ME00185B

ME00185B - Specifični agensi koji vezuju humani angiopoetin-2

Info

Publication number: ME00185B
Application number: MEP-2008-320A
Authority: ME
Inventors: Jonathan Daniel Oliner; Hosung Min
Original assignee: Amgen Inc
Priority date: 2001-10-11
Filing date: 2002-10-11
Publication date: 2010-10-10
Also published as: WO2003057134A8; CN1596266A; US20130158234A1; HK1076113A1; PL224701B1; US20100286060A1; SI1434791T1; EP2311849B1; PL372671A1; CN101787072B; NO20041917D0; NO20041917L; US20030229023A1; AU2009202513B2; HUP0402162A2; EP2316845B1; HK1133017A1; EA008248B1; BRPI0213223B1; CN101812118A

Abstract

Ovaj pronalazak se odnosi na peptide koji se vezuju za Ang-2. Takođe , ovaj pronalazak se odnosi na peptidna tela koja sadrže peptide, metod za proizvodnju takvih peptida i peptidnih tela i metod lečenja kojim se koriste ovakvi peptidi i peptidna tela.

Description

"5 Dos: 4544/ 18 AMGENINC. One Amgen Center Drive Thousand Oks, CA 9130- 1799 S.A.D l PCT/US02/32657 SPECIFICNI AGENSI KOJI VEZUJU HUMANI ANGIOPOETIN-2 Ova pnmena,u potpunosti, koristi prava U.S. Privremene patentne pnJave BR.60/328,624 registrovane ll. oktobra 2001. l O OBLAST PRONALASKA 15 Ovaj pronalazak se tice specificnih vezujucih agenasa koji prepoznaju vezuju angiopoetin-2 (Ang-2). Pronalazak se, još specificnije , tice stvaranja, dijagnosticke primene i terapeutske primene specificnih vezujucih agenasa i njihovih fragmenata, koji specificno vezuju Ang-2. STANJE TEHNIKE Angiogeneza, stvaranje novih krvnih sudova iz postojecih, je neophodna za mnoge fiziološke i patološke procese. Angiogeneza je, uobicajeno , regulisana proangiogenim i antiangiogenim faktorima, ali u slucaju oboljenja kao što su kancer, 20 okularna neovaskularna bolest, artritis i psorijaza, proces može poprimiti pogrešan tok. Folkman, J , Nat. Med., l :27-31(1995). Postoje brojna poznata oboljenja koja su udružena sa poremecenom ili neželjenom angiogenezom. Ove bolesti ukljucuju, ali nisu ogranicene samo na, okularnu neovaskularizaciju, kao što su retinopatije (ukljucujuci i dijabetesnu 25 retinopatiju), makularnu degeneraciju povezanu sa godinama, psorijazu, hemangioblastom, hemangiom, arteriosklerozu, inflamacijske bolesti, kao što su reumatoidne ili reumatske inflamacijske bolesti, posebno artritisi (ukljucujuci reumatoidni artritis), ili druge hronicne zapaljenske poremecaje , kao što su hronicna astma, arterijska ili posttransplantacijska ateroskleroza, endometrioza i neoplasticne 30 bolesti, na primer takozvane solidne tumore i tecne (ili hematopoezne) tumore (kao što ..._ _ _ __ __,____/ . 00185 B 2Dos: 4544/18 2 PCT/US02/32657 su leukemije i limfomi). Ostala oboljenja koja su udružena sa neželjenom angiogenezom bice ocigledna strucnjacima iz oblasti. Iako su mnogi signalni prenosni sistemi ukljuceni u regulaciju angiogeneze, jedan od najbitnijih i najselektivnijih sistema za endotelnu celiju ukljucuje Tie-2 5 tirozinkinazni receptor (na koji se odnosi \"Tie-2\" ili \"Tie-2R\" (na koji se odnosi \"ORK\")); Mišji Tie-2 o kome rec kao o \"tek\"-u) i njegove ligande, angiopoetine (Gale,N.W. and Yancopoulos,G.D.,Genes Dev.13:1055-1066[1999]). Postoje 4 poznata angiopoetina; angiopoetin-1 (\"Ang-1 \") do angiopoetin-4 (\"Ang-4\"). Ovi angiopoetini su još oznaceni kao \"Tie-2 ligandi\". (Davis,S.,et al., Cell, 87:1161-1169[1996]; Grosios, 10 K., et al., Cytogenet Cell Genet, 84:118-120[1999]; Holash, J., et al., Investigative Ophtalmology & Visual Science,42: 1617-1625[1999]; Koblizek, T .I., et al., Current Biology, 8:529-532 [1998]; Lin,P ., et al., Proe Nati Acad Sci USA, 95:8829-8834 [1998];Maisonpierre,P. e ., et al., Science, 277:55-60 [1997]; Papapetropoulos, A., et al., Lab Invest, 79:213-223 [1999]; Sato, T. N., et al., Nature , 375:70-74 [1998]; Shyu, 15 K. G., et al., Circulation, 95:2081-2087 [1998]; Suri, e., et al., Cell, 57:1171-1180 [1996]; Suri, e., et al., Science, 252:468-471[1998];Valenzuela, D. M., et al., Proceedings of the National academy of Sciences of the USA, 96:1904-1909 [1999]; Witzenbichler, B., et al., J Bio! Chem, 273:18514-18521 [1998]). Buduci da Ang-1 vezan za Tie-2 stimuliše fosforilaciju receptora u kultivisanim endotelnim celijama, 20 primeceNO je da Ang-2 istovremeNO agonizuje i antagonizuje fosforilaciju Tie-2 receptora. (Davis, S., et al. , [1996], supra; Maisonpierre, P.e., et al., [1997], supra; Kim, I., J.H. Kim, et al., Oncogene 19(39): 4549-4552 (2000); Teichert-Kuliszewska, K., P.C. Maisonpierre, et al., eardiovascular Research 49(3): 659-70 (200 l)). FeNOtipi miševa bez Tie-2 i bez Ang-1 su slicni i navodi se da Tie-2 25 fosforilacija koja je stimulisana Ang-1 posreduje u remodelovanju i stabilizaciji razvoja krvnih sudova in utero uz podršku celijske adhezije koja je podstaknuta endotelnom celijom. (Dumont, D .J., et al., Genes & Development, 8: 1897-1909[1994]; Sato, T.N., et al., Nature, 376:70-74[1995];Suri, e., et al., [1996] ,supra). Uloga Ang-1 u stabilizaciji suda bi mogla biti sacuvana u odrasih, gde je naširoko i znacajno potisnuta. (Hanahan, 30 D., Science, 277:48-50 [1997]; Zagzag, D., et al .. Experimental Neurology, 159:391- 400[1999]). Nasuprot tome, Ang-2 ekspresija je primarno ogranicena na mesta vaskularnog remodelovanja, gde se smatra da blokira funkciju Ang-1 , pri cemu indukuje stanje vaskulame plasticnosti koja dovodi do angiogeneze. (Hanahan, D., 00185 B 3Dos: 4544/1 8 3 PCT/US02/32657 [1997], supra;Holash, J., et al. , Science, 284:1994-1998 [1999] ; Maisonpierre, P. e .. et al., [1997], supra). Mnoge objavljene studije su direktno pokazale sud-selektivnu ekspresiju Ang- 2 u bolesnim stanjima udruženim sa angiogenezom. Ova patološka stanja ukljucuju, 5 na primer, psorijazu, makulamu degeneraciju i kancer. (Bunone, G., et al., American Journal of Pathology, 155:1967-1976 [1999]; Etoh, T., et al.. Cancer Research, 61:2145-2153 [2001]; Hangai, M., et al .. Investigative Ophthalmology & Visual Science, 42:1617-1625 [2001]; Holash, J., et al. , [1999] supra; Kuroda, K., et al .. Journal of Investigative Dermatology, 116:713-720 [2001] ; Otani, A., et al .. 10 Investigative Ophthalmology & Visual Science, 40:1912-1920 [1999]; Stratmann, A., et al. , American Journal of Pathology, 153:1459-1466 [1998] ; Tanaka, S., et al., J Clin Invest, 103:34-345 [1999]; Yoshida, Y., et al .. International Journal of Oncology, 15 :1221-1225[1999]; Yuan, K. , et al .. Journal ofPeriodontal Research, 35:165-171 [2000];Zagzag, D., et al. , [1999] supra). Mnoge od ovih studija su 15 fokusirane na rak, pri tome da u mnogih tipova tumora dolazi do pojave Ang-2 ekspresije. Nasuprot njenoj pojavi kod patološke angiogeneze, Ang-2 ekspresija je u normalnim tkivima izrazito ogranicena. (Maisonpierre, P. e., et al., [1997], supra; Mezquita, J., et al., Biochemical and Biophysical Research Communications, 260:492-498 [1999]). U zdravih odraslih, tri glavna mesta angiogeneze su ovarijum, 20 placenta i uterus; Ovo su prvobitna, normalna (nekancerska) tkiva u kojih je pronadena Ang-2 mRNA. Izvesne fukcionalne studije navode da Ang-2 može biti ukljucen u tumorsku angiogenezu. Ahmad et al. (Cancer Res., 61 :1255-1259 [2001]) opisuju prekomemu ekspresiju Ang-2 i pokazuju da je ona direktno udružena sa rastom tumora u mišjem 25 ksenograftskom modelu. Pogledati takode Etoh et al., supra, i Tanaka et al. , supra, gde izloženi podaci prikazuju direktnu udruženost prekomeme ekspresije Ang-2 sa tumorskom hipervaskularizacijom. Medutim, nasuprot tome, Yu et al. (Am. J Path., 158:563-570 [2001]) objavljuju podatke koji pokazuju da povecana ekspresija Ang-2 u Lewisovom karcinomu pluca i u TA3 celijama karcinoma dojke direktno produžuje 30 preživljavanje miševa kojima su ubrizgani odgovarajuci zaraženi transplantati ( transfektanti). U proteklih nekoliko godina, razlicite publikacije navode Ang-1 , Ang-2 ili/i Tie- 2 kao moguce mete za antikancersku terapiju. Na primer, svaki od U.S. Patent NOs. 00185 B 4Dos: 4544/18 4 PCT/US02/32657 6,166,185, 5,650,490, and 5,814,464 otkriva koncept anti-Tie-2 ligand antitela i tela receptora. U srodnoj studiji, Lin et al. (Proe. Nat!. Acad. Sci USA, 95:8829-8834 [1998]) su ubrizgali miševima adenovirus koji eksprimira rastvorljivi Tie-2; Rastvorljivi Tie-2 direktNO smanjuje broj i velicinu tumora koji se razvijaju u miševa. U slicnoj 5 studiji, Lin et al. , (J Clin. Invest., l 00:2072-2078[1997]) su pacovima ubrizgali rastvorljivi oblik Tie-2; Ovo jedinjenje je direktno smanjilo velicinu tumora u pacova. Siemeister et al. (Cancer Res., 59:3185-3189[1999]) su stvorili celijske linije humanog melanoma koje eksprimiraju vancelijski domen Tie-2, i ubrizgavali su ove celijske linije nagim miševima, i zakljucili su da solubilni Tie-2 direktno dovodi do \"znacajne l O inhibicije\" rasta tumora i tumorske angiogeneze. Pri pogledu na ovu informaciju i uz podatak da su i Ang-1 i Ang-2 vezani za Tie-2, nije jasno, iz ovih studija, da li bi Ang-1, Ang-2 ili Tie-2 bili atraktivni za antikancersku terapiju. Fuzija nekih peptida sa stabilnim proteinom plazme, kakav je konstantni region lg ,da bi se produžilo vreme poluživota ovih molekula, opisana je na primer u, PCT 15 publikaciji WO 00/24782, objavljenoj 4.maja.2000. Fuzija proteina ili njegovog fragmenta sa stabilnim proteinom plazme, kakav je konstantni region lg, da bi se produžilo vreme poluživota ovih molekula je razlicito opisana (pogledati, na primer, U.S. Patent 5,480,981; Zheng et al., J Immuno!., 154:5590-5600, (1995); Fisher et al., N Engl. J Med. , 334:1697-1702, (1996); Van Zee, K. et al., J ImmuNO!., 156:2221- 20 2230, (1996); U.S. Patent 5,808,029, izdat 15. septernnoa 1998; Capon et al .. Nature, 337:525-531, (1989);Harvill et al., Immunotech., 1:95-105, (1995); WO 97/23614, objavljeNO 3.jula 1997; PCTIUS 97/23183, fajl objavljen ll. decernnoa 1997; Linsley, J Exp. Med., 174:561-569, (1991); WO 95/21258, izdat 10. avgusta 1995.). Delotvoma anti-Ang-2 terapija može koristiti širokoj populaciji pacijenata 25 obolelih od raka, zato što je vecini solidnih tumora, da bi porasli više od 1-2 milimetra u promeru, neophodna neovaskularizacija. Takva terapija može imati širu primenu i kod drugih bolesti koje su udružene s angiogenezom kao što su retinopatije, artritis i psorijaza. Postoji, nedovoljno iskorišcena, potreba da se otkriju novi agensi koji specificno 30 prepoznaju i vezuju Ang-2. Takvi agensi bi bili korisni za dijagnosticki skrining i terapeutsku intervenciju u bolesnim stanjima koja su udružena sa Ang-2 aktivnošcu. Prema tome, predmet predstavljenog pronalaska je da obezbedi posebne agense koji vezuju Ang-2 tako da modulišu Ang-2 aktivnost. Takvi agensi iz predstavljenog 00185 B 5Dos: 4544118 5 PCTIUS02/32657 pronalaska su u obliku peptidnih tela, to jest, peptida koji su fuzionisani sa drugim molekulima kakav je Fc domen nekog antitela, gde peptidna polovina specificno vezuje Ang-2. 5 OPIS PRONALASKA Ovaj pronalazak usmeren u jednom svom aspektu na peptide (o kojima je takode ovde rec kao o polipeptidima) koji vezuju Ang-2. U predstavljeni pronalazak su ukljuceni i varijante i derivati takvih peptida. Sledeci aspect ovog pronalaska je da su peptidi i njihove varijante i derivati iz l O predstavljenog pronalaska pridodati nosacu. Još jedan aspekt je da peptidi mogu biti fuzionisani sa Fc domenom, s tim da obezbeduju antitela. Eventualno, peptidna tela sadrže najmanje jedan peptid od, na primer, SEKV ID BR :3- SEKV ID BR :6, ili SEKV ID BR :76- SEKV ID BR :157, isto tako i njihove varijante i derivate. Dalje peptidi mogu ukljucivati najmanje jedan 15 peptid koji odgovara formulama prikazanim u SEKV ID BR :65-SEKVID BR :75, i SEKV ID BR :158. Sledeci aspekt pronalaska obezbeduje molekule nukleinske kiseline ukljucujuci specificne vezujuce agense, i njihove varijante i derivate. Još jedan aspect ovog pronalaska obezbeduje molekule nukleinske kiseline koje 20 kodiraju peptidna tela, kao i njihove varijante i derivate. Eventualno, takvi molekuli nukleinske kiseline ukljucuju SEKV ID BR :33- SEKV ID BR :53. Sledeci aspekt pronalaska obezbeduje metod smanjenja tumora primenom efektivne doze specificnog vezujuceg agensa iz predstavljenog pronalaska subjektu kojem je potreban. Pronalazak takode obezbeduje metod inhibicije angiogeneze u 25 subjektu ukljucujuci primenu efektivne doze specificnog vezujuceg agensa iz predstavljenog pronalaska subjektu kojem je potreban. Pronalazak dalje obezbeduje metod lecenja subjekta, koji sadrži davanje efektivne doze specificnog vezujuceg agensa iz predstavljenog pronalaska subjektu kojem je potreban. Pronalazak se takode tice polipeptida koji može vezati Ang-2, pri cemu 30 polipeptid sadrži aminokiselinsku sekvencu WDPWT (SEKV ID BR :65), pri cemu se polipeptid sastoji od 5 do 50 aminokiselina u dužini, kao i njegove fiziološki prihvatljive soli. Polipeptid takode može da sadrži amino kiselinsku sekvencu: WDPWTC 00185 B 65 lO 15 20 25 30 Dos: 4544/ 18 6 PCT /US02/32657 (SEKV ID BR : 66) i njene fiziološki prihvatljive soli. Još, polipeptid može da sadrži aminokiselinsku sekvencu: Cz 2 WDPWT (SEKV ID BR : 67) pri cemu je z 2 kiselinski ili neutralni polarni amino kiselinski ostatak i nJene fiziološki prihvatljive soli. Polipeptid dalje može da sadrži amino kiselinsku sekvencu: Cz 2 WDPWTC (SEKV ID BR : 68) pri cemu je z 2 kiselinski ili neutralni polarni amino kiselinski ostatak nJene fiziološki prihvatljive soli. Još jedna suština pronalaska se tice polipeptida koji je sposoban da veže Ang-2 i koji sadrži amino kiselinsku sekvencu formule: a 1 a 2 a 3 Ca 5 WDPWTCa 12 a 13 a 14 (SEKV ID BR :69) pri cemu : a 1 ,a 2 i a 3 su svaki za sebe nezavisno amino kiselinski ostaci; as je amino kiselinski ostatak; a 12 ne postoji ili je amino kiselinski ostatak; a 13 ne postoji ili je neutralni hidrofobni, neutralni polarni ili bazniamino kiselinski ostatak; a 14 je neutralni hidrofobni ili neutralni amino kiselinski ostatak i njihove fiziološki prihvatljive soli. Omilji aspect je da: a 1 je V,I,P,W,G,S,Q,N,E,K,R ili H; a 2 je V,P,M,G,S,Q,D,E,K,R ili H; a 3 je A,V,P,M,F,T,G,D,E,K ili H; a 8 je A,V,G,Q,N,D, ili E; a 12 je S,Q,N,D,E,K, iliR; a 13 J. e L T ili H· i ' ' ' a 14 je V,L,I,W, ili M Još omiljenija suština je da: a 1 je Q, a 2 je E; a 3 je E; as je D ili E;a 12 je D ili E; a 13 je H . 14· M ; 1 a Je . 00185 B 75 10 15 20 25 30 Dos: 4544/ 18 7 PCT /US02/32657 Smatra se vrednim napomenuti daje upotreba malih slova sa gore napisanim brojevima (kao što su a 1 ili b 1 ) zamišljena da oznaci amino kiselinska mesta, ali ne oznacava jednoslovne skracenice za datu aminokiselinu. Jednoslovne skracenice za date amino kiseline su ovde prikazane velikim slovom. Pronalazak se dalje tice polipeptida koji je sposoban da veže Ang-2 i koji sadrži amino kiselinsku sekvencu formule: b 1 b 2 b 3 b 4 bsb 6 Cb 8 WDPWTCb 1 sb 16 b 17 b 18 b 19 b 20 (SEKV ID BR :70) Pri cemu: b 1 ne postoji ili je amino kiselinski ostatak, b 2 ne postoji ili je neutralni hidrofobni, neutralni polarni ili bazniamino kiselinski ostatak; b 3 ,b 4 ,bs i b 6 svaki za sebe nezavisno ne postoje ili su amino kiselinski ostaci; b 8 je amino kiselinski ostatak; b 1 s ne postoji ilije amino kiselinski ostatak; b 16 ne postoji ili je neutralni hidrofobni, neutralni polarni ili bazniamino kiselinski ostatak; b 17 ne postoji ili je je neutralni hidrofobni ili neutralni polarni ammo kiselinski ostatak; b 18 ,b 19 i b 20 svaki za sebe nezavisno ne postoje ili su ammo kiselinski ostatci; i njihove fiziološki prihvatljive soli. Omiljeni aspekt je da: b 1 ne postoji ilije A,V,L,P,W,F,T,G,S,Q,N,K,R, ili H; b 2 ne postoji ilije A,V,L,I,P,W,M,T,G,S,Y,N,K,R, ili H; b 3 ne postoji ili je A,L,I,P;W,M,T,G,S,Q,N,E,R, ili H; b 4 je V,I,P,W,G,S,Q,N,E,K,R, ili H; bs je V,P,M,G,S,Q,D,E,K,R ili H; b 6 je A,V,P,M,F,T,G,D,E,K ili H; b 8 je A,V,G,Q,N,D, ili E; b 1 s je S,Q,N,D,E,K iliR; b 16 J·e L T ili H· , , , b 17 je V,L,I,W ili M; b 18 ne postoji ili je A,V,L,P,W,F,T,G,Y,Q,D,E iliR; b 19 ne postoji ili je V,L,I,P,T,G,S,Y,Q,N,D,E iliR; i 00185 B 8Dos: 4544/ 18 8 PCT IUS02/32657 b 20 ne postoji ilije V,L,P,W,M,T,G,S,Y,Q,N,D,K iliR. Još jedan omiljeni aspektje da: b 1 ne postoji, ilije P ili T;b 2 ne postoji ilije I ili N; b 3 ne postoji ili jeR ili I; b 4 je Q; b 5 je E; b 6 je E; b 8 je D ili E; b 15 je D ili E; b 16 je H; b 17 je M; b 18 ne postoji ili je W ili P; b 19 ne postoji ili je G ili E; i b 20 ne 5 postoji ili je V ili K. Cenice se to što se pronalazak najradije tice polipeptida koji sadrži najmanje jednu aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe sastavljene od SEKV ID BR :4, i od SEKV ID BR :76 do ukljucujuci SEKV ID NO: 118, pri cemu je polipeptid sposoban da veže Ang-2, kao i njegove fiziološki prihvatljive soli. Peptidne l O sekvence su prikazane ispod: TABELA l PEPTID SEKVIDBR: PEPTIDNA SEKVENCA Con4-44 76 PIRQEECDWDPWTCEHMWEV Con4-40 77 TNIQEECEWDPWTCDHMPGK Con4-4 78 WYEQDACEWDPWTCEHMAEV Con4-31 79 NRLQEVCEWDPWTCEHMENV Con4-C5 80 AATQEECEWDPWTCEHMPRS Con4-42 81 LRHQEGCEWDPWTCEHMFDW Con4-35 82 VPRQKDCEWDPWTCEHMYVG Con4-43 83 SISHEECEWDPWTCEHMQVG Con4-49 84 W AAQEECEWDPWTCEHMGRM Con4-27 85 TWPQDKCEWDPWTCEHMGST Con4-48 86 GHSQEECGWDPWTCEHMGTS Con4-46 87 QHWQEECEWDPWTCDHMPSK Con4-41 88 NVRQEKCEWDPWCEHMPVR Con4-36 89 KSGQVECNWDPWTCEHMPRN Con4-34 90 VKTQEHCDWDPWTCEHMREW Con4-28 91 A WGQEGCDWDPWTCEHMLPM Con4-39 92 PVNQEDCEWDPWTCEHMPPM Con4-25 93 RAPQEDCEWDPWTCAHMDIK Con4-50 94 HGQNMECEWDPWTCEHMFR Y Con4-38 95 PRLQEECVWDPWTCEHMPLR Con4-29 96 RTTQEKCEWDPWTCEHMESQ Con4-47 97 QTSQEDCVWDPWTCDHMVSS Con4-20 98 QVIGRPCEWDPWTCEHLEGL Con4-45 99 WAQQEECA WDPWTCDHMVGL Con4-37 100 LPGQEDCEWDPWTCEHMVRS Con4-33 101 PMNQVECDWDPWTCEHMPRS AC2-Con4 102 FGWSHGCEWDPWTCEHMGST Con4-32 103 KSTQDDCDWDPWTCEHMVGP Con4-17 104 GPRISTCQWDPWTCEHMDQL 00185 B 9Dos: 4544/ 18 9 PCT/US02/32657 Con4-8 105 STIGDMCEWDPWTCAHMQVD AC4-Con4 106 VLGGQGCEWDPWTCRLLQGW Con4-1 107 VLGGQGCQWDPWTCSHLEDG Con4-C1 108 TTIGSMCEWDPWTCAHMQGG Con4-21 109 TKGKSVCQWDPWTCSHMQSG Con4-C2 110 TTIGSMCQWDPWTCAHMQGG Con4-18 111 WVNEVVCEWDPWTCNHWDTP Con4-19 112 VVQVGMCQWDPWTCKHMRLQ Con4-16 113 A VGSQTCEWDPWTCAHL VEV Con4-11 114 QGMKMFCEWDPWTCAHlVYR Con4-C4 115 TTIGSMCQWDPWTCEHMQGG Con4-23 116 TSQRVGCEWDPWTCQHLTYT Con4-15 117 QWSWPPCEWDPWTCQTVWPS Con4-9 118 GTSPSPCQWDPWTCSHMVQG TN8-Con4* 4 QEECEWDPWTCEHM *Treba napomenuti da izvesni peptidi ili/i peptidna tela mogu da sadrže prefiks \"TN\",\"TN8\" ili \"TN12\" tako da taj prefiks može ali i ne mora biti pridodat datom peptidnom telu. Stoga su, na primer, ovde pojmovi \"TN8-Con4\" i \"Con4\" 5 korišceni naizmenicno. 10 Sledeci aspekt pronalaska se tice jedinjenja od interesa cija formula je: ()(l)a-lfl-()(2)b i njegovih multimera, pri cemu je: F l v no sac; X 1 i X 2 su svaki za sebe nezavisno izabrani od: -(L 1 )e-P 1 ; -(L l )e-p l -(L 2 )d-p 2; -(L 1 )e-p 1 -(L 2)d-p2 -(L 3 )e-p3; -(L 1 )e-p 1 -(L2 )d-p2 -(L 3)e-p3 -(L 4 )r-p4; 15 pri cemu j edan ili više P 1 ,P 2 ,P 3 i P 4 svaki za sebe nezavisno sadrže gore 20 opisan polipeptid. Na primer, omiljeni aspekt je da P 1 ,P 2 ,P 3 i P 4 mogu svaki za sebe nezavisno da sadrže polipeptid od SEKV ID BR :3 do SEKV ID BR :6, i/ili SEKV ID BR:76 do SEKV ED BR: 157. Sledeci aspect je da je jedinjenje od interesa formule: )(l-Ft ili 00185 B 10Dos: 4544/18 10 PCT/US02/32657 i njegove fiziološki prihvatljive soli, gde su X 1 ,F 1 i X 2 ovde definisani. Sledeci aspect je da je jedinjenje od interesa formule : Ft-(L t)c-Pt i njegove fiziološki prihvatljive soli, gde su L 1 ,F 1 i P 1 ovde definisani. Još jedan 5 aspekt je da je jedinjenje od interesa formule: Ft-(Lt)c-Pt-(L2)d-P2 i njegove fiziološki prihvatljive soli, gde su L \\F 1 ,P 1 ,P 2 , i e i d ovde definisani. Sledeci aspekt je daje jedinjenje od interesa formule: pt_(LI)c-F•-(L2)d-J>2 10 i njegove fiziološki prihvatljive soli. Najomiljeniji aspekt je da je F 1 , Fc domen ili njegov fragment. 15 Pronalazak se dalje odnosi na polipeptid koji je sposoban da veže Ang-2 i koji sadrži aminokiselinsku sekvencu formule: J>c 2 Dc 4 Lc 6 c 7 c 8 LY (SEKV ID BR :71) pri cemu, c 2 je neutralni hidrofobni amino kiselinski ostatak c 4 je A,D ili E c 6 je kiseli amino kiselinski ostatak 20 e 7 je amino kiselinski ostatak; i c 8 je neutralni hidrofobni, neutralni polarni ili bazniamino kiselinski ostatak; i njegove fiziološki prihvatljive soli. Pogodniji aspekt je da c 2 je L ili M. Još jedan pogodan aspekt je da c 6 je D ili E. Dalje, pronalazak se odnosi na polipeptid sposoban da vezuje Ang-2 koji 25 sadrži aminokiselinsku sekvencu formule: 30 dld2d3d4J>d6Dd8LdiOdiidi2LYd'sdl6dl7 d 18dl9d20d2Id22 (SEKV ID BR :72) pri cemu, d 1 ne postoji ili je amino kiselinski ostatak; d 2 ne postoji ili je neutralni polarni, kiseli ili bazni amino kiselinski ostatak; d 3 ne postoji ili neutralni hidrofobni ili neutralni polarni amino kiselinski ostatak; d 4 ne postoji ili je amino kiselinski ostatak; 00185 B 115 Dos: 4544/1 8 ll d 6 je neutralni hidrofobni amino kiselinski ostatak; d 8 je A,D ili E; d 10 je kiseli amino kiselinski ostatak; d 11 je amino kiselinski ostatak; PCT/US02/32657 d 12 je neutralni hidrofobni, neutralni polarni ili bazni ammo kiselinski ostatak; d 15 ne postoji ili je neutralni polarni, kiseli ili bazni amino kiselinski ostatak; d 1 6 ne postoji ili je neutralni polarni, kiseli ili bazni amino kiselinski ostatak; d 17 ne postoji ili je neutralni hidrofobni ili neutralni polarni amino kiselinski 10 ostatak; 15 d 18 ne postoji ili je neutralni hidrofobni ili neutralni polarni amino kiselinski ostatak; d 19 ne postoji ili je neutralni hidrofobni, neutralni polarni ili bazni amino kiselinski ostatak; d 20 ne postoji ili je amino kiselinski ostatak; d 21 ne postoji ili je neutralni polarni, kiseli ili bazni amino kiselinski ostatak; d 22 ne postoji ili je neutralni hidrofobni, neutralni polarni ili bazni amino kiselinski ostatak; i njegove fiziološki prihvatljive soli. Još jedan aspekt je da: 20 d 1 je T,S,Q,R ili H; 25 30 d 2 je T,Q,N ili K, d 3 je F, d 4 je M,Q,E ili K; d 6 je L ili M; d 8 je D ili E; d 10 je E; d 11 je Q ili E; d 1 2 • T ·1· R Je 1 1 ; d 15 J \" e YD E ili K· ' ' ' dt6 je Q; d 17 je W ili F; d 18 je L,I,M ili T; d 19 J\"e L Fili Y. ' ' 00185 B 12Dos: 4544118 12 PCT/US02/32657 d 20 je Q,D ili E; d 21 ne postoji ili je Q ili H; d 22 ne postoji ilije A,L,G,S iliR. Omiljena suština je da polipeptid sadrži najmanje jednu amino kiselinsku 5 sekvencu koja je izanbrana iz grupe koja se sastoji od SEKV ID BR :6, i SEKV ID BR :119 do ukljucujuci SEKV ID BR :142, pri cemu je polipeptid sposoban da veže Ang-2. SEKV ID Br :6 i SEKV ID BR: 119-142 su dole prikazani: Peptid SEKVIDBR. Peptidna sekvenca Ll-l 191 QNYKPLDELDATL YEHFIFHYT Ll-2 120 LNFTPLDELEQTL YEQWTLQQS Ll-3 121 TKFNPLDELEQTL YEQWTLQHQ Ll-4 122 VKFKPLDALEQTL YEHWMFQQA Ll-5 123 VKYKPLDELDEIL YEQQTFQER Ll-7 124 TNFMPMDDLEQRL YEQFILQQG Ll-9 125 SKFKPLDELEQTL YEQWTLQHA L1-10 126 QKFQPLDELEQTLYEQFMLQQA Ll -ll 127 QNFKPMDELEDTLYKQFLFQHS Ll-12 128 YKFTPLDDLEQTL YEQWTLQHV Ll-13 129 QEYEPLDELDETL YNQWMFHQR Ll-14 130 SNFMPLDELEQTLYEQFMLQHQ Ll-15 131 QKYQPLDELDKTLYDQFMLQQG Ll-16 132 QKFQPLDELEETL YKQWTLQQR L1-17 133 VKYKPLDELDEWLYHQFTLHHQ Ll-18 134 QKFMPLDELDEIL YEQFMFQQS Ll-19 135 QTFQPLDDLEEYL YEQWIRRYH Ll-20 136 EDYMPLDALDAQL YEQFILLHG Ll-21 137 HTFQPLDELEETL YYQWL YDQL Ll-22 138 YKFNPMDELEQTLYEEFLFQHA AC6-Ll 139 TNYKPLDELDATL YEHWILQHS Ll-Cl 140 QKFKPLDELEQTL YEQWTLQQR Ll-C2 141 TKFQPLDELDQTL YEQWTLQQR Ll-C3 142 TNFQPLDELDQTL YEQWTLQQR Ll 6 KFNPLDELEETLYEQFTFQQ 10 Pronalazak se takode odnosi na polipeptid koji je sposoban da veže Ang-2 i koji sadrži aminokiselinsku sekvencu formule : ltJ>e3e4 ese6 e7 (; (SEKV ID BR :73) pri cemu 15 e 3 je neutralni polarni amino kiselinski ostatak; 00185 B 13Dos: 4544/18 13 e 4 je kiseli amino kiselinski ostatak; es je neutralni polarni ili kiseli amino kiselinski ostatak; e 6 je neutralni hidrofobni amino kiselinski ostatak; e 7 je neutralni hidrofobni amino kiselinski ostatak; PCT/US02/32657 5 i njegove fiziološki prihvatljive soli. Jedan od omiljenih aspekata je da e 3 je Y ili C. Sledeci pogodan aspekt je da e 4 je D ili E. Još jedan pogodan aspekt je da e 6 je I ili M. Pronalazak se dalje odnosi na polipeptid koji je sposoban da veže Ang-2 i koji sadrži amino kiselinsku sekvencu formule: 10 flf2t(IRPf7flffiOfiiGfi3:f4fisfi6fl7fi8fi9fO 15 20 25 30 (SEKV ID BR :74) pri cemu, f 1 je neutralni hidrofobni ili polarni amino kiselinski ostatak; f je neutralni hidrofobni ili polarni amino kiselinski ostatak; f 3 je neutralni polarni ili kiseli amino kiselinski ostatak; r je neutralni hidrofobni ili neutralni polarni amino kiselinski ostatak; f 7 je neutralni polarni amino kiselinski ostatak; fl je kiseli amino kiselinski ostatak; f je neutralni polarni ili kiseli amino kiselinski ostatak; f 10 je neutralni hidrofobni amino kiselinski ostatak; f 11 je neutralni hidrofobni amino kiselinski ostatak; f 13 je neutralni hidrofobni ili neutralni amino kiselinski ostatak; f 14 je neutralni hidrofobni ili neutralni amino kiselinski ostatak; f 1 s je neutralni polarni amino kiselinski ostatak; f 16 je neutralni polarni amino kiselinski ostatak; f 17 je neutralni ili kiseli amino kiselinski ostatak; f 18 je neutralni hidrofobni amino kiselinski ostatak; f 19 je neutralni hidrofobni ili neutralni polarni amino kiselinski ostatak; i f 0 je neutralni hidrofobni ili neutralni polarni amino kiselinski ostatak; i njegove fiziološki prihvatljive soli. Omiljeni aspekt je da: f 1 je S,A, ili G; f je G,Q ili P ; 00185 B 145 10 15 Dos: 4544118 f 3 je Q,G ili D; f je L,M ili Q; f 7 je e ili Y; fl je E ili D; f? je E,G ili D; f 10 je I ili M; f 11 je Fili L; f 13 je e ili W; f l4. G 'l' p Je 1 1 ; f 15 je T ili N; f 16 je Q,Y ili K; f 17 je N,D ili Q; f 18 je L,V,W iliR; f 19 je A,Q,Y ili I; i f 0 je L,A,G ili V 14 PCT/US02/32657 Još pogodniji aspect ovog pronalaska se tice polipeptida koji sadrži najmanje jednu amino kiselinsku sekvencu koja je izabrana iz grupe koja se sastoji od SEKV ID BR:3, i od SEKV ID Br :143 do zakljucno sa SEKV ID BR:148, pri cemu je, polipeptid sposoban da veže Ang-2 i njegove fiziološki prihvatljive soli. 20 SEKV ID BR :3, i od SEKV ID BR :143 do SEKV ID BR:148, su kao što sledi: Peptid SEKV IDNO: Sekvenca eon1-1 143 AGGMRPYDGMLGWPNYDVQA eon1-2 144 QTWDDPeMHILGPVTWRRei eon1-3 145 APGQRPYDGMLGWPTYQRIV eon1-4 146 SGQLRPeEEIFGeGTQNLAL eon1-5 147 FGDKRPLEeMFGGPIQLePR eon1-6 148 GQDLRPeEDMFGeGTKDWYG eon1 3 KRPeEEIFGGCTYQ Još jedan aspekt pronalaska se tice polipeptida koji je sposoban da veže Ang-2 i koji sadrži amino kiselinsku sekvencu formule: 25 Cg 2 Gg 4 g 5 DPFTg 10 GCg 13 (SEKV ID BR: 75) Pri cemu: 00185 B 155 Dos: 4544/18 15 g 2 je kiseli amino kiselinski ostatak; g 4 je neutralni hidrofobni amino kiselinski ostatak; g 5 je E,D ili Q; PCT/US02/32657 g 10 je neutralni hidrofobni ili neutralni polarni amino kiselinski ostatak; g 13 je kiseli ostatak; i njegove fiziološki prihvatljive soli. Omiljeni aspect je da g 2 je E ili D. Sledeci omiljeni aspect je da g 4 je V ili M. Još jedan omiljeni aspekt je da g 10 je Fili Q. Sledeci aspekt je d 13 . D ·1· E a g Je 1 1 . Pronalazak se dalje tice polipeptida koji je sposoban da veže Ang-2 i koji sadrži 10 amino kiselinsku sekvencu formule: h 1 h 2 h 3 h 4 Ch 6 Gh 8 h 9 DPFTh 14 GCh 17 h 18 h 19 h 20 15 20 25 30 (SEKV ID BR :158) Pri cemu, h 1 ne postoji ili je neutralan hodrofobni, neutralan polarni ili bazni amino kiselinski ostatak; h 2 je neutralni ili polarni amino kiselinski ostatak; h 3 je kiseli amino kiselinski ostatak; h 4 je neutralni hidrofobni ili neutralni polarni amino kiselinski ostatak; h 6 je kiseli amino kiselinski ostatak; h 8 je neutralni hidrofobni amino kiselinski ostatak; h 9 je E,D ili Q; h 14 je neutralni hidrofobni ili neutralni polarni amino kiselinski ostatak; h 17 j e kiseli amino kiselinski ostatak; h 18 je neutralni hidrofobni, neutralni polarni ili bazni amino kiselinski ostatak; h 19 je neutralni hidrofobni ili neutralni polarni amino kiselinski ostatak; h 20 ne postoji ili je amino kiselinski ostatak; i njegove fiziološki prihvatljive soli. Omiljeni aspekt je da: h 1 ne postoji ili je A,L,M,G,K ili H; h 2 je L,F ili Q; h 3 je D ili E; h 4 jeWiliY; h 6 je D ili E, 00185 B 165 Dos: 4544/ 18 h 8 je V ili M; h 14. F 'l' Q Je 1 1 ; h 17 je D ili E; h 18 je M,Y,N ili K; h l9 . L 'l' Q . Je 1 1 ; 1 16 h 20 ne postoji ili je M,T,G,S,D,K iliR. PCT/US02/32657 Još jedan aspekt pronalaska se tice polipeptida koji sadrži najmanje jednu amino kiselinsku sekvencu iz grupe koja se sastoji od SEKV ID BR :5, ili SEKV ID BR :149 do zakljucno sa SEKV ID BR : 157, pri cemu je polipeptid o kome je rec sposoban da 10 veže Ang-2, i njegove fiziološki prihvatljive soli. SEKV ID BR :5, ili SEKV ID BR :149 do SEKV ID BR : 157 su prikazane ispod. 15 20 25 Pep ti d SEKVIDBR. Sekvenca 12-9-1 149 GFEYCDGMEDPFTFGCDKQT 12-9-2 150 KLEYCDGMEDPFTQGCDNQS 12-9-3 151 LQEWCEGVEDPFTFGCEKQR 12-9-4 152 AQDYCEGMEDPFTFGCEMQK 12-9-5 153 LLDYCEGVQDPFTFGCENLD 12-9-6 154 HQEYCEGMEDPFTFGCEYQG 12-9-7 155 MLDYCEGMDDPFTFGCDKQM 12-9-C2 156 LQDYCEGVEDPFTFGCENQR 12-9-C1 157 LQDYCEGVEDPPTFGCEKQR 12-9 5 FDYCEGVEDPFTFGCDNH Najomiljeniji aspekt pronalaska se tice jedinjenja od interesa formule : (x l l 2 )q-F -(X )r i njegovih multimera, pri cemu je: F 1 nosac; X 1 i X 2 su svaki za sebe nezavisno izabrani od -(L 1 )s-P 1 ; -(Ll)s-Pl-(L 2)t-P2; -(L 1 )s-p 1 -(L 2)t-p2 -(L3)u-p3; -(L l)s-Pl-(L2)t-p2 -(L3)u-P3 -(L 4)v-P4; pri cemu jedan ili više P 1 ,P 2 ,P 3 i P 4 svaki za sebe nezavisno sadrže polipeptid koji je izabran iz grupe koja se sastoji od: (a) aminokiselinske sekvence WDPWT (SEKV ID BR :65), pri cemu se polipeptid o kome je rec sastoji od 5 do 50 aminokiselina u nizu; 00185 B 17Dos: 4544118 17 PCT/US02/32657 (b) aminokiselinske sekvence WDPWT (SEKV ID BR :66); (e) aminokiselinske sekvence Cz 2 WDPWT (SEKV ID BR:67), pri cemu je z 2 kiseli ili neutralni polarni amino kiselinski ostatak; (d) aminokiselinske sekvence CiWDPWTC (SEKV ID BR:68), pri cemu je z 2 5 kiseli ili neutralni polarni amino kiselinski ostatak; (e) aminokiselinske sekvence:Pc 2 Dc 4 Lc 6 c 7 c 8 LY (SEKV ID BR:71) pri cemu je c 2 neutralni amino kiselinski ostatak;c 4 je A,D ili E; c 6 je kiseli amino kiselinski ostatak; c 7 je kiselinski ostatak; i c 8 je neutralni hidrofobni, neutralni polarni ili bazniamino kiselinski ostatak; 10 (f) aminokiselinske sekvence Rpe 3 e 4 e 5 e 6 e 7 G (SEKV ID BR:73), pri cemu je e 3 neutralni polarni amino kiselinski ostatak; e 4 je kiseli amino kiselinski ostatak; e 5 je neutralni polarni ili kiseli amino kiselinski ostatak; e 6 je neutralni hidrofobni amino kiselinski ostatak; i e 7 je neutralni hidrofobni amino kiselinski ostatak; 15 (g) aminokiselinske sekvence Cg 2 Gg 4 g 5 DPFTg 10 GCg 13 (SEKV ID BR:75) pri cemu je g 2 kiseli amino kiselinski ostatak; g 4 je neutralni hidrofobni amino kiselinski ostatak; g 5 je neutralni polarni ili kiseli aminokiseinski ostatak; g 10 je neutralni hidrofobni ili neutralni polarni amino kiselinski ostatak; i g 13 je kiseli ostatak; (h) polipeptida od SEKV ID BR: l; 20 (i) polipeptida od SEKV ID BR:2; i (j) polipeptida od SEKV ID BR:7; 25 Pri cemu su L 1 ,L 2 ,L 3 i L 4 svaki za sebe nezavisno kopce; a q,r,s,t,u i v su svaki za sebe nezavisno O ili l, pod uslovom daje najmanje jedan od q ilir jednak l; i njihove fiziološki prihvatljive soli. Treba uzeti u obzir to da se pronalazak dalje tice fuzionog polipeptida koji sadrži najmanje jedan od opisanih peptida i nosac kao što je gore opisano, pri cemu je fuzioni polipeptid sposoban da veže Ang-2, i njegovih fiziološki prihvatljivih soli. U fuzionom polipeptidu, najbolje je, da je nosac najmanje jedan Fc domen, polietilen glikol, lipid, holesterolska grupa, ugljeni hidrat ili neki oligosaharid. Ostale podobne nosace, kakav 30 je albumin ili slicno, procenice oni koji se razumeju u struku i oni su sadržani u opsegu pronalaska. Onaj koji se razume u struku vrednovace razlicite molekule koji mogu biti umetnuti u strukturu specificnog vezujuceg agensa. Prema tome, dati molekul može biti 00185 B 18Dos: 4544/18 18 PCT/US02/32657 umetnut, na primer izmedu peptidnog dela i nosaca specificnog vezujuceg agensa, ili umetnut unutar samog peptidnog dela, sve dok podražava željenu aktivnost specificnog vezujuceg agensa. Neki od molekula se, na primer, mogu odmah umetnuti, kao što su neki Fc domen ili njegov fragment, propilen glikol ili ostali srodni molekuli kakvi su 5 dekstran, masna kiselina, lipid, holesterolska grupa, mali ugljeni hidrat, peptid, citotoksicni agensi, terapeutski agensi, detektibilna sredina kao što je ovde opisano (ukljucujuci fluorescentne agense, radioobeleživace kakvi su radioizotopi), oligosaharid, oligonukleotid, polinukleotid, interferentna (i druge) RNA, enzimi, hormoni i slicno. Ostale molekule pogodne za dodavanje u ovaj oblik procenice oni koji se razumeju u l O struku, i oni su sadržani u opsegu pronalaska. Ovo, na primer, ukljucuje inserciju jednog željenog molekula izmedu dve konsekutivne amino kiseline, eventualno pnpoJene pogodnoj kopci. Prateci primer insercije u Con4(C) sekvencu peptidnog tela: M-Fc-GGGGGAQQEECEWDPWTCEHMLE (SEKV ID BR :23) Onaj koji se razume u struku može lako umetnuti željeni molekul izmedu, na 15 primer, dva susedna glutaminska (\"QQ\") ostatka da bi postigao željenu strukturu ili/i funkciju, sve dok se podržava mogucnost peptida da veže Ang-2. Dakle, ova sekvenca može biti modifikovana kao što sledi: M-Fc-GGGGGAQ-[molekul]-QEECEWDPWTCEHMLE Podobni vezni molekuli mogu biti dodati ako se želi. Dalje ce se uzeti u obzir da 20 moleku! može biti dodat na brojna mesta na molekulu ukljucujuci prikladne bocne lance, izmedu nosaca i peptidne sekvence kao što sledi: 25 M-Fc-[molekul]- GGGGGAQQEECEWDPWTCEHMLE ili na bilo kojem drugom mestu koje poželi onaj koji se razume u struku. Ostale pogodni aspekti mogu biti pridodati od onih koji se razumeju u struku. Još jedan aspekt pronalaska se tice polinukleotida koji kodira specificne vezujuce agense (ukljucujuci, ali koji nisu ograniceni na peptide i peptidna tela) iz pronalaska, kako je ovde opisano. Onaj koji se razume u struku smatrace vrednim to što se tamo gde postoji poznata amino kiselinska sekvenca, mogu lako odrediti odgovarajuce nukleotidne sekvence primenom poznatih tehnika. Pogledati na primer 30 Suzuki, D., An Introduction to Genetic Analysis, W.H. Freeman Pub.Co. (1986). Primeri nukleotidnih sekvenci koje kodiraju peptide iz pronalaska su prikazani dole. Onaj koji se razume u struku ce prepoznati da data aminokiselina može kodirati više od 00185 B 19Dos: 4544/ 18 19 PCT /US02/32657 jednog kodona, tako da se pronalazak tice bilo koje nukleotidne sekvence koja kodira peptide ili/i peptidna tela iz pronalaska. 00185 B 20Dos: 4544118 20 PCT /US02/32657 Peptid SEKV. Peptidna sekvenca Primeri DNA sekvenci ID BR. Con4- 76 PIRQEECDWDPWT ccgatccgtcaggaagaatgcgactgggacccgtggacctgcgaacacatgtgggaagtt 44 CEHMWEV (SEKV ID BR: 159) Con4- 77 TNIQEECEWDPWT accaacatccaggaagaatgcgaatgggacccgtggacctgcgaccacatgccgggtaaa 40 CDHMPGK (SEKV ID BR: 160) Con4- 78 WYEQDACEWDP tggtacgaacaggacgcttgcga atgggacccgtggacctgcgaacacatggctgaagtt 4 WTCEHMAEV (SEKV ID BR:161) Con4- 79 NRLQEVCEWDPW aaccgtctgcaggaagtttgcgaatgggacccgtggacctgcgaacacatggaaaacgtt 31 TCEHMENV (SEKV ID BR: 162) Con4- 80 AATQEECEWDPW gctgctacccaggaagaatgcgaatgggacccgtggacctgcgaacacatgccgcgttcc cs TCEHMPRS (SEKV ID BR: 163) Con4- 81 LRHQEGCEWDPW ctgcgtcaccaggaaggttgcga atgggacccgtggacctgcgaacacatgttcgactgg 42 TCEHMPDW (SEKV ID BR: 164) Con4- 82 VPRQKDCEWDPW Gttccgcgtcagaaagactgcgaatgggacccgtggacctgcgaacacatgtacgttggt 35 TCEHMYVG (SEKV ID BR: 165) Con4- 83 SISHEECEWDPWT tccatctcccacgaagaatgcgaatgggacccgtggacctgcgaacacatgcaggttggt 43 CEHMQVG (SEKV ID BR:360) Con4- 84 W AAQEECEWDP tgggctgctcaggaagaatgcgaatgggatccgtggacttgcgaacacatgggtcgtatg 49 WTCEHMGRM (SEKV ID BR: 166) 00185 B 21Dos: 4544118 21 PCT/US02/32657 Con4- 85 TWPQDKCEWDP acttggccgcaggacaaatgcga atgggatccgtggacttgcgaacacatgggttctact 27 WTCEHMGST (SEKV ID BR: 167) Con4- 86 GHSQEECGWDPW ggtcactcccaggaagaatgcggttgggacccgtggacctgcgaacacatgggtacgtcc 48 TCEHMGTS (SEKV ID BR: 168) Con4- 87 QHWQEECEWDP cagcactggcaggaagaatgcgaatgggacccgtggacctgcgaccacatgccgtccaaa 46 WTCDHMPSK (SEKV ID BR: 169) Con4- 88 NVRQEKCEWDPW aacgttcgtcaggaaaaatgcgaatgggacccgtggacctgcgaacacatgccggttcgt 41 TCEHMPVR (SEKV ID BR: 170) Con4- 89 KSGQVECNWDPW aaatccggtcaggttgaatgcaactgggacccgtggacctgcgaacacatgccgcgtaac 36 TCEHMPRN (SEKV ID BR:171) Con4- 90 VKTQEHCDWDPW gttaaaacccaggaacactgcgactgggacccgtggacctgcgaacacatgcgtgaatgg 34 TCEHMREW (SEKV ID BR: 172) Con4- 91 A WGQEGCDWDP gcttggggtcaggaaggttgcgactgggacccgtggacctgcgaacacatgctgccgatg 28 WTCEHMLPM (SEKV ID BR: 173) Con4- 92 PVNQEDCEWDPW ccggttaaccaggaagactgcgaatgggacccgtggacctgcgaacacatgccgccgatg 39 TCEHMPPM (SEKV ID BR: 174) Con4- 93 RAPQEDCEWDPW cgtgctccgcaggaagactgcgaatgggacccgtggacctgcgctcacatggacatcaaa 25 TCAHMDIK (SEKV ID BR: 175) Con4- 94 HGQNMECEWDP cacggtcagaacatggaatgcgaatgggacccgtggacctgcgaacacatgttccgttac 50 WTCEHMFRY (SEKV ID BR:176) 00185 B 22Dos: 4544118 22 PCT/US02/32657 Con4- 95 PRLQEECVWDPW ccgcgtctgcaggaagaatgcgtttgggacccgtggacctgcgaacacatgccgctgcgt 38 TCEHMPLR (SEKV ID BR: 177) Con4- 96 RTTQEKCEWDPW cgtaccacccaggaaaaatgcgaatgggacccgtggacctgcgaacacatggaatcccag 29 TCEHMESQ (SEKV ID BR: 178) Con4- 97 QTSQEDCVWDPW cagacctcccaggaagactgcgtttgggacccgtggacctgcgaccacatggtttcctcc 47 TCDHMVSS (SEKV ID BR: l 79) Con4- 98 QVIGRPCEWDPW Caggttatcggtcgtccgtgcgaatgggacccgtggacctgcgaacacctggaaggtetg 20 TCEHLEGL (SEKV ID BR: 180) Con4- 99 W AQQEECA WDP tgggctcagcaggaagaatgcgcttgggacccgtggacctgcgaccacatggttggtctg 45 WTCDHMVGL (SEKV ID BR:181) Con4- 100 LPGQEDCEWDPW ctgccgggtcaggaagactgcga atgggacccgtggacctgcgaacacatggttcgttcc 37 TCEHMVRS (SEKV ID BR: 182) Con4- 101 PMNQVECDWDP ccgatgaaccaggttgaatgcga ctgggacccgtggacctgcgaacacatgccgcgttcc 33 WTCEHMPRS (SEKV ID BR: 183) AC2- 102 FGWSHGCEWDPW ttcggttggtctcacggttgcgaatgggatccgtggacttgcgaacacatgggttctacc Con4 TCEHMGST (SEKV ID BR: 184) Con4- 103 KSTQDDCDWDPW aaatccacccaggacgactgcgactgggacccgtggacctgcgaacacatggttggtccg 32 TCEHMVGP (SEKV ID BR: 185) Con4- 104 GPRISTCQWDPWT ggtccgcgtatctccacctgccagtgggacccgtggacctgcgaacacatggaccagctg 17 CEHMDQL (SEKV ID BR: 186) Con4- 105 STIGDMCEWDPW tccaccatcggtgacatgtgcgaatgggacccgtggacctgcgctcacatgcaggttgac 8 TCAHMQVD (SEKV ID BR: 187) AC4- 106 VLGGQGCEWDPW gttctgggtggtcagggttgcgaatgggacccgtggacctgccgtctgctgcagggttgg Con4 TCRLLQGW (SEKV ID BR: 188) Con4- 107 VLGGQGCQWDP gttctgggtggtcagggttgccagtgggacccgtggacctgctcccacctggaagacggt l WTCSHLEDG (SEKV ID BR: 189) Con4- 108 TTIGSMCEWDPW accaccatcggttccatgtgcgaatgggacccgtggacctgcgctcacatgcagggtggt Cl TCAHMQGG (SEKV ID BR: 190) Con4- 109 TKGKSVCQWDPW accaaaggtaaatccgtttgccagtgggacccgtggacctgctcccacatgcagtccggt 21 TCSHMQSG (SEKV ID BR:l91) 00185 B 23Dos: 4544/18 23 PCT/US02/32657 Con4- 110 TTIGSMCQWDPW accaccatcggttccatgtgccagtgggacccgtggacctgcgctcacatgcagggtggt C2 TCAHMQGG (SEKV ID BR: 192) Con4- 111 WVNEVVCEWDP tgggttaacgaagttgtttgcgaatgggacccgtggacctgcaaccactgggacaccccg 18 WTCNHWDTP (SEKV ID BR:l93) Con4- 112 VVQVGMCQWDP gttgttcaggttggtatgtgccagtgggacccgtggacctgcaaacacatgcgtctgcag 19 WTCKHMRLQ (SEKV ID BR: 194) Con4- 113 A VGSQTCEWDPW gctgttggttcccagacctgcgaatgggacccgtggacctgcgctcacctggttgaagtt 16 TCAHLVEV (SEKV ID BR: 195) Con4- 114 QGMKMFCEWDP cagggtatgaaaatgttctgcgaatgggacccgtggacctgcgctcacatcgtttaccgt ll WTCAHIVYR (SEKV ID BR: 196) Con4- 115 TTIGSMCQWDPW accaccatcggttccatgtgccagtgggacccgtggacctgcgaacacatgcagggtggt C4 TCEHMQGG (SEKV ID BR: 197) Con4- 116 TSQRVGCEWDPW acctcccagcgtgttggttgcgaatgggacccgtggacctgccagcacctgacctacacc 23 TCQHLTYT (SEKV ID BR: 198) Con4- 117 QWSWPPCEWDP cagtggtcctggccgccgtgcgaatgggacccgtggacctgccagaccgtttggccgtcc 15 WTCQTVWPS (SEKV ID BR: 199) Con4- 118 GTSPSFCQWDPW ggtacctccccgtccttctgccagtgggacccgtggacctgctcccacatggttcagggt 9 TCSHMVQG (SEKV ID BR: 200) TN8- 4 QEECEWDPWTCE caggaagaatgcgaatgggacccatggacttgcgaacacatg Con4 HM (SEKV ID BR: 20 l) Ll-l 119 QNYKPLDELDATL cagaactacaaaccgctggacgaactggacgctaccctgtacgaacacttcatcttccactacacc YEHFIFHYT (SEKV ID BR:202) Ll-2 120 LNFTPLDELEQTL ctgaacttcaccccgctggacgaactggaacagaccctgtacgaacagtggaccctgcagcagtc YEQWTLQQS e (SEKV ID BR: 203) Ll-3 121 TKFNPLDELEQTL accaaattcaacccgctggacgaactggaacagaccctgtacgaacagtggaccctgcagcacca YEQWTLQHQ g (SEKV ID BR: 204) L1-4 122 VKFKPLDALEQTL gttaaattcaaaccgctggacgctctggaacagaccctgtacgaacactggatgttccagcaggct YEHWMFQQA (SEKV ID BR: 205) 00185 B 24Dos: 4544118 24 PCTIUS02/32657 L1-5 123 VKYKPLDELDEIL gttaaatacaaaccgctggacgaactggacgaaatcctgtacgaacagcagaccttccaggaacgt YEQQTFQER (SEKV ID BR: 206) L1-7 124 TNFMPMDDLEQR accaacttcatgccgatggacgacctggaacagcgtctgtacgaacagttcatcctgcagcagggt LYEQFILQQG (SEKV ID BR: 207) L1-9 125 SKFKPLDELEQTL tccaaattcaaaccgctggacgaactggaacagaccctgtacgaacagtggaccctgcagcacgc YEQWTLQHA t (SEKV ID BR: 208) Ll-10 126 QKFQPLDELEQTL cagaaattccagccgctggacgaactggaacagaccctgtacgaacagttcatgctgcagcaggc YEQFMLQQA t (SEKV ID BR: 209) Ll-ll 127 QNFKPMDELEDTL cagaacttcaaaccgatggacgaattggaagacaccctgtacaaacagttcctgttccagcactcc YKQFLFQHS (SEKV ID BR: 21 O) Ll-12 128 YKFTPLDDLEQTL tacaaattcaccccgctggacgacctggaacagaccctgtacgaacagtggaccctgcagcacgtt YEQWTLQHV (SEKV ID BR: 211) Ll-13 129 QEYEPLDELDETL caggaatacgaaccgctggacgaactggacgaaaccctgtacaaccagtggatgttccaccagcg YNQWMFHQR t (SEKV ID BR: 212) L1-14 130 SNFMPLDELEQTL tccaacttcatgccgctggacgaactggaacagaccctgtacgaacagttcatgctgcagcaccag YEQFMLQHQ (SEKV ID BR: 213) Ll-15 131 QKYQPLDELDKTL cagaaataccagccgctggacgaactggacaaaaccctgtacgatcagttcatgctgcagcaggg YDQFMLQQG t (SEKV ID BR: 214) L1-16 132 QKFQPLDELEETL cagaaattccagccgctggacgaactggaagaaaccctgtacaaacagtggaccctgcagcagc YKQWTLQQR gt (SEKV ID BR: 215) L1-17 133 VKYKPLDELDEW gttaaatacaaaccgctggacgaactggacgaatggctgtaccaccagttcaccctgcaccaccag LYHQFTLHHQ (SEKV ID BR: 216) L1-18 134 QKFMPLDELDEIL cagaaattcatgccgctggacgaactggacgaaatcctgtacgaacagttcatgttccagcagtccc YEQFMFQQS (SEKV ID BR: 217) Ll-19 135 QTFQPLDDLEEYL cagaccttccagccgctggacgacctggaagaatacttgtacgaacagtggatccgtcgttaccac YEQWIRRYH (SEKV ID BR: 218) L1-20 136 EDYMPLDALDAQ gaagactacatgccgctggacgctatggacgctcagctgtacgaacagttcatcctgctgcacggt LYEQFILLHG (SEKV ID BR: 219) L1-21 137 HTFQPLDELEETL cacaccttccagccgctggacgaactggaagaaaccctgtactaccagtggctgtacgaccagct 00185 B 25Dos: 4544118 25 PCT/US02/32657 YYQWLYDQL g (SEKV ID BR: 220) Ll-22 138 YKFNPMDELEQTL tacaaattcaacccgatggacgaactggaacagaccctgtacgaagaattcctgttccagcacgct YEEFLFQHA (SEKV ID BR: 221) AC6- 139 TNYKPLDELDATL accaactacaaaccgctggacgaactggacgctaccctgtacgaacactggatcctgcagcactc Ll YEHWILQHS e (SEKV ED BR: 222) Ll- 140 QKFKPLDELEQTL cagaaattcaaaccgctggacgaactggaacagaccctgtacgaacagtggaccctgcagcagc Cl YEQWTLQQR gt (SEKV ID BR: 223) Ll- 141 TKFQPLDELDQTL accaaattccagccgctggacgaactggaccagaccctgtacgaacagtggaccctgcagcagc C2 YEQWTLQQR gt (SEKV ID BR: 224) Ll- 142 TNFQPLDELDQTL accaacttccagccgctggacgaactggaccagaccctgtacgaacagtggaccctgcagcagc C3 YEQWTLQQR gt (SEKV ID BR: 225) Ll 6 KFNPLDELEETLY aaattcaacccgctggacgagctggaagagactctgtacgaacagtttacttttcaacag EQFTFQQ (SEKV ID BR:226) Co nl- 143 AGGMRPYDGMLG gctggtggtatgcgtccgtacgacggtatgctgggttggccgaactacgacgttcaggct l WPNYDVQA (SEKV ID BR:227) Conl- 144 QTWDDPCMHILG cagacttgggacgatccgtgcatgcacattctgggtccggttacttggcgtcgttgcatc 2 PVTWRRCI (SEKV ID BR: 228) Conl- 145 APGQRPYDGMLG gctccgggtcagcgtccgtacgacggtatgctgggttggccgacctaccagcgtatcgtt 3 WPTYQRIV (SEKV ID BR:229) Conl- 146 SGQLRPCEEIFGC tccggtcagctgcgtccgtgcgaagaaatcttcggttgcggtacccagaacctggctctg 4 GTQNLAL (SEKV ID BR: 230) Co nl- 147 FGDKRPLECMFG ttcggtgacaaacgtccgctggaatgcatgttcggtggtccgatccagctgtgcccgcgt 5 GPIQLCPR (SEKV ID BR:231) Co nl- 148 GQDLRPCEDMFG ggtcaggacctgcgtccgtgcgaagacatgttcggttgcggtaccaaagactggtacggt 6 CGTKDWYG (SEKV ID BR: 232) 12-9- 149 GFEYCDGMEDPFT ggtttcgaatactgcgacggtatggaagacccgttcaccttcggttgcgacaaacagacc l FGCDKQT (SEKV ID BR:233) 12-9- 150 KLEYCDGMEDPF aaactggaatactgcgacggtatggaagacccgttcacccagggttgcgacaaccagtcc 00185 B 26Dos: 454411 8 26 PCT/US02/32657 2 TQGCDNQS (SEKV ID BR:234) 12-9- 151 LQEWCEGVEDPFT ctgcaggaatggtgcgaaggtgttgaagacccgttcaccttcggttgcgaaaaacagcgt 3 FGCEKQR (SEKV ID BR:235) 12-9- 152 AQDYCEGMEDPF gctcaggactactgcgaaggtatggaagacccgttcaccttcggttgcgaaatgcagaaa 4 TFGCEMQK (SEKV ID BR:236) 12-9- 153 LLDYCEGVQDPFT ctgctggactactgcgaaggtgttcaggacccgttcaccttcggttgcgaaaacctggac 5 FGCENLD (SEKV ID BR:23 7) 12-9- 154 HQEYCEGMEDPF caccaggaatactgcgaaggtatggaagacccgttcaccttcggttgcgaataccagggt 6 TFGCEYQG (SEKV ID BR:238) 12-9- 155 MLDYCEGMDDPF atgctggactactgcgaaggtatggacgacccgttcaccttcggttgcgacaaacagatg 7 TFGCDKQM (SEKV ID BR:239) 12-9- 156 LQDYCEGVEDPFT ctgcaggactactgcgaaggtgttgaagacccgttcaccttcggttgcgaaaaacagcgt C2 FGCENQR (SEKV ID BR:241) 12-9- 157 LQDYCEGVEDPFT ctgcaggactactgcgaaggtgttgaagacccgttcaccttcggttgcgaaaaacagcgt Cl FGCEKQR (SEKV ID BR:241) 12-9 5 FDYCEGVEDPFTF ttcgactactgcgaaggtgttgaagacccgttcactttcggctgtgataaccac GCDNH (SEKV ID BR: 242) 00185 B 27Dos: 4544/ 18 27 PCT /US02/32657 Još jedan aspekt pronalaska se tice vektora ekspresije koji sadrže najmanje jedan polinukleotid iz pronalaska. Još jedan aspekt pronalaska se tice celija domacina koje sadrže vektor ekspresije. Treba uzeti u obzir to da je najbolje da su celije domacin prokariotske celije (kao što su E.coli celije) ili eukariotske celije. Pronalazak se takode odnosi na farmaceutske oblike koji sadrže efektivnu dozu ovde opisanih jedinjenja, uz dodatak farmaceutski prihvatljivog nosaca. Pronalazak se takode odnosi na metod inhibicije neželjene angiogeneze u sisara, koji se sastoji u primeni efektivne terapeutske doze polipeptida ili jedinjenja kao što je gore opisano. Pronalazak se takode odnosi na metod modulacije angiogeneze u sisara koja se sastoji u primeni terapeutski efektivne doze polipeptida ili jedinjenja, kao što je gore opisano. Pronalazak se dalje tice metode inhibicije tumorskog rasta koja je pracena neželjenom angiogenezom u sisara, i koja se sastoji u primeni terapeutski efektivne doze polipeptida ili jedinjenja kao što je gore opisano. Još se pronalazak tice i metode lecenja kancera u sisara, koja se sastoji u primeni terapeutski efektivne doze polipeptida ili jedinjenja kao što je gore opisano i jednog hemoterapeutskog agensa. Jedan od aspekata pronalaska je da je hemoterapeutski agens najmanje jedan 5-FU,CPT-11 i Taxotere. Smatrace se vrednim, medutim, što ostali podobni hemoterapeutski agensi i ostala antikancerska terapija mogu biti korišceni. Pronalazak se takode tice metoda modulacije bilo vaskularne permeabilnosti bilo isticanja plazme u sisara koja se sastoji u primeni terapeutski efektivne doze polipeptida ili jedinjenja kao što je gore opisano. Pronalazak se dalje tice metoda lecenja bar jedne od ocnih neovaskularnih bolesti, gojaznosti, inflamacijskih bolesti, inflamacijskih poremecaja, ateroskleroze, endometrioze, neoplasticne bolesti, bolesti povezane s kostima, ili psorijaze u sisara koja se sastoji u primeni terapeutski efektivne doze polipeptida ili jedinjenja kao što je gore opisaNO. Treba uzeti u obzir to što specificni vezujuci agensi iz pronalaska mogu biti korišceni u terapiji mnogih bolesti udruženih sa neregulamom ili neželjenom angiogenezom. Ove bolesti ukljucuju, ali msu ogranicene na, okulamu neovaskularizaciju, kakva je retinopatija (ukljucujuci dijabetesnu retinopatiju i makulamu degeneraciju zavisnu od godina), psorijazu, hemangioblastom, hemangiom, aterosklerozu, inflamacijske bolesti, kao što su reumatoidne ili reumatske bolesti, posebno artritis (ukljucujuci reumatoidni artritis), ili druge hronicne hronicne 00185 B 28Dos: 4544/18 28 PCT/US02/32657 inflamacijske poremecaje, kao što su hronicna astma, arterijska i posttraumatska ateroskleroza, endometrioza ili neoplasticne bolesti, na primer, takozvane solidne tumore i tecne tumore (kakva je leukemija). Ostala oboljenja koja mogu biti tretirana primenom specificnih vezujucih agenasa bice jasne onima koji se razumeju u struku. Takva dodatna oboljenja ukljucuju, ali nisu ogranicena na, gojaznost, vaskulamu permeabilnost, isticanje plazme i bolesti povezane s kostima, ukljucujuci osteoporozu. Dakle, pronalazak se dalje tice metoda lecenja ovih oboljenja koja su udružena sa poremecenom ili neželjenom angiogenezom. Ostali aspekti ovog pronalaska bice, bez muke, jasni iz ovde prikazanog otkrica. KRATAK OPIS SLIKA Slika l prikazuje grafik zapremine tumora (y-osa) u odnosu na vreme (x-osa) u miševa koji imaju A-431 tumor i koji su tretirani peptidnim telom TN8-Con4-C iz predstavljenog pronalaska ili fosfatnim puferovanim slanim rastvorom (PBS). Detalji su objašnjeni u Primerima. Slika 2 prikazuje grafik koncentracije peptidnog tela (y-osa) u odnosu na vremensku post-dozu (x-osa) u miševa divljeg tipa koji su tretirani dozom od 50~-tg bilo 2xCon4-C, Ll-7-N bilo Ll-21-N peptidnim telom. Detalji su objašnjeni u Primerima. Slika 3 prikazuje grafik zapremine tumora (y-osa) u odnosu na vreme (x-osa) u miševa koji imaju A431 tumor i koji su tretirani peptidnim telom 2xCon4-C prema predstavljenom pronalasku, ili fosfatnim puferovanim slanim rastvorom (PBS) ili kontrolnim peptidnim telom. Detalji su objašnjeni u Primerima. Slika 4 prikazuje grafik koji predstavlja rast, in vitro kultiviranih celija tumora A431, koje su tretirane peptidnim telom Con4-C prema predstavljenom pronalasku, kontrolnim peptidnim telom, ili su netretirane. Detalji su objašnjeni u Primerima. Slika 5 prikazuje grafik zapremine tumora (y-osa) u odnosu na vreme (x-osa) u Colo205 tumorskim celijama koje su tretirane peptidnim telom Con4-C, peptidnim telom Ll-7-N, peptidnim telom Ll-21-N, ili peptidnim telom 2xCon4-C prema predstavljenom pronalasku, ili sa fosfatnim puferovanim slanim rastvorom (PBS), anti Ang-2-antitelom (ab536) ili Fc-om. Detalji su opisani u Primerima. Slika 6 prikazuje grafik tumorske zapremine (y-osa) u odnosu na vreme (x-osa) u ksenograftu Colo205 tumora koji imaju miševi i koji su tretirani razlicitim dozama 00185 B 29Dos: 4544/ 18 29 PCT/US02/32657 peptidnog tela 2xCon4-C koji odgovara predstavljenom pronalasku ili sa fosfatnim puferovanim slanim rastvorom(PBS) ili Fc. Detalji su opisani u Primerima. Slika 7 prikazuje grafik tumorske zapremine (y-osa) u odnosu na vreme (x-osa) u ksenograftu Colo205 tumora koji imaju miševi i koji su tretirani peptidnim telom 2xCon4-C koji odgovara predstavljenom pronalasku ili kontrolnim peptidnim telom. Slika 7 osim toga, prikazuje grafik CD-31 obojene oblasti (celokupna oblast tumora za ovapeptidna tela). Detalji su opisani u Primerima. Slika 8 prikazuje grafik tumorske zapremine (y-osa) u odnosu na vreme (x-osa) u ksenograftu Colo205 tumora koji imaju miševi i koji su tretirani peptidnim telom 2xCon4-C koji odgovara predstavljenom pronalasku ili sa fosfatnim puferovanim slanim rastvorom ili kontrolnim peptidnim telom. Detalji su opisani u Primerima. Ovaj grafik pokazuje da su anti-Ang-2 peptidna tela sposobna da inhibiraju rast Colo205 tumora nezavisno od vremena pocetka doziranja. Slika 9 prikazuje sažetak odnosa potpunog odgovora (CR- complete response) postignutog u golih mišica korišcenjem antitela Ab536 ili peptidnog tela 2xCon4-C, kod oba ksenografska modela A431 i Colo-205. Detalji su opisani u Primerima. Slika l OA prikazuje grafik tumorske zapremine (y-osa) u odnosu na vreme (x osa) u kseno graftu Colo205 tumora koji imaju miševi koji su tretirani peptidnim telom 2xCon4-C koji odgovara predstavljenom pronalasku, ili kombinacijom 2xCon4-C i taksotera, ili fosfatnim puferovanim slanim rastvorom (PBS), ili sa PBS plus taksotere. Detalji su opisani u Primerima. Slika l OB prikazuje grafik tumorske zapremine (y-osa) u odNOsu na vreme (x osa) u kseNOgraftu Colo205 tumora koji NOse miševi koji su tretirani peptidnim telom 2xCon4-C koji odgovara predstavljenom pronalasku, ili kombinaciju 2xCon4-C i 5-FU, ili sa fosfatnim puferovanim slanim rastvorom (PBS) ili sa PBS plus 5-FU. Detalji su opisani u Primerima. Slika ll prikazuje grafik porast nivoa (AUC±SE) u šapi pacova, model sa dodatno izazvanim artritisom, koji su tretirani peptidnim telom 2xCon4-C koji odgovara predstavljenom pronalasku, ili sa fosfatnim puferovanim slanim rastvorom (PBS) ili kontrolnim peptidnim telom ili normalnom ili artritis kontrolom. Detalji su opisani u Prim erima. Slika ll B prikazuje grafik mineralne gustine kostiju šape kod modela pacova sa dodatno izazvanim artritisom, koji su tretirani sa peptidnim telom 2xCon4-C koji 00185 B 30Dos: 4544/ 18 30 PCT/US02/32657 odgovara predstavljenom pronalasku, ili sa fosfatnim puferovanim slanim rastvorom, ili sa kontrolnim peptidnim telom ili normalnom ili artritis kontrolom. Detalji su opisani u Prim erima. Slika ll e prikazuje grafik pro mene tel esne mase u modelu pacova sa dodatno indukovanim artritisom, koji su tretirani sa peptidnim telom 2xeon4-e koji odgovara predstavljenom pronalasku, ili sa fosfatnim puferovanim slanim rastvorom, ili sa kontrolnim peptidnim telom ili normalnom ili artritis kontrolom. Detalji su opisani u Prim erima. Slika 12 prikazuje dva grafika koji prikazuju inhibiciju VEGF-izazvane kornealne angiogeneze u pacova. Prvi grafik prikazuje nooj krvnih sudova izmerenih u pacova koji su tretirani govedim serumskim albumiNOm (BSA), VEGF plus fosfatni puferovanii slani rastvor (PBS), ili VEGF plus PEPTIDNO TELO eon4-e 1z pronalaska. Drugi grafik prikazuje površinu krvnog suda (mm2) u pacova koji su tretirani govedim serumskim albumiNOm (BSA), VEGF plus fosfatnim puferovanim slanim rastvorom (PBS), ili VEGF plus peptidnim telom eon4-e iz pronalaska. Detalji su opisani u Primerima. Slike 13A,l3B i 13e prikazuju epitop koji mapira podatke (O.D: 370) za celokupnu dužinu humaNOg Ang-2 (hAng-2), od N-treminalnog kraja hAng-2, i do e terminalnog kraja hAng-2, odnosno, za peptidna tela TN8-eon4-e, Li-7-N, i 12-9-3-e koji odgovaraju pronalasku, isto kao i za kontrolno peptidno telo , Tie2-Fc, e2B8 ili 5B12. Detalji su opisani u Primerima. Slika 14 prikazuje vezujuci afinitet (KD) peptidnog tela 2xeon-4-e koji odgovara pronalasku, primenom Sapidyne KinExA analize. Detalji su objašnjeni u Prim erima. 00185 B 315 10 15 20 25 30 \\VO 03/057 134 31 PCT!US02/3 265 7 Detaljan opis pronalaska Naslovi odeljaka ovde se koriste samo u organizacione svrhe, i ni na koji nacin ne ogranicavaju predmet opisane prijave. Za dobijanje rekombinantnog molekula DNK, proteina i antitcla, kao i za transformacije kulture tkiva i celija, mogu se koristiti standardne tehnike. Enzimatske reakcije kao i tehnike precišcavanja tipicno sc koriste prema specifikacijama navedenim od strane proizvodaca . ili kako je to uobicajeno u datoj oblasti koristeci postupke navedene u Sarnbrook et aL. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring 1-larbor, NY [1989]), ili kako je ovde to prikazano. Ukoliko nisu data posebna objašnjenja, upotrebljena nomenklatura, i ovde opisani laboratorijski postupci i tehnike analiticke hemije, sinteticke organske hcmije, i medicinske i l~trmaeeutskc hemije, spadaju u one dobro poznate i uobicajeno korišcene u oblasti . Standardne tehnike se mogu koristiti u svrhe hemijske sinteze, hemijske analize, fam1accutskih preparacija, formulacija, i nacina primene i u lecenju pacijenata. Definicije Izrazi koji se koriste u celokupnom tekstu definisani su kako sledi, osim ukoliko to nije na neki drugi nacin ograniceno u pojedinim slucajevima . Termnin \"Ang-2\" odnosi se na polipeptid dat na slici 6 U.S. patenta br. 6,166,185 (\"Tie-2ligand-2\") ili njegovih fragmenata kao i slicnih polipcptida koji ukljucuju alelicne varijante, kombinovane (splice) varijante, derivate, supstitucije, deletacijc, i l ili umetnute varijante, fuzione peptidc i polipeptidc, i homologe razlicitih vrsta. Polipeptid Ang-2 može, ili ne, sadržavati dodatne terminalne ostatke, na pr., sekvence vodilje, ciljane sekvence, amino terminalni metioninski, amino tenninalni metioninski i lizinski ostke, i l i li tag ili fu zionc proteinskc sekvence, u zavisnosti od nacina dobivanja. Kada sc izraz \"biološki aktivan\" koristi u vezi Ang-2 ili Ang-2 specificno vezuj uceg agensa odnosi se na peptid i l i polipcptid cija je naj manje jedna vrsta aktivnosti karakteristicna za Ang-2 ili Ang-2 specificno vezujuci agens. Specificno vezujuci agens Ang-2 može imati agonisticku, antagonisticku , ili neutrališucu ili blokin~jucu aktivnost u odnosu na najmanje jednu od aktivnosti Ang-2. I z raz \"specificno vezujuci agens\" odnosi sc na moleku!, poželjno proteinu srodan moleku l, koji se specificno vezuje za Ang-2, njegove varijante i derivate, 00185 B 325 10 15 20 25 30 wo 03/057134 32 PCT/US02!32657 kako je to ovde definisano. Specificno vezujuci agens može biti protein, nukleinska kiselina, ugljeni hidrat, lipi d, ili jedinjenje male molekulske težine koje se preferencijalno vezuje za Ang-2 . U prioritetnoj manifestaciji, specificno vezt~juci agens prema sadašnjem pronalaskujcste peptid ili pcptibodi (pcptidno telo), kao i fragmenti, varijante ili njihovi derivati, samostalni ili u kombinaciji drugim aminokisclinskim sekvencama, što sc dobivaju poznatim tehnikama. Takve tehnike ukljucuju . ali nisu ogranicene na, cnzimatska raskidanja, hcmijska raskidanja, peptidnu sintezu ili rekombinantne tehnike. Anti-Ang-2 specificno vezujuci agensi sadašnjeg pronalaska sposobni su da sc vezuju za delove Ang-2 koji modulišu, na pr. , inhihiraju, ili potpomažu, biološku aktivnost i\ g-2 i l ili neku od drugih Ang-2 akti v nosti. Izraz \"varijante\", kako se ovde koristi, ukljucuje one peptide i polipeptidc gde su aminokiselinski ostaci insertovani, obrisani i l ili supstituisani u prirodnu (ili bar u poznatu) aminokiselinsku sekvencu u vezujuci agens. Varijante sadašnjeg pronalaska ukljucuju fuzione proteine kako je dole opisano . \"Derivati\" ukljucuju one vezujuce agense koji su hcmijski modifikovani na bilo koji nacin koji je razlicit od insercionih, obrisanih ili suptitucionih varijanti . \"Specificno se vezuje za Ang-2\" odnosi se na sposobnost specificno vezuj uceg agensa (kao što je peptibodi, ili njegov peptidni cleo) sadašnjeg pronalaska da prepozna i da se veže za maturisani, humani Ang-2 polipeptid pune ili parcijalne dužine, ili je njegov ortolog, kao što je njegov afinitet (odreden pomocu Affinity ELISA ili BIAcore ovde opisanim testovima) ili njegovom neutralizacioom sposobnošcu (odredenom na pr., ELISA neutralizacionim testom ovde opisanim, ili s licnim testovima) od najmanje 1 O puta yecom , ali opciono 50 puta vecom, l OO, 250 ili 500 puta vecom ili cak najmanje 1 000 puta vecom od afiniteta i li neutralizacione sposobnosti iste od bilo kog drugog angiopoictina ili drugog pcptida ili polipeptida, gde je peptidni deo peptibodi prvo fuzionisan za humani Fc deo radi evaluacije takvim testom. Izraz \"cpitop\" odnosi se na deo bi lo kog molekula koji može biti prepoznat i vezan specificno vczujucim agensom, na pr. , peptibodi, na jednom ili više antigen vezujucih regiona vezujuceg agensa. Epitopi se obicno sastoje od hemijski aktivnih provršinskih grupacija molekula, kao što su na primer, aminokiseline, sporedni 00185 B 335 10 15 20 25 30 WO 03/057134 33 l>CT/US02i32657 nizovi ugljenih hidrata, i imaju specificne trodimenzionalne strukturalne karakteristike kao i specificne karakteristike naelektrisanja. Epitopi koji se ovde koriste mogu biti sused ni i li ne. Izraz \"inhibirajuci i l ili neutralizujLLCi epitop\" je epitop koji, kada je vezan za specificno vezujuci agens kao što je pcptibodi, prouzrokuje gubitak (ili bar smanjenje) biološke aktivnosti molekula, celije, ili organizma koji sadrži takav epitop, in viva. in vitro. ili in situ. U kontekstu sadašnjeg pronalaska, neutralizujuci epitop sc nalazi na, ili je povezan sa, biološki aktivnim regionom Ang-2. Altcmativno, izraz \"aktivirajuci epitop\" je epitop koji kada je vezan za specificno vezujuci agens sadašnjeg pronalaska, kao što je antitclo, prouzrokuje aktivaciju, ili najmanje zadržavanje biološki aktivne konfom1acijc Ang-2. Izraz \"peptibodi fragment\" odnosi se na peptid ili polipcptid koji ukljucuje manje od kompletnog, netaknutog peptidnog tela (peptibodi). Izraz \"prirodni\" kada se koristi u vezi biološkog materijala kao što su molekuli nuklcinskih kiselina, polipeptidi, celije domacini, i s licno, odnosi se na one koji sc nalaze u prirodi i nisu modifikovani od strane ljudi. Izraz \"izolovani\" kada se koristi u vezi Ang-2 ili u vezi specificno vezujuceg agensa Ang-2, odnosi se najedinjenje kome je uklonjen najmanje jedan kontaminirajuci polipeptid ili jedinjcnje koje se nalazi u prirodi, i poželjno suštinski ocišceno od drugih kontaminirajucih polipeptida sisara koji bi mogli da ometaju njegovu terapeutsku ili dijagnosticku upotrebu. Izraz \"zreli'' kada se koristi u vezi Ang-2 peptibodi ili njegovog fragmenta, ili bilo kog specificno proteinu srodnog vezujucem agensu /\ g-2 odnosi se na peptid ili polipetid kome nedostaje sekvenca vodilja ili signalna sekvenca. Kada se vezujuci agens sadašnjeg pronalaska ekspresuje, na primer, u prokariotskim celijama domacina, \"zreli\" pcptid ili polipeptid mogu takode ukljucivati dodatne aminokisclinske ostatke (ali njima još uvek nedostaje sekvenca vodilja) kao što su amino tcnninalni metionin, ili jedan ili više metioninskih ili lizinskih ostataka. Na ovakav nacin dobijeni peptid ili polipeptid može se koristiti sa ili bez navedenih i uklonjcnih dodatnih aminokiselinskih ostataka. 17xazi \"efektivna kolicina\" i\" terapeutski efektivna kolicina\" kada se koriste u vezi sa specificno vezujucim agensom Ang-2 odnosi se na kolicinu specificno vezuj uceg agensa koja je korisna ili neophodna za podržavanje primetne promene 00185 B 345 10 15 20 25 30 wo 03/057134 34 PCT/lJS02i32657 na nivou jedne ili više od bioloških aktivnosti Ang-2. Promena može biti povectmje ili smanjenje nivoa aktivnosti Ang-2. Poželjno je daje navedena promena smanjenje ativnosti Ang-2. l1.raz \"peptibodi\" odnosi se na molckul koji ukljucuje Fc domen antitela vezan za najmanje jedan peptid. Proizvodnja peptibodi je uopšteno opisana u PCT publikacqi WO 00/24782, objavljene 4. maja, 2000. 1/.raz \"varijante,\" kako se ovde koristi, ukljucuje one molekule kao što su peptidi i l i kombinacije pep ti d- nosac kao što su peptibodi sadašnjeg pronalaska gde su aminokisclinski ostaci insertovani u, obrisani iz, i l ili surstituisani, aminokisclinsku sekvencu molekula. Varijante koje imaju jednu ili više insertovanih aminokiselina ukljucuju fuzione protcine kako je dole opisano . \"Derivati\" ukljucuje one peptide i ! ili kombinacije peptid - nosac kao što su pertibodi koji su hemijski modifikovani na nacin koji se razlikuje od insercionib, obrisanih ili susptitucionih varijanti. lraz \"fragment\" odnosi se na peptid ili kombinaciju peptid- nosac koja ukljucuje sekvencu manju od pune aminokiselinske sekvence takvih peptida i l ili kombinacija peptid -nosac. Takvi fragmenti mogu nastati, na primer, skracivanjem amino tcrminusa, skracivanjem karboksi terminusa i l ili internom dcletacijom ostatka (ostataka) aminokiselinske sekvence peptida ili kombinacije pep ti d- nosac. Fragmenti sc mogu dobiti altcmativnim RNK splajsovanjem ili iz in vivo ili in vitro aktivnosti proteaze. Takvi fragmenti se mogu konstruisati i koristeci hemijske sinteze pcptida, ili modifikovanjem poli nukleotida kojim se enkodira peptid, kombinaciju peptid · · nosac, ili Fc deo i l ili peptidni deo peptibodi. lzraz\" Fc\" odnosi se na jedan tip nosaca sadaš11jeg pronalaska, i ukljucuje sekvencu ne-antigcn-vezujuccg fragmenta antitela nastalog proteolitickom digestijom celog antitela, bez obzira na to da li je u monomernom ili multimemom obliku. Poželjno je da je izvor Fc u sadašnjem pronalasku potpuno humani Fc, i može hiti bilo koji od imunoglobulina, mada su lgGJ i IgG2 oni koji su prioritetni . Medutim, ovde su ukljuceni Fc moleku! i delimicno humanog po rekla, kao i oni koji nisu humanog porek!a. Fc se sastoje od monomemih polipeptida koji mogu biti vezani u dimcme ili multimerne fonne kovalcntnim (tj. , disulfidnim) vezama, kao i nckovalcntnim asocijacijama. Broj intermolekulskih disulfidnih veza izmedu monomernih podjedinica nativnih Fc molekula je od l do 4, u zavisnosti od klase 00185 B 355 10 15 20 25 30 \\VO 031 05 7 134 35 PCT/US02/32657 (na pr., !gG, lgA, IgE) ili podklase (na pr., IgGI , lgG2, lgG3, IgAl, IgGA2). Jedan takav primer nativne Fc je disulfidno vezani dimer nastao papainskom digestijom I gG [videti Ellison et al. (1982), Nu cl. Kiselinus. Res. l 0: 4071-9]. Izraz \"nativni Fc\" kako se ovde koristi je generican monomernim, dimernim i multimernim oblicima. Izraz \"Fc domen\" obuhvata nativni Fc i Fc varijantne molekule i sekvence kako su gore opisani. Kao i kod Fc varijanti i nativnih Fc, izraz \"Fc domen\" ukljucuj~ molekule monomernih ili multimernih oblika, bez obzira da li su . digestovani iz celokupnog antitela ili su dobiveni na neki drugi nacin . Izraz \"multimer\" kada sc primeni na Fc domene ili molekule koji ukljucuju Fc domene odnosi sc na molekule koji imaju dva ili više polipeptidna ni za kovalenlno povezana, nekovalcntno asocirana, ili povezana kovalentnim ili nekovalcntnim interakcijama. IgG molekuli tipicno formiraju dimere; IgM, pentamcrc; IgD, dimere; aIgA, monomcrc, dimere, trimere, ili tetramere. Multimeri mogu nastati korišcenjem sekvence i nastale aktivnosti nativnog lg izvora Fc ili dcrivatizacijom (kako je definisano dole ispod) takvog nativnog Fc. li'.raz \"dimer\" kada se primeni na Fc domene ili molekule koji ukljucuju Fc dornene odnosi se na molekule koji imaju dva polipeptidna niza kovalentno ili nekovalentno vezana. lzraz \"nosac\" odnosi sc na moleku] koji sprecava degradaciju i l ili povecava polu-život, redukuje toksicnos t , rcdukuje imuni odgO\\·or, ili povecava biološku aktivnost terapeutskog proteina. Primcri nosaca ukljucuju Fc domen kao i linearni polimer (na pr., polietilen glikol (PEG), poli lizin, dekstran itd.); polimer racvastog niza (videti na primer, U.S. patent br. 4,289,872, lknkenwalter et al, izdat 15 . septembra 1981. ; U. S. patent br. 5,229,490, Tam , izdat20.jula 1993 .; WO 93/21259, Frechet et al.. objavljen 28 . oktobra 1993.); lipid, holesterolska grupa (steroid); ugljeni hidrat ili oligosaharid; ili bilo koji prirodni ili sinteticki protein, polipeptid ili peptid koji se vezuje za receptor. Nosaci su dalje opisani dole. Izraz \"dcrivatizacija\" i \"derivat\" ili \"derivali.zovan\" ukljucuje procese i nastala jcdinjenja pri cemu (l) jedinjenje ima ciklicni deo; na primer, ukršten o povezivanje preko cisteinil ostataka u okviru jedinjenja; (2) jedinjenje je ukršteno povezano ili ima ukršteno povezana mesta; na primer, jcdinjenj e ima cisteinil 00185 B 365 10 15 20 25 30 wo 03/057134 36 PCT/US02!32657 ostatak tako formirajuci ukršteno povezane dimere u kulturi ili in vivo; (3) jedna ili više peptdil veza je zamenjena ne-peptidil vezama; (4) N-tcm1inus je zamenjen sa -NRRl, NRC(O)Rl, -NRC(O)OR l, -NRS(0)2R1, -NH C(O)NHR, a sukcinirnidnom grupom, ili supstituisanom ili nesupstituisanom benziloksikarbonii-NH-, pri cemu suR i Rl supstituenti na prstenu definisani dole; (5) C-tem1inus je zamenjen sa -C(O)R2 ili -NR3R4 pri cemu su R2, R3 and R4 definisani dole; i (6) jedinjenja kod kojih su pojedinacne aminokiselinske grupe modifikovane delovanjem agenasa sposobnih da reaguju sa odabranim sporednim nizovima ili terminalnim ostacima. Derivati su dalje opisani dole. lzraz \"peptid\" odnosi sc na molekule koj i sadrže 3 do oko 75 aminokiselina, sa prioritetnim molekulima od 5 do 50 aminokiselina, prioritetnijim sa 8 do 40 aminokiselina, a naj prioritetniji su oni što sadrže l O do 25 aminokiselina. Peptidi mogu imati prirodnu ili veštacku (tj., onu koja se ne nalazi u prirodi) aminokiselinsku sekvencu. Egzemplarni peptidi mogu se gcncrisati bilo kojim od ovde datih postupka, kao onim iz peptidne biblioteke (na pr., biblioteka fagi), generisanjem hemijskom sintezom, dobijenih digestijom proteina, ili generisanih pomocu rckombinantnih DNK tehnika. Izraz \"farmakološki aktivan\" oznacava da tako opisana supstanca ima aktivnost koja utice na medicinske parametre (na pr. , krvni pritisak, broj krvnih celija, nivo holesterola) ili stanje bolesti (na pr., rak, autoimuna oboljenja, itd.). laazi \"antagonistick i peptid\" ili \"inhibitorski peptid\" odnose se na peptid koji blokira ili na neki nacin ometa biološku aktivnost posmatranog asociranog proteina, ili ima biološku aktivnost koja se može uporediti sa onom poznatog antagonista ili inhibitora posmatranog asociranog proteina. Tako izraz\" Ang-2- antagonisticki peptid\" ukljucuje peptide koji se mogu identifikovati, ili dovesti u vezu sa, kao da imaju Ang-2 antagonisticke karakteristike. Dodatno tome, fiziološke prihvatljive soli jedinjenja sadašnjeg pronalaska su ovde takode obuhvacene . Izrazom \"fiziološki prihvatljive soli\" obuhvacene su bilo koje roznate soli, ili one za koje ce kasnije biti utvrdeno da su fiziološki prihvat lj i vc. Neki specificni prim eri su: acetat; tritluoroacetat; hidrohalogenidi, kao što su hidrohlorid i hidrobromid; sulfat; citrat; tartarat; glikoholat; i oksalat, mezilat i fosfat. 00185 B 375 10 15 20 25 30 WO 03/057134 37 PCT/US02/32657 Peptibocli J edan aspekt sadašnjeg pronalaska odnosi se na razvoj Ang-2 peptibodi. Cesto do interakcije proteinskog liganda sa svojim receptorom dolazi na relativno velikoj površini . Medutim , kako je pokazano za humani hormon rasta i njegov recepto r. samo nekoliko kljucnih ostataka na medufazi najvi še doprinosi energiji vezivanja. Clackson el al, Science 267: 383-6 (1995). Najveci deo proteinskog liganda ,iedva da iskazuje vezujuce epitope u ispravnoj topologiji ili ima funkciju koja nije povezana sa funkcijom vezivanja. Tako se molekuli samo \"peptidnc\" dužine (obicno 2 do 40 aminokiselina) mogu vezati za receptor proteina datog velikog proteinskog liganda. Takvi peptidi mogu podražavati bioaktivnost velikog protcinskog liganda (\"peptidni agonisti\") ili , kroz kompetitivna vezivanje, inhibirati bioaktivnost velikog proteinskog liganda (\"peptidni antagonisti\"). Displej tehnologija fagi pojavila se kao važna metoda idcntifikovanja takvih pepticlnih agonista i antagonista. Videti, na primer, Scott et al. .')cience 249: 386 (l990) ; Dev lin et al., Science 249: 404 ( 1990); U.S . patent br. 5,223,409, izdat 29. juna, 1993 .; U.S . patent br. 5,733,73 1, izdat 31. marta, 1998.; U.S. patent br. 5,498,530, izdat 12. marta, 1996.; U.S. patent br. 5,432,018, izdat ll. julal995.; U.S . patent br. 5,338,665, izdat 16. avgusta 1994. ; U.S. patent br. 5,922,545, izdat 13 . jula 1999.; WO 96/40987, objavljen 19. decembra 19% ; i WO 98/15833, objavljen 16. aprila 1998 . (svi su ovde inkorporisani kao reference). Kod peptidnih fagi di spl ej biblioteka, nasumicne peptidne sekvence mogu se izložiti fuzijom sa pokrovnim proteinima filamentinih faga. Ukoliko se to želi, peptidi na displeju mogu se afinitetno cluirati naspram ekstracelulamog domena receptora imobilisanog antitelom. Zadržani fag može se obogatiti sukcesivnim afinitetnim precišcavanjem i repropagacijom. Peptidi koji se najviše vezuju mogu biti sekvencionisani radi identifikacije kljucnih ostataka u okviru jedne ili više strukturno povezane familije pcptida Videti, na primer, Cwirla et al., Science 276: 1696-9 ( 1997), gde je prikazana identifikacija dve razlicite familije. Sekvenca peptida može takode sugerisati koji od ostataka može biti slobodno zamenjen alaninskirn skeniranjem ili mutagenezom na nivou DNK. Mutagenetske biblioteke mog u se dobiti i biti analizirane radi dalj e optimizacije sekvence najbolje ve7.1.1jucih molek ula . Lowman, Ann. Rev. Biophys. Biomol. Struci. 26: 401-24 (1997). Strukturna analiza interakcije protein - protein može sc takode upotrebiti u 00185 B 385 10 15 20 25 30 WO 03/057134 38 PCT/US02!32657 cilju odredivanja peptida koji podražav<~iu vezujucu aktivnost velikih proteinskih liganada. Pri takvoj analizi, kri stalna struktura može sugerisati identitet i relativnu o rij en tac i.i u kriticnih ostataka velikog proteinskog liganda, na osnovu koga bi se on mogao zamisliti. Videti, na primer, Takasaki et al. , Nature Biotech 15: 1266-70 ( 1997). ()vi analiticki postupci se mogu lakode upotrebiti radi istraživanja interakcija izmedu receptorskog proteina i peptida odabranih na osnovu fagi displej postupka. što može sugerisati dalje modifikacije pepticla u cilju povecanja afiniteta VeZ! V all_] Cl. Drugi postupci su konkurentni sa fagi displej postupkom u polju istraživanja peptida. Peptidna biblioteka se može fuzionisati za karboksilni terminus (završetak) lac repreS(H-a j ekspresovati u E. coli. Drugi postupak zasnovan na E. coli omogucava displej na celijskoj spoljnoj membrani fuzijom sa lipoproteinom asociranim sa pcptidoglikanom (P AL). U kasnijem tekstu ove i slicne metode nazivaju se zajednickim imenom \"E. coli displej.\" Jednim drugim postupkom , translacija nasumicne RNK se zaustavlja pre oslobadanja ribozoma, što rezultuje bibliotekom polipeptida sa svojim još uvek vezanom asociranom RNK. U kasnijem tekstu ove i slicne metode naziv~ju se zajednickim imenom \"ribozomski displej.\" Druge metode koriste hemijsku vezu peptida za RNK. Videti, na primer, Roberts i Szostak, f>roc Na rl A cad Sci USA, 94: 12297-303 (1997). U kasnijem tekstu ove i slicne metode nazivaju se zajednickim imenom \"RNK peptidni skrining.\" Razvijene su hcmijski izvedene peptidnc biblioteke gde su pcptidi imobilizovani na stabilnim. ne-biološkim materijalima, kao što su polietilenske šipke ili za rastvarac propustlj ive smole. Jedna dmga hemijski izvedena peptidna biblioteka koristi se fotolitogratijom da bi sc skenirali peptidi imobilisani na staklenim slajdovima. U kasnijem tekstu ove i slicne metode nazivaju se z~jednickim imenom \"hemijski peptid skrining.\" Postupak- hemijski peptid skrining- može biti koristan iz razloga što je njime omogucena upotreba D-aminokiselina, i drugih analoga koji se ne nalaze ll prirodi, kao i ne-peptidnih elemenata. Pregled bioloških i hemijskih postupaka dat je ll Wells i Lowman, Curr. Opin. Biotechnol, 3:355-62 (1992). Konceptualno, mogu se otkriti peptidni mimetici bilo kog proteina upotrebljavajuci fagi displej i druge gore opisane postupke. Ovi postupci korišceni su za mapiranje epitopa, za identifikaciju kriticnih aminokiselina u interakcijama protein - protein, i kao vodilje za otkrivanje novih terapeutskih agenasa. Videti na 00185 B 395 10 15 20 25 wo 03/057134 39 PCTIUS02/32657 pr., Cortcseetal. , Curr. Opin Biotech. 7:616-21 (1996). Danas sepcptidne biblioteke najcešce koriste za imunološka istraži vanja, kao što je mapiranje cpitopa. Videti Krccger, The Scientist l 0(13): 19-20(1996 ). Pcptidi identifikovani skriningom pomocu fagi displej biblioteke radije se smatraju vodiljama (engl., leads) prilikom razvijanja terapeutskih agenasa, nego što su sami terapeutski agensi. Kao i drugi proteini i peptidi, oni bi sc mogli lako i brzo ukloniti in viva filtracijom u bubregu, celularnim mehanizmom precišcavanja u retikulucndotelialnom sistemu ili proteolitickom degradacijom [Praneis, (supra) f. Kao rezultat toga, u oblasti se sada koriste pcptidi u c iUu validacije cilja nekog lcka, ili kao pomocno sredstvo prilikom osmišljavanja (dizajniranja) organskih jedinjenja do kojih se ne bi lako došlo, ili koja ne bi bila tako brzo identifikovana, skriningom hemijske biblioteke [Lowman, (supra); Kay et al. (supra)]. Korisno bi bilo za oblast od procesa kojim bi takvi peptidi u vecem prinosu davali terapeuske agense za lecenje angiogencze. Struktura peptibodi U nmnaceutskim oblicima supstance dobijene u skladu sa sadašnjim pronalaskom peptid se može vezati za nosac preko peptidnog N - terminusa ili C - terminusn. Tako se molekuli nosac- peptid sadašnjeg pronalaska mogu opisati pomocu s ledecih pet formula i njihovim multimerirna: (X,L-F,-(Xz)b (FORMULA I) x,-F, (FORMULA IT) F ,-X z (FORMULA III) F l-(L,)cP, (FORMULA IV) F ,-(T., )c-P I-(L2)d -P2 (FORMULA V) pri cemu : F 1 predstavlja nosac (poželj no Fc domen): svaki X 1 i X 2 su nezavisno odabrani od -O~J )cP,, -(L,)c-P,-(L2)d P2 , -(L ,),-PdL2kP2-(L3)c-PJ, i -(L, )c-P, -(L2)d-PdL3)c-P3-(L4),~P4 svaki P~, P 2 , P 3 , i P 4 predstavlj a nezavisne sekvence farmakološki aktivnih 00185 B 405 10 15 20 25 30 wo 03/057134 40 PCT/US02i32G5 7 peptida kako su ovde opisani; svaki L 1 , L 2 , L 3 , i L 4 predstavlja nezavisne linkerc; a svaki \"a\" , \"b\", \"e\", \"d\", \"e\", i''.('' nezavisno predstavljaju O ili l, uz uslov da je najmanje jedan od \"a\" i \"b\" jeste l. Peptidi Sadašnji pronalazak obuhvata peptide koji se selektivno vezuju ili specificno vezuju za Ang-2. Bilo koji broj takvih pepticla sc može upotrebiti u skladu sa sadašnjim pronalaskom. Fagi displej je posebno koristan za generisanje pcptida La potrebe sadašnjeg pronalaska. iz razloga što je pokazano da se afinitctna selekcija iz biblioteka nasumicnih peptida može upotrebiti za identifikaciju peptidnih liganada na bilo kom mestu bilo kog genskog proizvoda. Dedman et al., J. Bio!. Client. 268: 23025-30 (1993). Pcptidi sadašnjeg pronalaska se mogu dobiti bilo kojim postupkom koji je otkriven u oblasti. Upotrebljavaju je jednoslovne skracenice aminokiselina. Oznaka \"X\" u bilo kojoj sekvenci (i kroz celokupnu specifikaciju, osim ukoliko se drugacijc ne specificira u nekom trenutku) oznacava da može biti prisutan bilo koji od 20 prirodnih aminokiselinskih ostataka, ili bilo koja aminokiselina koja sc na nal<17i u prirodi (opisane dole pod naslovom\"Varijante\"). Bilo koji od ovih peptida može biti vezan u nizu (tj. , sekvencijalno), sa ili be/. linkcra, aprimcri u nizu vc7.anih primera dati su u tabeli. Linkeri su navedeni kao \"L\" mogu predstavljati bilo koji od onih ovde opisanih. YeD1ni niz sc ponavlja i, radi jasnosti. linkeri su prikazani odvojeni crticama. Bilo koji peptid koji sadrži cisteinil ostatak može biti ukršteno povezan sa drugim peptidom koji sadrži Cys, a bilo koji od njih, ili oba mogu biti vezani za nosac. Bilo koji peptid što sadrži više od jednog Cys ostatka može graditi i intrapeptidnu disulfidnu vezu. Bilo koj i od navedenih peptida može se derivatiwvati, kako je ovde to opisano . Kod derivata gde karboksilni završetak može biti zatvoren amino grupom, ta grupa jeste -NH 2. Kod derivata gde su aminokiselinski ostaci supstituisane grupe supstitucije se oznacavaju sa S, što oznacava bilo koju funkcionalnost opisanu u Bhatnagar et al , J. Med, Chem. 39: 3814-9 (19%), i Cuthbcrtson et al. , J. Med. Chem. 40: 2876-82 (1997), koje su ovde date kao reference. Svi peptidi su povezani peptidnim vezama, osim ukoliko to nije drugacije navedeno. 00185 B 415 10 15 20 25 30 wo 03/057134 41 PC:T/US021:>2657 Nosaci l ; jednom svom aspektu, sadašnji pronalazak omogucava da najmanje jedan pep ti d bude vezan za za najmanje jedan nosac (F 1 • F2) preko N- tem1inusa (završetka), C-terminusa ili bocnog niza nekog aminokiselinskog ostatka jednog ili više peptida. Mogu se koristiti i multipli nosaci ; na pr., Fc na svakom terminusu ili Fc na tenninusu iPEG grupa na drugom lerminusu ili bocnom nizu. Fc domen je poželjni nosac . Fc domen se može vezati za N ili C terminuse peptida i l i za oba, N i C termin use. Kako je gore napomenuto, Fc varijante su pogodni nosaci u okviru dometa sadašnjeg pronalaska. Nativni Fc može se znacajno modifikovati da bi se dobile Fc varijante u skladu sa sadašnjim pronalaskom, uz uslov da je zadržano vezivanje za receptor spasioc. Videti na primer, WO 97/34631 i WO 96/32478. Iz takvih Fc varijanti, može se ukloniti jedan ili više položaja iz nativne Fc. a koji doprinose strukturnim karakteristikama ili funkcionalnoj aktivnosti koja nije neophodna, fuzijom molekula sadašnjeg pronalaska. Ovi položaji mogu se ukloniti, na primer. supstitucijom ili deletacijom (brisanjem) ostataka, insertovanjem ostataka u dati položaj , ili skracivanjem delova gde se nalazi dati položaj. Insertovani ili supstituisani ostaci mogu takode sadržavati izmenjene aminokiseline, kao što su peptidomimetici ili D-aminokiseline. Fc varijante su poželjne iz nekoliko razloga, od kojih su neke date dole. Primeri Fc varijanti ukljucuju molekule i sekvence u kojima: l . Uklanjaju se položaji sa kojima se formir~ju disulfidne veze. Takvim uklanjanjem mogu se izbeci reakcije sa drugim proteinima koji sadrže cistein u celijama domacinima a koje služe za dobivanje molekula sadašnjeg pronalaska. U ovu svrhu. segment koji sadrži cistein na N-terminusu može se skratiti ili se cisteinski ostaci mogu obrisati ili susptituisati drugim aminokiselinama (na pr., alaniL ili seril) . Cak i kada se cisteinski ostaci uklone, pojedinacni nizovi Fc domenajoš uvek mogu formirati dimernc Fc domene koji se drže zajedno nekovallnim vezama. 2. Nativna Fc se modifikuje da bi bila kompatibilnija sa odabranom celijom domacinom . Na primer, može sc ukloniti PA sekvenca blizu N-terminusa tipicne nativne Fc, koji se može prepoznati digestivnim enzimom iz E. coli kao što je prolin iminopeptidaza. Takode se može dodati N-tcnninalni metioni.l ostatak, 00185 B 425 10 15 20 25 30 wo 03/057134 42 PCT/US02i32657 posebno kada se moleku! rekombinantno ekspresujc u bakterijskoj (E. coli) celiji . ~ - Uklanja sc deo N-terminusa nativne Fc da bi se spreci la N-terminalna heterogenost prilikom ekspresije u odabranoj celiji domacinu . U tu svrhu, može se obrisati bilo koji od prvih 20 aminokisclinskih ostataka na N-terminusu, posebno oni iz pnložaja l , 2, 3,4 i 5. 4. :.'v'ložc se ukloniti jedan ili više položaja u kojima sc vrši glikozilovanje. Ostaci koji se tipicno glikoziluju (na pr. , asparaginski) mogu dati citoliticki odgovor. Takvi ostaci se mogu obrisati ili supstituisati neglikozilovanim ostacima (na pr. alaninskim). S. Uklanjaju se položaji koji stup<~ u u interakcije sa komplementom, kao što je vezi v ni položaj Cl q. Na primer, može se obrisati ili supstituisati EKK sekvenca humanog !gG l. Dodavanje komplementa može biti da nije od koristi za molekule sadašnjeg pronala.'lka, te se na taj nacin izbegavaju takve Fc varUante. (l . Uklanjaju se položaji koji uticu na vezivanje za fc receptore a koji ne predstavljaju receptor spasioc. Nativna Fc može posedovati položaje za interakciju sa odrec1enim belim krvnim celijama a koji nisu neophodni molekulima koji se vezuju , tako da se oni mogu ukloniti . 7. Uklanja se ADCC položaj . ADCC položaji su poznati u oblasti. U vezi ADC:C položaja kod I gG l, videti na primer, Mol ec. Immuno/. 29 (5):633-9 (1992). Ni ovi položaji nisu potrebni fuzionim molekulima sadašnjeg pronalaska i mogu se ukloniti . 8. Kada se nativna Fc dobije iz antitela koje nije humanog porekla, nativna Fc sc mo7.e humanizovati. U cilju humanizacije nativne Fc tipicno se supstituišu odabrani ostaci, nativne Fc koja nije humanog porekta, ostacima koji se normalno nalaze u humanoj nati vnoj Fc. Tehnike koje se koriste za humanizaciju antitela su dobro poznate onima obucenim u oblasti . i\\lternalivni nosac može biti protein, polipeptid, peptid, antitelo, fragment antitela, ili mali moleku! (na pr., peptidomimeticko jedinjenje) sposoban da se veže za receptor spasioc. Na primer, kao nosac bi se mogao upotrebiti polipeptid opisan u Presta ct al., U.S. patent br. 5,739,277, izdat 14. aprila 1998. Peptidi se mogu takode odabrati pomocu fagi displej za vezivanje za FeRn receptor spasioc. Takva jedinjcn.ia koja se vezuju za rcceptor spasioc takode su ukljucena u termin \"nosac\" spadaju u oblast sadašnjeg pronalaska. Takvi nosaci bi trebalo da se od.abiraju radi 00185 B 435 10 15 20 25 30 wo 03/05 7134 43 PCT/US02/32657 produženog poluživota (na pr., izbegavanjem sekvenci koje prepoznaju proteaze) i smanjenom imunogenicnošcu (na pr. , f~1vorizovanjem nc-imununogenskih sekvenci_ kako je to otkriveno kod humanizacije antitela). Kako je gore naglašeno, polimerni nosaci se mogu takode upotrebiti za F 1 i F 2 . Sada su raspoloživi razliciti postupci za vezivanje hemijskih grupa kao nosaca, videti na pr., Patent Cooperation Treaty \"PCT\" Intemational Publication br. WO %/1 195:1. pod naslovom \"N-Terminally Chemically Modified Protein Compositions and Methods,\" ovde navedene kao reference ll svoj svojoj celokupnosti. U ovoj PCT publikaciji otkriva sc. izmedu ostalog, postupak selektivnog vezivanja u vodi rastvorni h polimera za N-tcm1inus proteina. Prioritetni polimer je polietilen glikol (PEC )_ Grupa PEG može biti bilo koje prihvatljive molekulske težine i može biti linearna ili racvasta. Prosecna moleku iska težina PEO prioritetno je u opsegu od oko 2 ki loDaltona (\"kDa\") do oko 100 kDa, prioritetnije od oko 5 kDa do oko 50 kDa, najprioritetnije od oko 5 kDa do oko l O kDa. Grupe PEO se obicno vezuju za jedinjenja sadašnjeg pronalaska acilovanjem ili reduktivnim alkilovanjem reaktivnih grupa na PEG funkcionalnostima (na pr., aldehidna, amino, tiolna ili cstarska grupa). Prihvatljiva strategija PEGilovanja sintetickih peptida sastoji se u kombiJJovanju, stvaranjem konjugovanih veza u rastvoru, pcptida i PEG grupa od kojih S\\,aki sadr7.i posebnu, medusobno rcaktivnu, funkcionalnost. Peptidi se lako mogu dobiti koristeci konvencionalnu sintezu na cvrstoj fazi, što je poznato u oblasti. Specificni položaj peptida se prethodno aktivira odgovarajucom funkcionalnom grupom. Prekursori se preciste i potpuno okrarakterišu pre reakcije sa PEG grupom. Ligacija peptida sa PEO obicno se vrši u vodenoj fazi i može sc lako pratiti reversno faznom ana litickom HPLC. PEGilovani peptidi se lako precišcavaju prcparativnom HPLC i karakterišu analitickom HPLC, analizom aminokiselina i lasersko desorpcionom masenom spcktrometrijom. Polisaharidni polimeri predstavljaju drugi tip u vodi rastvomih polimera koji se mogu koristiti za modifikaciju proteina. Dekstrani su polisaharidni polimeri koji se sastoje od pojedinacnih podjedinica glukoze uglavnom vezanih pomocu al- 6-veza. SCJm dekstran je raspoloživ u opsegu veceg broja molekulskih težina, a dekstran nwlckulskih težina od ok l kDa do oko 70 kDa je lako pristupacan. Dekstran je pogodan u vodi rastvorni polimer, koji se sam koristi u sadašnjem 00185 B 445 10 15 20 25 30 wo 03!057134 44 PCT/US02/3 2657 pronalasku kao nosac , ili u kombinaciji sa nekim drugim nosacem (na pr., Fc). Videti, na primer, WO 96/11953 and WO 96/05309. Objavljena je upotreba dekstrana konjugovanog za terapeutske ili dijagnosticke imunoglobuline, videti na primer, European Patent Publication br. O 315 456, koja je ovde inkorporisana kao referenca . Dekstran molekulske težine od oko l kDa do oko 20 k Da je prioritctan, kada se dekstran koristi kao nosac u skladu sa sadašnjim pronalaskom . Linker·i Ope iona je bilo koja grupa \"lin kera\" . Kada je prisutna. hemijska struktura ]inkera nij e od kriticne važnosti jer prwnstveno sl uži kao spej sc r. Poželjno je da sc linker sastoji od aminokiselina medusobno povezanih peptidnim vezama. Tako, u prioritetnim manifestacijama linker sacinjavaju oci 1 do 20 aminokiselina povezane peptidnirn vezama, pri cemu su aminokiseline odabrane od 20 prirodnih aminokiselina. Jedna ili više od ovih aminokiselina se mogu glikozilovati, što je vrlo poznato onima obucenim u oblasti. U prioritctnijim manifestacijama l do 20 aminokiselina su odabrane od glicina, alanina, prolina, asparagina, glutamina, i lizina. Još više prioritetno, linker se sastoji najvecim delom od aminokiselina koje nisu sterno zašticene. kao što su glicin i alanin. Tak.o su prioritetni linkeri poliglicini (posebno (Gly) 5 , (Gly)s), poly(Giy-Ala) i polialanini. Kombinacije Gly i Ala su takode priuritetnc, kao što ima linker na koji sc ovde pozivamo kao Kl i ima aminokise linsku sekvencu navedenu u ovde datim Primerima. l'vloguci su i linkeri koji nisu peptidi. Na primer, mogu se upotrebiti alkil linkeri kao što je NH-(CH2)s-C(O)-, pri cemu s = 2-20. Ovi alkillinkeri sc mogu daUe supstituisati bilo kojom grupom koja nije stcrno zahtevna, kao što je niža alkil grupa (na pr., C 1 -C(l), niža aci! grupa, halogen (na pr., Cl, Br), CN, NH 2 , fenil grupa, itd. Primer nc-peptidnog !inkera je PEG linker, i on je molekulske težine od l OO do 5000 kDa, prioritetno l OO do 500 kDa. Peptidni link eri se mogu derivatizovati na isti nacin kako je gore opisano. Varijante i derivati Varijante i derivati specificno vczujucih agenasa su ukljuceni unutar polja sadašnjeg pronalaska. Od varijanti ukljucene su insercione, deletacione i supstitueionc varijante. Podrazumeva se da posebni specificno vezujuci agens 00185 B 455 10 15 20 25 30 wo 03 /057134 45 PCTIUS02/32Ci57 sadašnjeg pronalaska može sadržavati jednu, dve ili sve tri vrste varijanti. Insercionc i supstitucione varijante mogu sadržavati prirodne aminokiseline, nekonvencionalne aminokiseline (kako je dole dato), ili ob e vrste. l ; jednom primeru su date insercione varijante pri cemu jedan ili više aminokisclinskih ostataka, prirodnih ili nckonvencionalnih aminokiselina, dopunjava amink.iselinsku sekvencu pcptida ili peptibodi . lnsertovani delovi sc mogu nalazi ti na bilo kom ili oba terminusa proteina, ili se mogu nalaziti unutar unutrašnjih oblasti aminokisclinske sekvence pep ti bodi. lnscrcionc varijante sa dodatnim ostacima na bilo kom ili oba lerminusa mogu ukljucivati, na primer, fuzione proteine i proteine koji ukUucuju obeležavanja aminokiselinama. Insercione varijante ukljucuju pcptide i peptibodi pri cemu sc jedan ili više aminokiselinskih ostataka dodaje aminokiselinskoj sekvenci peptida ili peptibodi, ili njihovom fragmentu. Varijantni proizvodi sadašnjeg pronalaska ukljucuju i maturisanc peptide ili peptibodi gde su sekvenca vodilja ili signalna sekvenca uklonjene, a dobiveni protcini imaju dodatne aminokiselinskc ostatke koji se sastoje od prirodnih aminokiselina ili onih koje to nisu. Zamišljeni su specificno vezujuci agensi (kakvi su pcptibodi) sa dodatnim metionil ostatkom u aminokiselinskom položaju -l (Mef 1 -peptibudi), kao i specificno vezt0uci agensi sa dodatnim mctioninskim i lizinskirn ostacima u položajima -2 i -l (Mcf 2 -Lys - 1 -). Varijante sa dodatnim Met, Met-Lys, Lys ostacima (il i jednim ili više baznih ostataka) su posebno korisni u svrhu povecane proizvodnje rekombinantnih proteina u bakterijskim celijama domacini ma. Sadašnji pronalazak takode obuhvata varijante specificno vezujucih agenasa sa dodatnim aminokiselinskim ostacima koji nastaju upotrebom specificnih sistema ekspresije. Na primer, upotrebom komercijalno dostupnih vektora kojima se ekspresuje željeni polipcptid kao deo glutation-S-transfcraze (GST) fuzionog proizvoda omogucava dobijanje že ljenog po.lipcptida sa dodatnim glicinskim ostatkom u aminokisclinskom položaju -l posle uklanjanja GST komponente sa željenog polipeptida. Zamišljene su i varijante koje nastaju ekspresijom drugih vektorskih sistema, ukljucujuci one gde su polihistidinski obeleživaci ugradeni u aminokiselinsku sekvencu, obicno na karboksilnom i l ili amino terminusu sekvence. 00185 B 465 10 15 20 25 30 \\VO 03/057 134 46 PCT/US021:\\2657 lnsercionc v arij ante ukljucuju i fuzione proteine gde su amino i l i li karboksilni tenninusi peptida ili peptibodi vezani za drugi polipeptid, njegov fragment ili aminokiseline koje nisu obicno prepoznate kao delovi bilo koje specificne sekvence proteina. Primeri fuzionih proteina su polipeptidi koji se odnose na ili proizvode imuni odgovor, proteini sa dugackim poluživotom cirkulacije, kao što su imunoglobulinski konstantni regioni. marker protcini, protein i i li polipeptidi koji olakšavaju precišcavanje željenog pcptida ili peptibodi, i polipeptidne sekvence koje potpomažu nastajanje multimcrnih proteina (kao što su leucinski ziper motiv, korisni u fmmiranju i za stabilnost climera). Ova vrsta insercionih varijanti obicno se sastoji od, ili sadrži znacajni deo nati vnog molekula vezanog za N- i C-završetke, za celokupni drugi peptid ili za njegov deo . Na primer, fuzioni proteini tipicno koriste sekvence vodilje drugih vrsta da bi se omogucila rekombinantna ekspresija proteina u heterolognom domacinu. Drugi korisni fuzioni protein ukljucuje adiciju imunološki aktivnog domena. kao što je epitop antitela, da bi se olakšalo precišcavanje fuzionog proteina. Ukljucivanje mesta raskida11ia na, ili blizu, mesta fuzije olakšace uklanjanje nevažnog polipeptida posle prccišcavanja. Druge korisne fuzije ukljucuju povezivanje funkcionalnih domena, kakvi su aktivna mesta enzima, domeni glikozilovanja, celijski ciljni signali ili transmcmbranske oblasti . Postoje razliciti komercijalno dostupni ekspresioni sistemi fuzionih proteina koji se mogu koristiti u skladu sa sadašnjim pronalaskom. Posebno korisni sistemi ukljucuju. ali nisu ograniceni na, glutation-S-transfcraza (GST) sistem (Phannacia), maltoza vezujuci proteinski sistem (NEB, Beverley, MA), FLAG sistem (IBl, New Haven, CT), i 6xHis sistem (Qiagen, Chatsworth, CA). Ovi sistemi sposobni su da proizvode rekombinantne peptide i ( ili pcptibodi sa samo malim brojem dodatnih aminokiselina, za koje se ne cini da mogu znacajno uticati na aktivnost peptida ili pcptibodi. Na primer, oba, FLAG sistem i 6xHis sistem dodaju samo kratke sekvence. z. a koje se zna da su slabo antigenicne i koje ne uticu nepovoljno na u vij a nj e po lipetida u svoju nati vnu konformacij u. Osmišljena j e druga N-terminalna fuzija za koju se smatra da je korisna u fuziji Met-Lys dipeptida na N-tenninalnom regionu proteina ili peptida. Takva fuzija može rezultovati povoljnim povecanjem proteinske ekspresije ili aktivnosti. Kada je poželjno da se isece fuzioni partner od željenog peptida ili 00185 B 475 10 15 20 25 30 WO 03/057134 47 PCT/CS02i3 2657 pcptibodi , drugi fuzioni sistemi proizvode polipcptidne hibride. U jednoj manifestaciji , fuzioni partner je vezan za rekombinantni pcptibodi peptidnom sekvencom koja sadrži specificnu sekvencu prepoznavanja proteaze. Primeri pogodnih sekvenci su one koje prepoznaje Tobacco Etch Virus proteaza (Life Technologies, Gaithersburg, MD) ili Factor Xa (New England Biolabs, Beverley, MA). Sadašnji pronalazak takode obezbeduje fuzione polipeptide koji ukljucuju sve ili delove pcptibodi ili peptida sadašnjeg pronalaska, u kombinaciji sa skracenim tkivnim faktorom (tTF). tTF je vaskularni ciljni agens koji se sastoji od skracenog oblika humanog proteina koji indukuje koagulaciju i koji deluje kao agens za zgrušavanje krvi u tumorskim krvnim sudovima, kako je opisano u U.S . patentirna br. : 5,877,289; 6,004,555 ; 6,132,729; 6,132,730; 6,156,321; i Evropskom patentu br. EP 0988056. Fuzija tTF za anti-Ang-2 pcptibodi ili peptid, ili njegov fragment, olakšava isporuku anti-Ang-2 ci ljnim celijama. U drugom aspektu, sadašnji pronalazak obezbeduje delctacione varijante gde su uklonjeni jedan ili više aminokiselinskih ostataka u peptidu ili peptibodi. Deletacijc (brisanja) se mogu izvršiti najednom ili oba terminusa peptibodi, ili uklanjanjem jednog ili više ostataka unutar aminokiselinskc sekvence peptibodi . Deletacione varijante obavezno ukljucuju sve fragmente pcptida ili peptibodi. U još jednom aspektu, sadašnji pronalazak obezbeduje supstitucione varijante peptida ili peptibodi sadašnjeg pronalaska. Supstitucione varijante ukljucuju one peptide i peptibodi gde sujedan ili više aminokiselinskih ostataka uklonj eni ili zamenjeni jednom ili više alternati vnih aminokiselina, a aminokiseline mogu biti prirodne ili one koje se ne nalaze u prirodi . Supstitucione varijante gcncrišu peptide ili peptibodi koji su \"slicni\" originalnom peptidu ili peptibocli , pri cemu dva molekula imaju odreden procenat identicnih aminokiselina. Supstitucione varijante ukljucuju supstitucije l , 2, 3,4, 5, 6, 7. 8, 9, l O, 15 , 20. 25, 30, aminokiselina unutar peptida ili peptibodi, pri cemu broj supstitucija može biti i do deset procenata, ili veci , peptida ili peptibodi. U jednom aspektu. supstitucije su po prirodi umcrene, medutim, sadašnji pronalazak obuhvata i supstitucije koje nisu umerene i koje ukljucuju i nekonvencionalne aminokiseline. Identicnost i slicnost srodnih peptida i peptibodi može se lako izracunati 00185 B 485 10 15 20 25 30 wo 03/0 57 134 48 PCT/US02/3 2Ci57 poznatim metodama. Takvi postupci ukljucuju, ali nisu ograniceni na, one opisane u Cornputational Molecular Biology, Lesk, A. M., cd., Oxford University Press, New York (1988); Biocomputing: Infonnatics and Genome Proj ccts, Smith, D.W., ed ., Academic Press, New York (1993); Computer Analysis ofSequence Data, Part l, Griffin, A.M. , and Griffin, H.G., eds , Humana Press, New Jersey (1994); Sequencc Analysis in Molecular Biology, von 1-ieinje, G ., Academic Press (1987); Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J. , eds., M. Stockton Press, New York (1991 ); i Cari ll o et al. , SLAM.! Applied Mat/1. , 48: l 073 (1988). Ptlželjne metode odredivanja slicnosti ili procenta identicnosti dva peptida ili polipcptida, ili polipeptida i peptida. osmišljene su da daju najveci broj poklapan.ia (match) uporedenih sekvenci. Metode za odredivanje identiteta opisane su u javno dostupnim kompjuterkim programima. Poželjne kompjuterske metode za odredivanje identicnosti dve sekvence ukljucuju , ali nisu ogranicene na, GCG programski paket. ukljucujuci GAP (Dcvereux el al., Nucl. Kiselinu. Res., 12:387 (1984); Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, Wl, BLASTP, BLASTN, and FAST A (Altschul et al. J. Mol. BioL, 215:403-410 ( 1990)). BLASTX program je javno dostupan od National Center for Bioteclmology lnfom1ation (NCBI) i drugih izvora (BLAST Manual, Altschul et al. NCB l NLM l NIH Bethcsda, MD 20894; Altschul et al .. supra (1990)). Dobro poznati Smith Watennan algoritam se takode može upotrebiti za odredivanje identicnosti. Neke sheme poklapanja dve sekvence am inokiselina mogu rezultovati poklapanjem dve sekvence u samo malom obimu, i ta mala poklopljena oblast može imati vrlo visoku identicnost sekvenci iako ne posto. ii znacajna povezanost izmedu pune dužine dve date sekvence. Shodno torne, u nekim manifestacijama, odabrani metod za odredivanje poklapanja (GAP program) dace poklapanje u rasponu od deset procenata pune dužine ciljanog poli peti da koji se u poreduje , tj ., najmanje 40 susednih aminokiselina u slucaju gde se uporeduju sekvence od najmanje 400 aminokiselina, 30 susednih aminokiselina u slucaju gde se uporeduju sekvence od najmanje 300 do oko 400 aminokiselina, najmanje 20 sused ni h aminokiselina u slucaju gde se uporeduju sekvence od najmanje 200 do oko 300 aminokiselina, i najmanje l O susednih aminokiselina u slucaju gde se uporeduju sekvence od najmanje l OO do 200 aminokiselina. 00185 B 495 10 15 20 25 30 'vVO 03/05 7134 49 PCT/US02/32657 Na primer, upotrebom kompjuterskog algoritma GAP (Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, WI), dva polipeptida, ciji sc procenat identicnosti sekvence odredt~je, se poredc u cilju optimalnog poklapaoja njihovih odgovar<~iucih aminokiselina (\"raspon poklapanja\", što je odredeno algoritmom). U nekim manifestacijama, zajedno sa algoritmom koristi sc i hendikep praznine otvaranja (koji se tipicno izracunava kao 3X prosecne dijagonale, \"prosccna dijagonala\" je prosek dijagonale upotrebljene matrice za porl':denje; \"dijagonala\" je mnoštvo ili broj pripisan svakom savršenom aminokiselinskom poklapanju datom matricom za porcdeqje), hendikep praznine produženja (koji je obicno 1 / 1 O hendikepa praznine otvaranja), kao i matrice za poredenje kao što su PAM 250 ili BLOSUM 62. lJ nekim manifestacijama, algoritam koristi i standardnu matricu za po redenje (videti Dayhoff et al. , Atlas of Protein Sequence and Structure, 5(3) (1978) za PAM 250 matricu poredenja; Henikoff ct al., Proe. Nat/. Acad. Sci USA, g e): l 0915- J 0919 (1992) za BLOSUM 62 matricu poredenja). U nekim manifestacijama parametri za uporedenje polipeptidnih sekvenci ukljucuju sledece: algoritam : Needleman et al., J Mol Bioi, 48:443-453 (1970); matrica za uporedenje : B LO SUM 62 od Hcnikotr et al. , supra ( 1992); hendikep praznine: 12 hendikep praznine dužine: 4 prag slicnosti: O Program ClAP može biti koristan uz upotrebu gore datih parametara. U nekim manifestacijama gore pomenuti parametri su zadati parametri za uporcdenja polipeptida (zajedno sa izostankom hendikepa u slucaju praznine završetka) pomocu GAP algoritma. U nekim manifestacijama parametri za uporedenje sekvenci polinukleotidnih molekula (nasuprot aminokiselinskoj sekvenci) ukljucuju sledece: algoritam : Needleman et al, supra (1970); matrica uporedenja: poklapanja = +l O , promašaj = o 00185 B 505 10 15 20 25 30 WO 03i05 7 134 50 PCTiUS02/3 2657 hendikep praznine: 50 hendikep praznine dužine: 3 Program GAP može biti koristan uz upotrebu gore datih parametara. Gore pomenuti parametri su zadati parametri :;, a uporedenja polinukleotidnih molekula. Drugi primeri algoritama, hendikcpi praznine otvaranja , hendikep praznine produženja, matrice uporedenja, prag slicnosti , itd ., mogu se koristiti, ukljucujuci one date u programskom prirucniku Wisconsin Package, Version 9, September, l 997. Šta posebno odabrati bice jasno onome obucenom u oblasti i zavisice od specificnosti traženog uporedenja, kao što je DNK-prema-DNK, protein-prema protein, protein-prema-DNK; i dodatno, porede li se dati parovi sekvenci (u kom sluc<~ u su obicno poželjni GAP i BestFit) ili izmedu jedne sekvence i velike baze podataka sekvenci (u kom slucaju su obicno poželjni FASTA ili BLASTA). Kako se ovde koristi, dvadeset konvencionalnih aminokiselina i njihove skracenice slede konvencionalnu upotrebu. Videti lmmunology-A Synthesis (2 11 d Edition , E. S. Golub and D. R. Gren, Eds., Sinaucr Associates, Sunderland, Mass. (1991)), lwjaje sadržana ovde kao referenca u bilo koju svrhu . Aminokiseline mogu imati L ili D stereohemiju (osim Gly, koji nije ni L ni D) i polipcptidi i farmaceutske forme sadašnjeg pronalaska mogu ukljucivati slereohemijsku kombinaciju jedi njenja. Medutim, prioritetna je L stereohemja jedinjenja Sadašnji pronalazak takode obezbeduje rcversne molekule pri cemu je sekvenca od amino završetka ka karboksi lerminusu reversna. Na primer, rcversnosl molekula nom1alne sekvence X 1 -X 2 -X, je X 3 -Xr X 1 . Sadašnji pronalazak takode obezbeduje retro-reversne molekule pri cemu je, kao i gore, sekvenca od amino završetka ka karboksi tem1inusu revcrsna, a ostaci koji su obicno\"!\" enantiomeri promenjeni su u \"D\" obJik . Stereoizomeri (na pr., D-aminokiseline) dvadeset konvencionalnih aminokiselina, aminokiselina koje nisu prirodne kao što su ex-, (x.-disupstituisane aminokiseline, N-alkil aminokiseline, mlccna kiselina, i druge nekonvencionalne aminokiseline mogu takode biti pogodne komponente za gradenje polipeptida sadašnjeg pronalaska. Primeri nekonvencionalnih aminokiselina ukljucuju, bez ogranicenja : aminoadipinsku kiselinu, bcta-alanin. beta-aminopropansku kiselinu, aminobutcmu kiselinu, pipcridinsku kiselinu, aminokaprinsku kiselinu, 00185 B 515 10 15 20 25 30 \\VO 03/05 7 L{4 51 PCT/US02f32657 aminoheptansku kiselinu, aminoizohuternu kiselinu, aminopimelinsku kiselinu, diaminobuternu kiselinu, dcsmozin, diaminopimelinsku kiselinu, diaminopropansku kiselinu, N-etilglicin, N-etilaspargin, hiroksili;-in, allo hidroksi lisin, hidroksiprolin, izodesm01.in, allo-izoleucin, N-metilglicin, sarkosin, N-metili:;.oleucin, N-metilvalin, norvalin, norleucin, oritin, 4-hidroksiprolin, -y karboksiglutamat. t:-N,N,N-trimetillizin. E -N-acctillizin, 0-fosfoscrin, N acetilserin, N-formilmetionin, 3-mctilhistidin, 5-hidroksilizin. cr-N-metilarginin, i druge slicne aminokiseline i aminokiseline (na pr .. 4-hidroksiprolin ). Slicno, ukoliko sc drugacije ne specificira, levi završetak polinuklcotidne sekvence koja sc sastoji od jednog niza naziva sc 5' završetak; levi završetak polinuklcntidnc sekvence koja se sastoji od dva ni za naziva se 5' direkcija (smer). Smer od 5' ka 3' adicije nascentnog RNK transkripta naziva se transkripcioni smer; oblasti sekvence DNK niza koji imaju istu sekvencu kao RNK i koji su 5' ka 5' završetku RNK transkripta nazivaju se \"uzvodne sekvence\"; oblasti sekvence DNK niza koji imaju imaju istu sekvencu kao RNK i koji su 3' ka 3' završetku RNK transkript<! nazivaju se \"nizvodne sekvence\". Podrazumcvace se da se aminokiselinski ostaci mogu podeliti na klase zasnovane na zajednickim osobinama hocnog nin : l. neutralni hidrofobni: Alanin (Ala; A), Valin (Val ; V), Leucin (Leu; L), Izol.cucin (He; I), Prolin (Pro; P), Triptofan (Trp; W), Fenilalanin (Phc; F), i Metionin (Met, M). 2. neutralni polarni: Glicin (Gly; G); Serin (Ser; S), Treonin (Thr; T), Tirosin (Tyr; Y), Cistein (Cys; C), Glutamin (Giu; Q), Asparagin (Asn; N), i Norleucin. 3. kiseli: Asparaginska Kiselina (Asp; D) , Glutaminska Kiselina (Glu; E); 4. bazni: Lizin (Lys; K), Arginin (Arg; R), Histidin (His; H). Videti Lcwin, B, Genes V, Oxford University Press (1994), str. ll. Umerene supstitucije aminokiselina mogu obuhvatiti nekonvencionalne aminokisclinske ostatke, koji se tipicno radije ugraduju hemijskom sintezom peptida nego sintezom u biološkim sistemima. One ukljucuju , bez ogranicenja, peptidomimctikc i druge revcrsnc ili invertovane forme aminokisclinskih grupa. 00185 B 525 10 15 20 25 30 wo 03/057 134 52 PCT /US02/3 2 65 7 Supstitucije koje n isu umerenc mogu uklj ucivati iz menu clana jedne od ovih klasa clanom druge klase. Prilikom izvodenja ovakvih promena prema nekim manifestacijama sadašnjeg pronalaska, uzima se u obzir hidropaticni indeks aminokiselina. Svakoj aminokisclini pripisan je hidropaticni indeks na osnovu karakteristika hidrofobnosti i naelckrisanja. Hidropaticni indeksi aminokiselina su: izoleuci n (+4.5); valin (+4.2); lcucin (+3 .8 ); fenilalanin (+2.8); cistein/cistin (+2.5); metionin (+1.9); al anin (+ 1.8); glicin ( -0.4); treonin (-0. 7); scrin (-0.8); triptol~111 ( -0.9); tirosin ( -1 .3); prolin (-U)); histiclin (-3 .2); glutamat (-3.5); glutamin (-3.5); aspartat (-3 .5); asparagin (-3.5); lizin (-3 .9); i arginin (-4 .5 ). V <~žnost hidropaticnog aminokiselinskog indeksa u cilju dodeljivanja biološke funkcije proteinu poznato je u oblasti. K ytc et al., J. Mol. Bio!, 157:105- 131 (1982). Poznato je da neke aminokiseline mogu biti supstituisane drugim aminokiselinama slicnog hidropaticnog indeksa ili broja, i da i dalje zadrže slicnu biološku aktivnost. Prilikom izvodenja promena zasnovanih na hidropaticnom indeksu, u nekim manifestacijama su uk ljucene supstitucije aminokiselina ciji je hidropaticni indeks unutar ±2. U nekim manifestacijama su ukljucene one unutar ±l, a u nek im manifestacijama one unut ar ±0.5. Takode se podrazumeva u oblasti da se supstitucija slicnih aminokiselina može efikasno izvršiti na osnovu hidrofilnosti, posebno kada je tako stvore ni biološki funkcionalna peptibodi ili peptid namenjen upotrebi u imunološkim manifestacijama, kao što je to u sadašnjem slucaj u. U nekim manifestacijama, najveca lokalna pro.sccna hidrofilnost proteina, regulisana hidrofilnošcu susednih aminoki selina, nalazi se u uzajamnom odnosu sa svojom imunogenicnošcu i antigenicnnšcu , ~j. , sa biološkim osobinama proteina. Sledece vrednosti hidrofilnsoti su pripisane datim aminokiselinskim ostacima : arginin (+3 .0); lizin (+3.0); aspartat (-1 3.0 ± l); glutamat (+3 .0 ±l); serin (·j tU); asparagin (+0.2); glutamin (+0.2); glicin (O); trconin (-0.4); prolin (- 0 .5 ± l); alan in ( -0 .5); histidin ( -0.5); cistein (-1.0); metionin ( -1.3) ; val in ( -1.5); leu cin (- 1. H); izoleucin ( -1 .8); tirozin ( -2.3 ); fenil al anin ( -2.5) i triptofan ( -3.4 ). Pri !.ikom izvode1~ja promena zasnovanih na slicnim vrednostima hidrofilnosti, u nekim manifestacijama, ukljucena je supstitucija aminokiselina cije su vrednosti unutar ±2. u nekim manifestacijama ukljucene su one unutar ±l , a u nekim 00185 B 535 wo 03/05 7134 53 PCf/US02/32657 manifestacijama ukljucene su one unutar ±0.5. Mogu se identilikovati epitopi primamih aminokisehnskih sekvenci na osnovu hidrofilnosti. Ovakve oblasti nazivaju se \"oblasti jezgra epitopa ... Primeri aminokiselinskih supstitucija navedeni su dole u tabeli 2. Tabela 2 Supstitucije am inokiselina Originalni ostaci Primeri supstitucija Po7 .cljne supstitucije Ala Val, Leu, Ile Val Arg Lys, Gin, Asn Lys As n Gln, Glu, Asp Gl n A sp Glu, Gln, Asp Gl u Cys Ser, Ala Ser Gin Asn, Glu, Asp A sn Gl u Asp, Gin, Asn As p Gly Pro, Ala Ala His Asn, Gin, Lys, Arg Arg Ile Leu, Val, Met, Ala, Phc, Leu nor! eu cin Leu norl.eucin, Tle, Val, Met. Ile Ala, Phc Lys Arg, 1 ,4diamino-butcma Arg kiselina, Gin, Asn Met Leu, Phc, Ile Leu Ph e Leu, Val, Ile, Ala, Tyr Leu Pro Ala Gly Ser Thr, Ala, Cys T hr Thr Scr Scr Trp Tyr, Phe Tyr Tyr Trp, Phe, Thr, Ser Ph e Val Ile, Met, Leu, Phe, Ala, Leu norleucin 00185 B 545 10 15 20 25 30 wo 031057134 54 PC'r!US02i32657 Obuceni majstor može da odredi ovde navedene pogodne varijante polipcptida koristeci dobro poznate tehnike. U nekim manifestacijama, onaj obucen u oblasti može da definiše pogodne površine molekula koj i se mogu promcniti bez uni štavanja aktivnosti od strane oblasti za koje se veruje da nisu važni za aktivnost. U nekim manifestacijama, mogu se identifikovali ostaci i delovi molekula koji se cuvaju medu slicnim peptidima ili polipcptidima. U nekim manil'estacijama, cak i površine koje mogu biti važne za biološku aktivnost ili strukturu mogu sc podvrci umerenim supstitucijama aminokiselina bez uništavanja biološke aktivnosti ili bez nepovoljnog uticaja na polipeptidnu strukturu. Dodatno, onaj obucen u oblasti može razmotriti studije struktura-funkcija i identifikovali ostatke iz slicnih polipeptida koji su važni za aktivnost ili strukturu. Imajuci u vidu takva poredenja , može se predvideti važnost aminokiselinskih ostataka u proteinu koji odgovaraju aminokiselinskim ostacima važnih za aktivnost u slicnim proteinima. Onaj obucen u oblasti mož.c birati hemijski slicne aminokisdinske supstitucije takvih važnih aminokiselinskih ostataka. Onaj obucen u oblasti može takode analizirati trodimenzionalnu strukturu i aminokisclinsku sekvencu u odnosu na takvu strukturu u slicnim polipeptidima. U svetlu takve informacije, onaj obucen u oblasti može predvideti poklapanje aminokiselinskih ostataka u antitclu u odnosu na njenu trodimenzionalnu strukturu. U nekim manifestacijama, onaj obucen u oblasti može odabrati da ne cini radikalne izmcnc na aminokiselinskim ostacima za koje je predvideno da se nalaze na površini proteina, jer bi takvi ostaci mogli biti ukljuceni u važne interakcije sa drugim rnolekulima. Štaviše, onaj obucen u oblasti može generisati test varijante sa jednom aminokiselinskom supstitucijom na svakom željenom aminokiselinskom ostatku. Varijante se zatim mogu testirati pomocu testova aktivnosti poznatim onima obucenim u oblasti. Navedene varijante mogu se iskoristiti za sakupljanje informacija o pogodnim varijantama. Na primer, ukoliko se otkrije da promena nekog aminokiselinskog ostatka rezultuje uništenom, nepoželjno smat~jenom, ili nepogodnom aktivnosti, varijante sa takvim promenama se mogu izbeci . Drugim recima , na osnovu informacija sakupljenih rutinskim eksperimentima, onaj obucen u oblasti može lako odrediti aminokiseline cije hi dalje supstitucije trebalo izbegavali, zajedno ili u kombinaciji sa drugim mutacijama. Izvestan broj naucnih publikacija posvecen je predvidanju sekundarne strukture. Videti Moult L, Curr. Op. in Biotech., 7(4):422-427 (l99(J), 00185 B 55wo 0:)/05 7134 55 PCT/OS02/3 2657 Chou et al. Bioc/1emistry. 13(2):222-245 (1974); Chou et al. Biochcmistry, 113(2):211-222 ( l 974 ); Ch ou er al, Adv. Enzymol Re/at . .-1reas Mol. Bio!, 47:45 - 148 (1978); Chou et al . .Ann. Rev. Biochem. , 47:251 -276 i Chou et al. Biophys. J, 26:367- 384 ( 1979). Štaviše, sada su dostupni kompjuterski programi koji pomažu predvidar1iu 5 sekundarne strukture. Jedna od metoda za predvidanje sekundarne strukture zasnovana je na modelova11iu homologijom. Na primer, dva polipeptida ili proteina sa identicnošcu sekvence vecom od JO %, ili slicnošcu od 40 % cesto imaju slicne struturnc topologije. Skori porast strukturne databaze proteina (PD13) omogucio je poboljšano predvidanje sekundarne strukture, ukljucujuci moguci broj savijanja unutar strukture polipeptida ili 10 proteina. Videti Holm et al., Nucl Acid. Res., 27(1):244-247 (1999). Predloženo je (Brenner et al. , Curr. Op. ,)'truct. Bio!, 7(3):369-376 (1997)) da postoji ograniceni broj savijanja u datom polipetidu ili proteinu, i da ce rešavanjem kriticnog broja struktura predvidanje struktura postati znacajno preciznije. Dodatne metode predvidar\\ia sekundarne strukture ukljucuju 15 \"threading\" (Jones, D., Curr. Opin. Struct. Biol., 7(3):377-87 (1997); Sippl et al., Structure. 20 4(1 ): 15-19 (1996)), \"analizu profila\" (Bowie et al., Science, 253 :164- l 70 (l 9<J l ); Gribskov et al., Meth. Enzym .. 183:146-159 ( 1990); Gribskov et al, Proe. Nat. Acad. Set, S4(13): 4355-4358 ( 1987)), i \"evolucionarno povezivanje\" (Videti Hnlm, supra (1999), i Brenner, supro (1997)). 20 25 30 U nekim manifestacijama, varijante peptibodi ukljucuju glikozilovanc varijante gde jedan ili više glikozilovanih položuja, kao što je N vezani položaj glikozilovanja, dodaju peptibodi. N-Vezani položaj glikozolovanja karakteri san je sekvencom Asn-X-Ser ili Asn-X-Thr, gde aminokiselinski ostatak oznacen kao X može biti bilo koji aminokiselinski ostatak osim prolina. Supstitucijom ili adicijom aminokiselinskih ostataka u cilju gradenja ovakve sekvence nastaje potencijalno novi položaj za adiciju N-vezanog ugljovodonicnog niza. Alternativno, supstitucije kojima se eliminiše navedena sekvenca uklonice i postojeci N-vezani ugljovodonicni niz. Sadašnjim pronalaskom takode je obezbedcno premcštanjc N-vezanih ugljovodonicnih nizova pri cemu se jedan ili više N-vezanih položaja glikozilovanja (pretežno oni prirodni) eliminišu a nastaje jedan ili više novih N-vezanih položaja. Sadašnji pronalazak takode obezbeduje \"derivate\" koji ukljucuju peptibodi modifikovanc drugacije od, ili kao dodatak, insercijama, dclctacijama, ili 00185 B 565 10 15 20 25 30 \\VO 03/057134 56 PCT/US02/32657 supstitucijama aminokiselinskih ostataka. Poželjno je da su modifikacije kovalentne prirode i d <l ukljucuju , na primer, hemijsku vezu sa polimerima, Jipidima, drugim organskim i neorganskim grupama. Derivati sadašnjeg pronalaska dobijaju se radi povecanja poluživota peptibodi, ili se mogu dizajnirati u cilju poboljšanja ciljanja peptibocli željenih celija, tkiva ili organa. Pri meri deri'v·ata ukljucuju grupe pri cemu su izvršene jedna ili više sledecih modifikacija : • Jedna ili više peptidnih [-C(O)NR-] veza zamenjena je vezom koja nije peptidna, kao što je veza -CH 2 -karbamat [ -CH 2 -0C(O)NR-]; fosfonatna veza; -CH 2 -sulfonamidna [-CH 2 -S(0) 2 NR-] veza; a urea [-NHC(O)NH-] veza; -CH 2 -sekundama amino veza; ili alkilovana peptidil veza (-C(O)NR()_ gde predstavlja R 6 ni:l.i alkil] ; • Peptidi gde je N-tenninus dcrivatimvan u -NRR 1 f:,>rupu ; u - • NRC(O)R grupu; u -NRC(O)OR grupu; u -NRS(OhR grupu; u NHC(O)NHR grupu, pri cemu R i R 1 predstavljaju vodonik ili niži alkil, uz uslov da oba R i R 1 ne predstavljaju vodonik; u sukcinimidnu grupu; u benziloksikarbonil -NH- (CBZ-NH-) grupu; ili u benziloksikarbonil-NH- grupu za koju je vezano l do 3 supstitucnta za fenil prsten odabranih od grupe koja sc sastoji od niže alkil, niže alkoksi, hlora, i broma; i Peptidi gde je slobod ni C terminus derivatizovan u -C(O)R 2 pri cemu jeR odabrano od grupe koja se sastoj i od niže alkoksi i NR 1 R 4 . \" R 1 . R 4 . d b d k . - · pn cemu su · 1 nezav1sno o a rane o grupe OJa sc sastoji od vodonika i niže alkil. Pod \"niža\" podrazumcvaju sc grupe sa l do 6 ugljenikovih atoma. Dodatno, modifikacije individualnih aminokiselina mogu se uvesti u polipeptidc ili fonnulacUe sadašnjeg pronalaska reakcijom ciljanih aminokisdinskih ostataka peptida sa organskim sredstvom ; ,a derivati zaciju koje može reagovati sa odabranim bocnim nizovima ili terminalnim ostacima. Dole su dati sledeci primcri : Lizinil i amino terminalni ostaci mogu reagovati sa anhidridima cilibarne ili drugih karboksilnih kiselina. Derivatizacija ovim agensima uslov ljava promenu šarže lizin il ostataka. Drugi pogodni reagensi za dcrivatizacij u alfa-amino- ostataka 00185 B 575 10 15 20 25 30 WO 03/057 134 57 PCT/US02/32657 ukljucuju irnidoestre kao što su metil pikolinimidat; piridoksal fosfat; piridoksal; hlorborhiclrid; trinitrobenzensulfonska kiselina; 0-metilizourca; 2,4 pentandion; i transaminazom-katalizovana reakcija sa glioksilatom. Arginil ostaci sc mogu modifikovati reakcijom sajednim ili više konvencinnalnih reagenasa, izmedu ostal ih fenilglioksalorn, 2,3-butandionorn, l ,2- cikloheksandionom, i ninhidrinom. Derivatizacija argininskih ostataka zahteva da se reakcija izvodi pod alkalnim uslovima zbog visoke pKa guaniclinske funkcionalne grupe. Nadalje, ovi reagensi mogu reagovati sa lizinskim grupama kao i guanidino grupom arginina. Speci fi c na modifikacija tiro zi l ostataka per se je ekstenzivno proucavana, sa posebnim osvrtom na uvodenje spektralnih obeleživaca u tirozil ostatke reakcijom sa aromaticnim diazonijumjedinjenjima ili tetranitrometanom. Obicno se N acetilimidizol i tctranitrometan mogu koristiti u cilju gradenja O-acetil tirozil reakcionih vrsta i 3-nitro derivata. Karboksilne bocne grupe (asparlil ili glutamil) mogu se selektivno modifikovati reakcijom sa karbodiimidima (R'-N~oC>N-R') kao što su l-cikloheksil- 3-(2-morfolinil-( 4-etil) karbodiimid il i l-eti 1-3-( 4-azonia-4,4-dimeti !pentil) karbodiimid . Dalje, aspartil i glutamil ostaci mogu se tranfonnisati u asparaginil i glutaminil ostatke reakcijom sa amonijumjonima. (ilutaminil i asparaginil ostaci se cesto dcaminuju u odgovarajuce glutamil i aspartil ostatke. Altcmativno, ovi ostaci sc mogu deamidovati pod blago kiselim uslovima. J edan i drugi oblik ovih ostataka spada u poU e sadašnjeg pronalska. Dcrivatizacija pomocu bifukcionalnih agcnasa je korisna u cilju umrežavanja peptida ili njihovih funkcionalnih derivata u u vodi nerastvornu podrž.avajucu matricu ili u druge makromolekulske nosace. Uobicajeno korišceni agensi za umrežavanje ukljucuju na pr., l, l-bis(diazoacetil)-2-feniletan, glutaraldehid, N-hidroksisukcinimidne estre, na primer, estre 4-azidosalicilnc kiseline. homobifunlccionalne imidoestre, ukUucujuci disukcinimidil estre kao što je 3,3'-ditiobis(sukcinimidilpropionat), i bifunkcionalne imide maleinske kiseline Icao što je bis-N-maleimido-1 ,8-oktan. Agensi za derivatizaciju kao što je metil-3- ((p-aziclofcnil)ditio]propioimidat daju intennedijere koji se mogu aktivirati svetlošcu a koji grade ukrštene veze u prisustvu svetlosti. Alternativno, reaktivne matrice koje su nerastvome u vodi kao što su ugljeni hidrati aktivirani cijanogen 00185 B 585 10 15 20 25 30 wo 03i057 134 58 PCT/US02iJ2657 hromidom, kao i reaktivni supstrati opisani u U .S. pat. br. 3.%9,287; 3,691 ,016; 4, 195, 128; 4,247,642; 4,229,537; i 4,330.440 mogu se koristiti u cilju imobili:;.acije proteina. Druge moguce modifikacije ukljucuju hidroksilovanjc prolina i lizina, fosfori lovanje hidroksilnih grupa seril i treonil ostataka, oksid ac iju sumporovog atoma u Cys, mctilovanje alfa-amino grupa lizinskih, argininskih, i histidinskih bocnih nizova (Creighton, T.E., Proteins: Structure and Molcculc Propc1iics, W. H. Freeman & Co., San Francisco, str. 79-86 (1983)), acctilovanje N-terminalnih amina, i, Ll nekim s lucajevima amidovanjc e-terminalnih karboksilnih grupa. Prioritetno je da tako modifikovanc grupe poboljšavaju jednu ili više karakteristikajedinjcnja, ukljucujuci anti-angeniogenicnu aktivnost, rastvorljivost, apsorpcij u, biološki poluživot i slicno. Alternativno, derivatizovanje grupa može rezultivati i time dajedinjenja imaju iste, suštinski iste, karakteristike i l ili osobine nederivatizovanogjedinjenja. Grupe mogu alternativno eliminisati ili prigušiti bilo koji sporedni efekatjedinjenja, i slicno. .Jedinjenja sadašnjeg pronalaska mogu se menjati i na DNK nivou . DNK sekvenca bilo kog dclajedinjenja može se promeniti u kodone kompatibilnije sa izabranom celijom domacinom. Za E. coli, koj a je poželjna celija domacin, optimizovani kodoni su poznati u oblasti. Kodoni mogu biti supstituisani da bi sc eliminisali rcstrikcioni položaji ili da bi se ubacili tihi restrikcioni položaji . koji mogu pornoci obradi DNK u odabranoj celiji domacinu . Nosac , linker, i peptidne DNK sekvence mogu se modifi.kovati da uk ljuce bilo koju od prethodnih promena sekvence. Tako su ovde diskutovane sve modifikacije, supstitucije, derivatizacijc, itd., podjednako primenjenc na sve aspekte sadašnjeg pronalaska, ukljucujuci ali ne ogranica vaj uci se na peptide, pcptidne di mere, i mul tim ere, linkere i nosace. Dodatno. onaj obucen u oblasti može pregledati studije struktura-funkcija i identiiikovati ostatke kod slicnih peptida važnih za aktivnost ili strukturu. imajuci u vidu takva porcdcnja, može se predvideti važnost aminokiselinskih ostataka u peptidu a koji odgovaraju aminokiselinskim ostacima važnim za aktivnost ili strukturu slicnih peptida. Onaj obucen u oblasti može izabrati hemijski slicne aminoki selinske supstitucije predvidenih važnih aminokiselinskih ostataka peptida. On~j obucen u oblasti takode može analizirati trodimenzionalnu strukturu i aminokiselinsku sekvencu u odnosu na strukturu slicnih polipcptida. imajuci u vidu 00185 B 595 10 15 20 25 30 V·/ O 03i05 7134 59 PCT/US02/32657 takvu inJ(mnac~ju, onaj obucen u oblasti može prcdvideti pružanje aminok1sclinskih ostataka peptida u odnosu na svoju trodimenzionalnu strukturu. Onaj obucen u oblasti može odabrati da ne cini radikalne izmene aminokiselinskih ostataka za koje je predvideno da ce se nalaziti na površini proteina, jer ti ostaci mogu uc~slvovati u važnim interakcijama sa dru gi m molekulima. Štaviše, onaj obucen u oblasti može generi sati test varijante koje sadrže jednu supstituisanu aminokiselinu na bilo kom željenom aminokiselinskom ostatku. Varijante se zatim mogu testirati pomocu testova aktivnosti poznatim onima obucenim u oblasti. Dobijeni podaci mogu se koristili radi sakupljanja infom1acije o pogodnim varijantama. Na primer, ukoliko se otkrije da promena nekog posebnog aminokiselinskog ostatka vodi nestaloj, neželj eno redukovanoj ili neodgovarajucoj aktivnosti , varijante dobijene takvim izmcnama se izbegavaju. Drugim recima, zasnovano na in formac iji sakupljenoj takvi m rutinskim eksperimentima, onaj obucen u oblasti može Jako odrediti na kojima aminokiselinama bi trebalo izbegavati supstituc~e, samostalne ili u kombinaciji sa drugim mutacijama. Veci broj naucnih publikacija posvecen je predvidanju sekundarne strukture. Videti Moult J. , C uiT. Op. in Biotech., 7(4): 422-427 (1996), Chou et al., Biochernistry, 13(2): 222-245 (1974); Chou et al.. Biochemistry, 113(2): 211-222 (1974); Chou et al., Adv. Enzyrnol. Relat. Areas Mol. Bio!., 47:45-148 (1978) ; Chou ct al., Ann . Rev. Biochem., 47: 25 1-276 and Chou et al., Biophys. J. , 26: 367-3H4 (1979) . Štaviše, sada su dostupni kompjuterski programi koji pomažu predvidanju sekundarne strukture. Jedna od metoda za predvidanje sekundarne strukture zasnovana je na modelovanju homologijom. Na primer, dva polipeptida ili proteina cija je identicnost sekvence veca od 30%, ili slicnost veca od 40%, cesto imaju slicne strukturne topologij e. Skori pora.<>t strukturne databaze proteina (PDB) omogucio je poboljšano predvidanje sekundarne strukture, ukljucujuci moguci broj savijanja unutar strukture polipeptida ili proteina. Videti Holm et al. , Nucl Acid. Res., 27(1):244-247 (1999). Predloženo je (Brenner et al., Curr. Op. Struct. Bio!. 7(3):369-376 ( 1997)) da postoji ograniceni broj savijanja u datom polipetidu ili proteinu, i da ce rešavanjcm kriticnog broja struktura predvidanje struktura postati znacajno preciznije. Dodatne metode predvidanja sekundarne strukture ukljucuju \"threading\" (Jones, D., CuiT. Opin. Struct. Biol., 7(3):377-87 (1997); Sippl et al., 00185 B 605 10 15 20 25 30 \\VO 03/057134 60 PCT/US02/32657 Structure, 20 4(1 ): 15-19 (1996)), \"analizu profila\" (Bowie et al., Science, 253:164- 170 (1991 ); Gribskov et al., Meth . Enzym., 183:14(J-159 (1990); Gribskov et al, Proe. Nat. Acad. Set, S4(13): 4355-4358 (1987)), i \"evolucionarno povezivanje\" (Videti Holm, supra (1999), i Brenner, supra (1997)). Sadašnji pronalazak dalje obuhvata derivate specificno vezujuceg agensa, na pr., pe:ptibodi, kovalentno modifikovanc da ukljuce jedan ili više u vodi rastvomc polimeme dodatke, kao što su polietilen glikol, polioksietilen glikol, ili polpropilen glikol , kako je opisano u U.S. patent hr.: 4,640,835; 4,496,689; 4,301,]44; 4,670,417; 4,791,192; i 4,179,337. Drugi korisni polimeri poznati u oblasti ukljucuju monometoksi-polietilen glikoL dekstran, celulozu ili druge polimere 7.asnovanc na ugljenim hidratima, poli-( N-vinil pirolidon)-polietilen glikol, propilen glikol homopolimcre, a polipropilen oksid / etilen oksid kopolimer, polioksietilovane poliole (na pr, glicerol) i poli vinil alkohol, kao i smese ovih polimera. Posebno prioritetni su peptibodi kovalentno modi.fikovani pomocu polietilen glikolnih (PEG) podjedinica. U vodi rastvorni polimeri mogu se vezati za specificne položaje, na primer za amino terminus pcptibodi, ili nasumicno vezati za jedan ili više bocnih nizova polipeptida. Upotreba PEG u cilju poboljšanja terapeutskog kapaciteta specificno vezujucih agenasa, na pr., peptibodi, i posebno za humanizovana antitcla, opisan je \\..JS patentom br. G, 133 ,42(J (Gom.ales et al.) izdat J 7. oktobra 2000. Sadašnjim pronalaskom takode je osmišljena dcrivatizacija peptida i l ili dela nosacajedi1~jenja. Takvi derivati mogu poboljšati rastvorljivost, apsorpciju , biološki poluživot, i slicne osobine jedinjenja. Grupe se mogu alternativno eliminasti ili mogu prigušiti njihov bilo kakav sporedni, ili slican, efekat. Primeri derivata ukljucujujcdinjenja kod kojih: l . .ledinjenjc ili neki njegov deo su ciklicni. Na primer, peptidni deo se može tako modifikovati da sadrži dva ili više Cys ostatka (na pr., u linkeru), koji mogu ciklizovati formiranjem disulfidne veze. 2. Jedinjenje je povezano ukrštanjem ili je tako napravljeno da može doci do ukrštanja izmedu molekula. Na primer, pcptidni deo se može modifikovati tako da sadrži Cys ostatak i stoga je sposobno da gradi intermolekulsku disultidnu vezu sa slicnim molekulom. Jedinjenje se takode može ukršteno povezati preko svojih C tcrminusa. 00185 B 615 10 15 20 25 30 WO 03/0) 7 134 61 PCTfUS02i3 2657 3 . .l edna ili više peptidnih [ -C(O)NR-] veza zamen jeno je vezom koja nije peptidna. Pri meri ne-pcptidnih veza su -CH2-karbamat [ -CH2-0C(O)NR-]; fosfonatna; -CH 2 -sulfonamidna [ -CH2-S(O)zNR-] ; i urea [ -NHC(O)NH-]; -CHr sekundarna amino ; ili alkilovana peptidil veza [-C(O)NR 6 - gde predstavlja R 6 ni/.i alkil]. 4. N-terminus je derivatizovan. Tipicno , N-terminus može biti acilovan ili modifikovan u supstituisani amin. Primeri N-tem1inalnih derivatnih grupa ukljucuju -NRR 1 (razlicitu od -NH 2 ), -NRC(O)R1,-NRC(O)OR, -NRS(O}zR, NHC(O)NHR 1 , sukcinimidnu, benziloksikarbonil -NH- (CBZ-NH-) grupu; pri cemu R i Rl nezavisno predstavljaju vodonik ili niži alkil i gde fenil prsten može biti supstiluisan pomocu l do 3 supstituenta odabranih grupe koja se sastoji od CI C4 alkil, C 1 -C4 alkoksi, hlora, i broma. 5. Slobodni C-terminus je derivatizovan. Tipicno C-terminus se esterifikujc ili prevodi u amid. Na primer, mogu se upotrebiti postupci opisani u oblasti u cilju dodavanja grupe (NH-CH2-CH 2 -NH 2 h jedinjcnju sadašnjeg pronalaska na e terminus. Slicno tome, mogu se koristiti metode opisane u oblasti u cilju dodavanja -NH 2 grupe jedinjenju sadašnjeg pronalaska naC-terminus. Prim eri e-terminalnih derivata ukljucuju , na primer, -C(O)R 2 pri cemu R predstavlja nižu alkoksi ili - NR 3 Rt pri cemu su R 3 i R4 nezavisno predstavljaju vodonik i C 1 -Cs alkil grupu (prioritetno C 1 -Cl alkil grupu). 6. Disulfid na veza zamenjuje se drugom, poželjno stabilnijom, grupom kojom sc vrši ukrštanje (na pr., alkilenskom). Videti, na pr. , Bhatnagar (supra) ; Alberts el ai, Thirteenth Am. Pep. Symp., 357-9 ( 1993). 7. Jedan ili više pojedinacnih aminokiselinskih ostataka se modifikuje. Poznato je da razlicita sredstva za derivatizaciju specificno reaguju sa odabranim bocnim nizovima ili terminalnim ostacima, kako je to detaljno opisano dole. Lizinil ostaci i amino terminalni ostaci mogu reagovati sa anhidridima cilibarne ili drugih karboksilnih kiselina. Dcrivatizacija ovim agensima uslovljava promenu šarže lizinil ostataka. Drugi pogodni reagensi za derivatizaciju alfa-amino ostataka ukljucuju imidoestre kao što su metil pikolinimidat; piridoksal fosfat; piridoksal; hlorborhidrid; trinitrobenzensulfonska kiselina; 0-metilizourea; 2,4 pentandion; i transaminaza-katalizovana reakcija sa glioksilatom. Arginil ostaci se mogu modifikovati reakcijom sa jednim ili kombinacijom 00185 B 625 10 15 20 25 30 \\VO OJ/057134 62 PCT/USOl/32657 više konvencionalnih reagenasa, ukljucujuci fenilgl ioksal, 2,3-butandion, 1,2- ciklobeksandion, i ninhidrin. Derivatizacija argininskih ostataka zahteva da sc reakcija izvodi pod alkalnim uslovima zbog visoke pKa guanidinske funkcionalne grupe. Nadalje, ovi reagensi mogu reagovati sa lizinskim grupama kao i guanidino grupom argmma. Specificna modifikacija tirozil ostataka per se je ekstenzivno proucavana , sa posebnim osvrtom na uvodenje spektralnih obeleživaca u tiro7.il ostatke reakcijom sa aromaticnim diazonijum jedinjenjima ili tetranitrometanom. Obicno sc N acetilimiclizol i tctranitrometan koriste u cilju gradenja O-acetil tirozil reakcionih vrsta i 3-nitro derivata. Karboksilne bocne grupe (aspartil ili glutamil) mogu sc selektivno modifikovati reakcijom sa karbodiimidima (R'-N=C=N-R') kao što su 1-cikloheksil- 3-(2-morfolinil-( 4-ctil) karbodiimid il i l-eti 1-3-( 4-azonia-4,4-cl i metil pentil) karbodiimid. Dalje, aspartil i glutamil ostaci mogu se tranformisati u asparaginil i glutaminil ostatke reakcijom sa amonij um jonima. Glutaminil i asparaginil ostaci se cesto deaminuju u odgovarajuce glutamil i aspartil ostatke. Alternativno, ovi ostaci se mogu deamidovati pod blago kiselim uslovima. Jedan i drugi oblik ovih ostataka spada u polje sadašnjeg pronalska. Cisteinil ostaci se mogu zameni ti aminokisclinskim ostacima ili drugim grupama radi eliminisanja disulfidnog vezivanja. ili, nasuprot tome, radi stabilizovanja ukrštenih veza. Videti, na pr., Bhatnagar, (~upra) . Dcrivatizacija pomocu bifukcionalnih agenasaje korisna u cilju umrežavanja peptida ili njihovih funkcionalnih derivata u u vodi nerastvornu podržavajucu matricu ili u druge makromolekulske nosace. Uobicajeno korišccni agensi za umrežavanje ukljucuju na pr., l, 1-bis(diazoacetil)-2-feniletan, glutaraldehid, N-hidroksisukcinimidne estre, na primer, estre 4-azidosalicilne kiseline, homobifunkcionalne imidoestre, ukljucujuci disukcinimidil estre kao što je 3,3'-ditiobis(sukcinimidilpropionat), i bifunkcionalne imide maleinske kiseline kao što je bis-N-maleimido-1,8-oktan. Agensi za derivatizaciju kao što je metil-3- [(p-azidofenil)ditio]propioimidat daju intermedijere koji se mogu aktivirati svetlošcu a koji grade ukrštene veze u prisustvu svetlosti. Alternativno, reaktivne matrice koje su nerastvorne u vodi kao što su ugljeni hidrati aktivirani cijanogen bromidom, kao i reaktivni supstrati opisani u U.S . pat. br. 3,969,287; 3,691,016; 00185 B 635 10 15 20 25 30 \\VO 03/057 J 34 63 l'CT/US02/J2(>57 4,195, 128; 4,247,642; 4,229,537; i 4,330,440 mogu se koristiti u cilju i mobilizacije proteina. U gl j enohidratne ( oligosaharidne) grupe mogu se pogodno vezati za položaje koji su poznati kao mesta glikozilovanja proteina. Obicno, O-vezani oligosaharidi sc vezuj ll za scrinske (Ser) ili treoninske (Thr) ostatke dok se ponovo vezani oligosaharidi vezuju za asparaginske (Asn) ostatke kada su deo sekvence Asn-X Ser l Thr. gde X može predstavljati bilo koju aminokiselinu osim prolina. X je prioritetno jedna od 19 prirodnih aminokiselina a koja nije prolin. Strukture N vezanih i O-vezanih oligosaharida i oswtaka šecera nadenih u svakom od datih tipova je razlicit . .Jedan tip secera koji se uobicajeno nalazi u oba je N acetilneuraminska kiselina (zove se i sial inska kiselina). Sialinska kiselina se obicno nalazi kao terminalni ostatak kod oba, N-vezanih i O-vezanih oligosaharida i, usled svoje negativne šarže, uslovljava kisele osobine glikozilovanom jedi njenju. Tako mesto (mesta) mogu se ugraditi u linker koda jedinjenj a sadašnjeg pronalaska i prvenstveno se glikoziliju u celiji za vreme rekombinantnog dobijanja polipeptidnih jedinjenja (na pr., u celijama sisara kao što su Cl- IO, BHK, COS). Medutim. takva mesta se mogu dalje glikozilovati sintetickim i polu-sintetickim postupcima poznatim u oblasti. Druge moguce modifikacije ukljucuju hidroksi lovanje prolina i lizina, fosfori lovanje hidroksilnih gmpa seril i treonil ostataka, oksidaciju sumporovog atoma ll Cys, mctilovanje alfa-amino grupa lizinskih, argininskih, i histidinskih bocnih nizova [Creighton, T.E., Proteins: Structure and Moiecule Properties (W. H. Freeman & Co., San Francisco) str. 79-86 (1983)]. Jedinjenja sadašnjeg pronalaska mogu se menjati i na DNK nivou. DNK sekvenca bilo kog dela jedinjenja može sc promeniti u kodone kompatibilnije sa izabranom celijo.m domacinom. Za E. coli, koja je poželjna celija domacin, optimi?.Ovani kodoni su poznati u oblasti. Kodoni mogu biti supstituisani da bi sc eliminisa li restrikcioni položaji ili da bi se ubacili tihi restrikcioni položaji, koji mogu pomoci obradi DNK u odabranoj celiji domacinu. Nosac, linker, i peptidne DNK sekvence mogu se modifikovati da ukljuce bilo koju od prethodnih promena sekvence. Afinitetno sazrevanje Jedna manifestacija sadašnjeg pronalaska ukljucuje \"afinitetno zrele\" 00185 B 645 10 15 20 25 30 wo 03/057134 64 PCT/US02/32657 peptide i peptibodi. Postupak ima u vidu povecanje afiniteta ili bioaktivnosti pepticla i peptibodi sadašnjeg pronalaska koristeci fagi displej ili neku drugu tehnologiju za selekciju. Zasnovano na konsenzus sekvenci (koje se generiše za skup srodnih peptida), dirigovane sekundarne fagi displej biblioteke se mogu generisati pri cemu su \"core\" aminokiseline (odredene na osnovu konsenzus sekvence) konstantne ili se menjaju sa ucestalošcu pojavljivanja. Alternativno, pojedinacne peptidne sekvence se mogu upotrebiti za generisanje pomerene, dirigovane fagi displej biblioteke. Ispiranjem takvih biblioteka dobivaju se peptidi (koji se mogu tensformisati u peptibodi) sa poboljšanom mogucnošcu vezivanja za Ang-2 ili sa poboljšanom bioaktivnošcu. Ne-peptidni analozi l mimetika proteina Dalje, zamišljeni su i ne-peptidni analozi kojima se omogucava stabilizovanje strukture ili postiže smanjena biodegradacija. Dobivanje analoga pcptidomimetika se može izvršiti na osnovu odabranog inhibitomog peptida zamenjujuci jedan ili više ostataka ne-peptidnim grupama. Prioriteno je da ne peptidnc grupe omoguce prirodne konformacije datog peptida, ili da stabilizuju prioritetnu, na pr., bioaktivnu, konformaciju cime se zadržava sposobnost prepoznavanja i vezivanja za Ang-2. U jednom aspektu, dobiveni analog l mimetik ispoljava afinitet prema Ang-2. Jedan primer metoda za dobivanje ne-pcptidnih mimetickih analoga iz peptida opisan je u in Nachman et al. Regul. Pept. 57:359- 370 (1995). Ukoliko se želi, peptidi sadašnjeg pronalaska mogu se modifikovati, na primer, glikozilovanjem, amidovanjem, karboksilovanjem ili fosfori lovanjem, ili transformacijom u kiselinske adicionc soli, amide, estere, prioritetno C tenninalne estre, i N-aci! derivate peptida sadašnjeg pronalaska. Peptibodi se takode mogu modifikovati i dobiti peptidni derivati gradenjem kovalentnih ili nckovalentnih kompleksa sa drugim gn1pama. Kovalentno vezani kompleksi mogu se dobiti vezivanjem hemijskih grupa za funkcionalne grupe bocnih nizova aminokiselina ukljucujuci peptibodi, za N- ili C-tcrminus. Posebno, podrazumeva se da peptidi mogu biti vezani za reporter grupu, ukljucujuci, ali ne ogranicavajuci se na radiomarker, fluorescentni marker, enzim (na pr., onaj koji katalizuje kolorimetrijsku ili fluorometrijsku reakciju), supstrat, cvrstu matricu, ili nosac (na pr., biotin ili avidin). Sadašnji pronalazak shodno 00185 B 655 10 15 20 25 30 wo 03/057134 66 PCT/US02i3265 7 sc ckstrahuju sa polimera rastvorom l % sircetne kiseline koji se zatim liofilizuje i dobiva sc sirovi materijal. On se normalno može precistiti tehnikama kao što su gel fil trovanje na Sephadex G-l S nosacu koristeci S % sircetnu kiselinu kao rastvarac. Liofilizacijom odgovarajucih frakcija eluiranih sa kolone dobivaju se homogeni peptidi ili pcptidni derivati , koji zatim mogu biti karakterisani standardnim tehnikama kao što su analiza aminokiselina, tankoslojna hromatografija, HPLC, ultraljubicasta apsorpciona spektroskopija, molm·na rotacija. rastvorljivost, i može se kvantiiikovati Edmanovom degradacijom na cvrstoj t~l7.:i . Postoje i drugi postupci, kao što je odabiranje peptida iz fagi displej biblioteke. Biblioteke se mogu pripremiti od seta aminokiselina kao je ovde opisano. Fagi displej može biti posebno efikasan u identifikovanju peptida korisnih u skladu sa sadašnjim pronalaskom. Ukratko, fagi biblioteka se priprema (koristeci na pr., ml 13 fd, ili lambda fagi), prikazujuci uloške od 4 do oko 80 aminokisclinskih ostataka. Ulošci mogu predstavljati, na primer, potpuno degenerisani ili devijantni raspored. Zatim se mogu izabrati ulošci koji nose fagi koje se vezuju za željeni antigen. Ovaj proces se može ponoviti u nekoliko ponovnih selekcija fage koja se vezuje za željeni antigen. Ponavljanja dovode do obogacivanja specificnih sekvenci koje nose fag. Može se izvesti analiza DNK sekvence u cilju identifikacije sekvenci ekspresovanih peptida. Može se odrediti minimalni linearni deo sekvence koja sc vezuje za željeni antigen. Postupak se može ponoviti koristeci devijantnu biblioteku koja sadrži uloške sa delimicnim ili celokupnim minimalnim linearnim delom plus jednim ili više dodatnih degenerisanih ostataka uzvodno ili nizvodno od njega. Ovim tehnikama mogu se identifikovati peptidi sadašnjeg pronalaska koji poseduju još veci vezujuci afinitet prema Ang-2 od agenasa koji su ovde vec identifikovani . Bez obzira na nacin na koji se dobivaju peptidi, moleku] nukleinske kiseline što enkodira svaki takav peptid i peptibodi se može gcnerisati pomocu standardnog postupka koristeci rckombinantnu DNK . Nukleotidnom sekvencom takvog DNK molekula može se pogodno manipulisati ne menjajuci aminokisclinsku sekvencu koju oni kodiraju na racun degenerisanosti koda nukleinske kiseline kao i na racun prcferencc kodona u specificnoj celiji domacinu. Tehnike rekombinantne DNK predstavljaju pogodan postupak za dobijanje 00185 B 665 10 15 20 25 30 wo 03/057134 67 PCT/US02/32657 peptibodi pune dužine, kao i drugih velikih specificnih vezujucih agenasa sadašnjeg pronalaska, koji jesu proteini ili podsec<~ju na protcine, ili njihovih fragmenata. DNK moleku! koji kodira pcptibodi ili fragment može se insertovati u ekspresioni vektor, koji se potom može insertovati u celiju domacina u cilju proizvodnje anlitela ili fragmenta. Obicno sc DNK moleku! koji enkodira peptid ili peptibodi može dobiti koristeci ovde opisane postupke u Primerima. Probe i tipicni uslovi hibridizacije su dati u Ausubel et al. (Current Protocols in Molecular Biology, Cu!Tent Protocols Press [J 9S>4]). Posle hibridizacije ispitivani blot se ispira uz odgovarajucu rigoroznost, u zavisnosti od faktora kao što su velicina probe, ocekivana homologija probe u odnosu na klon, vrsta biblioteke koja se ispituje, i broja klonova koje se ispituju. Primeri testiranja velike strogoce su 0.1 X SSC, i 0.1 proccnat SDS na temperaturi 50-65 oc_ Dvohibridne metode testiranja koje koriste kvasac mogu se upotrebiti za identifikaciju peptida sadašnjeg pronalaska koji se vezuju za Ang-2. Tako se antigen, ili njegov fragment, mogu koristiti za testiranje peptidnih biblioteka, ukljucujuci fagi displej biblioteke, za identifikaciju i selekciju Ang-2 vezujucih agenasa, na pr., peptibodi, sadašnjeg pronalaska. Alternativno. razliciti ekspresioni vektori l sistemi domacini se mogu koristili lokalizaciju i ekspresiju peptida sadašnjeg pronalaska. Takvi sistemi ukljuct~ju ali nisu ograniceni na mikroorganizme kao što su transformisane bakterije pomocu rekombinantne bakteriofage, plasmid ili kozmid DNK ekspresionih vektora, transformisani kvasac pomocu ekspresionih vektora kvasca, celijskih sistema insekata inficiranih ekspresionim vcktorima virusa (na pr., bakulovirusom), celijskim sistemom biljaka transfektovanih ckspresionim vektorima virusa (na pr., mozaicnim virusom karfiola, CaMV. mozaicnim virusom duvana, TMV) ili transformisanih pomocu bakterijskih eksprcsionih vektora (na pr., Ti ili pBR322 plazmid); ili celijskim sistemima životinja. Celije sisara korisne za dobivanje rckombinantnih proteina ukljucuju , ali nisu ogranicene na, VERO celije, IkLa celije , celijske linije jajnika Kineskog hrcka (CHO), COS celije (kao što su COS-7), Wl38, BHK, HepG2, 3T3, RIN, MDCK, A549, PC12, K562 i 293 celije . Primeri protokola za rekombinantnu ekspresiju peptida opisani su dole. Izraz \"ekspresioni vektor\" odnosi se na plazmid, fagi , virus ili vektor, za 00185 B 675 10 15 20 25 30 wo 03/057134 68 PCTtUS02/32657 ekspresiju polipeptida iz DNK (RNK) sekvence. Ekspresioni vektor može ukljucivati transkripcionu jedinicu koja ukljucuje skup (l) genetickog elementa ili elemenata koji sadrže regulatorsku ulogu u ekspresiji gena, na primer, promotori il i pospdivaci , (2) strukturu ili sekvencu koja en kodira vezujuci agens koja je transkrihovana u rnRNK i translatovana u protein, i (3) odgovarajuce transkripcionc sekvence inicijacije i terminacije. Strukturne jedinice koje se koriste u ekspresionim sistemima kvasca ili eukariotskim eksprcsionim sistemima prvenstveno ukljucuju sekvencu vodilju cime se omogucava ekstracclularna sekrecija translatovanog proteina od strane celije domacina. Alternativno, u slucaju kada je rekombinantni protein eks preso van bez sekvence vodilje ili transportne sekvence, on može sadržavati amino tcrminalni metioninski ostatak. Ovaj ostatak može, ili ne, biti potom uklonjen sa ekspresovanog rekombinantnog proteina pri cemu se dobiva krajnji peptidni proizvod. Na primer, peptidi se mogu rekombinantno ekspresovati u kvascu koristeci komercijalno dostupni ekspresioni sistem, na pr., the PichiaExpression System ( lnvitrogen, San Diego, CA), sledeci instrukc~je proizvodaca. Ovaj sistem se oslanja na pre-pro-alfa sekvencu radi upravljanja sekrecijom, ali je transkripcija uloška vodena promotorom alkohol oksidaze (AOXI) kada sc izvrši indukcija metanoJ om. Sekretovani peptid se precišcava od medijuma rasta kvasca pomocu , na pr., metoda koje se koriste za precišcavanje peptida od bakterijskih i humanih celijskih supernatanata. Alternativno, cDNK kodirajuci peptid se mož.e klonirati u bakulovirus eksprcsioni vektor pVL1393 (PharMingcn, San Diego, CA). Takav vektor se može upotrebiti prema proizvodackim uputstvima (PharMingen) radi infekcije celija Spodoptera frugiperda u sF9 od proteina slobodnom medijumu cime se dobiva rekombinantni protein. Rekombinantni protein sc može precistiti i konccntrovati iz medij uma koristeci kolonu heparin-sefaroza (Phannacia). Alternativno, peptid se može ekspresovati u sistemu insekta. Sistemi insekata za ekspresiju proteina su dobro poznati onima obucenim u oblasti. Jedan takav sistem, Autographa californica nuclear polyhedrosis virus (AcNPV) može se 00185 B 685 10 15 20 25 30 wo 03i057 !34 69 PCT/US02/32657 koristiti kao vektor za ekspresiju stranih gena u celijama Spodoptera frugiperda ili u Trichoplusia larvae. Kodirajuca sekvenca pcpticla se može klonirati u neesencijalnu oblast virusa, kao što je polihedrin gen, i kontrolisati polihedron promotorom. Uspešna inscrcija peptida inaktivira polihedrin gen i dobiva se rekombinantni virus bez zaštitnog protenskog omotaca. Rekombinantni virusi se mogu koristiti za infekciju S. frugiperda cel~ja ili Trichoplusia larvae u kojima se ckspresujc peptid. Smith et al. , J Viral. 46: 584 ( 1983); Engelhard et al., Proe. Nat. Acad Sci. (USA) 91: 3224-7 (1994). U dwgom primeru, DNK sekvenca koja enkodira peptid može se amp lifikovati pomocu PCR i klonirati u pogodni vektor, na primer, pGEX-3X (Pharmacia). Vektor pGEXje dizajniran da proizvodi fuzioni protein ukljucujuci glutation-S-transferazu (GST), kodiranu vektorom, i protein kodiran DNK fragmentom insertovanim u mesto za kloniranje u vektom. Prajmeri za PCR mogu sc generisati i ukljuct~u na primer, pogodno mesto za raskidanje. Kada se koristi fuziona grnpa iskljucivo da bi se olakšala ekspresija, ili inace nije poželja kao dodatak željenom peptidu, rekombinantni fuzioni protein može tada biti razdvojen od GST dela fuzionog proteina. Peptid dobiven pomocu The pGEX-3X/specificno vezujuceg agensa se transformiše uE. coli XL-l Blue celije (Stratagene, La Jolla CA), i izo!uju se pojedinacni transformanti i uzg~jaju . Plazmidna DNK iz individualnih transformanata se može precistiti i delimicno sekvencionisati koristeci aparat za automatsko sekvencionisanje da bi se potvrdilo prisustvo ž.eljenog specificno vezuj uceg agensa koji enkodira insert nukleinske kiseline u ispravnu orijentaciju . Neke peptidne formulacije sadašnjeg pronalaska jesu one u kojima je peplibodi konjugovana za bilo koji antitumorski peptid kao što je to tumor necrosis faktor (TNF) . U posebno prioritetnom postupku, TNF-specificno vezujuci agens generiše peptidne himere kao rekombinantne fuzije sa peptidom kodiranim sekvencama stopljeni u ram za TNF (Novagen, Madison, W J) kodirajuce sekvence. Peptid- TN F eDNA sc može klonirati u pET-ll b vektor (Novagen) i može se indukovati ekspresija TNF peptida u BL21 E. coli prema instrukcijama proizvot1aca pET ll b vektora. Rastvorni TNF peptidi mogu se od bakterijskih lizata precistiti amonijum sulfatnim rastvaram , hidrofobnom interaktivnom hromatografijom na Phenyl-Sepharose 6 Fast Flow. jonoizmenjivackom 00185 B 695 10 15 20 25 30 wo 03/057134 70 PCT/US02/J2657 hromatografijom na DEAE-Sepharose Fast Flow, i gel filtraciono hromatografijom na Sephacryi-S-300 HR. Fuzioni protein, koji se može dobiti kao m:rastvorno inkluziono telo u baktcriji, može se dobiti na nacin koji sledi . Celija domacin se sakrifikuje centrifugiranjem, ispere pomocu 0.15 M NaCl, 10 mM Tris, pH 8,1 mM EDTA; i tretira pomocu 0.1 mg/mllizozima (Sigma, St. Louis, MO) u toku l S min na sobnoj temperaturi . Lizat se izbistri sonifikovanjem, a ostaci celije se pretvore u kuglice ccntrifugiranjem tokom l O min na 12,000 X g. Fuzioni protein što sadrži kuglicu ponovo sc suspenduj e u 50 mM Tris, pH 8, i lO mM EDTA, prevodi u sloj iznad 50 % glicerola i centrifugira tokom 30 min na 6000 X g. Kuglica sc može pono vo suspendovati u standardnom fosfatnom pufcrovanom rastvoru soli (PBS) u kome nema Mg++ i Ca++. Fuzioni protein može dalje biti prccišcavan frakcionisanjem ponovno suspendovane kuglice u den aturisanom SDS-PAGE (Smnbrook et al., s ctpra). Gel se može potopiti u 0.4 M KCl da bi se vizualizovao protein, koji se može isec i i cluirati pomocu struje u gel protocnom puferu bez SDS. Ukoliko se GST l fu zioni protein dobiva iz bakterije kao rastvorni protein, može se precistiti pomocu (IST Puriiication Module-a (Pharmacia). Fuzioni protein se može podvrc i digestiji radi raskidanj a GST od peptida sadašnjeg pronalaska. Reakcija digestacijc (20-40 mg fuzionog proteina, 20-30 jedinica humanog tromb ina ( 4000 U/mg, Sigma) u 0.5 ml PBS in ku bira se 16-48 h na sobnoj temperaturi i nanese na denaturisani SDS-PAGE gel radi trakcionisanja reakcionih proizvoda. Gel se može potopiti u 0.4 M KCl u ci Uu vizualizacije proteinskih traka. Identitet proteinske trake koja odgovara ocekivanoj molckulskoj težini peptida može se potvrditi analizom aminokiselinske sekvence koristeci aparat za automatsko sekvencionisanje (Applied Biosystems Model 473A, Foster City, CA). Alternativ no, identitet se može potvrditi pomocu HPLC i l ili masenc spektrometrijc peptida. Alternativno, DNK sekvenca što cnkodira peptid mo že sc klonirati u plazmid koji sadrži željeni promotor i, opciono, sekvencu vodilju [Better ei al., Science 240 : l 041-43 (1988)]. Sekvenca proizvoda može se potvrditi automatskim sckvencionisanjcm. Plazmid se zatim može transformisati u soj MCI 061 E. coli pomocu standardnih postupaka koristeci CaC12 inkubaciju i tretirm1je bakterije toplotnim šokom (Sambrook et al. , supro) . Transformisana bakterija može se gaj iti 00185 B 705 10 15 20 25 30 wo 031057134 71 I'CT/US02/3 2657 u LB medijumu uz dodatak karbenicili na, a dobivanje prekomemo eksprcsovanog proteina može sc indukovati rastom u pogodnom medijumu. Ukoliko je prisutna, sekvenca vodilja može izazvati sekreciju peptida i može biti uklonjena tokom sekrccijc. Izluceni rekombinantni protein se može prccistiti od kulture bakterijskog medijuma dole opisanim postupcima. Sistemi kod domacina sisara za ekspresiju rekombinantnog proteina su dobro poznati onima obucenim u oblasti. Sojevi celija domacina se mogu odabrati prema specificnoj sposobnosti da procesuje ekspresovani protein ili proizvede neke post-translacione modifikacije, korisne za aktivnost proteina. Takve modifikacije proteina uklj u cuj u. ali nisu ogranicene na, ace ti lovanje, karboksilovanj e, glikozilovanje, fosforilovanje, lipidaciju i aci lovanje. Razlicite celije domacini kao što su CHO, HeLa, MDCK, 293 , WI38, i slicne , poseduju posebnu celularnu mašinu i karakteristicne mehanizme za takvu post-trans1acionu aktivnost i mogu se odabrati radi osiguranja ispravne modifikacije i procesovanje uvedenog, stranog proteina. Poželjno je da se transformisanc celije mogu dugo koristiti, da daju visok prinos proteina i da omogucavaju stabilnu ekspresiju. Kada sc jednom takve celije transformišu vektorima koji sadrže markere koji se mogu izabirati zajedno sa željenom ekspresionom kasetom, celije sc ostave da rastu 1-2 dana u ohogacenom medijumu. Marker koji se može odabrati je dizajniran omoguci rezistenciju prema selekciji i njegovo prisustvo omogucava rast i povracaj celija koje uspešno ekspresuj u uvedene sekvence. Rezistentni grumeni stab i ln o trans form isan ih celija mogu se razmnožiti koristeci tehnike uzgajanja u tkivu koje odgovara celiji . Može se upotrebiti veci broj selekcionih sistema za povracaj celija koje su transformisane radi proizvodnje rekombinantnog proteina. Takvi selekcioni sistemi ukljucuju , ali nisu ograniceni na, HSV timidin kinazu, hipoksantin guanin fosforiboziltransferaza i adenin fosforiboziltranferaza gen, u tk-, hgprt ili aprt- celij e. Takode , antimetabolicka rezistencija se može upotrebiti kao osnova selekcije DHFR koja prenosi rezistenciju prema metotreksatu; gpt koji prenosi rezistenciju prema mikofenolnoj kiselini ; neo koji prenosi rezistenciju prema aminoglikozidu G418 i prenosi rezistenciju prema hlorsulfuronu; i hygro koj i prenosi rezistenciju prema higromicinu. Dodatni geni što se mogu 00185 B 715 wo 03/057134 72 PCT/US02i32657 odabrati i koji mogu biti korisni ukljucuju trpB, koji omogucava celijama da koriste indol namesto triptofana, ili hisD , koji omogucava celijama da koriste histinol namesto histidina. Markeri koji daju vizuelnu indikaciju identifikacije transformanata ukljucuju antocijanine, r)-glukuronidazu i njen supstrat, GUS, i luci ferazu i njen supstrat, luciferin. 00185 B 725 10 15 20 25 30 \\VO 03/05 7 134 73 PCT/US02/32657 Prccišcavanje i ponovno nabiranje specificno vczujucih agcnasa l.! nekim slucajevima može biti potrebno da se speci fi c no vezujuci agensi kao što su peptidi i l ili peptibocli sadašnjeg pronalaska podvrgnu \"ponovnom nabiranju\" i da se oksiduju ll pogodnu tercijarnu strukturu i generišu disulfidne veze u cilju da postanu biološki aktivni. Ponovno nabiranje se može postici koristeci neke postupke dobro poznate u oblasti. Takvi postupci ukljucuju , na primer, izlaganje solubilisanog polipeptidnog agensa pH vrednosti obicno iznad 7 u prisustvu haotropnog agensa. Odabir haotropnog agensa slicno je nacinu izbora za ukljucivanje solubilizacijc tela, medutim, haotrpni agens sc obicno koristi pri manjim koncentracijama. Primer haotropnog agensa je guanidin. U najvecem broju slucajeva rastvor u kome se vrši ponovno nabiranje l oksidacija sadrži i redukciono sredstvo zajedno sa svojim oksidovanim oblikom u specificnom odnosu radi generisanja specificnog redoks potencijala koji omogucava da dode do reverzibilnog nastajanja disulfida u cilju uspostavljanja cisteinskih mostova. Neki uobicajeno korišcen i redoks parovi ukljucuju cistein l cistamin, glutation l ditiobisGSH, kupri hlorid, ditiotreitol DTT l ditian DTT, i 2-merkaptoetanol (bME) l ditio bME. U mnogim slucajevima upotrebljava se ko-rastvarac da bi se povecala efikasnost ponovnog nabiranja. Uobicajeno korišceni ko-rastvaraci ukljucuju glicerol. polietilen glikol razlicitih molekulskih tc7.ina, i arginin. Može biti poželjno da se preciste peptidi i peptibodi sadašnjeg pronalaska. Tehnike prccišcavm\\ja proteina dobro su poznate onima obucenim u oblasti. Takve tehnike ukljucuju , na jednom nivou, sirovo frakcionisanje frakcija koje sadrže, ili ne sadrže, proteine. Kada sc peptid i l ili peptibodi razdvoji od drugih proteina, željeni peptid ili polipeptid se može dalje precišcavati hrornatografskim tehnikama ili tehnikama clektroforeze u cilju postizanja parcijalnog ili potpunog precišcavanja (ili precišcavanja do homogenosti). Posebno pogodne analiticke metode za dobijanje peptibodi ili peptida sadašnjeg pronalaska su jonoizmei\\jivacka hromatografija, ckskluziona hromatograiija; elektroforeza na poliakrilamidnom gelu; iz.oelektricno fokusiranje. Posebno efikasna metoda za prccišcavanje pcptida je brza tecna luomatografija proteina ili cak HPLC. Pojedini aspekti sadašnjeg pronalaska ticu se precišcavanja, i u specificnim 00185 B 735 10 15 20 25 30 \\VO 0310)7134 74 PCT/US02i32657 manifestacijama. znatnim precišcavanjcm, peptibodi ili peptida sadašnjeg pronalaska. Izraz \"prccišcena peptibodi ili peptid\" kako se ovde koristi, odnosi se na jcdi1~jenja , koja sc mogu izolovati iz drugih komponenti, pri cemu sc peptibodi ili peptid prccišcavaju do bilo kog .stepena u odnosu na svoj prirodni oblik. Precišceni peplid ili peptibodi sc stoga odnosi i na peptibodi ili peptid koji je osloboden okoline u kojoj sc nalazi u prirodi. l : opštem slucaju, \"precišccn\" se odnosi na smesu peptida ili pcptibodi koja su bila podvrgnuta frakcionisanju radi uklanjanja razlicitih drugih komponenti, a koja zadržavaju u velikoj meri svoju ekspresovanu biološku aktivnost Kada se koristi izraz \"znact~jno precišcen\", ovaj izraz sc odnosi na smesu pep ti da ili peptibodi gde peptibodi ili peptid cini glavnu komponentu smcse, sadržavajuci oko 50 %, oko 60 %, oko 70 %, oko 80 %, oko 90 %, oko 95 o/t, , ili više, proteina u smesi. Razliciti postupci za kvantifikovanje stepena precišcavanja peptida ili peptibodi bice poznati onima obucenim u oblasti u svetlu sadašnjeg pronalaska. Oni ukljucuju. na primer, odredivanje specificne aktivnosti vezivanja aktivne frakcije, ili odredi vanje kolicine peptida ili pcptibodi u frakcijama SDS l PAGE analizom. Prioriteni poslupak za odredivanje cistoce frakcije peptida ili peptibodi jeste izracunavanje aktivnosti vezivanja date frakcije, njeno upored ivanje sa aktivnošcu vezivanja pocetnog ekstrakta, i na osnovu toga izracunavanja stepena precišcavar~ja, ovde odredenog kao \"-n ti broj precišcenosti.\" Stvarne jedinice upotrebljene za iskazivanje velicine aktivnosti vezivanja, naravno, zavisice od odabrane specificne tehnike testiranja za pracenje precišcavanja, i od toga iskazuje li, ili ne, peptibodi ili peptid mcrljivu aktivnost vezivanja. Razlicite tehnike pogodne za precišcavanjc poznate su onima obucenim u oblasti . One ukljucuju, na primer, taloženje amonijum sulfatom, PEG, antitelima (imunoprecipitacija), i slicne, ili denaturaciju toplotom za cime sledi centrifugiranje, hromatografski koraci kao što su afinitetna hromatograf~a (na pr., Protein-A-Sepharose), jonoizmenjivacka, gel filtracija, revcrsno-fazna, hidroksiapatitna i atinitetna hromatografija, izoelektricno fokusiranje, gel elektroforeza, i njhovc kombinacije i druge tehnike. Kako je opšte poznato u oblasti , veruje se da sc redosled izvodenja razlicitih faza precišcavanja može menjati. ili da sc neke faze mogu izostaviti, pri cemu sc i nadalje zadržava pogodni postupak za dobijanje znacajno precišccnog specificno precišcenog agensa. 00185 B 745 10 15 20 25 30 WO 03!057 134 75 PCT!US02/32657 Ne postoji opšti zahtev da se peptid ili peptibodi sadašnjeg pronalaska uvek obezbede u svom najprecišcenijem obliku. Naravno, ima se u vidu da ce dobijeni bitno manje specificno vezujuci agensi biti od koristi u nekim manifestacijama. Delimicno precišcavanjc može se postici u manje faza u kombinaciji, ili koristeci razlicite oblike iste opšte sheme prccišcavanja. Na primer, podrazumeva se da hromatog,rafija na katjonskoj izmenjivackoj koloni na HPLC aparatu obicno d<~e veci \"-nti broj\" nego ista tehnika koja koristi hromatografski sistem pod niskim pritiskom. Postupci koji daju niži stepen relativne precišcenosti mogu imati prednost u ukupnom bilansu peptida ili peptibodi , ili u zadržavm~ju aktivnosti vezivanja peptida ili peptibodi . Poznato je da migracija peptida ili polipeptida može varirati, neki put znacajno. u zavisnosti od razlicitih uslova od SDS l PAGE l Capaldi et at .. Biochem. Biophys. Res. Comm .. 76: 425 (1977)]. Stoga ce se smatrati da pod razlicitim uslovima elektroforeze mogu varirati nadene molekulske težine precišcenih ili delimicno precišcenih proizvoda ekspresije specificno vezujucih agenasa. Testovi vezivanja U imunološkim testovima vezivanja tipicno se koriste agensi za hvatanje u cilju specificnog vezivanja za, i cesto za imobilizaciju, analit ciljnog antigena. Sredstvo za hvatanje je grupa koja se spcciticno vezuje za analit. U jednoj manifestaciji sadašnjeg pronalaska, agens za hvatanje je peptid ili pcptibodi i li njihov Ji·agment koji sc specificno vezuje za Ang-2. Ovi imunološki testovi vezivanja su dobro poznati u oblasti (Asai, ed ., Methods in Cell Biology, Vol. 37, Antibodics in Cell Biology, Academic Press, Inc., New York (1993)]. U imunološkim testovima vezivanja cesto se koriste agensi za markiranje koji signaliziraju egzistenciju vezivnog kompleksa nastalog od agensa za hvatanje i antigena. Agens za obeležavanje mož. c biti jedan od molekula ukljucen u vezivni kompleks, tj. , on može biti obeleženi specificno vezujuci agens ili obeleženi anti specificni vezujuci agens antitela. Alternativno, agens za ohclcžavanje može biti treci mo leku] , obicno drugo antitelo, koje se vezuje za vezivni kompleks. Agens za oheležavanje mo ž.e biti, na primer, anti-specificni vezujuc i agens antitela sa markerom. Drugo antitelo, specificno za vezivni kompleks, može biti be7. 00185 B 755 10 15 20 25 30 WO 03/0571 34 76 PCT/US02/3 2Ci57 obeleživaca, ali može biti vezano cetvrtim molekulom specificnim za vrste antitela a ciji je clan drugo antitelo. Na primer, drugo anti telo može biti modifikovano grupom koja sc može detektovati, kao što je biotin, a koje sc može vezati za cetvrti molekul. kao što je enzimom obleženi streptavidin. Drugi proteini sposobni za specificno vezivanje za konstantne regione imunoglobulina, kao što su protein A ili protein G, mogu se takode upotrebiti kao sredstva za markirm~je. Ovi vezujuci proteini su normalni konstituenti ce! ijskih zidova bakterija streptokoka i iskazuj u jaku ne-imunogenu reaktivnost sa konstantnim regionima imunoglobulina iz razlicitih vrsta. Akerstrmn, J. Jmrnunol, 135 :2589-2542 (1985); Chaubert, Mod PathoL, I 0:585- 591 (1997). Posle upotrebe svake kombinacije agenasa može biti potrebna detaljna analiza, inkubacija i l ili faze ispiranja. Inkubacione faze mogu varirati od oko 5 sekundi do nekoliko sati, prioritetno od oko 5 minuta do oko 24 sata. Medutim , inkubaciono vreme zavisice od formata analize, analita, zapremine rastvara, koncentracije i slicno . Obicno, testovi se iz:vode na sobnoj temperaturi, iako se mogu izvoditi na razlicitim temperaturama. A . Nckompetitivni testovi vezivanja: Imunološki testovi vezivanja mogu biti nekompetitivnog tipa. Ovi testovi sadrže kolicinu kaptiranog analita koji se direktno analizira. Na primer, u prioritetnom \"sendvic\" testu, agens za kaptiranje (anti telo ili pcptibodi) mogu sc direktno vezati za cvrsti supstrat gde su imobilisani. Imobilisani agensi za kaptiranjc zatim hvataju (vezuju se za) antigen prisutan u testi ranom uzorku. Tako imobilisani protein se zatim vezuje za sredstvo za obeležavanjc, kao što je drugo m1titelo sa markerom. U drugom prioritetnom \"sendvic\" testu, drugom antitelu nedostaje marker, ali se može vezati za antitelo obeleženo specificnim markerom za vrstu anti tela iz koje je drugo anti telo izvedeno. Drugo anti telo može se takode modifikovati grupom koja se može detektovati, kao što je hiotin, za koji se treci obeleženi moleku!, kao što je strcptavidin, može specificno vezati . Videti Harlow i Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, Ch 14, Cold Spring Harbor Laboratory, NY (1988), ovde sadržana kao referenca. 00185 B 765 10 15 20 25 30 wo 03/057134 77 PCT!US02/32657 B. Kompetitivni testovi vezivanja: Imunološki testovi vezivanja mogu biti kompetitivnog tipa. Kolicina prisutnog analita u uzorku indirektno se odreduje merenjem kolicine zamcnjenog dodatog analita, ili konkurentno uklonjcnog, iz agensa za hvatanje (antitela ili peptibodi ) analitom prisutnim u uzorku. U jednom prioritetnom kompetitivnom testu ve/.ivanja, poznata kolicina analita, ohicno obeležcnog, dodaje sc uzorku i uzorak st zatim dovodi u kontakt sa agensom za hvatanje. Kolicina obeleženog analita vezanog za antitelo obrnuto je proporcionalna koncentraciji analita prisutnog u uzorku. (Videti, Barlow i Lane, A11tibodies, A Laboratory Manual, Ch 14, str. 579-583, supra) . LJ slcdecem prioritetnom kompetitivnom testu vezivanja, agens za hvatanje se imobiliše na cvrstom supstratu. Kolicina proteina vezana za agens za hvatanje može se odrediti ili merenjem kolicine prisutnog proteina u kompleksu protein l antitelo, ili alternativno merenjem kolicine preostalog nekompleksiranog proteina. Kolicina proteina može se detektovati obczbedivanjcm obeleženog proteina. Barlow i Lane (s-upra). U .i oš jedan prioritetnom kompetitivnom testu vezivanja koristi se inhibicija haptena. U ovom testu sc poznati analit imobiliše na cvrstom supstratu. 1 Jzorku se dodaje poznata kolicina antitela, a zatim uzorak dolazi u dodir sa imobilisanim analitom. Kolicina antitela vezana za imobilisani analit obrnuto je proporcionalna kolicini analita prisutnog u uzorku. Kolicina imobilisanog antitela može se odrediti detektovanjem imobilisane frakcije antitela ili frakcije koja zaostaje u rastvom. Detekcija može biti direktna kada je antitelo obeleženo, ili indirektna kada se potom doda obclcžena grupa koja se specificno vezuje za antitelo, kako je gore opisano. C. Upotreba kompetitivnih testova vezivanja: Kompetitivni testovi vezivanja mogu se koristiti za odredivanje ukrštene reaktivnosti cime se omogucava onome obucenom u oblasti da odredi da li je proteinski ili enzimski kompleks, koji je prepoznat od strane peptibodi sadašnjeg pronalaska, poželjan protein a ne ukršeno reagujuci moleku! , ili da odredi da li je peptibodi specificna za antigen ne vezujuci se za antigene koji nisu u vezi. U 00185 B 775 10 15 20 25 30 wo 03/057134 78 PCT/US02/32657 testovima ovog tipa antigen sc imobili šc za cvrstu podlogu i analizi sc doda nepoznata smesa proteina, koja sc takmici u vezi vanju peptibodi za imobilisani protein. Moleku! koj i se takmici vezuje se za jedan ili više antigena koji nisu u vezi sa datim antigenom. Sposobnost proteina da sc takm ice u vezivanju peptibodi za imobilisani antigen pored i sc sa vezivanjem istog proteina koji j e bio imobilisan za cvrstu podlogu da bi se odredila ukrštcna reaktivnost smesc proteina. D. Dru gi testovi vezivanja Sadašnji pronalazak obezbedt~je i Western blot metode za detekciju ili kvan ti fik aciju prisustvu Ang-2 u uzorku. Primenjena tclmika obicno ukljucuje razdv<~janje proteina iz uzorka gel elektroforezom na osnovu molekulskih težina i vezivanjem proteina za pogodnu cvrstu podlogu, kao što je nitrocelulozni filter, najlonski filter, ili derivatizivani najlonski filter. Uzorak se inkubira zajedno sa pcptiboui, ili njenim fragmentima, koja sc specificno vez~je za Ang-2 a detektuje se nasta li kompleks. Ove peptibodi se mogu direktno obeležiti, ili se alternativno mogu potom detektivati pomocu obeleženih anti tela koja se specificno vez~ju za peptibodi. Dijagnost icni testovi Dcrivatni vezujuci agensi, kao što su peptidi i peptibodL ili njihovi fragmenti, sadašnjeg pronalaska su korisni za dijagnozu uslova ili bolesti karaktcrisanom ekspresijom Ang-2 iLi podjedinica, ili u testovima kojima se prate pacijenti koji su tretirani sredstvima za indukovanje Ang-2, njegovih fragmenata, antagonsita ili inhibitora aktivnosti Ang-2 . Dijagnosticni testovi za Ang-2 ukljucuju metode u kojima se koriste peptibodi i obeleživac za detekciju Ang-2 u tccnostirna lj udskog organizma ili ekstraktima celija ili tkiva. Pcptibodi sadašnjeg pronalaska mogu se koristiti modifikovane ili nemodifikovane. U prioritetnom dijagnostickom testu peptibodi se obeležavaj u vezivanjem na pr., markera ili reporter molekula. Poznato su mnogo razlicitih obcleživaca i reporter molekula, neki od njih su vec opisani ovde. Prioritetno, sadašnji pronalazak je koristan za dijagnozu bolest i ljudi . U oblasti su poznati razliciti protokoli za mcrenje Ang-2 proteina pomocu peptibodi specificnih za dati protein. Primeri ukljucuju testove : enzimski vezani 00185 B 785 10 15 20 25 30 WO 03/057134 79 PC:T/US02i3 2657 imunosorbcntni test (EUSA), radioimunotcst (RIA) i sortirat~je fluorescencom aktiviranih celija (FACS). Poželjan je dvopolož.ajni monoklonalno zasnovani imunotest koji koristi monoklonalna antitela koja reaguju sa dva epitopa, što sc medusobno ne ometaju, sa Ang-2, ali može se upotrebiti i test vezivanja. Ovi testovi opisani su, na primer, u Maddox el at, J Exp. Med., 158: 121 l (1983). U cilju da obezbedivanja osnove za dijagnozu, obicno se odreduju normalne ili standardne vrednosti humane Ang-2 ekspresije. Ovo odredi vanje može se ostvariti kombinovanjem telesnih tecnosti ili celijskim ekstraktima iz normalnih subjekata. poželjno ljudi, sa peptibodi za Ang-2, pod uslovima pogodnim za formiranje kompleksa koji su dobro poznati u oblasti. Kolicina nastajanja standardnog kompleksa može se kvantifikovati uporedenjem vezivanja peptibodi za poznate kolic ine Ang-2 proteina, sa kontrolnim i uzorkom oboljenja. Zatim sc standardne vrednosti dobijene iz normalnih uzoraka uporeduju sa vrednostima dobijenim iz uzoraka iz potencijalno obolelih subjekata. Devijacija izmedu standardne vrednosti i vrednosti dobijene iz uzorka subjekta navodi na ulogu Ang- 2 u obolelom stanju. tJ dijagnosticke svrhe, u nekim manifestacijama tipicno ce peptibodi ili peptidi sadašnjeg pronalaska biti obeleženi grupom koja se može detektovati. Grupa koja se može detektiovati može biti bilo koja sposobna da proizvede, direktno, ili indirektno, signal koji se može detektovati . Na primer, grupa koja se može detektovati može biti radioizotop, kao štoje 3 H, 14 C, 12 P, ~ 15 S, ili 125 1, fluorescentno ili hemiluminiscentno jedi njenje, kao što je fluorescein izotiocijanat, rodamin, ili luciferin, ili neki enzim, kao što je alkalna fosfataza, ~-galaktozidaza, ili peroksidaza iz rena. Bayer et al, Meth. E nz., 184: 138-163, ( 1990). Bolesti Sadašnji pronalazak obezbeduje vezujuci agens kao što je peptid, peptibodL ili fragment, varijante ili njihove derivate koji se vezuju za Ang-2 koji je koristan u lecenju humanih oboljenja i patoloških stanja. Agensi koji moduliraju vezujucu aktivnost Ang-2, ili druge celularne aktivnosti, mogu se koristiti u kombinaciji sa drugim terapeutskim agensima u cilju povecanja nj hovih terapeutskih efekata ili u cilju smanjenja potencijalnih sporednih efekata. U jednom aspektu, sadašnji pronalazak obezbeduje reagense i metode 00185 B 795 10 15 20 25 30 wo 03/057l34 80 J>CT/US02/3 265 7 korisne u lecenju oboljenja i stanja karakteri sanim nestabilnim ili nenormalnim nivoima aktivnosti Ang-2 u celiji. Ova oboljenja ukljucuju rak, i druga hiperproliferativna stanja, kao što je hiperplazUa. psorijaza, kontaktni dermatitis, imunološka oboljenja, i neplodonost. SaJa.šnji pronalazak takode obezbeduje metode leccnja raka kod životinja, ukljucujuci ljude, ukljucujuci primenu efektivne kolicine specificno vezuj uceg agensa životinji, kao što su peptibodi, koja inhibira ili smanjuje aktivnost Ang-2. Pronalazak je dalje usmeren na postupke za inhibiran je rasta celija raka, ukljucujuci procese ce l ul arne prolifcracije, in vazi v nosti, i metastaza u biološkim sistemima. Metode ukljucuju upotrebu jedinjenja sadašnjeg pronalaska kao inhibitora rasta cclUa raka. Poželjnije, primenjenim postupcima se inhibira ili smanjuje rast celija raka, invazivnosti, metastaza, ili ucestalost tumora u ž i vo ti njama, kao što su sisari. Postupci sadašnjeg pronalaska lako se mogu adaptirati za upotrebu u sistemima za testiranje na pr., testiranje rasta celija raka i njihove osobine, kao i identifikovanje jedinjenja koja deluju na rast celija raka. Kanccri koji se mogu leciti metodama sadašnjeg pronalaska poželjno se javljaju kod sisara. Sisari ukijucuju, na primer, ljude i druge primate, kao i ljubimce ili družbene životinje kao što su kucici i macke, laboratorijske životinje kao što su pacovi, miševi i zecevi, i domace životinje kao što su konji, svinje, ovce i stoka. Tumori i neoplazme ukljucuju rast celija tk i va kod koi ih je multiplikacija nekontrolisana i progresivna. Neki rast je benignog karaktera, ali drugi su maligni i mogu dovesti do smrti organizma. Maligne neoplazme ili rak sc razlikuju od benignog rasta po tome što, pored iskazane agresivne celularne proliferacije, one mogu napasti okolno tkivo i metastazirati. Štaviše, maligne ncoplazmc se karakterišu time što pokazuju veci gubitak u diferencijaciji (veca dediferencijacija), i po svojoj organizaciji u odnosu jedne na drugu i okolna tkiva. Ova osobina zove sc \"anap1azija.\" Ncoplazme koje se mogu Jeciti sadašnjim pronalaskom ukljuct~ju i cvrste tumore, tj. , karcinome i sarkome. Karcinomi ukljucuju one maligne neoplazme izvedene iz epitelinih celija koje se inliltriraju (upadaju) u okolna tkiva i rczultuju metastazama. Adenokarcinomi su karcinomi izvedeni iz tkiva žljczda, ili koji cine prepoznatljive strukture žljezda. Jedan druga široka kategorija raka ukljucuje sarkome, koji su tumori cije su celije uklopljene u 00185 B 805 10 15 20 25 30 wo 03/057134 81 PCT/US02/3 2657 fibrilalrnu ili homogenu supstancu sl icnu cmbrionskom veznom tkivu. Pronalazak takodc omogucava lecenje raka mijclidnih ili Jimfoidnih sistema, uk!jucuj uci leukemije, limfome i druge vrste raka koji sc tipicno ne javljaju kao rnasivni tumor, vec se distribuiraju vaskularnim ili limforetikularnim sistemima. Vrs te celija raka ili tumora koji se mogu Jeciti prema sadašnjem pronalasku ukljucuju, na primer, tumor što proizvodi ACTH, akutnu limfocitnu leukemiju, akutnu nelimfocitnu leukemiju, rak adrenalnog kortcksa. rak bešikc, rak mozga, rak dojke, cervikalni rak, hronicnu limfocitnu leukemiju, hronicnu mijelocitnu leukemiju, rak debelog creva, kutanu lim1omu T celija, rak endomctrijuma, rakjcdnjaka, Ewing-ov sarkom, rak žucnog mchura, leukemiju vlaknastih celija, rak glave i vrata, Hodgkin-ov limfom. Kaposi-jev sarkom, rak bubrega, rak jetre, rak pluca (malih celija i ne-malih ce lija) , maligno izlivanje trbušne maramice, maligno izlivanje plucne maramice, melanom, mezoteliorn, multipli mijelom. neuroblastom, gliom , ne-Hodgkin-ov limfom, osteosarkom, rak jajnika (celije klice), rak pankreasa, rak penisa, rak prostate, retinoblastom, rak kože, sarkom mekog tkiva, karcinome ljuspastih celija , rak stomaka, rak testisa, rak tiroidee, trofoblastne neoplazme, rak uterusa, rak vagine, rak stidnice, i Wilms-ov tumor. Sadašnji pronalasak je narocito ovde il ustro van upucivanjem na lecenje nekih tipova eksperimentalno definisanih tipova raka. U ovim ilustrativnim lccenjima koriste se vrhunski in vitro i in viva modeli. Ovi postupci se mogu koristiti z.a idenri\"fikaciju agenasa za koje se može ocekivati da su efikasni u in viva protokolima tecenja. Medutim, smatrace se da postupak sadašnjeg pronalaska nije ogranicen na date tipove tumora, vec se proširuje na bilo koji cvrsti tumor izveden iz bilo kod sistema organa. Tipovi raka cija je invazivnost ili metastaza povezana sa Ang-2 ekspresijom i l i aktivnošcu j e posebno podložna inhibisanju ili cak je indukovana regresija sredstvima sadašnjeg pronalaska. Pronalazak sc može primeniti ukljucivanjemjedinjenja sadašnjeg pronalaska kao što je peptibodi u kombinaciji sa drugim hemoterapeutskim sredstvom protiv raka, kao što je bilo koj i hcmoterapeutski agens. Komb inacija 00185 B 815 10 15 20 25 30 WO 03/057 134 82 PCT/US02/3 2657 specificno vezujuceg agensa sa takvim drugim agensima može potencirati hemotcrapcutski protokol. Brojni hemoterapeuski protokoli ce se sami prikazati u glavi obucenih lekara kao pristupacni za inkorporaciju u postupak sadašnjeg pronalaska. Može se koristiti bilo koji hemoterapeuski agens, ukljucujuci alkilujucc agense, antimetabolite, hormone i antagonistc, radioizotope, kao i prirodne proizvode. Na primer, jedinjenje sadašnjeg pronalaska može se primeniti zajedno sa antibioticima kao što je doksorubicin i dmgi antracikhnski analozi, azotovc slacice kao što je ciklofosfamid, primidinovi analozi kao što je S-fluorouraci l, cisplatina, hidroksiurea, taksol i njegovi prirodni i sinteticki derivati, i slicno . Kao drugi primer, u slucaju mešovitih tumora, kao što je adenokarcinoma dojke, gde t umori uk l .i ucuju gonadotropin-zavisne i gonadotropin-nezavisne celije , jedinjenje se može primeniti zajedno sa leuprolidom ili goserelinom (sinteticki peptidni analozi LH-RH). Drugi antincoplasticni protokoli ukljucuju upotrebu tetraciklinskih jedinjenja uz drugi modalitet lccenja , na pr. , hirurgijom, radijacijom, itd., ovde nazvano i \"pomocni antineoplasticni modaliteti.\" Tako, postupak sadašnjeg pronalaska se može primeniti zajedno sa takvim konvencionalnim protokolom što je dobro za smanjivanje sporednih efekata i povecanje efikasnosti. Sadašnji pronalazak tako obezbeduje jedinjenja i postupke korisne u leccnju velikog broja tipova raka, ukljucujuci cvrste tumore i leukemije. Tipovi raka koji sc mogu leciti, ukljucuju ali nisu ograniceni na, adenokarcinome dojke, prostate, i debelog creva, sve oblike brohnogenih karcinoma pluca; mijeloida; mclanoma; hepatoma; neuroblastoma; papiloma; apudoma; horistoma; branhioma; malignog karcinoidnog sindroma; karcinoidno oboljenja srca; karcinoma (na pr., Walker, bazalnih celija, bazoskvamni, Brown-Pearce, duktalni, Ehrlich-ov tumor, Krebs 2, merkel celija, mucinozne, ne-male celije pluca, ovsena celija, bradavica, tvrdi, bronhiolarni, bronhogeni, skvamoidnih celija, i tranzicionih celija); histiocitnih oboljenja; leukemija; maligna histiocitoza; Hodgkin-ova bolest; karcinom imunoproliferativnih malih celija pluca ; nc-Hodgkin-ovog limfoma; plazmaci toma; rctikuloendotelioza; melanoma; hondroblastoma; hondroma; hondrosarkoma; fi hroma; fibrosarkoma; tumori velikih celija; histiocitoma; lipama; liposarkoma; mezotclioma; miksoma; miksosarkoma; osteoma; osteosarkoma; hordama; kraniofaringioma; disgerminoma; hamartoma; mczenhimoma; 00185 B 825 10 15 20 25 30 \\VO 03i057 134 83 PCT/US02/32657 meooncCroma; miosarkoma; amcloblastoma; cementoma; odontoma; tm·atoma; timoma; Lofoblasticni tumor. Dalje, sledeci tipovi raka mogu se takode leciti: adcnom; holangiom; holesteatom; ciklindrom; cistadenokarcinom; cistadenom; tumor granuloznih celija; ginandroblastom; hepatom; hidradenom; tumor ostrvca celija; tumor Leydig-ovih celija; papilom; tumor Sertoli celija; tumor theca celija; leiomiom; leiomiosarkom; mi.oblastom ; miom; miosarkom; rabdomiom; rabdomiosarkom; ependimom; ganglioncurom; gliom; meduloblastom; meningiom; neurilcmmom; neuroblastom; ncuroepiteliom; neurofibrom; neurom; paragangliom; paragangliom nonhromafin; angiokeratom; angiolimphoidna hiperpla7.ia sa eosinofilijom; skleroza angiom; angiomatozis; glomangiom; hernangioendotcliom; hemangiom; hemangiopericitom; hemangiosarkom; limfangiom; limfangiomiom; limfangiosarkom; pincalom; karcinosarkom; hondrosarkom; cistosarkom filodes; fibrosarkom ; hcmangiosarkom; leiomiosarkom; leukosarkom; liposarkom; limfangiosarkom; miosarkom; miksosarkom; karcinom jajnika; rabdomiosarkom; sarkom; neoplazme; nerotibromatozis; i cervikalna displazija. Drugi aspekt sadašnjeg pronalaska koristi materijale i metode sadašnjeg pronalaska u cilju sprecavanja i l ili tecenja bilo kog hiperproliferativnog stanja kože ukljucujuci psorijazu i kontaktni dermatitis ili druga hiperproliferativna oboljenja. Pokazano je da pacijenti sa psorijazom ili kontaktnim dermatitisom imaju povišenu aktivnost Ang-2 unutar tih ozleda [Ogoshi et al., J. Jnv. DermatoL, 110:818-23 (1998) ]. Poželjno je da se specificno vezujuci agensi specificni za Ang- 2 koriste u kombinaciji sa drugim farmaceutskim agensima u lecenju ljudi koji ispoljavaju ove klinicke simptome. Specificno vezujuci agensi mogu se primcniti koristeci bilo koj i od razlicitih nosaca ovde opisanim putevima prim ene kao i drugim nosacima koji su dobro poznati onima obucenim u oblasti. Drugi aspekti sadašnjeg pronalaska ukljucuju lecenje razlicitih retinopatija (ukljucujuci dijabctsku retinopatiju i makulamu degencraciju iT.azvanu starenjem) povezanih sa angiogenezom, kao i oboljenjima l bolestima ?..enskog reproduktivnog trakta kao što je endometrioza, matericni fibroidi. i druga takva stanja povezana sa disfunkcijom vaskulame proliferacije (ukljucujuci mikrovakularni rast endometrijuma) tokom ženskog reproduktivnog ciklusa . .loš jedan aspekt sadašnjeg pronalaska odnosi se na lecenje abnormalnog 00185 B 835 10 15 20 25 30 WO 03/057134 84 PCI'/US02/32657 vaskularnog rasta ukljucujuci cerebralne arteriovenske nakaznosti (A VMs) gastrointcstinalne povrede i oporavka mukoze, ulceracije gastroduodenalnc mu koze kod pacijenata sa istorijom pcpticnog oboljenja grizlice, ukljucujuci ishemiju usled kapi , široki spektar plucnih vaskularnih oboljenja kod bolesti jetre i portalne hipertenz ij e kod pacijenata sa nehepaticnom portalnom hipertenzijom. Drugi aspekt sadašnjeg pronalaska jeste prevencija raka koristeci jedi njenja i metode obezbedenim sadašnjim pronalaskom. Takvi reagensi ukljucuju specificno vezujucc agensc kao što su peplibodi protiv Ang-2. Fannaceutske formulacije Farmaceutske formulacije Ang-2 specificno vezujucih agenasa kao što su peptibodi spadaju u polje sadašnjeg pronalaska. Farmaceutske fonnulacije ukljucujuci antitela detaljno su opisane u, na primer, US patentu 6,171 ,586, Lam et al., izdat 09 . januara 2001. Takve formulacije ukljucuju terapeutsku ili profilakticki efektivnu kolicinu specificno vezujuceg agensa kao što je anti telo, ili fragment, varijanta, derivate, ili njegove fuzioni derivate kako je ovde opisano, u smcsi sa fam1aceutski prihvatljivim agensom. U prioritetnoj manifestaciji, farmaceutske formulacijrc ukljucuju antagonisticke specificno vezujuce agcnse koji modulišu parcijalno ili potpuno najmanje jednu biološku aktivnost Ang-2 u smesi sa farmaceutski prihvatljivim agensom . Tipicno, specificno vezujuci agensi su dovoljno precišceni u cilju primene u životinji . Farmaceutska formulacija može sadržavati materijal za formulisanjc - modifikovanje, održavanje ili prezervaciju, na primer, pH, osmolamosti, viskoznosti, bistrine, boje, izotonicnosti, mirisa, sterilnosti, stabilnosti, brzine rastvaranja ili oslobadanja, adsorpcUu ili penetraciju formulacije. Pogodni materijali za formulaciju ukljucuju , ali nisu ograniceni na, aminokiseline (kao što je glicin, glutamin, asparagin, arginin ili lizin), antimikrobna sredstva, antioksidante (kao što je askorbinska kiselina, natrijum sul fit ili natijum hidrogensulfit), pufere, (kao što je boratni , bikarbonatni, Tris-HC!, citratni, fosfatni, druge organske kiseline), agensi za povecavanje zapremine (kao što je mani to l i l i glicin), helataciona sredstva l kao što je etilendiami ntetrasircetna kiselina (EDTA )J ~ kompleksirajuca sredstva (kao što je kafein, polivinilpirolidon, beta ciklodekstrin ili hidroksipropil-beta-ciklodekstrin); punioci; monosaharidi ; proteini 00185 B 845 10 15 20 25 30 wo 03/057134 85 PCTiUS02!32657 (kao što je serum albumin, gelatinc ili imunoglobulini); boje; zacini i sredstva za razblaživanje; emulzitlkatori; hidrofilni polimeri (kao što je polivinilpiro!idon); polipeptidi niske molekulske težine; kontra joni koji formiraju soli (kao što je natrijum); konzervansi (kao što je benzalkonijum hlorid), ben;.oeva kiselina, salicilna kiselina timerosal, fenetil alkohol, metilparaben, propilparaben, hlorheksidin, sorbinska kiselina ili vodonik peroksid), rastvaraci (kao što je glicerin. propilcn glikol ili polietilen glikol), šcccrni alkoholi (kao što je manitol ili sorbitol), agensi za suspendovanje, površinski aktivni i v lažcci agensi (kao što su pluronici. PEG, sorbitanski cstri, polisorbati kao što je polisorbat 20, polisorbat 80, triton, trometamin, lecitin, holesterol, tiloksapal); agensi što poveca vaj u stabilnost (saharoza ili sorbitol); agensi što povecavaju tonus (kao što su halogenidi alkalnih metala (poželjno natrijum ili kalijum hlorid, manitol sorbitol); sredstva za transport (delivery vehicles); razblaživaci; ekscipijenti; i l ili farmaceutski aduvanti (pomocna sredstva). (Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition. A.R. Gennaro, ed., Mack Publishing Company, 1990). On~j obucen u oblasti odredice optimalnu farmaceutsku fonnulaciju u zavisnosti od, na primer, nameravanog nacina pri mene, vrste dotura i željene doze. Videti na primer, Remington's Pharmaceutical Sciences, supra. Takve fonnulacije mogu uticati na fizicko stanje, stabilnost, brzinu oslobadanja in vivo, brzinu in vivo ekskrecije specificno vezujuceg agensa. Primarni transporter ili nosac u farmaceutskoj formulaciji može biti po svojoj prirodi vodeni ili ne-vodeni . Na primer, pogodni transporter ili nosac može biti voda za injektiranje, fiziološki rastvor soli ili veštacka cerebrospinalna tecnost, po mogucstvu sa dodatim drugim materijalima uobicajenim za formulacije namenjene parentcralnoj primeni. Neutralni puferovani rastvor soli ili rastvor soli pomešan sa serum albuminom su dalji primeri transportera. Drugi primcri farmaceutskih formulacija ukljucuju Tris pufer pH 7.0-8.5, ili acetatni puffer pH 4.0-5.5, koji mogu dalje ukljucivati sorbitol ili njegovu pogodim zamenu. U jednoj manifestaciji sadašnjeg pronalaska formulacije vezujuceg agensa mogu se pripremati za skladištenje mešanjem odabranih jedinjenja željenog stepena cistoce 00185 B 855 10 15 20 25 30 v.; o 03/057134 86 PCT/US02i32657 sa opcinnim agensima za fonnulisanje (Remington's Pharmaceutical Sciences, supra) u obliku liofilizovanog kolaca ili vodenog rastvara. Dalje, proizvod, vezujuci agens, može biti formulisan kao liofilizat koristeci odgovarajuce cxcipijcnte kao što je saharoza. Framaceutske formulacije se mogu odabrati za parenteralnu primenu. Alternativno, formulacije se mogu odabrati za inhalaciju ili za enteralnu primenu kao što su oralna, slušna, oftalmološka, rektalna ili vaginalna. Preparacija takvih farmaceutski prihvatljivih formulacija jeste unutar obucenosti u oblasti. Komponente za formulaciju prisutne su u koncentracijama prilagodenim mestu pri mene. Na primer, puferi se koriste da održe formulaciju na fiziološkom pil ili na nešto nižem pH, tipicno unutar pH opsega od oko 5 do oko 8. Kada se ima u vidu parenteralna primena terapeuske formulacije za upotrebu sadašnjeg pronalaska mogu bili u ne-pirogenom obliku, parenteralno prihvatljivom vodenom rastvoru ukljucujuci željeni specificno vezujuci agens u farmaceutski prihvatljivom nosacu. Narocito pogodan nosac za parenteralno injektiranje jeste sterilna destilovana voda u kojoj se vezujuci agens formu! iše kao sterilni, izotoni rastvor koji sc dobro cuva . Još jedan preparat može ukljuciti formulaciju željenog molekula sa agensom, kao što su injektabilne mikrosfere, biodegradativne cestice , polimernajedinjenja (polimlccna kiselina, poliglikolna kiselina). perle, ili lipozomi, koji omogucavaju kontrolisana ili podržano oslobaelanjc proizvoda koji se onda može isporuciti (primeniti) injektiranjem depoa. I 1ialuronska kiselina se može takode upotrebiti, i to može imati efekta u ostvarivanju podržanog delovanja u cirkulaciji. Drugi pogodni nacini unošenja željenog molekula ukljucuju implantirane sprave za isporuku (primenu) Jeka. U drugom aspektu, fmmaceutske fom1ulacije pogodne za parenteralnu primenu mogu se formulisati kao voden i rastvori , poželjno u fiziološki pogodnim pufcrima kao što su Hanks-ov rastvor, ringer.ov rastvor ili fiziološki puferovani rastvor soli. Vodene suspenzije za injektiranje mogu sadržavati supstance koje poveca vaj u viskozitet suspenzije, kao što su natrij um karboksi metil celuloza, sorbitol ili dekstran. Dodatno, suspenzije aktivnih jedinjenja sc mogu pripraviti kao odgovarajuce uljne suspenzije za injektiranje. Pogodni lipofilni rastvaraci ili nosaci ukljucuju masne kiseline, kao što su sezamovo ulje ili sinteticki estri masnih kiselina, kao što su etil oleat, trigliceridi ili lipozomi . Ne-lipidni polikatjoni 00185 B 865 10 15 20 25 30 wo 03/057 134 87 PCT/US02t:\\ 26 57 amino polimera sc takode mogu koristiti za primenu. Opciono, suspenzija može takode sadržavati pogodne stabilizatorc ili agense radi povecanja rastvorljivosti jedinjenja i time omoguciti preparaciju visoko koncentrovanih rastvara. U drugoj manifestaciji, fam1aceutske formulacije se mogu fonnulisati kao suvi prah za inhalaciju. Na primer, vezujuci agens može biti f(mnulisan kao suvi prah za inhalaciju . Inhalacioni rastvori polipeticlnog molekula ili molekula nukleinske ki seline mogu se fonnulisati i sa propelantom za aerosol. U još jednoj manifestaciji , rastvori se mogu pretvoriti u fini sprej . Plucna pri mena je dalje opisana u PCT prijavi br. PCT l US94/001875 , u kojoj je opisana plucna primena hemijski modifikovanih proteina. lsto tako se ima u vidu da se neke formulacije mogu oralno primeniti. U jednoj manifestaciji sadašnjeg pronalaska, molekuli vezuj uceg agensa koji se aclministriraju na ovaj nacin mogu se formulisati sa ili bez onih nosaca koji se obicno upotrebljavaju u sastavljanju cvrstih doza kao što su tablete i kapsule. Na p1imer, kapsule se mogu osmisliti da otpuštaju aktivni deo formulacije na mestu u gastrointestinalnom traktu kada je maksimalna bioraspoloživost i minimalna pre sistemska degradacija. U cilju olakšanja apsorpcije molekula vez~juceg agensa mogu se ukljuciti dodatna sredstva. Razblaživaci , zacini, voskovi niske tacke topljenja, biljna ulja, podmazivaci , agensi za suspendovanje, agensi za dezintegracUu tableta, a mogu se uporehiti i vezivna sredstva. Farmaceutske formulacije za oralnu primenu se mogu formulisati i koristeci farmaceutski prihvatljive nosace dobro poznate u oblasti doziranja pogodnih za oralnu primenu. Takvi nosaci omogucavaju da se farmaceutske formulacije u cilju gutanja od strane pacijenta tormulišu kao tablete. pilule, dražce, kapsule, tecnosti , gelovi. sirupi, guste suspenzije, suspenzije i slicno. Farmaceutske formulacije za oralnu primenu mogu se dobiti kombinovanjem aktivnih jedi~jenja sa cvrstim ekscipijentom i preradom dobije smese u granule (opciono posle mlevenja) u cilju dobijanja srži tablete ili dražcc. Mogu se dodati, ukoliko se to želi, pogodna pomocna sredstva. Pogodni ekscipijcnti ukljucuju ugljenohidratne ili proteinske ponioce, kao što su šeceri , ukljucujuc i laktozu, saharozu, manitol i sorbitol, kukuruzni skrob, pšenicu, pirinac , krompir, i druge biljke; celulozu, ako što je metil celuloza, hidroksipropilmetil celuloza, ili natrijum karboksimetilceluloza; gurne, ukljucujuci arabiku i 00185 B 875 10 15 20 25 30 wo 03/057134 88 PCT/US02!32657 tragantovu gumu, i proteine, kao što su žclatin i kolagen. Ukoliko se to želi, mogu sc dodati dezintegracioni agensi ili rastvaraci, kao što su ukršteno vezani polivinil pirolidon , agar, ili alginska kiselina ili njena so, kao što je natrij im alginat. Sadržaj dražee može se upotrebiti zajedno sa pogodnim zaštitnim slojem , kao što su koncentrovani rastvori soli, koji takode mogu sadržavati gumu arabiku, talk, polivinilpirolidon, karbopol gel, polietilen glikol i l ili titanijum dioksid, rastvore laka i pogodne organske rastvaracc ili smcsc rastvaraca. Boje ili pigmenti mogu se dodati tabletama ili oblogama dražea radi identifikacije proizvoda ili u cilju obeležavanja kolicine aktivnog jedinjenja, ~j .. do7..e. Farmaceutske preparacije koje se oralno upotrebljavaju ukljucuju i kapsule koje se gurnu napravljene od želatina, kao i meke, zatopljene kapsule napravljene od želatina i zaštitnog sloja, kao što je glicerol ili sorbitol. Kapsule koje se gurnu mogu sadržavati aktivne sastojke pomcšane sa poniocima ili vezivnim sredstvima, kao što su laktoza ili razlicite vrste skroba, podmazivacima , kao što je talk ili magne z.ijum stearat, i, opciono, stabilizatorima. U mekim kapsulama aktivna jedinjenja mogu biti rastvorena ili suspendovana u pogodnim tecnostima, kao što su masna ulja, tecnost ili tecni polietilen glikol sa, ili bez, stabilizatora. Druga farmaceutska f(.)rmul acija može ukljuciti efektivnu kolicinu vezujuccg agensa u smesi sa netoksicnim ekscipijentima pogodnim za proizvodnju tableta. Rastvarajuci tablete u sterilnoj vodi, ili drugom pogodnom nosacu, rastvori se mogu pripraviti u obliku jedinicnih doza. Pogodni ekscipijcnti ukljucuju, ali nisu ograniceni na, inertne razblaživacc, kao što su kalcijum karbonat, natrijum karbonat ili bikarbonat, laktoza, ili kalcijum fosfat; ili vezivni agensi, kao što su skrob, stearinska kiselina, ili talk. Dodatna farmaceutska kompozicija bice ocig ledna onima obucenim u oblasti , ukljucujuci formulacije koje ukljucuju molekule vczujuceg agensa u formul acijama podržane ili kontrol isane isporuke. Tehnike za formulisanje razlicitih drugih podržanih ili kontrolisanih nacina transporta, kao što su lipozoms ki nosaci, biodegradativne mikrocesticc ili porezne perlice i injektirani depoi , takode su poznati onima obucenim u oblasti. Videti na primer, PCT/US l)J/00829 u kome je opisano kontrolisana otpuštanje poreznih polimernih mikrocestica za isporuku farmaceutskih formulacija. Dodatni primeri preparacija podržanog otpuštanj a ikljucuju polupropustljive polimerne matrice u obliku 00185 B 885 10 15 20 25 30 wo 03/057134 89 PCT/US02/32657 oblikovanih predmeta, na pr., filmova , ili mikrokapsula. Matrice za podržano otpuštanje ukljucuju poliestrc, hidrogcle, polilaktide (U.S. 3,773,919, EP 58,481 ), kopolimere L-glutaminske kiseline i gama-etil L glutamat lSidman et al, Biopo!ymers, 22:547-556 (1983)], poli (2-hidroksietil-metakrilat) [Langer et al .. J Biomed Mater. Res ., 15:167-277, (1981 )] i (Langer et al., Chem. Tech , 12:98- 1 05(198:?.)), etilen vinil acetat (Langer et al., supra) ili poli-D(-)-3-hidroksibutcmu kiselinu (EP.l33 ,988) Formulacij e podržanog otpuštanja takode ukljucuju lipozornc, koji se mogu pripraviti bilo kojom od nekoliko metoda poznatih u oblasti. Videti na pr., Eppstein et al.. Proe. Nat!. Acad. Sci. (USA), 82 :3688-3692 (1985) ; EP 36,676; EP 88,046; EP 143,949 . Za farmaceutske formul acije koje se koriste za in viva primenu je tipicno da moraju biti sterilne. To se može postici filtrovanjem kroz sterilne membrane za filtraciju. Kada sc formulacija liofilizuje, steri lizacija sc može izvršiti pre ili posle liofilizacijc i rekonstitucije. Fonnulacija za parenteralnu primenu može se cuvati i liofilizovanom obliku ili kao rastvor. Dodatno, parenteralne formulacije obicno se drže u kontejnerima snabdevenim sterilnim pristupom, na primer, vrecica ili bocica sa intravenoznim rastvaram snabdevena je zapušacem koji se može probiti iglom za supkutano injektiranje. Kada se jednom izvrši farmaceutska formu lacija, može se cuvati u sterilnim bocicama kao rastvor, suspenzija, ge l, emulzija, cvrsti materij al, ili kao dehidratisani ili liofilizovani prah. Takve formulacije mogu se cuvati kao gotovi oblici pripremljeni za upotrebu, ili u obliku (na pr., liofilizovanom) koji zahteva rckonstituciju pre pn mene. U specificnoj manifestaciji, sadašnji pronalazak usmeren je na pribor za produkcijujedinicajedinicnih doza. Svaki pojedinacni pribor sadrži prvi kontejner sa suvim proteinom i drugi kontejner sa vodenom formulacijom. U okviru sadašr~jeg pronalaska ukljuceni su i pri bori koji sadrže prethodno napunjene špricevc sa jednim ili više pregrada (na pr., tecni spricevi i liošpricevi). Efektivna kolicina farmaceutske formulacije koj a se terapeutski koristi zavisice. na primer, od terapeutskog konteksta i ciljeva. Onaj obucen u oblasti razumece da ce pogodni nivoi doziranja za lecenje varirati delimicno u zavisnosti od od molekula koji se isporucuje, indikacije za koji moleku! se koristi vezujuci agens, nacina pri mene, i velicine (telesne težine, telesne površine ili velicine 00185 B 895 10 15 20 25 30 wo 03/057134 90 PCT/US02!32657 organa) i stanja (godina i opšteg zdravlja) pacijenta. Prema tome, lekar može ti trovati dozu i kodifikovati nacin primene da bi se dobio optimalni terapeutski efekat. Tipicno doziranje može biti u opsegu od oko 0.1 mg/kg do oko l OO mg/kg ili više, u zavisnosti od gore spomenutih faktora. U drugim manifestacijama. doza može varirati od 0.1 mg/kg do oko l OO mg/kg; ili l mg/kg do oko l OO mg/kg; ili 5 mg/kg do oko l OO mg/kg. Terapeuski efektivna doza se može za svako jedinjenje inicijalno odrediti u testovima celijske kulture ili na životinjskim modelima kao što su miševi, pacovi, zecevi. psi, svinje ili majmuni. Životinjiski model može se takode upotrebiti za odredivanje odgovarajuceg opsega koncentracije u nacina primene. Takva informacija se može iskoristiti za odredivanje korisnih doza i nacina primene kod ljudi. Tacna doza odreduje se u svetlu cinioca vezanih za subjekat koji se leci. Doziranje i primena se podešavaju da bi se omogucili dovoUni nivoi aktivnog jedinjenja ili da sc održi željeni efekat. Faktori koji mogu biti uzeti u obzir ukljucuju ozbiljnost stanja bolesti, opšte zdravlje subjekta, godine, težinu, u pol subjekta, vreme i frekvencu primene, kombijaciju(e) lckova, osetljivost reakcije, i odgovor na terapiju. Farmaceutske fonmdacije dugog trajanja mogu se primenjivati svaka 3 do 4 dana, sveke nedelje, ili dvonedcljno, u zavisnosti od poluživota i brzine ekskrecije svake posebne formulacije. Frekvenca doziranja zavisice od farmakokinetickih parametara molekula vezuj uceg agensa koji se koristi u formulaciji . Tipicno , formulacija se primenjuje sve dok se ne dostigne doza koja obezbeduje željeni efekat. Formulacija se stoga može primcniti kao jedinicna doza, ili kao multiple doze (u istoj ili razlicitim koncentracijama l dozama) tokom vremena, ili kao kontinuirana infuzija. Rutinski sc vrši dalje uskladivanje odgovarajuceg doziranja. Odgovarajuca doziranja se mogu odrediti upotrebom pogodnih podataka iz odgovora na dozu (dose response). Nacin primene farmaceutske formulacije je u skladu sa poznatim metodama, na pr., oralnim, intravenoznim injektiranjem, intraperitonealnim, intracerebralnim (intra-parenhimalnim), intracerebroventrikulamim, intramuskulamim, intra okulamim, intraarterijskim, intraportalnim, preko ozleda, intramedulamim, 00185 B 905 10 15 20 25 30 WO 0310571 34 91 PCTiUS02/32657 intratekalnim, intraventrikulamim, transdennalninl, subkutanim, intraperitonealnim, intranazalnim, enteralnim, topikalnim, sublingvalnim, uret.r:alnim, vaginalnim, ili rektalnim nacinom, sistemima za održivo otpuštanje ili implementacijom pomocnih sredstava. Kada je poželjno, formulacije se mogu primeniti injekcijom bolusa ili kontinuiranom infuzijom, ili implementacijom pomocnog sredstva. Alternativno ili dodatno, formulacija se može lokalno primeniti implantacijom membrane, sundera, ili nekog drugog pogodnog materijala na koji se apsorbuje željeni moleku! ili enkapsulira (stavlja u kapsulu). Kada se koristi implementaciono sredstvo, ono se može implantirati u pogodno tkivo ili organ , a transport željenog molekula se može vršiti difuzijom, bolusom sa vremenskim otpuštanjem, ili kontinuiranom primenom. U nekim slucajevima, poželjno je da se upotreba farmaceutskih fonnulacija vrši ex vivo . U takvim slucajevima, celije, tkiva, ili organe koji su uklonjeni iz pacijenta i izloženi dejstvu farmaceutske formulacije, posle cega se celije, tkiva i l ili organi implantiraju nazad u pacijenta. U drugim slucajevima, vezujuci agens sadašnjeg pronalaska kao što je peptibodi može sc isporuciti implantacijom odredenih celija koje su dobijene genetskim inž.enjeringom, koristeci ovde opisane postupke, u cilju ekspresije i sekrecije polipeptida. Takve celije mogu biti životinjskog ili humanog porekla, i mogu biti autologne, hcterologne, ili ksenogenske. Opciono, celije sc mogu obesmrtiti . U cilju da se smanji šansa imunološkog odgovora, celije se mogu enkapsuli.rati radi izbegavanja infiltracije okolnog tkiva. Materijali za enkapsulaci_ju tipicno su biokompatibilni, polupropustljivi polimerni zidovi ili membrane koje omogucavaju otpuštanje proteinskog(ih) proizvoda ali sprecavaju destrukciju celija od strane pacijentovog imunog sistema ili drugih štetnih faktora iz okolnih tkiva. Kombinaciona terapija Specificno vezujuci agensi sadašnjeg pronalaska kao što su pcptibodi mogu se koristiti u kombinaciji sa drugim terapetucima u lecenju oboljenja povezanih za ekspresijom Ang-2. Ovi drugi terapeutici ukljucuju, na primer. lecenje radijacijom hemoterapiju, i ciljane terapije kao što sul-IcrceptinTM, RituxanTM, GleevccTM, i 00185 B 915 10 15 20 25 30 wo 03/057!34 92 PCT/US02/32657 ' slicne . Dodatne kombinacione trapije koje nisu ovde specificno navedene spadaju takode u okvir sadašnjeg pronalska. U lecenju hcmoterapijom mogu se koristiti antinepolasticni agensi ukljucujuci , na primer, alkilujuce agense ukljucujuci : azotove slacice, kao što su mehlor-etamin, ciklofosfamid, ifosfamid, melfalan i hloramhucil; nitrozouree, kao što su karmustin (BCNU), lomustin (CCNU), i semustin (metil-CCNU); etileniminc l metilmelamine kao što su tr.ietilemnelamin (TEM), trietilen, tiofosforamid (tiotcpa), heksametilmelamin (HMM, altretamin); alkil sulfonate kao što su busulfan ; triazine kao što su dakarbazi n (DTIC); antimctabolite ukljucujuci analoge fo lnc kiseline kao što su metotreksat i trimctreksat; pirimidinske analoge kao što su 5-fluoruracil, f1uordeoksiUiidin , gemcitabin, citozin arabinozid (AraC, citarabin), 5-azacitidin, 2,2'-difluordeoksicitidin, purinske analoge kao što su 6- merkaptopurin, 6-tioguanin, azatioprin, 2'-cleoksikoformicin (pentostatin), eritrohidroksinoniladenin (EHNA), fludarabin fosfat, i 2-hlordcoksiadenozin (cladribin, 2-CdA); prirodne proizvode ukljucujuci antimitoticke !ekove kao što su paklitaksel. vinka alkaloide ukljucujuci vinblastin (VLB), vinkristin, i vinorelbin, taksoter, estramustin, i estramustin fosfat; ppipodofilotoksim~ kao što su etoposid i teniposid; antibiotike kao što su aktimomicin D, daunomicin (rubidomicin), doksorubicin, mitoksantron, idarubicin, blcomicini, p l ikamicin (mitramicin ), mitomicinC. i aktinomicin; enzime kao što su L-asparaginaze; modifikatorc biološkog odgovora kao što su interferon-alfa, IL-2, G-CSF i GM-CSF; razlicite agcnse ukljucujuci platinske koordinacione komplekse kao što su cisplatina i karboplatina, antracendione kao što su mitoksantron, supstituisanu urece kao što je hidrok.siurea. metilhidrazinske derivate ukljucujuci N-metilhidrazin (MfH) i prokarbazin , adrenokortikoidne supresante kao što su mitotan (o,p'-DDD) i aminoglutetimid; hormone i antagoniste ukljucujuci adrenokortikosteroidnc antagoniste kao što su prednison i njegovi ekvivalenti, deksametazon i aminoglutetimid; progestin kao što je hidroksiprogestcron kaproat, medroksiprogesteron acetat i mcgestrol acetat; estrogcn kao što je dietilstilbestrol i ctinil estradiolski ekvivalenti; antiestrogen kao što je tamoksifen; androgeni ukljucujuci testosteron propionat i fluoksimesteron l ekvivalenti: antiandrogene kao što su flutamid , gonadotropin-otpuštajuci hormonski analozi i leuprolid ; i ne steroidne antiandrogene kao što je flutamid . 00185 B 925 10 15 20 25 30 WO 03/057134 93 PCT/US02 /32657 Kombinaciona terapija pomocu f~tktora rasta može ukljuciti citokine, limfokine, faktore rasta, ili druge hematopoieticne faktore kao što su M-CSF, GM CSF, TNF, IL-l, IL-2, lL-3, EL-4, DL-5, IL-6, IL-7, IL-8, DL-9, IL-10, EL-ll , IL-12, IL-13 , lL-14, IL-15 , IL-16, IL-17, IL-18, fFN, TNFO, TNFI , TNF2, G-CSF, Meg CSF, GM-CSF, trombopoietin, faktor stem (nespecijalizovanih) celija, i eritropoietin. Druge formulacije mogu sadržavati poznate angiopoietinc, na primer Ang-1, -2, -4,-Y, i l ili humani Ang-slicni polipeptid, i l ili vaskularni cndotelialni faktor rasta (VEGF). Faktori rasta ukUucuju angiogcnin, morfogeni protein- J kostiju, morfogeni protein-2 kostiju, morfogeni protein-3 kostiju, morfogeni protein-4 kostiju, morfogeni protein-5 kostiju, morfogeni protein-6 kostiju, morfogeni protein-7 kostiju, morfogeni protein-S kos tU u, morfogeni protein-9 kostiju, morfogeni protein-l O kostiju, morfogeni protein-ll kostiju, morto geni protein-l2 kostiju, morfogeni protein-13 kostiju, mortogeni protcin-14 kostiju, morfogeni protein-15 kostiju, koštani morfogeni proteinski rcceptor lA, koštani morfogeni proteinski receptor IB, iz mozga derivatizovani neurotrofni faktor, ciliarni neutrofni faktor, receptor ciliamog neutrofnog faktora, ci to kinom indukovani neutro fil ni hemotakticni faktor l, citokinom indukovani neutro fil, hemotakticni faktor, citokinom indukovani neutrofilni hemotakticni faktor 2, faktor rasta endotclialnih celija , endotelin l, faktor epidem1alnog rasta, epitelium deri vatizovani neutro.Glni atraktant, faktor 4 rasta fibroblasta, faktor 5 rasta fibroblasta, taktor 6 rasta fibroblasta, faktor 7 rasta fibroblasta, h1ktor 8 rasta fibroblasta, faktor 8b rasta fibroblasta, faktor 8c rasta fibroblasta, faktor 9 rasta fibroblasta, faktor l O rasta fibroblasta, kiseli faktor rasta fibroblasta, bazni faktor rasta fibroblasta, iz glialne celijske linije izvedeni neulrofni faktor receptor-1 , iz glialne celijske linije izvedeni neutrofni faktor receptor-2, protein povezan sa rastom, protein-l povezan sa rastom, protein-2 povezan sa rastom , protein-3 povezan sa rastom, heparin vezujuci epidermalni faktor rasta, faktor rasta hepatocita, rcceptor faktor rasta hepatocita, insulinu slican faktor I rasta, receptor insulinu slicnog faktora rasta, insulinu slican faktor ll rasta, vezujuci protein insulinu slicnog faktora rasta, faktor rasta keratinocita, inhibitorski faktor leukemije, rcceptor-1 inhibitorskog faktora leukemije, faktor rasta nerva, reccptor faktora rasta nerva, neurotropin-3 , neurotropin-4, faktor rasta pl acente, faktor 2 rasta placente, iz krvnih plocica izvedeni faktor rasta endotelialnih celija , iz krvnih 00185 B 935 10 15 20 25 30 wo 03/057 134 94 PCT/llS02/32657 plocica izvedeni faktor rasta, iz krvnih plocica izvedeni faktor rasta A niz, iz krvnih plocica izvedeni taktor rasta AA, iz krvnih plocica izvedeni faktor rasta AB, iz krvnih plocica izvedeni taktor rasta B niz, iz krvnih plocica izvedeni faktor rasta BB, rcceptor-1 iz krvnih plocica izvedenog faktora rasta, receptor-2 iz krvnih plocica izvedenog faktora rasta, stimulišuci faktor rasta pre-B celija, faktor stem (nespecijalizovanih) celija, receptor faktora stem (ncspecijalizovanih) celija, transformišuci faktor-l rasta, transformišuci taktor-2 rasta, transformišuci f~tktor-1 rasta, transformišuci faktor-1.2 rasta, transformišuci faktor-2 rasta, transfonnišuci faktor-J rasta, transformišuci faktor-5 rasta, latentni transformišuci faktor-l rasta, vezivni protein [ transformišuceg faktora-l rasta, vezivni protein II transformišuceg faktora- l rasta, vezi v ni protein III transfonnišuceg faktora-l rasta, recep tor tip l tumor faktora nekroze, receptor tip II tumor faktora nekroze, aktivatorski receptor plazminogcna tipa urokinaze, vaskularni cndotclialni faktor rasta, i himemi protcini i biološki ili njiho vi imunološki aktivni fragmenti. Imunoterapeutici Jmunoterapeutici se obicno oslanjaju na upotrebu imunih (rezistentnih) efcktorskih celija i molekula da ciljaju i unište celije raka. Imuni cfektori mogu biti, na primer, peptibodi sadašnjeg pronalaska koje prepoznaju neke markere na površini cilj anih celija. Sama peptibodi može služiti kao efektor za terapiju ili može angažovati (regrutovati) druge celije da ubiju ciljanu celiju . Peptibodi može biti konjugovana za Jek ili toksin (hemoterapeutik, radionuklid, niz ricina A, kolera toksin, toksin velikog kašlja, itd.) i tako može samo služiti kao agens za ciljanje. Prema sadašnjem pronalasku, mutantni oblici Ang-2 mogu se ciljati (napasti) imunotcrapijom pomocu peptibodi ili konjugata peptibodi sadašnjeg pronalaska. Narocito se ima u vidu da se peptibodi formulacije sadašnjeg pronalaska mogu koristiti u kombinovanom prilazu terapiji u konjugaciji sa Ang-2 ci lj anom terapijom . Pasi vna imuno terapija se pokazala da je posebno efikasna protiv nekoliko vrsta raka. Videti, na primer, WO 98/39027. Sledeci primeri su dati samo u ilustrativne svrhe, i ne bi trebalo da budu protumaceni na bilo koji nacin kao limitirajuci polja sadašnjeg pronalaska. 00185 B 945 10 15 20 25 30 WO OJ/057134 95 PCT/US02i32657 Primer l Ang-2 ekspresija u patološkom i normalnom tkivu Ang-2 ekspresija je analizirana u normalnom i patološkom tkivu koristeci in situ hibridizaciju. Fragmenti humanih (Genbank Accession Number: AF004327, nukleotidi 1274-1 726) Ang-2 sekvenci, i mišjih Ang-2 sekvenci (Genbank Accession Number: AF004326, nukleotidi 1135-1588), su amplifikovani reversnom transkriptazom-PCR iz humane ili mišje fctalne plucne cDNK, klonirani u pGEM-T plazmidi verifikovani sekvcncionisanjem. Izvršen je prepis 33 P obeleženih antiscns RNK proba iz linearizovanog plazmidnog templata pomocu 33 P-UTP i RNK polimcraze. Blokovi u formaldehidu fiksiranih, u parafin ugradenih tkiva su sekcirani na 5 J-lm i sakupljani na naelektrisanim slajdovima. Pre in situ hibridizacije tkiva su sc permeabilizovala pomocu 0.2 M HCl, za cime sledi digestija koristeci Proteinazu K, i acetilovanje pomocu trietanolamina i anhidrida sircetnc kiseline. Delici (sekcije) su hibridizovani preko noci na 55 oc koristeci radio obele žene probe, a zatim podvrgnute digestij i RNaze i iscrpnom ispiranju u oko 0.1 X SSC na 55 o c. Slajdovi su uronjeni u emulziju Kodak NTB2, eksponirani na 4°C tokom 2-3 nedelje, razvijeni, i obojeni na nacin za bojenje mikroskopskih uzoraka. Sekcije su pregledane tamnim poljem i standardnim osvetlcnjcm da bi se omogucila simultana proccna morfologije tkiva i hibridizacionog signala. Re7,ultati indiciraju da je u normalnom postanatalnom humanom bicu Ang- 2 ekspresija ogranicena na nekoliko vrsti tkiva što sadrže angiogene vaskulature, kao što su j aj nici, placenta i uterus. Ang-2 ekspresija nije detektovana u normalnom odraslom srcu ljudi, mozgu, buregu, jetri, plucima, pankreasu, slezini, mišicima, krajnicima, timusu, slepom crcvu, limfnim cvorovi .rna, žucnom mehuru, prostati ili testisima. U mišu starom pet nedelja (ali ne i u odraslom majmunu niti coveku), bubrezi su ispoljavali izraženu Ang-2 ekspresiju u rektalnom kanalu. Radi odredivanja da li je ekspresija zaostatak embrionskog razvoja, ovaj eksperiment je ponovljen na bubrezima miševa cija je starost varirala do jedne godine koristeci mišju Ang-2 probu i gore opisane uslove. Promeceno je da Ang-2 ekspresija opada tokom neonatalnog razvoja, ali je još uvek bila ocigledna u bubrezima jednogodišnjih miševa. Ang-2 ekspresija je takode detektovana u prakticno svim testiranim tipovima tumora, ukljucujuci , primarne humane tumore kao što su karcinom 00185 B 955 10 15 20 25 30 wo 03/057134 96 PCT/US02/32657 debelog creva (5 slucajeva), karcinom dojke (l O slucajeva). karcinom pluca (8 slucajeva), glioblastom (l slucaj), metastatske humane tumore kao što su karcinom dojke (2 slucaja), karcinom pluca (2 slucaja) i karcinom jajnika (2 slucaja) koji su metasta;;irali u mozgu, i tumorskim modelima glodara kao što su C6 (gliom pacova), HT29 (humani karcinom debelog creva), Colo-205 (humani karcinom debelog creva), HCT116 (humani karcinom debelog creva), A431 (humani karcinom epiderma), A673 (humani rabdomiosarkom), HT l 080 (humani fibrosarkom), PC-3 (humani karcinom prostate), B 16F1 O (mišji melanom), M ethA (mišji sarkom), i Lewis karcinom pluca mets. Dodatno, ekspresija Ang-2 je detektovana u novim sudovima koji urastaju u Matrigel plug kao odgovor na VEGF i u mišjem modelu hipoksUe retinopatije pre zrelosti . Primer 2 Molckulski modeli za evaluaciju Ang-2 pcptibodi Razvijeni su molekulski testovi (Afinitetna ELISA, Neutralizaciona ELISA, i BlAcore) za direktno odredivanje vezivanja peptibodi za Ang-2 i povezane clanove familije, i na efekat peptibodi na Ang-2:Tie-2 interakciju. Ovi in vitro testovi su dole opisani. Afinitetn,a ELISA Za inicijalni skrining kandidata anti-Ang-2 peptibodi, upotrebU eni su precišceni humani Ang-2 (R&D Systems, Inc; kataloški broj ()23 -AN; Ang-2 nabavlja ka osmesa 2 skracene verzije) ili mišji Ang-2 polipeptid (pripremljen kako je gore opisano). Za potvrdne testove vezivanja humani Ang-2 je dobi jen iz kondicioniranih medija humanih 293T celija sa prepisanim humanim Ang-2 DNK pune dužine i uzgajanje u Dulbecco-vom Modified Eagle Medium (DMEM) bez seruma, koji sadrži oko 50 mikrograma na ml albumina seruma goveceta (BSA). Koristeci mikrotitarske ploce, približno 100 mikrolitara na sudic Ang-2 je dodat svakom suclicu i ploce su inkubirane oko 2 sata posle cega su isprane cetiri puta fosfatom puferovanim vodenim rastvaram soli (PBS) koji sadrži oko 0.1 procenat Tween-20. Sudici su potom blokirani koristeci oko 250 mikrolitara na sudic približno 5 proccntni BSA u PBS, ploce su inkubirane na sobnoj temperaturi oko 2 sata. Posle inkubacije, višak rast vora sredstva za blokiranje je odbaceno, i oko 00185 B 965 10 15 20 25 30 wo 03i057134 97 PCT/US02i3 2657 100 rnikrolitara svakog kandidata anti-i\ g-2 pcptibodi je dodat sudicu u seriji razblaž:enja polazeci od koncentracija od oko 40 nanomolarne i zatim serijski razblaživanoj 4-struko u PBS koji sadrži l proccnat BSA. P loce su zatim inkubiranc preko noci na sobnoj temperaturi. Posle inkubacije, ploce su isprane pomocu PBS koji sadrži oko 0.1 procenat Tween-20. ispiranje je ponovljeno još cetiri puta, posle cega je svakom sudi cu dodato oko l OO mikrolitara kozjeg anti humanog lgG(Fc)-HRP (Pierce Chemical Co., kataloški br. 31416) prethodno razblaženog u odnosu l :5000 u PBS koji sadrži l procenat BSA. Ploce su in ku birane približno l sat na sobnoj temperaturi . Ploce su zatim isprane pet puta pomocu PBS koji sadrži oko 0.1 procenat Tween-20, posle cega je d od ato oko l OO mikrolitara na sudic TMB (3,3',5,5'-Tctrametilbenzidinski Liquid Substrate System; Sigma Chemical Company, St. Louis, MO, kataloški broj T8665), i ploce su inkubirane oko 5-15 minuta dok sc nije razvila plava boja. Apsorbancaje zatim odredena spcktrofotometrom na oko 370 nm. Neutralizaciona ELISA Mikrotitarske ploce u kojima je vezan humani Ang-2 polipeptid su pripremljene kako je opisano u poglavlju Afinitetna ELISA. Kandidati anti-Ang-2 peptibodi su titrovani od l 000 nM do 0.2 pM u 4-strukim razblaženjima PBS koji sadrži oko l% BSA i oko l nM Tie-2 (koji sc nabavlja kao Tie-2-Fc moleku! gde Tie-2 deo sadrži samo rastvorni ektracelularni deo molekula: R&D Systems, kataloški broj 313-TI). Posle dodavanja oko l OO mikro litara anti telo l Tie-2 rast vora svakom sudicu, ploce su inkubirane preko noci na sobnoj temperaturi , a zatim isprane pet puta pomocu PBS koji sadrži oko 0.1 procenat Tween-20. Posle ispiranja dodate je oko l OO mikro litara na sud ic anti-Tie-2 anti tela (Pharmingen Inc., kataloški br. 557039) do krajnje koncentracije od oko l mikrogram na ml, i ploce su inkubirane oko l sat na sobnoj temperaturi. Zatim je dodato oko 100 mikrolitara na sudic kozjeg anti-miš-IgG-HRP (Pierce Chemical CO., kataloški br. 31432) pri razbla~enju od l: l 0,000 u PBS koji sadrži oko 1 procenat B SA. Ploce su inkubiranc oko l sat na sobnoj temperaturi, a zatim isprane pet puta pomocu PBS koji sadrži oko 0.1 procenat Tween-20. Dodato je oko l OO mikro litara TMB supstrata (opisano gore) na sudic ostavljeno je da se razvije boja. Apsorbancaje zatim odredena spektrofotometrom na oko 3 70 nm. 00185 B 975 10 15 20 25 30 wo 03/057134 98 PCT/US02/32657 Afinitctna B!Acore Afinitetna analiza svakog kandidata Ang-2 peptibodi izvršena na BIAcorc@2000 (13iacore, Inc., Piscataway, NJ) koristeci PBS i 0.005 procentni P20 Površinski aktivni rastvor (Biacorc, Inc.) kao pu fer. Recombinant Protein G (Repligen, Needharn, MA) je imobilisan na scnzorski cip CM5 istraživacke cistoce (Biacore, Inc.) preko primarnih amino grupa koristeci Amine Coupling Kit (Biacore. Inc.) prema proizvodackom protokolu . Testovi vez:ivanja su izvršeni prvo hvatanjem oko Ru svakog kandidata anti-Ang-2 peptibodi za imohilisani Protein G. posle cega su razi icite koncentracije (O-l OO nM) huAng-2 ili mAng-2 injektirane preko vezane površine anti tela pri brzini protoka od 50 nl/min tokom 3 minuta. Odre(1eni su vezujuci parametri, ukUucujuci ka (konstantu brzine asoeUacije), kc1 (konstantu brzine disocijacUe) i KD (konstantu ravnoteže disocijacije) koristeci BIA evaluation 3.1 computer program (Biacore, Inc.). Niže vrednosti konstanti ravnoteže disocijacije indiciralc su veci afinitet pcptibodi prema 1\ g-2. Primer 3 Identifikacija Ang-2 vezujucih pcptida l. Dobijanje Ang-2-obloženih magnetnih perlica A. !mobilizacija Ang-2 na magnetnim perlicama U cilju ncspecificnog eluiranja imobilisan je biotinilovani protein Ang-2 (Biotinylated Recombinant Human Angiopoietin-2, R&D Systems, Inc.; kataloški broj BT (>23) na Streptavidin Dynabeads (Dynal, Lake Success, NY) pri koncentracijama od oko 4 J..Lg biotinilovanog Ang-2 proteina na l OO !J l perlica nabavUenih od proizvodaca za sva tri kruga selekcije. Za eluiranje antigena (Ang- 2) i receptora (Tie-2), 2 (lg biotinilovanog Ang-2 proteina imobilisano je na 50 ~tl Streptavidin Dynabeads za druge krugove selekcije. Koncentracija oblaganjaje za treci krug selekcije smanjena na 1 J..Lg biotinilovanog Ang-2 proteina na 50 (ll perlica. Povlaceci perlice pomocu magneta na jednu stranu epruvetice i uklanjajuci tecnost pipetom, perlice su isprane pet puta fosfatnim pufcrom vodenog rastvora soli (PBS) i ponovo su suspendovane u PBS. Biotinilovani protein Ang-2 je dodat ispranim perli cama na gornjim koncentracijama i inkubiran U7. rotiranje na sobnoj temperaturi, za cime sledi inkubiranje od nekoliko sati do 00185 B 985 10 15 20 25 30 wo 03/057134 99 PCTi1JS02i32657 preko noci na 4 ac uz rotiranje. Ang-2-obložene perlice su blokirane dodavanjem BSA do oko l % krajnje koncentracije i inkubirane su preko noci na 4 °C uz rotirar\\je. Dobivene Ang-2-obložene perlice su zatim isprane pet puta sa PBS pre nego što su podvrgnute selekciji. B. Dobijanje negativnom selekcijom perlica Dodatne perlice pripreljene su i za negativnu selekciju. Za svaki uslov ispiranja, 500 111 perlica nabavljenih od proizvodaca podvrgnuto je gore datom postupku (odeljak lA) osim što je izostavljena inkubaciona faza sa biotinilovanim Ang-2. U poslednjoj fazi ispiranja, perlice su podcljene u pet alikvota od po 100 l-LL Selekcija Ang-2 vezujuce fagi A . Opšta strategija Za izbor Ang-2 vezujuci fagi upotrebljene su tro-vlaknaste biblioteke fagi, oznacenih kao \"TN8-lX\" (5Xl 0 9 nezavisnih transformanata}, \"TN12-I\" ( l.4X l o 'J nezavisnih transformanata), and \"Linear\" (2.3X: l 0° nezavisnih transfonnanata) (sve od Dyax Corp.). Svaka biblioteka sc zatim podvrgnuta ili nespecificnom eluiranju, Ang-2 eluiranju, i reccptorskom cluiranju (Tie-2) . Za Ang-2 je primenjeno devet razlicitih uslova ispii·anja (TN8-IX koji koristi nespecificni metod ispiranja, TN8-IX koji koristi Ang-2 metod ispiranja, TN8-IX koji koristi Tie-2 metod ispiranja, TN12-l koji koristi nespecificni metod ispiranja, TN12-l koji koristi Ang-2 metod ispiranja, i TN12-I koji koristi Tie-2 metod ispiranja, Linearni koji koristi nespecificni metod ispiranja, Linearni koji koristi Ang-2 metod ispiranja, i Linearni koji koristi Tie-2 metod ispiranja). Za sve tri biblioteke, fagi iz prvog kruga selekcije su za dalje krugove selekcije el.uirani samo nespecificnim nacinom . Ang-2 i Tie-2 eluiranja su korišcena u drugom i trecem krugu selekcije. U slucaju Linearne biblioteke je selekcija izvršena samo do drugog kruga Ang-2 i Tie-2 eluiranja. B. Negativna selekcija Za svaki od uslova ispiranja al ik vo tiran o je oko l OO nasumicnih biblioteckih ekvivalenata TN8-IX i TN12-I biblioteka (oko 5 X 10 11 pfu za TN8- 00185 B 995 10 15 20 25 30 wo 03i057134 100 PCT/US02/32657 IX, i oko 1.4 X 10 11 pfu za TN12-1) i oko lO nasumicnih biblioteckih ekvival.cnata linearne biblioteke {oko 1 X l 0 11 pfu) iz bibliotcckc zalihe razblaženo na oko 400 !J.l pomocu PBST (PBS sa 0.05 % Tween-20). Posle poslednjeg ispiranja tecnost j e odstranjena iz prvog alikvota od 100 111 perlica dobivenih negativnom selekcijom (odeljak 1 B), potom je perlicama dodato približno 400 111 rablažene zalihe biblioteke. Dobivena smesa je inkubirana oko 20 minuta na sobnoj temperaturi uz rotiranje. Supernatani fagi je odstranjen magnetom i dodat je drugom ali kvotu od l OO ).ll za još jednu negativnu selekcionu fazu. Na ovaj nacin izvršeno je pet negativnih selekcionih faza. C. Selekcija pomocu perlica obloženih Ang-2 proteinom Posle negativnog selekcionog koraka (odcljak lB) supernatant fagi je dodat Ang-2 obložen im perlicama (odeljak l A). Ovakva smesa inkubirana je uz rotaciju tokom jednog do dva sata na sobnoj temperaturi_ omogucavajuci da se fagi vežu za cilj ni protein. Pošto sc odbaci supematant, perlice se ispem oko deset puta sa PBST za cime slede dva ispiranja sa PBS . D. Nespecificno eluiranje Posle finalnog ispiranja tecnost je odstranjena ( odeljak 2C) a perli cama je dodato oko l ml ra..stvora soli Min A (60 mM K 2 HP04, 33 mM KH 2 P0 4 , 7.6 mM (NH4)S04, i 1.7 mM natrijum citrata). Smesa perlicaje direktno dodata koncentrovanom uzorku bakterije koja se inficira (videti dole odeljak 3A i 3B). E. Antigen (Ang-2) eluiranje vezane fagi U drugom krugu, posle poslednjcg ispiranja (odeljak 2C), vezani fagi su eluirani sa magnetnih perlicadodatkom !OO 1111 pM , 0.1 nM, i 10 nM rekombinantnog Ang-2 proteina (Recombinant Human Angiopoictin-2, R&D Systems, .Lnc., Minneapolis, Minnesota) sukcesivno sa 30 minutnom inkubacijom za svak i od datih uslova. Preostali fagi su nespecifino eluirani (odeljak 20). Fagi iz l O nM i nespecificnih eluiranja su kombinovanc, i podvrgnute trecem krugu selekcije (videti odeljak 4, dole). U selckcionom krugu 3, posle poslednje faze ispiranja (odeljak 2C), vezani fagi su eluirani sa magnetnih perlica dodatkom l nM rekombinantnog Ang-2 00185 B 1005 10 15 20 25 30 wo 03/057[34 101 PCT/US02/32657 proteina, i l O nM rekombinantnog Ang-2 proteina sa 30 min utnom inkubacijom za svaki od datih uslova. Dodatno, fagi su eluirani pomocu 1 ml 1 OO mM rastvara trietilamina (Sigma, St. Louis, Missouri) oko l O minuta u rotatom. pH rastvora koj i sadrži fagi i trietilamin neutral isan je pomocu 0.5 ml l M Tris-H Cl (pH 7.5). Posle poslcdnjeg cluiranja pomocu l OO mM rast vora trietilamina, preostali fagi su eluirani dodatkom perlica bakteriji (ode~jak 2D). F. Eluiranje vezanih fagi pomocu receptora (Tie-2) U drugom krugu, posle poslednjeg ispiranja (odeljak 2C), vezani fagi su eluirani sa magnetnih perlica dodatkom oko !OO ~d l pM, 0.1 nM, i lO nM rekombinantnog Tie-2 proteina (Recombinant Human Tic-2-Fc Chimera, R&D Systems, lnc., Minneapolis, Minnesota) sukcesivno sa 30 minutnom inkubacijom za svaki od datih uslova. Preostali fagi su ncspecifino eluirani (odeljak 2D) . Fagi iz 10 nM i nespecificnih eluiranja su kombinovane, i podvrgnute trecem krugu selekcije (videti odeljak 4, dole). U sclekcionom krugu 3, posle poslednje faze ispiranja (odeljak 2C), vezani fagi su cluirani sa magnetnih perlica dodatkom 1 nM rekombinantnog Ang-2 proteina, i l O nM rekombinantnog Tie-2 proteina sa 30 minutnom inkubacijom za svaki od datih uslova. Dodatno, fagi su el u irani pomocu l ml l OO mM rast vora trietilamina (Sigma, St. Louis, Missouri) oko lO minuta u rotatoru. pH rastvora koji sadrži fagi i trietilamin neutralisan je pomocu 0.5 ml l M Tris-HC! (pH 7.5). Posle poslednjeg cluiranja pomocu l OO mM mM rastvora trietilamina, preostali fagi su cluirani dodatkom perlica baktcriji (odeljak 2D). 3. Amplifikacija A. Priprcma~je celija za oblaganje S veža E. Coil (XL-l Blue MRF') kultura j e gajen a do OD 600 od oko 0.5 u LB medijumu koji je sadržavao oko 12.5 ~tg l ml tetraciklina. Za svaki od uslova ispiranja je oko 20 ml ove kulture ohladeno na ledu i ccntrifugirano. Bakterijska perlicajc ponovo suspendovana u oko l ml rastvora Min A Salts (Soli). B. Transdukcija 00185 B 1015 10 15 20 25 30 WO 03i057 134 102 PCT/US02/32657 Svaka smesa iz svakog razlicitog postupka eluiranja datih gore (odeljci 2D, 2E i 2F) dodataje uzorku koncentrovane bakterije (odeljak 3A) i inkubirana na oko 37 o c oko 15 minuta. Približno 2 ml med\\iuma NZCYM. (2XNZCYM, 50 f.lg l ml Ampicillin) je dodato svakoj od smesa i inkubirana na oko 37 a c tokom 15 minuta. 4 ml nastalog rastvara je nanesen na veliku NZCYM agar plocu koja sadrži oko 50 ~Lg l ml ampicilina i izvršena je inkubacija preko noci na 37 °C. C. Sakupljanje fagi Svaka smesa bakterija l fagi je uzgajana preko noci na velikoj NZCYM agar ploci ( odcljak 313), posle cega su zgrehane u oko 35 ml LB medijuma. Agar ploca je dalje isprana sa dodatnih 35 ml LB medijuma. Dobivena smesa bakterija l fagi u LB medijumu je ccntrifugirana da bi se kuglice odstranile. Približno 50 ml supernatanta fagi je zatim preneto u novu epruveticu , i oko 12.5 rastvara PEG (20% PEG8000, 3.5M amonij um acetat) je dodalo i inkubirana na ledu tokom 2 sata da sc fagi precipituju. Staložene fagi su odvojeni centrifugiranjem i ponovo su suspcnclovani u 6 rnl pufera za ponovno suspendovanje fagi (250 mM NaCl, l OO mM Tri s pH8, l mM EDTA) . Ovakav rastvor fagi jt! dalje prccišcavan centrifugiranjem preostalih bakterija i taloženjcm fagi po drugi put dodatkom oko 1.5 ml rastvara PEG. Posle faze centri fugiranja, kuglice fagi su ponovo suspcndovane u oko 400 f..ll PBS. Dobiveni rastvor je podvrgnut poslednjcm centrifugiranju da se odstrane bilo kakvi ostaci bakterija. Nastali preparat fagi je titrovan standardnim testom u kome se formiraju plocice. 4. Dodatna selekcija i amplifikacija U drugom krugu, amplifikovani preparati faga (oko 10 1 0 pfu) i?.: prvog kruga (odeljak JC) se koriste kao inputne fage u selekcionim i amplifikacionim fazama (odcljci 2 i 3 ). U slucaju Ang-2 i Tie-2 eluiranih rastvara, fage iz l O nM i nespecificnih eluiranih rastvara se kombinuju i amplifikuju za treci krug selekcije. Ampliftkovane preparacije fagi (oko 10 9 pfu) iz 2. kruga po redu je korišcen kao fagi input za 3. krug selekcije i amplifikacije ( odcljci 2 i 3 ). Posle faza eluiranja (odeljci 20, 2E, i 2F) 3. kruga, mala frakcija eluiranih fagi je nanesena kao u testu formiranja plocica (ode ljak 3C). Pojedinacne plocice su izvadene i 00185 B 1025 10 15 20 25 30 WO 03/057 134 103 PCT /US02/3 2657 stavljene u plocu sa 96 mikrotita:rskih sudica koji su u svakom sudicu sadržavali l OO f.!] TE pu tera. Ove glavne ploce su inkubiranc na 4 o c preko noci da se fagi eluiraju u TE pufer. 5. Klonalna analiza Klonovi fagi analizirani su fagi ELISA i DNK sekvcncionisanjem. Sek vene~ su poredane prema kombinovanim rezultatima ova dva testa. A. Fagc ELISA XL-l Blue MRF' kultura je gajena dok nije postigla ODGoo oko 0.5. Oko trideset ~tl ove kulture je alikvotirano u svaki sudic mikrotitarske ploce od 96 sudi ca . Oko l O f.!l eluiranih fagi ( odeljak 4) je dodato svakom sudi cu i ostavljeno oko 15 minuta da inficira bakteriju na sobnoj temperaturi. Oko 100 J.!l LB medijuma što sadrži približno 12.5 11g l ml tetraciklina i približno 50 j.lg l ml ampicilinaje dodato svakom sudicu. Mikrotitarska ploca je zatim inkubirana uz muckanje preko noci na oko 37 o c. Rekombinantni Ang-2 protein (oko l j.lg l ml u PBS) je ostavljen da se veže za Maxisorp ploce sa 96 sudica (NUNC) preko noci na oko 4 \"C . U kontrolnoj probi je cisti streptavidin obložen u odvojene Maxisorp ploce sa uko 2 j.lg l ml u PBS. S led eceg dana je tecnost u Maxisorp plocama obloženi m proteinom odbacena , i svaki sudic je blokiran sa oko 300 fl l 5 % rastvorom mleka na oko 4 o c preko noci (alternativno, l sat na sobnoj temperaturi). Rastvor mleka je zatim odbacen , a sudici su isprani tri puta pomocu PBST rastvora. Posle poslednje faze ispiranja. svakom sudicu Maxisorp ploca obloženih proteinom dodato je oko 50 )ll PBST ·· 4 % 1 mleka. Oko 50 fll kultura ostavljenih preko noci iz svakog sudica, iz mikrotitarske ploce sa 96 sudica, prenelo je u odgovarajuce sudice ploce obložene Ang-2 kao i u kontrolnu, sa streptavidinom obložene ploce. l OO f.!l smese u svakoj od tipova ploca je inkubirano oko l sat na sobnoj temperaturi . Tecnost je tada iz Maxisorp ploca odbacena, i sudici su isprani oko tri puta pomocu PBST. HRP konjugovana anti-Ml3 antitela (Amersharn Pharmacia Biotech) su razblažcna to oko l : 7 ,500, i oko l OO f.!l razblaženog rastvara je dodato svakom sudi cu iz Maxisorp ploca i inkubirano oko l sat na sobnoj temperaturi . Tecnost je tada 00185 B 1035 10 15 20 \ O o: vos7134 104 PCT/US02/32657 odbacena i sudici su isprani oko pet puta pomocu PBST. Oko 100 fll TMB supstrata (Sigma) je tada dodato svakom sudi cu , i reakcija je L'.austavljena koristeci 50 ~tl SN rastvara H2S04 . The OD4 5 o je ocitano spektrofotometrom (Molecular Devices). B. Sekvcncionisanje klonova faga la svaki fagi klor'!, templat za sekvencionisanjc je dobije pomocu PCR. Sledeci oligonukleotidni par je upotrebljen za amplifikaciju približno 500 nukleotidnih fragmenata: Prajmer l : 5'-CGGCGCAACTATCGGTATCAAGCTG-3'(SEQ lD NO: 54) Prajmer 2: 5'-CATGTACCGTAACACTGAGTTTCGTC-3'(SEQ ID NO: 55) Za svak i od klonova pripremU ena j e sledeca smesa: Reagensi Zapremina (/-LL) l epruvetice dH2 0 26.25 50% glicerol 10 l OX PCR pu fer (w/o 5 MgCiz) 25 mMMgCh 4 l O mM dN TP mix l l OO J1M prajmer l 0.25 l OO J1M prajmer 2 0.25 Taq polimcraza 0.25 Faga u TE (odeljak 4) J Krajnja rcakciona zapremina 50 Za PCR, korišcenje termocikler (GeneAmp PCR System 9700, Applied Biosystems) izvodenje sledeceg programa: 94 oc tokom 5 minuta; (94 °C JO sec, 00185 B 1045 10 15 20 wo 03/057134 105 PCT/l JS02/32G57 55 o c 30 sec, 72 °C 45 sec) x 30 ciklusa; 72 °C tokom 7 minuta; ohladiti na 4° C. PCR proizvod svake reakcije je prccišcavan pomocu QIAquick Multiwcll PCR Purification kit (Qiagen), sledeci proizvodacki protokol. Prccišceni PCR proizvod je zatim testiran koristeci oko l O l-lg svake PCR rcakcione smese sa oko l ~-tl boje (1 O X BBXS agarozni gel koji prima boju) na 1 % agaroznom gelu. Preostali proizvod je sekvencionisan pomocu ABI377 Sequcncer (Pcrkin Elmer) sledeci od proizvodaca preporuceni protokol. 6. Rangiranje sekvenci i odredivanje konsenzus sekvence A. Rangiranje sekvenci i analiza Pcptidne sekvence koje su prevedene iz razlicitih nukleotidnih sekvenci (odeljak 58) su korelisane na ELISA podatke. Klanovi koji su pokazivali visoku OD4so u Ang-2 obloženim sudicima i nisku OD4so u streptavidin obloženim sudicima dobili su najviši prioritet prilikom rangiranja. Sekvence koje su se pojavile nekoliko puta su takode dobile visoki prioritet prilikom rangiranja. Sekvence kandidati su izabrane na osnovu ovih kriterijuma za dalju analizu kao peptidi ili peptibodi . B. Odrcdivanje konsenzus sekvence Iz TN8-IX biblioteke generisano je tri razlicite klase konsenzus motiva: 00185 B 1055 10 15 wo 03/057134 106 KRPCEEXWGGCXYX (SEQ ID NO:SG) KRPCEEXFGGCXYX (SEQ ID N0:57) XXXCXDXYWYCXXX(SEQ lD NO: (il) XXXCXDXYTYCXXX (SEQ lD NO: 62) XXXCXDXFWYCXXX (SEQ ID NO : (J3) XXXCXDXFTYCXXX(SEQ ID NO: 64) XXXCXWDPWTCEXM (SEQ ID NO: 58) Iz TN12-1 biblioteke generisanje jedan konsenzus motiv: WSXCA WFXGXXXXXCRRX (SEQ ID NO: 59) PCT/US02i32657 U svim motivima konsenzus sekvenci, pod vucene su \"srž (core) aminokiselinske sekvence \" iz kojih je dobijena svaka konsenzus sekvenca odredivanjem one aminokiseline koja sc najcešce nalazi na svakom mestu. \"X\" se odnosi na bilo koju prirodnu aminokiselinu. Dva cisteina u susedstvu core sekvenci su fiksirane aminokiseline u bibliotekama TN8-TX i TN12-l. Peptidi idcntifikovani kao oni koji se vezuju za Ang-2 su navedeni dole u tabeli 3. Tabela 3: Ang-2 vezujuci pcptidi Peptid Sekv. Id br. Sekvenca TN8-8 l KRPCEEMWGGCNYD TN8- 14 2 HQICKWDPWTCKHW TN8-Conl ..., KRPCEEJFGGCTYQ J TN8-Con4 4 QEECEWDPWTCEHM TN12-9 5 FDYCEGVEDPFTFGCDNH Ll 6 KFNPLDELEETL YEQFTFQQ Cl7 7 QYGCDGFLYGCMJN 00185 B 1065 10 15 20 25 \\VO 03i057134 107 PCT/US02i32657 Primer4 Konstrukcija DNK enkodiranih peptibodi Modifikovani peptidi odabrani kao potencijalni ihibitori Ang-2:Tic-2 vezivanja (videti tabelu 3) korišceni su za konstrukciju fuzionih proteina gde je bilo monomer svakog peptida ili tandem dimer svakog pcptida (sa linkerom izmedu monomernih jedinica) podvrgnut fuziji za DNK koji enkodira linker pracen Fc rcgionom humanog lg G l. Svaki modifikovani peptid je konstruisan anclacionim parovima oligonukleotida (\"oligos\") za generisanje polinukleotidnog dupleksa koji enkodira peptid zajedno sa ukljucenim linkerom, u zavisnosti od peptida, od bilo pet glicinskih ostataka, osam glicinskih ostataka ili jednog lizinskog ostatka; ove konstrukcije su generisane kao Ndel do Xhol fragmenti. Ovi dupleks polinukleotidni molekuli su ligirani u vektor (pAMG21-Fc N-terminalni, dalje opisan dole) koji sadrži humani Fc gen, koji je prethodno bio digestiran sa Ndel i Xhol. Nastale ligacione (vezane) smese su transformisane elektroporacUom u E. coli soja 259Ci celije (GM221, dalje opisane dole) standardnim postupcima. Testiranajc sposobnost klonova da proizvedu rekombinantni proteinski proizvod, i da li sadrže gensku fuziju koja ima ispravnu nukleotidnu sekvencu. Po jedan od takvih klonova je izabran za svaki od modifikovanih peptida (tj., Fc-peptidnih fuzionih proizvoda). Konstmkcija pAMG21-Fc N-terminalnog vektora pAMG21 Eksprcsioni plasmid pAMG21 (A TCC br. 98113) je izveden iz cksprcsionog vektora pCFM1656 (ATCC No. 69576) i ckspresionog vektorskog sistema opisanog u United States patent br. 4, 710,4 73, sledeci postupak opisan u publikovanoj International Patent Application WO 00/24 782 (videti deo pri mera 2 koji se nalazi na stranama l OO-l 03, kao i slike 17A i 17B). 00185 B 1075 10 15 20 25 WO 03i057 134 108 PCT/US02i32657 Fc N-tenninalni vektor Fc N-lerminalni vektor je stvoren koristeci E. coli soj 3 788, pAMG21 Tpo_Gly5_Fc monomer, kao templat. Informacija o kloniranju ovog soja mo7c se naci u WO 00/24782 (Videti tamo primer 2 i sliku 1 0). Za 5' PCR pra_ imer (opisan dalje dole) je odredeno da ukloni Tpo peptidnu sekvencu u p!\\l'v1G Tpo Gly5 i zameni je polilinkerom koji sadrži J\\paLI i Xhol polož<~je . Koristeci soj 3788 kao templat, PCRje izvršena pomocu Expand Long Po lymerase. koristeci oligonukleotid sa SEQ ID NO: 8. dole, kao 5' prajrner i univerzalni 3' prajmer, SEQ ID NO: 9, dol e. Nastali PCR proizvod je precišcen na gelu i digestiran koristeci restrikcione enzime Ndel and BsrGl. Oba, plasmid i polinukleotid koji cnkodira željeni peptid, zajedno sa svojim linkcrom su precišceni na gelu koristeci Qiagen (Chatsworth, CA) spin kolone za gel precišcavanje . Plazmid i insert su zatim ligirani pomocu standardnih ligacionih postupaka, i dobivena Ji gaciona smesa je transformisana u E. coli celije (soj 2596). Odabrani su pojedinacni klonovi i izvršeno je DNK sek vencionisanje. Identifikovan je ispravan k l on i upotrebljen je kao izvor vektora za ovde opisane modifikovane peptide. 5'Prajmer: ACAAACAAACATATGGGTGCACAGAAAGCGGCCGCAAAAAAA CTCGAGGGTGGAGGCGGTGGGGACA (SEQ ID NO: 8) 3' Prajmer: GGTCATTACTGGACCGGATC (SEQ ID NO: 9) Kao dodatak dobijanju ovako modifikovanih pcptida kao N tcnninalnih fuzija za Fc (N-terminalne peptibodi), neki od njih su dobiveni kao C-terrninalni fuzioni proizvodi (C-tenninalne pcptibodi). Vektor koji korišcen za pravljenje e-terminalnih fuzionih proizvoda opisan je dole. 00185 B 1085 10 15 20 25 WO 03i057 134 109 Konstrukcija Fc C-tenninalnog vckwra PCTf(JS02/32657 Fc C-terminalni vektor za modiftkovane pepticle je kreiran koristeci kao templatE. coli soj 3728, pAMG21 Fc_Gly5_ Tpo monomer.lnformacija o klllniranju ovog soja može se naci u WO 00/24782 (Videti tamo primer 2 i sliku 7) . Za 3' PCR prajmer (SEQ ID NO: l O) je odredeno da ukloni Tpo pcptidnu sekvencu i da je zameni polilinkerom koji sadrži ApaLI i Xhol položaje. Koristeci soj 3728 kao templat, PCRjc izvršena pomocu Expand Long Polymcrase, koristeci univerzalni 5' prajmer (SEQ lD NO: ll) i gore pornenuti 3' prajmer. Nastali PCR proizvod je precišcen na gelu i digestiran koristeci restrikcione enzime Ndel and BsrGI. Oba, plasmid i polinukleotid koji cnkodira svaki željeni peptid zajedno sa svojim linkcrom su precišceni na gelu koristeci Qiagen (Chatsworth, CA) spin kolone za gel precišcavanjc . Plazmidi insert su zatim ligirani pomocu standardnih ligacionih postupaka, i dobivena ligaciona smesa je transformisana u E. coli celije (soj 2596). Odabrani su pojedinacni klanovi i izvršeno je DNK sekvcncionisanje. Iclcnlifikovan je ispravan klon i upotrebljen je kao izvor vektora za ovde opisane modifikovane peptide. 5' Prajmcr: CGTACAGGTTTACGCAAGAAAATGG (SEQ ID NO: lO) 3' Prajmer: TTTGTTGGATCCATTACTCGAGTTTTTTTGCGGCCGCTTTCTGTG CACCACCACCTCCACCTTTAC (SEQIDNO: ll) GM22 l (#2596). Soj domacin #2596, upotreblj en za ekspresiju Fc pcptid fuzionih peptida, je E. coli K-12 soj rnodifikovan tako da sadrži luks promotor, i oba, temperatumo osetljivi lambda represor cl857s7 u ranom ebg 00185 B 109wo 03/057134 5 10 15 20 25 30 11 o PCT/US02/32657 regionu, i the laciQ rcpresor u kasnom ehg regionu. Prisustvo ova dva rcpresorska gena omogucava upotrebu ovog domacina sa razlicitim ekspresionim sistemima. ATCC oznaka ovog sojaje 202174. Primer S Dobijanje peptibodi Ekspresija u E. coli. Kulture svake od pAMG21-Fc fuzionih konstrukcija u E. coli GM221 su gajene na 37 o c Tcrrific Broth medijumu (videti Tartof i Hobbs, \"Improved media for growing plasmid and cosmid cloncs\", Bcthesda Research Lab s rocus, vol u men 9, strana 12, 1987, citirano u gore pomenutoj Sambrook et al. referenci). Indukcija ekspresije genskog proizvoda lux PR prornotorom je postignuta posle dodatka sintetickog sredstva za samoindukovanje, N-(3-oksoheksanoil)-DL-homoserin laktona, medijumu za uzgajanje kulture do krajnje koncentracije od 20 nanograma na mililitar (ng l ml). Kulture su in.kubirane na 37 c c dodatnih šest sati. Bakterijske kulture su zatim ispitivane mik.roskopijom na prisustvo inkluzionih tela i sakupljanc centrifugiranjem Refraktilna inkluziona tela su primeccna u indukovanim kulturama, ukazujuci da su Fc-fuzijc najverovatnije nastale u nerastvomoj frakciji E. coli. Cclijskc kuglice su direktno liziranc rcsuspendovanjem u Laemmli uzorku pufera koji sadr:! i l 0% ~ merkaptoctanola a zatim analizirane pomocu SDS-PAGE. U najvecem broju slucajeva, intenzivna coomassie-obojena traka odgovar~juce molekulske težine primecuje se na SDS-P AGE gelu. Precišcavanje. Celije su smrskan e u vodi ( 1 l l O) koristeci homogenizator visokog pritiska (dva prolaza pri 14,000 PSI), i inkluziona tela sakupljena su centrifugiranjem (4000 RPM u J-6B centrifugi, tokom jednog sata). lnkluziona tela su solubilizovana u 6 M guanidinu, 50 mM Tris, 10 mM DTT, pH 8.5, tokom jednog sata pri odnosu 1/10. U slucaju linearnih pcptida fuzionisanih sa Fc, solubilisana smesa je raz blažena dvadesetpet puta u 2 M uree, 50 mM Tris, 160 mM arginina, 2 mM cisteina, pH 8.5. Ostavljeno je da se vrši oksidacija dva dana na 4 c c, uz nastajanje disulfidom povezcmogjedinjenja (tj., Fc-peptid homdimera). U slucaju ciklicnih peptida fuzionisanih sa rc, upotrebljen je isti protokol uz dodatak sledeca tri uslova 00185 B 110wo 03/057 134 5 10 15 111 PCT/US02n 2657 za toldovanje (savijanje): (1) 2 M urea, 50 mM Tris, l 60 mM arginin, 4 mM cistein, l mM cistamin, pH 8.5; (2) 4 M urea, 20% glicerol, 50 mM Tris, l 60 mM arginin, 2 mM cistein, pH 8.5; i (3) 4 M urea, 20% glicerol, 50 mM Tris, 160 mM arginin, 4 mM cistein, 1 mM cistamin, pH 8.5 . Ponovo savijeni protein je dijalizovan protiv 1.5 M uree, 50 mM NaCl, 50 mM Tris, pH 9.0. pH ove smese je spuštena na pH 5 sircetnom kiselinom. Precipitat je uklonjen centrifugiranjem, a pH supcmatanta je podcšeno na 5 do (J.5, u zavisnosti od izoelektricne tacke svakog od fuzionih proizvoda. Protein je filtrovan i stavljen je na 4°C na SP-Scpharosc HP kolonu uravnoteženu u 20 mM NaAc, 50 mM NaCl na pH odredenom za svaki proizvod. Protein je eluiran koristeci linearni gradijent na 20 zapreminskih kolona u istom puferu u opsegu od SO mM NaCl do 500 mM NaCl. Pik je odvojen i filtrovan. Peptibodi generisane koristeci navedenu proceduru date su u tabeli 4 dole. 00185 B 111WO 03/057 I 34 112 PCT/US02/32657 Tabela 4 · Pcptibodi Sekvenca peptibodi Ll(N) MGAQKFNPLDELEETL YEQFTFQQLEGGGGG-Fc (SEQ IDNO: 12) LI (Nl \\VT MKFNPLDELEETL YEQFTFQQLEGGGCiG- Fc (SEQ ID NO: 1 3) Ll (N) l K WT MKFNPLDELEETLYEQFTFQQGSGSATGGSGSTASSGS GSATHLEGGGGG- Fc (SEQ ID NO: 14) 2x L1 (N) MGAQKFNPLDELEETL YEQFl'FQQCGGGGGGGKFNPL DELEETLYEQFTFQQLEGGGGG-Fc (SEQ ID NO: 15) 2xLl (N) WT MKFNPLDELEETL YEQFTFQQGGGGGGGKFNPLDELEE TL YEQFTFQQLEGGGGG--Fc (SEQ ID NO: 16) Con4 (N) MGAQQEECEWDPWTCEHMLEGGGGG- Fc (SEQ ID NO: 17) Con4 (N) l K-WT MQEECEWDPWTCEHMGSGSA TGGSGST ASSGSGSATH LEGGGGG-Fc (SEQ ID NO: 18) 2xCon4 (N) l K MGAQQEECEWDPWTCEHMGSGSATGCJSGSTASSGSG S ATHQEECEWDPWTCEHMLEGGGGG Fc (SEQ TD NO: 19) Ll(C) M-Fc-GGGGGAQKFNPLDELEETLYEQFTFQQLE (SEQ IDN0:20) 00185 B 1125 wo 031 057134 113 PCT /US02/3 2 65 7 Ll (C) l K M-Fc- GGGGGAQGSGSATGGSGSTASSGSGSATHKFNPLDELE ETL YEQFTFQQLE (SEQ ID N0:2 1) 2x L l(C) M-Fc- GGGGGAQKFN PLDELEETL YEQF L'FQQGGGGGGGGKF NPLDELEETLYEQFTFQQLE (SEQ ID N0:22) Con4 (C) M-·-Fc-GGGGCiAQQEECEWDPWTCEHMLE (SEQ ID N0:23) Con4(C) l K M-Fc- GGGGGAQGSGSA TGGSGST ASSGSGSATHQEECEWDP WTCEHMLE (SEQ ID N0 :24) 2xCon4 (C) l K M-Fc- GGGGGAQQEECEWDPWTCEHMGSGSATGGSGST ASS GSGSATHQEECEWDPWTCEHMLE (SEQ ID N0:25) Con4-Ll (N) MGAQEECEWDPWTCEHMGGGGGGGGKFNPLDELEET L YEQFTFQQGSGSATGGSGST ASSGSGSATHLEGGGGG- Fc (SEQ ID N0:26) Cor14-Ll (C) M-Fc- GGGGGAQGSGSATGGSGSTASSGSGSATHKFNPLDELE ETL YEQFIFQQGGGGGQEECEWDPWTCEHMLE (SEQ TD N0-.27) TN-12-9 (N) MGAQ-FDYCEGVEDPl--1FGCDNHLE-GGGGG-Fc (SEQ ID N0:28) Ct7(N) MGAQ-QYGCDGFLYGCMINLE-GGGGG-Fc (SEQ ID N0:29) TN~-8 (N) MGAQ-KRPCEEMWGGCNYDLEGGGGG-Fc (SEQ ID N0:30) TN8- 14 (N) MGAQ-HQICKWDPWTCKI-IWLEGGGGG- Fc (SEQ lD N0 :3 1) Con J (N) MGAQ-KRPCEElFGG< :TYQLEGGGGG-Fc (SEQ ID N0:32) U tabeli 4, \"Fc\" se odnosi na humanu Fc lgGl sekvencu. U ko loni dva daje sc aminokiselinska sekvenca pcptibodi. Njen Fc deo je obeležen kao \"Fc\", dat je u SEQ lD NO: 60, dole. Smatrace se da kada se koristi oznaka, na p ri mer, \"Con4\" ili \"Con-4\", to se odnosi na pcptid Con-4, dok upotreba sufiksa \"C\", \"(C)\", ili \"-C\"; ili \"N\", \"(N)\", ili \"-N\" 00185 B 1135 10 15 20 wo 03/057 134 114 PCT/US02/32G57 uz o;;.na.ku, oznacava daje moleku! pcptibod i onakav kakav je tu opisan. Su!iksi \"N\", \"(N)\", ili \"-N\" u imenu peptibodi oznacav~ju da Ang-2 vezujuci peptid (ili pcptidi) je /su N-tem1inalni prema Fc domenu. a sufiksi \"C\", \"(C)\" ili \"-C oznacavaju da Ang-2 vezujuci pcptid (ili peptidi) je /su C-terminalni prema Fc domenu . Dalje, 2xCon4 (C) lK, kako je definisano u SEQ ID NO: 25 , može se obclcžavati i bez sufiksa \"lK\". Aminokiselinska sekvenca Fc dela svake peptibodi data je kako sledi (od amino tcnninusa prema karboksilnom tcrrninusu): s s DKTHTCPPCPAPELLGGPSYFLFPPKPKDTLMfSRTPEVTCWYDV SHEDPEYKFNWYVDGVEYHNAKTKPREEQYNSTYRYVSYLTVL HQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPP RDELTKNQVSLTCLYKGFYPSDIA YEWESNGQPENNYKTTPPVL DSDGSFFLYSKLTVDKSR WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSL LSPGK (SEQ ID NO: 60) DNK sekvenca (SEQ lD Nos: 33-53) koja enkodira peptibodi odgovara pep ti bodi SEQ ID NOs : 12-3 2, redom, u tabeli 4) navedena je dole: 00185 B 1145 10 15 20 25 30 wo 03/05 7 134 115 PCT/US02/32657 SEQ ID NO: 33 ATGGGTGCACAGAAATTCAACCCGCTGGACGAACTGGAAGAAACTCT GTACGAACAGTTCACTTTCCAGCAGCTCGAGGGTGGAGGCGGTGGGG ACAAAACTCACACATGTCCACCTTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGG GACCCiTCAGTTTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGAT CTCCCGGACCGCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGA AGACCC'TGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACC.iGCGTGGAGGTGC ATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGT/\\CAACAGCACGTAC CGTGJ. CIGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAA TGGC AAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATC GAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGT GTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAG CCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGA GTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTC CCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGT GGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGAT GCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTC TCCGGGTAAATAATGGATCC SEQ lD N0:34 ATGAAATTCAACCCGCTGGACGAACTGGAAGAAACTCTGTACGAACA GTTCACTTTCCAGCAGCTCGAGGGTGGAGGCGGTGGGGACAAAACTCA CACATGTCCACCTTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGT TTTCCI.CTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCAfGATCTCCCGGACC CCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGA GGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAA GACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCA GCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACA AGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCA TCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTG CCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGC CTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGC 00185 B 1155 10 15 20 25 \\VO 03/05 7 134 116 PCT/US02/32657 AATGCK1CAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGA CTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAG CAGG'J.GGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGG e TCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTA A ATAA SEQ ID N0:35 ATGAAATTCAACCCGCTGGACGAACTGGAAGAAACTCTGTACGAACA GTTCACTTTCCAGCAGGGATCCGGTTCTGCTACTGGTGGTTCCGGCTCC ACCGC.AAGCTCTGGTTCAGGCAGTGCGACTCATCTCGAGGGTGGAGGC GGTGGGGACAAAACTCACACATGTCCACCTTGCCCAGCACCTGAACTC CTGGGGGGACCGTCAGTTTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACC CTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTG AGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGT GGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACA GCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGC TGAA'l.GGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCA GCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGA ACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAA CCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACAT CGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGA CCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAA GCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTCJGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCAT GCTCCCITGA TGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCC TCTCCCTGTCTCCGGGTAAATAA SEQ ID N0:36 ATGGGTGCACAGAAATTCAACCCGCTGGACGAACTGGAAGAAACTCT GTACGAACAGTTCACTTTCCAGCAGGGTGGTGGTGGTGGTGGCGGTGG 00185 B 1165 10 15 20 25 30 wo 03/057 134 117 PCT/US02/32657 TAA TAAGTTCAACCCACTGGATGAGCTGGAAGAGACTCTGTATGAACAGTT CACTI\"I 'CCAGCAACTCGAGGGTGGAGGCGGTGGGGACAAAACTCACA CATGTCCACCTTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTTT TCCTCI'TCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCC CTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAG GTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAG ACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAG CGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAA GTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCAT CTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGC CCCCA'rCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCC TGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCA ATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGAC TCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGC AGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCT CTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAA A SEQ ID N0:37 ATGAAATTCAACCCGCTGGACGAACTGGAAGAAACTCTGTACGAACA GTTCACTTTCCAGCAGGGTGGTGGTGGTGGCGGTGGTAAGTTCAACCC ACTGGATGAGCTGGAAGAGACTCTGTATGAACAGTTCACTTTCCAGCA ACTCGAGGGTGGAGGCGGTGGGGACAAAACTCACACATGTCCACCTT GCCCACiCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTTTTCCTCTTCCCCCC AAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATG CGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTG GTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGG AG GAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCC TGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCC AACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAA AGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGG ATGAGC'l'GACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCT 00185 B 1175 10 15 20 25 WO 03/0571 34 118 PCT/US02/J2657 TCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCG GAGAACAACTACAAGACCACGC:CTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCC TTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAG GGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCAC TACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATAA SEQ ID N0:38 ATGGGTGCACAGCAGGAAGAATGCGAATGGGACCCATGGACTTGCGA ACACATGCTCGAGGGTGGAGGCGGTGGGGACAAAACTCACACATGTC CACCTTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTTTTCCTCT T CCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGG T CAC/\\TGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGT T CAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGC CGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTC ACCGTCCTGCJ\\CCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAA GGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCA A AGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCAT CCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTC A AAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGG CAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGA e GGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGG CAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCAC AACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATAA SEQ ID N0:39 30 ATGCAGGAAGAATGCGAATGGGACCCATGGACTTGCGAACACATGGG ATCCGGTTCTGCTACTGGTGGTTCCGGCTCCACCGCAAGCTCTGGTTCA GGCAGTGCGACTCATCTCGAGGGTGGAGGCGGTGGGGACAAAACTCA 00185 B 118wo 03/057 [ 34 119 PCTIUS02i32657 CACATGTCCACCTTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGT TTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCrCCCGGACC CCTGAGGTC:ACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGA GGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAA 5 GACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCA GCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAA TGGCAr'\\.CJGAGTACA AGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCA TCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTG CCCCCA TCCCC1GGA TGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGC 1 o CTGGTCAAAGGCTTCT ATCCCAGCGACA TCGCCGTGGAGTGGGAGAGC AATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGA CTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAG CAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGC TCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAA 15 ATAA SEQ ID N0:40 ATGGGTGCACAGCAGC1AAGAA TGCGAATGGGACCCATGGACTTGCGA ACACATGGGATCCGGTTCTGCTACTGGTGGTTCCGGCTCCACCGCAAG CTCTGGTTCAGGCAGTGCGACTCATCAGGAAGAATGCGAATGGGACCC 20 ATGGACTTGCGAACACATGCTCGAGGGTGGAGGCGGTGGGGACAAAA CTCACACATGTCCACCTTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGT CAGTTTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGA'fCTCCCG GACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACC CTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATG 25 CCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTG GTCAGCGTCCrCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAG TACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAA ACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACAC CCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGAC 30 CTGCCTGGTC.I\\AAGGCTTCTA TCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGA GAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGC TGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACA AGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCG1'GATGCATG 00185 B 119WO 0.3/0571 34 120 PCT/US02i32657 AGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGG GTAAATAA SEO ID N0:41 ATGGACAAAACTCACACATGTCCACCTTGCCCAGCACCTGAACTCCTG 5 GGGGGACCGTCAGTTTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTC ATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGC CACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGA GGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCA CGT ACCGTG\"J.GGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGA 10 ATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCC . CCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACC ACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCA GGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGC CGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCA 15 CGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCT ACAGCAAGCT CACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTC CGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTC CCTGTCTCCGGGTAAAGGTGGAGGTGGTGGTGCACAGAAATTCAACCC GCTGGACGAGCTGGAAGAGACTCTGTACGAACAGTTT ACTTTTCAACA 20 GCTCGAGT AA SEQ TD N0:42 ATGGACAAAACTCACACATGTCCACCTTGCCCAGCACCTGAACTCCTG GGGGGACCGTCAGTTTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTC 25 A TGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGG ACGTGAGC CACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGA GGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCA CGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGA ATGGCAAGCJAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCC 30 CCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACC ACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCA GGTCAGCCTCIACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCT A TCCCAGCGACATCGC CGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCA 00185 B 1205 10 15 20 25 30 wo 03/057134 121 PCT/US02/32G57 CGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCT CACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTC CGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTC CCTGTCTCCGGGTAAAGGTGGAGGTGGTGGTGCACAGGGATCCGGTTC TGCT ACJ'GGTGGTTCCGGCTCCACCGCAAGCTCTGGTTCAGGCAGTGC GACTCATAAATTCAACCCGCTGGACGAACTGGAAGAAACTCTGTACGA ACAGTTCACTTTCCAGCAACTCGAGTAA SEQ IDN0:43 ATGGACAAAACTCACACATGTCCACCTTGCCCAGCACCTGAACTCCTG GGGGGACCGTCAGTTTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTC ATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGC CACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGA GGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCA CGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGA ATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCC CCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACC ACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCA GGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGC CGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCA CGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCT CACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCT e CGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTC CCTGTCTCCGGGTAAAGGTGGAGGTGGTGGTGCACAGAAATTCAACCC GCTGGACGAACTGGAAGAAACTCTGTACGAACAGTTCACTTTCCAGCA GGGTGGTGGTGGTGGTGGCGGTGGTAAGTTCAACCCACTGGATGAGCT GGAAGAGACTCTGTATGAACAGTTCACTTTCCAGCAACTCGAGTAA SEQ ID N0:44 ATGGACAAAACTCACACATGTCCACCTTGCCCAGCACCTGAACTCCTG GGGGGACCGTCAGTTTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTC ATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGC 00185 B 121wo 03/057 134 122 PCT!US02/3 2657 CACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGA GGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCA CGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGA ATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCC 5 CCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACC ACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCA GGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGC CGTGGACiTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCA CGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTICCTCTACAGCAAGCT 10 CACCGTCiGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTC CGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTC CCTGTCTCCGGGTAAAGGTGGAGGTGGTGGTGCACAGCAGGAAGAAT GCGAATGGGACCCATGGACTTGCGAACACATGCTCGAGTAA SEQ ID N0:45 15 ATGGACAAAACTCACACATGTCCACCTTGCCCAGCACCTGAACTCCTG GGGGGACCGTCAGTTTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTC ATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGC CACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGA GGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCA 20 CGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGA ATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCC CCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACC ACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCA GGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGC 25 CGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCA CGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCT CACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTC CGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTC CCTGTCTCCGGGTAAAGGTGGAGGTGGTGGTGCACAGGGATCCGGTTC 30 TGCTACTGGTGGTTCCGGCTCCACCGCAAGCTCTGGTTCAGGCAGTGC GACTCATCAGGAAGAATGCGAATGGGACCCATGGACTTGCGAACACA TGCTCGAGTAA SEQ ID N0:46 00185 B 122wo 03/057134 123 PCT/US02/32657 ATGGACAAAACTCACACATGTCCACCTTGCCCAGCACCTGAACTCCTG GGGGGACCGTCAGTTTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTC ATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGC CACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGA 5 GGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCA CGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGA ATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCC CCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACC ACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCA 10 GGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGC CGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCA CGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCT CACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTC CGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTC 15 CCTGTCTCCGGGTAAAGGTGGAGGTGGTGGTGCACAGCAGGAAGAAT 20 GCGAATGGGACCCATGGACTTGCGAACACATGGGATCCGGTTCTGCTA CTGGTGGTTCCGGCTCCACCGCAAGCTCTGGTTCAGGCAGCGCGACTC ATCAGGAAGAATGCGAATGGGACCCATGGACTTGCGAACACATGCTC GAGTAA SEQEDN0:47 ATGGGTGCACAGGAAGAATGCGAATGGGACCCATGGACTTGCGAACA CATGGGTGGTGGTGGTGGTGGCGGTGGTAAATTCAACCCGCTGGACG A 25 ACTGGAAGAAACTCTGT ACGAACAGTTCACTTTCCAGCAGGGATCCGG TTCTGCTACTGGTGGTTCCGGCTCCACCGCAAGCTCTGGTTCAGGCAG T 30 T GCGACTCATCTCGAGGGTGGAGGCGGTGGgGACAAAACTCACACATGT CCACCTTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTTTTCCTC TCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGG TCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGT TCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAG 00185 B 1235 10 15 20 25 30 wo 03/057134 124 PCT/US02/32657 CCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTC ACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAA GGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAA AGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCAT CCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCA AAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGG CAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGAC GGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGG CAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCAC AACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATAA SEQ lD N0:48 ATGGACA.AAACTCACACATGTCCACCTTGCCCAGCACCTGAACTCCTG GGGGGACCGTCAGTTTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTC ATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGC CACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGA GGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCA CGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGA ATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCC CCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACC ACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCA GGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGC CGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCA CGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGC T CACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTC CGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTC CCTGTCTCCGGGTAAAGGTGGAGGTGGTGGTGCACAGGGATCCGGTTC TGCTACTGGTGGTTCCGGCTCCACCGCAAGCTCTGGTTCAGGCAGTGC GACTCATAAATTCAACCCGCTGGACGAACTGGAAGAAACTCTGTACG A ACAGTTCACTTTCCAGCAGGGTGGTGGCGGTGGTCAGGAAGAATGCGA ATGGGACCCATGGACTTGCGAACACATGCTCGAGTAA 00185 B 124wo 03i057134 125 PCT/US02!32657 SEQ ID N0:49 ATGGGTGCACAGTTCGACTACTGCGAAGGTGTTGAAGACCCGTTCACT TTCGGTTGCGACAACCACCTCGAGGGTGGAGGCGGTGGGGACAAAAC TCACACATGTCCACCTTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTC 5 AGTTTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGG ACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCT GAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCC AAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGT CAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTA 1 o CAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCA TCG AGAAAAC CATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCC TGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCT GCCTGGTCAA.AGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGA GCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTG 15 GACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCT ACAGCAAGCTCACCGTGG ACAAG AGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAG GCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGT AAATAA 20 SEO ID N0:50 ATGGGTGCAC:AGCAGTACGGTTGCGACGGTTTTCTGTACGGTTGCATG ATCAACCTCGAGGGTGGAGGCGGTGGGGACAAAACTCACACATGTCC ACCTTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTTTTCCTCTTC CCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTC 25 ACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTC AACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCC GCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCA CCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAG GTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAA 30 GCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCC CGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAA AGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGC AGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGAC 00185 B 125wo 03/057134 126 PCT/US02/32657 GGCTCCTTCTTC;CTCT ACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGG CAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCAC AACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGT AAA T AA SEQ ID N0 :51 5 ATGGGTGCACAGAAACGCCCATGCGAAGAAATGTGGGGTGGTTGCAA CTACGACCTCGAGGGTGGAGGCGGTGGGGACAAAACTCACACATGTC CACCTTGCCCAGCACCTG AACTCCTGGGGGGACCGTCAGTTITCCTCTT CCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCA TGA'fCTCCCGGACCCCTGAGGT CACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTT 1 o CAACTGGT ACGTGGACGGCGTGGAGGTGCAT AA TGCCAAGACAAAGC CGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTC ACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAA GGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAA AGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCAT 15 CCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCA AAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGG CAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGAC GGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGG CAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCAC 20 AACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAAT AA SEQ lD N0:52 ATGGGTGCACAGCACCAGATCTGCAAATGGGACCCGTGGACCTGCAA ACACTGGCTCGAGGGTGGAGGCGGTGGGGACAAAACTCACACATGTC CACCTTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTTTTCCTCTT 25 CCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGA TCTCCCGGACCCCTGAGGT CACATGCGTGGfGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTT CAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGC CGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTC ACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAA 30 GGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAA AGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCAT CCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCA AAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGG 00185 B 1265 10 15 wo 03/057134 128 PCT!US02/32657 2xL1 (C) 0.90 1.0 Con4 (N) lK- 1.9 WT Ll(N) 6 ll Nema inhibicijc Cl7 (N) 9 13 Nema inhibicije !2-9 (N) 21 7.7 Nema inhibicije C:onl (N) 26 -200 Nema inhibicije 8-14 (N) 45 33 Nema inhibicije LI(C) 65 37 8-8 (N) 80 -700 Nema inhibicije Negativna Nema Nema Nema Nema Nema Nema kontrola inhibicije inhibicije inhibicije inhibicije inhibicije inhibicije peptibodi4883 Aminokisclinska sekvenca negativne kontrole peptibodi 4883 je sledeca (Fc deo je podvucen, linker je \"GGGGG\", a pcptidni deo je napisan masnim slovima): MDK THTCPPCP APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVD VSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL HQDW1 ,NGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPS RDEL TK NQVSLTCLVKGFYPSDLA VEWESNGQPENNYKTTPPVLD SDGSFFL YSKL TVDKSRWQQGNVFSCS VMHEALHNHYTQKSLSLS PGK-GGGGG-CTAGYHWNSDCECCRRN (SEQ ID NO: 243) Ovde ce sc smatrati da upotreba izraza \"Nema inhibicije\" ne znaci dajedinjenja nemaju inhibitorna svojstva. Umesto toga, \"Nema inhibicije\" kako se ovde koristi odnosi se na ona jec.linjenja koja su, kada se testiraju koristeci neutralizacioni ELISA test pod ovde opisanim uslovima, iskazala IC 5 o vrednosti vece od 1000 nM, što je naj viša koncentracija na kojoj su ova jedinjenja testi rana. lako nisu detektovana znacajna inhibitorna svojstva molekula koji su obeleženi sa \"Nema inhibicijc\", smatracc se da ti molekuli mogu u stvari iskazati inhibitoma svojstva pod drugim uslovima testiranja, ili u drugim testovima. U prioritetnoj manifestaciji, smatrace se da se pronalazak odnosi na peptibodi koja imaju inhibitornc kvalitete pod uslovima testiranja koji su ovde opisani. 00185 B 1275 10 15 20 WO 03!057134 129 PCT:l ;S02!32657 Dve peptihodi su tcstirane koristeci afinitetni BIAcore test (kako je opisano u primcru 2). Rezultati su dati u tabeli 6 dole. Peptibodi Pb Ll (N) Con4 (N) TN12-9 (N) hAng-2 mAng-2 Kn ka(l/Ms) kd(l/s) Kn(nM) ka (l/Ms) kd(l/s) (nM) 3- l 2.9 X ] 0) 9.1 X 10 4 0.42 5.6 X 10) 2.3 X 10 4 0.67 3.3 X 1()-~ 2.2 X 10 4 0.60 7.3 X 10::. 4.4 X 10 4 8.2 1.2 x 1 o ' 1.0 X lOCj 0.32 7.2 X 10) 2.3 X 10 4 Tabela 6 Afinitet peptibodi (Pb) prema hAng-2 i mAng-2 Primer 7 Proucavanje terapeutske efikasnosti sistematicnom primenom Ang-2 peptibodi Ang-2 peptibodi, TN8-Con4-C, su subkutano primenjcni u miševe sa A43l tumorom prema rasporedu jednom dnevno 72 sata posle izazivanja tumora. Upotrebljene doze peptibodi bile su l 000, 200, 40 i 8 ug/miš/dan. Svim životinjama dato je ukupno 20 doza. Zapremina tumora i tclesna težina beležene su tri puta nedeljno . Na kraju studije životinje su žrtvovane, i njihovi serumi su sakupljeni u cilju odredivanja nivo peptibodi ELISA eksperimentom. Tumori i grupa normalnih tkiva su sakupljeni iz svih grupa. Rezltati su prikazani na slici 1. Kako se može videti, primecene su znacajne razlike u rastu tumora izmedu grupe tretirane pomocu Ang-2 peptibodi i kontrolne grupe_ Sve cetiri doze Ang-2 peptibodi inhibirale su rast tumora u poredenju sa kontrolnom grupom (p <0.0001 vs _ kontrolnoj grupi koristeci ponovljeno merenje ANOVA). Nasuprot tome, tumori u kontrolnoj grupi su nastavili da rastu mnogo vecom brzinom. Lecenje ovim peptibodi nije imalo znacajnog efekta na krajnju telesnu težinu, težinu organa ili hematološke parametre životinja tretiranih gore navedenim dozama. 00185 B 1285 10 15 20 25 30 WO 03/05 7 134 130 Primer 8 l . Konstrukcija Ang-2 sekundarnih pcptidnih biblioteka A. Elektrokompetentne celije E.coli PCT/US02!32 657 Epicurian Coli@ XLl-Blue MRF' za elektroporaciju sposobne celije (Stratagene #200 158) su kupljene od Stratagene (Stratagenc Cloning Systems, La Jolla, CA). B. Modifikacija pCESl vektora PCRje izvršen koristeci Extend Long Template PCR Systems (Roche Diagnostics Corp. , Indianapolis, IN) sa l 11g pCESI vektora (TargetQuest Inc.) kao templatom. Zapremina PCR smese bila je 100 !J.l i <>naje sadržavala lx PCR pufcr, 200 nM svakog od dva prajmera 5' CAAACGAATGGATCCTCATTAAAGCCAGA-3' (SEQ ID NO: 244) i 5' GGTGGTGCGGCCGCACTCGAGACTGTTGA/\\.AGTTGTTTAGCA-3' (SEQ ID NO: 245), 200 nM dNTP, i 3 jedinice (U) Tag DNK polimcraze. TRIO Thermoblock (Biomctra) PCR sistem je radio kako sledi : 94 o c tokom 5 minuta; 30 cikla na 94 o c tokom 30 sekundi, 50 ac tokom 30 sekundi, 72 a c tokom 45 sekundi; i 72°C tokom lO minuta; ohladiti na 4 a c. PCR proizvodi su stavljeni na l % agarozni gel i precišceni na QJAGEN spin koloni (QIAGEN Inc., Valencia, CA) prema proizvodackim protokolima. Druga PCR reakcija je izvršena sa S 111 PCR proizvoda i 200 nM svakog od dva prajmcra 5'-CAAACGAATGGATCCTCATTAAAGCCAGA-3' (SEQ ID NO: 246) i 5'- AACACAAAAGTGCACAGGGTGGAGGTGGTGGTGCCiGCCGCACT -3' (SEQ ID NO: 247) pod istim PCR uslovima opisanim gore. PCR proizvodi i originalni pCES l vektor su zatim odvojeno digestovani u l OO ~-tl reakciji koj a je sadržavala lx NEB2 pu fer. 60 U A palJ (New England Biolabs, Beverly, MA), 60 U BamHI (New England Biolabs) na 37 a c tokom l sata. Digestovana DNKje zatim precišcena na QIAGEN spin koloni i ligirana zajedno u 40 J .. d reakciji koja sadrži lx ligacioni pufer i 40 U T4 DNK ligazc (New England Biolabs), preko noci na sobnoj temperaturi. Vektori su transfektovani u E. coli i inkubirani na 3 7 o e preko noci . Izolovane pojedinacne kolonije su odabrane i plazmid je zatim precišcen na 00185 B 1295 10 15 20 25 30 wo 03/057 134 131 PCTIIJS02/3 2657 QIAGEN spin koloni. Isprani insert je potvrden DNK sekvencionisanjcm. C. Dobijanje vektorske DNK Jedan mikrogram modifikovanog pCESI vektora DNK (iz odeljka lB gore) je transformisan u 40 111 elektrokompetcntne XLI -blue E. coli (iz odeljka lA gore) koristeci (renc Pul ser ll (BIO-RAD, Hercules, CA) setovan na 2500V, 25 flF, i 200 oma. Transfonnisani uzorak bakterije zatim je odmah prenesen epruvcticu koja sadr7.i 960 ~Ll SOC (2 % triptona, 0.5 % ekstrakta kvasca, l O mM NaCl, 2,5 mM KC l, 20 mM glukoze, l O mM MgS04, l O mM MgS0 4 ), i kultura je ostavljena da raste na 37 °C uz muckanje tokom l sata. C:elije su zatim prost1ie na 2xYTAGT (2xYT sa 100 ug J ml ampicilina, 12.5 ug/ml tctraciklina i 2% glukoze) agar plocu i inkubiranc na 37 oc preko noci . Pojedinacna kolonija je potvrdena sekvencionisanjem i upotrebljena za inokulaciju 2 litra 2xYTAGT medijuma na 37 oc: uz muckanje preko noci. Plazmidni vektor DNK je precišcen koristeci QIAGEN Plasmid Maxi Kit prema proizvodackim protokolima. D. Digcstija vektorske DNK U ku pn o oko 2000 mikrograma vektorske DN K (iz ode lj ka lC iznad) j e digestirano u 5000 111 reakciji koja sadrži lx NEB pufer2, 300 U ApaLI, i 300 U Xhol na 3 7 ac preko noci. Reakcija restrikcionog digestiranja je inkubirana preko noci na 3 7°C i analizirana na gotovom 0.8 % agaroznom gel u (Em bi Tee, San Diego. CA). Linearizovani vektor DNK je zatim isecen sa gela i ekstrahovan koristeci QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN Inc.) prema proizvodackim uputstvin1a. E. Dobijanje biblioteke oligonukleotida Šest biblioteka oligonukleotida (1 fiksirana i 5 dopirani h) je projektovano na osnovu sekvenci izvedenih iz gore opisanih rezultata. Jedna tlksirana biblioteka oligonuklcotida bi la je: 5'-CACAGTGCACAGGGTNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKS ARTGGGATCCGTGGASCNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKCA TT CTCTCGAGATCA-3' (broj biblioteke 20) (SEQ ID NO : 248); 00185 B 1305 10 15 20 25 \\VO 03/057 134 132 PCT/US02/3 2657 a dve od 70% dopiranih biblioteka oligonuklcotida su sledece : 5 1 -CACAGTGCACAGGGTNNKNNKNNKaaKcgKccKNNKga KgaKatKttKggKggKNNKacKtaKcaKNNKNNKNNKCA TTCTC TCGAGATCA-3 1 (broj biblioteke 27); (SEQ ID NO: 249); 5 1 -C ACAGTGCACAGGGTNNKaaKttKaaKccKctKgaKgaKctKgaKga K acKctKtaKgaKcaKttKacKttKcaKcaKNN K CA TTCTCTCGAGA TCA- 31 (broj biblioteke 99); (SEQ lD NO: 250); Mala slova predstavljaju smesu od 70% od naznacenih baza i lO% od svakog od preostala tri nukleotida). Druge tri od 91 % dopirane biblioteke oligonukleotida su kako sledi: 5 1 -CACAGTGCACAGGGTNNKNNKNNKcaKgaKgaKTGCgaKtg KgaKccKtgKacKTGCgaKcaKatKNNKNNKNNKCATTCTCTCGAG A TC A-3~ (broj biblioteke 94); (SEQ ID NO: 251 ); 5 1 -CA CAGTGCACA GGGTNNKttKgaKtaKN NKgaKggKgtKgaKgaKcc KttKacKttKggKNNKgaK.aaKcaKNNKCATTCTCTCGAG A TCA-3 1 (broj biblioteke 25); (SEQ lD NO: 252); I 5~-CACAGTGCACAGGGTNNKaaKttKaaKccKctKgaKgaKctKgaKga KacKctKtaKgaKcaKttKacKttKcaKcaKNNKCA TTCTCTCGAGATCA-3 1 (broj biblioteke 26); (SEQ ID NO: 253); 5 U gore datim oligonuklcotidima onaj obucen u oblasti razumcce da \"N\" oznacava da su svaki od cetiri nukleotida (A, T, C, i G) podjednako zastupljeni tokom sinteze oligonukleotida, a \"K\" oznacava da su nukleotidi G i T zastupljeni tokom sinteze oligonukleotida. Mala slova predstavljaju smesu od 91 %od naznacenih baza i 3 %od svakog od preostala tri nukleotida. Svaki od ovih oligonukleotidaje upotrebljen kao templat u PCR. Za PCR reakcije je upotrebljen Expand High Fidelity PCR Syslem kit (Roche Diagnostics Corp .). Svaka biblioteka je amplifikovana u devedcstšest 00185 B 1315 10 15 20 25 30 wo 03i057134 133 PCT/US02/32657 sudica u 50 1-11 PCR reakciji koja je sadržavala l nM biblioteckih oligonukleotida, lX PCR pufer, 300 nM od svakog prajmera: 5'-CACAGTGCACAGGGT-3' (SEQ ID NO: 254); 5'-TGATCTCGAGAGAATG-3' (SEQ ID NO: 255); 200 !J.M dNTP, 1.5 mM MgCh, i 350 U Expand polimeraze. Tem10cikler (GeneAmp PCR System 9700, Applied Biosystems) je upotrebljen za rad sledcc~g programa: 94 °C tokom 5 minuta; 25 cikla (94 o c tokom 30 sekundi, 52.5 °C tokom 60 sekundi, 72 o c tokom 30 sekundi); 72 oc tokom lO minula; ohladiti na 4 °C. Slobodni nukleotidi su zatim uklonjeni koristeci QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN Inc. Cat#281 04) prema proizvodackim protokolima. F. Digcstija biblioteke oligonukleotida Za svaku biblioteku su PCR proizvodi (odeljak l E) digestirani u reakciji od 1200 1-11 kojaje sadržavala lx NEB pufer2, 750 U ApaLT, i 750 U Xhol na 37 °C preko noci. Digestirana DNKje razdvojena na gotovom 3% agaroznom gclu (Embi Tee, San Diego, CA). Željena DNK traka iz svake reakcUe je isecena sa gela i ekstrahovana koristeci COST AR Spin-X centrifugu sa filterom u cevcici, 0.22 !J.m acetat celuloze (Coming Inc. , CClt# 8160). G. Ligacija vektora sa bibliotekom oligonukleotida Reakcija ligacije od 450 f-l l sadržavala je lincarizovani vektor (odeljak l D) i svaka cligcstirana boblioteka PCR proizvoda (odeljak lF) u 1:5 molamom odnosu, lx NEB ligacioni pufer, i 20,000 U T4 DNK ligaze na 16 o c preko noci . Ligirani proizvodi su inkubirani na 65 oc tokom 20 minuta da se inaktivira T4 DNK ligaza i dalje su inkubirani sa 100 U Noti na 37 oc tokom 2 sata da se minimizira samo ligacija vektora. Ligirani proizvodi su zatim precišceni standardnom ekstrakcijom fenolom i hloroformom (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Maniatis et al .. 3rd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2000) i ponovo suspendovani 00185 B 1325 10 15 20 25 30 \\VO 031 057134 134 PCT/USOZ/32657 u 120 Fl l hO. H. Elektroporaciona transformacija Dvanaest clektroporacionih reakcija je izvršeno za svaku biblioteku. U svakoj transfonuaciji je l O ).tl ligiranog vektora DNK (odeljak I G) i 300 ) .. d XLI BLUE rv! RF' celija (odeljak lA) pomešane u 0.2 cm kiveti (BIO-RAD). Nastala smesa je pulsovana Gene Pulser II nameštenom na 2500 V, 25 uF, i 200 oma. Transfonnisane bakterije iz dvanaest reakcija elektroporacijc su zatim kombi no vane i prenesene u balon koji je sadržavao 26 ml SOC za inkubiranjc na 37 °C tokom l sata. Celije su dodate u 450 ml2xYTAG i g~jene na 37 oc uz muckanjc tokom 5 sati. Celije su centrifugirane na 4000 rpm tokom 15 minuta na 4 °C. ( :cl ijske kugi ice su zatim ponovo suspendovane u 12 m l 15 % glicerol l 2xYT i cuvane na -80 c c. Ovo je bila primarna zaliha biblioteka. Titar je pokazao daje velicina biblioteke 5.0x!O'J (broj biblioteke 20), 3.3 xl0 10 (broj biblioteke 94), 4 . 7 x l 0 9 (broj biblioteke 25), 5.0 x 10 9 (broj biblioteke 26 ), 3.0 x lO lJ (broj biblioteke 27), i 4.2 x 10 9 (broj biblioteke 99) nezavisnih transformanata. 2. Amplifikacija biblioteka A. Dobijanje sekundarnih zaliha biblioteka Iz primarnih biblioteka celijskih zaliha (iz odeljka lli iznad), dovoljno celija da se pokrije l OX višak biblioteka svake velicine, je upotrebljeno za inokulaciju 2xYTAGT (2YT sa 100 ug/ml ampicilina, 12.5ug/ml tctraciklina i 2 %glukoze) medija tako daje polazni 00 600 bio O. l. Kulture su ostavljene da rastu na 37 cc uz muckanje tokom nekoliko sati sve do OD6oo = 0.5 . Jedna desetina alikvota iz svake biblioteke je uzeta i uzgajana je u razdvojen im balonima sledeca dva sata na 37 °C. Ove subkulture su zatim centrifugirane na 4000 rpm koristeci Beckman JA~14 rotor tokom 10 minuta na 4 cc, i kuglice bakterija su ponovo suspendovane u 7 .0 ml (za svaku biblioteku) 15 % glicero l /2xYT radi cuvanja na -80 °C. B. Indukcija fagi Alikvoti Ml3K07 helper fagi (Amersham Pharmacia Biotech) su dodati preostalim bakterijskim kulturama pri OD c,oo:.::.: 0.5 (iz odeljka 2A iznad) do krajnje 00185 B 133wo 03/057 134 127 PCT/US02/3 2657 CAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGAC GGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGG CAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCAC AACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATAA 5 SEQ lD N0 :53 ATGGGTGCACAGAAACGTCCATGCGAAGAAATCTTCGGTGGTTGCACC TACCAGCTCGAGGGTGGAGGCGGTGGGGACAAAACTCACACATGTCC ACCTTGCCCACiCACCl'GAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTTTTCCTCTTC CCCCCAAAAC'CCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTC 10 ACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTC AACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCC GCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCA CCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAG GTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAA 15 GCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCC CGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAA AGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGC AGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGAC GGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGG ~ CAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCG TGATGCATGAGGCTCTGCAC 25 AACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATAA Primer 6 Peptibodi testovi Cetrnaest peptibodi je testirano koristeci ncutralizacionu ELIS A, i tri peptibodi je testirano koristeci afinitetnu ELISA. Rezultati su dati u tabeli 5. Tabela S hAng-2 mAng-2 hAng-l Peptibodi ICSO ECSO IC SO (nM) EC SO IC SO (nM) EC 50 (nM) (nM) (nM) (nM) 2xCon4 (C) 1 K 0.04 0.02 Con4-L1 (C) 0.05 0.04 Con4 (C) 0.20 0.30 2xLl (N) 0.65 0.80 Con4(N) 0.85 0.03 0.72 0.07 Nema Nema inhibicije inhibicije 00185 B 1345 10 15 20 25 WO 03/057134 135 PCT /US02/3 2657 koncentracije od 3 X l 0 9 pfu/ml. Helper 1agi su ostavljeni da inficiraju bakterije na 37 o c tokom 30 minuta bez muckanja i 30 minuta uz blago muckanje. lnficirane cel~jc su centrifugiranc na 5000 rpm tokom 15 minuta na 4 ac. Celijske kuglice su ponovo suspendovane u istoj zapremini (iz odeljka 2A i;r.nad) medijuma 2xYTAK (2YT sa 1 OO ug/ml ampicilina i 40 ug / ml kanamicina). Produkcija fagi vršena je na 30 ac preko noci uz muckanje . C. Sakupljanje fagemida K.ulture bakterija iz odeljka 28 iznad su ccntrifugiranc na 5000 rpm tokom 15 minuta na 4 ac. Supematanti su zatim preneseni u nove tlaše, i 0.2 zapremine 20% PRG/2.5M NaCl je dodato i inkubirana na ledu tokom l sata da se stalože fagemidi. Staloženi fagemidi su centrifugirani na l 0,000 rpm tokom 30 minuta na 4 °C i pa7.1jivo ponovo suspendovani u 100 ml hladnog PBS. Rastvor fagemidaje dalje precišcavan uklanjanjem preostalih celija centrifugiranjem na 4000 rpm tokom l O minuta na 4 ac taloženjem fagemida dodavanjem 0.2 zapre mine of 20 % PEG/2.5M NaCl. Fagemidi su centrifugirani na 10,000 rpm tokom 30 minuta na 4 °C, a kuglice fagemida su ponovo suspcndovane u 1.8 ml hladnog PBS. Šest ml60 % rastvora glicerola solution je dodato rastvoru fagemida radi cuvanja na -80 o c. Ti tar fagemida je odreden standardnim postupkom (Molecular Cloning, Maniatis ct al 3rd Edition). 3. Selekcija Ang-2 vezujuce fagi A. Imobilizacija Ang-2 na magnetne perlice Biotinilovani Ang-2 (iz odeljka 3A iznad) je imobilisan na Dynabcad M- 280 Streptavidin (DYNAL, Lake Success, NY) pri koncentraciji od 2000 ng Ang- 2 proteina na l OO ~Ll zalihe perl ica dobivenih od proizvodaca. Povlaceci perlice pomocu magneta na jednu stranu epruvetice i uklanjajuci tecnost pipetom, perlice su isprane dva puta fosfatnim puferom vodenog rastvora soli (PBS) i ponovo su suspendovane u PBS. Biotinilovani protein Ang-2 je dodat ispranim perlicama na gornjim koncentracijama i inkubiran uz rotiranje na sobnoj temperaturi l sat. Ang- 2-obložcne perlice su blokirane dodavanjem BSA do oko 2 % krajnje 00185 B 1355 \\VO 03/05 7134 136 PCT/US02/32657 koncentracije i inkubirane su preko noci na 4°C uz rotiranje. Dobivene Ang-2- obložen<: perlice su zatim isprane dva puta sa PBST (PBS sa 0.05% Tween-20) pre nego što su podvrgnute selekciji. B. Selekcija pomocu Ang-2 obloženih perlica Oko l 000-struki bibliotecki ekvivalent fagemida (iz odeljka 2C iznad) je blokiran tokom jednog sata pomocu l ml PBS koji sadrži 2% A. Uzorak blokiranog iagemidaje u tri koraka negativno selekcionisan dodajuci ga praznim pcrlicama (iste perlice kao u odcljku 3A, ali bez Ang-2 proteinske obloge), i ova smesa je inkubirana na sobnoj temperaturi tokom 15 minuta uz rotiranje. Supcrnatant koji sadrži fagemid je izvucen 1 o pomocu magneta i prenesen u drugu epruveticu koja je sadržavala prazne perlice (iste perlice kao u odeljku 3A, ali bez Ang-2 proteinskc obloge), i ova smesa je inkubirana na 15 20 25 sobnoj temperaturi tokom 15 minuta uz rotiranje. Ovaj postupak je ponovljen. Supernatant koji sadrži fagcmid je izvucen pomocu magneta i prenesen u novu epruveticu koja je sadržavala perlice obložene Ang-2 proteinom (iz odeljka 3A), i ova smesa je inkubirana na sobnoj temperaturi tokom 15 minuta uz rotiranje. Pošto je supernatant odbacen, perlice vezane za fagemid su isprane l O puta sa 2 % mleko-PBS; l O puta sa 2 '~o BSA-PBS; l O puta sa PBST i dva puta sa PBS . Fagemidi su ostavljeni da se eluiraju u 1 ml 100 mM trietilaminskog rastvara (Sigma, St. Louis, MO) tokom 10 minuta uz rotiranje. pH rastvara koji sadrži fagemid je neutral isan dodatkom 0.5 ml l M Tris-H CI (pH 7.5). Dobijeni fagemidi su upotrebljeni za infekciju l O ml sveže odg~jenih XLI Blue MRP' bakterija (OD 600 oko 0.5) na 37 oc tokom 30 minuta bez muckanja i 30 minuta uz slabo muckanje . Sve inficirane XLl-BLUE MRF' celije su zatim prostrte na 15X15cm 2xYTAG plocu i inkubiranc na 30 °C preko noci. C. Indukcija i sakupljanje fagc lO ml alikvot medijuma 2xYTAGT je dodat ploci (iz odeljka 3B) da se ponovo suspenduju XLI-BLUE MRF' celije. Sve XLI-BLUE MRF' celije su sakupljene u epruveticu, i alikvot od 250 ).d ovih celija je dodat u 25 ml 00185 B 1365 10 15 20 25 30 WO OJ/057134 137 PCT/US02/32657 2xYTAGT i uzgajanje na 37 o c do ODG no = 0.5. M t 3K07 helper fagi su dodate do krajnje koncentracije od 3 x 10 9 efu/ml i inkubiranc su na 37 °C tokom 30 minuta bez muckanja i 30 minuta uz slabo muckanje. c:eJije su centrifugirane na 5000 rp m tokom l O minuta na 4 a c i ponovo suspendovanc u 25 ml 2x YTAK. Ove bakterije su ostavljene da rastu na 30 °C preko noci uz muckanje. Indukovani fagemidi su sakupljeni i precišceni kako se dati u odeljku 2C. D. Drugi krug selekcije Drugi krug selekcije je izvršen kao što je opisano u odcljcima 3B do 3C osim sledeceg . Oko 1000-struki bibliotecki ekvivalent fagcmida iz odeljka 3C je upotrebljen kao input fagemid. Kolicina biotinilovane Ang-2 proteinske (odeljak JA) obloge na Dynabead M-280 Strcptavidin je opala na 20 n g. Za tage vezane perlice su zatim isprane l O puta sa 2 % mleko-PB S; l O puta sa 2 % BSA-PBS; l O puta sa PBST, pri cemu je poslednje ispiranje ukljucivala 60 m.inuta inkubacije na sobnoj temperaturi u PBST. Perlice su isprane dva puta sa PBS. Elucioni uslovi bili su isti kao i prvom krugu (odeljak 3B). E. Treci krug selekcije Treci krug selekcije je izvršen kao što je opisano u odeljcima JB do 3C osim sledeceg. Oko l O -struki bibliotecki ekvivalent fagemida iz odeljka 30 je upotrebljen kao input fagemid. Oko 2 ng biotinilovane Ang-2 proteinske (iz odeljka JA) obloge na Dynabead M-280 Streptavidin. Za fagi vezane perlice su zatim isprane l O puta sa 2 % mleko-PBS ; l O puta sa 2 % BSA-PBS; l O puta sa PBST, pri cemu je poslcdnje ispiranje ukljuci valo 60 minuta inkubacije na sobnoj temperaturi u PBST. Perlice su isprane dva puta sa PBS. Elucioni uslovi bili su isti kao i pravom krugu (odeljak JB). f. Cetvrti krug selekcije (~etvrti krug selekcije je izvršen kao što je opisano u odeljcima 3B do 3C osim sledeceg. Bibliotecki ekvivalent tagemida iz odeljka 3D je upotrebljen kao input fagemid . Kolicina biotinilovane Ang-2 proteinske (odeljak 3A) obloge na Dynabead M-280 Streptavidinje opala na 0.4 ng u slucaju biblioteka 25, 26, i 27. U bibliotekama 20 i 94, kolicina za oblaganje zadržana je na 2 ng. Biblioteka 99 00185 B 1375 10 15 20 25 30 WO 03/057 134 138 PCT/US02/32657 nije uzet<\\ za cetvrti krug selekcije. Uslovi eluiranja bili su isti kao i u prvom krugu (odcljak 3B). 4. KLONALNA ANALIZA A. Dobijanje glavne ploce Pojedinacne kolon~je iz drugog kruga selekcije su uzete i inokulirane u plocu sa% sudica koje sadrže 120 J1]2xYTAGT po sudicu. Ploce sa 96 sudica su inkubiranc na muckalici na 30 ac preko noci. Cetrdeset mikrolitara 60 % glicerola je dodato po sudicu radi cuvanja na -80°C. B. Fagemid ELISA Oko 2 f.ll alikvoti celija iz glavne ploce (iz odeljka 4A iznad) su inokulirani u sveži Costar(R) plocu sa 96 sudi ca (Coming incorporated. Coming, NY. cat. #9794) koji su sadržavali 100 !J.l2xYTAGT po sudicu, ova nova ploca sa celijama je uzgajana na 37 o c do približne OD c,oo = 0.5. Cetrdeset ~tl2xYTAGT koji je sadržavao M13K07 helper fagi (1.5 x 10 13 efu/ml) je dodat svakom sudicu, i ploca sa 96 sudicaje inkubirana na 37 oc tokom 30 minuta bez muckanja i 30 minuta uz slabo muckanje. Ploca je centrifugirana na 2000 rpm (Beckman CS-6R tabletop centrifuge) tokom 10 minuta na 4 °C. Supernatanti su uklonjeni iz sudica, i svaka celijska kuglica je ponovo suspcndovana koristeci 150 )..ll 2x YTAK po sudi cu. Ploca je inkubirana na 30 o e preko noci radi ekspresije fagemida. H uman i Ang-2 protein je obložen na Maxisorp plocu sa 96 sudica (NUNC) na 1 f.l gl ml u JxPBS na 4 o c preko noci . Kao kontrola, odvojena Maxisorp ploca je obložena sa 2 % BSA (Sigma). Sledeceg dana, celijske kulture inkubirane preko noci su centrifugirane na 2000 rpm tokom 1 O minuta na 4 oc. Deset !J. l supernatanta iz svakog sudicaje preneseno u novu plocu sa 96 sudica koji su sadržavali BSA/PBS rastvor da razblaže supernatant na l: l O. Dobivene smese su inkubirane tokom 1 sata na sobnoj temperaturi uz muckanje radi blokiranja fagemid a. U meduvremenu, Ang-2 proteinima obložena ploca je blokirana koristec i 400 1-1-l rastvara 2 % BSA l PBS na sudic tokom l sata na sobnoj temperaturi uz muckanjc. Rasvor I3SA je odbacen, i svaki sud ic je dobro ispran tri puta pomocu PBS rast vora. Posle poslednjc faze ispiranja, 100 j.ll rastvara blokiranog fagemida 00185 B 1385 10 15 20 25 30 wo 03/057134 139 PCT/US02/32657 je dodalo svakom sudicu ploce obložene Ang-2 proteinom, kao i kontrolnoj ploci. i one su inkubirane tokom l sata na sobnoj temperaturi iz muckanjc. Tecnost je odbacena. i svaki sudic je dobro ispran tri puta rast vorom PBST. Sto f.tl HRP kot~ugovanog anti-Ml3 mAh (Amcrsham Pharmacia Biotech) pri razblaženju od 15,000 je dodato svakom sudicu ploce obložene 1\\.ng-2 proteinom, kao i kontrolnoj p loci, i om: su inkubirane tokom l sata na sobnoj temperaturi iz muckanje. Tecnost je opet odbacena, i svaki sudic je dobro ispran tri puta rastvorom PBST. Sto )..ll LumiGLO hemiluminiscentnih supstrata (Kirkegaard & Peny Laboratories, Gaithersburg, MD) je dodato sudicima , i svaki sudic je ocitan koristeci Luminoskan Ascent DLRearly aparat (Lahsystems, Franklin, MA). C. Sekvencionisanje klonova fagi Izvršena je PCR reakcija koristeci kao temp lat l )..ll bakterija iz svakog sudica glavne ploce (odeljak 4A). Zapremina svake PCR smcse bila je 50 ~tl i sadržavala je lx PCR pufer, po 300 nM od svakog prajmera: 5'-GTTAGCTCACTCATTAGGCAC-3' (SEQ ID NO: 256) i 5'-GTACCGTAACACTGAGTTTCG-3' (SEQ ID NO : 257); 200 ~tM dNTP, 2 mM MgCh, i 2.5 U taq DNK polimeraze (Roche Molecular Biochemicals). GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems) je upotrebljen za izvršenje sledeceg programa: 94 °C tokom 5 minuta; 40 cikla (94 oc tokom 45 sekundi, 55 ac tokom 45 sekundi, 72 oc tokom 90 sekundi); 72 oc tokom l O minuta; ohladiti na 4 °C. PCR prozvodi SLl precišceni pomocu Qli\\quick 96 PCR Purification Kit (QIAGEN Inc.) prema proizvodackom uputstvu. Svi precišccni PCR proizvodi su sekvencionisani pomocu prajmera 5' TTACACTTTATGCTTCCG-3' (SEQ ID NO: 258) koristeci ABI 3770 Sequencer (Perkin Elmer) prema proizvodackom uputstvu. 5. Rangiranje sekvenci Pcptidnc sekvence koje su translatovane iz nukleotidnih sekvenci (iz odeljka 4C iznad) su korelisane sa ELISA podacima. Važnijim su smatrani klonovi koji su pokazali visoko OD citanje u Ang-2 obloženim sudicima i nisko OD citanje u BSA obloženim sudicima . Sekvence koje su se pojavljivale više ~--------------------------------------------------------1 00185 B 1395 10 wo 03/057 134 140 PCT/US02 1:12657 puta takode su smatrane važnim. Dvadesetcetiri peptidnih sekvenci iz biblioteke 20, 26 peptidnih sekvenci iz biblioteke 94, 7 peptidnih sekvenci iz biblioteke 25, 18 pepticlnih sekvenci iz biblioteke 26,6 peptidnih sekvenci iz biblioteke 27, i 4 peptidnih sekvenci iz biblioteke 99 su izabrane za dalju analizu i generaciju peptibodi. Dodatno, za jedanaest konsenzus sek venci iz biblioteka 20 i 94, tri konscn:tus sekvenci iz biblioteka 26 i 99, i dve iz biblioteke 25 je odredena sekvenca i one su upotrebljene za generisanje peptibodi. Peptibodi iz tabele 7 su evaluirane koristeci protokol netralizacionc ELISA opisan u primeru l O. Rezultati su prikazani u tabeli 7. Tabela 7 Con4 izvedene hAng-2:Tie2 Sekvenca peptibodi (Seq Id No:) a finitetn o-sazrele ICso(nM) Pb s Con4-44 (C) 0.09 M-Fc-GGGGGAQ- PIRQEECDWDPWTCEHMWEV -LE (SEQ ID NO: 259) Con4-40 (C) 0.10 M-Fc-GGGGGAQ- TNIQEECEWDPWTCDHMPGK-LE (SEQ ID NO: 260) Con4-4 (C) 0.12 M-Fc-GG<.JGGAQ- WYEQDACEWDPWTCEHMAEV-LE (SEQ ID NO: 261) Con4-3l (C) 0.16 M-Fc-GGGGGAQ- NR LQEVCEWDPWTCEHMENV -LE (SEQ ID NO: 262) Con4-C'5 (C) 0.16 M-Fc-GGGGGAQ- AA TQEECEWDPWTCEHMPRS-LE (SEQ ID NO: 263) Con4-42 (C) 0.17 M-Fc-GGGGGAQ- LRHQEGCEWDPWTCEHMFDW-LE 00185 B 140wo 03/057 134 141 PCT/US02/J2657 (SEQ ID NO: 264) Con4-35 (C) 0. 18 M-Fc-GGGGGAQ- VPRQKDCEWDPWTCEHMYV G-LE .(SEQ ID NO : 265) Con4-43 (C) 0. 18 M-Fc-GGGGGAQ- SISHEECEWDPWTCEHMQVG-LE (SEQ ID NO : 266) Con4-49 (C) 0.19 M-Fc-GGGGGAQ- W AAQEECEWDPWTCEHMGRM-LE (SEQ ID NO: 267) Con4-27 (C) 0.22 M-Fc-GGGGGAQ- TWPQDKCEWDPWTCEHM G ST-LE (SEQ ID NO: 268) Con4-48 (C) 0.26 M-Fc-GGGGGAQ- GHSQEECGWDPWTCEHMGTS-LE (SEQ ID NO: 269) Con4-46 (C) 0.26 M-Fc-GGGGGAQ- QHWQEECEWDPWTCDHMPSK-LE (SEQ ID NO: 270) Con4-41 (C) 0.26 M-Fc-GGGGGAQ- NVRQEKCEWDPWTCEHMPVR-LE (SEQ ID NO: 27 1) Con4-36 (C) 0.28 M-Fc-GGGGGAQ- KSGQVECNWDPWTCEHMPRN-LE (SEQ ID NO: 272) Con4-34 (C) 0.28 M-Fc-GGGGGAQ- VKTQEHCDWDPWTCEHMREW-LE (SEQ ID NO: 273) Con4-28 (C) 0.30 M-Fc-GGGGGAQ- AWGQEGCDWDPWTCEHMLPM-LE (SEQ ID NO : 274) Con4-39 (C) 0.30 M-Fc-GGGGGAQ- PVNQEDCEWDPWTCEHMPPM-LE (SEQ ID NO: 275) Con4-25 (C) 0.31 M-Fc-GGGGGAQ- RAPQEDCEWDPWTCAHMDIK-LE (SEQ ID NO: 276) 00185 B 141wo 031 057 134 142 PCT/US02/J 2657 Con4-50 (C) 0.38 M-Fc-GGGGGAQ- HGQNMECEWDPWTCEHM FRY -LE (SEQ ID NO : 277) Con4-38 (C) 0.40 M -Fc-GGGGGAQ- PRLQEECVWDPWTCEHMPLR-LE (SEQ ID NO : 278) Con4-29 (C) 0.41 M-F c-GC)GGGAQ- RTTQEKCEWDPWTCEHMESQ-LE (SEQ ID NO: 279) Con4-47 (C) 0.44 M -Fc-GGGGGAQ- QTSQEDCVWDPWTCDHMVSS-LE (SEQ ID NO: 280) Con4-20 (C) 0.48 M -Fc-GGGGGAQ- QVIGRPCEWDPWTCEHLEGL-LE (SEQ ID NO: 281) Con4-45 (C) 0.48 M-Fc-GGGGGAQ- WAQQEECAWDPWTCDHMVGL-LE (SEQ ID NO: 282) Con4-37 (C) 0.49 M-Fc-GGGGGAQ- LPGQEDCEWDPWTCEHM VRS-LE (SEQ ID NO: 283) Con4-33 (C) 0.52 M-Fc-GGGGGAQ- PMNQVECDWDPWTCEHMPRS-LE (SEQ ID NO: 284) AC2-Con4 (C) 0.52 M-Fc-GGGGGAQ- FGWSHGCEWDPWTCEHMGST-LE (SEQ ID NO: 285) Con4-32 (C) 0.75 M-Fc-GGGGGAQ- KSTQDDCDWDPWTCEHMVGP-LE (SEQ ID NO: 286) Con4-l7 (C) 0.96 M-FoGGGGGAQ- GPRISTCQWDPWTCEHMDQL-LE . . (SEQ ID NO: 287) Con4-8 (C) 1.20 M-Fc-GGGGGAQ- STIGDMCEWDPWTCAHMQVD-LE (SEQ ID NO: 288) AC4-Con4 (C) 1.54 M-Fc-GGGGGAQ- YLGGQGCEWDPWTCRLLQGW -LE (SEQ ID NO: 289) Con4- l (C) 2.47 M-Fc-GGGGGAQ- VLGGQGCQWDPWTCSHLEDG-LE (SEQ ID NO : 290) Con4-CI (C) 2.75 M -Fc-GGGGGAQ- TTIGSMCEWDPWTCAHMQGG-LE 00185 B 142wo 03/057 134 143 PCT/US02/32657 (SEQ ID NO: 291) Con4-21 (C) 3.21 M-Fc-GGGGGAQ- TKGKSVCQWDPWTCSHMQSG-LE (SEQ JO NO: 292) Con4-C2 (C) 3.75 M-Fc-GGGGGAQ- TTIGSMCQWDPWTCAHMQGG-LE (SEQ ID NO: 293) Con4- 18 (C) 4.80 M-Fc-GGGGGAQ- WVNEVYCEWDPWTCNHWDTP-LE (SEQ ID NO: 294) Con4-19 (C) 5.76 M-Fc-GGGGGAQ- VVQYGMCQWDPWTCKHMRLQ-LE (SEQ ID NO: 295) Con4-1 6 (C) 6.94 M-Fc-GGGGGAQ- A VGSQTCEWDPWTCAHLV EV -LE (SEQ ID NO: 296) Con4-l 1 (C) 9.70 M-Fc-GGGGGAQ- QGMKMFCEWDPWTCAHIYYR-LE (SEQ ED NO: 297) Con4-C4 (C) 9.80 M-Fc-GGGGGAQ- TTIGSMCQWDPWTCEHMQGG-LE (SEQ ID NO: 298) Con4-23 (C) 9.88 M-Fc-GGGGGAQ- TSQRVGCEWDPWTCQHL TYT -LE (SEQ lD NO: 299) Con4-15 (C) 15.00 M-Fc-GGGGGAQ- QWSWPPCEWDPWTCQTVWPS-LE (SEQ ID NO: 300) Con4-9 (C) 20.1 1 M-Fc-GGGGGAQ- GTSPSFCQWDPWTCSHMVQG-LE (SEQ ID NO: 301) Con4-10 (C) 86.61 M-Fc-GGGGGAQ- TQGLHQCEWDPWTCKVLWPS-LE (SEQ ID NO: 302) Con4-22 (C) 150.00 M-Fc-GGGGGAQ- VWRSQYCQWDPWTCNLGGDW -LE (SEQ ID NO: 303) Con4-3 (C) 281.50 M-Fc-GGGGGAQ- DKELEECQWDPWTCQFFYGA-LE (SEQ ID NO : 304) 00185 B 143wo 03/057 JJ4 144 PCT/lJS02i32657 Con4-5 (C) Nema M-Fc-GGGGGAQ- inhibicijc ATFARQCQWDPWTCALGGNW-LE (SEQ ID NO: 305) Con4-30 (C) Nema M-Fc-GGGGGAQ- inhibicije GPAQEECEWDPWTCEPLPLM-LE (SEQ ID NO: 306) Con4-2(J (C) Nema M-Fc-GGGGGAQ- inhibicijc RPEDMCSQWDPWT\\VHLQGYC-LE (SEQ ID NO : 307) Con4-7 (C) Nema M-Fc-GGGGGAQ- inhibicije L WQLA VCQWDPQTCDHMGAL-LE (SEQ ID NO: 308) Con4- 12 (C) Nema M-Fc-GGGGGAQ- inhibicije TQLVSLCEWDPWTCRLLDGW -LE (SEQ ID NO : 309) Con4- 13 (C) Nema M-Fc-GGGGGAQ- inh.ibicije MGGAGRCEWDPWTCQLLQGW-LE (SEQ ID NO: J l O) Con4- 14 (C) Nema M-Fc-GGGGGAQ- inrubicije MFLPNECQWDPWTCSNLPEA-LE (SEQ ID NO: 31 1) Con4-2 (C) Nema M-Fc-GGGGGAQ- inhibicije FGWSHGCEWDPWTCRLLQGW-LE (SEQ ID NO: 3 12) Con4-6 (C) Nema M-Fc-GGGGGAQ- inhibicije WPQTEGCQWDPWTCRLLHGW-LE (SEQ ID NO : 313) Con4-24 (C) Nema M-Fc-GGGGGAQ- inh.ibicijc PDTRQGCQWDPWTCRLYGMW-LE (SEQ ID NO: 314) AC l-Con4 (C) Nema M-Fc-GGGGGAQ- inhibicije TWPQDKCEWDPWTCRLLQGW -LE (SEQ ID NO: 3 15) AC3-Con4 (C) Nema M-Fc-GGGGGAQ- inhibicije DKILEECEWDPWTCRLLQGW -LE (SEQ ID NO: 316) AC5-Con4 (C) Nema M-Fc-GGGGGAQ- inlllbicije AA TQEECEWDPWTCRLLQGW -LE (SEQ ID NO: 317) 00185 B 144wo 03/057134 145 l'CT/US02!32657 Ll izvedene hAng-2:Tie2 Sekvenca peptibodi (Seq ld No:) afinitetno-sancle ICso(nM) Pb s Ll-7 (N) 0.03 MGAQ- TNFMPM DDLEQRL YEQFiLQQG- LEGGGGG-Fc (SEQ ID NO: 318) ACG-Ll (N) 0.03 MGAQ- TNYKPLDELDATLYEHWILQl IS LEGGGGG-Fc (SEQ ID NO: 319) Ll-15 (N) 0.04 MGAQ- QKYQPLDELDKTLYDQFMLQQG LEGGGGG-Fc (SEQ ID NO: 320) Ll-2 (N) 0.04 MGAQ-LNFTPLDELEQTLYEQWTLQQS LEGGGGG-Fc (SEQ ID NO: 321) Ll-1 O (N) 0.05 MGAQ- QKFQPLDELEQTL YEQFMLQQA LEGGGGG-Fc (SEQ ID NO: 322) Ll-13 (N) 0.05 MGAQ- QEYEPLDELDETL YNQWMFHQR LEGGGGG-Fc (SEQ ID NO: 323) Ll-5 (N) 0.05 MGAQ-VK YKPLDELDEIL YEQQTFQER LEGGGGG-Fc (SEQ ID NO: 324) Ll-C2 (N) 0.05 MGAQ- TKFQPLDELDQTLYEQWTLQQR LEGGGGG-Fc (SEQ ID NO: 325) Ll-C3 (N) 0.06 MGAQ- TNFQPLDELDQTL YEQWTLQQR LEGGGGG-Fc (SEQ ID NO: 326) Ll-ll (N) 0.07 MGAQ- QNFKPMDELEDTL YKQFLFQHS LEGGGGG-Fc (SEQ ID NO: 327) 00185 B 145wo 03/057134 146 PCTiUS02/32657 Ll -17 (N) 0.08 MGAQ- VKYKPLDELDEWL Y HQFTLHHQ LEGGGGG-Fc (SEQ ID NO: 328) Ll-l2 (N) 0.08 MGAQ- YKFTPLDDLEQTLYEQWTLQHV LEGGGGG-Fc (SEQ ID NO: 329) Ll-l (N) 0.08 MGAQ-QNYKPLDELDATLYEHFIFHYT LEGGGGG-Fc (SEQ ID NO: 330) Ll-4 (N) 0.08 MGAQ- VKFKPLDALEQTL YEHWMFQQA LEGGGGG-Fc (SEQ IDNO: 331) Ll-20(N) 0.09 MGAQ- EDYMPLDALDAQLYEQEDLLHG LEGGGGG-Fc (SEQ ID NO: 332) Ll-22 (N) 0.09 MGAQ- YKFNPMDELEQTL YEEFLFQHA LEGGGGG-Fc (SEQ ID NO: 333) Ll-14 (N) 0.11 MGAQ- SNFMPLDELEQTLYEQFMLQHQ LEGGGGG-Fc (SEQ ID NO: 334) LI-16(N) 0.11 MGAQ- QKFQPLDELEETLYKQWTLQQR LEGGGGG-Fc (SEQ ID NO: 335) Ll-18 (N) 0. 16 MGAQ-QKFMPLDELDEIL YEQFMFQQS LEGGGGG-Fc (SEQ ID NO: 336) Ll -3 (N) 0.16 MGAQ- TKFNPLDELEQTLYEQWTLQHQ LEGGGGG-Fc (SEQ ID NO: 337) Ll-21(N) 0.17 MGAQ- HTFQPLDELEETL YYQWL YDQL LEGGGGG-fc (SEQ ID NO: 338) 00185 B 146wo 03/0571 34 147 PCT!US02/32657 LI-Cl (N) 0.56 MGAQ- QKFKPLDELEQTL YEQWTLQQR LEGGGGG-Fc (SEQ lD NO: 339) Ll-19 (N) 1.26 MGAQ- QTFQPLDDLEEYL Y EQWIRRYH LEGGGGG-Fc (SEQ ID NO: 340) Ll-9 (N) 1.62 MGAQ- SKFKPLDELEQTLY EQWTLQHA LEGGGGG-Fc (SEQ ID NO: 341) Con l izvedene hAng-2:Tie2 Sekvenca peptibodi (Seq Id No:) a fin i t ctn o-sazrele ICso(nM) Pb s Con 1-4 (C) 1.68 M -Fc-GGGGGAQ- SGQLRPCEEIFGCGTQNLAL-LE (SEQ ID NO: 342) Con l-l (C) 3.08 M-Fc-GGGGGAQ- AGGMRPYDGMLGWPNYDVQA-LE (SEQ ID NO: 343) Con 1-6 (C) 8.60 M-Fc-GGGGGAQ- GQDLRPCEDMFGCGTKDWYG-LE (SEQ ID NO: 344) Conl-3 (C) 16.42 M-Fc-GGGGGAQ- APGQRPYDGMLGWPTYQRIV -LE (SEQ ID NO: 345) Coni-2(C) Nema M-Fc-GGGGGAQ- inhibicije QTWDDPCIVlliELGPVTWRRCI-LE (SEQ ID NO: 346) Conl-5 (C) Nema M-Fc-GGGGGAQ- inhibicije FGDKRPLECMFGGPlQLCPR-LE (SEQ ID NO: 347) Maticna: Con l (C) 26.00 M-Fc-GGGGGAQ-KRPCEEIFGGCTYQ- LE (SEQ ID NO: 348) 00185 B 147wo 03 /05 7 134 148 PCT/US02/32657 12-9 izvedene hAng-2:Tie2 Sekvenca peptibodi (Scq ld No:) afinitetno-sazrelc ICso(nM) Pb s 12-9-3 (C) 0.81 M-Fc-GGGGGAQ- LQEWCEGVEDPFTFGCEKQR-LE (SEQ ID NO: 349) 12-9-7 (C) 0.93 M-Fc-GGUCiGAQ- MLDYCLGMDDPF.I'FUCDKQM-LE (SEQ ID NO : 350) I 2-9-6 (C) 0.95 M-Fc-GGGGGAQ- HQEYCEGMEDPFTFGCEYQG-LE (SEQ TD NO: 351) 12-9-C2 (C) 1.4 I M-Fc-GGUGGAQ- LQDYCEGVEDPFI.FGCENQR-LE (SEQ ID NO: 352) 12-9-5 (C) 1.56 M-Fc-GGGGGAQ- LLDYCEGVQDPFTFGCENLD-LE (SEQ ID NO: 353) 12-9-1 (C) 1.84 M-Fc-GGGGGAQ- GFEYCDGMEDPJ:TFGCDKQT-LE (SEQ ED NO: 354) 12-9-4 (C) 2.05 M-Fc-GGGGGAQ- AQDYCEGMEDPI <\"fFGCEMQK-LE (SEQ ID NO: 355) 12-9-Cl (C) 2.68 M-Fc-GGGGGAQ- LQDYCEGVEDPFTFGCEKQR-LE (SEQ ID NO: 356) 12-9-2 (C) 8.42 M-Fc-GGGGGAQ- KLEYCDGMEDPf.'TQGCDNQS-LE (SEQ ID NO: 357) Maticna : 12-9 (C) 15.00 M-Fc-GGGGGAQ- FDYCEGVEDPFTFGCDNJ-1 -IJ~ (SEQ ID NO: 358) Primer 9 Šest primera anti-Ang2 peptibodi su testirane na vczivnu aktivnost prema huAng2 (R&D Systems. BN012103A) na BIAcore. Protein G je imohilisan na CM5 cip prema 5 standardnom aminskom protokolu za kuplovanje (BIAcorc Inc.), i peptibodi su zatim u cilju kaptiranja injektiranc preko površine proteina G (RL ~ I OO Ru). Radi testiranja vezivanja hAng2 i kaptiranog peptidnog tela, 0.3 nM do 40nM huAng2 je ubrizgan preko zahvacene površine i vezujuci senzorgrami su analizirani primenom BIA evaluacije 3.0 (BIAcore Inc.). U Tabeli 8 su sažeti rezultati eksperimenta. 00185 B 1485 wo 03/057134 149 PCT/US02/U657 Tabela 8. ·- Peptidno telo PARTIJA KD(M) Ka (l/Ms) Kd(l/s) . . Con4-44(C) 011702 2. \\E-1 O 2.9E+05 5.9E-05 --- i------ ----- . .. - -- - ·- --- - LI-7(N) 022102 2.4E-l O 3.7E+05 8.7E-05 --- -· Ll-l O (N) 021302 7.7E-IO l .SE-+ ·05 I. IE-05 -· •. . .. - ---- ·- ----- - Ll-2 1 (N) 021802 2.4.1 E-l O 5.6E+05 l.4E-05 l - · ·- - -- . ----~ ·-· Con4(C) 33456-77 3.8E-1 O 5.3E+05 2 .0E-05 ... --- --- - - - -·- 2xCon4 (C) IK 092501 3.4E-I O 4.8E+05 1.6E-05 -· .. - - - Primer 10 ELISA neutralizacija Pripremljeni mcdijumi humanog, mišjeg, makaki i pacovskog Ang-2 i humanog i mišjeg Ang-1 su razblaženi u DMEM/501-lg/ml BSA kao što sledi: hAng-2-razblaž:cnjc l :64; mAng-2-razblaženje l :64; pacovski Ang-2-nerazhlažen; makaki Ang-2 razblaženje l :32; hAng-1-razblaženjc l :4; i mAng-1-razblaženje l :4. Stepen razblaženja ovih pripremljenih medijuma je odreden njihovom sposobnošcu 10 da vežu !nM hTie2-Fc (koji je obezbeden kao Tie-2-Fc moleku! , gde Tie-2 deo sadrži samo solubilni ekstracelijski deo molekula; R&D Systems, catalog number 313-Tl) do oko 50% od maksimalne spose>bnosti vezivanja (to jest platoa). Mikrotitarske plocice su premazane sa l OOJll razblažcnog pripremljenog medijuma. Za neutralizaciju Ang-2 ELISA metodom, predložena anti-Ang-2 peptidna tela su titrirana, od 62nM do 0.015pM u 4-stepena 15 razblaženja, u r<.istvor PBS koji sadrži 1% BSA i oko ln! V1 Tie-2 (koji je obezbcdenjc kao Tie-2-Fc molekul, gde Tie-2 deo sadrži samo solubilni ekstracelijski deo molekula; R&D Systems, catalog number 313-Tl). Za neutralizaciju Ang-1 ELISA metodom, predložena PEPTIDNA TE I.A anti-Ang-2-antitela su titrirana od lOOOnM do 0.2pM u 4-stepena razblaženja u rastvor PBS koji sadrži l% BSA i oko lnfv1 Tic-2 (pripremljen je kao Tie-2- 20 Fc moleku!, gde Tie-2 deo sadrži samo solubilni ekstracdijski deo molekula; R&D Systems, catalog number 313-Tl). 00185 B 149wo 03/057134 150 PCTiU S02i32657 Nakon dodavanja oko 1 OO mikro! i tara rastvara peptidno tclo/Tie-2 u svaki odc~jak, plocice su inkubirane preko noci na sobnoj temperaturi. a potom pet puta isprane sa PBS koji sadrži oko O. I procei)at Tween-20. Nakon ispiranja, je oko l OO mikrolitara anti-Tic-2 antitela (Pharmigen Inc., catalog #557039) dodato po odcljku do konacne koncentracije od 5 oko I mikrograma na ml, a plocice su inkubiranc oko l sat na sobnoj temperaturi . Zatim. je oko l OO mikro! i tara rastvara kozjih anti-mišji-IgG-HRP, razblažcr~ja l: l OOOO u PBS koji sadrži I %BSA (Pierce Chemical Co ., catalog #31432) dodato po uJcljku. Plocice su inkubirane na sobnoj temperaturi oko I sata, a potom pet puta isprane sa PBS koji sadrži oko 0.1 procenat Tween-20. Oko l OO mi kroli tara TMB supstrata (SIGMA, 10 catalog #T8665) je zatim dodato po odeljku što je dovelo do nastanka plave boje. 15 Apsopcija je zatim citana sa spektrofotometra na 370nm . Rezultati su prikazani ispod u Tabeli 9. Tabela 9 PEPTIDNIM TI·:LOM posrcdovana Neutralizacija angiopoetina: lie2 interakcije . . . . .. hAng-2 mAng-2 rAng-2 cAng-2 hAng-l mAng-1 -· pept. telo ICsu( nM) ICsu( nM) ICsrJ(nM) ICsu( nM) IC;o(nM) IC so( nM) 2xCon4 (C) 0.026 0.035 0 .024 0.047 l 3.0 3.2 i Con4 (C) 0.197 0.289 0.236 0.540 200 300 -·- .. . Con4-44 0.08 0. 16 0.22 43 (C) .... -· Con4-40 0.20 0.27 0.35 >1000 (C) ·•· . -· . -· · - Ll-7 (N) 0.046 0.063 0.035 0.108 >1000 > 1000 .. .. -- Ll-21 (N) 0.179 0.249 0.204 0.608 > 1000 > 1000 ... ····- ,--~ 1000 Ll-JO (N) 0.06 0.06 0.06 - 00185 B 150wo 03!057 134 Plan studije 151 Primer ll PK studija PCT/US02/32657 Mu:ž:iaci CD-l miševa, težine 20-30g, su nasumicNO podeljeni u svaku od 5 terapijskih peptidno telo -grupa (2xCon4-CLI-7-N, i Ll-21-N). Životinje su dobijale pojedinacni IV bolus (n=3 8/ po grupi) ili pojedinacnu supkutanu dozu od 50)-lg peptibody(n=34 po grupi). Injekcije su davane preko repne vene i ispod kože na ledima poštujuci IV i SC primenu. 10 Uzorkovanja krvi i Analiticke metode Uzorci krvi su sakupljani, za svaku koncentraciju anti-Ang-2 peptidnog tela, merenjem prvohitne doze (predoze) i na 1,2,4,8,16,24,48 ,72,96,120,144,168,216,264,312 i 336 sati nakon primcnjene doze (post-doza) za SC i IV grupe. Dodatni uzorci su sakupljani za sve IV grupe kao post-doza 5-og i 30-og minuta. Dve životinje su iskrvarile u pokazanom vremenu, i one su žrtvovane nakon uzorkovanja. Krv (otprilike 0.50 mL) je 15 sakupljana punkcijom srca u cevcice polipropilenskog microtain serumskog scparatora. Uzorci su držani na ledu oko 20 minuta ili sve dok sc nije pojavila grudvasta formacija. Serum je izdvojen iz krvnih uzoraka centrifugiranjem tokom otprilike l O min. na 2-8 C, i cuvan do testiranja na otprilike -70 C. Uzorci su mercni upotrebom vremenski potvrdene rezo l utne fluorescencijc (TRF) sa donjom granicom za kolicinu (LLOQ) od l OOng/mL. 20 NUNC fluoroMax isorp mikrotitarske plocice su premazane rekombinantnim mišjim Ang-2 protciNOm. Plocice su potom bile blokirane proteinskim rastvorom da bi se smanjilo nespecificNO vezivanje. Standardi, kontrole kvaliteta i nepoznati uzorci su pripremljeni kao l 0% puferovani uzorci mišjeg seruma i pi peti rani su u odeljkc mikrotitarskih plocica. eptidna tela su bila posebno vezana za nepokretni Ang-2. Nakon ispiranja svih ne vezanih 25 supstanci (Kirkegaard&Perry Laboratories Inc.). biotinilovana monoklonalna kozja anti Humana IgG(li +L) antitcla (Jackson ImmuNOReasearch Laboratories Inc.) su dodata u odeljke. Nakon ispiranja nevezanog cvropijum streptavidina. vezani evropijum je osloboden od streptavidina kiselim rastvaram koji je pipetiran u svaki odeUak. Fluorescentni signal je dobijeni ocitan na Wallacovom fluorometru . Uzorak za analiziranje 30 anti-Ang-2 pcptidnog tela iz mišjeg seruma je u opsegu od 0 .078-5~tg/mL. 00185 B 151WO 03/057134 152 PCT/US02/32657 Farmakokinetskc analize. Glavne koncentracije jedi njenja, znaci podatci odnosa koncentracija-vreme za svaku grupu podvrgnutu su analizama upotrebom WinNOnlin Professional (Verzija 3.3, Pharsight Corp. , l'v1ountain View, Ct\\). Navedena vremena uzorkovanja koja su korišcena za PK 5 analize, su kao u;:orci prikupljana, unutar l 0% navedenog vremena. Sve vredNOsti koncentracija koje su manje od LLOQ su poništene pre PK analiza. Sledeci PK parametri su procenJ em : Završno poluvreme (t ) je racunato kao t = ln(2)/ kc 1 , gde je kd vrednost završne konstante P rvo o \"' reda koja Je procenjcna linearnom regresijom završne 10 linearnologaritamske laze raspada. Površina ispod serumske koncentracija-vreme krive (A uc(O·I ast)) je procenJena korišccnjem lincarnologaritamskog trapezoidnog metoda od nultog vremena do poslednjeg, vremene poslednje merlji ve koncentracije (Ciasl). Površina ispod krive od nultog vremena do beskonacNOsti (AUCuJ -.., 1 ) je procenjena 15 kao zbir odgovarajuceg (AUC(O-Iast)) i predvidene vredNOsti Clasrlke~ : AUC(o-·\")=AUCw -last) + predpostavljeni Clastlkel Apsolutna bioraspoloživost (F) nakon SC primene je izracunata kao: Rezultati su prikazani na Slici.2 20 00185 B 152WO 03/057 I 34 153 PCT/US02/32657 Primer 12 Ženkama miša bez dlake je prema studiji, nultog dana, potkožno ubrizgano lx10 7 A431 celija . Ang-2 antitela 2xCon4-C su u dozi od 200J.Lg/mišica/dan potkožno primenjena treceg dana. Zapremine tumora i telesne težine su zapisivane u pravilnim intervalima, kao 5 što je prikazano na slici. Znacajne razlike u tumorskom rastu su zapažene izmedu grupe tretirane Ang-2 peptidnim telom i kontrolne grupe nosaca i kontrolne grupe peptidnog tela (p<0.0001 u odnosu na svaku kontrolu korišcenjem ponovljenog ANOVA merila sa Scheffeovim post hoc testom). Terapija ovim peptidnim telom nije imala znacajano dejstvo na tel esne težine. Rezultati su prikazani na Slici 3. 10 Primer 13 Kriva porasta A431 in vitro 2000 A431 celija je zasejano po odeljku na plocice za tkivne kulture sa 96 odeljaka, u 2001-11 DMEM kome je dodat 10% fetalni govedi serum (FBS). Medijum je zatim 15 aspiriran 16 sati nakon zasejavanja. Potom su sledeci medijumi vraceni nazad u odeljke i organizovani su u triplikate: lOOJ.Ll DMEM po odeljku. 10% FBS, negativne kontrole l mg/ml peptidnog tela 4883 ili peptidnog tela TN8-Con4. lste postavke su ponovljene na 5 plocica. Medijum sa jedne plocice je aspirira.n 24,48,72 ili 120 sati nakon terapije. Sto ~d l 0% trihlorsirceLnc kiseline (TCA) je dodato po odeljku, a plocice su cuvane na 4C. Sve 20 plocice su sakupljene onda kada je poslednja plocica bila najmanje 4 sata u l O% TCA. l 0% TCA je protrešena, a odeljci su 5 puta isprani vodom iz cesme. Celije su potom bojene tokom JO minuta sa lOOJ.Ll 0.4% sulforodamina B (Sigma S-9012) u 1% sircetnoj kiselini (Sigma A-6283) na sobnoj temperaturi, a potom 5 puta isprane sa 1% sircetnom kiselinom. Plocice su zatim sušene na vazduhu. Boja je rastvarana sa 300,..tl 20mM 25 nepuferisanog Tri sa (pH> l O) tokom 2 sata u centrifugi. Opticka gustina (OD) je potom citana na 540nm na citacu za mikrotitarske plocice. Rezultati su prikal':ani na Slici 4. Primer 14 Ženkama miša bez dlake je prema studiji potkožno ubrizgano nultog dana 2x l 0 6 30 Colo-205 celija plus Matrigel (2:1). Treceg dana su Ang-2 peptidna tela Ll-7-N, Ll-21-N, Con4-C, i 2xCon4-C u dozi od l4J.Lg/mišica supkutano primenjena, dvaput nedeljno. 47)lg/mišica Anti-Ang-2 antitela Ab536 je primenjeno kao pozitivna kontrola, tri puta ncdeljno. Zapremine tumora i telesne težine su zapisivane u pravilnim intervalima. 00185 B 153wo 03/0 57 134 154 PCT/US02/32657 Znacajne razlike u tumorskom rastu su zapa:ž.cne izmedu svake od grupa tretiranih Ang-2 peptidnim telom i kontrole nosaca i kontrolnog pcptidnog tela (p<O.OOOl u odnosu na svaku kontrolu korišcenjem ponovljenog ANOVA merila sa Scheffeovim post hoc testom). Lecenje ovim pcptidnim telima nema znacajno dejstvo na telesnu težinu (rezultati msu 5 prikazani). Rezultati su prikazani na Slici 5. Primer lS Ženkama miša hez dlake je prema studiji nultog dana potkožno uhrizgano 2x l O r' Colo-205 celija plus Matrigel (2:1 ). Treceg dana je Ang-2 pcptidno telo 2xCon4-C 1 O potkožno primenjcno u dozama od 14, 2.8 i 0.56J.Lg/mišica, dvaput nedeljno. Zapremine tumora i telesne težine su zapisivane u pravilnim intervalima. Znacajne razlike u tumorskom rastu su zapažene izmedu grupa sa srednjom i visokom dozom Ang-2 peptidnog tela i grupa nosaca i kontrolnog peptidnog tela (p=0.003 za srednju dozu i p<O.OOOl za visoku dozu korišcenjem ponovljenog ANOVA merila sa Scheffeovim post 15 hoc testom) . Lecenje ovim peptidnim telima nema znacajno dejstvo na telesnu težinu. 20 Isprekidana linija predstavlja smanjenje ukupnog n grupe sa 10 na 9 mišica, usled uginuca jedne od mišica zbog nepoznatog uzroka. Rezultati su prikazani na slici 6. Primer 16 Anti-A.ng-2 peptidno telo protiv Colo-205 ksenograft tumora Ženkama miša hez dlake je prema studiji potkožno ubrizgano nultog dana 2xl 0 6 Colo-205 celija plus Matrigel (2: l).Ang-2 peptidno telo 2xCon4-C ili kontrolno peptidno telo u dozi od 350J.Lg/dan treceg dana. Tumori iz grupa koje su tretirane kontrolnim peptidnim telom (kao što je opisano na tabeli 5) su sakupljani kako 14-og dana (kontrola 25 prema velicini) tako i 1 R-og dana (kontrola u skladu sa vremenom). Tumori iz grupe tretirane 2xCon4(C) su sakupljeni 18-og dana. Zapremine tumora su zap1s1vane u pravilnim intervalima, kao što je prikazano. Znacajne razlike u tumot·skom rastu su zapažene izmedu kontrolne grupe u skladu sa vremenom i grupe tretirane 2xCon4-C (p=O.O 154 ponovljenim ANOVA meri lom Scheffeovim post hoc testom). Lecenje ovim 30 peptidnim telima nema znacajno dejstvo na telcsnu težinu. Tumori koji su pripremljeni za image analize su seceni u vidu krune i njihovi polovinski komadici su zamrznuti u OCT-u (Sakura Finetek USA Inc., Torrance,CA). Krio-sekcije su bojene imunohistohemijski korišcenjcm 2J.Lg/ml anti-mišjeg CD3 I 00185 B 154W003/05 7134 155 PCT/US02/32657 (katalog#553370, BD PharMingen, San Diego, CA) sa DAB kao hromogenom. Tumorski isecci su digitalno fotografisani na objektivu uvelicanja 20X. C'ctiri «ciljana» polja su zahvacena po t umoru, sa l O tumora po terapijskoj grupi. MetaMorph (Universal Imaging Corporation, Downington,P A) analizni sistem slika je korišcen od mesta ulaza krvnih 5 sudova obojenih sa CD31. Podrucja koja su pozitivna za CD31 bojenje su prikazana kao odnos ukupnog tumorskog tkiva u svakom polju. Rezultati su prikazani na Slici 7. Primer 17 Ženkama miša bez dlake je prema stud~ji nultog dana potkožno ubrizgano 2x 10 6 10 Colo-205 celija plus Matrigel (2: l). Terapija u dozi od 350 ~Lg/mišica, i to dvaput nedeljno, Ang-2 peptidnim telom 2xCon4-C ili ekvivalentnim kontrolnim peptidnim telom u dozi od 350 fJ.g/mišica je zapoceta 3, 10 ili 15 studijskog dana. Zapremine tumora i telesne težine su zapisivane u pravilnim intervalima. Znacajne razlike u tumorskom rastu zapažene su izmedu svih grupa tretiranih Ang-2 peptidnim telom i grupe nosaca (p=0.089 za grupu od 15 15-og dana i p<Cl.OOOI za grupu od 3-eg i 10-og dana korišcenjem ponovljenog ANOVA merila sa Scheffcovim post hoc testom). Lecenje ovim peptidnim telima nema znacajno dejstvo na telesnc težine. Rezultati su prikazani na Slici 8 (telesne težine nisu prikazane). 20 Primer 18 Pregled vrednosti potpunog odgovora (CR) je postignut korišcenjem 47~tg Ab536 antitela/ ženkama miša bez dlake, koje je primenjeno intraperitonealno triputa nedeljno, ili 2xCon4(C), koji je primenjen supkutano kao raspored multiplih doza u razlicitim dugotrajnim studijama (2: 1 O nedelja doziranja) kod oba modela i A431 i Colo-205. CR koji se ovde koristi se odnosi na posledicu kad nemer~jiv i tumor zaostaje nakon lccenja . 25 Rezultati su prikazani na Slici 9. Primer 19 a)Kombinacija Pb i taksotera u Colo-205 tumorskom tkivu Ženkama miša bez dlake je prema studij i nultog dana potkožno ubrizgano 2x l 0 6 30 Colo-205 celija plus Matrigel (2: l). Terapije su zapocete sa a) 350~g/mišica Ang-2 peptidni.m telom 2xCon4-C i to dvaput nedeljno, b) 20mg/kg qwx3 i.p taksoterom, ili e) njihovom kombinacijom 14-og dana studije. Zapremine tumora i telesne težine su zapisivane u pravilnim intervalima. Znacajne razlike u tumorskom rastu su zapažene 00185 B 155WO 03/057 I 34 158 PCT /US02/32657 Primer 21 Model kornealne angiogeneze Dejstvo CON4(C) na angiogenezu u pacova izazvanu VEGF-om Ang-2 peptidno telo CON4(C) je procenjivano u komealnom modelu angiogeneze 5 u pacova. Angiogeneza je indukovana implantacijom najlonske plocice natopljene VEGF om (ili BSA-kontrolom) u stromu rožnjace (n=8/grupa). Peptidno telo TN8CON4-C je pri menj ivano supkutanom injekcijom 1.0 ili 0. 1 mg/pacov/dan tokom sedam dana. Druge dve grupe životinja su tretirane istom dozom peptidnog tela 4883 kao negativnom kontrolom. Sve grupe su prethodno tretirane pojedinacnom pocetnom dozom bilo od 3.0 ili 1 O 0.3mg što je tri puta više od uobicajene doze od 1.0 ili 0.1 mg (pogledati sliku). Nakon sedam dana tecenja, dve vaskularne krajnje tacke su utvrdene iz svake od digitalnih slika rožnjace pacova: broj krvnih sudova koji presecaju srednju tacku izmedu diska i limbusa, i površina krvnog suda. Lecenje TN8CON4-C znacajno inhibira angiogcnezu indukovanu VEGF-om na nacin zavisan od doze (p<0.04), buduci da lecenje kontrolnim peptidnim 15 telom nema znacajno dejstvo na obe krajnje tacke. Nepostoji dokaz ocigledne toksicnosti koji je zasnovan na tclesnim težinama tretiranih životinja. Rezultati su prikazani na Slici 12. 20 P.rimet· 22 Mapiranje epitopa Puna dužina (aminokiseline 1-495), N-terminalni deo (aminokiseline 1-254) i C tem1inalni deo (aminokiseline 255-495) humanih Ang-2 (hAng-2) proteina su klonirani u vektor ekspresije sisara koji je voden CMV sa C-terminalnim delom od 6xHis ostataka. Tri posledicne tvorevine plus vektorska kontrola su kratkotrajno eksprimirane u 293T 25 celijama. Propisani mcdijumi su onda sakupljani iz transfektiranih celija, a iskazivanje nivoa ekspresije Ang-2 u medijumima je procenjivano anti-6xhis ELISA i Western blotom. Vezujuci epitop anti-Ang-2 antitela i peptidnih tela je odreden prema njegovoj sposobnosti da veže tri oblika humanog hAng-2 ELISA metodom prema sledecem protokolu: dobrovezujuca opitna plocica sa 96 odeljaka je premazana sa 100!-Ll propisanog 30 medijuma po odeljku i inkubirana na 37 C tokom l sata. Propisani medijum je aspiriran, a plocica je blokirana sa 200)-.Ll 5%BSA u PBS po odeljku na sobnoj temperaturi tokom l sata. Potom je aspiriran hlokirajuci rastvor. l 00!-Ll anti tela, peptidnog tela ili Tie2-Fc je dodato u l !lg/ml u l %BSA u PBS i inkubirana na sobnoj temperaturi tokom l sata. Odeljci 00185 B 1565 'vVO 03/05 7134 159 PCT/US02/32657 su isprani cetiri puta sa 200f.ll 0.1% Tween-a u PI3S. l OOf.il HRP-konjugovanog kozjeg antihumanog lgG ili kozjeg antimišjeg lgG je dodato po odeljku i inkubirana na sobnoj temperaturi 45 minuta. Odeljci su potom isprani 4 puta sa 200~tl 0.1% Twcen-a u PBS. Potom je dodato l OO~d TMB supstrata po odeljku. Opticka gustinajc citana na 370nm. Rezultati su prikazani na Slici 13a, Slici 13b i Slici 13c. Primer 23 Usled izvesnih ogranicenja u osetljivosti koja su sastavni deo BiaCore eseJa, 10 vezujuci aiinitctjc takode procenjen korišcenjem Sepydine KinExA eseja. Vezivanje 2xCON4-C (Ph5714) za huAng-2 je testirano na KinExA (Sapydine, Boise, lD). Zrnca Reacti-Gela 6x (Pierce, Rockford,IL) su prethodno prcmazana sa hu-Ang-2 i blokirana sa BSA. Uzorci od lOpM i 30 pM 2xCON4-C su inkubirani u razlicitim koncentracijama lm-Ang-2 (0.3 pM-3nM) na sobnoj temperaturi 8 sati pre prolaska kroz 15 hu-Ang-2-namazanog zrncima. Kolicina zrno-vezujuceg peptidnog tela je merena fluorescentno obeleženim kozjim antihumanim Fc-antitclom (Jackson Immuno Research, West Grave, PA) . Vezujuci signal je proporcionalan koncentraciji slobodnog peptidnog tela u ravnoteži . Ravnotežna konstata disocijacije (Ko) je dobijena nclineamom regreSIJOm 20 konkurentnih krivi korišccnjem jednostranog homogenog vezujuceg modela dvostruka kriva (KinExTM softver). KO je potom odredena tako da hude otprilike 2pM za vezivanje 2xCON4-C sa hu-Ang-2. 25 Kako je prikazano na Slici 14, korišcenjem KinExA eseja, 7 .a peptidno telo 2xCon4 je pokazano da ima - 2pM afinitet za hA.ng-2. Primer 24 Peptidi sa PEG-om Ll -7 peptid je sintetisan pomocu sintetizatora 431 ABI korišcenjem standardnog protokola sjedinjavanja i dvostrukog sjedinjavanja od rezidue 14 (met) do N-tem1inalnog 30 dela l (Cys), brojeci od N-terminalnog dela do C-te1minalnog dela. Spajanje peptida Ll-7 sa Metoksipoli(etilenglikol)-maleimidom; MW:5Kda; koji je 00185 B 157wo 03i057134 160 PCTfUS02/32657 oznacen kao \"mPEG5K-(Li-7 peptid)\" Rastvor 0.8mg pcptida L 1-7 u 400).11 pufcra l (20mM fosf~tta , S mM EDTA, pH 6.5) Je tretiran sa 13.5mg metoksipoli (etilenglikol)-maleimida (MW=5KDa; Sheanvater Corp.); 0.27 ml 50.0mg/ml rastvara u puferu l. Reakciona smešaje inkubirana na 4C preko 5 noci , potom razblažena sa l.6mL pufera A (20mM tris hidrohlorida, pH 7.2) i dijalizirana u Slide-A-Lyzer kaseti (35 00 MWCO,Pierce) nasuprot istom puferu. Dijalizirana reakciona smeša je procišcena jon izmenjivom hromatografijom na 1.0 mL l IiTrap Q Sepharoza HP kolona (Amersham Biosciences Corp.). Proi7.vodni pik je podeljen u dve frakcije od 1.0 mL pomoc.u gradijenta od 100% pufera A do 100% putcra B (pufer A+O.S MNaCl) preko 10 zapremine 40 kolona. Kombinovane frakcije proizvoda su koncenlrovane Microsep lK centrifugalnim uredajem (Pall Life Sciences) do 250!11 tako da sadrže 0.23 mg proteina/mL. Spajanje peptida Ll-7 sa 1,11-bis-maleimidotetraetilenglikolom; koji je oznacen kao 15 \"PE04(Ll-7peptid)z2: Rastvor J .Omg peptida Ll-7 u 500!11 pufera l (20mM fosfata, 5mM EDTA,pH 6.5) Je tretiran sa 0.0375 mg l ,11-bis-maleimidotetraetilenglikola (Pierce) (0.375mL u 0.1 mg/mL rastvara u puferu l). Reakciona smeša je inkubirana na 4C tokom 3.33 sata, potom je dijalizirana u Slide-A-Lyzer kaseti (3500MWCO, Pierce) nasuprot puferu A 20 (20mM Tris hidrohlorid, pH 7.2). Dijalizirana reakciona smcša je procišcena jon izmenjivom hromatografijom na 1.0 mL HiTrap Q Seraphose HP kolona (Amersham Biosciences Corp.). Proizvodni pik dimera je podeljen u tri frakcije od I .Oml pomocu gradijenta od 100% pufera A do 100% pufera B (pufer A plus NaCl) preko zapremine 40 kolona. Kombinovane frakcije proizvoda su konccntrovane Microsep lK centrifugalnim 25 uredajem (Pall Life Sciences) do 550!J.I koji sadr?.i 0.12 mg proteina/ml. Spajanje peptida Ll-7 sa poli(etilenglikol)-bis-maleimidom: MW 3.4 KDa; koji je oznacen kao \"PEG3 .4K(LI -?peptid)2\" Rastvor 3.0 mg Ll-7 peptida u 1.5 mL pufera l (20mM fosfata, 5 mM EDTA, pH 30 6.5) je tretiran sa 1.125 mg poli(etilenglikol)-bis-maleimida (MW=3.4 Kda, Shearwater Corp.); 0.563 ml 2.0 mg/ml rastvara pufera l. Reakciona smeša je inkubirana na 4 C tokom noci, a potom dijalizirana u Slide-Lyzer kascti (3500 MWCO, Pierce) nasuprot puferu A (20 mM Tris bidrohlorida,pH 7.2). Dijalizirana reakciona smeša je procišcena jon 00185 B 158wo 03/057 134 161 PCT/US02/32657 izmcnjivom hromatografijom na 5.0 ml HiTrap Q Scpharose HP kolona (Amersham Biosciences Corp.). Proizvodni pik dimera je podeljen u tri frakcije od 3.0ml pomocu gradijenta od 100% pufera A do 100% pufera B (pufer A plus NaCl) preko zaprcmine 40 kolona. Kombinovane frakcije proizvoda su koncentrovanc u Microscp lK centrifugalnom 5 urcdaju(Pall Lire Sciences) do 850~tl koji sadrži 0.24 mg proteina/ml. Rezultati MALDJTOF mass spektoskopijc su sledeci: Uzorak# oznaka Exp. MS Ohs. MS l L 1-7 (ne PEG-ovani 3,545 3,538.7 pep ti d) 2 mPEG5K -(Ll-7 8,500 8,851 pep ti d) 3 PE04(L l-7peptid)z 7,443 7,446.29 PEG3.4K(Ll- 10,552 4 7peptidh 10,550 6,882.61 3,550.13 Vrednovace se to što indeks \" 2 \" zaPEG3.4K (Ll-7 peptid) i PE04(LI-7peptid) 10 oznacava da postoje dva peptida po polimernom lancu, pojedinacno smeštena na svakom od krajeva polimera. Odredivanje IC:so IC 50 za inhibiciju hAng-2:hTie2-Fc interakcije za peptide bez Ll-7 i peptide sa 15 PEG, IC 50 su odredene ELISA neutralizacUom kako je opisano u Primeru 2. Za ELISA neutralizaciju, mikrotitarskc plocice na koje je vezan humani Ang-2 su pripremljene za ELISA neutralizaciju kao što je opisano u Primeru 2. Izabrani anti-Ang-2 Ll-7 peptidi sa PEG-om i peptidi bez Ll-7 su titrirani od lOOOnM do 0. 2 pM u 4-stcpenska razblažcnja u rastvoru PBS koji sadrži oko 1% BSA i oko lnM Tie-2 (koji je obezbeden kao Tie-2-Fc 20 moleku! gde Tie-2 deo sadrži samo solubilni ekstracelijski deo molekula; R&D Systems, catalog broj 313-TI). Posle dodavanja oko 100 mikrolitara antitelo/Tic2 rastvora u svaki odeljak, plocice su inkubirane preko noci na sobnoj temperaturi, i potom pet puta isprane u PBS koji sadr7. i oko 0.1 procenat Twcen-20. Nakon ispiranja, dodato je oko 100 mikrolitara anti-Tie-2 antitela (Pharmingen., catalog#557039) u svaki odeljak do konacne 25 koncentracije od oko l mikrograma na ml, a plocice su inkubirane oko l sat na sobnoj temperaturi. Zatim je oko 1 OO mikrolitara kozjih anti-mišjih-IgG-HRP (Pierce Chemical CO., catalog #31432) dodato u rastvor l : 10000 PBS koji sadrži oko l procenat BSA. 00185 B 1595 10 vVO 03/057134 162 PC'l'!US02/32657 Plocice su inkubirane na sobnoj temperaturi oko l sat, nakon cega su bile isprane pet puta sa PBS koji sadrži oko 0.1 procenat Tween-20. Zatim je oko 1 OO mikro litara TMB supstrata (opisanog gore) dodato po odeljku što je dovelo do širenja boje. Apsorpcija je potom citana na spektrofotomctru na 3 70nm. Ll-7 peptidi (C-GGGGG-AQ-TNFMPMDDLEQRL YEQFILQQG-LE) (SEQ ID N0 :359) su ukljucivali : N-tenninalni cistein za sparivanje sa PEG-orn i 5Gly linker. AQ i LE bocne sekvence su obe predstavljene u originalnom virusnom klonu i peptidnom telu . Rezultati IC 5o inhibicije sa hAng-2:Tie2 su bili kao što sledi: P~tid Ll-7 peptid mPEG5K-(LI -7 peptid) PE04(Li-7 peptid) 2 PEG3.4K(Ll-7 peptid) 2 ICso (nM) 0.49 11.7 0.064 0.058 vt5\"\\~o K 1 J-r C~ic l\\ \"'J: ~Yitši' ~n PODGO RI CA, S. Markovica F Tel. 069-406-889: 081 /2 48-3 - n 00185 B 160DOS: 4544/18 <11 0> AMGEN INC. A- 801 8 (PCT) . ST25 .txt LISTING SEKVENCI <120 > SPECIFICNO VEZUJUCI AGENSI ANGIOPETINA- 2 <130> A- 80 1B <140> NIJE JOŠ ODREÐEN <141 > 2002 - 10- 11 <150> us 60/414 ,1 55 <151 > 2002 - 09 - 27 <150> us 60/328 , 624 <151> 2001 - 10 - 11 <160> 359 <170> Patentin verzija 3.1 <210> l <211> 14 <212> PRT <213> Veštacka sekvenca <220> <223> Ang-2 vezujuci peptidi <400> Lys Arg Pro Cys Glu Gl u Met Trp Gly Gly Cys Asn Tyr Asp l 5 10 <210> 2 <211> 14 <2 12> PRT str . l PCT /US02/3267 . .=.. KA 1 n.!>-~ v ...,.,~'slav 6u . plt. Ml~ Mar\\\\o\\ica \\ 9 pooGORI~~S .: 08 ~ 12 48 -377 - 069-406-889 ' lei. 00185 B 161• DOS: 4544/18 <213> Veštacka sekvenca A-801 8 (PCT).ST25.txt <220> <223> Ang- 2 vezujuci peptidi <400> 2 His Gln Ile Cys Lys Trp Asp Pro Trp Thr Cys Lys His Trp l 5 10 <210> 3 <211> 14 <212> PRT <213> Veštacka sekvenca <220> <223> Ang-2 vezujuci polipeptid <400> 3 Lys Arg Pro Cys G l u Glu Ile Phe Gly Gly Cys Thr Tyr Gln l 5 10 <210> 4 <211> 14 <212> PRT <213> Veštacka sekvenca <220> <223> Ang-2 vezujuci polipeptid <400> 4 Gin Glu Glu Cys Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His Met 1 5 10 <2 10> 5 <211> 18 <212> PRT <213> Veštacka sekvenca <220> <223> Ang-2 vezujuci polipeptid str. 2 PCT /US02/3267 00185 B 162DOS: 4544/18 <400> 5 A-801B (PCT).ST25 .txt Phe Asp Tyr Cys Glu Gly Val Glu Asp Pro Phe Thr Phe Gly Cys Asp 1 5 10 15 Asn His <210> 6 <211> 20 <212> ffif <213> Veštacka sekvenca <220> <223> Ang-2 vezujuci polipeptid <400> 6 Lys Phe Asn Pro Leu Asp Glu Leu Glu Glu Thr Leu Tyr Glu Gin Phe 1 5 10 15 Thr Phe Gin Gin 20 <210> 7 <211> 14 <212> ffif <213> Veštacka sekvenca <220> <223> Ang-2 vezujuci peptidi <400> 7 Gin Tyr Gly Cys Asp Gly Phe Leu Tyr Gly Cys Met lie Asn 1 5 10 <210> 8 <211> 67 <212> m< <213> Veštacka sekvenca <220> <223> oligonukleotid str. 3 PCf/US02/3267 00185 B 163DOS: 4544/18 PCT /US02/3267 <400> 8 A-801 8 (PCT).ST25.txt acaaacaaac atatgggtgc acagaaagcg gccgcaaaaa aactcgaggg tggaggcggt 60 ggggaca 67 <2 10> 9 <211> 20 <212> [)\\J( <213> Veštacka sekvenca <220> <223> oligonukleotid <400> 9 ggtcattact ggaccggatc <2 10> 10 <211> 25 <2 12> DNK <2 13> Veštacka sekvenca <220> <223> oligonukleotid <400> 1 0 cgtacaggt t t acgcaagaa aatgg <2 10> ll <2 11> 66 <2 12> DNK <2 13> Veštacka sekvenca <220> <223> oligonu kl eotid <400> ll 20 25 t ttgttggat ccattact cg agtttttttg cggccgctt ' t ctgtgcacca ccacctccac 60 ctt tac 66 <210> 12 <211> 32 <2 12> PRT str . 4 00185 B 164DOS: 4544/18 <213> Veštacka sekvenca A-801 6 (PCT) .ST25 .txt <220> <223> Peptidno telo sposobno da se vezuje za Ang-2 <220> <221> raznovrsni oblici <222> ( 3 2 ) .. ( 3 2) <223> Xaa = Fc <400> 12 Met Gly Ala Gin Lys Phe Asn Pro Leu Asp Glu Leu Glu Glu Thr Leu 1 5 10 15 Tyr Glu Gin Phe Thr Phe Gin Gin Leu Glu Gly Gly Gly Gly Gly Xaa 20 25 30 <210> 13 <211 > 29 <212> FRT <213> Veštacka sekvenca <220> <223> Peptidno telo sposobno da se vezuje za Ang-2 <220> <221> raznovrsni oblici <222> ( 2 9 ) .. ( 2 9) <223> Xaa = Fc <400> 13 Met Lys Phe Asn Pro Leu Asp Glu Leu Glu Glu Thr Leu Tyr Glu Gin 1 5 10 15 Phe Thr Phe Gin Gin Leu Glu Gly Gly Gly Gly Gly Xaa <2 10> 14 <2 11> 51 <212> PRT 20 25 str . 5 PCT /US02/3267 00185 B 165DOS: 4544/18 <213> Veštacka sekvenca A-801 8 (PCT) .ST25.txt <220> <223> Peptidno telo sposobno da se vezuje za Ang-2 <220> <221> raznovrsni oblici <222> (51 ) .. (51) <223> Xaa = Fc <400> 14 Met Lys Phe Asn Pro Leu Asp Glu Leu Glu Glu Thr Leu Tyr Glu Gin 1 5 10 15 Phe Thr Phe Gin Gin Gly Ser Gly Ser Ala Thr Gly Gly Ser Gly Ser 20 25 30 Thr Ala Ser Ser Gly Ser Gly Ser Ala Thr His Leu Glu Gly Gly Gly ~ ~ ~ Gly Gly Xaa 50 <210> 15 <211> 60 <212> ffif <213> Veštacka sekvenca <220> <223> Peptidno telo sposobno da se vezuje za Ang-2 <220> <221> raznovrsni oblici <222> (60) .. (60) <223> Xaa = Fc <400> 15 Met Gly Ala Gin Lys Phe Asn Pro Leu Asp Glu Leu Glu Glu Thr Leu 1 5 10 15 Tyr Glu Gin Phe Thr Phe Gin Gin Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly 20 25 30 str. 6 PCT /US02/3267 00185 B 166DOS: 4544/18 A-801 8 (PCT) .ST25.txt Lys Phe Asn Pro Leu Asp Giu Leu Giu Giu Thr Leu Tyr Giu Gin Phe ~ 40 ~ Thr Phe Gin Gin Leu Giu Giy Giy Giy Giy Giy Xaa ~ ~ oo <210> 16 <211> 56 <212> PRT <213> Veštacka sekvenca <220> <223> Peptidno telo sposobno da se vezuje za Ang -2 <220> <221> raznovrsni oblici <222> ( 5 6 ) \" ( 5 6) <223> Xaa = Fc <400> 16 Met Lys Phe Asn Pro Leu Asp Giu Leu Giu Giu Thr Leu Tyr Glu Gin 1 5 10 15 Phe Thr Phe Gin Gin Gly Giy Giy Gly Giy Giy Giy Lys Phe Asn Pro ~ ~ ~ Leu Asp Giu Leu Giu Glu Thr Leu Tyr Glu Gin Phe Thr Phe Gin Gin ~ ~ ~ Leu Glu Gly Giy Giy Giy Giy Xaa 50 ~ <2 10> 17 <211> 26 <212> ffiT <213> Veštacka sekvenca <220> <223> <220> Peptidno telo sposobno da se vezuje za Ang-2 str. 7 PCT /US02/3267 00185 B 167DOS: 4544/18 <221 > raznovrsni oblici A-801 B (PCT).ST25.txt <222> (26) .. (26) <223> Xaa = Fc <400> 17 Met Gly Ala Gin Gin Glu Glu Cys Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu 1 5 10 15 His Met Leu Glu Gly Gly Gly Gly Gly Xaa 20 25 <210> 18 <2 11> 45 <21 2> PRT <213> Veštacka sekvenca <220> <223> Peptidno telo sposobno da se vezuje za Ang-2 <220> <221> raznovrsni oblici <222> (45) .. (45) <223> Xaa = Fc <400> 18 Met Gin Glu Glu Cys Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His Met Gly 1 5 10 15 Ser Gly Ser Ala Thr Gly Gly Ser Gly Ser Thr Ala Ser Ser Gly Ser 20 25 30 Gly Ser Ala Thr His Leu Gfu Gly Gfy Gly Gly Gly Xaa 35 40 45 <2 10> 19 <2 11> 62 <212> ffir <213> Artificial Sequence <220> str. 8 PCT/US02/3267 00185 B 168DOS: 4544/18 <223> <220> A-801 8 (PCT) .ST25.txt Peptidno telo sposobno da se vezuje za Ang-2 <221> r aznovrsni oblici <222> (62) .. (62) <223> Xaa = Fc <400> 19 Met Gly Ala Gin Gin Glu Glu Cys Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu 1 5 10 15 His Met Gly Ser Gly Ser Ala Thr Gly Gly Ser Gly Ser Thr Ala Ser ~ ~ ~ Ser Gly Ser Gly Ser Ala Thr His Gin Glu Glu Cys Glu Trp Asp Pro 35 40 45 Trp Thr Cys Glu His Met Leu Glu Gly Gly Gly Gly Gly Xaa 50 55 60 <2 10> 20 <211 > 31 <212> PRT <213> Veštacka sekvenca <220> <223> Peptidno telo sposobno da se vezuje za Ang-2 <220> <221> raznovrsni oblici <222> ( 2 ) . . ( 2 ) <223> Xaa = Fc <400> 20 Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Lys Phe Asn Pro Leu Asp Glu 1 5 10 15 Leu Glu Glu Thr Leu Tyr Glu Gin Phe Thr Phe Gin Gin Leu Glu <210> 21 <211> 53 ~ ~ ~ str. 9 PCT /US02/3267 00185 B 169DOS: 4544/18 <212> PRT A-801 8 (PCT).ST25.txt <213> Veštacka sekvenca <220> <223> Peptidno telo sposobno da se vezuje za Ang-2 <220> <221> raznovrsni oblici <222> (2) .. (2) <223> Xaa = Fc <400> 2 1 Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Gly Ser Gly Ser Ala Thr Gly 1 5 10 15 Gly Ser Gly Ser Thr Ala Ser Ser Gly Ser Gly Ser Ala Thr His Lys w ~ ~ Phe Asn Pro Leu Asp Glu Leu Glu Glu Thr Leu Tyr Glu Gin Phe Thr ~ ~ ~ Phe Glu Gin Leu Glu 50 <210> 22 <211 > 59 <2 12> PRT <213> Veštacka sekvenca <220> <223> Pept i dno t el o sposobno da se vezuje za Ang- 2 <220> <221> raznovrsni oblici <222> (2) .. (2) <223> Xaa = Fc <400> 22 Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Lys Phe Asn Pro Leu Asp Glu 1 5 10 15 str. l O PCT/US02/3267 00185 B 170• DOS: 4544/18 A- 801 8 ( PCT) . ST25 . txt Leu Glu Glu Thr Leu Tyr Glu Gin Phe Thr Phe Gin Gin Gly Gly Gly 20 25 30 Gly Gly Gly Gly Gly Lys Phe Asn Pro Leu Asp Glu Leu Glu Glu Thr 35 40 45 Leu Tyr Glu Gin Phe Thr Phe Gin Gin Leu Glu 50 55 <2 10> 23 <2 11> 25 <212> PRT <213> Veštacka sekvenca <220> <223> Peptidno telo sposobno da se vezuje za Ang-2 <220> <221> raznovrsni oblici <222> (2) . . (2) <223> Xaa = Fc <400> 23 Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Gin Glu Glu Cys Glu Trp Asp 1 5 10 15 Pro Trp Thr Cys Glu His Met Leu Glu <2 10> 24 <2 11> 47 <212> PRT 20 25 <213> Veštacka sekvenca <220> <223> Peptidno telo sposobno da se vezuje za Ang-2 <220> <22 1> r aznovr s ni oblici <222> (2) . . (2) <223> Xa a = Fc s t r . ll PCT /US02/3267 00185 B 171DOS: 4544/18 A-801 8 (PCT).ST25.txt <400> 24 Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Gly Ser Gly Ser Ala Thr Gly 1 5 10 15 Gly Ser Gly Ser Thr Ala Ser Ser Gly Ser Gly Ser Ala Thr His Gin 20 25 30 Glu Glu Cys Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His Met Leu Glu ~ ~ ~ <210> 25 <2 11 > 61 <212> FRT <213> Veštacka sekvenca <220> <223> Peptidno telo sposobno da se vezuje za Ang-2 <220> <221> raznovrsni oblici <222> ( 2 ) . . ( 2) <223> X aa = F e <400> 25 Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Gin Glu Glu Cys Glu Trp Asp 1 5 10 15 Pro Trp Thr Cys Glu His Met Gly Ser Gly Ser Ala Thr Gly Gly Ser 20 25 30 Gly Ser Thr Ala Ser Ser Gly Ser Gly Ser Ala Thr His Gin Glu Glu 35 40 45 Cys Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His Met Leu Glu w ~ ~ <21 0> 26 <21 1> 75 <212> PRT <213> Veštacka sekvenca str. 12 PCT IUS02/3267 00185 B 172DOS: 4544/18 A-801 8 (PCT).ST2 5.txt <220> <223> Peptid n o te lo s pos o b n o d a se vez u j e za An g-2 <220> <221> raznovrsni oblici <222> (75) .. (75) <223> Xaa = Fc <400> 26 Met Gly Ala Gin Glu Glu Cys Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His l 5 10 15 Met Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Lys Phe Asn Pro Leu Asp Glu 20 25 30 Leu Glu Glu Thr Leu Tyr Glu Gin Phe Thr Phe Gin Gin Gly Ser Gly 35 40 45 Ser Ala Thr Gly Gly Ser Gly Ser Thr Ala Ser Ser Gly Ser Gly Ser oo ~ oo Ala Thr His Leu Glu Gly Gly Gly Gly Gly Xaa 65 70 75 <210> 27 <211> 72 <212> PRT <213> Veštacka sekvenca <220> <223> P e p t i d n o t e l o s p o s o b n o d a s e v e z u j e z a A n g - 2 <220> <221> raznovrsni oblici <222> ( 2 ) .. ( 2 ) <223> X aa = F e <400> 27 Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Gly Ser Gly Ser Ala Thr Gly 1 5 10 15 Gly Ser Gly Ser Thr Ala Ser Ser Gly Ser Gly Ser Ala Thr His Lys w ~ ~ str. 13 PCT /US02/32657 00185 B 173DOS: 4544/18 A-801 8 (PCT) .ST25 .txt Phe Asn Pro Leu Asp Glu Leu Glu Glu Thr Leu Tyr Glu Gin Phe Thr 35 40 45 Phe Gin Gin Gly Gly Gly Gly Gly Gin Glu Glu Cys Glu Trp Asp Pro 50 55 60 Trp Thr Cys Glu His Met Leu Glu 65 70 <210> 28 <211 > 30 <212> FRT <213> Veštacka se kven ea <220> <223> Peptidno telo sposobno da se vezuje za Ang-2 <220> <221> raznovrsni oblici <222> ( 3 o ) .. ( 3 o ) <223> Xaa = Fc <400> 28 Met Gly Ala Gin Phe Asp Tyr Cys Glu Gly Val Glu Asp Pro Phe Thr 1 5 10 15 Phe Gly Cys Asp Asn His Leu Glu Gly Gly Gly Gly Gly Xaa 20 25 30 <210> 29 <2 11> 26 <212> PRT <213> Veštacka sekvenca <220> <223> Peptidno telo sposobno da se vezuje za Ang-2 <220> <221 > raznovrsni oblici <222> (26) .. (26) str. 14 PCT IUS02/3267 00185 B 174DOS: 4544/18 A- 801 8 ( PCT) . ST25 .txt <223> Xaa Fc <400> 29 Met Gly Ala Gin Gin Tyr Gly Cys Asp Gly Phe Leu Tyr Gly Cys Met 1 5 10 15 lie Asn Leu Glu Gly Gly Gly Gly Gly Xaa 20 25 <2 10> 30 <2 11> 26 <212> FRT <213> Veštacka sekvenca <220> <223> Peptidno telo sposobno da se vezuje za Ang-2 <220> <221> raznovrsni oblici <222> ( 2 6 ) .. ( 2 6) <223> Xaa = Fc <400> 30 Met Gly Ala Gin Lys Arg Pro Cys Glu Glu Met Trp Gly Gly Cys Asn 1 5 10 15 Tyr Asp Leu Glu Gly Gly Gly Gly Gly Xaa 20 25 <2 10> 31 <2 11 > 26 <2 12> PRT <213> Veštacka sekvenca <220> <223> Peptidno telo sposobno da se vezuje za Ang-2 <220> <22 1> raznovrsni oblici <222> (26) .. (26) str. 15 PCT IUS02/3267 00185 B 175DOS: 4544/18 A-8018 (PCT) .ST25.txt <223> Xaa = Fc <400> 31 Met Gly Ala Gin His Gin lie Cys Lys Trp Asp Pro Trp Th r Cys Lys 1 5 10 15 His Trp Leu Glu Gly Gly Gly Gly Gl y Xaa 20 25 <210> 32 <211> 26 <212> PRT <213> Veštacka sekvenca <22.0> <223> Peptidno telo sposobno da se vezuje za Ang -2 <220> <221> raznovrsni oblici <222> (26) .. (26) <223> X aa = F e <400> 32 Met Gly Ala Gin Lys Arg Pro Cys Glu Glu lie Phe Gly Gly Cys Thr 1 5 10 15 Tyr Gin Leu Glu Gly Gly Gly Gly Gly Xaa 20 25 <21 0> 33 <211> 784 <212> IN<. <213> Veštacka sekvenca <220> <223> DNK kodirajuca peptiDNK tela sposobna da se vezuju za Ang- 2 <400> 33 PCT/US02/3267 atgggt gcac agaaattcaa cccgctggac gaactggaag aaactctgta cgaacagttc 60 actttccagc agctcgaggg tggaggcggt ggggacaaaa ctcacacatg tccaccttgc 120 ccagcacctg aactcctggg gggaccgtca gttttcctct tccccccaaa acccaaggac 180 str . 16 00185 B 176DOS: 4544/18 accctcatga gaccctgagg aagccgcggg caccaggact gcccccatcg accctgcccc aaaggcttct aactacaaga ctcaccgtgg gaggctctgc a tee <210> 34 <211> 768 <212> DNK tctcccggac tcaagttcaa aggagcagta ggctgaatgg agaaaaccat catcccggga atcccagcga ccacgcctcc acaagagcag acaaccacta A- 801 8 (PCT) . ST25.txt ccctgaggtc acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa ctggtacgtg gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca caacagcacg taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caaggagtac aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca ctccaaagcc aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac tgagctgacc aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc catcgccgtg gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac cgtgctggac tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag gtggcagcag gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat cacgcagaag agcctctccc tgtctccggg taaataatgg <213> Veštacka sekvenca <220> <223> DNK encod ing peptibodies capable of bind ing to Ang-2 <400> 34 atgaaattca acccgctgga cgaactggaa gaaactctgt acgaacagtt cactt t ccag cagctcgagg gtggaggcgg tggggacaaa actcacacat gtccaccttg ceca gea cet gaactcctgg ggggaccgtc agttttcctc ttccccccaa aacccaagga caccctcatg atctcccgga cccctgaggt cacatgcgtg gtggtggacg tgagccacga agaccctgag gtcaagttca actggtacgt ggacggcgtg gaggtgcata atgccaagac aaagccgcgg gaggagcagt acaacagcac gtaccgtgtg gtcagcgtcc tcaccgtcct gcaccaggac tggctgaatg gcaaggagta caagtgcaag gtctccaaca aagccct ccc agcccccatc gagaaaacca tctccaaagc caaagggcag ccccgagaac cacaggtgta caccctgccc ccatcccggg atgagctgac caagaaccag gtcagcctga cctgcctggt caaaggcttc tatcccagcg acatcgccgt ggagtgggag agcaatgggc agccggagaa caactacaag accacgcctc ccgtgctgga ctccgacggc tccttcttcc tctacagcaa gctcaccgtg gacaagagca ggtggcagca ggggaacgtc ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg cacaaccact acacgcagaa gagcctctcc ctgtctccgg gtaaataa <210> 35 str. 17 PCT /US02/3267 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 784 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 768 00185 B 177DOS: 4544/18 PCTIUS02/32657 A-801B (PCT) .ST25.txt <211> 834 <212> DNK <213> Veštacka sekvenca <220> <223> DNK kodirajuca peptiDNK tela sposobna da se vezuju za Ang-2 <400> 35 atgaaattca acccgctgga cgaactggaa gaaactctgt acgaacagtt cactttccag 60 cagggatccg gttctgctac tggtggttcc ggctccaccg caagctctgg ttcaggcagt gcgactcatc tcgagggtgg aggcggtggg gacaaaactc acacatgtcc accttgccca gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtt ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggatga gctgaccaag aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc ctctccctgt ctccgggtaa ataa <210> 36 <211> 861 <212> DNK <213> Veš tacka sekvenca <220> <223> DNK kodirajuca peptiDNK tela sposobna da se vezuju za Ang-2 <400> 36 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 834 atgggtgcac agaaattcaa cccgctggac gaactggaag aaactctgta cgaacagttc 60 actttccagc agggtggtgg tggtggtggc gaagagactc tgtatgaaca gttcactttc aaaactcaca catgtccacc ttgcccagca ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct ggtggtaagt tcaacccact ggatgagctg cagcaactcg agggtggagg cggtggggac cctgaactcc tggggggacc gtcagttttc atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc str. 18 120 180 240 300 360 00185 B 178DOS: 4544/1 gtggaggtgc ataatgccaa gtggtcagcg tcctcaccgt aaggtctcca acaaagccct cagccccgag aaccacaggt A- 801 8 (PCT) .ST25 .txt gacaaagccg cgggaggagc agtacaacag cctgcaccag gactggctga atggcaagga cccagccccc atcgagaaaa ccatctccaa gtacaccctg cccccatccc gggatgagct cacgtaccgt g t acaagtgc agccaaaggg gaccaagaac PCT/US02/3267 420 480 540 600 caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc ttctatccca gcgacat cgc cgtggagtgg 660 gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac 720 ggctccttct tcctctacag caagctcacc gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac 780 gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc 840 tccctgtctc cgggtaaata a 86 1 <210> 37 <21 1 > 849 <2 1 2> DNK <2 13> Veštacka sekvenca <220> <223> DNK kodirajuca peptiDNK tela sposobna da se vezuju za Ang- 2 <400> 37 atgaaat t ca acccgctgga cgaactggaa gaaactctgt acgaacagtt cactttccag cagggt ggtg gtggtggcgg tggtaagttc aacccact gg atgagctgga agagactctg t atgaacagt tcact t tcca gcaactcgag ggtggaggcg gtggggacaa aactcacaca tgtccacctt gcccagcacc tgaactcctg gggggaccgt cagttttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc aactggtacg tggacggcgt ggaggt gcat aat gccaaga caaagccgcg ggaggagcag tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc c t caccgtcc t gcaccagga ctggctgaat ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccct cc cagcccccat cgagaaaacc atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg t caaaggctt c t atcccagc gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct cccgtgct gg actccgacgg ctccttcttc ctct acagca agctcaccgt ggacaagagc aggtggcagc aggggaacgt cttctcat gc t ccgt gat gc atgaggctct gcacaaccac tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtaaataa <2 1 0> 38 str . 19 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 849 00185 B 179DOS: 4544/18 PCT/US02/3267 A-80 J 8 (PCT).ST25 .txt <211> 759 <212> DNK <213> Veštacka sekvenca <220> <223> DNK kodirajuca peptiDNK tela sposobna da se vezuju za Ang-2 <400> 38 atgggtgcac agcaggaaga atgcgaatgg gacccatgga cttgcgaaca catgctcgag 60 ggtggaggcg gtggggacaa aactcacaca tgtccacctt gcccagcacc tgaactcctg 120 gggggaccgt cagttttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg 180 acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc 240 aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag 300 tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat 360 ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc 420 atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg 480 gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc 540 gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct 600 cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc 660 aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac 720 tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtaaataa 759 <210> 39 <211> 816 <212> DNK <213> Veš tacka sekvenca <220> <223> DNK kodirajuca peptiDNK tela sposobna da se vezuju za Ang-2 <400> 39 atgcaggaag aatgcgaatg ggacccatgg acttgcgaac acatgggatc cggttctgct 60 actggtggtt ccggctccac cgcaagctct ggttcaggca gtgcgactca tctcgagggt 120 ggaggcggtg gggacaaaac tcacacatgt ccaccttgcc cagcacctga actcctgggg 180 ggaccgtcag ttttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc 240 cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt caagttcaac 300 tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac 360 aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaatggc 420 str . 20 00185 B 180ros: 4544/18 PCT/US02/32657 aaggagtaca tccaaagcca gagctgacca atcgccgtgg gtgctggact tggcagcagg acgcagaaga <210> 40 <211> 867 <212> DNK agtgcaaggt aagggcagcc agaaccaggt agtgggagag ccgacggctc ggaacgtctt gcctctccct A- 801 8 CPCT) .S T25.txt ctccaacaaa gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc ccgagaacca caggtgtaca ccctgccccc atcccgggat cagcctgacc tgcct ggt c a aaggcttcta tcccagcgac caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacgcctccc cttcttcctc tacagcaagc tcaccgtgga caagagcagg ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac gtctccgggt aaataa <213> Veštacka sekvenca <220> <223> DNK kodirajuca peptiDNK tela sposobna da se vezuju za Ang-2 <400> 40 a t g ggtgcac agcaggaaga atgcgaatgg gacccatgga cttgcgaaca catgggatcc ggttct gcta ctggtggttc cggctccacc gcaagctctg gttcaggcag t gcgactcat caggaagaat gcgaatggga cccatggact tgcgaacaca t gctcgaggg tggaggcggt ggggacaaaa ctcacacatg tccaccttgc ccagcacctg aactcctggg gggaccgtca gttttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccggac ccctgaggtc acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccct gagg tcaagttcaa ctggtacgtg gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc catcccggga tgagctgacc aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag agcctctccc tgtctccggg taaataa <210> 4 1 <2 11 > 774 <212> DNK str . 21 480 540 600 660 720 780 816 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 867 00185 B 181DOS: 4544/18 PCT IUS02/3267 A-801 s (PCT) .5T25.txt <213> Veštacka sekvenca <220> <223> DNK kodirajuca peptiDNK tela sposobna da se vezuju za Ang-2 <400> 41 atggacaaaa ctcacacatg tccaccttgc ccagcacctg aactcctggg gggaccgtca 60 gttttcctct tccccccaaa acatgcgtgg tggtggacgt gacggcgtgg aggtgcataa taccgtgtgg tcagcgtcct aagtgcaagg tctccaacaa aaagggcagc cccgagaacc aagaaccagg tcagcctgac gagtgggaga gcaatgggca tccgacggct ccttcttcct Cj Cj Cj ciciCCj l. CL <_CL Cc 11_ CJCCC acccaaggac accctcatga tctcccggac ccctgaggtc gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac agccctccca gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc acaggtgtac accctgcccc catcccggga tgagctgacc ctgcctggtc aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac ctacagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag Cy Lyatyv-al Cj3.Cjyl_uv_uyv- U«_uuv.\"uv-LU v\"cli-y v-«_*y t_« ,t_ 4 .Cj 120 180 240 300 360 420 480 540 600 vvu agcctctccc tgtctccggg taaaggtgga ggtggtggtg cacagaaatt caacccgctg 720 gacgagctgg aagagactct gtacgaacag tttacttttc aacagctcga gtaa 774 <210> 42 <211> 840 <212> DNK <213> Veštacka sekvenca <220> <223> DNK kodirajuca peptiDNK tela sposobna da se vezuju za Ang-2 <400> 42 atggacaaaa ctcacacatg tccaccttgc ccagcacctg aactcctggg gggaccgtca gttttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccggac ccctgaggtc acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc catcccggga tgagctgacc aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac str. 22 60 120 180 240 300 360 420 480 540 00185 B 182r:x::s: 4544/18 \"f!cr/US02/32657 tccgacggct gggaacgtct agcctctccc actggtggtt ccgctggacg <210> 43 <211> 858 <212> DNK ccttcttcct tctcatgctc tgtctccggg ccggctccac aactggaaga A-801 8 (PCT) . ST25. txt ctacagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag taaaggtgga ggtggtggtg cacagggatc cggttctgct cgcaagctct ggttcaggca gtgcgactca taaattcaac aactctgtac gaacagttca ctttccagca actcgagtaa <213> Veštacka sekvenca <220> <223> DNK kodirajuca peptiDNK tela sposobna da se vezuju za Ang-2 <400> 43 atggacaaaa ctcacacatg tccaccttgc ccagcacctg aactcctggg gggaccgtca gttttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccggac ccctgaggtc acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc catcccggga tgagctgacc aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag agcctctccc tgtctccggg taaaggtgga ggtggtggtg cacagaaatt caacccgctg gacgaactgg aagaaactct gtacgaacag ttcactttcc agcagggtgg tggtggtggt ggcggtggta agttcaaccc actggatgag ctggaagaga ctctgtatga acagttcact t t ccagcaac tcgagtaa <210> 44 <211> 756 <212> DNK <213> Veš tacka sekvenca str. 23 600 660 720 780 840 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 858 00185 B 183DOS: 4544/18 PCT/US02/3267 A-80 1 8 (PCT) .ST25.txt <220> <223> DNK kodirajuca peptiDNK tela sposobna da se vezuju za Ang-2 <400> 44 atggacaaaa ctcacacatg tccaccttgc ccagcacctg aactcctggg gggaccgtca 60 gttttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccggac ccctgaggtc 120 acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg 180 gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg 240 taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac 300 aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc 360 aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc catcccggga tgagctgacc 420 aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg 480 gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac 540 tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag 600 gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag 660 agcctctccc tgtctccggg taaaggtgga ggtggtggtg cacagcagga agaatgcgaa 720 tgggacccat ggacttgcga acacatgctc gagtaa 756 <210> 45 <211> 822 <2 12> DNK <213> Veštacka sekvenca <220> <223> DNK kodirajuca peptiDNK tela sposobna da se vezuju za Ang-2 <400> 45 atggacaaaa ctcacacatg tccaccttgc ccagcacctg aactcctggg gggaccgtca 60 gttttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccggac ccctgaggtc 120 acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg 180 gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg 240 taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac 300 aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc 360 aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc catcccggga tgagctgacc 420 aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg 480 gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac 540 tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag 600 gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag 660 str. 24 00185 B 184OOS: 4544/18 PCT/US02/32657 A- 801 8 (PCT) .ST25.txt agcctctccc tgtctccggg taaaggtgga ggtggtggtg cacagggatc cggttctgct 720 actggtggtt ccggctccac cgcaagctct ggttcaggca gtgcgactca tcaggaagaa 780 tgcgaatggg acccatggac ttgcgaacac atgctcgagt aa <210> 46 <211> 864 <212> DNK <213> Veštacka sekvenca <220> <223> DNK kodirajuca peptiDNK tela sposobna da se vezuju za Ang-2 <400> 46 atggacaaaa ctcacacatg tccaccttgc ccagcacctg aactcctggg gggaccgtca gttttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccggac ccctgaggtc acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc catcccggga tgagctgacc aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag agcctctccc tgtctccggg taaaggtgga ggtggtggtg cacagcagga agaatgcgaa tgggacccat ggacttgcga acacatggga tccggttctg ctactggtgg ttccggctcc accgcaagct ctggttcagg cagcgcgact catcaggaag aatgcgaatg ggacccatgg acttgcgaac acatgctcga gtaa <210> 47 <211> 906 <212> DNK <213> Veš tacka sekvenca <220> <223> DNK kodirajuca peptiDNK tela sposobna da se vezuju za Ang-2 str. 25 822 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 864 00185 B 1851:03: 4544/18 ECT/US02/32657 A-801 8 (PCO.ST25.txt <400> 47 atgggtgcac aggaagaatg cgaatgggac ccatggactt gcgaacacat gggtggtggt 60 ggtggtggcg gtggtaaatt caacccgctg gacgaactgg aagaaactct gtacgaacag 120 ttcactttcc agcagggatc cggttctgct actggtggtt ccggctccac cgcaagctct 180 ggttcaggca gtgcgactca tctcgagggt ggaggcggtg gggacaaaac tcacacatgt 240 ccaccttgcc cagcacctga act cet gggg ggaccgtcag ttttcctctt ccccccaaaa 300 cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg 360 agccacgaag accctgaggt caagttcaac tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat 420 gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc 480 accgtcctgc accaggactg gctgaatggc aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa 540 gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca 600 caggtgtaca ccctgccccc atcccgggat gagctgacca agaaccaggt cagcctgacc 660 tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag 720 ccggagaaca actacaagac cacgcctccc gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc 780 tacagcaagc tcaccgtgga caagagcagg tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc 840 gtgatgcatg aggctctgca caaccactac acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt 900 aaataa 906 <210> 48 <211> 897 <212> DNK <213> Veštacka sekvenca <220> <223> DNK kodirajuca peptiDNK tela sposobna da se vezuju za Ang-2 <400> 48 atggacaaaa ctcacacatg tccaccttgc ccagcacctg aactcctggg gggaccgtca 60 gttttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccggac ccctgaggtc 120 acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg 180 gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg 240 taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac 300 aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc 360 aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc catcccggga tgagctgacc 420 aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg 480 gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac 540 tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag 600 str . 26 00185 B 186IX>S : 4544/ 18 J:Cl'/US02/32657 A - 801 8 (PCT) .ST25.txt <400> 50 atgggtgcac agcagtacgg ttgcgacggt tttctgtacg gttgcatgat caacctcgag 60 ggtggaggcg gtggggacaa aactcacaca tgtccacctt gcccagcacc tgaactcctg 120 gggggaccgt cagttttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg 180 acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc 240 aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag 300 tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat 360 ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc 420 atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg 480 gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc 540 gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct 600 cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ct ct a cagea agctcaccgt ggacaagagc 660 aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac 720 tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtaaataa 759 <210> 51 <21 1> 759 <212> DNK <213> Veštacka sekvenca <220> <223> DNK kodirajuca peptiDNK tela sposobna da se vezuju za Ang-2 <400> 51 atgggtgcac agaaacgccc atgcgaagaa atgtggggtg gttgcaacta cgacctcgag 60 ggtggaggcg gtggggacaa aactcacaca tgtccacctt gcccagcacc tgaactcctg 120 gggggaccgt cagttttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg 180 acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc 240 aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag 300 tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat 360 ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc 420 atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg 480 gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc 540 gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct 600 cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ct ct a cagea agctcaccgt ggacaagagc 660 aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac 720 tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtaaataa 759 str . 28 00185 B 187DOS: 4544118 PCf/US02/3265 7 A-801 B CPCT).ST25.txt tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat 360 ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc 420 atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg 480 gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc 540 gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct 600 cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc 660 aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac 720 tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtaaataa 759 <2 10> 54 <2 11> 25 <212> CN< <213> Veštacka sekvenca <220> <223> oligonukleotid <400> 54 cggcgcaact atcggtatca agctg <210> 55 <211> 26 <212> DNK <213> Veštacka sekvenca <220> <223> o1igonuk1eoti d <400> 55 cat gtaccgt aacactgagt ttcgtc <210> 56 <211> 14 <212> PRT <213> Veštacka sekvenca <220> <223> Saglasni motivi dobijeni od TN8-IX biblioteke str. 30 25 26 00185 B 188DOS: 4544/18 A- 801 8 (PCT) . ST25 .txt <400> 58 Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu Xaa Met l 5 10 <210> 59 <211> 18 <212> PRT <213> Veštacka sekvenca <220> <223> Sag l asni motivi dobijeni od TN12-I bibli oteke <220> <221> raznovrsni oblici <222> (3 , 8, 10- 14 and) .. (18) <223> Xaa se pdnosi na bilo koju prirodnu amino kiselinu . <400> 59 Trp Ser Xaa Cys Ala Trp Phe Xaa Gl y Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Arg l 5 10 15 Arg Xaa <2 10> 60 <211> 227 <212> ffiT <213> Veštacka sekvenca <220> <223> Humani Fc igGl <400 > 60 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 1 5 10 15 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met w ~ ~ PCf/US02/3267 lie Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 35 40 45 str. 32 00185 B 189DOS: 4544/18 A-80 l 8 (PCT).S T25.txt <222> ( 1-3 , 5, 7, 12, 13 i) .. (l4) <223> Xaa se odnosi na bilo koju prirodnu amino kiselinu . <400> 61 Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Asp Xaa Tyr Trp Tyr Cys Xaa Xaa Xaa l 5 10 <2 10> 62 <2 11> 14 <212> FRT <213> Veštacka sekvenca <220> <223> Sag l asni motivi dobijeni od TN8- IX biblioteke. <220> <221> raznovrsni oblici <222> (1-3, 5, 7, 12, 13 i) .. (14) <223> Xaa se odnosi na bilo koju prirodnu amino kiselinu . <400> 62 Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Asp Xaa Tyr Thr Tyr Cys Xaa Xaa Xaa l 5 10 <210> 63 <211> 14 <212> PRT <213> Veštacka sekvenca <220> <223> Saglasni motivi dobijeni od TN8- IX biblioteke <220> <221> r aznovrsni oblici <222> (1-3, 5, 7, 12, 13 and) .. (14) <223> Xaa se odnosi na bilo koju prirodnu amino kiselinu. <400> 63 str . 34 PCf/US02/3267 00185 B 190DOS: 4544/18 A-801 6 (PCT).ST25.txt <223> Polipeptid sposoban da se vezuje za Ang-2 <400> 66 Trp Asp Pro Trp Thr Cys l <210> 67 <211> 7 <212> PRT 5 <213> Veštacka sekvenca <220> <223> Polipeptid sposoban da se vezuje za Ang-2 <220> <221> raznovrsni oblici <222> (2) . . (2) <223> Xaa je kkiseo ili neutralan polarni amino kiselinski ostatak <400> 67 Cys Xaa Trp Asp Pro Trp Thr l 5 <210> 68 <211> 8 <212> PRT <213> Veštacka sekvenca <220> <223> Polipeptid sposoban da se vezuje za Ang-2 <220> <221> raznovrsni oblici <222> (2) .. (2) <223> Xaa je kiseli ili neutralan polarni amino kiselinski ostatak <400> 68 Cys Xaa Trp Asp Pro Trp Thr Cys l 5 str. 36 PCT/US02/3267 00185 B 191DOS: 4544/18 <2 10> 70 <211> 20 <2 12> ffiT <213> Veštacka sekvenca <220> A-801 B (PCT).ST25.txt <223> Polipeptid sposoban da se vezuje za Ang-2 <220> <221> raznovrsni oblici <222> (l and) .. (15) PCT/US02/32657 <223> Xaa je odsutan ili je neutralan hidrofobni , neutralan polarni, ili bazni amino kiselinski ostatak . <220> <221> raznovrsni oblici <222> (2 and) .. (I6) <223> Xaa je odsutan ili je neutralan hidrofobni , neutralan polarni, ili bazni amino kiselinski ostatak. <220> <221> raznovrsni oblici <222> (3-6 , 18, 19 and) .. (20) <223> Xaa je svaki nezavisno odsutan ili je amino kiselinski ostatak. <220> <221> raznovrsni oblici <222> (8) . . (8) <223> Xaa j e amino ki selinski ostatak . <220> <22 1> raznovrsni oblici <222> (17) .. ( l 7) <223> Xaa je odsutan ili je neutralan hidrofobni , neutralan polarni amino kiselinski ostatak str . 38 00185 B 192DOS: 4544/18 PCT/US02/3267 <221> ranovrsni oblici A-801 8 (PCT).ST25.txt <222> C8) .. (8) <223> Xaa je odsutan ili je neutralan hidrofobni , neutralan polarni, ili bazni amino kiselinski ostatak . <400> 71 Pro Xaa Asp Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Leu Tyr l 5 10 <210> 72 <211> 22 <212> PRT <213> Veštacka sekvenca <220> <223> polipeptid sposoban da se vezuje za Ang-2 <220> <221> raznovrsni oblici <222> (1 , 4 and ) .. (20) <223> Xaa je odsutan ili je amino kiselinski ostatak . <220> <221 > raznovrsni oblici <222> (2, 15, 16 and) .. (21) <223> Xaa je odsutan ili je neutralan hidrofobni , neutralan polarni , ili bazni amino kiselinski ostatak. <220> <221> raznovrsni oblici <222> (3 , 17 and) .. (18) <223> Xaa je odsutan ili je neutral an hidrofobni , neutralan pol arni amino kiselinski ostatak. <220> <221 > raznovrsni oblici <222> (6) .. (6) str. 40 00185 B 193DOS: 4544/18 <211> 8 <212> PRT <213> Veštacka sekvenca <220> A-80 1 B (PCT). ST25. txt <223> Polipeptid sposoban da se vezuje za Ang-2 <220> <221> raznovrsni oblici <222> (3) .. (3) <223> Xaa je neutralan polarni , ili kiseli amino kisel inski ostatak . <220> <221> raznovrsni obl ici <222> (4) .. (4) <223> Xaa j e ki sel i amino kiselinski ost atak . <220> <221> raznovrsni oblici <222> (5) .. C5) <223> Xaa je neutralan polarni ili kiseli amino kiselinski ostatak. <220> <221> raznovrsni oblici <222> (6 and) .. (?) <223> Xaa je neutralan hidrofobni amino kiselinski ostatak. <400> 73 A rg Pro Xaa Xaa X aa Xaa Xaa Gly l 5 <210> 74 <211> 20 <212> PRT <213> Veštacka sekvenca str . 42 PCT/US02/3267 00185 B 194DOS: 4544/18 A - 801 8 (PCT) .ST25.txt Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Xaa Xaa Xaa Xaa l 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa 20 <210> 75 <2 11> 13 <212> PRT <213> Veštacka sekvenca <220> <223> Polipeptid sposoban da se vezuje za Ang-2 <220> <221> raznovrsni oblici <222> C2) .. (2) <223> Xaa je ki seli amino kiselinski ostatak; <220> <221> raznovrsni oblici <222> ( 4 ) .. ( 4 ) <223> Xaa je neutralan hidrofobni amino kiselinski ostatak . <220> <221> raznovrsni obli ci <222> (5) .. (5) <223> Xaa je E, D, ili Q. <220> <221> raznovrsni oblici <222> CIO) . . (l O) PCT /US02/3267 <223> Xaa je neutral an hidrof obni ili neutralan polarni amino kiselinski ostatak . <220> <221> raznovrsni oblici <222> (13) .. (13) str. 44 00185 B 195DOS: 4544/18 A-801 8 (PCT).ST25.txt <220> <223> Polipeptid sposoban da se vezuje za Ang-2 <400> 78 Trp Tyr Glu Gin Asp Ala Cys Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His 1 5 10 15 Met Ala Glu Val 20 <210> 79 <2 11> 20 <212> ffiT <213> Veštacka sekvenca <220> <223> Polipeptid sposoban da se vezuje za Ang-2 <400> 79 ASP , Aro Leu Gin Glu Val Cys Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His 1 5 10 15 Met Glu Asn Val 20 <210> 80 <2 11> 20 <212> ffiT <213> Veštacka sekvenca <220> <223> Polipeptid sposoban da se vezuje za Ang-2 <400> 80 Ala Ala Thr Gin Glu Glu Cys Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His 1 5 10 15 Met Pro Arg Ser 20 <2 10> 81 <211 > 20 <212> PRT str. 46 PCT/US02/3267 00185 B 196DOS: 4544/18 <211> 20 <212> PRT <213> Veštacka sekvenca <220> A-801 8 (PCT).ST25.txt <223> Polipeptid sposoban da se vezuje za Ang-2 <400> 84 Trp Ala Ala Gin Giu Giu Cys Giu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Giu His 1 5 10 15 Met Giy Arg Met 20 <2 10> 85 <211 > 20 <212> PRT <213> Veštacka sekvenca <220> <223> Polipeptid sposoban da se vezuje za Ang-2 <400> 85 Thr Trp Pro Gin Asp Lys Cys Giu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Giu His 1 5 10 15 Met Giy Ser Thr 20 <210> 86 <211 > 20 <212> PRT <213> Veštacka sekvenca <220> <223> Poiipeptid sposoban da se vezuje za Ang-2 <400> 86 Giy His Ser Gin Glu Giu Cys Gly Trp Asp Pro Trp Thr Cys Giu His 1 5 10 15 Met Giy Thr Ser str. 48 PCT/US02/3267 00185 B 197DOS: 4544/18 Met Pro Arg Asn 20 <210> 90 <211> 20 <212> PRT <2 13> Veštacka sekvenca <220> A-801 8 (PCT).ST25.txt <223> Polipeptid sposoban da se vezuje za Ang-2 <400> 90 Val Lys Thr Gin Glu His Cys Asp Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His 1 5 10 15 Met Arg Glu T~cf <? 10> 91 <211> 20 <212> PRT <213> Veštacka sekvenca <220> <223> Polipeptid sposoban da se vezuje za Ang-2 <400> 91 Ala Trp Gly Gin Glu Gly Cys Asp Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His 1 5 10 15 Met Leu Pro Met 20 <210> 92 <211> 20 <212> FRr <213> Veštacka sekvenca <220> <223> Polipeptid sposoban da se vezuje za -2 str. 50 PCT/US02/3267 00185 B 198DOS: 4544/18 A-801 B (PCT).ST25.txt <220> <223> Polipeptid sposoban da se vezuje za Ang-2 <400> 95 Pro Arg Leu Gin Glu Glu Cys Val Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His 1 5 10 15 Met Pro Leu AJ.8 <210> 96 <2 11> 20 <212> PRT <213> Veštacka sekvenca <220> <223> Polipeptid sposoban da se vezuje za Ang-2 <400> 96 Arg Thr Thr Gin Glu Lys Cys Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His 1 5 10 15 Met Glu Ser Gin 20 <2 10> 97 <2 11> 20 <212> PRT <213> Veštacka sekvenca <220> <223> Polipeptid sposoban da se vezuje za Ang-2 <400> 97 Gin Thr Ser Gin Glu Asp Cys Val Trp Asp Pro Trp Thr Cys Asp His 1 5 10 15 Met Val Ser Ser 20 <2 10> 98 <21 1 > 20 <212> PRT str. 52 PCTIUS02/3267 00185 B 199DOS: 4544/18 <211> 20 <212> PRT <213> Veštacka sekvenca <220> A-801 B (PCT).ST25.txt <223> Polipeptid sposoban da sevezuje za Ang-2 <400> 101 Pro Met Asn Gin Val Glu Cys Asp Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His 1 5 10 15 Met Pro Arg Ser 20 <2 10> 102 <211 > 20 <2 12> PRT <213> Veštacka sekvenca <220> <223> Polipeptid sposoban da se vezuje za Ang-2 <400> 102 Phe Gly Trp Ser His Gly Cys Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His 1 5 10 15 Met Gly Ser Thr 20 <2 10> 103 <2 11> 20 <212> PRT <213> Veštacka sekvenca <220> <223> Polipeptid sposoban da se vezuje za Ang-2 <400> 103 Lys Ser Thr Gin Asp Asp Cys Asp Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His 1 5 10 15 Met Val Gly Pro str. 54 PCT /US02/3267 00185 B 200DOS: 4544/18 Leu Gin Gly T{cf <2 10> 107 <2 11> 20 <21 2> PRT <213> Veštacka sekvenca <220> A-801 8 (PCT).ST25.txt <223> Polipeptid sposoban da se vezuje za Ang-2 <400> 107 Val Leu Gl y Gly Gln G l y Cys G l n Trp Asp Pro Trp Thr Cys Ser His l 5 10 15 Leu G l u Asp Gly 20 <210> 108 <211> 20 <212> PRT <213> Veštacka sekvenca <220> <223> Polipeptid sposoban da se vezuje za Ang-2 <400> 108 Thr Thr lie Gly Ser Met Cys Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Ala His 1 5 10 15 Met Gin Gly Gly 20 <2 10> 109 <2 11 > 20 <2 1 2> PRT <213> Veštacka sekvenca <220> <223> Polipeptid sposoban da se vezuje za Ang-2 str. 5 6 PCTJUS02/3267 00185 B 201DOS: 4544/18 PCT/US0213267 A-801 8 (PCT).ST25.txt <220> <223> Polipeptid sposoban da se vezuje za Ang-2 <400> 112 Val Val Gin Val Gly Met Cys Gin Trp Asp Pro Trp Thr Cys Lys His 1 5 10 15 Met Arg Leu Gin 20 <210> 11 3 <211> 20 <212> ffif <213> Veštacka sekvenca <220> <223> Polipeptid sposoban da se vezuje za Ang-2 <400> 11 3 Ala Val Gly Ser Gin Thr Cys Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Ala His 1 5 10 15 Leu Val Glu Val 20 <2 10> 114 <211> 20 <212> PRT <213> Veštacka sekvenca <220> <223> Polipeptid sposoban da se vezuje za Ang-2 <400> 114 Gin Gly Met Lys Met Phe Cys Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Ala His 1 5 10 15 lie Val Tyr Arg 20 <210> 11 5 <21 1 > 20 <212> PRT str. 58 00185 B 202DOS: 4544/18 <211> 20 <212> PRT <213> Veštacka sekvenca <220> A-801 8 (PCT) .ST25.txt <223> Polipeptid sposoban da se vezuje za Ang-2 <400> 118 Gly Thr Ser Pro Ser Phe Cys Gin Trp Asp Pro Trp Thr Cys Ser His 1 5 10 15 Met Val Gin Gly 20 <210> 119 <2 11> 22 <212> FRT <213> Veštacka sekvenca <220> <223> Polipeptid sposoban da se vezuje za Ang-2 <400> 119 Gln Asn Tyr Lys Pr o Leu Asp Glu Leu Asp Ala Thr Leu Tyr G l u His l 5 10 15 Phe Ile Phe His Tyr Thr 20 <210> 120 <211> 22 <212> PRT <213> Veštacka sekvenca <220> <223> Polipeptid sposoban da se vezuje za Ang-2 <400> 120 Leu Asn Phe Thr Pro Leu Asp Glu Leu Glu Gin Thr Leu Tyr Glu Gin 1 5 10 15 Trp Thr Leu Gin Gin Ser str. 60 PCT/US02/3267 00185 B 203Dos: 4544/18 Gin Thr Phe Gin Glu Arg 20 <210> 124 <211> 22 <212> PRT <213> Veštacka sekvenca <220> A-801 8 (PCT) .ST25.txt <223> Polipeptid sposoban da se vezuje za Ang-2 <400> 124 Thr Asn Phe Met Pro Met Asp Asp Leu Glu Gin Arg Leu Tyr Glu Gin 1 5 10 15 Phe lie Leu Gin Gin Gly 20 <2 1G> 125 <2 11> 22 <212> PRT <213> Veštacka sekvenca <220> <223> Polipeptid sposoban da se vezuje za Ang-2 <400> 1 25 Ser Lys Phe Lys Pro Leu Asp Glu Leu Glu Gin Thr Leu Tyr Glu Gin 1 5 10 15 Trp Thr Leu Gin His Ala 20 <210> 12 6 <211> 22 <212> PRT <213> Veštacka sekvenca <220> <223> Polipeptid sposoban da se vezuje za Ang- 2 str . 62 PCT/US02/3267 00185 B 204DOS: 4544/18 A-801 B (PCT).ST25.txt <220> <223> Polipeptid sposoban da se vezuje za Ang-2 <400> 129 Gin Glu Tyr Glu Pro Leu Asp Glu Leu Asp Glu Thr Leu Tyr Asn Gin 1 5 10 15 Trp Met Phe His Gin Arg 20 <210> 130 <2 11 > 22 <2 12> PRT <213> Veštacka sekvenca <220> <223> Polipeptid sposoban da se vezuje za Ang-2 <400> 130 Ser Asn Phe Met Pro Leu Asp Giu Leu Giu Gin Thr Leu Tyr Giu Gin 1 5 10 15 Phe Met Leu Gin His Gin 20 <210> 131 <211 > 22 <212> PRT <213> Veštacka sekvenca <223> Polipeptid sposoban da se vezuje za Ang-2 <400> 131 Gin Lys Tyr Gin Pro Leu Asp Giu Leu Asp Lys Thr Leu Tyr Asp Gin 1 5 10 15 Phe Met Leu Gin Gin Giy 20 <2 10> 132 <211> 22 <212> PRT str . 64 PCT/US02/3267 00185 B 205DOS: 4544/18 <21 1> 22 <212> PRT <213> Veštacka sekvenca <220> A-801 8 CPCT).ST25.txt <223> Polipeptid sposoban da se vezuje za Ang-2 <400> 135 Gin Thr Phe Gin Pro Leu Asp Asp Leu Glu Glu Tyr Leu Tyr Glu Gin 1 5 10 15 Trp lie Arg Arg Tyr His 20 <210> 136 <211 > 22 <212> PRT <213> Veštacka sekvenca <220> <223> Polipeptid sposoban da se vezuje za Ang-2 <400> 136 Glu Asp Tyr Met Pro Leu Asp Ala Leu Asp Ala Gin Leu Tyr Glu Gin 1 5 10 15 Phe lie Leu Leu His Gly 20 <210> 137 <211 > 22 <212> ffif <213> Veštacka sekvenca <220> <223> Polipeptid sposoban da se vezuje za Ang-2 <400> 137 His Thr Phe Gin Pro Leu Asp Glu Leu Glu Glu Thr Leu Tyr Tyr Gin 1 5 10 15 Trp Leu Tyr Asp Gin Leu str. 66 PCT/US02/3267 00185 B 206DOS: 4544/18 Trp Thr Leu Gln Gln Arg 20 <210> 141 <211> 22 <212> PRT <213> Veštacka sekvenca <220> A-801 9 (PCT).ST25.txt <223> Polipeptid sposoban da se vezuje za Ang-2 <400> 141 Thr Lys Phe Gin Pro Leu Asp Glu Leu Asp Gin Thr Leu Tyr Glu Gin 1 5 10 15 Trp Thr Leu Gin Gin Arg 20 <2 10> 142 <2 11 > 22 <212> PRT <213> Veštacka sekvenca <220> <223> Polipeptid sposoban da se vezuje za Ang-2 <400> 142 Thr Asn Phe Gin Pro Leu Asp Glu Leu Asp Gin Thr Leu Tyr Glu Gin 1 5 10 15 Trp Thr Leu Gin Gin Arg 20 <2 10> 143 <2 11> 20 <212> PRT <213> Veštacka sekvenca <220> <223> Polipeptid sposoban da se vezuje za Ang -2 str. 68 PCT/US0213267 00185 B 207DOS: 4544/18 A-801 8 CPCT).ST25.txt <220> <223> Polipeptid sposoban da se vezuje za Ang-2 <400> 146 Ser Gly Gin Leu Arg Pro Cys Glu Glu lie Phe Gly Cys Gly Thr Gin 1 5 10 15 Asn Leu Ala Leu 20 <210> 147 <211 > 20 <212> PRT <213> Veštacka sekvenca <220> <223> Polipeptid sposoban da se vezuje za Ang-2 <400> 147 Phe Gly Asp Lys Arg Pro Leu Glu Cys Met Phe Gly Gly Pro Ile Gln l 5 10 15 Leu Cys Pro Arg 20 <210> 148 <211> 20 <212> PRT <213> Veštacka sekvenca <220> <223> Polipeptid sposoban da se vezuje za Ang-2 <400> 148 Gly Gln Asp Leu Arg Pro Cys Glu Asp Met Phe Gly Cys Gly Thr Lys l 5 10 15 Asp Trp Tyr Gly 20 <2 10> 14 9 <2 11 > 20 <2 12> PRT str . 70 PCT/US02/3267 00185 B 208DOS: 4544118 <211> 20 <212> PRT <213> Veštacka sekvenca <220> A-801 8 (PCT).ST25.txt <223> Polipeptid sposoban da se vezuje za Ang-2 <400> 152 Ala Gin Asp Tyr Cys Glu Gly Met Glu Asp Pro Phe Thr Phe Gly Cys 1 5 10 15 Glu Met Gin 'los <210> 153 <2 11> 20 <2 12> PRT <213> Veštacka sekvenca <220> <223> Polipeptid sposoban da se vezuje za Ang-2 <400> 153 Leu Leu Asp Tyr Cys Glu Gly Val Gin Asp Pro Phe Thr Phe Gly Cys 5 10 15 Glu Asn Leu Asp 20 <2 10> 154 <2 11> 20 <212> PRT <213> Veštacka sekvenca <220> <223> Polipeptid sposoban da se vezuje za Ang-2 <400> 154 His Gin Glu Tyr Cys Glu Gly Met Glu Asp Pro Phe Thr Phe Gly Cys 1 5 10 15 Glu Tyr Gin Gly str. PCT/US02/32657 00185 B 209DOS: 4544/18 Glu Lys Gin ~~ <210> 158 <211> 20 <212> PRT <213> Veštacka sekvenca <220> A-801 8 CPCT) .ST25.txt <223> Polipeptid sposoban da se vezuje za Ang-2 <220> <221> raznovrsni oblici <222> CD .. CD PCT /US02/3265 7 <223> Xaa je odsutan ili je neutral an hi drofobni , neutralan polarni ili bazni amino kiselinski ostatak <220> <221> raznovrsni oblici <222> C2 , 4 , 14) .. (19) <223> Xaa je neutralan hidrofobni ili neutralan polarni amino kiselinski ostatak . <220> <221> raznovrsni oblici <222> C3 , 6) .. (17) <223> Xaa je kiseli amino kiselinski ostatak. <220> <221> raznovrsni oblici <222> ( 8) \" ( 8) <223> Xaa je neutralan hidrofobni amino kiselinski ostatak. <220> <221> raznovrsni oblici <222> (9) . . (9) str . 74 00185 B 210DOS: 4544/18 PCT/US02/3267 A-801 s (PCT).ST25 .txt accaacatcc aggaagaatg cgaatgggac ccgtggacct gcgaccacat gccgggtaaa 60 <2 10> 161 <2 11> 60 <212> CN< <213> Veštacka sekvenca <220> <223> DNK kodirajuci peptid sposoban da se vezuje za Ang- 2 <400> 161 tggtacgaac aggacgcttg cgaatgggac ccgtggacct gcgaacacat ggctgaagtt 60 <2 10> 162 <2 11> 60 <212> DNK <213> Veštacka sekvenca <220> <223> DNK kodirajuci peptid sposoban da se vezuje za Ang-2 <400> 162 aaccgtctgc aggaagtttg cgaatgggac ccgtggacct gcgaacacat ggaaaacgtt 60 <210> 163 <211> 60 <212> DNK <213> Veštacka sekvenca <220> <223> DNK kodirajuci peptid sposoban da se vezuje za Ang-2 • <400> 163 gctgctaccc aggaagaatg cgaatgggac ccgtggacct gcgaacacat gccgcgttcc 60 <210> 164 <211> 60 <212> DNK <213> Veštacka sekvenca <220> str. 76 00185 B 211Dos: 4544/18 PCT/US02/3267 A-801 8 (PCT).ST25.txt <220> <223> DNK kodirajuci peptid sposoban da se vezuje za Ang-2 <400> 168 ggtcactccc aggaagaatg cggttgggac ccgtggacct gcgaacacat gggtacgtcc 60 <210> 169 <211> 60 <212> DNK <213> Veštacka sekvenca <220> <223> DNK kodirajuci peptid sposoban da se vezuje za Ang-2 <400> 169 cagcactggc aggaagaatg cgaatgggac ccgtggacct gcgaccacat gccgtccaaa 60 <210> 170 <211> 60 <212> DNK <213> Veštacka sekvenca <220> <223> DNK kodirajuci peptid sposoban da se vezuje za Ang-2 <400> 170 aacgttcgtc aggaaaaatg cgaatgggac ccgtggacct gcgaacacat gccggttcgt 60 <210> 171 <211> 60 <212> DNK <213> Veštacka sekvenca <220> <223> DNK kodirajuci peptid sposoban da se vezuje za Ang-2 <400> 171 aaatccggtc aggttgaatg caactgggac ccgtggacct gcgaacacat gccgcgtaac 60 <210> 172 <2 11 > 60 str . 78 00185 B 212DOS: 4544/18 <210> 176 <211> 60 <212> DNK <213> Veštacka sekvenca <220> A-801 6 (PCT) .ST25 .txt <223> DNK kodirajuci peptid sposoban da se vezuje za Ang- 2 <400> 176 PCT /US02/3267 cacggtcaga acatggaatg cgaatgggac ccgtggacct gcgaacacat gttccgttac 60 <210> 177 <211> 60 <212> DNK <213> Veštacka sekvenca <220> <223> DNK kod irajuci peptid sposoban da se vezuje za Ang-2 <400> 177 ccgcgtctgc aggaagaatg cgtttgggac ccgtggacct gcgaacacat gccgctgcgt 60 <210> 178 <211> 60 <212> DNK <213> Veštacka sekvenca <220> <223> DNK kodirajuci peptid sposoban da se vezuje za Ang-2 <400> 17 8 cgtaccaccc aggaaaaatg cgaatgggac ccgtggacct gcgaacacat ggaatcccag 60 <210> 179 <211> 60 <212> DNK <213> Veštacka sekvenca <220> <223> DNK kodirajuci peptid sposoban da se vezuje za Ang-2 str. 80 00185 B 213DOS: 4544/18 PCT/US02/3267 A-801 8 (PCT).ST25.txt <220> <223> DNK kodirajuci peptid sposoban da se vezuje za Ang-2 <400> 183 ccgatgaacc aggttgaatg cgactgggac ccgtggacct gcgaacacat gccgcgttcc 60 <210> 184 <211> 60 <212> DNK <213> Veštacka sekvenca <220> <223> DNK kodirajuci peptid sposoban da se vezuje za Ang-2 <400> 184 ttcggttggt ctcacggttg cgaatgggat ccgtggactt gcgaacacat gggttctacc 60 <210> 185 <211> 60 <212> DNK <213> Veštacka sekvenca <220> <223> DNK kodirajuci peptid sposoban da se vezuje za Ang-2 <400> 185 aaatccaccc aggacgactg cgactgggac ccgtggacct gcgaacacat ggttggtccg 60 <210> 186 <211> 60 <212> DNK <213> Veštacka sekvenca <220> <223> DNK kodirajuci peptid sposoban da se vezuje za Ang-2 <400> 186 ggtccgcgta tctccacctg ccagtgggac ccgtggacct gcgaacacat ggaccagctg 60 <2 10> 187 <211> 60 <2 12> DNK str. 82 00185 B 214DOS: 4544/18 <211> 60 <212> DNK <213> Veštacka sekvenca <220> A-801 B (PCT).ST25.txt <223> DNK kodirajuci peptid sposoban da se vezuje za Ang-2 <400> 1 91 PCT/US02/3267 accaaaggta aatccgtttg ccagtgggac ccgtggacct gctcccacat geagtceggt 60 <210> 192 <211> 60 <212> DNK <213> Veštacka sekvenca <220> <223> DNK kodirajuci peptid sposoban da se vezuje za Ang-2 <400> 192 accaccatcg gtt ccatgtg ccagtgggac ccgtggacct gcgctcacat gcagggtggt 60 <2 10> 193 <2 11> 60 <212> DNK <213> Veštacka sekvenca <220> <223> DNK kod irajuci peptid sposoban da se vezuje za Ang-2 <400> 193 tgggttaacg aagttgt ttg cgaatgggac ccgtggacct gcaaccactg ggacaccccg 60 <210> 194 <211> 60 <212> DNK <213> Veštacka sekvenca <220> <223> DNK kodirajuci peptid sposoban da se vezuje za Ang-2 <400> 194 str. 84 00185 B 215Dos: 4544/18 PCT/US02/3267 A-801 6 (PCT).ST25.txt <223> DNK kodirajuci peptid sposoban da se vezuje za Ang-2 <400> 198 acctcccagc gtgttggttg cgaatgggac ccgtggacct gccagcacct gacctacacc 60 <210> 199 <211> 60 <212> DNK <213> Veštacka sekvenca <220> <223> DNK kodirajuci peptid sposoban da se vezuje za Ang-2 <400> 199 cagtggtcct ggccgccgtg cgaatgggac ccgtggacct gccagaccgt ttggccgtcc 60 <210> 200 <211> 60 <212> DNK <213> Veštacka sekvenca <220> <223> DNK kodirajuci peptid sposoban da se vezuje za Ang-2 <400> 200 ggtacctccc cgtccttctg ccagtgggac ccgtggacct gctcccacat ggttcagggt 60 <210> 201 <211> 42 <212> DNK <213> Veštacka sekvenca <223> DNK kodirajuci peptid sposoban da se vezuje za Ang-2 <400> 201 caggaagaat gcgaatggga cccatggact tgegaacaca tg <210> 202 <211> 66 <212> DNK <213> Veštacka sekvenca str. 86 42 00185 B 216DOS: 4544'18 7 PCf/US02/3265 A-80 l 8 (PCT).ST25.txt gttaaattca aaccgctgga cgctctggaa cagaccctgt acgaacactg gatgttccag 60 caggct 66 <2 10> 206 <21 l> 66 <212> [N( <213> Veštacka sekvenca <220> <223> DNK kodirajuci peptid sposoban da se vezuje za Ang-2 <400> 206 gttaaataca aaccgctgga cgaactggac gaaatcctgt acgaacagca gaccttccag 60 gaacgt 66 <210> 207 <211> 66 <212> DNK <213> Veštacka sekvenca <220> <223> DNK kodirajuci peptid sposoban da se vezuje za Ang-2 <400> 207 accaacttca tgccgatgga cgacctggaa cagegtctgt acgaacagtt catcctgcag 60 cagggt 66 <210> 208 <211> 66 <212> DNK <213> Veštacka sekvenca <220> <223> DNK kodirajuci peptid sposoban da se vezuje za Ang-2 <400> 208 tccaaattca aaccgctgga cgaactggaa cagaccctgt acgaacagtg gaccctgcag 60 cacget 66 <210> 209 <2 11> 66 str . 8E 00185 B 217Dos: 4544/18 7 A-80 1 s (PCT). ST25. txt <223> DNK KODIRAJUCI peptid sposoban da se vezuje za Ang-2 <400> 2 1 2 PCT/US02/3265 aggaat acga accgctggac gaactggacg aaaccctgta caaccagtgg a t gttccacc 60 agegt 65 <210> 213 <211> 66 <212> D NK <213> Veštacka sekvenca <220> <223> DNK kodirajuci peptid sposoban da se vezuje za Ang-2 <400> 2 1 3 t ccaacttca tgccgctgga cgaactggaa cagaccct gt acgaacagtt cat getgeag 60 caccag 66 <210> 214 <211> 66 <212> DNK <2 13> Veštacka sekvenca <220> <223> DNK kodirajuci peptid sposoban da se vezuje za Ang-2 < 400> 2 1 4 cagaaatacc agccgctgga cgaactggac aaaaccctgt acgatcagtt catge t geag 60 cagggt 66 <210> 215 <211> 66 <212> D NK <213> Veštacka sekvenca <220> <223> DNK kodirajuci peptid sposoban da se vezuje za Ang-2 <400> 215 cagaaattcc agccgct gga cgaactggaa gaaaccctgt acaaacagtg gaccctgcag 60 cagegt 66 str . 90 00185 B 218DOS: 4544/18 A-801 8 (PCT).ST25.txt <220> <223> DNK kodirajuci peptid sposoban da se vezuje za Ang-2 <400> 21 9 PCT/US02/3267 gaagactaca tgccgctgga cgctctggac gctcagctgt acgaacagtt catcctgctg 60 cacggt 66 <210> 220 <211> 66 <212> DNK <213> Veštacka sekvenca <220> <223> DNK kodirajuci peptid sposoban da se vezuje za Ang-2 <400> 220 cacaccttcc agccgctgga cgaactggaa gaaaccctgt actaccagtg gctgt acgac 60 cagctg 66 <210> 221 <211> 66 <212> DNK <213> Veštacka sekvenca <220> <223> DNK KODIRAJUCI peptid sposoban da se vezuje za Ang-2 <400> 221 tacaaattca acccgatgga cgaactggaa cagaccctgt acgaagaatt cctgttccag 60 cacgct 66 <210> 222 <211> 66 <212> DNK <213> Veštacka sekvenca <220> <223> DNK kodirajuci peptid sposoban da se vezuje za Ang- 2 <400> 222 str . 92 00185 B 219DOS: 4544/18 A-801 8 (PCT).ST25.tXt <212> DNK <213> Veštacka sekvenca <220> <223> DNK KODIRAJUCI peptid sposoban da se vezuje za Ang-2 <400> 226 PCf/US02/3267 aaattcaacc cgctggacga gctggaagag actctgtacg aacagtttac ttttcaacag 60 <210> 227 <211> 60 <212> DNK <213> Veštacka sekvenca <220> <223> DNK kodirajuci peptid sposoban da se vezuje za Ang-2 <400> 227 gctggtggta tgcgtccgta cgacggtatg ctgggttggc cgaactacga cgttcaggct 60 <210> 228 <211> 60 <212> DNK <213> Veštacka sekvenca <220> <223> DNK kodirajuci peptid sposoban da se vezuje za Ang-2 <400> 228 cagacttggg acgatccgtg catgcacatt ctgggtccgg ttacttggcg tcgttgcatc 60 <2 10> 229 <211> 60 <212> DNK <213> Veštacka sekvenca <220> <223> DNK kodirajuc i peptid sposoban da se vezuje za Ang-2 <400> 229 gctccgggtc agcgtccgta cgacggtatg ctgggttggc cgacctacca gcgtatcgtt 60 str . 94 00185 B 220DOS: 4544/18 PCT!US02/3267 A- 801 8 (PCT ) .ST25.txt <400> 233 ggtttcgaat actgcgacgg tatggaagac ccgttcacct tcggttgcga caaacagacc 60 <210> 234 <211> 60 <212> DNK <213> Veštacka sekvenca <220> <223> DNK kod irajuci peptid sposoban da se vezuje za Ang-2 <400> 234 aaactggaat actgcgacgg tatggaagac ccgttcaccc agggttgcga caaccagtcc 60 <210> 235 <211> 60 <212> DNK <213> Veštacka sekvenca <220> <223> DNK kodirajuci peptid sposoban da se vezuje za Ang-2 <400> 235 ctgcaggaat ggtgcgaagg tgttgaagac ccgttcacct tcggttgcga aaaacagcgt 60 <210> 236 <211> 60 <212> DNK <213> Veštacka sekvenca <220> <223> DNK kodirajuci peptid sposoban da se vezuje za Ang-2 <400> 236 gctcaggact actgcgaagg tatggaagac ccgttcacct tcggttgcga aatgcagaaa 60 <210> 237 <211> 60 <212> DNK <213> Veštacka sekvenca str. 96 00185 B 221DOS: 4544/18 PCTIUS02/3267 A-801 B (PCT).ST25.txt <213> Veštacka sekvenca <220> <223> DNK kodirajuci peptid sposoban da se vezuje za Ang-2 <400> 241 ctgcaggact actgcgaagg tgttgaagac ccgttcacct tcggttgcga aaaacagcgt 60 <210> 242 <211> 54 <212> DNK <213> Veštacka sekvenca <220> <223> DNK kodirajuci peptid sposoban da se vezuje za Ang-2 <400> 242 ttcgactact gcgaaggtgt tgaagacccg ttcactttcg gctgtgataa ecac 54 <210> 243 <211> 250 <212> PRT <213> Veštacka sekvenca <220> <223> DNK kodirajuci peptid sposoban da se vezuje za Ang- 2 <400> 243 Met Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Giu Leu Leu 1 5 10 15 Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 20 25 30 Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser ~ 40 ~ His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 50 55 60 Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr 65 70 75 80 Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn str. 98 00185 B 222DOS: 4544/18 A-801 8 (PCT ) .ST25.txt <220> <223> oligonukleotid <400> 245 ggtggtgcgg ccgcactcga gactgttgaa agttgtttag ea <210> 246 <211> 29 <212> DNK <213> Veštacka sekvenca <220> <223> oligonukl eotid <400> 246 caaacgaatg gatcctcatt aaagccaga <210> 247 <211> 43 <212> DNK <213> Veštacka sekvenca <220> <223> oli gonukl eotid <400> 247 aacacaaaag tgcacagggt ggaggtggtg gtgcggccgc act <210> 248 <211> 91 <212> PRT <213> Veštacka sekvenca <220> <223> oligonukleotid <400> 248 Cys Ala Cys Ala Gly Thr Gly Cys Ala Cys Ala Gly Gly Gly Thr Asn 1 5 10 15 Asn Lys Asn Asn Lys Asn Asn Lys Asn Asn Lys Asn Asn Lys Asn Asn str. 1 OO PCT/US02/3267 42 29 43 00185 B 223DOS: 4544/18 A-801 s (PCT) .ST25 .txt <220> <223> oligonukleotid <400> 250 Cys Ala Cys Ala Gly Thr Gly Cys Ala Cys Ala Gly Gly Gly Thr Asn 1 5 10 15 Asn Lys Ala Ala Lys Thr Thr Lys Ala Ala Lys Cys Cys Lys Cys Thr 20 25 30 Lys Gly Ala Lys Gly Ala Lys Cys Thr Lys Gly Ala Lys Gly Ala Lys 35 40 45 Ala Cys Lys Cys Thr Lys Thr Ala Lys Gly Ala Lys Cys Ala Lys Thr w ~ w Thr Lys Ala Cys Lys Thr Thr Lys Cys Ala Lys Cys Ala Lys Asn Asn 65 70 75 80 Lys Cys Ala Thr Thr Cys Thr Cys Thr Cys Gly Ala Gly Ala Thr 85 90 95 <2 10> 251 <211> 91 <2 12> PRT <213> Veštacka sekvenca <220> <223> oligonukl eotid <400> 251 Cys Ala Cys Ala Gly Thr Gly Cys Ala Cys Ala Gly Gly Gly Thr Asn 1 5 10 15 Asn Lys Asn Asn Lys Asn Asn Lys Cys A la Lys Gly Ala Lys Gly Ala 20 25 30 Lys Thr Gly Cys Gly Ala Lys Thr Gly Lys Gly Ala Lys Cys Cys Lys 35 40 45 Thr Gly Lys Ala Cys Lys Thr Gly Cys Gly Ala Lys Cys Ala Lys Ala w ~ w Thr Lys Asn Asn Lys Asn Asn Lys Asn Asn Lys Cys Ala Thr Thr Cys 65 70 75 80 Thr Cys Thr Cys Gly Ala Gly Ala Thr Cys Ala str. I 02 PCT/US02/3267 00185 B 224DOS: 4544/18 35 A-801 8 (PCT).ST25.txt 40 45 Ala Cys Lys Cys Thr Lys Thr Ala Lys Gly Ala Lys Cys Ala Lys Thr 50 55 60 Thr Lys Ala Cys Lys Thr-Thr Lys Cys Ala Lys Cys Ala Lys Asn Asn 65 70 75 80 Lys Cys Ala Thr Thr Cys Thr Cys Thr Cys Gly Ala Gly Ala Thr 85 90 95 <2 10> 254 <2 11 > 15 <212> 0\\JK <213> Veštacka sekvenca <220> <223> oligonukleotid <400> 254 cacagtgcac agggt <2 10> 255 <211> 16 <212> DNK <213> Veštacka sekvenca <220> <223> oligonukleotid <400> 255 tgatctcgag agaatg <210> 256 <211> 21 <212> DNK <213> Veštacka sekvenca <220> <223> oligonukleotid <400> 256 gttagctcac tcattaggca e str . 104 PCT/US02/3267 15 16 21 00185 B 225Dos: 4544/18 <2 10> 260 <21 1> 31 <2 12> PRT 20 <213> Veštacka sekvenca <220> A-801 s (PCT).ST25.txt 25 30 <223> Peptidna tela sposobna da se vezuju za Ang-2 <220> <221> raznovrsni oblici <222> (2) . . (2) <223> X aa = F e <400> 260 Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Thr Asn lie Gin Glu Glu Cys 1 5 10 15 Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Asp His Met Pro Gly Lys Leu Glu 20 25 30 <210> 261 <211 > 31 <212> PRT <213> Veštacka sekvenca <220> <223> Peptidna tela sposobna da se vezuju za Ang-2 <220> <221> raznovrsni oblici <222> ( 2 ) .. ( 2 ) <223> Xaa • Fc <400> 261 Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Trp Tyr Glu Gin Asp Ala Cys 1 5 10 15 Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His Met Ala Glu Val Leu Glu str. l 06 PCT/US02/3267 00185 B 226DOS: 4544/18 20 A- 801 8 (PCT) . ST25.txt 25 30 <210> 264 <211> 31 <212> PRT <2!3> Veštacka sekvenca <220> <223> Peptidna tela sposobna da se vezuju za Ang-2 <220> <221> raznovrsni oblici <222> C2) . . (2) <223> Xaa = Fc <400> 264 Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Leu Arg His Gin Glu Gly Cys 1 5 10 15 Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His Met Phe Asp Trp Leu Glu 20 25 30 <210> 265 <21 I> 3 I <2 I2> PRT <213> Veštacka sekvenca <220> <223> Peptidna tela sposobna da se vezuju za Ang-2 <220> <221> raznovrsni oblici <222> ( 2 ) o o ( 2 ) <223> Xaa = Fc <400> 265 Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Val Pro Arg Gin Lys Asp Cys 1 5 10 15 Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His Met Tyr Val Gly Leu Glu str. l 08 PCT/US02/3267 00185 B 227DOS: 4544/18 <2 10> 268 <2 11> 31 <212> PRT 20 <213> Veš tacka sekvenca <220> A-801 8 (PCT) .ST25.txt 25 30 <223> Peptidna tela sposobna da se vezuju za Ang-2 <220> <221> raznovrsni oblici <222> C2) .. C2) <223> Xaa = Fc <400> 268 Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Thr Trp Pro Gin Asp Lys Cys 1 5 10 15 Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His Met Gly Ser Thr Leu Glu 20 25 30 <2 10> 269 <2 11> 31 <212> PRT <213> Veštacka sekvenca <220> <223> Peptidna tela sposobna da se vezuju za Ang-2 <220> <221> raznovrsni oblici <222> ( 2 ) .. ( 2 ) <223> Xaa = Fc <400> 269 Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Gly His Ser Gin Glu Glu Cys 1 5 10 15 Gly Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His Met Gly Thr Ser Leu Glu str. 11 O PCT/US02/3267 00185 B 228DOS: 4544/18 <210> 272 <211 > 31 <212> PRT 20 <213> Veštacka sekvenca <220> A-801 B CPCT) .ST25.txt 25 30 <223> Peptidna tela sposobna da se vezuju za Ang-2 <220> <221> raznovrsni oblici <222> (2) .. (2) <223> Xaa = Fc <400> 272 Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Lys Ser Gly Gin Val Glu Cys 1 5 10 15 Asn Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His Met Pro Arg Asn Leu Glu 20 25 30 <210> 273 <211 > 31 <212> PRT <213> Veštacka sekvenca <220> <223> Peptidna tela sposobna da se vezuju za Ang-2 <220> <221> raznovrsni oblici <222> (2) .. (2) <223> Xaa = Fc <400> 273 Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Val Lys Thr Gin Glu His Cys 1 5 10 15 Asp Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His Met Arg Glu Trp Leu Glu str. l 12 PCT/US02/3267 00185 B 229Dos: 4544/18 <21 0> 276 <2 11 > 31 <212> FRf 20 <213> Veštacka sekvenca <220> A-801 8 (PCT).ST25.txt 25 30 <223> Peptidna tela sposobna da se vezuju za Ang-2 <220> <221> raznovrsni oblici <222> ( 2 ) .. ( 2 ) <223> Xaa = Fc <400> 276 Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Arg Ala Pro Gin Glu Asp Cys 1 5 10 15 Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Ala His Met Asp lie Lys Leu Glu 20 25 30 <2 10> 277 <21 1> 31 <212> PRT <213> Veštacka sekvenca <220> <223> Peptidna tela sposobna da se vezuju za Ang-2 <220> <221> raznovrsni oblici <222> C2) .. C2) <223> Xaa = Fc <400> 277 Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin His Gly Gin Asn Met Glu Cys 1 5 10 15 Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His Met Phe Arg Tyr Leu Glu str. I I 4 PCT/US02/3267 00185 B 230DOS: 4544/18 <210> 280 <211 > 31 <2 12> PRT 20 <213> Veštacka sekvenca <220> A-801 B (PCT).ST25.tXt 25 30 <223> Peptidna tela sposobna da se vezuju za Ang-2 <220> <221> raznovrsni oblici <222> e 2 ) .. ( 2 ) <223> Xaa = Fc <400> 280 Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Gin Thr Ser Gin Glu Asp Cys l 5 10 15 Val Trp Asp Pro Trp Thr Cys Asp His Met Val Ser Ser Leu Glu 20 25 30 <2 10> 281 <2 11 > 31 <2 12> PRT <213> Veštacka sekvenca <220> <223> Peptidna tela sposobna da se vezuju za Ang-2 <220> <221> raznovrsni oblici <222> (2) .. (2) <223> Xaa = Fc <400> 281 Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Gin Val lie Gly Arg Pro Cys 1 5 10 15 Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His Leu Glu Gly Leu Leu Glu str. 11 6 PCT/US02/32657 00185 B 231DOS: 4544/18 <210> 284 <211 > 31 <212> PRT 20 <213> Veštacka sekvenca <220> A-801 B (PCT).ST25.txt 25 30 <223> Peptidna tela sposobna da se vezuju za Ang-2 <220> <221> raznovrsni oblici <222> e 2 ) .. ( 2 ) <223> Xaa = Fc <400> 284 Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Pro Met Asn Gin Val Glu Cys 1 5 10 15 Asp Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His Met Pro Arg Ser Leu Glu 20 25 30 <210> 285 <211 > 31 <212> PRT <213> Veštacka sekvenca <220> <223> Peptidna tela sposobna da se vezuju za Ang-2 <220> <221> raznovrsni oblici <222> ( 2 ) .. ( 2 ) <223> Xaa = Fc <400> 285 Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Phe Gly Trp Ser His Gly Cys 1 5 10 15 Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His Met Gly Ser Thr Leu Glu str. 118 PCT/US02/3267 00185 B 232DOS: 4544/18 <210> 288 <211 > 31 <212> PRT 20 <213> Veštacka sekvenca <220> A-801 B (PCQ .ST25 .tXt 25 30 <223> Peptidna tela sposobna da se vezuju za Ang-2 <220> <221> raznovrsni oblici <222> (2) .. C2) <223> Xaa = Fc <400> 288 Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Ser Thr lie Gly Asp Met Cys 1 5 10 15 Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Ala His Met Gin Val Asp Leu Glu 20 25 30 <210> 289 <2 11> 31 <2 12> PRT <213> Veštacka sekvenca <220> <223> Peptidna tela sposobna da se vezuju za Ang-2 <220> <221> raznovrsni oblici <222> ( 2 ) . . ( 2 ) <223> Xaa = Fc <400> 289 Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Val Leu Gly Gly Gin Gly Cys 1 5 10 15 Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Arg Leu Leu Gin Gly Trp Leu Glu str. 120 PCT/US02/3267 00185 B 233DOS: 4544/18 7 <2 10> 292 <2 11 > 31 <2 12> PRT 20 <213> Veštacka sekvenca <220> A-801 8 (PCT) .ST25.txt 25 30 <223> Peptidna tela sposobna da se vezuju za Ang-2 <220> <221> raznovrsni oblici <222> (2) .. (2) <223> Xaa = Fc <400> 292 Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Thr Lys Gly Lys Ser Val Cys 1 5 10 15 Gin Trp Asp Pro Trp Thr Cys Ser His Met Gin Ser Gly Leu Glu 20 25 30 <2 10> 293 <211 > 31 <212> PRT <213> Veštacka sekvenca <220> <223> Peptidna telasposobna da se vezuju za Ang-2 <220> <221> raznovrsni oblici <222> ( 2 ) .. ( 2 ) <223> Xaa = Fc <400> 293 Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Thr Thr lie Gly Ser Met Cys 1 5 10 15 Gin Trp Asp Pro Trp Thr Cys Ala His Met Gin Gly Gly Leu Glu str. 122 PCT!US02/3265 00185 B 234DOS: 4544/18 <210> 296 <211 > 31 <212> PRT 20 <213> Veštacka sekvenca <220> A-801 8 (PCT).ST25 .txt 25 30 <223> Peptidna tela sposobna da se vezuju za Ang-2 <220> <221> raznovrsni oblici <222> e 2) .. ( 2) <223> Xaa = Fc <400> 296 Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Ala Val Gly Ser Gin Thr Cys 1 5 10 15 Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Ala His Leu Val Glu Val Leu Glu <210> 297 <211 > 31 <212> PRT 20 25 30 <213> Veštacka sekvenca <220> <223> Peptidna tela sposobna da se vezuju za Ang-2 <220> <221> raznovrsni oblici <222> (2) .. (2) <223> Xaa = Fc <400> 297 Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Gin Gly Met Lys Met Phe Cys 1 5 10 15 Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Ala His lie Val Tyr Arg Leu Glu str. 124 PCT/US02/3267 00185 B 235DOS: 454411 8 <210> 300 <211 > 31 <212> FRf 20 <213> Veštacka sekvenca <220> A-80 l 6 (PCT).ST25.txt 25 30 <223> Peptidna tela sposobna da se vezuju za Ang-2 <220> <221> raznovrsn i oblici <222> ( 2 ) .. ( 2 ) <223> X aa = F e <400> 300 Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Gin Trp Ser Trp Pro Pro Cys 1 5 10 15 Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Gin Thr Val Trp Pro Ser Leu Glu <2 10> 30 l <2 11> 31 <212> FRf 20 25 30 <213> Veštacka sekvenca <220> <223> Peptidna tela sposobna da se vezuju za Ang-2 <220> <221> raznovrsni oblici <222> (2) . . (2) <223> Xaa = Fc <400> 301 Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Gly Thr Ser Pro Ser Phe Cys 1 5 10 15 Gin Trp Asp Pro Trp Thr Cys Ser His Met Val Gin Gly Leu Glu str. 126 PCT/US02/32657 00185 B 236DOS: 4544/ 18 <210> 304 <21 1> 31 <212> PRT 20 <213> Artificial sequence <220> A-8018 (PeT).ST25 .txt 25 30 <223> Peptibodies capable of binding to Ang-2 <220> <221> raznovrsni oblici <222> e 2 ) .. ( 2 ) <223> Xaa = Fc <400> 304 Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Asp Lys ile Leu Glu Glu eys 1 5 10 15 Gin Trp Asp Pro Trp Thr eys Gin Phe Phe Tyr Gly Ala Leu Glu 20 25 30 <2 10> 305 <21 1> 31 <212> PRT <213> Veštacka sekvenca <220> <223> Peptidna tela sposobna da se vezuju za Ang-2 <220> <221> raznovrsni oblici <222> ( 2) .. e 2 ) <223> Xaa = Fc <400> 305 Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Ala Thr Phe Ala Arg Gin eys 1 5 10 15 Gin Trp Asp Pro Trp Thr eys Ala Leu Gly Gly Asn Trp Leu Glu str. 128 PCT/US02/32657 00185 B 237DOS: 4544/18 <210> 308 <213> 31 <212> PRT 20 <213> Veštacka sekvenca <220> A-80 l 8 (PCT) .ST25.txt 25 30 <223> Peptidna tela sposobna da se vezuju za Ang-2 <220> <221> raznovrsni oblici <222> ( 2 ) .. ( 2 ) <223> Xaa = Fc <400> 308 Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Leu Trp Gin Leu Ala Val Cys 1 5 10 15 Gin Trp Asp Pro Gin Thr Cys Asp His Met Gly Ala Leu Leu Glu 20 25 30 <210> 309 <211 > 31 <212> PRT <213> Veštacka sekvenca <220> <223> Peptidna tela sposobna da se vezuju za Ang-2 <220> <221> raznovrsni oblici <222> (2) .. C2) <223> Xaa = Fc <400> 309 Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Thr Gin Leu Val Ser Leu Cys 1 5 10 15 Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Arg Leu Leu Asp Gly Trp Leu Glu str. 130 PCTJUS02/3267 00185 B 238DOS: 4544/18 <210> 312 <211> 31 <212> ffif 20 <213> Veštacka sekvenca <220> A-801 8 (PCT).ST25.txt 25 30 <223> Peptidna tela sposobna da se vezuju za Ang-2 <220> <221> raznovrsni oblici <222> (2)0 0(2) <223> X aa = F e <400> 312 Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Phe Gly Trp Ser His Gly Cys 1 5 10 15 Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Arg Leu Leu Gin Gly Trp Leu Glu 20 25 30 <210> 313 <211 > 31 <212> PRT <213> Veštacka sekvenca <220> <223> Peptidna tela sposobna da se vezuju za Ang-2 <220> <221> raznovrsni oblici <222> (2) o o (2) <223> Xaa = Fc <4 00 > 313 Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Trp Pro Gin Thr Glu Gly Cys 1 5 10 15 Gin Trp Asp Pro Trp Thr Cys Arg Leu Leu His Gly Trp Leu Glu str. 132 PCT/US02/3267 00185 B 239DOS: 4544/18 A-801 s (PCT). ST25 .txt 20 25 30 <210> 3 16 <2 11> 31 <212> PRT <213> Veštacka sekvenca <220> <223> Peptidna tela sposobna da se vezuju za Ang-2 <220> <221> raznovrsni oblici <222> (2) . . (2) <223> Xaa = Fc <400> 316 Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Asp Lys lie Leu Glu Glu Cys 1 5 10 15 Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Arg Leu Leu Gin Gly Trp Leu Glu <2 10> 3 17 <2 11> 31 <212> PRT 20 <213> Verštacka sekvenca <220> 25 <223> Peptidna tela sposobna da se vezuju za Ang-2 <220> <221> raznovrsni oblici <222> (2) .. (2) <223> Xaa = Fc <400> 3 17 30 Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Ala Ala Thr Gin Glu Glu Cys 1 5 10 15 Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Arg Leu Leu Gin Gly Trp Leu Glu str. 134 PCT/US02/3267 00185 B 240DOS: 4544/18 5 A-80 1 8 (PCT).5T2 5.txt lO 15 Leu Tyr Glu His Trp lie Leu Gin His Ser Leu Glu Gly Gly Gly Gly w ~ ~ Gly Xaa <210> 320 <211 > 34 <212> PRT <213> Veštacka sekvenca <220> <223> Peptidna tela sposobna da se vezuju za Ang-2 <220> <221> raznovrsni oblici <222> (3 4) . . (34) <223> X aa = F e <400> 320 Met Gly Ala Gin Gin Lys Tyr Gin Pro Leu Asp Glu Leu Asp Lys Thr 1 5 10 15 Leu Tyr Asp Gin Phe Met Leu Gin Gin Gly Leu Glu Gly Gly Gly Gly 20 25 30 Gly Xaa <2 10> 321 <2 1 l> 34 <2 12> PRT <213> Veštacka sekvenca <220> <223> Peptidna tela sposobna da se vezuju za Ang-2 <220> <22 1> r aznovrsni oblici <222> ( 34) .. ( 34) str . 136 PCT/US0213267 00185 B 241DOS: 4544/18 A- 801 8 (PCT) . ST25 .txt <223> Peptidna tela sposobna da se vezuju za Ang-2 <220> <221> raznovrsni oblici <222> (34) .. (34) <223 > Xaa = Fc <400> 323 Met Gly Ala Gin Gin Glu Tyr Glu Pro Leu Asp Glu Leu Asp Glu Thr 1 5 10 15 Leu Tyr Asn Gin Trp Met Phe His Gin Arg Leu Glu Gly Gly Gly Gly 20 25 30 Gly Xaa <210> 324 <211> 34 <212> PRT <213> Veštacka sekvenca <220> <223> Peptidna tela sposobna da se vezuju za Ang -2 <220> <221> raznovrsni oblici <222> (34) .. (34) <223> Xaa = Fc <400> 324 Met Gly Ala Gin Val Lys Tyr Lys Pro Leu Asp Glu Leu Asp Glu lie 1 5 10 15 Leu Tyr Glu Gin Gin Thr Phe Gin Glu Arg Leu Glu Gly Gly Gly Gly 20 25 30 Gly Xaa <2 10 > 32 5 <2 11 > 34 str . 138 PCT/US02/3267 00185 B 242DOS: 4544/18 Gly Xaa <2 10> 327 <2 11> 34 <21 2> PRT <213> Veštacka sekvenca <220> A -801 8 (PCT).ST25 .txt <223> Peptidna tela sposobna da se vezuju za A ng-2 <220> <221> r aznovrsni oblici <222> (34) .. (34) <223> Xaa = Fc <220> <221> ra znovrsni oblici <222> (34) . . (34) <223> Xaa = Fc <400 > 327 Met Gly Ala Gin Gin Asn Phe Lys Pro Met Asp Glu Leu Glu Asp Thr 1 5 10 15 Leu Tyr Lys Gin Phe Leu Phe Gin His Ser Leu Glu Gly Gly Gly Gly 20 25 30 Gly Xaa <210> 328 <2 11> 34 <212> PRT <21 3> V eštacka se kve nca <220> <223> Pept idna tela sposobna da se vezuju za Ang-2 <220> str. 140 PCT/US0213267 00185 B 243DOS: 4544/18 A-801 B (PCT).ST25.txt <220> <223> Peptidna tela sposobna da se vezuju za Ang-2 <220> <221> raznovrsni oblici <222> (34) .. (34) <223> Xaa = Fc <400> 330 Met Gly Ala Gin Gin Asn Tyr Lys Pro Leu Asp Glu Leu Asp Ala Thr 1 5 10 15 Leu Tyr Glu His Phe lie Phe His Tyr Thr Leu Glu Gly Gly Gly Gly 20 25 30 Gly Xaa <210> 33 1 <211 > 34 <21 2> PRT <213> Veštacka sekvenca <220> <223> Peptidna tela sposobna da se vezuju za Ang-2 <220> <221> r aznovrsni oblici <222> (34) . . (34) <223> Xaa <= Fc <400 > 33 1 Met Gly Ala Gin Val Lys Phe Lys Pro Leu Asp Ala Leu Glu Gin Thr 1 5 10 15 Leu Tyr Glu His Trp Met Phe Gin Gin Ala Leu Glu Gly Gly Gly Gly 20 25 30 Gly Xaa str. 142 PCT/US02/3267 00185 B 244DOS: 4544/ 18 A-801 8 CPCT) .ST25.txt Leu Tyr Glu Glu Phe Leu Phe Gin His Ala Leu Glu Gly Gly Gly Gly 20 25 30 Gly Xaa <210> 334 <2 11> 34 <212> PRT <213> Veštacka sekvenca <220> . <223> Peptidna tela sposobna da se vezuju za Ang-2 <220> <221> raznovrsni oblici <222> C34) .. (34) <2 23 > Xaa = Fc <400> 334 Met Gly Ala Gin Ser Asn Phe Met Pro Leu Asp Glu Leu Glu Gin Thr 1 5 10 15 Leu Tyr Glu Gin Phe Met Leu Gin His Gin Leu Glu Gly Gly Gly Gly 20 25 30 Gly Xaa <2 10> 335 <2 11 > 34 <21 2> PRT <213> Veštacka sekvenca <220> <223> Peptidna tela sposobna da se vezuju za Ang-2 <22.0> <22 1> raznovrsni oblici <222> C34) . . (34) <223> Xaa = Fc str . 144 PCT AJS02/32657 00185 B 245DOS: 4544/18 <220> <221> raznovrs ni oblici <222> (34) .. (34) <223> Xaa = Fc <400> 337 A-801 s (PCT).ST25.txt Met Gly Ala Gin Thr Lys Phe Asn Pro Leu Asp Glu Leu Glu Gin Thr 1 5 10 15 Leu Tyr Glu Gin Trp Thr Leu Gin His Gin Leu Glu Gly Gly Gly Gly 20 25 30 Gly Xaa <210> 338 <211 > 34 <212> FRT <213> Veštacka sekvenca <220> <223> Peptidna tela sposobna da se vezuju za Ang-2 <220> <221> raznovrsni oblici <222> (34) .. (34) <223> Xaa = Fc <400> 338 Met Gly Ala Gin His Thr Phe Gin Pro Leu Asp Glu Leu Glu Glu Thr 1 5 10 15 Leu Tyr Tyr Gin Trp Leu Tyr Asp Gin Leu Leu Glu Gly Gly Gly Gly Gly Xaa <2 10 > 339 <2 11 > 34 <212> PRT ~ ~ ~ str . 146 PCTIUS02/3267 00185 B 246DOS: 4544/18 <210> 341 <211 > 34 <212> PRT <213> Veštacka sekvenca <220> A-801 B (PCT).ST25.txt <223> Peptidna tela sposobna da se vezuju za Ang-2 <220> <221> raznovrsni oblici <222> C34) .. (34) <223> X aa = F e <400> 341 Met Gly Ala Gin Ser Lys Phe Lys Pro Leu Asp Glu Leu Glu Gin Th r 1 5 10 15 Leu Tyr Glu Gin Trp Thr Leu Gin His Ala Leu Glu Gly Gly Gly Gly w ~ ~ Gly Xaa <2 10> 342 <211> 31 <212> FRT <213> Veštacka sekvenca <220> <223> Peptidna tela sposobna da se vezuju za Ang-2 <220> <221> raznovrsni oblici <222> C2) .. (2) <223> Xaa = Fc <400> 342 Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Ser Gly Gin Leu Arg Pro Cys str. 148 PCT/US02/32657 00185 B 247DOS: 4544118 1 5 A-801 8 (PCT).ST25.txt 10 15 Glu Asp Met Phe Gly Cys Gly Thr Lys Asp Trp Tyr Gly Leu Glu 20 25 30 <210> 345 <211 > 31 <212> PRT <213> Veštacka sekvenca <220> <223> Peptidna tela sposobna da se vezuju za Ang-2 <220> <221> raznovrsni oblici <222> e 2 ) .. ( 2 ) <223> Xaa = Fc <400> 345 Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Ala Pro Gly Gin Arg Pro Tyr 1 5 10 15 Asp Gly Met Leu Gly Trp Pro Thr Tyr Gin Arg lie Val Leu Glu 20 25 30 <210> 346 <211 > 31 <212> PRT <213> Veštacka sekvenca <220> <223> Peptidna tela sposobna da se vezuju za Ang-2 <220> <221> raznovrsni oblici <222> ( 2 ) .. ( 2) <223> Xaa = Fc <400> 346 Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Gin Thr Trp Asp Asp Pro Cys str. 150 PCT/US02/32657 00185 B 248DOS: 4544/18 5 A-801 8 CPCT) .5T25.txt lO Phe Gly Gly Cys Thr Tyr Gin Leu Glu 20 25 <210> 349 <211> 31 <212> PRT <213> Veštacka sekvenca <220> <223> Peptidna tela sposobna da se vezuju za Ang-2 <220> <221> raznovrsni oblici <222> C2) .. (2) <223> Xaa = Fc <400> 349 15 Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Leu Gin Glu Trp Cys Glu Gly 1 5 10 15 Val Glu Asp Pro Phe Thr Phe Gly Cys Glu Lys Gin Arg Leu Glu <210> 350 <211> 31 <212> PRT 20 25 30 <213> Veštacka sekvenca <220> <223> Peptidna tela sposobna da se vezuju za Ang-2 <220> <221> raznovrsni oblici <222> (2) .. (2) <223> Xaa = Fc <400> 350 Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Met Leu Asp Tyr Cys Glu Gly str. 152 PCT/US0213267 00185 B 249DOS: 4544/18 5 A-801 s (PCT) .ST25 .txt 10 15 Val Glu Asp Pro Phe Thr Phe Gly Cys Glu Asn Gin Arg Leu Glu 20 25 30 <210> 353 <211> 31 <212> PRT <213> Veštacka sekvenca <220> <223> Peptidna tela sposobna da se vezuju za Ang-2 <220> <221> raznovrsni oblici <222> ( 2 ) .. ( 2 ) <223> Xaa = Fc <400> 353 Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Leu Leu Asp Tyr Cys Glu Gly 1 5 10 15 Val Gin Asp Pro Phe Thr Phe Gly Cys Glu Asn Leu Asp Leu Glu 20 25 30 <210> 354 <211 > 31 <2 12> PRT <213> Veštacka sekvenca <220> <223> Peptidna tela sposobna da se vezuju za Ang-2 <220> <221> raznovrsni oblici <222> (2) . . (2) <223> Xaa = Fc <400> 354 Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Gly Phe Glu Tyr Cys Asp Gly str. 154 PCf/US02/3267 00185 B 250DOS: 4544/18 5 A-80 l 6 (PCT).ST25.txt lO 15 Val Glu Asp Pro Phe Thr Phe Gly Cys Glu Lys Gin Arg Leu Glu 20 25 30 <210> 357 <211 > 3 1 <212> PRT <213> Veštacka sekvenca <220> <223> Peptidna tela sposobna da se vezuju za Ang-2 <220> <221> raznovrsni oblici <222> (2) . . (2) <223> Xaa = Fc <400> 357 PCT/US02/3267 ~ A C) V (\") ;-< A. T · , ! 2JV 1 . 11 ;: r· Di n s lav !~vA.~·~ Or< ....... ~;,arKovica 19 Tel 069-405-889 08 1/248-377 Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Lys Leu Glu Tyr Cys Asp Gly 1 5 10 15 Met Glu Asp Pro Phe Thr Gin Gly Cys Asp Asn Gin Ser Leu Glu 20 25 30 <210> 358 <211 > 29 <212> PRT <213> Veštacka sekvenca <220> <223> Peptidna tela sposobna da se vezuju za Ang-2 <220> <221> raznovrsni oblici <222> (2) .. (2) <223> Xaa = Fc <400> 358 Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Phe Asp Tyr Cys Glu Gly Val str. 156 00185 B 251Dos : 4544/18 ZAHTEVI PCTIUS02/32657 / A D V ( ) ;.-.;;:: .P.. l Cu pjc.Jd 2 B ran i sja v POD®RICA<š~~~ o Te l. os9-406 -ss9:lb8, ;248 -37~ l. Polipeptid sposoban da veže Ang-2 gde receni polipeptid sadrži amino kiselinsku sekvencu WDPWT (SEKV. ID. BR: 65) i gde receni polipeptidje od 5 do 50 amino kiselina u dužini, i njegove fiziološki prihvatljive soli. 2. Polipeptid sposoban da veže Ang-2 gde receni polipeptid sadrži amino kiselinsku sekvencu WDPWTC (SEKV. ID. BR: 66) i njegove fiziološki prihvatljive soli. 3. Polipeptid sposoban da veže Ang-2 gde receni polipeptid sadrži amino kiselinsku sekvencu Cz 2 WDPWT (SEKV.ID.N0:67) gde z 2 je kiseli ili neutralni polarni amino ostatak, i njegove fiziološki prihvatljive soli. 4. Polipeptid prema zahtevu 3, gde receni polipeptid koji još sadrži amino kiselinsku sekvencu Cz 2 WDPWTC (SEKV.ID. BR: 68) 5. Polipeptid sposoban da veže Ang-2 koji sadrži amino kiselinsku sekvencu formule: (SEKV. ID. NO: 69) 00185 B 252Dos : 4544/18 gde: a 1 , a 2 i a 3 su svaki za sebe amino kiselinski ostaci, a 5 je amino kiselinski ostaci; a 1 2 je odsutan ili je amino kiselinski ostatak; PCTIUS02/32657 a 1 3 je odsutan ili neutralan hidrofobni, neutralan polaran ili bazni amino kiselinski ostatak; a 14 je neutralan hidrofobni ili neutralan polarni aminokiselinski ostatak; i njegove fiziološki prihvatljive soli. 6. Polipeptid prema zahtevu 5 gde: a 1 je V, I, P, W, G, S, Q, N, E, K, R, ili H; a 2 je V, P, M, G, S, Q, D, E, K, R, ili H; a 3 je A, V, P, M, F, T, G, D, E, K, ili H; a 8 je A, V, G, Q, N, D ili E; a 12 je S,Q,N,D,E,K,ili R; 1 3 • LT ·1· H a Je , tt ; a 1 4 je V, L, I, W ili M; i njegove fiziološki prihvatljive soli. 7. Polipepeptid prema zahtevu 5 gde: l· Q a Je ; 2 . E a Je ; a 3 je E; a 5 je D ili E; 12 . D ·1· E a Je 1 1 ; 13. H . a Je ; 1 a 14 je M; i njegove fiziološki prihvatljive soli. 8. Polipeptid sposoban da vezuje Ang-2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu formule: blb2b3 b4bsb6CbsWDPWTCblsbl6 bl7 bl8bl9b2o (SEKV. ID BR: 70) gde: b 1 je odutan ili je jedan amino kiselinski ostatak; 00185 B 253Dos : 4544/18 PCT/US02/32657 b 2 je odsutan ili neutralan hidrofobni, neutralan polarni, ili bazni amino kiselinski ostatak; b 3 , b 4 , b 5 i b 6 su svaki zasebno odsutni ili su to amino kiselinskiostaci; b 8 je amino kiselinski ostatak; bis je odsutan ili je aminokiselinski ostatak; bi 6 je odsutan ili je neutralan hidrofobni, neutralan polarni ili bazni amino kiselinski ostatak; bi 7 je odsutan ili neutralan hidrofobni ili neutralan polarni amino kiselinski ostatak; bi 8 , bi 9 i b 20 su svaki zasebno odsutni ili amino kiselinski ostatak; i njihove fiziološki prihvatljive soli. 9. Polipeptid prema zahtevu 8 gde: b 1 je odsutan ili je A, V, L, P, W, F, T, G, S, Q, N, K, R, ili H; b 2 je odsutan ilije A, V, L, l, P, W, M, T, G, S, Y, N, K, R, iJiH; b 3 je odsutan ili je A, L, I, P, W, M, T, G, S, Q, N, E, R, ili H; b 4 je V, I, P, W, G, S, Q, N , E, K, R, ili H; b 5 je V, P, M, G, S, Q, D, E, K, R, ili H; b 6 je A, V, P, M, F, T, G, D, E, K, ili H; ili njegove fiziološki prihvatljive soli. l O. Polipeptid prema zahtevu 8 gde: b 1 je odutan ili je P, ili T; b 2 je odsutan ili je I, ili N; b 3 je odsutan R, ili I; b 4 ili Q; b 5 ili E· ' b 6 je E; b 8 je D ili E; b 15 • D ·1· E Je I 1 ; b 16 je H; b 17 je M; b 18 je odsutan ili je W ili P; b 19 je odsutan ili je G ili E; i 00185 B 254Dos : 4544/18 PCT /US02/3 2657 b 20 je odsutan ili je V ili K. i njegove fiziološki prihvatljive soli. ll. Polipeptid koji sadrži najmanje jednu amino sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEK ID BR: 4 i SEKV. ID BR: 76 do SEKV ID BR.: 118 zakljucno , da receni polipeptidje sposoban da se vezuje za Ang-2 i njegove fiziološki prihvatljive soli. . PEPTID SEKV ID BR. PEPTIDNA SEKVNCA Con4-44 76 IPIR QEECD WD PWTCEHMWEV Con4-40 77 [NI Q EECEWD PWTCD HMPG K Con4-4 78 WYEQDACEWDPWTCEHMAEV Con4-31 79 NRLQEVCEWDPWTCEHMENV Con4-C5 80 IAATQEECEWDPWTCEHMPRS Con4-42 81 LRHQEGCEWDPWTCEHNWDW Con4-35 82 ~PRQKDCEWDPWTCEHMYVG Con4-43 83 S IS HEECEWD PWTCEHM Q V G Con4-49 84 W AAQEECEWDPWTCEHMGRM Con4- 27 85 TWPQDKCEWDPWTCEHMGST Con4-48 86 GHSQEECGWDPWTCEHMGTS Con4-46 87 Q HW QEECEWD PWTCD HMPSK Con4-41 88 NVRQEKCEWDPWTCEHMPVR Con4-36 89 KSGQVECNWDPWTCEHMPRN Con4-34 90 ~KTQEHCDWDPWTCEHMREW Con4-28 91 iA WGQEGCDWDPWTCEHMLPM Con4-39 92 IPVNQEDCEWDPWTCEHMPPM Con4-25 93 \\RAPQEDCEWDPWTCAIK Con4-50 94 lH.GQNMECEWDPWTCEHNWRY Con4-38 95 IPRLQ EECVWD PWTCEHMPLR Con4-29 96 \\RTTQEKCEWDPWTCEHMESQ Con4-47 97 QTSQEDCVWDPWTCDHMVSS Con4- 20 98 QVIGRPCEWDPWTCEHLEGL Con4-45 99 W AQQEECA WDPWTCDHMVGL Con4-37 100 fLPGQEDCEWDPWTCEHMVRS Con4-33 101 ~MNQVECDWDPWTCEHMPRS AC2-Con4 102 FGWSHGCEWDPWTCEHMGST 00185 B 255Dos: 4544/18 PCT/US02/32657 Con4-32 103 KSTQDDCDWDPWTCEHMVGP Con4-17 104 GPRISTCQWDPWTCEHMDQL Con4-8 105 STIGDMCEWDPWTCAHMQVD AC4-Con4 106 VLGGQGCEWD PWTCRLLQGW Con4-l 107 VLGGQGCQWDPWTCSHLEDG Con4-C l 108 Til GSM CEWD PWTCAHM QGG Con4-21 109 TKGKSVCQWDPWTCSHMQSG Con4-C2 110 TIIGSMCQWDPWTCAHMQGG Con4-18 ll l WVNEVVCEWDPWTCNHWDTP Con4-19 112 WVQVGMCQWDPWTCKHMffiLQ Con4-16 113 ~VGSQTCEWDPWTCAHLVEV Con4-ll 114 QGMKMFCEWDPWTCAHIVYR Con4-C4 115 lfii G S M CQ WD PWTCEHM QGG Con4-23 116 ~SQRVGCEWDPWTCQHLTYT Con4-15 117 QWSWPPCEWDPWTCQTVWPS Con4-9 118 GTSPSFCQWDPWTCSHMVQG TN8-Con4 4 QEECEWD PWTCEHM 12. Fuzioni polipeptid koji se sastoji od najmanje jednog peptida prema zahtevima l ,5,8 ili ll i nosaca, gde receni fuzioni polipeptid je sposoban da se vezuje za Ang-2 i njegove fiziološki prihvatljive soli. 13. Fuzioni polipeptid prema zahtevu 12 gde receni nosac je najmanje jedan od Fc domena, polietilen glikol, lipid, grupa holesterola, ugljeni hidrat i jedan poljeaharid. 14. Polipeptid prema zahtevima l ,5,8 ili ll koji je ciklican. 15. Dim er ili multimer polipeptida prema zahtevima l ,5 ,8 ili ll 16. Jedinjenje od interesa sa formulom: ()(l)a-l?l-()(2)b i njihovi multimeri, gde : F l. v Je nosac; X 1 i X 2 su svaki nezavjeno odabrani od -(L 1 )c-P 1 ; -(L l )e-p l-(L2)d-p2; -(L 1 )c-P 1 -(e)d-P 2 -(L 3 )e-P 3 ; i -(L l)c-PI-(L2)d-P2 -(L3)e-P3 -(L 4)r-P4; 00185 B 256Dos : 4544/18 PCT/US02/32657 gde jedan ili više od P 1 , P 2 , P 3 i P 4 gde svaki nezavisno sadrži polipeptid odabran iz grupe koja se sastoji od: (a) amino kiselinske sekvence WDPWT(SEKV.ID BR: 65), gde receni polipeptidje dužine od 5 do 50 amino kiselina; (b) amino kiselinske sekvence WDPWTC (SEKV. ID BR: 66), (e) amino kiselinske sekvence Cz 2 WDPWT (SEKV. ID BR: 67), (d) amino kiselinske sekvence Cz 2 WDPWTC (SEKV ID BR : 68), gde z 2 je kiseli ili neutralni polarni amino kiselinski ostatak; L 1 , L 2 , L 3 i L 4 su svaki nezavjeno kopce; i a, b, e, d, e, i f su svaki nezavjeno O ili l , gde se podrazumeva da su bar jedan od a ili b jednaki l; i njegove fiziološki prihvatljive soli. 17. Jedinjenje od interesa prema zahtevu 16 gde z 2 je A,V, G, Q, N, D ili E. 18. Jedinjenje od interesa prema zahtevu 16 gde jedan ili više od P 1 , P 2 , P 3 i P 4 svaki nezavjeno koji sadrži polipeptid odabran iz grupe koja se sastoji od SEKV. ID BR: 4 i SEKV. ID BR: 76 do SEKV ID BR. 118 zakljucno . 19. Jedinjenje od interesa, prema zahtevu 16 formule: x'-F' ili F 1 -X 2 20. Jedinjenje od interesa, prema zahtevu 16 formule: F'-(LI)c-PI i njegove fiziološki prihvatljive soli. 21. Jedinjenje od interesa, prema zahtevu 16 formule: FI-(Lt)c-PI-(L2)d-P2 i njegove fiziološki prihvatljive soli. 22. Jedinjenje od interesa, prema zahtevu 16 formule: P 1 -(L 1 )c-F 1 -(L 2 )d-P 2 i njegove fiziološki prihvatljive soli. 23. Jedinjenje od interesa, prema zahtevu 16 gde F 1 je jedan Fc domen ili fragment. nJegov 24. Jedinjenje od interesa, prema zahtevu 16 formule gde F 1 sadrži amino kiselinsku 00185 B 257Dos : 4544/18 PCTIUS02/32657 sekvencu SEKV. ID. BR : 60. 25. Polinukleotid koji sadrži jedinjenje od interesa prema zahtevu l, 5, 8 ili ll. 26. Ekspresioni vector koji sadrži polinukleotid iz zahteva 25. 27. Celija domacin koja sadrži ekspresioni vector iz zahteva 26. 28. Celija domacin prema zahtevu 17 gde je ta celija prokariotska. 29. Celija domacin prema zahtevu 28 gde je ta celija E. coli celija. 30. Celija domacin prema zahtevu 27 gde ta celija je eukariotska celija. 31. Polipeptid koji je u stanju da vezuje Ang-2 i koji sadrži jednu amino kiselinsku sekvencu formule : (SEKV. ID BR: 71) gde c 2 je neutralni hidrofobni amino kiselinski ostatak c 4 je A, D ili E c 6 je jedan aminokiselinski ostatak c 7 je jedan amino kiselinski ostatak; i c 8 je neutralni hidrofobni, neutralni polarni ili bazni amino kiselinski ostatak; i njegove fiziološki prihvatljive soli. 32. Polipeptid prema zahtervu 31 gde c 2 je L ili M. 33. Polipeptid prema zahtevu 31 gde c 6 je D ili E 34. Polipeptid sposoban da vezuje Ang-2 i koji sadrži jednu amino kiselinsku sekvencu formule : (SEKV ID BR: 72) gde: d 1 je odsutan ilije amino kiselinski ostatak; d 2 je odsutan ili je neutralan polarni, kiseli ili bazni amino kiselinski ostatak; d 3 je odsutan ili je neutralan hidrofobni ili neutralni polarni amino kiselinski ostatak; d 4 je odsutan ili je amino kiselinski ostatak; d 6 je neutralan hidrofobni amino kiselinski ostatak; d 8 je A, D ili E; d 10 je jedan amino kiselinski ostatak; d 11 je jedan amino kiselinski ostatak; 00185 B 258Dos : 4544/ 18 PCT/US02/32657 d 12 je neutralan hidrofobni, neutralan polarni ili bazni amino kiselinski ostatak; d 15 je odsutan ili neutralan polarni, kiseli ili bazni amino kiselinski ostatak; d 16 je odsutan ili neutralan polarni, kiseli ili bazni amino kiselinski ostatak; d 17 je odsutan ili neutralni hidrofobni ili neutralan polarni amino kiselinski ostatak d 18 je odsutan ili neutralan hidrofobni ili neutralan polarni amino kiselinski ostatak d 19 je odsutan ili neutralan hidrofobni, neutralan polarni ili bazni amino kiselinski ostatak; d 20 je odsutan ili je jedan amino kiselinski ostatak; d 21 je odsutan ili neutralan polarni, kiseli ili bazni amino kiselinski ostatak; d 22 je odsutan ili neutralan hidrofobni, neutralan polarni ili bazni amino kiselinski ostatak; i njegove fiziološki prihvatljive soli. 35. Polipeptid prema zahtevu 34 gde: dljeT,S,Q,R,orH; d 2 je T, Q, N, or K; d 3 je F; d 4 je M, Q, E, or K; d 6 je L ili M ; d 8 je D ili E; d 1 0 je E; d ll. Q \"l\" E Je 1 1 ; d 12· T \"l\" R Je 1 1 ; d 15 Y,D,E,ili K; dl6je Q; d 1 7 • W ·1· F Je 1 1 ; d 18 je L, l, M, ili T; d 19 jeL,F,ili Y; d 20 je Q, D, ili E; d 21 je odsutan ili je Q, ili H; d 22 je odsutan ili je A, L, G, S, ili R; i njegove fiziološki prihvatljive soli. 36. Polipeptid koji se sastoji od najmanje jedne amino kiselinske sekvence odabrane iz grupe koja se sastoji od SEKV ID BR: 6 i SEKV ID BR: 119 do SEKV ID BR: 142 zakljucno, gde receni polipeptid je u stanju da se vezuje za Ang-2 i njegove fiziološki prihvatljive soli; Pep ti d SEKV ID BR. Peptidna Sekvenca Ll-l 119 QNYKPLDELDA TL YEHFIFHYT Ll-2 120 fl-'NFTPLDELEQTL YEQVfTLQQS 00185 B 259Dos : 4544/18 PCTIUS02/32657 Ll-3 121 TKFNPLDELEQTL YEQVITLQHQ Ll-4 122 VKFKPLDALEQTL YEHWMFQQA LI-5 123 VKYKPLDELDEYEQQTFQER Ll-7 124 TNFMWMDDLEQRL\\QQQG Ll-9 125 SKFKPLDELEQTL YEQVITLQHA Ll-10 126 QKFQPLDELEQTL YEQFMLQQA Ll-ll 127 QNFKPMDELEDTL YKQFLFQHS Ll-12 128 YKFTPLDDLEQTL YEQVITLQHV Ll-13 129 QEYEPLDELDETL YNQWMFHQR Ll-14 130 SNFMWLDELEQTL YEQFMLQHQ Ll-15 131 QKYQPLDELDKTLYDQFMLQQG Ll-16 132 QKFQPLDELEETL YKQV ITLQQR LI-17 133 VKYKPLDELDEWLYHQFTLHHQ Ll-18 134 QKFMWLDELDEYEQFMFQQS LI-19 135 QTFQPLDDLEEYL \\QWIRR YH LI-20 136 EDYMWLDALDAQL YEQFLHG LI-21 137 BTFQPLDELEETL YYQVfL YDQL 37. Fuzioni polipeptid koji sadrži najmanje jedan peptid prema zahtevima 31 , 34 ili 36 i nosac, gde receni fuzioni polipeptid je u stanju da se vezuje za Ang-2 i njegove fiziološki prihvatljive soli. 38. Fuzioni polipeptid prema zahtevu 3 7 gde receni nosac je najmanje jedan iz Fc domena, polietilen glikol, lipid, holesterol grupa, ugljeni hidrat ijedan oligosaharid. 39. Polipeptid prema zahtevu 31 , 34 ili 36 koji je ciklican . 40. Dimer ili multimer polipeptida prema zahtevu 31 , 34 ili 36. 41 . Jedinjenje od interesa sa formulom : (XI)a-FI-(X2)b i njegovi multimeri, gde : F 1 je nosac; X 1 i X 2 su svaki nezavisno odabrani od : (L\\-P 1 ; (L I)c-PI-(L2 )ct-P2 -(L3 )e -P3; i (L 1 )e-p 1 -(L 2 )d- p2 -(L\\ -p3 -(L 4)r p4 ; 00185 B 260Dos : 4544/18 PCT /US02/32657 gde jedan ili više od P 1 , P 2 , P 3 i P 4 svaki zasebno sadrži polipeptid prema zahtevu 31,34 ili 36; L 1 , L 2 , L 3 i L 4 su svaki zasebno linkovi a, b, e, d, e if su svaki zasebno O ili l pod uslovom daje bar jedan od a ili b jednak l. 42. Jedinjenje od interesa prema zahtevu 41 gde jedan ili više od P 1 , P 2 , P 3 i P 4 svaki zasebno sadrži polipeptid odabran iz grupe koja se sastoji od SEKV. ID BR.:6 i SEKV ID BR: 119 do SEKV ID BR: 142 zakljucno. 43. Jedin jen je od interesa prema zahtevu 41 formule : X 1 -F 1 ili F 1 -X 2 i njihove fiziološki prihvatljive soli. 44. Jedinjenje od interesa prema zahtevu 41 formule : F 1 -(L\\-P 1 i njegove fiziološki prihvatljive soli. 45. Jedinjenje od interesa prema zahtevu 41 formule: F 1 -(L 1 )c-P 1 -(L 2 )d-P 2 i njegove fiziološki prihvatljive soli. 46. Jedinjenje od interesa prema zahtevu 41 formule : F 1 -(L 1 )c-F 1 -(L 2 )d-P 2 i njegove fiziološki prihvatljive soli. 47. Jedinjenje od interesa prema zahtevu 41, gde P 1 je Pc domen ili njegov fragment. 48. Jedinjenje od interesa prema zahtevu 41 gde P 1 sadrži amino kiselinsku sekvencu SEKV ID BR: 60. 49. Polinukleotid koji kodira polipeptid prema bilo kom od zahteva 31, 34 ili 36. 50. Ekspresioni vector koji sadrži polinukleotid prema zahtevu 49. 51. Celija domacin koja sadrži ekspresioni vector prema zahtevu 50. 52. Celija domacin prema zahtevu 51 gde je ta celija prokariotska celija. 53. Celija domacin prema zahtevu 52 gde je ta celija E. coli celija. 54. Celija domacin prema zahtevu 51 gde je ta celija eukariotska celija. 55. Polipeptid koji je u stanju da vezuje Ang-2 i koji sadrži amino kiselinsku sekvencu formule: (SEKV ID BR: 73) gde e 3 je neutralan polarni amino kiselinski ostatak; 00185 B 261Dos : 4544118 e 4 je kiseo amino kiselinski ostatak; e 5 je neutralan polarni ili kiseli amino kiselinski ostatak; e 6 je neutralni hidrofobni amino kiselinski ostatak; e 7 je neutralni hidrofobni amino kiselinski ostatak; i njegove fiziološki prihvatljive soli. 56. Polipeptid prem azahtevu 55 gde e 3 je Y ili C. 57. Polipeptid prema zahtevu 55 gde e 4 je D ili E. 58. Polipeptid prema zahtevu 55 gde e 6 je I ili M. PCT IUS02/32657 59. Polipeptid koji je u stanju da vezuje Ang-2 i koji sadrži amino kiselinsku sekvencu formule : (SEKV ID BR : 74) gde, f 1 je neutralan hidrofobni ili neutralan polarni amino kiselinski ostatak; f je neutralni hidrofobni ili neutralan polarni amino kiselinski ostatak; f 3 je neutralan polarni ili kiseli amino kiselinski ostatak; t je neutralni hidrofobni ili neutralni polarni amino kiselinski ostatak; e je neutralni polarni amino kiselinski ostatak; fl je kiseli amino kiselinski ostatak; f je neutralni polarni ili kiseli amino kiselinski ostatak; f 10 je neutralan hidrofobni amino kiselinski ostatak; f 11 je neutralan hidrofobni amino kiselinski ostatak; f 13 je neutralan hidrofobni ili neutralan polarni amino kiselinski ostatak; f 14 je neutralni hidrofobni ili neutralan polarni amino kiselinski ostatak; f 15 je neutralan polarni amino kiselinski ostatak; f 16 je neutralan polarni amino kiselinski ostatak; f 17 je neutralan polarni ili kiseli amino kiselinski ostatak; f 18 je neutralni hidrofobni ili bazni amino kiselinski ostatak; f 19 je neutralni hidrofobni ili neutralni polarni amino kiselinski ostatak;i f 20 je neutralni hidrofobni ili neutralan polarni amino kiselinski ostatak; i njihove fiziološki prihvatljive soli. 60. Polipeptid prema zahtevu 59 gde: f 1 je S, A ili G; f je G, Q ili P; 00185 B 262Dos : 4544/18 e je Q, G ili D; f je L, M ili Q; f 7 je e ili Y; fl je E ili D; f je E, G ili D; f 10 je I ili M; f 11 je F ili L; f 13 je e ili W; f l4. G 'l' p Je 1 1 ; f 15 je T ili N; f 16 J'e Q Y ili K· , , , f 17 je N,D ili Q; f 18 je L, V, W iliR; f 19 je A, Q, Y ili I; i f 0 je L, A, G ili V i njegove fiziološki prihvatljive soli. PeT/US02/32657 61. Polipeptid koji sadrži najmanje jednu amino kiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEKV ID BR: 3 i SEKV ID BR: 143 do SEKV ID BR: 148 zakljucno, gde receni polipeptidje u stanju da se vezuje za Ang-2 i njegove fiziološki prihvatljive soli; Peptid SEKV.IDBR: Sekvenca eonl-1 143 AGGMRPYDGMLGWPNYDVQA eonl-2 144 QTWDDPeMHILGPVTWRRei eonl-3 145 APGQRPYDGMLGWPTYQRIV eonl-4 146 SGQLRPeEEWGeGTQNLAL eonl-5 147 FGDKRPLEeMFGGPIQLePR eonl-6 148 GQDLRPeEDMFGeGTKDWYG e oni 3 KRPeEEIFGGeTYQ 62. Fusioni polipeptid koji sadrži najmanje jedan polipeptid prema zahtevima 55, 59 ili 61 i nosac, gde receni fusioni polipeptid je u stanju da vezuje Ang-2, i njegove fiziološki prihvatljive soli. 00185 B 263Dos : 4544/18 PCT/US02/32657 63. Fusioni polipeptid prema zahtevu 62 gde receni nosac je bar jedan od Fc domena, polietilen glikol, lipid, holesterol grupa i jedan oligosaharid. 64. Polipeptid prema zahtevu 55, 59 ili 61 koji je ciklican . 65. Dimer ili multimer jedinjenja prema zahtevima 55, 59 ili 61 . 66. Jedinjenje od interesa formule: l l ( 2) (X )a-F- X b i njegovi multimeri, gde : F 1 je nosac; X 1 i X 2 su svaki nezavisno odabrani od -(Ll)c-Pl ; -(L 1 )c-P 1 -(L 2 )ct-P 2 ; -(L l )e-p l --(L 2)ct-p2 -(L 3 )e-p3; -(L l)c-Pl-(L2)ct-P2 -(L3)e-P3 -(L 4)f-P4; gde jedan ili više od P 1 , P 2 , P 3 i P 4 svaki nezavisno sadrži polipeptid prema zahtevu 55, 59 ili 61; L 1 , L 2 , L 3 i L 4 su svaki nezavisno linkovi; i a, b, e, d, e i f su svaki nezavisno O ili l , pod uslovom da bar jedan od a ili b je jednak jedan; i njegove fiziološki prihvatljive soli. 67. Jedinjenje od interesa prema zahtevu 66 gde jedan ili više od P 1 , P 2 , P 3 i P 4 od kojih svaki nezavisno sadrži polipeptid odabran iz grupe koja se sastoji od SEKV. ID. BR: 3 i SEKV ID BR: 143 do SEKV ID BR: 148 zakljucno. 68. Jedinjenje od interesa prema zahtevu 66 formule: i njegove fiziološki prihvatljive soli. X 1 -F 1 ili F 1 -X 2 69. Jedinjenje od interesa prema zahtevu 66 formule : F 1 -(L 1 )c-P 1 i njegove fiziološki prihvatljive soli. 70. Jedinjenje od interesa prema zahtevu 66 formule : FI-(LI)c-Pt-(L2)ct-P2 i njegove fiziološki prihvatljive soli. 00185 B 264Dos : 4544/18 PCT /US02/32657 71. Jedinjenje od interesa prema zahtevu 66 formule: lfl-(~l)c-lfl-(~2)d-J>2 i njegove fiziološki prihvatljive soli. 72. Jedinjenje prema zahtevu 66 gde P 1 je jedan Pc domen ili njegov fragment. 73 . Jedinjenje od interesa prema zahtevu 66 gde P 1 sadrži amino kiselinsku sekvencu SEKV ID BR : 60 74. Poinukleotid koji kodira polipeptid prema bilo kojem od zahteva 55, 59 ili 61 75. Ekspresioni vektor koji sadrži polinukleotid prema zahtevu 74. 76. Celija domacin koja sadrži ekspresioni vektor prema zahtevu 75. 77. Celija domacin prema zahtevu 76 gde je to prokariotska celija. 78. Celija domacin prema zahtevu 77 gde je ta celija E. coli celija. 79. Celija domacin prema zahtevu 76 gde je to eukariotska celija. 80. Polipeptid sposoban da vezuje Ang-2 koji sadrži amino kiselinsku sekvencu formule: gde Cg2Gg4gsDJ>J?TgtoGCgl3 (SEKV. ID BR: 75) g 2 je amino kiselinski ostatak; g 4 je neutralan hidrofobni amino kiselinski ostatak; g 5 je E,D, ili Q; g 10 je neutralan hidrofobni ili neutralan polarni amino kiselinski ostatak; g 13 je kiselinski ostatak; i njegove fiziološki prihvatljive soli. 81. Polipeptid prema zahtevu 80 gde g 2 je E ili D. 82. Polipeptid prema zahtevu 80 gde g 4 je V ili M. 83. Polipeptid prema zahtevu 80 gde g 1 0 je P ili Q. 84. Polipeptid prema zahtevu 80 gde g 13 je D ili E. 85. Polipeptid sposoban da vezuje Ang-2 koji sadrži amino kiselinsku sekvencu formule: gde h 1 h 2 h 3 h 4 Ch 6 Gh 8 h 9 DJ>J?Th 14 GCh 17 h 18 h 19 h 20 (SEKV. ID BR : 158) h 2 je neutralan hidrofobni ili neutralni polarni amino kiselinski ostatak; h 3 je amino kiselinski ostatak; 00185 B 265Dos : 4544/18 h 4 je neutralni hidrofobni ili neutralni amino kiselinski ostatak; h 6 je amino kiselinski ostatak; h 8 je neutralni hidrofobni amino kiselinski ostatak; h 9 je E, D ili Q; PCT /US02/32657 h 14 je neutralni hidrofobni ili neutralni polarni amino kiselinski ostatak; h 17 je kiseli amino kiselinski ostatak; h 18 je neutralni hidrofobni, neutralan polarni ili bazni amino kiselinski ostatak; h 19 je neutralni hidrofobni ili neutralan polarni amino kiselinski ostatak; i h 20 je odsutan ili je amino kiselinski ostatak; i njegove fiziološki prihvatljive soli. 86. Polipeptid prema zahtevu 85 gde : h 1 je odsutan ili A, L, M, G, K ili H h 2 je L,F ili Q; h 3 je D ili E; h 4 je W ili Y; h 6 je D ili E; h 8 je V ili M; h 14 je Fili Q; h 17 je D ili E; h 18 je M, Y, N, ili K; h 19 je L ili Q; i h 20 je odsutan ili M, T, G, S,D, K iliR; i njegove fiziološki prihvatljive soli. 87. Polipeptid koji sadrži najmanje jednu amino kiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEKV. ID BR: 5, i SEKV. ID BR: 149 do SEKV ID BR: 157 zakljucno, gde receni polipeptid je u stanju da se vezuje za Ang-2 i njegove fiziološki prihvatljive soli; 88. Fuzioni polipeptid koji sadrži najmanje jedan peptid prema zahtevu 80, 85 ili 87 i nosac, gde receni fuzioni polipeptid je u stanju da vezuje Ang-2 i njegove fiziološki prihvatljive soli. 00185 B 266Dos : 4544/18 PCT/US02/32657 Peptid SEKV. ID BR.: Sekvenca 12-9-1 149 GFEYCDGMEDPFTFGCDKQT 12-9-2 150 ~LEYCDGMEDPFTQGCDNQS 12-9-3 151 ~QEVVCEGVEDPFTFGCEKQR 12-9-4 152 ~QDYCEGMEDPFTFGCEMQK 12-9-5 153 ~LDYCEGVQDPFTFGCENLD 12-9-6 154 ~QEYCEGMEDPFTFGCEYQG 12-9-7 155 ~LD YCEGMD D PFTFGCD KQ M 12-9-C2 156 ~QDYCEGVEDPFTFGCENQR 12-9-C1 157 ~QDYCEGVEDPFTFGCEKQR 12-9 5 FDYCEGVEDPFTFGCDNH 89. Fuzioni polipeptid prema zahtevu 88 gde receni nosac je najmanje jedan Fc domen, polietilen glikol, lipid, holesterol grupa, ugljeni hidrati jedan oligosaharid. 90. Polipeptid prema zahtevu 80, 85 ili 87 koji je ciklican. 91. Dimer ili multimer polipeptida prema zahtevima 80,85 ili 87. 92. Jedinjenje od interesa formule : (Xt)a-Ft-(X2)b i njegovi multimeri, gde : F 1 je nosac; X 1 i X 2 su svaki nezavisno odabrani od -(L 1 )c-P 1 ; -(L l )e-p ~-(L 2)d-p2; -(LI)c-PI-(L 2)d_p2 -(L3)e-P3; -(L l)c -PI-(L2)d_p2 -(L3)e-P3 -(L 4)r-P4; gde jedan ili više od P 1 , P 2 , P 3 i P 4 svaki nezavisno sadrzi polipeptid prema zahtevu 80, 85 ili 87; L 1 , L 2 , L 3 i L 4 su svaki nezavisno linkovi; i a, b, e, d, e if su svaki nezavisno O ili l, pod uslovom da najmanje jedan od a i b je jednak jedan; i njegove fiziološki prihvatljive soli. 93. Jedinjenje od interesa prema zahtevu 92 gde jedan ili vise od P 1 , P 2 , P 3 i P 4 nezavisno jedan od drugoga sadrže polipeptid odabran iz grupe koja se sastoji od SEKV ID BR : 5 i SEKV ID BR : 149 do SEKV ID BR: 157 zakljucno. 00185 B 267Dos : 4544/18 PCT /US02/32657 94. Jedinjenje od interesa prema zahtevu 92 formule : x'-F' i njegove fiziološki prihvatljive soli. 95. Jedinjenje od interesa prema zahtevu 92 formule : F 1 -(L 1 )c-P 1 i njegove fiziološki prihvatljive soli. 96. Jedinjenje prema zahtevu 92 formule : F 1 -(L 1 )c-P 1 -(L 2 )d-P 2 i njegove fiziološki prihvatljive soli. 97. Jedinjenje od interesa prema zahtevu 92 formule: F 1 -(L 1 )c-F 1 -(L 2 )d-P 2 i njegove fiziološki prihvatljive soli. 98. Jedinjenje prema zahtevu 92 gde F 1 je jedan Fc domen ili njegov fragment. 99. Jedinjenje od interesa prema zahtevu 92 gde F 1 sadrži amino kiselinsku sekvencu SEKV. ID BR: 60 100. Polinukleotid encoding polipeptid prema bilo kojem od zahteva 80, 85 ili 87. l 01. Ekspresioni vektor koji sadrži polinukleotid prema zahtevu l OO. l 02. Ce lij a domacin koj a sadrži ekspresioni vektor prema zahtevu l O l. l 03. Celija domacin prema zahtevu l 02 gde je ta celija prokariotska celija . l 04. Celija domacin prema zahtevu l 03 gde je ta celija E. Coli celija. l 05. Celija domacin prema zahtevu l 02 gde je ta celija eukariotska celija. 106. Polipeptid prema jednoj od SEKV ID BR: l, SEKV ID BR: 2, SEKV ID BR: 3, ili SEKV ID BR: 4 ili njegove varijante. 107. Polipeptid prema jednoj od SEKV. ID BR: 5, SEKV. ID BR: 6, ili SEKV ID BR: 7 ili njegove varijante. 108. Jedinjenje od interesa formule: (X 1 )q-F 1 -(X 2 )r i njegovi multimeri, gde : F l. v Je nosac; X 1 i X 2 su svaki nezavisno odabrani od: -(LI)s-PI; 00185 B 268Dos : 4544118 PCT /US02/32657 -(L l)s-Pl-(L2)t-P2; -(L l )s-p l -(L\\-p2 -(L 3)u-p3; i -(L l )s-P I-(L2)t-p2 -(L3)u-P3 -(L 4)v-P4; gde j edan ili više od P 1 , P 2 , P 3 i P 4 svaki nezavisno sadrži polipeptid odabran iz grupe koja se sastoji od : (a) amino kiselinska sekvenca WDPWT (SEKV ID BR:65), gde receni polipeptidje dužine od 5 do 50 amino kiselina. (b) amino kiselinska sekvenca WDPWTC (SEKV. ID BR: 66); (e) amino kiselinska sekvenca Cz 2 WDPWT (SEKV: ID BR: 67), gde z 2 je kiseli ili neutralni polarni amino kiselinski ostatak; (d) amino kiselinska sekvenca Cz 2 WDPWTC (SEKV ID BR: 68), gde z 2 je jedan kiseli ili neutralni polarni amino kiselinski ostatak; (e) amino kiselinska sekvenca Pc 2 Dc 4 Lc 6 c 7 c 8 LY (SEKV. ID BR: 71) gde c 2 je neutralni hidrofobni amino kiselinski ostatak; c 4 je A, D ili E; c 6 je amino kiselinski ostatak; c 7 je amino kiselinski ostatak; i c 8 je neutralan hidrofobni, neutralan polarni ili bazni amino kiselinski ostatak; (f) amino kiselinska sekvenca RPe 3 e 4 ese 6 e 7 G (SEKV. ID BR: 73) gde e 3 je neutralan polarni amino kiselinski ostatak; e 4 je jedan kiseli amino kiselinski ostatak; es je neutralni polarni ili kiseli amino kiselinski ostatak; e 6 je neutralni hidrofobni amino kiselinski ostatak; i e 7 je neutralni hidrofobni amino kiselinski ostatak; (g) amino kiselinska sekvenca Cg 2 Gg 4 gsDPFTg 10 GCg 13 (SEKV. ID BR. 75) gde g 2 je jedan amino kiselinski ostatak; g 4 je neutralan hidrofobni amino kiselinski ostatak; gs je neutralni polarni ili jedan kiseli amino kiselinski ostatak; g 10 je neutralni hidrofobni ili neutralni polarni amino kiselinski ostatak; i g 13 je amino kiselinski ostatak; (h) Polipeptid SEKV. ID BR: l; (i) Polipeptid SEKV: ID BR: 2; i G) Polipeptid SEKV: ID BR : 7 L 1 , L 2 , L 3 i L 4 su svaki nezavisno linkovi; i q, r, s, t, u i v su svaki nezavisno O ili l, pod uslovom daje bar jedan od q ilir jednak l; i njegove fiziološki prihvatljive soli. l 09. Farmaceutski oblik koji sadrži efikasnu kolicinu jedinjenja prema zahtevima l, 31, 55 ili 80 u dodatnoj smeši sa farmaceutski prihvatljivim nosacem. 110. Metod za inhibiciju neželjene angiogeneze kod sisara koji podrazumeva davanje terapeutski efektivne doze jedinjenja prema zahtevima 12, 16, 37, 41, 62, 66, 88 ili 92. 00185 B 269Dos : 4544118 PCTIUS02/32657 111. Metod za lecenje aniogeneze kod subjekta, gde receni metod se sastoji od davanja efektivne kolcinejedinjenjaprema zahtevima 12, 16, 37, 41, 62, 66, 88 ili 92. 112. Metod modulacije angiogeneze kod sisara koji se sastoji od davanja efektivne kolcine jedinjenja prema zahtevima 12, 16, 37, 41, 62, 66, 88 ili 92. 113. Metod za inhibiciju rasta tumora karakteristican po neželjenoj angiogenezi kod sisara, koji se sastoji od davanja efektivne kolcine jedinjenja prema zahtevima 12, 16, 37, 41' 62, 66, 88 ili 92. 114. Metod za lecenje raka kod sisara koji se sastoji od davanja efektivne kolcine jedinjenja prema zahtevima 12, 16, 37, 41 , 62, 66, 88 ili 92. 115. Metod prema zahtevu 114. gde hemoterapeutski agens je bar jedan od 5-FU, CPT- 11 i Taxotere. 116. Metod modulacije bilo vaskulame permeabilnosti bilo isticanja plazme u sisara koja se sastoji od davanja efektivne kolcine jedinjenja prema zahtevima 12, 16, 37, 41, 62, 66, 88 ili 92. 117. Metod za lecenje lecenja bar jedne od ocnih neovaskulamih bolesti, gojaznosti, inflamacijskih bolesti, inflamacijskih poremecaja, ateroskleroze, endometrioze, neoplasticne bolesti, bolesti povezane s kostima, ili psorijaze u sisara koja se sastoji od davanja efektivne kol cine jedinjenja prema zahtevima 12, 16, 3 7, 41 , 62, 66, 88 ili 92. 00185 B 270Dos : 4544/18 PCT /US02/32657 Abstrakt : Ovaj pronalazak se odnosi na peptide koji se vezuju za Ang-2. Takode , ovaj pronalazak se odnosi na peptidna tela koja sadrže peptide, metod za proizvodnju takvih peptida i peptidnih tela i metod lecenja kojim se koriste ovakvi peptidi i peptidna tela. ADVO K ~T C~ ~ Bran~ lav El.IC r ovca1S ~~~069-406 -8~ ' 2 s- 377 00185 B 271"

Claims

1.Polipeptid sposoban da veže Ang-2 gde rečeni polipeptid sadrži amino kiselinsku sekvencu WDPWT (SEKV. ID. BR: 65) i gde rečeni polipeptid je od 5 do 50 amino kiselina u dužini, i njegove fiziološki prihvatljive soli.

2.Polipeptid sposoban da veže Ang-2 gde rečeni polipeptid sadrži amino kiselinsku sekvencu WDPWTC (SEKV. ID. BR: 66) i njegove fiziološki prihvatljive soli.

3. Polipeptid sposoban da veže Ang-2 gde rečeni polipeptid sadrži amino kiselinsku sekvencu Cz2WDPWT (SEKV. ID. NO: 67) gde z2 je kiseli ili neutralni polarni amino ostatak, i njegove fiziološki prihvatljive soli.

4. Polipeptid prema zahtevu 3, gde rečeni polipeptid koji još sadrži amino kiselinsku sekvencu Cz2WDPWTC (SEKV. ID. BR: 68)

5. Polipeptid sposoban da veže Ang-2 koji sadrži amino kiselinsku sekvencu formule: a1a2a3Ca5WDPWTCa12a13a14 (SEKV. ID. NO: 69) gde: a1, a2 i a3 su svaki za sebe amino kiselinski ostaci, a5 je amino kiselinski ostaci; a12 je odsutan ili je amino kiselinski ostatak; a13 je odsutan ili neutralan hidrofobni, neutralan polaran ili bazni amino kiselinski ostatak; a14 je neutralan hidrofobni ili neutralan polarni aminokiselinski ostatak; i njegove fiziološki prihvatljive soli.

6. Polipeptid prema zahtevu 5 gde: a1 je V, I, P, W, G, S, Q, N, E, K, R, ili H; a2 je V, P, M, G, S, Q, D, E, K, R, ili H; a3 je A, V, P, M, F, T, G, D, E, K, ili H; a1 je A, V, G, Q, N, D ili E; a2 je S, Q, N, D, E, K, ili R; a13 je L, T ili H; a14 je V, L, I, W ili M; i njegove fiziološki prihvatljive soli.

7. Polipepeptid prema zahtevu 5 gde: a1 je Q; a2 je E; a3 je E; a5 je D ili E; a2 je D ili E; a13 je H; i a14je M; i njegove fiziološki prihvatljive soli.

8. Polipeptid sposoban da vezuje Ang-2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu formule b1b2b3b4b5b6Cb8WDPWTCbI5b16b17b18b19b20 (SEKV. ID BR: 70) gde: b1 je odutan ili je jedan amino kiselinski ostatak; b2 je odsutan ili neutralan hidrofobni, neutralan polarni, ili bazni amino kiselinsk ostatak; b3, b4, b5 i b6 su svaki zasebno odsutni ili su to amino kiselinskiostaci; b8 je amino kiselinski ostatak; b15 je odsutan ili je aminokiselinski ostatak; b16je odsutan ili je neutralan hidrofobni, neutralan polarni ili bazni amino kiselinski ostatak; b17 je odsutan ili neutralan hidrofobni ili neutralan polarni amino kiselinski ostatak; b18, b19 i b20 su svaki zasebno odsutni ili amino kiselinski ostatak; i njihove fiziološki prihvatljive soli.

9. Polipeptid prema zahtevu 8 gde: b1 je odsutan ili je A, V, L, P, W, F, T, G, S, Q, N, K, R, ili H; b2 je odsutan ili je A, V, L, I, P, W, M, T, G, S, Y, N, K, R, iliH; b3 je odsutan ili je A, L, I, P, W, M, T, G, S, Q, N, E, R, ili H; b4 je V, I, P, W, G, S, Q, N, E, K, R, ili H; b5 je V, P, M, G, S, Q, D, E, K, R, ili H; b6 je A, V, P, M, F, T, G, D, E, K, ili H; ili njegove fiziološki prihvatljive soli.

10. Polipeptid prema zahtevu 8 gde: b1 je odutan ili je P, ili T; b2 je odsutan ili je I, ili N; b3 je odsutan R, ili I; b4 ili Q; b5 ili E; b6 je E; b8 je D ili E; b15 je D ili E; b16 je H; b17 je M; b18 je odsutan ili je W ili P; b19 je odsutan ili je G ili E; i b20 je odsutan ili je V ili K. i njegove fiziološki prihvatljive soli.

11. Polipeptid koji sadrži najmanje jednu amino sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEK ID BR: 4 i SEKV. ID BR: 76 do SEKV ID BR.: 118 zaključno, da rečeni polipeptid je sposoban da se vezuje za Ang-2 i njegove fiziološki prihvatljive soli.

12. Fuzioni polipeptid koji se sastoji od najmanje jednog peptida prema zahtevima 1, 5, 8 ili Ili nosača, gde rečeni fuzioni polipeptid je sposoban da se vezuje za Ang-2 i njegove fiziološki prihvatljive soli.

13. Fuzioni polipeptid prema zahtevu 12 gde rečeni nosač je najmanje jedan od Fc domena, polietilen glikol, lipid, grupa holesterola, ugljeni hidrat i jedan poljeaharid.

14. Polipeptid prema zahtevima 1, 5, 8 ili 11 koji je cikličan.

15. Dimer ili multimer polipeptida prema zahtevima 1, 5, 8 ili 11

16. Jedinjenje od interesa sa formulom: gde jedan ili više od P1, P2, P3 i P4 gde svaki nezavisno sadrži polipeptid odabran iz grupe koja se sastoji od: (a) amino kiselinske sekvence WDPWT(SEKV.ID BR: 65), gde rečeni polipeptid je dužine od 5 do 50 amino kiselina; (b) amino kiselinske sekvence WDPWTC (SEKV. ID BR: 66), (c) amino kiselinske sekvence Cz2WDPWT (SEKV. ID BR: 67), (d) amino kiselinske sekvence Cz2WDPWTC (SEKV ID BR : 68), gde z2 je kiseli ili neutralni polarni amino kiselinski ostatak; L1, L2, L3 i L4 su svaki nezavjeno kopče; i a, b, c, d, e, i f su svaki nezavjeno 0 ili 1, gde se podrazumeva da su bar jedan od a ili b jednaki 1; i njegove fiziološki prihvatljive soli.

17. Jedinjenje od interesa prema zahtevu 16 gde z2 je A,V, G, Q, N, D ili E.

18. Jedinjenje od interesa prema zahtevu 16 gde jedan ili više od P1, P2, P3 i P4 svaki nezavjeno koji sadrži polipeptid odabran iz grupe koja se sastoji od SEKV. ID BR : 4 i SEKV. ID BR: 76 do SEKV ID BR. 118 zaključno.

19. Jedinjenje od interesa, prema zahtevu 16 formule :

20. Jedinjenje od interesa, prema zahtevu 16 formule:

21. Jedinjenje od interesa, prema zahtevu 16 formule: njegove fiziološki prihvatljive soli.

22. Jedinjenje od interesa, prema zahtevu 16 formule: njegove fiziološki prihvatljive soli.

23.Jedinjenje od interesa, prema zahtevu 16 gde F1 je jedan Fc domen ili njegov fragment.

24.Jedinjenje od interesa, prema zahtevu 16 formule gde F1 sadrži amino kiselinsku sekvencu SEKV. ID. BR: 60.

25. Polinukleotid koji sadrži jedinjenje od interesa prema zahtevu 1, 5, 8 ili 11.

26. Ekspresioni vector koji sadrži polinukleotid iz zahteva 25.

27. Ćelija domaćin koja sadrži ekspresioni vector iz zahteva 26.

28. Ćelija domaćin prema zahtevu 17 gde je ta ćelija prokariotska.

29. Ćelija domaćin prema zahtevu 28 gde je ta ćelija E. coli ćelija.

30. Ćelija domaćin prema zahtevu 27 gde ta ćelija je eukariotska ćelija.

31. Polipeptid koji je u stanju da vezuje Ang-2 i koji sadrži jednu amino kiselinsku sekvencu formule: gde c2 je neutralni hidrofobni amino kiselinski ostatak c4je A, DiliE c6 je jedan aminokiselinski ostatak c7 je jedan amino kiselinski ostatak; i c8 je neutralni hidrofobni, neutralni polarni ili bazni amino kiselinski ostatak; i njegove fiziološki prihvatljive soli.

32. Polipeptid prema zahtervu 31 gde c2 je L ili M.

33. Polipeptid prema zahtevu 31 gde c6 je D ili E

34. Polipeptid sposoban da vezuje Ang-2 i koji sadrži jednu amino kiselinsku sekvencu formule: d1 d2d3 d4Pd6Dd8Ld1 °d11 d12L Yd15d16d17d18d19d20d21 d22 (SEKV ID BR: 72) gde: d1 je odsutan ili je amino kiselinski ostatak; d je odsutan ili je neutralan polarni, kiseli ili bazni amino kiselinski ostatak; d3 je odsutan ili je neutralan hidrofobni ili neutralni polarni amino kiselinski ostatak; d4 je odsutan ili je amino kiselinski ostatak; d6 je neutralan hidrofobni amino kiselinski ostatak; d8 je A, D ili E; d10 je jedan amino kiselinski ostatak; d11 je jedan amino kiselinski ostatak; gde c2 je neutralni hidrofobni amino kiselinski ostatak c4je A, DiliE c6 je jedan aminokiselinski ostatak c7 je jedan amino kiselinski ostatak; i c8 je neutralni hidrofobni, neutralni polarni ili bazni amino kiselinski ostatak; i njegove fiziološki prihvatljive soli. 32. Polipeptid prema zahtervu 31 gde c2 je L ili M. 33. Polipeptid prema zahtevu 31 gde c6 je D ili E 34. Polipeptid sposoban da vezuje Ang-2 i koji sadrži jednu amino kiselinsku sekvencu formule: d1 d2d3 d4Pd6Dd8Ld10d11 d12L Yd15d16d17d18d19d20d21 d22 (SEKV ID BR: 72) gde: d1 je odsutan ili je amino kiselinski ostatak; d je odsutan ili je neutralan polarni, kiseli ili bazni amino kiselinski ostatak; d3 je odsutan ili je neutralan hidrofobni ili neutralni polarni amino kiselinski ostatak; d4 je odsutan ili je amino kiselinski ostatak; d6 je neutralan hidrofobni amino kiselinski ostatak; d8 je A, D ili E; d10 je jedan amino kiselinski ostatak; d11 je jedan amino kiselinski ostatak; d12 je neutralan hidrofobni, neutralan polarni ili bazni amino kiselinski ostatak; d15 je odsutan ili neutralan polarni, kiseli ili bazni amino kiselinski ostatak; d16 je odsutan ili neutralan polarni, kiseli ili bazni amino kiselinski ostatak; d17je odsutan ili neutralni hidrofobni ili neutralan polarni amino kiselinski ostatak d18je odsutan ili neutralan hidrofobni ili neutralan polarni amino kiselinski ostatak d19 je odsutan ili neutralan hidrofobni, neutralan polarni ili bazni amino kiselinski ostatak; d20 je odsutan ili je jedan amino kiselinski ostatak; d21 je odsutan ili neutralan polarni, kiseli ili bazni amino kiselinski ostatak; d22 je odsutan ili neutralan hidrofobni, neutralan polarni ili bazni amino kiselinski ostatak; i njegove fiziološki prihvatljive soli.

35. Polipeptid prema zahtevu 34 gde: dljeT,S,Q,R,orH; d2 je T, Q,N, orK; d3 je F; d4 je M, Q, E, orK; d6je L ili M; d8 je D ili E; d10 je E; d 11 je Q ili E; d12jeT ili R; d15Y,D,E,ili K; d'6je Q; d17 je W ili F; dl8je L, I, M, ili T; dI9jeL,F,ili Y; d2° je Q, D, ili E; d21 je odsutan ili je Q, ili H; d22je odsutan ili je A, L, G, S, ili R; i njegove fiziološki prihvatljive soli.

36. Polipeptid koji se sastoji od najmanje jedne amino kiselinske sekvence odabrane iz grupe koja se sastoji od SEKV ID BR: 6 i SEKV ID BR: 119 do SEKV ID BR: 142 zaključno, gde rečeni polipeptid je u stanju da se vezuje za Ang-2 i njegove fiziološki prihvatljive soli;

37. Fuzioni polipeptid koji sadrži najmanje jedan peptid prema zahtevima 31, 34 ili 36 i nosač, gde rečeni fuzioni polipeptid je u stanju da se vezuje za Ang-2 i njegove fiziološki prihvatljive soli.

38. Fuzioni polipeptid prema zahtevu 37 gde rečeni nosač je najmanje jedan iz Fc domena, polietilen glikol, lipid, holesterol grupa, ugljeni hidrat ijedan oligosaharid.

39. Polipeptid prema zahtevu 31, 34 ili 36 koji je cikličan.

40. Dimer ili multimer polipeptida prema zahtevu 31, 34 ili 36.

41. Jedinjenje od interesa sa formulom : (X1)a-F1-(X2)b i njegovi multimeri, gde : F1 je nosač; X1 i X2 su svaki nezavisno odabrani od : - (L1)c-P1; - (L1)c-P1-(L2)d-P2-(L3)e-P3; i - (L'je-P’-CLV P2-(L3)e-P3-(L4)rP4; gde jedan ili više od P1, P“, PJ i P4 svaki zasebno sadrži polipeptid prema zahtevu 31, 34 ili 36; L', L2, L3 i L4 su svaki zasebno linkovi a, b, c, d, e i f su svaki zasebno 0 ili 1 pod uslovom daje bar jedan od a ili b jednak 1.

42. Jedinjenje od interesa prema zahtevu 41 gde jedan ili više od P1, P2, P3 i P4 svaki zasebno sadrži polipeptid odabran iz grupe koja se sastoji od SEKV. ID BR.:6 i SEKV ID BR: 119 do SEKV ID BR : 142 zaključno.

43. Jedinjenje od interesa prema zahtevu 41 formule : njihove fiziološki prihvatljive soli.

44. Jedinjenje od interesa prema zahtevu 41 formule : njegove fiziološki prihvatljive soli.

45. Jedinjenje od interesa prema zahtevu 41 formule : njegove fiziološki prihvatljive soli.

46. Jedinjenje od interesa prema zahtevu 41 formule : njegove fiziološki prihvatljive soli.

47. Jedinjenje od interesa prema zahtevu 41, gde F1 je Fc domen ili njegov fragment.

48. Jedinjenje od interesa prema zahtevu 41 gde F1 sadrži amino kiselinsku sekvencu SEKV ID BR : 60.

49. Polinukleotid koji kodira polipeptid prema bilo kom od zahteva 31, 34 ili 36.

50. Ekspresioni vector koji sadrži polinukleotid prema zahtevu 49.

51. Ćelija domaćin koja sadrži ekspresioni vector prema zahtevu 50.

52. Ćelija domaćin prema zahtevu 51 gde je ta ćelija prokariotska ćelija.

53. Ćelija domaćin prema zahtevu 52 gde je ta ćelija E. coli ćelija.

54. Ćelija domaćin prema zahtevu 51 gde je ta ćelija eukariotska ćelija.

55. Polipeptid koji je u stanju da vezuje Ang-2 i koji sadrži amino kiselinsku sekvencu formule : gde e3 je neutralan polarni amino kiselinski ostatak; e4 je kiseo amino kiselinski ostatak; e5 je neutralan polarni ili kiseli amino kiselinski ostatak; e6 je neutralni hidrofobni amino kiselinski ostatak; e7 je neutralni hidrofobni amino kiselinski ostatak; i njegove fiziološki prihvatljive soli.

56. Polipeptid prem azahtevu 55 gde e3 je Y ili C.

57. Polipeptid prema zahtevu 55 gde e4 je D ili E.

58. Polipeptid prema zahtevu 55 gde e6 je I ili M.

59. Polipeptid koji je u stanju da vezuje Ang-2 i koji sadrži amino kiselinsku sekvencu formule : gde, f1 je neutralan hidrofobni ili neutralan polarni amino kiselinski ostatak; f2 je neutralni hidrofobni ili neutralan polarni amino kiselinski ostatak; f3 je neutralan polarni ili kiseli amino kiselinski ostatak; f4 je neutralni hidrofobni ili neutralni polarni amino kiselinski ostatak; f7 je neutralni polarni amino kiselinski ostatak; f je kiseli amino kiselinski ostatak; f je neutralni polarni ili kiseli amino kiselinski ostatak; f10 je neutralan hidrofobni amino kiselinski ostatak; f11 je neutralan hidrofobni amino kiselinski ostatak; f13 je neutralan hidrofobni ili neutralan polarni amino kiselinski ostatak; f14 je neutralni hidrofobni ili neutralan polarni amino kiselinski ostatak; f15 je neutralan polarni amino kiselinski ostatak; f16 je neutralan polarni amino kiselinski ostatak; f17je neutralan polarni ili kiseli amino kiselinski ostatak; f18je neutralni hidrofobni ili bazni amino kiselinski ostatak; f19 je neutralni hidrofobni ili neutralni polarni amino kiselinski ostatak;i f20 je neutralni hidrofobni ili neutralan polarni amino kiselinski ostatak; i njihove fiziološki prihvatljive soli.

60. Polipeptid prema zahtevu 59 gde: f1 je S, A ili G; f2 je G, Q ili P; f5 je Q, G ili D; f4 je L, M ili Q; f7je C ili Y; f8 je E ili D; f9 je E, G ili D; f'° je I ili M; f11 je F ili L; f13 je Čili W; f14 je G ili P; f15je T ili N; f16 je Q, Y, ili K; f17 je N,D ili Q; f18 je L, V, Wili R; f19 je A, Q, Y ili I; i f*°je L, A, G ili V i njegove fiziološki prihvatljive soli.;

61. Polipeptid koji sadrži najmanje jednu amino kiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEKV ID BR: 3 i SEKV ID BR: 143 do SEKV ID BR: 148 zaključno, gde rečeni polipeptid je u stanju da se vezuje za Ang-2 i njegove fiziološki prihvatljive soli;;

62. Fusioni polipeptid koji sadrži najmanje jedan polipeptid prema zahtevima 55, 59 ili 61 i nosač, gde rečeni fusioni polipeptid je u stanju da vezuje Ang-2, i njegove fiziološki prihvatljive soli.;

63. Fusioni polipeptid prema zahtevu 62 gde rečeni nosač je bar jedan od Fc domena, polietilen glikol, lipid, holesterol grupa i jedan oligosaharid.;

64. Polipeptid prema zahtevu 55, 59 ili 61 koji je cikličan.;

65. Dimer ili multimer jedinjenja prema zahtevima 55, 59 ili 61.;

66. Jedinjenje od interesa formule: i njegovi multimeri, gde : F'je nosač; 1*2 . X i X su svaki nezavisno odabrani od -(L1)c-P1; -(L1 )C-P1-(L2)d-P2; -(L1 )C-P1-(L2)d-P2-(L3)e-P3; -(L1 )C-P1 -(L2)d-P2-(L3)e-P3-(L4)f-P4; gde jedan ili više od P1, P2, P3 i P4 svaki nezavisno sadrži polipeptid prema zahtevu 55, 59 ili 61; L , L2, L3 i L4 su svaki nezavisno linkovi; i a, b, c, d, e i f su svaki nezavisno 0 ili 1, pod uslovom da bar jedan od a ili bje jednak jedan; i njegove fiziološki prihvatljive soli.

67. Jedinjenje od interesa prema zahtevu 66 gde jedan ili više od P7, P2, P3 i P4 od kojih svaki nezavisno sadrži polipeptid odabran iz grupe koja se sastoji od SEKV. ID. BR : 3 i SEKV ID BR: 143 do SEKV ID BR : 148 zaključno.

68. Jedinjenje od interesa prema zahtevu 66 formule : njegove fiziološki prihvatljive soli.

69. Jedinjenje od interesa prema zahtevu 66 formule : njegove fiziološki prihvatljive soli.

70. Jedinjenje od interesa prema zahtevu 66 formule :

71. Jedinjenje od interesa prema zahtevu 66 formule : i njegove fiziološki prihvatljive soli.

72. Jedinjenje prema zahtevu 66 gde F1 je jedan Fc domen ili njegov fragment.

73. Jedinjenje od interesa prema zahtevu 66 gde F1 sadrži amino kiselinsku sekvencu SEKV ID BR : 60

74. Poinukleotid koji kodira polipeptid prema bilo kojem od zahteva 55, 59 ili 61

75. Ekspresioni vektor koji sadrži polinukleotid prema zahtevu 74.

76. Ćelija domaćin koja sadrži ekspresioni vektor prema zahtevu 75.

77. Ćelija domaćin prema zahtevu 76 gde je to prokariotska ćelija.

78. Ćelija domaćin prema zahtevu 77 gde je ta ćelija E. coli ćelija.

79. Ćelija domaćin prema zahtevu 76 gde je to eukariotska ćelija.

80. Polipeptid sposoban da vezuje Ang-2 koji sadrži amino kiselinsku sekvencu formule: gde g2 je amino kiselinski ostatak; g4 je neutralan hidrofobni amino kiselinski ostatak; g5 je E,D, ili Q; g10 je neutralan hidrofobni ili neutralan polarni amino kiselinski ostatak; g13 je kiselinski ostatak; i njegove fiziološki prihvatljive soli.

81. Polipeptid prema zahtevu 80 gde g2 je E ili D.

82. Polipeptid prema zahtevu 80 gde g4 je V ili M.

83. Polipeptid prema zahtevu 80 gde g10 je F ili Q.

84. Polipeptid prema zahtevu 80 gde g13 je D ili E.

85. Polipeptid sposoban da vezuje Ang-2 koji sadrži amino kiselinsku sekvencu formule : gde h2 je neutralan hidrofobni ili neutralni polarni amino kiselinski ostatak; h3 je amino kiselinski ostatak; h4 je neutralni hidrofobni ili neutralni amino kiselinski ostatak; h6 je amino kiselinski ostatak; h8 je neutralni hidrofobni amino kiselinski ostatak; h9 je E, D ili Q; h14 je neutralni hidrofobni ili neutralni polarni amino kiselinski ostatak; hl7je kiseli amino kiselinski ostatak; h18 je neutralni hidrofobni, neutralan polarni ili bazni amino kiselinski ostatak; h19 je neutralni hidrofobni ili neutralan polarni amino kiselinski ostatak; i h20 je odsutan ili je amino kiselinski ostatak; i njegove fiziološki prihvatljive soli.

86. Polipeptid prema zahtevu 85 gde : h1 je odsutan ili A, L, M, G, K ili H h2 je L,F ili Q; h3 je D ili E; h4 je W ili Y; h6 je D ili E; h8 je Vili M; h14 je F ili Q; h17je D ili E; h18 je M, Y, N, ili K; h19 je L ili Q; i h20je odsutan ili M, T, G, S,D, K ili R; i njegove fiziološki prihvatljive soli.

87. Polipeptid koji sadrži najmanje jednu amino kiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEKV. ID BR : 5, i SEKV. ID BR : 149 do SEKV ID BR : 157 zaključno, gde rečeni polipeptid je u stanju da se vezuje za Ang-2 i njegove fiziološki prihvatljive soli;

88. Fuzioni polipeptid koji sadrži najmanje jedan peptid prema zahtevu 80, 85 ili 87 i nosač, gde rečeni fuzioni polipeptid je u stanju da vezuje Ang-2 i njegove fiziološki prihvatljive soli.

89. Fuzioni polipeptid prema zahtevu 88 gde rečeni nosač je najmanje jedan Fc domen, polietilen glikol, lipid, holesterol grupa, ugljeni hidrat ijedan oligosaharid.

90. Polipeptid prema zahtevu 80, 85 ili 87 koji je cikličan.

91. Dimer ili multimer polipeptida prema zahtevima 80,85 ili 87.

92. Jedinjenje od interesa formule : (X1)a-F1-(X2)b i njegovi multimeri, gde: F1 je nosač; X1 i X2 su svaki nezavisno odabrani od -(L1)c-P1; -(L1)C-P1 -(L2)d-P2; -(L1 )C-P1 -(L2)d-P2-(L3)e-P3; -(L1)c-P 1 -(L2)d-P2-(L3)e-P3-(L4)f-P4; gde jedan ili više od P1, P2, P3 i P4 svaki nezavisno sadrži polipeptid prema zahtevu 80, 85 ili 87; L1, L2, L3 i L4 su svaki nezavisno linkovi; i a, b, c, d, e i f su svaki nezavisno 0 ili 1, pod uslovom da najmanje jedan od a i bje jednak jedan; i njegove fiziološki prihvatljive soli. a, b, c, d, e i f su svaki nezavisno 0 ili 1, pod uslovom da najmanje jedan od a i bje jednak jedan; i njegove fiziološki prihvatljive soli.

93. Jedinjenje od interesa prema zahtevu 92 gde jedan ili vise od P1, P2, P3 i P4 nezavisno jedan od drugoga sadrže polipeptid odabran iz grupe koja se sastoji od SEKV ID BR : 5 i SEKV ID BR : 149 do SEKV ID BR: 157 zaključno.

94. Jedinjenje od interesa prema zahtevu 92 formule : i njegove fiziološki prihvatljive soli.

95. Jedinjenje od interesa prema zahtevu 92 formule : i njegove fiziološki prihvatljive soli.

96. Jedinjenje prema zahtevu 92 formule : i njegove fiziološki prihvatljive soli.

97. Jedinjenje od interesa prema zahtevu 92 formule : i njegove fiziološki prihvatljive soli.

98. Jedinjenje prema zahtevu 92 gde F1 je jedan Fc domen ili njegov fragment.

99. Jedinjenje od interesa prema zahtevu 92 gde F1 sadrži amino kiselinsku sekvencu SEKV. ID BR : 60

100. Polinukleotid encoding polipeptid prema bilo kojem od zahteva 80, 85 ili 87.

101. Ekspresioni vektor koji sadrži polinukleotid prema zahtevu 100.

102. Ćelija domaćin koja sadrži ekspresioni vektor prema zahtevu 101.

103. Ćelija domaćin prema zahtevu 102 gde je ta ćelija prokariotska ćelija.

104. Ćelija domaćin prema zahtevu 103 gde je ta ćelija E.Coli ćelija.

105. Ćelija domaćin prema zahtevu 102 gde je ta ćelija eukariotska ćelija.

106. Polipeptid prema jednoj od SEKV ID BR: 1, SEKV ID BR: 2, SEKV ID BR: 3, ili SEKV ID BR: 4 ili njegove varijante.

107. Polipeptid prema jednoj od SEKV. ID BR: 5, SEKV. ID BR : 6, ili SEKV ID BR : 7 ili njegove varijante.

108. Jedinjenje od interesa formule : i njegovi multimeri, gde : F1 je nosač; X1 i X2 su svaki nezavisno odabrani od : -(L')s-P1; ~(L1 )S-P1 -(L^)t-P^; -(L1)s-P1-(L2)t-P2-(L3)u-P3; i -(L1 )S-P1 -(L2)t-P2-(L3)U-P3-(L4)V-P4; gde jedan ili više od P1, P2, P3 i P4 svaki nezavisno sadrži polipeptid odabran iz grupe koja se sastoji od : (a) amino kiselinska sekvenca WDPWT (SEKV ID BR:65), gde rečeni polipeptid je dužine od 5 do 50 amino kiselina. (b) amino kiselinska sekvenca WDPWTC (SEKV. ID BR: 66); (c) amino kiselinska sekvenca Cz2WDPWT (SEKV: ID BR: 67), gde z2 je kiseli ili neutralni polarni amino kiselinski ostatak; (d) amino kiselinska sekvenca Cz2WDPWTC (SEKV ID BR: 68), gde z2 je jedan kiseli ili neutralni polarni amino kiselinski ostatak; (e) amino kiselinska sekvenca Pc2Dc4Lc6c7c8LY (SEKV. ID BR : 71) gde c2 je neutralni hidrofobni amino kiselinski ostatak; c4 je A, D ili E; c6 je amino kiselinski ostatak; c7 je amino kiselinski ostatak; i c8 je neutralan hidrofobni, neutralan polarni ili bazni amino kiselinski ostatak; (f) amino kiselinska sekvenca RPe3e4e5e6e7G (SEKV. ID BR: 73) gde e3 je neutralan polarni amino kiselinski ostatak; e4 je jedan kiseli amino kiselinski ostatak; e5 je neutralni polarni ili kiseli amino kiselinski ostatak; e6 je neutralni hidrofobni amino kiselinski ostatak; i e7 je neutralni hidrofobni amino kiselinski ostatak; (g) amino kiselinska sekvenca Cg2Gg4g;,DPFTg10GCg13 (SEKV. ID BR. 75) gde g2 je jedan amino kiselinski ostatak; g4 je neutralan hidrofobni amino kiselinski ostatak; g5 je neutralni polarni ili jedan kiseli amino kiselinski ostatak; g10 je neutralni hidrofobni ili neutralni polarni amino kiselinski ostatak; i g13 je amino kiselinski ostatak; (h) Polipeptid SEKV. ID BR : 1; (i) Polipeptid SEKV: ID BR : 2; i 0) Polipeptid SEKV: ID BR : 7 L1, L2, L3 i L4 su svaki nezavisno linkovi; i q, r, s, t, u i v su svaki nezavisno 0 ili 1, pod uslovom daje bar jedan od q ili r jednak 1; i njegove fiziološki prihvatljive soli.

109. Farmaceutski oblik koji sadrži efikasnu količinu jedinjenja prema zahtevima 1,31, 55 ili 80 u dodatnoj smeši sa farmaceutski prihvatljivim nosačem.

110. Metod za inhibiciju neželjene angiogeneze kod sisara koji podrazumeva davanje terapeutski efektivne doze jedinjenja prema zahtevima 12, 16, 37, 41, 62, 66, 88 ili 92.

111. Metod za lečenje aniogeneze kod subjekta, gde rečeni metod se sastoji od davanja efektivne kolčine jedinjenja prema zahtevima 12, 16, 37, 41, 62, 66, 88 ili 92.

112. Metod modulacije angiogeneze kod sisara koji se sastoji od davanja efektivne kolčine jedinjenja prema zahtevima 12, 16, 37, 41, 62, 66, 88 ili 92.

113. Metod za inhibiciju rasta tumora karakterističan po neželjenoj angiogenezi kod sisara, koji se sastoji od davanja efektivne kolčine jedinjenja prema zahtevima 12, 16, 37, 41,62, 66, 88 ili 92.

114. Metod za lečenje raka kod sisara koji se sastoji od davanja efektivne kolčine jedinjenja prema zahtevima 12, 16, 37, 41, 62, 66, 88 ili 92.

115. Metod prema zahtevu 114. gde hemoterapeutski agens je bar jedan od 5-FU, CPT-11 i Taxotere.

116. Metod modulacije bilo vaskulame permeabilnosti bilo isticanja plazme u sisara koja se sastoji od davanja efektivne kolčine jedinjenja prema zahtevima 12, 16, 37, 41, 62, 66, 88 ili 92.

117. Metod za lečenje lečenja bar jedne od očnih neovaskulamih bolesti, gojaznosti, inflamacijskih bolesti, inflamacijskih poremećaja, ateroskleroze, endometrioze, neoplastične bolesti, bolesti povezane s kostima, ili psorijaze u sisara koja se sastoji od davanja efektivne kolčine jedinjenja prema zahtevima 12, 16, 37, 41, 62, 66, 88 ili 92.