SCV2 i da bi se unela restrikciona mesta koja ga oivičavaju pomoću tačkaste mutacije. PCR reakcija za umnožavanje ORF2 sastojala se od inicijalnog koraka 95°C tokom 9 minuta, zatim je sledilo 38 ciklusa denaturacije na 95°C tokom 1 minuta, vezivanje prajmera za jednolančanu matricu na 48°C tokom 1 minuta, ekstenzija prajmera na 72°C tokom 1 minuta i finalna ekstenzija na 72°C tokom 7 minuta.

Drugi par PCR prajmera, Hpa 1-2 prikazan u SEQ ID NO:9 i Nar 1-3 prikazan u SEQ ID NO: 10, dizajniran je za umnožavanje pSK+ vektora i njegovog SCV1 genomskog inserta. Tačkaste mutacije unesene su na 5’ krajevima PCR prajmera da bi se napravila restrikciona mesta Narl i Hpal koja oivičavaju umnoženi fragment. Ovaj par prajmera umnožavao je pSK+ vektor i njegov insert SCV1 genomsku DNK kojoj nedostaje ORF2 kapsidni gen, to jest, SCV1 genom minus SCV1 ORF2 (pSK-SCVl AORF2) upotrebom SCV1 infektivnog DNK klona kao matrice za PCR. PCR reakcija se sastojala od inicijalnog koraka 95°C tokom 9 minuta, zatim je sledilo 38 ciklusa denaturacije na 95°C tokom 1 minuta, vezivanje prajmera za jednolančanu matricu na 50°C tokom 1 minuta, ekstenzija prajmera na 72°C tokom 3.5 minuta i finalna ekstenzija na 72°C tokom 7 minuta. SCV2 ORF produkt iz PCR reakcije je sečen sa AcII i Psil da bi se uklonile unesene tačkaste mutacije. pSK-SCVl AORF2 proizvod (pSK vektor-SCVl genom proizvod kome nedostaje ORF2 gen zi SCV1) sečen sa Narl i Hpal da bi se uklonile PCR-om unesene tačkaste mutacije. Poslednja digestija proizvela je lepljivi kraj i “blunf’-ravni kraj koji su komplementarni sa SCV2 ORF2 PCr proiuzvodom koji je sečen sa AcII i Psil restrikcionim enzimima. Isečeni SCV2 ORF2 proizvod i proizvod PSK-SCVl sa deletiranim ORF2 ligirani su sa T4 DNK ligazom da bi formirali himerni SCV1-2 genomski DNK klon, u kome je ORF2 gen iz SCV1 zamenjen sa ORF2 genom iz SCV2. Kada su dva proizvoda iz PCR-a isečena i religirana, PCR-om unesene tačkaste mutacije koje su korišćene za olakšavanje kloniranja uklonjene su u dobijenom himemom klonu. Escherichia coli DH5ot kompetentne ćelije su transformisane. Rekombinantni plazmidi koji sadrže himerni DNK klon izolovani su i potvrđeni PCR-om, restrikcionim enzimima i delimičnim sekvenciranjem DNK. Himemi SCV1.2 genom kompletne dužine je isečen iz pSK+ vektora (rekombinantni plazmid) sa Kpnl digestijom. Himemi DNK genom je dimerizovan kratkom reakcijom ligacije sa T4 DNK ligazom koja favorizuje formiranje linearnih dimera da bi se proizveo SCV1-2 himemi infektivni DNK klon (slika6). rekombinantni plazmidi koji sadrže dve kopije himemog viralnog genoma potvrđeni su PCR-om, restrikcionim enzimima i sekvenciranjem DNK.

PRIMER 12

Procena in vitro infektivnosti SCV1-2 himemog DNK

Vijabilnost himemog SCV DNK klona (nepatogeni SCV1 sa imunogenim kapsidnim genom iz SCV2) tesirana je u PK-15 ćelijama. Kad su PK-15 ćelije transfektovane sa himemim vuralnim DNK klonom, viralni antigen specifičan za SCV2 ORF2 kapsidni gen detektovan je pomoću IFE oko 2 dana posle infekcije. SCV1 kapsidni antigen nije detektovan u transfektovanim ćelijama. Eksperiment ukazuje na to daje himemi DNK klon infektivan in vitro, da replikuje u PK-15 ćelijama i proizvodi imunogeni kapsidni portein iz SCV2.

PRIMER 13

Konstruisanje recipročnog himernog SCV2-1 DNK klona

Da bi se konstruisao recipročan SCV2-1 hiemmi DNK klon, ORF kapsidni gen iz SCV2 zamenjen je sa onim iz nepatogenog SCV1 u kičmi genoma patogenog SCV2 (Slika 6). Dizajnirana su dva prajmerska para za PCRF: par, Bgl-II-ORF2 prikazan u SEQ ID NO: 13 i SpH-I-ORF2 prikazan u SEQ ID NO: 14, koji umnožavaju SCV1 ORF2 gen i sa tačkastim mutacijama unose na krajevima restrikciona mesta Bglil and SpH\. Drugi par prajmera za PCR Bgl-II-PCV2 prikazan u SEQID NO: 15 i SpH-I-PCV2 prikazan u SEQID NO: 16, umnožavali su pSK vektor i SCV2 genom minus ORF2 gen (pSK-SCV2 AORF) upotrebom SCV2 infektivnog DNK klona kao matrice za PCR, i unošenjem pomoću tačkastih mutacija restrikcionih mesta za Bgll i Sphl na krajevima. pSK-SCV2 AORF produkt i SCV1 ORF2 PCR produkt sečeni su sa Bgll i Sphl restrikcionim enzimima da bi proizveli komplementarne lepljive i ravne “blunt” krajeve koji zajedno ligiraju. Nakon transformacije u E.coli ćelije,izolovani su autentični rekombinantni plazmidi i potvrđeni sečenjem sa enzimima i sekvenciranjem DNK. Reciporčni himemi SCV2-1 genom kompletne dužine isečen je iz rekombinantnog plazmida sa Šaci restrikcionim enzimom, i dimerizovan kao što je ovde opisano da bi se dobio recipročni himemi SCV2-1 infektivni klon.

PRIMER 14

In vitro transfekciia PK-15 ćelija sa SCV1, SCV2, SCV1-2 i SCV2-1 DNK klonovima

Infektivnost SCV2 klona in vitro i in vivo demonstrirana je u primerima 3-5, koji su gore u tekstu opisani. Da bi se infektivnost SCV1 i dva himema klona testirala, PK-15 ćelije bez SCV1 kontaminacije pripremljene na ocnovu metoda iz primera 1 gajene su u LabTek komorama (LabTek chamber slides)(Nalge Nunc Int., Denmark). Kada su PKčl5ćelije dostigle oko 80% konfluentnosti ćelije su transfektovane sa SCV1, SCV2, SCV1-2 i SCV2-1 DNK klonovima upotrebom Lipofectamine Plus reagensa na osnovu protokola koji je preporučio proizvođač (Life Technologies, Ine). Lažno-transfektovane ćelije sa praznim pSK vektorom uključene su kao kontrole. Tri dana nakon transfekcije, ćelije su fiksirane sa rastvorom koji sadrži 80% aceton i 20% metanol na 4°C tokom 20 minuta. Dokaz o infektivnosti i virusnoj replikaciji u ćelijama transfektovanim sa SCV1 i SCV2-1 DNK klonovima potvrđena je indirektnim imunofluorescentnim esejom (IFE) pomoću monoklonalnog antitela protiv SCV1 ORF2 kapsidnog gena, koji smo dobili zahvaljujući ljubaznosti Dr. G. M. Allan (G. M. Allan et al., "Production, preliminary characterization and applications of monoclonal antibodies to porcine circovirus," Vet. Immunol. Immunopathol. 43:357-371 (1994)). Fiksirane ćelije su oprane sa fosfatnim puferom u fiziološkom rastvoru (PBS puferom), i inkubirane sa SCV1 monoklonalnim antitelom na 37°C tokom 45 minuta. Ćelije su zatim tri puta oprane sa PBS puferom, i inkubirane sa fluorscein izotiocijanat (FITC) obeleženim kozijim anti-mišijim inunoglobulinom G (Kirkegaard & Perry Laboratories Ine, Gaithersburg, MD) na 37°C tokom 45 minuta.

Ćelije su zatim tri puta oprane sa PBS puferom, i inkubirane sa sekundarnim FITC-obeleženim kozijim anti-zečijim IgG (Kirkegaard & Perry Laboratories Ine, Gaithersburg, MD) na 37°C tokom 45 minuta. Posle ispiranja slajdova tri puta sa PBS puferom, slajdovi su napunjeni sa flormont-G, stavljena su pokrovna stakla i preparat je pregledan pod fluorescentnim mikroskopom. Iinfektivnost ćelija transfektovanih sa SCV2 i himemim SCV1-2 DNK klonovima potvrđena je sa IFE pomoću antitela specifičnih za SCV2, kao stoje ranije opisano u primeru 4.

Infektivnost SCV1, himemog SCV1-2 i recipriočnog himemog SCV2-1 klona potvrđena je u in vitro transfekciji PK-15 ćelija. Dve identične kopije kompletnog SCV1 genoma ligirane su u tandemu u pSk vektor da bi se dobio SCV1 DNK klon (si.6). Himemi SCV 1-2 DNK klon posedovao je ORF2 kapsidni gen iz SCV1 zamenjen sa patogenim SCV2 u kičmi nepatogenog SCV1 genoma. Reciporčni himenri SCV2-1 klon imao je ORF kapsidni gen iz SCV2 zamenejn sa istim iz nepatogenog SCV1 u kičmi patogenog SCV2 genoma. Ako je in vitro infektivan, himemi SCV1-2 klon će proizvoditi ORF2 kapsidni antigen od SCV2 a recipročni SCV2-1 klon će eksorimirati SCV1 ORF2 kapsidni antigen u transfektovanim PK-15 ćelijama. Rezultati su pokazali da su SCV1, himemi SCV1-2 i recipročni himemi SCV2-1 klonovi na iznenađenje bili infektivni kada se transfektuju u PK-15 ćelije i eksprimirali su odgovarajuće viralne kapsidne antignsek proteine kao što je demonstrirano pomoću IFE upotrebom antitela specifičnih za SCV1 ili SCV2. IFE u kome su upotrebljena monoklonalna antitela protiv SCV1 ORF2 i antitela protiv SCV2 potvrdila su da su SCV1 DNK i SCV1-2 DNK klonovi infektivni. IFE u kome je upotrebljeno SCV1 ORF2-specifično monoklonalno antitelo pokazao je daje SCV1-2 himerni DNK klon takođe infektivan. Oko 10-20% transfektovanih PK-15 ćelija bile s pozitivne za SCV1 kapsidni i SCV2 antigen, i eksprimirale su SCV1 ORF2 antigen, u okviru jedra transfektovanih ćelija (si.7).

PRIMER 15

Eksperimentalno inokulisanje svinja sa SCV1, SCV2, himernim SCV1-2 i recipročnim himernim SCV2-1 klonovima

Da bi se procenila imunogenost i patogenost himemih DNK klonova, četrdeset specifičnih bez patogena (SBP) svinja starih 4-6 nedelja nasumice je upućeno u pet soba u kojima je bilo po 8 životinja. Pre inokulacije, životinje su testirane na antitela za SCv, PRRSV, PPV i za hepatitis E virus svijna. Dodatno, pre-inokulacioni uzorci seruma testirani su PCR-om za SCV1 i SCV2 nukleinske kiseline da bi se potvrdilo da svinje nisu prirodno inficirane sa bilo kojim od ova dva virusa. SCV1, SCV2, SCvl-2 i SCV2-1 DNK klonovi su inokulisani direktnim injeciranjem klonirane plazmidne DNK u superficijalne butne limfne čvorove svinja. Svinje iz grupe 1 primile su PBS pufer (fiziološki rastvor puferisan fosfatom) i služili su kao negativna kontrola. Svinje iz grupe 2 bile su injecirane u butne limfne čvorove sa 200 ml infektivnog SCV1 DNK klona. Svinje iz grupe 3 bile su injecirane u butnelimfne čvorove sa 200 pl infektivnog SCV2 DNK klona. Svinje iz grupe 4 bile su injecirane u butne limfne čvorove sa 200 pl infektivnog SCV1-2 DNK klona. Svinje iz grupe 5 bile su injecirane u butne limfne čvorove sa 200 pl infektivnog SCV2-1 DNK klona. Sve životinje su na dnevnoj bazi pregledane za kliničke znakove bolesti. Uzorci seruma su sakupljani iz svake životinje-2, 7, 14, 21, 28, 35, 42 i 49 dana posle inokulacije (DPI). 21. DPI za nasumice odabrane životinje iz svake grupe urađena je nekropcija. Za ostale četiri životinje iz svake grupe nekropsija je urađena 49. DPI. Tokom nekropsije sakupljena su različita tkiva i organi kao što je već ranije opisano u primeru 7, i procesovani su za histološki pregled.

Imunogenost SCV1, SCV2 i himemog infektivnog SCV1-2 klona su pregledane kod svinja. Uzorci seruma su sakupljeni iz svih konrolnih i inokulisanih životinja-2 (0), 7, 14, 21, 28, 35, 42 and 49 DPI i urađeni su eseji za SCV1, SCV2, SCV1-2 i SCV2-1 viremiju pomoću PCR reakcije klon specifičnih DNK sekvenci, za anti-SCVl antitela pomoću IFE i za anti- SCV2 ORF2 antitela pomoću ELISA testa. Pre inokulacije -2 DPI, životinje iz svih pet grupa su bile negativne u PCR testu za oba SCV1 i SC2.

V

Životinje koje su bile negativna kontrola za SCV1 i SCV2 viremije u studiji (videti tabelu 7 dalje u tekstu). Pet svinja u neinokulisanoj kontrolnoj grupi imale su detektibilna SCV2 majčinske antitela -2 DPI i dve svinje su imale detektabilna SCV1 majčinska antitela 7 DPI (videti tabelu 8 dalje u tekstu). Majčinska antitela i SCV1 i SCV2 u ovim prasićima nestla su do 21 DPI. Tokom ove studije nije bila detektovana nikakava serokonverzija niti u SCV1 niti u SCV2 ni u jednom od osam kontrolnih neinokulisanih svinja.

U grupi inokulisanoj sa SCV1, viremija je prvi put detektovana kod inokulisane svinje 7 DPI (tabela 7 dalje u tekstu), i poslednji put je detektovana 35 DPI. Pet od osam životinja koje su inokulisane sa SCV1 infektivnim DNK klonom bile su pozitivne za SCV1 viremiju. Prosečna dužina trajanja kontinualne SCV1 viremije bio je 0.625 nedelja. Do 21. SCV1, sve životinje u grupi koja je su inokulisane sa SCV1 su podlegle serokonverziji u SCV1 i ostala je pozitivna na SCV1 antitela do kraja studije tj 49 DPI.

Za SCV2 DNK klon ovde je pokazano da je infektivan u svinjama. U grupi inokulisanoj sa SCV2 DNK, SCV2 viremija prvi put je detektovana 7 DPI (tabela 7 dalje u tekstu). Do 21 DPI, sve životinje iz grupe 3 koje su inokulisane sa SCV2 bile su pozitivne za SCV2 viremiju. Prosečna dužina trajanja SCV2 viremije bio je 2.12 nedelja. Dve svinje iz grupe koja je inokulisane sa SCV2 imale su detektibilne nivoe majčinskih SCV2 antitela 7DPI (tabela 8 dalje u tekstu) i majčinska antitela su u ovim prasićima nestala su do 14. DPI. Serokonverzija u SCV2, koja je utvrđena ELISA testom sa specifičnima SCV2 antitelima, prvi put je detektovana 35 DPI. Do 42 DPI sve svinje koje su inokulisane sa SCV2 infektivnim DNK klonom su podlegle serokonverziji u SCV2.

U grupi 4 svinja koje su inokulisane sa SCV1-2 himemom infektivnim DNK klonom, viremija specifična za himemi virus prvi put je detektovana 14 DPI (tabela 7 dalje u tekstu), Četiri od 7 inokulisanih životinja dobilo je viremiju sa SCV1-2 između 14 i 42 DPI. Prosečna dužina himeme SCV1-2 viremoje bila je 1 nedelju. Jedna svinja imala je detektabilne nivoe majčinskih SCV2 antitela 7 i 14 DPI, ali su majčinska antitela nestala do 21 DPI (tabela 8 dalje u tekstu). Serokonverzija u SCV2 ORF2-specifično antitelo dogodila se

prvi put 28 DPI. Do 49 DPI, sve svinje inokulisane sa himernim SCV1-2 DNK klonom podlegle su serokonverziji u SCV2 specifično antitelo.

Kod svinja koje su inokulisane sa recipročnim himernim SCV2-1 klonom, viralna DNK specifična za SCV2-1 himemi virus nije bila detektovana u uzorcima seruma (tabela 7 dalje u tekstu). Međutim, do 21 DPI sve životinje iz grupe 5 su podlegle serokonverziji u SCV1 antitelo. PCR proizvodi koji su dobijeni umnožavanjem iz selektovanih svinja u svakoj grupi sekvencirani su i potvrđeno je da su autentični odgovarajući infektivni klonovi koji su korišćeni u inokulaciji u svakoj grupi.

PRIMER 16 Klinička procena

Svinje su izmerene 0 DPI i i u vreme nekropsije. Rektalne temperature i kliničke respiratorne vrednosti, koje su bile u osegu od 0 do 6 (0=normalno; 6= teško) (P. G. Halbur et al, "Comparison of the pathogenicity of two U.S. porcine reproductive and respiratory syndrome virus isolates with that of the Lelystad virus," Vet. Pathol. 32:648-660 (1995)), beležene su svaki drugi dan počevši od 0 do 49 DPI. Klinička zapažanja, uključujući dokaze obolenja centralnog nervnog sistema, obolenja jetre (ikterus), muskoskeltalno obolenje i promene stanja organizma, takođe su beležena na dnevnoj bazi. Tim od dva čoveka je izveo sve klinočke procene.

Nijedna od kontrolnih kao ni inokulisanih svinja nije pokazivao očigledne znakove kompletne kliničke slike PMWS. Nisu postojale razlike u dobijanju na telesnoj težini ili u srednjim telesnim temperaturama između bilo koje od grupa. Jedna od svinja iz grupe 3 koja je inokulisana sa SCV1-2 uginula je jedan dan nakon inokulacije. Posle izvedene nekropsije i kliničkih analiza, nije detektovan patogeni agens i smrt nije bila povezana sa inokulacionom procedurom ili himemim SCV1-2 virusom.

PRIMER 17

Krupna patologija i histopatologiia

Za četiri svinje iz svake grupe urađena je nekropsija 21 i 49 DPI. Tim za nekropsiju nije imao informacije o infektivnom statusu svinja u momentu nekropsije. Na svim svinjama je urađena kompletna nekropsija. Procenjen postotak pluća sa krupnom vidljivom upalom pluća zabeležen je za svaku svinju i baziran je na prethodno opisanom sistemu za vrednovanje. (P. G. Halbur et al, 1995, supra). Druge lezije kao uvećanje limfnih čvorova odvojeno je notirano. Isečci za histopatološki pregled uzeti su iz nosne školjke, pluća (sedam isečaka) (id.), srca, mozga, limfnih čvorova (traheobranhijalnih, butni, mezenteričnih, sublingvalnih), krajnika, timusa, jetre, bešike, slezine, zglobova, tankog creva, debelog creva, pankreas i bubrega. Tkiva su pregledana bez prethodnih informacija o njima, i ocenjeni su subjektivnim vrednostima za težinu stanja lezija pluća, limfnih čvorova, i lezija jetre kao stoje opisano u primeru 7. Vrednost za pluća bile su u opsegu od 0 (normalna) do 3 (teška limfohistiocitična intresticijalna upala pluća). Vrednost za jetru bile su u opsegu od 0 (normalna) do 3 (težak limfohistiocitični hepatitis). Vrednosti za limfne Čvorove bile su za procenjenu količinu limfoidnog raspadanja folikula i bili su u opsegu od 0 (normalno nema limfoidnog raspadanja) do 3 (teško limfoidno raspadanje i histocitična zamena folikula).

Da bi se odredila patogenost SCV1, SCV2, himemih SCV1-2 i recipročno himemih SCV2-1 infektivnih DNK klonova u svinjama, prvo su pregledane krupne lezije. Rezultati su prikazani u tabeli 9 dalje u tekstu. Limfni čvorovi životinja koje su bile u kontrolnoj grupi 1 koja nije inokulisana bili su normalni i 21 i 49 DPI. Svinje u četiri grupe koje su inokulisane imale su raličite stepene krupnih lezija koje su bili ograničene na limfnim čvorovima. U grupi 2 svinja koje su inokulisanesa SCV1, limfni čvorovi su bili krupni normalni 21 DPI, međutim, blago do umereno oticanje i diskoloracija limfnih čvorova detektovana je 49 DPI. Sve svinje iz grupe 3 koje su inokulisane sa SCV2 imale su uvećane limfne čvorove dva do pet puta u odnosu na normalnu veličinu, koji su bili čvrsti i smeđe obojeni i 21 i 49 DPI. Limfni čvorovi iz životinja koje su inokulisane sa himemim SCV1-2 klonom bili su blago do umereno otečeni i obezbojeni i 21 i 49 DPI kod 5 od sedam svinja. U grupi 5 svinja koje su inokulisane sa SCV2-1 klonom, 1 od 8 životinja imalo je blago oicanje i obezbpjavanje limfnih čvotova 21 DPI. Prosečne vrednosti krupnih lezija limfnih čvorova u svinjama inokulisanim sa himemim SCV1-2 klonom nisu bile statistički različite od onih u grupama 1, 2 i 5, ali su se statistički razlikovale od onih u grupi 3 koje su inokulisane sa patogenim SCV2 i to i 21 i 49 DPI. Prosečne vrednosti lomfoidnih lezija na 49 DPI iz životinja koje su inokulisane sa SCV1, SCV2, SCV1-2 nisu međusobno bile statistički različite ali su se statistički razlikovale od presečnih vrednosti za gross lezije grupa 1 i 5.

Zatim su pregledane mikroskopske lezije. Rezultati su prikazani u tabeli 10. Nikakve mikrolezije bilo kog DPI nisu bile detektovane niti u okviru kontrolne grupe 1 svinja niti u okviru svinja iz grupe 2 koje su inokulisane sa SCV1. Mikroskopske plućne lezije koje su okarakterisane kao blaga peribronhijalna limfoplazmacitična i histocitična branhointersticijalna upala pluća, zapažene su kod 1 od osam svinja iz grupe inokulisane sa SCV2. Kod životinja inokulisanih sa SCV1-2 i SCV2-1, u plućima nisu primećene nikakve mikroskopske lezije.. U timusima inokulisanih svinja nisu primećene nikakve lezija. Blagi multifokalni limfoplazmacitični miokarditis zabeležen je kod 2 od 8 svinja u grupi koja je inokulisana sa SCV2. Tkivo srca iz životinja inokulisanih sa SCV1-2 i SCV2-1 nisu imala nikakve mikroskopske lezije. Blagi multifokalni limfoplazmacitični intersticijalni nefritis primećen je kod 4 od 8 svinja iz grupe koja je inokulisana sa SCV2, i kod 2 od 7 svinja inokulisanih sa SCV1-2 i kod 1 od 8 svinja inokulisanih sa SCV2-1. Blago do umereno limfoidno raspadanje i histocitična zamena folikula primećena je na krajnicima kod 5 od 8 svinja, u slezini 3 od 8 svinja i u limfnim čvorovima 8 od 8 svinja iz grupe koja je inokulisane sa SCV2. Kod životinja koje su inokulisane sa himernim SCV1-2, primećeno je blago limfoidno raspadanje i histocitična zamena folikula u limfnim čvorovima kod 2 od 7 svinja ali isto nije bilo primećeno niti u slezini niti u krajnicima. Nikakvo limfoidno raspadanje i histocitična zamena folikula nisu primećeni u limfnim čvorovima, slezini ili krajnicima životinja inokulisanih sa recipročnim himemim SCV2-1. Blag limfoplazmacitični hepatitis primećen je kod 7 od 8 svinja inokulisanih sa SCV2-1. Lezije u drugim tkivima su bile neprimetne.

Mikroskopske lezije u polućima, jetri i limfnim čvorovima su vrednovane na osnovu objavljenog sistema za vrednovanje (P. G. Halbur et al, 1995, supra). Rezultati su prikazani u tabeli 10 dalje u tekstu. Prosečne vrednosti za lezije u limfnim čvorovima u svinjama iz grupe 4 koje su inokulisane sa himemim SCV1-2 bile su slične onima iz grupa 1, 2 i 5 ali su se statistički razlikovale od onih iz grupe 3 koja je inokulisana sa patogenim SCV2 i 21 i 49 DPI. Prosečne vredosti za mikroskopske lezije jetre iz grupe koja je inokulisana sa himemim SCV1-2, 21 DPI bile su statistički različite od onih iz grupe 3 koja je inokulisana sa SCV2 ali su bile slične onima iz grupa 1, 2 i 5, 21 DPI. 49 DPI prosečne vrednosti za mikroskopske lezije jetre životinja iz grupe 4 koje su inokulisne sa himemim SCV1-2 bile su statistički različite od onih iz grupa svinja 1, 2, 3 i 5. Za druga tkiva i organe nije bilo prihvatljivog sistema za vrednovanje

PRIMER 18 Serologiia

Krv je sakupljena iz svih svinja 2, 7, 14, 21, 28, 35, 42 i 49 DPI. Serumska antitela na PRRSV su korišćena u eseju pomoću Herd Check PRRSV ELISA (IDEXX Laboratories, Westbrook, MA). Serumska antitela na SPV detektovana su esejom inhibicije hemaglutinacije (HI) (H. S. Joo et al, "A standardized haemagglutination inhibition test for porcine parvovirus antibody," Aust. Vet. J. 52:422-424 (1976)). Serumska antitela na SCV2 detektovana su modifikovanim indirektnim ELISA testom koji se bazira na rekombinantnom ORF2 kapsidnom proteinu iz SCV2 koji je opisa, ovde u tekstu (videti takođe P. Navvagitgul et al, "Modified indirect porcine circovirus (PCV) type 2-based and recombinant capsid protein (ORF2)-based ELISA for the detection of antibodies to PCV," Immunol. Clin. Diagn. Lab Immunol. 1:33-40 (2002)). serumska antitela za SCV1 detektovana su esejom indirektne imunofluorescencije (IFE). PK-15 ćelije inficirane sa SCV1 gajene su u LabTek komorama sa osam bunarčića. Kada su PK-15 ćelije dostigle oko 95-100% konfluentnosti, inficirane ćelije su fiksirane sa rastvorom koji sadrži 80% aceton i 20% metanol na 4°C tokom 20 minuta. Fiksirane ćelije su oprane jedanput sa PBS. Sto mikrolitara uzorka seruma svinje koji je razblažen u PBS 1:10 dodato je u komore, i inkubirano tokom 1 minuta na 37° C. Ove ćelije su zatim tri puta isprane sa PBS i inkubirane 45 minuta na 37° C sa kozijim anti-svinjskim sekundarnim antitelima obeleženim sa FITC. Slajdovi (komore) su zatim isprani tri puta sa PBS, napunjeni sa fluormont-G, stavljena su pokrovna stakla i pregledani su fluorescentnim mikroskopom.Za pozitivnu kontrolu. Ćelije inficirane sa SCV1 su inkubirane sa diluiranim SCV1 specifičnim monoklonalnim antitelom (pokolon od Dr. G. M. Allan), i zatim inkubirane sa kozijim anti-mišijim IgG obeleženim sa FITC(Kirkegaard & Perry Laboratories, Ine., Gaithersburg, Md.). Za negativnu kontrolu, ćelije inficirane sa SCV1 inkubirane su sa svinjskim serumom bez SCV1 i SCV2 antitela, razblaženje je bilo 1:10, a zatim su inkubirane sa sa kozijim anti-svinjskim IgG obeleženim sa FITC (Kirkegaard & Perry Laboratories, Ine., Gaithersburg, Md.).

PRIMER 19 DETEKCIJA PCR-OM

Da bi se u serumu inokulisanih svinja detektovali SCV1, SCV2, himemi SCV1-2 i recipročni himemi SCV2-1, uzorci seruma koji su sakupljeni u različitim DPI testirani su PCR-om. Viralna DNK je izolovana iz 100 pl svakog uzorka seruma pomoću DNAzol reagensa na osnovu uputstva proizvođača(Molecular Research Center, Cincinnati, OH). Izolovana DNK je resuspendovana u vodi bez DNaze, RNaze i proteinaze. Da bi se umnožili klon specifične genomske sekvence SCV1, SCV2, himemog SCV1-2 i recipročno himemog SCV2-1, dizajnirano je dva seta PCR prajmera za “nested” PCR (tabela 6 u tekstu iznad). Prvi set “nested” prajmera dizajniran je na osnovu objavljene SCV1 sekvence. Prajmeri Gen.PCVl prikazan u SEQ ID NO:20 i Orf.PCVl prikazan u SEQ ID NO: 19 umnožavaju fragment od 400 baznih parova u prisustvu SCV1 genoma. “Nested” prajmeri nested.Gen.PCVl prikazan u SEQ ID NO:22 i nested.Orf.PCV 1 prikazan u SEQ ID NO:21, umnožavaju fragment od 220 bp.

Da bi se detektovala SCV2 viremija, SCV2 par prajmera Gen.PCV2 prikazan u SEQ ID NO:24 i Orf.PCV2 prikazan u SEQ ID NO:23 umnožavaju fragment od 900 baznih parova u prisustvu SCV2 genoma u prvoj rundi PCR-a. Prajmeri nested.Gen.PCV2 prikazan u SEQ ID NO:26 i nested.Orf.PCV2 prikazan u SEQ ID NO:25, umnožavaju fragment od 600 bp u “nested” pCR-u.

Da bi se detektovala himema SCV1-2 viremija, prva runda PCR-a upotrebljavala je za SCV1 specifičan par prajmera Gen.PCVl prikazan u SEQ ID NO:20 i SCV2-ORF2 specifični prajmer Orf.PCV2 prikazan u SEQ ID NO:23 radi umnožavanja himemog fragmenta od 580 baznih parova Za “nested” PCR, SCV1 specifični prajmer nested.Gen.PCVl prikazan u SEQ ID NO:22 i SCV2-ORF2 specifičan prajmer nested.Orf.PCV2 prikazan u SEQ ID NO:25, korišćen je radi umnožavanja himemog fragmenta od 370.

Da bi se detektovala recipročna himema SCV2-1 viremija, prva runda PCR-a upotrebljavala je za SCV2 specifičan prajmer Gen.PCV2 prikazan u SEQ ID NO:24 i SCV1-ORF2 specifični prajmer Orf.PCVl prikazan u SEQ ID NO: 19 radi umnožavanja himemog fragmenta od 700 baznih parova Za “nested” PCR, SCV2 specifični prajmer nested.Gen.PCV2 prikazan u SEQ ID NO:26 i SCV1-ORF2 specifičan prajmer nested.Orf.PCV 1 prikazan u SEQ ID NO:21, korišćen je radi umnožavanja himemog fragmenta od 460. Svi parametri PCR reakcije bili su suštinski isti, sastojali su se od 38 ciklusa denaturacije na 94°C tokom 1 minuta, vezivanje prajmera na 45°C tokom 1 minuta, i ekstenzije na 72°C tokom 1.5 minuta. Uzorci seruma iz svinja koje su bile negativna kontrola testirani su PCR-RFLP esejom za dojagnoziranje, koji može da detektuje i razlikuje i SCV1 i SCV2 kao što je ranije opisano (M. Fenaux et al, "Genetic characterization of type 2 porcine circovirus (PCV-2) from pigs with postvveaning multisystemic wasting syndrome in different geographic regions of North America and development of a differential PCR-restriction fragment length polymorphism assay to detect and differentiate betvveen infections with PCV-1 and PCV-2," J. Clin. Microbiol. 38: 2494-503 (2000)). PCR proizvodi iz odabranih životinja u svakoj grupi bili su sekvencirani da bi se potvrdilo poreklo virusa kojim su inficirane svinje.

PRIMER 20

Imunohistohemiia (IHH)

IHH detekcija SCV2-specifičnog antigena izvedena je na tkivima limfnih čvorova koji su sakupljena iz svih svinja kojim je urađena nekropsija 21 i 49 DPI. Zečiji poliklonalni antiserum protiv SCV2 upotrebljen je za IHC, na osnovu opštih procedura koje su opisane ranije(S. D. Sorden et al, "Development of a polyclonal-antibody-based immunohistochemical method for the detection of type 2 porcine circovirus in formalin-fixed, paraffm-embedded tissue," J. Vet. Diagn. Invest. 11:528-530 (1999)).

Bazirano na IHH bojenju SCV2-specifičnog antigena, limfoidna tkiva iz kontrole koja nije inokulisana, svinje inokulisane sa SCV1 i SCV2-1 bile su negativne za SCV2 antigen. SCV2 antigen detektovan je u limfoidnim tkivima kod 7 od 8 životinja iz grupe inokulisane sa SCV2. SCV2 antigen takođe je detektovan u limfoidnom tkivu kog 1 od 7 svinja iz grupe inokulisane sa SCV1-2.

Claims

1. Infektivni himemi molekul nukleinske kiseline svinjskog cirkovirusa (SCV1-2) , naznačen time, što poseduje molekul nukleinske kiseline koji kodira infektivni, nepatogeni SCV1 koji sadrži imunogeni otvoreni okvir čitanja 2 (open reading frame - ORF2) gena patogenog SCV2 na mestu ORF2 gena SCV1 molekula nukleinske kiseline.

2. Himemi molekul nukelinske kiseline prema patentnom zahtevu 1, naznačen time, što himemi molekul nukleinske kiseline ima nukleotidnu sekvencu koja je prikazana na slici 9, njegov komplemetami lanac ili nukleotidnu sekvencu koja je najmanje 95% homologa sa nukleotidnom sekvencom na slici 9.

3. Biološki funkcionalan plazmid ili viralni vektor, naznačen time, što sadrži himerni molekul nukleinske kiseline prema patentnom zahtevu 2.

4. Plazmid prema patentnom zahtevu 3, naznačen time, što ima ATCC dodeljen broj deponovanog patenta PTA-3912.

5. Izolovana domaćinska ćelija transfektovana sa vektorom, naznačena time, što sadrži himemi molekul nukleinske kiseline prema patentnom zahtevu 2.

6. Avirulentni infektivni himerni svinjski cirkovirus, naznačen time, što ga proizvode ćelije koje sadrže himerni molekul nukleinske kiseline prema patentnom zahtevu 2.

7. Infektivni himemi svinjski cirkovirus prema patentnom zahtevu 6, naznačen time, što pomenute ćelije sadrže plazmid koji ima ATCC dodeljen broj deponovanog patenta PTA-3912.

8. In vitro poces za dobijanje imunogenog polipeptidnog proizvoda, naznačen time, što obuhvata: gajenje, pod odgovarajućim nutritivnim uslovima prokariotskih ili eukariotskih domaćinskih ćelija transfektovanih sa himemim molekulom nukleinske kiseline prema zahtevu 2 na način koji omogućava ekspresiju pomenutog polipeptidnog proizvoda, i izolaciju željenog polipeptidnog proizvoda ekspresije pomenutog molekula nukleinske kiseline.

9. Viralna vakcina koja štiti svinju od viralne infekcije ili sindroma kržljavosti odbijene prasadi (postweaning multisystemic wasting syndrome - PMWS) koji izaziva SCV2, naznačena time, što sadrži netoksični, fiziološki prihvatljiv nosač i imunogenu količinu člana odabranog iz grupe koju čine: (a) himemi molekul nukleinske kiseline koji ima nukleotidnu sekvencu prikazanu na slici 9, njegov komplemetami lanac ili nukleotidnu sekvencu koja je najmanje 95% homologa sa nukleotidnom sekvencom na slici 9; (b) biološki funkcionalni plazmid ili viralni vektor koji sadrži himemi molekul nukleinske kiseline, komplemetami lanac ili nukleotidnu sekvencu koja je najmanje 95% homologa sa nukleotidnom sekvencom na slici 9; (c) avirulentni infektivni himemi svinjski cirkovirus dobijen iz himemog molekula nukleinske kiseline SCV1-2, gde je ORF2 kapsidni gen SCV1 zamenjen sa OFR2 kapsidnim genom SCV2.

10. Viralna vakcina na osnovu patentnog zahteva 9, naznačena time, što pomenuta vakcina sadrži živi himemi svinjski cirkovirus.

11. Viralna vakcina prema patentnom zahevu 9 ili zahtevu 10 za upotrebu u zaštiti svinje protiv virusne infekcije ili sindroma kržljavosti odbijene prasadi (postweaning multisystemic wasting syndrome - PMWS) izazvanim sa SVC2.

12. Upotreba vakcine prema patentnom zahtevu 9 ili zahtevu 10 u postupku pripremanja leka za zaštitu svinje od viralne infekcije ili sindroma kržljavosti odbijene prasadi (postweaning multisystemic vvasting-PMWS) koga izaziva SCV2.

13. Upotreba prema patentnom zahtevu 12, naznačena time, što lek sadrži himemi molekul nukleinske kiseline ili živi himemi svinjski cirkovirus.

14. Upotreba prema patentnom zahtevu 13, naznačena time, što je lek za parenteralnu, intranazalnu, intradermalnu ili transdermalnu primenu.

15. Upotreba prema patentnom zahtevu 14, naznačena time, što je lek za intralimfoidnu ili intramuskularu primenu.

16. Postupak za pripremu infektivnog himemog molekula nukleinske kiseline SVC1-2 prema patentnom zahtevu 1, naznačen time, što obuhvata uklanjanje otvorenog okvira čitanja 2 (ORF2) gena molekula nukleinske kiseline koji kodira infektivni nepatogeni SCV1; zamene pozicije ORF2 gena SCV1 sa imunogenim ORF2 genom iz patogenog SCV2; i oporavak himemog molekula nukleinske kiseline.

17. Postupak prema patentnom zahtevu 16, naznačen time, što se pomenuti ORF2 gen iz SCV2 dobija iz molekula nukleinske kiseline SCV2 koga sadrži ekspresioni vektor koji ima ATCC dodeljen broj deponovanog patenta PTA-3913.

18. Infektivni recipročni himemi molekul nukleinske kiseline SCV2-1 naznačen time, što sadrži molekul nukelinske kiseline koji kodira infektivni patogeni SCV2 koji ima imunogeni ORF2 gen iz nepatogenog SCV1 na mestu ORF2 gena od SCV2 molekula nukleinske kiseline.

19. Viralna vakcina prema zahtevu 9 ili 10, naznačena time, što dalje obuhvata imunogenu količinu bar jednog dodatnog svinjskog antigena.

20. Viralna vakcina prema zahtevu 19, naznačena time, što bar jedan dodatni svinjski antigen je izabran iz grupe koju čine svinjski virus reproduktivnog ili respiratornog sindroma (PRRSV) i svinjskog parvovirusa (PPV).

21. Viralna vakcina prema zahtevu 19 za upotrebu u zaštiti svinje protiv virusne infekcije ili sindroma kržljavosti odbijene prasadi (postvveaning multisystemic wasting syndrome -PMWS) izazvanih sa PCV2.

22. Upotreba virusne vakcine prema zahtevu 19 u proizvodnju preparata za zaštitu svinje od virusne infekcije ili sindroma kržljavosti odbijene prasadi (postvveaning multisystemic vvasting syndrome - PMWS) izazvanog sa PCV2.

23. Upotreba prema zahtevu 22, naznačena time, što je lek namenjen za davanje svinji.