MX2008015263A - Uso de proteinas y pepetidos de la superfamilia del factor beta transformador de crecimiento para purificacion y metodos terapeuticos. - Google Patents

Abstract

Miembros de la superfamilia de TGF-ß y fragmentos peptídicos basados en proteínas miembro se emplean para purificar soluciones que contienen proteínas miembro o como productos terapéuticos.

Description

USO DE PROTEINAS Y PEPTIDOS DE LA SUPERFAMILIA DEL FACTOR BETA TRANSFORMADOR DE CRECIMIENTO PARA PURIFICACION Y METODOS TERAPEUTICOS Campo de la Invención Esta invención se refiere al uso de péptidos y proteínas de la Superfamilia del Factor ß Transformador de Crecimiento (TGF-ß , por sus siglas en inglés) y sus mutantes . Antecedentes de la Invención Los reguladores naturales del crecimiento, diferenciación y función celular han proporcionado importantes herramientas farmacéuticas, clínicas y de laboratorio y objetivos para intervención terapéutica. Se ha mostrado que una variedad de estos reguladores tienen efectos profundos en las rutas de desarrollo y diferenciación celular, básica. La superfamilia del factor beta transformador de crecimiento (TGF-ß) es una gran familia de proteínas multifuncionales que regulan una variedad de funciones celulares que incluyen proliferación, migración, diferenciación y apoptosis celular. El TGF-ß, el miembro fundador, se ha mostrado que juega una variedad de papeles que varían desde formación de patrón embriónico a regulación de crecimiento celular .en tejidos de adulto. El TGF-ß ejerce sus funciones biológicas por cascadas de transducción de señal que activan y/o suprimen finalmente la expresión de un conjunto de genes específicos. Otros REF . : 198657 miembros de la superfamilia de TGF-ß incluyen la familia de TGF-ß, factores de diferenciación de crecimiento (GDF) , activinas, inhibinas, Proteínas Morfogénicas Óseas (BMP) , y otros ligandos relacionados. Es importante la transduccion de señales mediada por BMP para una variedad de procesos normales, que incluyen crecimiento óseo y la función del sistema nervioso, ojos y órganos tal como ríñones. Las BMP tienen diversas actividades biológicas en diferentes contextos biológicos, incluyendo la inducción de cartílago, hueso y tejido conectivo, en papeles en el desarrollo del riñon, dientes, intestino, piel y pelo. Se pueden producir BMP en el laboratorio, sin embargo, hay pocos procedimientos convenientes para la purificación de estos materiales y el desarrollo de métodos de purificación frecuentemente ha sido ad hoc y consumidor de tiempo, con los procesos de purificación que toman algunas veces hasta 6 meses en desarrollarse. Por consiguiente, es deseable tener métodos más eficientes para purificar BMP y otros miembros de la superfamilia de TGF-ß. Definiciones Como se usa en-.la presente y en las reivindicaciones anexas, las formas singulares "un", "una", y "el (la)" incluyen las referencias plurales a menos que el contexto indique claramente otra cosa. De esta manera, por ejemplo, una referencia a "una célula" incluye una pluralidad de estas células, y una referencia a "un anticuerpo" es una referencia a uno o más anticuerpos y equivalentes de los mismos conocidos por aquellos expertos en la técnica, y asi sucesivamente. Los términos "polinucleótido" , "secuencia de nucleótidos" , "ácido nucleico", "molécula de ácido nucleico", "secuencia de ácido nucleico", y "oligonucleótido" se refieren a una serie de bases de nucleótidos (también llamados "nucleótidos") en el ADN y ARN, y significan cualquier cadena de dos o más nucleótidos. Los polinucleótidos pueden ser mezclas quiméricas o derivados o versiones modificadas de los mismos, de hebra individual o de doble hebra. El oligonucleótido se puede modificar en la porción base, en la porción de azúcar, o en la estructura de fosfato, por ejemplo, para mejorar la estabilidad de la molécula, sus parámetros de hibridación, etc. El oligonucleótido antisentido puede comprender una porción base modificada que se seleccione del grupo que incluye pero no se limita a 5-fluorouracilo, 5-bromouracilo, 5-clorouracilo, 5-yodouracilo, hipoxantina, xantina, 4-acetilcitosina, 5- ( carboxihidroxilmetil ) uracilo, 5-carboximetilaminometil-2-tiouridina, 5-carboximetilaminometiluracilo,. dihidrouracilo, beta-D-galactosilqueosina, inosina, ?ß-isopenteniladenina, 1-metilguanina, 1-metilinosina, 2, 2-dimetilguanina, 2-metiladenina, 2-metilguanina, 3-metilcitosina, 5-metilcitosina, N6-adenina, 7-metilguanina, 5- metilaminometiluracilo, 5-metoxiaminometil-2-tiouracilo, beta-D-mannosilqueosina, 51 -metoxicarboximetiluracilo, 5-metoxiuracilo, 2-metiltio-N6-isopenteniladenina, wybutoxosina, pseudouracilo, queosina, 2-tiocitosina, 5-metil-2-tiouracilo, 2-tiouracilo, 4-tiouracilo, 5-metiluracilo, éster metílico del ácido uracil-5-oxiacético, ácido uracil-5-oxiacético, 5-metil-2-tiouracilo, 3- ( 3-amino-3-N-2-carboxipropil ) uracilo, y 2,6-diaminopurina . Una secuencia de nucleótidos tiene típicamente información genética, que incluye la información usada por la maquinaria celular para elaborar proteínas y enzimas. Estos términos incluyen ADNc genómico de doble hebra o de hebra individual, ARN, cualquier polinucleótido sintético y genéticamente manipulado, y polinucleótidos tanto homosentido como antisentido. Esto incluye moléculas de doble hebra y de hebra individual, es decir, ADN-ADN, ADN-ARN e híbridos de ARN-ARN, así como "ácidos nucleicos de proteína" (PNA) formados al conjugar bases a una estructura de aminoácidos. Esto también incluye ácidos nucleicos que contienen bases modificadas, por ejemplo, tio-uracilo, tío-guanina, y fluoro-uracilo, o que contienen carbohidrato, o lípidos. Se pueden sintetizar polinucleótidos para el uso con modalidades de la invención por métodos normales conocidos en la técnica, por ejemplo, por el uso de un sintetizador automatizado de ADN (tal como aquellos que están comercialmente disponibles de Bioserach, Applied Biosystems, etc.). Como ejemplos, se pueden sintetizar oligonucleótidos de fosforotioato por el método de Stein et al., Nucí. Acids. Res., 16, 3209, (1988), se pueden preparar oligonucleótidos de metilfosfonato por el uso de soportes poliméricos de vidrio con poros controlados (Sarin et al., Proc. Nati. Acad. Sci. EUA, 85, 7448-7451, (1988), etc. Se han desarrollado varios métodos para distribuir ADN antisentido o ARN a las células, por ejemplo, se pueden inyectar moléculas antisentido directamente en el sitio de tejido, o moléculas antisentido modificadas, diseñadas para seleccionar como objetivo las células deseadas (antisentido enlazado a péptidos o anticuerpos que se unen de manera especifica a receptores o antigenos expresados en la superficie celular objetivo) se pueden administrar de manera sistémica. De manera alternativa, se pueden generar moléculas de ARN por trascripción in vitro e in vivo de secuencias de ADN que codifican para la molécula de ARN antisentido. Estas secuencias de ADN se pueden incorporar en una amplia variedad de vectores que incorporan promotores adecuados de ARN-polimerasa tal como los promotores de polimerasa T7 o SP6. De manera alternativa, se pueden introducir de manera estable en las lineas celulares las construcciones antisentido de ADNc que sintetizan constitutiva o induciblemente ARN antisentido, dependiendo del promotor usado. Sin embargo, frecuentemente es difícil lograr concentraciones intracelulares del antisentido suficiente para suprimir la traducción de los ARNm endógenos. Por lo tanto, un planteamiento preferido utiliza una construcción recombinante de ADN en la cual se coloca el oligonucleótido antisentido bajo el control de un promotor fuerte. El uso de esta construcción para transfectar células objetivo en el paciente dará por resultado la trascripción de cantidades suficientes de ARN de hebra individual que formarán pares de bases complementarias con los transcriptos endógenos del gen objetivo e impedirán de este modo la traducción del ARNm del gen objetivo. Por ejemplo, se puede introducir in vivo un vector tal que se tome por una célula y dirijan la trascripción de un ARN antisentido. Este vector puede permanecer episomal o llegar a ser cromosomáticamente integrado, en tanto que se pueda transcribir para producir el ARN antisentido deseado. Estos vectores se pueden construir por métodos de tecnología de ADN recombinante, común en la técnica. Los vectores pueden ser plásmidos, virales u otros conocidos en la técnica, usados para replicación y expresión en células de mamífero. La expresión de la secuencia que codifica para el ARN antisentido puede ser cualquier promotor conocido en la técnica para actuar en células de mamífero, preferentemente de humano. Estos promotores pueden ser inducibles o constitutivos. Estos promotores incluyen pero no se limitan a: la región promotora temprana de SV40 (Bernoist y Chambón, Nature, 290, 304-310, (1981) , el promotor contenido en la repetición terminal larga 3' del virus de sarcoma de Rous, Yamamoto et al., Cell, 22, 787-797, (1980), el promotor de timidina-cinasa de herpes, Wagner et al., Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 78, 1441-1445, (1981), las secuencias reguladoras del gen de metalotioneina Brinster et al., Nature 296, 39-42, (1982) , etc. Se puede usar cualquier tipo de plásmido, cósmido, vector viral o cromosoma artificial de levadura para preparar la construcción de ADN recombinante que se puede introducir directamente en el sitio de tejido. De manera alternativa, se pueden usar vectores virales que infectan selectivamente el tejido deseado, caso en el cual se puede lograr la administración por otra ruta (por ejemplo, de manera sistémica) . Los polinucleótidos se pueden flanquear por secuencias reguladoras naturales (control de expresión) , o se pueden asociar con secuencias heterólogas, incluyendo promotores, sitios de entrada de ribosoma internos (IRES) y otras secuencias de sitios de unión de ribosoma, intensificadores, elementos de respuesta, supresores, secuencias de señal, secuencias de poliadenilación, intrones, regiones no codificantes 5' y 3', y similares. -. Los ácidos nucleicos también se pueden modificar por muchos medios conocidos en la técnica. Los ejemplos no limitantes de estas modificaciones incluyen metilación, "tapas", sustitución de uno o más de los nucleótidos que se presentan de manera natural con un análogo, y modificaciones internucleótido tal como por ejemplo, aquéllas con enlaces no cargados (por ejemplo, fosfonatos de metilo, fosfotriésteres, fosforoamidatos, carbamatos, etc.) y con enlaces de carga (por ejemplo, fosforotioatos, fosforoditioatos, etc.). Los polinucleótidos pueden contener una o más porciones adicionales covalentemente enlazadas, tal como por ejemplo, proteínas (por ejemplo, nucleasas, toxinas, anticuerpos, péptidos de señal, poli-L-lisina, etc.), intercaladores (por ejemplo, acridina, psoralen, etc.), queladores (por ejemplo, metales, metales radioactivos, hierro, metales oxidativos, etc.), y alquiladores. Los polinucleótidos se pueden derivatizar por formación de un metil- o etil-fosfotriéster o un enlace de alquil-fosforamidato . Adicionalmente, los polinucleótidos en la presente también se pueden modificar con una marca capaz de proporcionar una señal detectable, ya sea de manera directa o indirecta. Las marcas de ejemplo incluyen radioisótopos, moléculas fluorescentes, biotina, y similares. "identidad" o "similitud", como se conocen en la técnica, son relaciones entre dos o más polipéptidos o dos o más secuencias de polinucleótidos como se determina al comparar las secuencias. En la técnica, identidad también significa el grado de relación de secuencia entre las secuencias de polipéptido como se determina por la correspondencia entre cadenas de estas secuencias. Se pueden calcular fácilmente tanto la identidad como la similitud por métodos conocidos tal como aquellos descritos en: Computational Molecular Biology, Lesk, A. . , ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing : Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, New York, 1993/ Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A. M., y Griffin, H. G., eds . , Humana Press, New Jersey, 1994; and Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. y Devereux, J. , Eds., M Stockton Press, New York, 1991. Los métodos comúnmente empleados para determinar identidad o similitud entre secuencias incluyen, pero no se limitan a, aquéllos descritos en Carillo, H., y Lipman, D., SIAM J Applied Math., 48:1073 (1988). Los métodos para determinar identidad y similitud se codifican en programas de computadora públicamente disponibles. Los métodos de programa de computadora preferidos para determinar identidad y similitud entre dos secuencias incluyen, pero no se limitan a, paquete de programa GCG, Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research, 12(1), 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, y FASTA Atschul, S. F. et al., J olec. Biol., 215, 403 (1990)). "Homólogos" se refiere al grado de similitud de secuencia entre dos polímeros (es decir, moléculas de polipéptido o moléculas de ácido nucleico) . Las cifras del porcentaje de homología referidas en la presente reflejan la máxima homología posible entre los dos polímeros, es decir, el por ciento de homología cuando los dos polímeros se alinean de este modo para tener el número más grande de posiciones correspondidas (homologas) . El término "por ciento de homología" se refiere al grado de identidad de secuencia de aminoácidos entre polipéptidos . La homología entre cualquiera de dos polipéptidos es una función directa del número total de correspondencia de aminoácidos en una posición dada en cualquier secuencia, por ejemplo, si la mitad del número total de aminoácidos en cualquiera de las secuencias es el mismo entonces las dos secuencias se dice que exhiben 50 % de homología . El término "fragmento", "análogo", y "derivado" cuando se refiere a polipéptidos se refiere a un polipéptido que puede retener esencialmente la misma función o actividad biológica como el polipéptido original. De esta manera, un análogo puede incluir una proteína precursora que se puede activar por escisión de la porción de proteína precursora para producir un polipéptido maduro activo. El fragmento, análogo, o derivado del polipéptido puede ser uno en el cual se sustituyen uno o más de los aminoácidos con residuos de aminoácido conservados o no conservados y estos residuos de aminoácido pueden ser o no los codificados por el código genético, o aquéllos en los cuales uno o más de los residuos de aminoácido incluye un grupo sustituyente, o aquéllos en los cuales el polipéptido se fusiona con un compuesto tal como polietilenglicol para incrementar la vida media del polipéptido, o aquéllos en los cuales se fusionan aminoácidos adicionales al polipéptido tal como un péptido de señal o una secuencia tal como marca de polihistidina que se emplea para la purificación del polipéptido o la proteina precursora. Estos fragmentos, análogos, o derivados se juzgan que están dentro del alcance de la presente invención. El término "polipéptido" se refiere a un polímero de aminoácidos sin considerar la longitud del polímero; de esta manera, "péptidos", "oligopéptidos" , y "proteínas" se incluyen dentro de la definición de polipéptido y se usan de manera indistinta en la presente. Este término tampoco especifica ni excluye modificaciones químicas o de post-expresión de los polipéptidos de la invención, aunque se pueden incluir o excluir modificaciones químicas o de post-expresión de estos polipéptidos, como modalidades específicas. Por lo tanto, por ejemplo, las modificaciones a polipéptidos que incluyen la unión covalente de grupos glicosilo, grupos acetilo, grupos fosfato, grupos lípido y similares se abarcan de manera expresa por el término polipéptido. Adicionalmente , los polipéptidos con estas modificaciones se pueden especificar como especies individuales que se incluyen o excluyen en la presente invención. Las modificaciones naturales o químicas diferentes, tal como aquéllas listadas en los ejemplos anteriores pueden presentarse en otra parte del polipéptido, incluyendo la estructura peptidica, las cadenas secundarias de aminoácidos y los términos amino o carboxilo. Se apreciará que puede estar presente el mismo tipo de modificación en el mismo grado o grado variable en varios sitios en un polipéptido determinado. También, un polipéptido determinado puede contener muchos tipos de modificaciones. Los polipéptidos pueden estar ramificados, por ejemplo, como resultado de la ubiquitinacion, y pueden ser cíclicos, con o sin ramificación. Las modificaciones incluyen acetilación, acilación, ADP-ribosilación, amidación, unión covalente de flavina, unión covalente de una porción heme, unión covalente de un nucleótido o derivado de nucleótido, unión covalente de un lípido o derivado de lípido, unión covalente de fosfotidilinositol, reticulación, ciclización, formación de enlace de disulfuro, desmetilación, formación de reticulaciones covalentes, formación de cisteína, formación de piroglutamato, formilación, gamma-carboxilación, glicosilación, formación de ancla de GPI, hidroxilación, yodinación, metilación, miristoilación, oxidación, pegilación, procesamiento a proteolítico, fosforilación, prenilación, racemización, selenoilación, sulfación, adición de aminoácidos mediada por ARN de transferencia a proteínas tal como arginilación, y ubiquitinacion. (Ver, por ejemplo, proteins- structure and molecular properties, 2nd Ed., T. E. Creighton, . H. Freeman and Company, New York (1993) ; modificación covalente post-transduccional de proteínas, b. c. Johnson, Ed., Academic Press, New York, Págs. 1-12, 1983; Seifter et al., Meth Enzymol 182:626-646, 1990; Rattan et al., Ann NY Acad Sci 663:48-62, 1992). También se incluyen dentro de la definición los polipéptidos que contienen uno o más análogos de un aminoácido (incluyendo, por ejemplo, aminoácidos que no se presentan de manera natural, aminoácidos que se presentan sólo de manera natural en un sistema biológico no relacionado, aminoácidos modificados de sistemas de mamífero, estereoisómeros de varios aminoácidos, etc.), polipéptidos con enlaces sustituidos, así como otras modificaciones conocidas en la técnica, que se presentan tanto de manera natural como de manera no natural. El término "polipéptido" también se puede usar de manera indistinta con el término "proteína" o "péptido" . El término "análogo de péptido de dedo 1" se refiere a un oligopéptido que es al menos 75 % homólogo a una porción de la región de dedo 1 de un miembro de la superfamilia de TGF-beta. En algunas modalidades, el análogo de péptido de dedo 1 es al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, o al menos 95 % homólogo a la secuencia tipo silvestre. En ciertas modalidades, el oligopéptido incluye al menos 8 residuos de aminoácido, al menos 16 residuos de aminoácidos, o al menos 24 residuos de aminoácido. Los análogos de péptido de dedo 1 pueden ser mutantes en los cuales se han alterado o suprimido uno o más aminoácidos y pueden incluir residuos de aminoácido modificados o no naturales. El término "péptido" se refiere a cualquier polímero de dos o más aminoácidos, en donde cada aminoácido se enlaza a uno o dos aminoácidos diferentes mediante un enlace peptídico (-CONH-) formado entre los grupos NH2 y COOH de aminoácidos adyacentes. En una modalidad, los aminoácidos son aminoácidos que se presentan de manera natural, particularmente alfa-aminoácidos de la forma L-enantiomérica . Sin embargo, se pueden incluir en un péptido otros aminoácidos, formas enantioméricas, y derivados de aminoácidos. Los péptidos incluyen "polipéptidos" , que, en la hidrólisis, producen más de dos aminoácidos. Los polipéptidos pueden incluir proteínas, que comprenden típicamente 50 ó más aminoácidos. Los polipéptidos de acuerdo a modalidades de la presente invención se pueden proporcionar en una forma aislada, o se pueden purificar a homogeneidad. Los polipéptidos y polinucleótidos en ciertos casos son al menos 90 % puros, al menos 95 % puros, al menos 98 % puros, o al menos 99 % puros. El término "polipéptido" se refiere a un polímero de aminoácidos sin considerar la longitud del polímero; de esta manera, "péptidos", "oligopéptidos" , y "proteínas" se incluyen dentro de la definición de polipéptido y se usan de manera indistinta en la presente. Este término tampoco especifica ni excluye modificaciones químicas o de post-expresión de los polipéptidos de la invención, aunque se pueden incluir o excluir modificaciones químicas o de post-expresión de estos polipéptidos como modalidades específicas. Por lo tanto, por ejemplo, las modificaciones a polipéptidos que incluyen la unión covalente de grupos glicosilo, grupos acetilo, grupos fosfato, grupos lípido y similares se abarcan de manera expresa por el término polipéptido. Adicionalmente, los polipéptidos con estas modificaciones se pueden especificar como especies individuales que se van a incluir o excluir de la presente invención. Las modificaciones naturales u otras químicas, tal como aquéllas listadas en los ejemplos anteriores pueden presentarse en cualquier parte de un polipéptido, incluyendo la estructura peptídica, las cadenas laterales de aminoácidos y los términos amino o carboxilo. Se apreciará que puede estar presente el mismo tipo de modificación en el mismo variable grado en varios sitios en un polipéptido determinado. También, un polipéptido determinado puede contener muchos tipos de modificaciones. Los polipéptidos pueden estar ramificados, por ejemplo, como resultado de la ubiquitinación, y pueden ser cíclicos, con o sin ramificación. Las modificaciones incluyen acetilación, acilación, ADP-ribosilación, amidación, unión covalente de flavina, unión covalente de una porción heme, unión covalente de un nucleótido o derivado de nucleótido, unión covalente de unión covalente de un lípido o derivado de lípido, unión covalente de fosfotidilinositol, reticulación, ciclización, formación de enlace de disulfuro, desmetilación, formación de reticulaciones covalentes, formación de cisteína, formación de piroglutamato, formilación, gamma-carboxilación, glicosilación, formación de ancla de GPI, hidroxilación, yodinación, metilación, miristoilación, oxidación, pegilación, procesamiento a proteolítico, fosforilación, prenilación, racemización, selenoilación, sulfatación, adición de aminoácidos mediada por ARN de transferencia a proteínas tal como arginilación, y ubiquitinación . (Ver, por ejemplo, proteins-structure and molecular properties, 2nd Ed., T. E. Creighton, W. H. Freeman and Company, New York (1993); modificación covalente post-transduccional de proteínas, b. c. Johnson, Ed., Academic Press, New York, Págs. 1-12, 1983; Seifter et al., Meth Enzymol 182:626-646, 1990; Rattan et al., Ann NY Acad Sci 663:48-62, 1992). También incluidos dentro de la definición están polipéptidos que contienen uno o más análogos de un aminoácido (incluyendo, por ejemplo, aminoácidos que no se presentan de manera natural, aminoácidos que se presentan sólo de manera natural en un sistema biológico no relacionado, aminoácidos modificados de sistemas de mamífero, etc.), polipéptidos con enlaces sustituidos, así como otras modificaciones conocidas en la técnica, que se presentan tanto de manera natural como no natural. El término "polipéptido" también se puede usar de manera indistinta con el término "proteína" o "péptido". El término "péptido" se refiere a cualquier polímero de dos o más aminoácidos, en donde cada aminoácido se enlaza a uno o dos aminoácidos diferentes mediante un enlace peptídico ( —CONH--) formado entre los grupos NH2 y COOH de aminoácidos adyacentes. De manera preferente, los aminoácidos son aminoácidos que se presentan de manera natural, particularmente, alfa-aminoácidos de la forma L-enantioméricoa . Sin embargo, se pueden incluir en un péptido otros aminoácidos, formas enantioméricas y derivados de aminoácidos. Los péptidos incluyen "polipéptidos", que, en la hidrólisis, producen más de dos aminoácidos. Los polipéptidos pueden incluir proteínas, que comprenden típicamente 50 o más aminoácidos . El término "aislado" significa que el material se remueve de su ambiente original o nativo (por ejemplo, el ambiente natural si se presenta de forma natural) . Por lo tanto, un polipéptido que se presenta de manera natural presente en un animal vivo no está aislado, pero el mismo polipéptido, separado por intervención humana de algo o todo el material coexistente en el sistema natural, está aislado. Los polipéptidos pueden ser parte de una composición, y aún estar aislados ya que ese vector o composición no es parte del ambiente en el cual se encuentra la naturaleza. De manera similar, el término "sustancialmente purificado" se refiere a una sustancia, que se ha separado o removido de otro modo, a través de intervención humana, del ambiente químico inmediato en el cual se presenta en la naturaleza. Se pueden obtener o producir polipéptidos sustancialmente purificados por cualquiera de varias técnicas y procedimientos conocidos en general en el campo. El término "purificación" se refiere al incremento de la actividad específica o concentración de un polipéptido particular o polipéptidos en una muestra. En una modalidad, la actividad específica se expresa como la relación entre la actividad del polipéptido objetivo y la concentración del polipéptido total en la muestra. En otra modalidad, se expresa la actividad específica como la relación entre la concentración del polipéptido objetivo y la concentración del polipéptido total. Los métodos de purificación incluyen pero no se limitan a diálisis, centrifugación y técnicas de cromatografía en columna, que son procedimientos bien conocidos por aquéllos expertos en la técnica. Ver, por ejemplo, Young et al., 1997, "Production of biopharmaceutical proteins in the milk of transgenic dairy animáis," BioPharm 10 (6) : 34-38. "Asociado con": Cuando dos entidades se "asocian con" una con otra como se describe en la presente, se enlazan por una interacción covalente o no covalente directa o indirecta. De manera preferente, la asociación es covalente. Las interacciones no covalentes deseables incluyen unión por hidrógeno, interacciones por fuerzas de van der Waals, interacciones hidrófobas, interacciones magnéticas, interacciones electrostáticas, etcétera. El término "aislado" significa que el material se remueve de su ambiente original o nativo (por ejemplo, el ambiente natural si se presenta de manera natural) . Por lo tanto, un polinucleótido o polipéptido que se presenta de manera natural presente en un animal vivo no está aislado, pero el mismo polinucleótido o polipéptido, separado por intervención humana de algo o todos los materiales coexistentes en el sistema natural, está aislado. Por ejemplo, un "fragmento de ácido nucleico aislado" es un polímero de ARN o ADN que es de hebra individual o doble, que contiene opcionalmente bases de nucleótidos sintéticas, no naturales o alteradas. Un fragmento de ácido nucleico aislado en la forma de un polímero de ADN puede estar comprendido de uno o más segmentos de ADNc, ADN genómico o ADN sintético y combinado con materiales de carbohidrato, lípido, proteína u otros. Estos polinucleótidos puede ser parte de un vector y/o estos polinucleótidos o polipéptidos pueden ser parte de una composición, y aún estar aislados ya que ese vector o composición no es parte del ambiente en el cual se encuentra en la naturaleza. De manera similar, el término "sustancialmente purificado" se refiere a una sustancia, que se ha separado o removido de otro modo, a través de intervención humana, del ambiente químico inmediato en el cual se presenta en la naturaleza. Se pueden obtener polipéptidos o ácidos nucleicos sustancialmente purificados, o se pueden producir por cualquiera de varias técnicas y procedimientos conocidos en general en el campo. Los términos "sustancialmente puro" y "aislado" no se propone que excluyan mezclas de polipéptidos con sustancias que no están asociadas con los polipéptidos en la naturaleza. Los métodos generales para expresar y recuperar proteína extraña producida por un sistema de células de mamífero se proporcionan por, por ejemplo, Etcheverry, "Expresión of Engineered Proteins in Mammalian Cell Culture," en Protein Engineering: Principies and Practice, Cleland et al. (eds.) páginas 163 (Wiley-Liss, Inc. 1996). Las técnicas normales para recuperar proteína producida por un sistema bacteriano se proporcionan por ejemplo por Grisshammet et al., "Purification of over-produced proteins from E. coli cells," en DNA Cloning 2: Expression Systems, 2nd Edition, Glover et al. (eds.) páginas 59-92 (Oxford University Press 1995). La transformación de células de insecto y la producción de polipéptidos extraños en las mismas se describe por Guarino et al., US5162222 y publicación WIPO WO94/06463. También se describen métodos para aislar proteínas recombinantes a partir de un sistema de baculovirus, por Richardson (ed. ) , "Baculovirus Expression Protocols" (The Humana Press, Inc. 1995) . En una modalidad, los polipéptidos de la invención se pueden expresar usando un sistema de expresión de baculovirus (ver, Luckow et al., Bio/Technology, 1988, 6, 47, "Baculovirus Expression Vectors: a Laboratory Manual", O'Rielly et al., (Eds.), W. H. Freeman and Company, New York, 1992, US4,879,236, cada uno de los cuales se incorpora en la presente como referencia en su totalidad) . Además, se puede usar, por ejemplo, el sistema de expresión de baculovirus completo MAXBACMR (Invitrogen) para la producción en células de insecto. Los polipéptidos de acuerdo a varias modalidades de la presente invención también se pueden aislar por aprovechamiento de proteínas particulares. Por ejemplo, se puede usar cromatografía de adsorción de iones metálicos inmovilizados (IMAC) para purificar proteínas con alto contenido de histidina, incluyendo aquéllas que comprenden marcas de polihistidina . De forma breve, primero se carga un gel con iones metálicos divalentes para formar un quelato (Sulkowski, Trends in Biochem, 3:1 (1985)). Las proteínas con alto contenido de histidina se adsorberán a esta matriz con diferentes afinidades, dependiendo del ión metálico usado, y se eluirán por elución competitiva, disminuyendo el pH, o por el uso agentes quelantes fuertes. Otros métodos de purificación incluyen purificación de proteínas glicosiladas por cromatografía de afinidad de lecitina y cromatografía de intercambio iónico (M. Deutscher, (ed.), Meth. Enzymol. 182:529 (1990)). Dentro de modalidades adicionales de la invención, se puede construir una fusión del péptido de interés y una marca de afinidad (por ejemplo, proteína de unión a maltosa, un dominio de inmunoglobulina ) para facilitar la purificación. El término "in vitro" se refiere a un ambiente artificial y a reacciones o procesos que se presentan dentro de un ambiente artificial. Los ambientes in vitro incluyen, pero no se limitan a, tubos de prueba y cultivos celulares. El término "in vivo" se refiere al ambiente natural (por ejemplo, un animal o una célula) y a procesos o reacción que se presenta dentro de un ambiente natural. El término "fenotipo" se refiere al carácter observable en una célula o un organismo. Este carácter observable puede comprender la apariencia física, así como un nivel de composiciones fisiológicas particulares presentes en la célula u organismo. El término "ruta de transducción de señal" se refiere a las moléculas que se propagan en una señal extracelular a través de la membrana celular para llegar a ser una señal intracelular . Esta señal entonces puede estimular una respuesta celular. Las moléculas de polipéptido comprendidas en los procesos de transducción de señales pueden ser tirosina-cinasas proteicas de receptor y no de receptor. "Receptor" se refiere a una estructura molecular dentro de una célula o en la superficie de una célula que en general se caracteriza por la unión selectiva de una sustancia especifica . Los términos "compuesto" o "agente" se usan de manera indistinta en la presente para referirse a un compuesto o compuestos o composición de materia que, cuando se administra a un sujeto (humano o animal) incluye un efecto farmacológico y/o fisiológico deseado por acción local y/o sistémica . El término "sujeto" se refiere a cualquier mamífero, incluyen un humano, o un sujeto no humano. Los sujetos no humanos pueden incluir animales experimentales, de prueba, agrícolas, de entretenimiento o de compañía. Un sujeto puede ser un sujeto humano. Un sujeto puede ser un animal domesticado, tal como un perro, gato, vaca, cabra, oveja, cerdo, .etcétera. Un sujeto puede ser un animal experimental, tal como un ratón, rata, conejo, mono, etcétera. Como se usa en la presente, el término "molécula pequeña" se usa para referirse a moléculas, ya sea creadas artificialmente (por ejemplo, mediante síntesis química) o que se presentan de manera natural, que tienen un peso molecular relativamente bajo. En muchas modalidades, las moléculas pequeñas son monoméricas y tienen un peso molecular de menos de aproximadamente 1500 g/mol. Las moléculas pequeñas preferidas son biológicamente activas ya que producen un efecto local o sistémico en animales, preferentemente mamíferos, más preferentemente humanos. En ciertas modalidades preferidas, la molécula pequeña es un fármaco. De manera preferente, aunque no necesariamente, el fármaco es uno que se ha juzgado ya seguro y efectivo para el uso por la agencia o corporación gubernamental apropiada. Por ejemplo, los fármacos para el uso en humanos listados por la FDA de acuerdo con 21 C.F.R. §§ 330.5, 331 hasta 361, y 440 hasta 460; fármacos para uso veterinario listados por la FDA de acuerdo con 21 C.F.R. §§ 500 hasta 589, incorporada en la presente como referencia, son todos considerados aceptables para el uso de acuerdo con la presente invención. Breve Descripción de la Invención En un aspecto, la invención es un medio cromatográfico que comprende una resina cromatográfica derivatizada. con un péptido que es al menos 75 % homólogo a una porción de una proteína que es un miembro de la superfamilia de TGF-ß. El miembro puede ser un TGF-ß, un factor de diferenciación de crecimiento (GDF) , una proteína morfogénica ósea, una activina, o una inhibina. El péptido puede ser una molécula sustancialmente completa de la proteína. El péptido puede ser al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, o al menos 95 % homólogo a una porción de un péptido de dedo-1 del miembro. En otro aspecto, la invención es un método para purificar una muestra que incluye un factor de crecimiento que es un miembro de súper familia de TGF-ß. El método incluye proporcionar una columna de cromatografía que contiene una resina de cromatografía derivatizada con un péptido que es al menos 75 % homólogo a una porción de una proteína que es un miembro de la súper familia de TGF-ß, cargar la columna con la muestra bajo condiciones en las cuales el factor de crecimiento tiende a agregarse, y eluir el factor de crecimiento de la columna bajo condiciones en las cuales tiende a solubilizarse el factor de crecimiento. El péptido no necesita ser una porción del factor de crecimiento. En otro aspecto, la invención es un medio de cromatografía que comprende una resina de cromatografía derivatizada con un péptido que es al menos 75 % homólogo a una porción de un péptido de dedo-1 de un miembro de la súper familia de TGF-ß ... En otro aspecto, la invención es una solución de proteínas morfogénicas óseas en un solvente que comprende una concentración predeterminada de una proteína morfogénica ósea predeterminada, y una concentración predeterminada de un péptido que es al menos 75 % homólogo a una porción de un péptido de dedo-1 de un miembro de la súper familia de TGF-ß. El miembro de la súper familia de TGF-ß puede ser, pero no necesita ser, la proteina morfogénica, ósea, predeterminada. En otro aspecto, la invención es un método para estabilizar una solución de la proteina morfogénica ósea. El método incluye adicionar una concentración predeterminada de un péptido que es al menos 75 % homólogo a una porción de un péptido de dedo-1 de un miembro de la súper familia de TGF-ß a una solución de la proteina morfogénica ósea. En otro aspecto, la invención es una composición que incluye un péptido que es al menos 75 % homólogo a una porción de un péptido de dedo-1 de un miembro de la súper familia de TGF-ß a una solución de la proteina morfogénica ósea y un portador. El portador puede ser un gel, un polímero, hueso desmineralizado, o una sutura, una malla quirúrgica, una cerámica, una micela, o cualquier combinación de lo anterior. Por ejemplo, el portador puede incluir una solución amortiguadora, colágeno, o una esponja de colágeno, o un material basado en celulosa. De manera alternativa o además, el portador puede incluir uno o más de alquilcelulosa (incluyendo hidroxialquilcelulosa) , incluyendo metilcelulosa , etilcelulosa, hidroxietilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, hidroxipropil-metilcelulosa, y carboximetilcelulosa . En algunas modalidades, el portador puede incluir poligliconato, ácido hialurónico, ácido poliláctico, poli (etilenglicol) , alginato de sodio, poli (etilenglicol ) , óxido de polioxietileno, polímero de carboxivinilo, y poli (alcohol vinílico) . El péptido se puede estabilizar por uno o más de un poli (polietilenglicol) conjugado, o un grupo sialilo conjugado, una cadena de polisialilo conjugado, incorporación de aminoácidos modificados, incorporación de aminoácidos no naturales, enlaces covalentes inter-cadena, enlaces covalentes intra-cadena, enlaces no covalentes inter-cadena, enlaces no covalentes inter-cadena, y un intensificador de presentación. En otro aspecto, la invención es un método de ensayo que comprende poner en contacto una población de células con un péptido que es al menos 75 % homólogo a una porción de un péptido de dedo-1 de un miembro de la súper familia TGF-ß y detectar un cambio en una característica de las células cuando el péptido está presente versus cuando está ausente el péptido. La característica se puede seleccionar de una etapa en un ciclo celular, de la expresión de un gen o proteína, de una característica fenotípica visible o medible, de un nivel de expresión de un gen o proteína, y de la transducción de una señal desde un receptor. El método puede incluir adicionalmente poner en contacto las células con una proteína que es un miembro de la súper familia de TGF-ß. El péptido se puede restringir en una configuración particular. En otro aspecto, la invención es un método de ensayo que comprende poner en contacto una población de receptores con una cantidad conocida de un péptido que es al menos 75 % homólogo a un péptido de dedo-1 de una porción de un miembro de la súper familia de TGF-ß y detectar un cambio en la cantidad de péptido que no está unida a los receptores. Los receptores se pueden poner en contacto con una proteina que es un miembro de la súper familia de TGF-ß. En otro aspecto, la invención es una composición que comprende un péptido que es al menos 75 % homólogo a una porción de un péptido de dedo-1 de un miembro de la súper familia de TGF-ß y un agente que incrementa la estabilidad in vivo del péptido con respecto a la eliminación de un animal. En otro aspecto, la invención es un método de ensayo que comprende poner en contacto una población de receptores con una cantidad conocida de un péptido que es al menos 75 % homólogo a un péptido de dedo-1 de una porción de un miembro de la súper familia de TGF-ß y una molécula pequeña y detectar un cambio en la cantidad de péptido que no está unida a los receptores cuando la molécula pequeña está presente versus cuando la molécula pequeña está ausente. Breve Descripción de las Figuras La invención se describe con referencia a varias figuras, en las cuáles, La Figura 1 es una vista esquemática de BMP-2, que muestra las regiones de dedo y varias hélices y ß-hojas (Adaptado de Scheufler, et al., J. Mol. Bio. (1999), 287: 103-115) . La Figura 2 es una vista esquemática de un método de cromatografía de afinidad de acuerdo a una modalidad de ejemplo de la invención. La Figura 3A es un cromatograma y la Figura 3B una fotografía de un gel de SEC, que muestran la elución de BMP-3 a partir de una columna empleando BMP-12 inmovilizado. La Figura 4A es un cromatograma y la Figura 4B una fotografía de un gel de SEC, que muestra la elución de BMP-3 desde una columna empleando BMP-2 inmovilizado. La Figura 5A es un cromatograma y la Figura 5B es una fotografía de un gel de SEC, que muestran la elución de BMP-12 desde una columna que emplea BMP-12 inmovilizada. La Figura 6A es un cromatograma y la Figura 6B es una fotografía de un gel de SEC, que muestran la elución de BMP-12 desde una columna que emplea BMP-2 inmovilizada. Las Figuras 7A y 7B son un conjunto de fotografías de geles de SEC (Figura 7A: no reducido, Figura 7B: reducido) que muestran la elución de varias BMP desde columna de HPLC de fase invertida que emplea BMP inmovilizadas. La Figura 8A es un cromatograma y la Figura 8B es una fotografía de un gel de SEC, que muestran la elución de BMP-3 desde una columna empleando fragmentos mutantes de BMP-2 inmovilizados .

La Figura 9A es un cromatograma y la Figura 9B es una fotografía de un gel de SEC, que muestran la elución de BMP-3 desde una columna empleando fragmentos tipo silvestre de BMP-12 inmovilizado. La Figura 10A es un cromatograma y la Figura 10B es una fotografía de un gel de SEC, que muestra la elución de BMP-12 desde una columna empleando fragmentos mutantes de BMP-2 inmovilizados. La Figura 11A es un cromatograma y la Figura 11B es una fotografía de un gel de SEC, que muestra la elución de BMP-12 desde una columna empleando fragmentos mutantes de BMP-2 inmovilizados. La Figura 12A es un cromatograma y la Figura 12B es una fotografía de un gel. de SEC, que muestra la elución de GDF-9 desde una columna empleando fragmentos mutantes de BMP-2 inmovilizados . La Figura 13 es una gráfica que ilustra la turbidez de soluciones de 0.5 mg/mL de BMP-12 con respecto a las concentraciones de NaCl y 2-metil-2 , 4-pentanodiol en Tris 50 mM, pH 8. La Figura 14 es una fotografía de un gel después de SEC del eluato de resinas conjugadas con péptidos de dedo-BMP y cargado con BMP-12 bajo varias condiciones. Descripción Detallada de la Invención En ciertas modalidades, se emplea una porción del primer péptido de dedo de una BMP para realizar la cromatografía de afinidad. La estructura secundaria de los miembros de la superfamilia de TGF-ß se tipifica por dos ß-hojas antiparalelas separadas por un alfa-hélice de cuatro vueltas aproximadamente perpendicular a las hebras en las ß-hojas. La segunda de las dos ß-hojas tiene una conformación de cruzamiento torcido. La estructura frecuentemente se estabiliza por un lazo de cisteína formado como pares de residuos de cisteína de puentes de disulfuro intra-cadena . Se estabilizan adicionalmente algunos miembros de la superfamilia de TGF-ß por la formación de dímeros o multímeros de mayor orden. La Figura 1 muestra las regiones de dedo y las varias hélices y ß-hojas en una BMP de ejemplo, la BMP-2. Para muchos miembros de la superfamilia de TGF-ß, las ß-hojas se pueden subdividir en nueve ß-hebras. Otras características de BMP-2, tal como la hélice alfa-2 y la hebra ß53, no se encuentran en todos los miembros de la superfamilia de TGF-ß, algunos de los cuales pueden exhibir hélices adicionales y ß-hebras que no se encuentran en BMP-2 (Scheufler, et al., J. Mol. Bio. (1999), 287: 103-115). Los miembros de ejemplo de la superfamilia de TGF-ß incluyen pero no se limitan a BMP2, BMP3, BMP4, BMP5, BMP6, BMP7, BMP8A, BMP8B/OP2, BMP9/GDF2, BMP10, BMP11/GDF11, BMP12/GDF7, BMP13/GDF6, BMP15, ????ß/nodal, BMP17 /LeftyB, BMP18/Lefty2/GF ß4, a-inhibina, inhibina ß?, inhibina ß?, inhibina pC, inhibina pE/BMP14/GDF12, TGF ß?, TGF ß2, TGF ß3, GDF1 , GDF3/Vgr-2, GDF5, BDF8, BDF9, BDF10/BMP3B, GDF15, artemina, GDNF (factor neurotrófico glial-derivado) , sustancia inhibidora de conducto de Mullerian, neuturina, y persefina. En tanto que el análisis posterior se enfoca en BMP, las enseñanzas se pueden aplicar a cualquier miembro de la superfamilia de TGF-ß. Las BMP tienden a agregarse y precipitarse a pH fisiológico (Ruppert, et al., 1996 Eur J Bíochem. 1996, 237 (1) : 295-302) . En algunas modalidades, esta tendencia se aprovechó al enlazar BMP enteras o análogos de péptido de dedo-1 derivados de sus primeros dominios de dedo como ligandos enlazados a cuentas de sefarosa para producir resinas de cromatografía de afinidad. Cromatografía La Figura 2 ilustra los principios de purificación por afinidad de acuerdo a ciertas modalidades de la invención. Se inmoviliza una BMP o análogo de péptido de dedo-1 en medio de cromatografía. Los medios de ejemplo incluyen agarosa (por ejemplo, SefarosaMR) , poliestireno, sílice, dextrano y acrilamida. Los medios entonces se convierten en suspensión espesa en una columna de acuerdo a las técnicas conocidas por aquellos expertos en la técnica. La columna se carga con una solución que contiene una BMP bajo condiciones que favorecen la precipitación de BMP. En una modalidad, se cargan BMP sobre la columna desde medio acondicionado con CHO que contiene ya sea sulfato de dextrano o heparina, por ejemplo, 100 microgramos/mililitro a pH fisiológico. En algunas modalidades, la solución también puede incluir NaCl 1.2M. Se pueden lavar otras impurezas de la columna en tanto que la BMP permanece agregada en la columna. La BMP entonces se lava de la columna bajo condiciones que promueven la solvatación. Un experto en la técnica reconocerá que la concentración iónica del pH y el solvente de carga se puede optimizar para varias combinaciones de análogos inmovilizados de péptido de dedo-1 y materiales que se purifican. En algunas modalidades, se pueden usar aditivos para optimizar la solubilidad o insolubilidad del material que se purifique. Por ejemplo, se puede adicionar sulfato de dextrano o heparina a un medio de cultivo para favorecer la solubilización de la BMP en tanto que se expresa y se segrega por las células. Antes de la carga sobre la columna, se puede ajusfar el medio acondicionado a una concentración iónica alta para promover la captura eficiente y/o agregación eficiente durante el proceso de cromatografía. Los solubilizadores de BMP de ejemplo se conocen por aquellos expertos en la técnica e incluyen pero no se limitan a, ácido acético, ácido trifluoroacético, ácido clorhídrico, alcoholes, acetonitrilo, propilenglicol, glicerol, Tween-80, CHAPS (ácido 3- ( ( 3-colamidopropil ) dimetilamonio) -1- propanosulfónico) , L-arginina, urea 6M, y guanidina 6M en HC1. Un experto en la técnica reconocerá que estos solventes varían en su agresividad con respecto a la solubilización de BMP. En ciertas modalidades, se eluye BMP con una solución 500 mM de arginina o ácido acético 50 mM. Los precipitadores de BMP de ejemplo se conocen por aquellos expertos en la técnica e incluyen pero no se limitan a solventes con pH mayor que aproximadamente 5, soluciones salinas que incluyen, por ejemplo, cloruro de sodio, sales de fosfato, sales de sulfato de amonio y sodio, y citrato. La concentración de cloruro de sodio para promover la precipitación depende del pH de la solución. Algunas proteínas de TGF-ß precipitarán en soluciones de alta concentración de sal y pH bajo, o viceversa. Un experto en la técnica reconocerá cómo optimizar la concentración de sal y el pH para obtener las características deseadas de precipitación para proteínas particulares. Se pueden emplear fragmentos de péptidos de dedo de BMP en lugar de la región de dedo completa. La secuencia particular usada para cromatografía o las aplicaciones descritas más adelante pueden tener al menos 8, al menos 16, o. al menos 24 residuos de aminoácido. La secuencia puede ser al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, o al menos 95 % homologa a la región correspondiente de la proteína nativa. En algunas modalidades, se pueden formar mutantes con residuos de serina en lugar de residuos de cisteina en la secuencia nativa. Esto puede reducir la reticulación entre cadenas peptidicas en las cuentas de sefarosa, que pueden interferir con la nucleacion de agregados de BMP. También se pueden hacer modificaciones a la secuencia peptidica para mejorar la unión del péptido al sustrato. Por ejemplo, los péptidos terminados en lisina se unirán fácilmente a las cuentas de cromatografía a través de la formación de enlaces de amida. Si la secuencia natural del péptido deseado no se termina ya con lisina, se puede modificar para adicionar el residuo de lisina. De manera alternativa o además, la N-terminal del péptido se puede amidar y la C-terminal acilar para asegurar que sólo un extremo del péptido se unirá a la cuenta de sustrato. En una modalidad alternativa, se puede interponer un separador entre el péptido y la cuenta de sustrato. El separador proporciona flexibilidad conformacional adicional al péptido, permitiendo más libertad para lograr la estructura secundaria óptima para nuclear agregados de péptido. El separador puede ser una cadena orgánica simple o puede ser una secuencia de aminoácidos de no unión. La secuencia puede ser un oligómero de uno o dos aminoácidos o puede exhibir homología al menos parcial a una porción no de unión de una proteína que es un miembro de la superfamilia de TGFp o alguna otra proteína. De manera alternativa o además, un separador puede tener una porción que exhibe homología parcial a una porción de una proteína que es un miembro de la superfamilia de TGFP y una porción que no lo es. En algunas modalidades, la efectividad del péptido unido puede variar dependiendo de si el extremo libre es la C-terminal o la N-terminal. También se pueden suprimir, modificar como se describe en la presente o de acuerdo a otros métodos conocidos p"or aquellos expertos en la técnica, o se pueden reemplazar los aminoácidos individuales. Estabilizadores de solución de BMP En algunas modalidades, se pueden usar análogos de péptido de dedo-1 para estabilizar soluciones de las BMP en varios portadores farmacéuticamente aceptables. En algunas modalidades, las BMP se disuelven en una solución que contiene una concentración particular de análogos de péptido de dedo-1. En algunas modalidades, la relación de concentraciones es 1:1, pero puede ser menos o más. Sin que se una por ninguna teoría particular, se piensa que el análogo de péptido de dedo-1 competirá con las primeras regiones de dedo de la proteína, impidiendo la multimerización de las BMP monoméricas o dimerizadas. Como resultado, puede ser deseable tener una mayor concentración de péptido que de proteína, por ejemplo, 2:1, 5:1, 10:1, 20:1 ó 30:1. En algunas modalidades, la concentración de proteína que se va a distribuir está en un intervalo de aproximadamente 0.01 a aproximadamente 4 mg por ce o mi de portador, por ejemplo, de aproximadamente 0.05 mg a aproximadamente 1.5 mg por ce. Los portadores de ejemplo de las BMP incluyen los materiales analizados más adelante para composiciones terapéuticas, materiales formadores de hidrogel y otros polímeros y portadores tal como aquellos descritos en la patente de los Estados Unidos número 6,620,406, los contenidos de la cual se incorporan en la presente como referencia. Ensayos En otra modalidad, se usan análogos de péptido de dedo-1 en ensayos biológicos. Por ejemplo, un análogo de péptido de dedo-1 puede interactuar con el receptor de BMP e inducir una respuesta biológica relacionada a BMP, por ejemplo, transducción de señales. Los ensayos también pueden determinar respuestas tal como un cambio en el ciclo celular, en la expresión de un gen o proteína particular, en una alteración visible o medible en el fenotipo, en un cambio en el nivel o estado de modificación de una proteína, o en otras características celulares. Esta respuesta se puede medir usando equipos de prueba de selección o ensayo, comercialmente disponibles. El análogo de péptido de dedo-1 se puede usar para probar células particulares para determinar de manera simple si son sensibles a BMP o para identificar BMP particulares a los cuales la célula sea más o menos sensible. Por ejemplo, se pueden identificar células que respondan a los análogos de péptido de dedo-1 al modificar una actividad metabólica, por ejemplo, al incrementar o disminuir la producción de una proteina particular, polinucleótido, metabolito, u otro componente celular. En una modalidad alternativa, el análogo de péptido de dedo-1 se emplea como un competidor de BMP. En esta modalidad, el análogo de péptido de dedo-1 compite con proteínas completas de BMP para unirse con el receptor celular. Por ejemplo, se pueden valorar células de cáncer, bacterias y otras células comprendidas en la enfermedad, para la presencia de receptores particulares de BMP u otros receptores cuya unión con los análogos de péptido de dedo-1 inhiba una porción particular de la célula. De manera alternativa o además, se pueden realizar ensayos con receptores aislados en lugar de con células. En algunas modalidades, se pueden usar métodos de selección de alto rendimiento usando receptores conocidos para valorar las interacciones receptor-péptido . Las modalidades de ejemplo en las cuales se pueden emplear los análogos de péptido de primer dedo como agonistas de BMP incluyen, pero no se limitan al uso de los análogos de péptido de primer dedo de BMP-2 para tratar osteoporosis , reparar o regenerar fracturas óseas, y regeneración de cartílago, análogos de péptido de primer dedo de BMP-12 para representación de tendón, análogos de péptido de primer dedo de BMP-9 para inducción de diferenciación neuronal colinérgica, y análogos de péptido de primer dedo de GDF-19 para el tratamiento de falla cardiaca. Las modalidades de ejemplo en las cuales se pueden emplear los análogos de péptido de primer dedo como antagonistas de BMP incluyen pero no se limitan al uso de análogos de péptido de primer dedo de BMP3 para tratar osteoporosis , fractura ósea, y enfermedades óseas, BMP15 y GDF9 para anticoncepción, GDF3 para tratar diabetes tipo II, obesidad, y síndrome metabólico, BMP4 para reparar o regenerar tejido del sistema nervioso central CNS o nervios periféricos, TGF-ß para tratar varios cánceres y tumores, o GDF8 para tratar distrofia muscular, sarcopenia, debilidad, o trastornos neurológicos . En esta modalidad, el fragmento de péptido de primer dedo compite con la proteína completa para unirse a los receptores pero entonces impide la respuesta celular o de tejido que de otro modo promovería la proteína. Se puede medir o valorar la unión peptídica más directamente usando un ensayo de radio-receptor, en el cual el péptido marcado en la muestra compite con la BMP no marcada para la unión al receptor o célula particular, o viceversa. La marcación se puede hacer con 125I, 35S, 32P, u otros radioisótopos adecuados. Conforme se incrementa la unión del análogo de péptido de dedo-1, se reduce la cantidad de BMP que es capaz de unirse. El complejo de receptor-BMP entonces se aisla del ligando libre, por ejemplo por lavado (en el caso de una línea celular adherente) , filtración o centrifugación rápida (en el caso de una línea celular no adherente o receptor unido a un soporte sólido) , o precipitación del complejo de receptor-ligando con anticuerpos, polietilenglicol , u otro agente precipitador seguido por filtración o centrifugación (en el caso de un receptor soluble) . La comparación con una curva normal preparada con concentraciones conocidas de ligando marcado permite la cuantificación exacta ya sea de la concentración de péptido o de proteína en la muestra. La cantidad del ligando marcado en el complejo entonces se cuantifica, típicamente por conteo gamma, y se compara a normas conocidas. Estos métodos se han descrito en la literatura usando otros receptores ( . Williams, Med. Res. Rev., 11: 147-184 (1991); . Higuchi y B. B. Aggarwal, Anal Biochem. , 204: 53-58 (1992); M. J. Cain, R. K. Garlick and P. M. Sweetman, J. Cardiovasc. Pharm. , 17: S150-S151 (1991) ; cada uno de los cuales se incorpora en la presente como referencia) , y se adaptan fácilmente al presente sistema. Otros métodos para cuantificar péptidos o BMP incluyen radioinmunoensayo y ELISA, como se describe en 4,857,456. De manera alternativa o además, una vez que se identifica un análogo particular de péptido de dedo-1, se puede optimizar adicionalmente al reemplazar aminoácidos individuales para estabilizar una estructura secundaria particular, para prevenir la formación de enlaces cys-cys inter-cadena, o para crear un ajuste mejor con el receptor celular. Estas mutaciones se pueden identificar usando modelos de computadora o usando técnicas biológicas. Por ejemplo, los métodos de ejemplo de la mutagénesis de proteina se pueden encontrar en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual., 2d ed. (Cold Spring Harbor, N.Y.: Cold Spring Harbor Laboratory Press) (1990). En esta modalidad, puede ser deseable usar el péptido o péptido optimizado como un producto terapéutico que actúa como un imitador de BMP. En otras modalidades, los residuos de aminoácido o péptidos individuales se pueden modificar químicamente, por ejemplo, por glicosilación o derivatización con poli (etilenglicol ) . En otra modalidad, el análogo de péptido de dedo-1 interactúa directamente con proteínas completas de BMP. Por ejemplo, en análogo de péptido de dedo-1 se puede usar para valorar proteínas de BMP al prevenir la homo- o hetero-dimerización de la proteína. En esta modalidad, puede ser deseable modificar el análogo de péptido de dedo-1 de modo que se pueda internalizar por una célula, donde se presenta f ecuentemente la dimerización . De manera alternativa o adicionalmente, el péptido se puede emplear para modular de manera positiva la dimerización de proteínas de BMP. La interacción del análogo de péptido de dedo-1 y la proteína de BMP se puede valorar usando cualquiera de las técnicas descritas anteriormente. Además, los ensayos para el tamaño de proteína, por ejemplo, electroforesis en gel nativo, espectroscopia de masa, o cromatografía de filtración en gel, se pueden emplear para caracterizar el efecto del análogo de péptido de dedo-1. En algunas modalidades, el análogo de péptido de dedo-1 se puede usar como un producto terapéutico que actúa como un antagonista de BMP al prevenir la función apropiada de BMP. En otra modalidad, se pueden emplear análogos de péptido de dedo-1 como filtros para identificar sustancias, por ejemplo, moléculas pequeñas, que modulan de manera positiva o negativa interacciones de BMP-BMP o BMP-receptor . Los receptores de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, receptores de serina/treonina-cinasa, por ejemplo, ACVR1/ALK2, ACVR1B/ALK4, ACVR1C/ALK7, ACVR2 /ACTRI I , ACVR2B/ACTRI IB, ACVRL1/ALK1, BMPR1A/ALK3, BMPR1B/ALK6, BMPR2/T-ALK, TGFPR1/ALK5, y TGF-pR2, y co-receptores tal como RGMa, RGMb/DRAGON , RGMc/HFE2, TGFpR3, Cripto, Cryptic, y Endoglin. Por ejemplo, se pueden emplear ensayos de alto rendimiento para identificar un inhibidor de molécula pequeña de una BMP. Se puede llevar a cabo un ensayo libre de células similar a un ensayo FRET en el cual el filtro detecta la interrupción de la interacción BMP-péptido. Por ejemplo, ya sea la BMP o el análogo de péptido de dedo-1 se puede modificar con una molécula donadora, en tanto que el otro se modifica con una molécula aceptadora.

En otra modalidad, se pueden modificar análogos de péptido de dedo-1 para que se restrinjan en una configuración particular para retener una estructura secundaria determinada. Por ejemplo, los aminoácidos particulares en el análogo de péptido de dedo-1 se pueden reemplazar con cisteinas que formarán enlaces de disulfuro y estabilizarán una conformación particular. De manera alternativa o adicionalmente, se pueden adicionar cisteinas a los extremos N- y C-terminales del análogo de péptido de dedo-1 para restringir el péptido o estabilizar una conformación particular. En algunas modalidades, puede ser deseable desplegar análogos de péptido de dedo-1 mutantes o tipo silvestres y permitirles replegarse en una configuración alternativa. Por ejemplo, el análogo de péptido de dedo-1 se puede solubilizar y desnaturalizar usando un agente caotrópico. La separación del análogo de péptido de dedo-1 del agente caotrópico permite que se repliegue en una configuración termodinámicamente favorecida. Cuando están presentes residuos de cisteina en la secuencia primaria de aminoácidos de la proteina, puede ser deseable lograr el replegado en un ambiente que permita la formación correcta de enlaces de disulfuro (por ejemplo, un sistema de reducción-oxidación) . Los métodos generales de replegamiento se describen en Kohno, Meth. Enzym., 185:187-195 (1990) . También se pueden emplear chaperoninas para mediar el plegamiento.

Composiciones Terapéuticas Los análogos de péptido de dedo-1 identificados como que tienen potencial terapéutico se pueden aplicar a tejido en la forma de una solución amortiguadora. Una solución amortiguadora de ejemplo es una composición que comprende, además del péptido, de aproximadamente 1.0 a aproximadamente 10.0 % (p/v) de glicina, de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 5.0 % (p/v) de un azúcar, por ejemplo, sacarosa, de aproximadamente 1 a aproximadamente 20 mM de clorhidrato de ácido glutámico, y opcionalmente de aproximadamente 0.01 a aproximadamente 0.1 % de un agente tensioactivo no iónico, tal como polisorbato 80 ó T een. Las soluciones de ejemplo frecuentemente son de aproximadamente 1 % a aproximadamente 20 % p/v de portador celulósico/amortiguador. Si se desea, se puede adicionar una sal . También se pueden usar materiales más viscosos como portadores. Estos materiales pueden incluir materiales farmacéuticamente aceptables que tienen viscosidad y polaridad tal que, cuando se combinan con el análogo de péptido de dedo-1, forman una composición que posee características apropiadas de manejo para el sitio de tejido. Por ejemplo, puede ser deseable tener material relativamente menos viscoso (pero aún no demasiado líquido) para el uso en un sitio periodontal que en una fractura ósea. La adición del portador al péptido permite que el análogo de péptido de dedo-1 permanezca en el sitio de enfermedad o de lesión durante un tiempo suficiente para permitir que el análogo de péptido de dedo-1 actúe en células locales ya sea al favorecer o reducir varias actividades metabólicas. El portador también puede permitir que el análogo de péptido de dedo-1 se libere de la lesión, defecto o sitio de enfermedad durante un intervalo de tiempo. Una familia de ejemplo de portadores para la administración de los péptidos son polímeros en partículas, porosos, descritos en detalle en la patente de los Estados Unidos número 5,171,579, la descripción completa de la cual se incorpora en la presente como referencia. Un portador alternativo útil para la presente invención es una formulación de proteína osteogénica, polímeros porosos en partículas y otro agente secuestrante o portador, tal como material celulósico. Otros materiales que se pueden emplear como portadores o agentes secuestrantes incluyen carboximetilcelulosa, ácido hialurónico, alginato de sodio, poli (etilenglicol ) , óxido de polioxietileno, polímero de carboxivinilo y poli (alcohol vinílico) . Estas composiciones se describen . en la solicitud PCT publicada WO 93/00050, la descripción completa de la cual se incorpora de este modo en la presente como referencia. El agente secuestrante puede estar presente en una concentración de aproximadamente 1 a aproximadamente 10 % (p/v de implante) . Donde se emplean polímeros porosos en partículas como el portador, el polímero poroso en partículas/agente secuestrante celulósico se puede combinar además opcionalmente con glicerol acuoso como un diluyente, por ejemplo, en concentraciones de aproximadamente 10 a aproximadamente 80 % (v/v) con relaciones de ejemplo de agente secuestrante/solución líquida: polímeros porosos en partículas de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 0.9 (v/v). Otra familia de ejemplo de portadores es materiales colagenosos. Los materiales adecuados de colágeno incluyen esponjas de colágeno CollastatMR y HelistatMR (Integra LifeSciences Corp., Plainsboro, N.J.). Otros materiales de colágeno que pueden ser adecuados para el uso en la presente invención se describen en la patente de los Estados Unidos número 5,206,028; patente de los Estados Unidos número 5,024,841; patente de los Estados Unidos número 5,256,418. Un portador de colágeno puede estar en la forma de una esponja. La esponja de colágeno se puede cargar con péptido antes de la administración al remojar la esponja en el volumen deseado y concentración deseada del péptido durante un periodo adecuado de tiempo. La esponja de colágeno puede cargarse por remojo con el péptido en un intervalo de aproximadamente 10 % a aproximadamente 150 % de v/v [mi de proteína/cc de esponja seca] , por ejemplo, de aproximadamente 10 a aproximadamente 60 % v/v. De manera alternativa, el péptido se puede adsorber a la esponja de colágeno durante la producción. En este caso, se puede adicionar péptido a la esponja de colágeno durante la producción y liofilizar para formar un producto unitario. El péptido se puede adicionar en una relación de aproximadamente 10 a aproximadamente 150 % de v/v, por ejemplo, en el intervalo de aproximadamente 60 a aproximadamente 80 % de v/v. Otra familia de ejemplo de portadores son los materiales basados en celulosa tal como alquilcelulosa (incluyendo hidroxialquilcelulosa) , incluyendo metilcelulosa, etilcelulosa, hidroxietilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, hidroxipropil-metilcelulosa, y carboximetilcelulosa, por ejemplo, las sales catiónicas de carboximetilcelulosa (CMC) . La reticulación y peso molecular de esos materiales y cualquier otro portador polimérico descrito en la presente se puede modificar para ajustar la velocidad de distribución del péptido encapsulado y para estabilizar el péptido in vivo. En el caso de portadores celulósicos, el portador puede estar en la forma de un gel viscoso celulósico hidratado. Se puede incrementar la viscosidad de los materiales celulósicos a través de medios mecánicos, tal como alta agitación durante un periodo adecuado de tiempo, seguido por esterilización en .autoclave. El péptido y el portador celulósico pueden estar en una solución de amortiguador adecuado. Una solución de amortiguador adecuado es una composición que comprende de aproximadamente 1.0 a aproximadamente 10.0 % (p/v) de glicina, de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 5.0 % (p/v) de una azúcar, de manera preferente sacarosa, de aproximadamente 1 a aproximadamente 20 mM de clorhidrato de ácido glutámico, y opcionalmente de aproximadamente 0.01 a aproximadamente 0.1 % de un agente tensioactivo no iónico, tal como polisorbato 80. Las soluciones de ejemplo son de aproximadamente 1 % a aproximadamente 20 % p/v de portador celulósico/amortiguador. Si se desea, se puede adicionar una sal. La cantidad de péptido combinada con un portador de gel viscoso puede estar en un intervalo de aproximadamente 0.05 a aproximadamente 1.5 mg, por ejemplo, de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 1.0 mg por centímetro cúbico por material requerido de implante . Otros materiales que pueden ser adecuados para el uso como portadores para análogo de péptido de dedo-1 de acuerdo a varias modalidades incluyen pero no se limitan a hueso desmineralizado, poligliconato, ácido hialurónico, malla o suturas quirúrgicas, polímeros sensibles a temperatura, y minerales y cerámicas, tal como fosfatos de calcio, hidroxiapatita, etc., y combinaciones de éstos. Otros portadores potenciales incluyen portadores para formulaciones inyectables de BMP. Los portadores adecuados para formulaciones inyectables incluyen, por ejemplo, colágeno soluble, ácido hialurónico, ácido poliláctico/polietilenglicol, y polímeros.

Los análogos de péptido de dedo-1 para el uso en esta modalidad simplemente se pueden combinar con el portador y proteína completa o se pueden inmovilizar en el portador. Por ejemplo, se pueden unir péptidos terminados en amina a los portadores carboxilados usando técnicas normales de química de polímero. En otro ejemplo, los péptidos se pueden terminar con carboxi-NHS y unir a polímeros aminados. De manera alternativa o además, los péptidos se pueden biotinilar y coordinar con portadores que se han funcionalizado con estreptavidina . Los portadores alternativos para análogos de péptido de dedo-1 incluyen micelas. Por ejemplo, se pueden usar técnicas de doble emulsión tal como aquéllas descritas en Gref, et al., Science, 1994, 263:1600-1603 para encapsular composiciones terapéuticas en micelas que entonces se pueden administrar a un sujeto usando cualquiera de las técnicas descritas en la presente o cualquier otra técnica de distribución conocida por aquellos expertos en la técnica. En algunas modalidades, la superficie de las micelas puede incluir un agente de selección de objetivo. El agente de selección de objetivo se puede unir covalentemente a la micela o se puede retener usando interacciones ligando-receptor (por ejemplo, biotina-estreptavidina) o interacciones electrostáticas. Los agentes de selección de objetivo de ejemplo incluyen anticuerpos y fragmentos de anticuerpo, ligandos de ácido nucleico (por ejemplo, aptámeros) , oligonucleótidos, oligopéptidos, polisacáridos, lipoproteinas de baja densidad (LDL) , foliato, transíerrina, asialicoproteinas , proteina de envoltura gpl20 del virus de inmunodeficiencia humana (VIH), carbohidratos, polisacáridos, ligandos de receptor enzimático, ácido siálico, glicoproteina , lipido, molécula pequeña, agente bioactivo, biomolécula, fragmentos inmunorreactivos tal como Fab, Fab ' , o fragmentos Los péptidos para el uso como un producto terapéutico se pueden modificar para incrementar su estabilidad in vivo, incrementando su tiempo de circulación y reduciendo la velocidad de eliminación del cuerpo. Por ejemplo, los péptidos se pueden funcionalizar o combinar con una cadena de poli (alquilenglicol) tal como poli (etilenglicol ) (PEG) o poli (propilenglicol) (PPG). El peso molecular opcional de estas cadenas de polímero se puede optimizar usando técnicas conocidas por aquellos expertos en la técnica. De manera alternativa o adicionalmente, se pueden conjugar péptidos con grupos sialilo o cadenas de polisialilo. También se pueden modificar los péptidos al modificar químicamente residuos de aminoácido con grupos químicos más pequeños tal como metilo, sulfato, etc. Los residuos individuales de aminoácido también se pueden reemplazar con aminoácidos no naturales tal como D-estereoisómeros o beta-residuos. En algunas modalidades, se pueden estabilizar peptidos por enlaces covalentes o no covalentes ínter- o intra-cadena . Estos enlaces se pueden promover al adicionar residuos apropiados de aminoácido al péptido o al modificar aminoácidos en el péptido con grupos químicos apropiados, tal como tiol, donadores y aceptadores de enlaces de hidrógeno, etc. También se pueden asociar péptidos con o fusionar (por ejemplo, en las terminales N o C o de manera interna) con la longitud completa o un fragmento de una proteína natural o sintética que actúa como un intensificador de presentación. Las proteínas de ejemplo se conocen por aquellos expertos en la técnica e incluyen albúmina de suero bovino. Los análogos de péptido de dedo-1, en un amortiguador adecuado o combinado con un portador adecuado tal como aquellos descritos anteriormente, se pueden aplicar directamente a un tejido y/o a un sitio en necesidad de reparación de tejido. Por ejemplo, el péptido se puede aplicar físicamente al tejido a través de rociado o inmersión, o usando un cepillo u otro aplicador adecuado, tal como una jeringa para inyección. De manera alternativa, o además, el péptido se puede aplicar directamente al sitio en necesidad de reparación de tejido. En algunas modalidades, las composiciones terapéuticas de acuerdo a una modalidad de la invención se pueden administrar a un sujeto o se pueden formular primero para distribución por cualquier ruta disponible que incluye, pero no se limita a, rutas parenteral (por ejemplo, intravenosa), intradérmica, subcutánea, oral, nasal, bronquial, oftálmica, transdérica (tópica) , transmucosa, rectal, y vaginal. Las composiciones farmacéuticas inventivas pueden incluir un polipéptido purificado o proteina expresada de una linea de células de mamífero y un agente de distribución (es decir, un polímero catiónico, transportador molecular peptídico, agente tensioactivo, etc., como se describe anteriormente) en combinación con un portador farmacéuticamente aceptable. Como se usa en la presente, la frase "portador farmacéuticamente aceptable" incluye solventes, medio de dispersión, revestimientos, agentes antibacterianos y antifungoideos, agentes isotónicos y de retraso de absorción, y similares, compatibles con la administración farmacéutica. Los compuestos activos complementarios también se pueden incorpora en las composiciones . Una composición farmacéutica se formula para ser compatible con su ruta propuesta de administración. Las soluciones y suspensiones usadas para aplicación parenteral, intradérmica, o subcutánea pueden incluir los siguientes componentes: un diluyente estéril tal como agua para inyección, solución salina, aceites fijos, polietilenglicoles , glicerina, propilenglicol u otros solventes sintéticos; agentes antibacterianos tal como alcohol bencílico o metilparabenos ; antioxidantes tal como ácido ascórbico o bisulfito de sodio; agentes quelantes tal como ácido etilendiaminatetraacético; amortiguadores tal como acetatos, citratos o fosfatos y agentes para el ajuste de tonicidad tal como cloruro de sodio o dextrosa. Se puede ajustar el pH con ácidos o bases, tal como ácido clorhídrico o hidróxido de sodio. La preparación parenteral se puede encerrar en ampolletas, jeringas desechables o frascos de múltiples dosis elaborados de vidrio o plástico. Las composiciones farmacéuticas adecuadas para uso inyectable incluyen frecuentemente soluciones acuosas estériles (donde son solubles en agua) o dispersiones y polvos estériles para preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables, estériles. Para administración intravenosa, los portadores adecuados incluyen solución salina fisiológica, agua bacteriostática, Cremophor ELMR (BASF, Parsippany, NJ) o solución salina amortiguada con fosfato (PBS) . En todos los casos, la composición debe ser estéril y debe ser fluida al grado que pueda existir capacidad de manejo en jeringa. Las formulaciones farmacéuticas de ejemplo son estables bajo las condiciones de elaboración y almacenamiento y se conservan contra la acción contaminante de microorganismos tal como bacterias y hongos. En general, el portador pertinente puede ser un solvente o medio de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol, y polietilenglicol liquido, y similares), y mezclas adecuadas de los mismos. La fluidez apropiada se puede mantener, por ejemplo, por el uso de un revestimiento tal como lecitina, por el mantenimiento del tamaño requerido de partícula en el caso de dispersión y por el uso de agentes tensioactivos . La prevención de la acción de microorganismos se puede lograr por varios agentes antibacterianos y antifungoideos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol , fenol, ácido ascórbico, timerosal, y similares. En muchos casos, será deseable incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tal como manitol, sorbitol, o cloruro de sodio en la composición. La absorción prolongada de las composiciones inyectables se puede dar al incluir en la composición un agente que retrase la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina. Se pueden preparar soluciones inyectables y estériles al incorporar el polipéptido o proteína purificada en la cantidad requerida en un solvente apropiado con uno o una combinación de ingredientes enumerados anteriormente, como se requiera, seguido por esterilización filtrada. En general, se preparan dispersiones al incorporar el polipéptido purificado o proteína expresada de una línea de células de mamífero en un vehículo estéril que contiene un medio básico de dispersión y los otros ingredientes requeridos de aquellos enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos de ejemplo de preparación son secados al vacio o secado por congelación que produce un polvo del ingrediente S activo más cualquier ingrediente deseado adicional a partir de una solución filtrada anteriormente estéril, de los mismos. Las composiciones orales pueden incluir un diluyente inerte o un portador comestible. Para el propósito de administración terapéutica oral, el polipéptido o proteina 0 purificada se puede incorporar con excipientes y usar en la forma de tabletas, pastillas, o cápsulas, por ejemplo, cápsulas de gelatina. También se pueden preparar composiciones orales usando un portador fluido para el uso como un enjuague bucal. Los agentes de unión 5 farmacéuticamente compatibles, y/o materiales adyuvantes se pueden incluir como parte de la composición. Las tabletas, pildoras, cápsulas, pastillas y similares pueden contener cualquiera de los siguientes ingredientes, o compuestos de una naturaleza similar: una aglutinante tal como celulosa 0 microcristalina, goma de tragacanto o gelatina; un excipiente tal como almidón o lactosa, un agente desintegrante tal como ácido alginico, Primogel, o almidón de maíz; un lubricante tal como estearato de magnesio o Sterotes; un agente deslizante tal como dióxido de silicio coloidal; un agente edulcorante § tal como sacarosa o sacarina; un agente saborizante tal como menta, salicilato de metilo, o sabor naranja. Las formulaciones para distribución oral pueden incorporar de manera ventajosa agentes para mejorar la estabilidad dentro del tacto gastrointestinal y/o para mejorar la absorción. Para la administración por inhalación, las composiciones inventivas que comprenden polipéptido o proteina purificada expresada de una linea de célula de mamífero y un agente de distribución se distribuye de manera preferente en la forma de una expresión en aerosol a partir de un recipiente o dispensador presurizado que contiene un propulsor adecuado, por ejemplo, un gas como dióxido de carbono, o un nebulizador. La presente invención contempla la distribución de las composiciones usando una aspersión nasal, inhalador, u otra distribución directa a las vías aéreas superiores y/o inferiores. La administración intranasal de vacunas de ADN dirigidas contra virus de influenza se ha mostrado que induce respuestas de células T CD8, indicando que al menos algunas células en el tracto respiratorio pueden tomar ADN cuando se distribuyen por esta ruta, y los agentes de distribución de la invención mejorarán la captación celular. De acuerdo a ciertas modalidades de la invención, las composiciones que comprenden un polipéptido purificado expresado de la línea de células de un mamífero y un agente de distribución se formulan como partículas porosas grandes para administración por aerosol. La absorción transepitelial de composiciones de acuerdo a una modalidad de la invención se pueden mejorar usando las técnicas descritas en la publicación de patente de los Estados Unidos número 20030235536, los contenidos de la cual se incorporan en la presente como referencia. La administración sistémica también puede ser por medio transmucoso o transdérmico . Para administración transmucosa o transdérmica, se usan en la formulación penetrantes apropiados a la barrera que se va a permear. Estos penetrantes se conocen en general en la técnica, en incluyen, por ejemplo, administración transmucosa, detergentes, sales biliares, y derivados de ácido fucidico. Se puede lograr la administración transmucosa a través del uso de aspersiones nasales o supositorios. Para administración transdérmica, el polipéptido o proteina purificada y los agentes de distribución se formulan en ungüentos, bálsamos, geles o cremas como se conoce en general en la técnica. Las composiciones también se pueden preparar en la forma de supositorios (por ejemplo, con bases convencionales de supositorio tal como manteca de cacao y otros glicéridos) o enemas de retención para distribución rectal. En una modalidad, las composiciones se combinan con un agente que protegerá al polipéptido o proteina contra eliminación rápida del cuerpo, tal como formulación y liberación controlada, incluyendo implantes y sistemas microencapsulados de distribución. El agente también puede servir como portador para la composición. Se pueden usar polímeros biodegradables y biocompatibles tal como etileno-acetato de vinilo, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres, y ácido poliláctico. Los métodos para la preparación de estas formulaciones serán evidentes para aquellos expertos en la técnica. Los materiales también se pueden obtener de manera comercial a partir de Alza Corporation y Nova Pharmaceuticals , Inc. También se pueden usar suspensiones liposómicas (incluyendo liposomas dirigidos a células infectadas con anticuerpos monoclonales a antígenos virales) como portadores farmacéuticamente aceptables. Estos se pueden preparar de acuerdo a métodos conocidos por aquellos expertos en la técnica, por ejemplo, como se describe en la patente de los Estados Unidos número 4,522,811. Es ventajoso formular composiciones orales o parenterales en forma de dosis unitaria para facilidad de administración y uniformidad de dosis. La forma de dosis unitaria como se usa en la presente se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosis unitarias para el sujeto que se va a tratar; cada unidad que contiene una cantidad predeterminada de proteína o polipéptido activo calculado que produce el efecto terapéutico deseado en asociación con el portador farmacéutico requerido. El polipéptido o proteína de acuerdo a una modalidad de la invención se puede administrar a varios intervalos y durante periodos diferentes de tiempo, como se requiera. El experto en la técnica apreciará que ciertos factores pueden influenciar en la dosis y programación requerida para tratar de manera efectiva un sujeto, incluyendo pero no limitado a la severidad de una enfermedad o trastorno, tratamientos anteriores, la salud general y/o edad del sujeto, y otras enfermedades presentes. En general, el tratamiento de un sujeto con un polipéptido o proteina como se describe en la presente puede incluir un tratamiento individual, o en muchos casos, puede incluir una serie de tratamientos. Adicionalmente se entiende que las dosis apropiadas pueden depender de la potencia del polipéptido o proteina y se pueden adaptar opcionalmente al receptor particular, por ejemplo, a través de la administración de dosis crecientes hasta que se logre una respuesta deseada, preseleccionada . Se entiende que el nivel especifico de dosis para cualquier sujeto animal particular puede depender de una variedad de factores que incluyen la actividad del polipéptido o proteina especifica empleada, la edad, peso corporal, salud general, género, y dieta del sujeto, el tipo de administración, la ruta de administración, la velocidad de excreción, cualquier combinación de fármacos, y el grado de expresión o actividad que se module. La presente invención incluye el uso de composiciones inventivas para el tratamiento de animales no humanos. Por consiguiente, se pueden seleccionar dosis y métodos de administración de acuerdo con principios conocidos de farmacología y medicina veterinaria. Se puede encontrar guía, por ejemplo, en Adams, R. (ed.), Veterinary Pharmacology and Therapeutics , 8th edition, Iowa State University Press; ISBN: 0813817439; 2001. Las composiciones farmacéuticas inventivas se pueden incluir en un recipiente, paquete o dispensador conjuntamente con instrucciones para administración. Ej emplos Ejemplo 1 Se inmovilizó BMP-12 en cuentas de SepharoseMR activadas con NHS a una relación de aproximadamente 20 mg:4 mL y el medio resultante se combinó con agua o amortiguador de solución salina neutral para preparar una columna. Se cargo medio condicionado con CHO aumentado con NaCl 1.2 M sobre la columna. En algunos casos, el medio se preconcentró con respecto a BMP antes de la carga. La columna se lavó con 15 CV (volúmenes de columna) de NaCl 1.2 M en Na2HP04 a pH 7.2, seguido por arginina 0.5 M/NaCl 0.5 M en Tris 20 nM a pH 7.5 (15 CV) y un lavado de baja concentración de sal (acetato de amonio 50 mM a pH 7, 15 CV) . La columna se diluyó adicionalmente con ácido acético, usando un gradiente de 5 CV a ácido acético 50 mM a pH 3, seguido por una búsqueda con 15 CV. Finalmente, la columna se diluyó con 5 CV en solución de ácido acético con clorhidrato de guanidina 6M (GuHCl) . Se capturó de manera efectiva BMP-3 por el medio de cromatografía y se eluyó con ácido acético (Figura 3A) . El producto eluido se analizó usando HPLC. Como se ve en la Figura 3B, un fragmento de propéptido co-purifica junto con la proteína madura, y también se observaron cantidades traza de la BMP-3 madura en el pico de guanidina. Ejemplo 2 Se inmovilizó BMP-2 en cuantas de sefarosa como en el Ejemplo 1 y se usó para probar la carga y elución de BMP-3. Como se muestra en las Figuras 4A-4B, la BMP-3 se capturó de manera efectiva por la concentración de alta concentración iónico y se eluyó con ácido acético. Como para la columna de BMP-12, un fragmento de propéptido co-purifica junto con la proteína madura, y también se observaron cantidades traza de la BMP-3 madura en el pico de guanidina. Ejemplo 3 Se cargó la BMP-12 y se eluyó desde una columna de afinidad de BMP-12 como en el Ejemplo 1. La BMP-12 se capturó de manera efectiva por la columna usando la solución de alto contenido de sal y se eluyó con ácido acético y guanidina (Figuras 5A-5B) . Se capturaron tanto las formas monoméricas como diméricas de BMP-12.

Ejemplo 4 Se cargó BMP-12 y se eluyó desde una columna de afinidad de BMP2 como los Ejemplos 1 y 2. La BMP-12 se capturó de manera efectiva por la columna usando la solución de alta concentración iónica y se eluyó con ácido acético y guanidina (Figuras 6A-6B) . Ejemplo 5 La resina de afinidad de BMP, que usan BMP-12 y BMP-2, se prepararon como se describe en los Ejemplo 1 y 2 y se usaron para preparar columnas de HPLC. Estas columnas se usaron cargadas con BMP-3 y BMP-12. Como se muestra en las Figuras 7A-7B, fueron igualmente efectivas BMP-12 y BMP-2 como ligandos de afinidad para HPLC de fase inversa. En algunos casos, se emplearon técnicas de cromatografía de exclusión de tamaño o fase inversa para mejorar la purificación. Ejemplo 6 Un mutante del péptido de dedo-1 de BMP-2 (SDVGWNDWIVAPPGYHAFYCHGEK) se enlazó a cuentas de sefarosa mediante una lisina C-terminal o una relación de 5 mg de péptido /mL de resina. Se usaron 4 mL de la resina resultante (1.6 x 2.0 cm) para preparar una columna. La columna se cargó con BMP-3 y se eluyó como en el Ejemplo 1. Como se muestra en las Figuras 8A-8B, la BMP-3 se capturó de manera efectiva por la columna usando la solución de alto contenido de sal y se eluyó, junto con un fragmento de propéptido, en ácido acético.

En general, la cromatografía con los péptidos inmovilizados proporcionó el producto de mayor pureza que con la proteína entera . Ejemplo 7 Un péptido de dedo-1 de BMP-12 tipo silvestre ( KELGWDDWI IAPLDYEAYHCEGLC ) se usó para purificar BMP-3 como en el Ejemplo 1. Como se muestra en las Figuras 9A-9B, la BMP-3 se capturó de manera efectiva por una columna usando la solución de alto contenido de sal y se eluyó en ácido acético. Menos del fragmento de propéptido eluyó que en el Ejemplo 6. En general, la BMP-12 inmovilizada fue menos efectiva que el mutante de BMP-2. SDS-PAGE muestra que el péptido de BMP-12 inmovilizado se oligomerizó, quizás debido a los residuos libres de cisteína. Ejemplo 8 Se purificó BMP-12 usando una columna preparada con el péptido mutante de BMP-2 descrito en el Ejemplo 6. Como se muestra en las Figuras 10A-10B, la BMP-12 se capturó de manera efectiva por la columna usando la solución de alto contenido de sal y se eluyó con ácido acético. Una pequeña cantidad de BMP-12 se eluyó con GuHCl 6M. Ejemplo 9 Se purificó BMP-12 usando una columna preparada con el péptido tipo silvestre de BMP-12 descrito en el Ejemplo 7. Como se muestra en las Figuras 11A-11B, la BMP-12 se capturó de manera efectiva por la columna usando la solución de alta concentración iónica y se eluyó con ácido acético. Una pequeña cantidad de BMP-12 eluyó con GuHCl 6M. Ejemplo 10 Se purificó GDF-9 usando una columna preparada con el péptido mutante de primer dedo de BMP-2 descrito en el Ejemplo 6. Como se muestra en las Figuras 12A-12B, se capturó de manera efectiva GDF-9 por la columna usando una solución de alta concentración de sal y se eluyó tanto con arginina 500 m y ácido acético. También estuvo presente un contaminante de menor peso molecular. Ejemplo 11.- Puesta en ejemplos proféticos para mutantes peptidicos restantes. Se preparan resinas de afinidad de BMP usando uno o más de los siguientes péptidos: Tabla 1: Secuencias peptidicas de ejemplo para preparación de resina de afinidad. BMP2 Dedol Tipo SDVGWNDWIVAPPGYHAFYCHGEC silvestre BMP2 Dedol Mutl : SDVGWNDWIVAPPGYHAFYCHGEK BMP2 Dedol Mut2 : SDVGANDWIVAPPGYHAFYCHGEC BMP2 Dedol Mut3 : SDVGANDWIVAPPGYHAFYCHGEK BMP2 Dedol Mut4 : SDVG ND IVAPPGYHAFYCHAEC BMP2 Dedol Mut5: SDVGWNDWIVAPPGYHAFYCHAEK BMP2 Dedol Mut6: SDVGAND IVAPPGYHGFYCHGEC BMP2 Dedol Mut7 : SDVGAND IVAPPGYHGFYCHGEK BMP2 Dedol Tipo LYVDFSDVG NDWIVAPPGYHAFY silvestre : BMP2 Dedol Mutl : LYVDFSDVGAND IVAPPGYHAFY BMP2 Dedol ut2 : LYVDFSDVGWNDWIVAPPGYHGFY BMP12 Dedol Tipo KELGWDDWI IAPLDYEAYHCEGLC silvestre : BMP12 Dedol Mutl : KELGWDDWI lAPLDYEAYHCEGLK BMP12 Dedol Mut2 : AELGWDDWI lAPLDYEAYHCEGLK BMP3 Dedol Tipo ADIGWSEWIISPKSFDAYYCSGAC silvestre : BMP3 Mutl: ADIGWSEWI ISPKSFDAYYCSGAK Ejemplo 12 Selección de solubilidad de BMP.- Se usó un robot de manejo de líquidos Tecan para mezclar una placa principal de reactivos, 800 µL x 1.25 de concentración (para cada solución; ver Tablas 2 y 3), cada uno en amortiguador Tris 50 mM a pH 8. Se usó una pipeta de 8 canales para transferir 80 del material desde la placa principal en una microplaca de UV de media área, de la cual se leyó A320 de cada muestra para definir una muestra en blanco. Se usó una pipeta de repetición para adicionar 20 µL de 2.5 mg/mL de BMP-12 en TFA al 0.1 % para elaborar una solución de 0.5 mg/mL, que entonces se agitó a 14,000 rpm. La absorción UV (A320) se leyó y la absorción en blanco se sustrajo para determinar la solubilidad. El procedimiento se repitió con un intervalo más amplio de concentraciones de 2-metil-2 , 4 -pent anodiol (MPD) y un conjunto más fino de concentraciones de sal (Tabla 4) . En la Figura 13 se muestra una gráfica que compara la turbidez de las soluciones de BMP-12 con respecto a concentraciones de NaCl y MPD Tabla 2 NaCl, M 1-Propanol, % 0 2.5 5 10 15 25 0 1.724 1.848 2.134 2.000 3.172 1.419 0.1 1.745 2.135 2.212 1.945 3.199 0.104 0.25 1.804 2.397 2.300 2.105 1.392 0.022 0.5 1.953 2.170 1.629 1.313 0.305 -0.001 0.75 1.911 2.023 1.541 1.032 0.094 -0.003 1 1.988 1.601 1.817 1.000 0.040 -0.010 1.25 1.702 1.376 1.643 1.018 0.033 0.022 1.5 1.981 1.358 1.598 0.973 0.036 0.478 Tabla 3 Tabla 4 2-metil-2,4- NaCl,M pentanodiol, % 2.5 5 10 15 20 25 30 35 40 45 0.00 1.936 2.122 2.148 2.035 2.136 2.631 3.443 3.006 3.519 3.308 0.05 n/a n/a n/a n/a n/a 1.994 0.979 0.376 0.330 0.318 0.10 1.900 2.338 2.341 2.287 2.573 0.626 0.206 0.150 0.083 0.087 0.25 2.061 2.399 2.-434 2.433 1.006 0.047 -0.015 -0.065 0.015 -0.012 0.50 2.045 2.414 2.258 1.420 0.165 0.038 -0.091 0.026 0.024 -0.008 0.75 1.985 2.076 2.211 0.818 0.099 0.001 2-metil-2,4- NaCl,M pentanodiol, % 2.5 5 10 15 o 20 25 30 35 40 45 1.00 2.133 1.903 2.110 0.400 0.089 -0.015 5 1.25 1.819 1.643 1.688 0.257 0.040 -0.011 1.50 1.767 1.521 1.798 0.227 0.045 0.003 Ejemplo 13 Se acoplaron resinas de afinidad con los péptidos listados en la Tabla 5. Las resinas acopladas, más una resina -LO no conjugada por el uso como un control, se suspendieron en 16 5 % de etanol, NaCl 150 m , y amortiguador Tris 20 mM a pH 7.5 a una relación de 25 % v/v (por ejemplo, 25 % de etanol, 75 % de amortiguador Tris). Se empleó un robot de manejo de líquidos Tecan para tomar un alícuota 200 \i de cada suspensión espesa 15 en una de las ocho filas de una placa filtro de poliestireno 10 de 96 concavidades (filtros hidrófolos de 0.45 µ??, número de catálogo Whatman 770-1806) . La centrifugación a 1200 g durante 3 minutos removió la fase líquida, dejando 50 µL de resina húmeda en los filtros. Las resinas se pusieron en equilibrio 20 con los amortiguadores de carga listados en la Tabla 6 (K es 15 un coeficiente que caracteriza la concentración de proteína que se une a una resina particular en un amortiguador particular. Se preparó una placa de carga de B P-12 al adicionar 40 µL de solución de cromatografía de exclusión de tamaño de peso molecular bajo (LMW/SEC) (BEP, dializada en TFA al 0.1 % y concentrada a 3.76 mg/mL) a 260 L de cada amortiguador de carga en una placa de 96 concavidades, que da por resultado 0.48 mg/mL de proteina en cada concavidad. Las resinas se cargaron al transferir 150 L de la placa de carga a la placa de filtro y luego se incubaron 20 minutos en una plataforma de agitación para facilitar la unión. La placa filtro se centrifugó y el filtrado se recolectó en una placa UV de 96 concavidades. La concentración de proteina en el filtrado, o flujo de paso, se calculó como (A280-A320) /l ¦ 3. La placa de filtro entonces se lavó con 150 iL de ácido acético 100 m , seguido por 150 L de guanidina 4M-HC1 y acetato de sodio 50 mM a pH 4.0. La concentración de proteina se midió en el nuevo filtrado como se describe anteriormente. Como se muestra en la Tabla 6, las resinas se acoplaron a los péptidos 747, 747, 748 y 749 unidos a BMP-12 con una alta afinidad en los amortiguadores 1-5 de carga. Sin embargo, para los péptidos 750 y 751, la unión fue más fuerte en MES 25 mM a pH 6 pero débil en ácido acético 50 mM con NaCl 0.1 M a pH 3.0, que puede permitir un proceso eficiente de elución con unión sin la necesidad de caotropos o reactivos orgánicos. El flujo de paso y las muestras de elución de ácido acético en la columna 4 de la placa (cargada con MES pH 6) se analizaron en un gel (Figura 14) .

Tabla 5 Nombre de Péptido ID Péptido B P2 N-trun 1S 751 Ac-SDVGWNDWIVAPPGYHAFYSHGEK BMP2 N-trun 1 750 Ac-SDVGWNDWIVAPPGYHAFYCHGEK BMP12 N-trun 1S 749 Ac-ELGWDDWI IAPLDYEAYHSEGLK B P5 748 Ac-RDLGWQDWIIAPEGYAAFYSDGEK BMP2 Saturado 747 Ac-LYVDFSDVGWNDWIVAPPGYHAFYS HGEK BMP2 C-trunc 2 746 Ac-LYV**SDVGWNDWIVK BMP2 N-trunc 2 745 Ac-VAPPGYHAFYSHGEK Tabla 6 Condiciones 1 2 3 4 5 6 10 11 12 de carga* Resina Ácido Ácido Acetato MES 25nM, HEPES CHES 1 , Tris 5QrrM, Tris 5QttM, Tris 50 itM, acético acético 50 NaA 25 pH 6.0 25nM, pH pH 9.7 NaCl 0.1M, NaCl 0.25M, NaCl 0.1M, 50 itM, p?, NaCl itM, pH 7.0 MPD 40%, pH MPD 30%, pH MPD 20%, pH NaCl 0.1 0.1M, pH 4.0 5.0 8.0 8.0 8.0 M, pH 2.9 Fluj o de Control 0 1 1 1 1 -1 0 0 0 paso, K 745 1 1 1 0 1 -1 0 0 0 74 6 7 25 18 47 6 -1 0 0 0 747 10 47 28 38 11 -1 0 0 0 748 11 59 57 62 23 -1 1 1 1 749 5 26 42 56 9 -1 0 0 1 750 1 6 6 36 2 -1 0 1 1 751 1 6 9 38 4 -1 0 0 1 Condiciones 1 2 3 4 5 6 10 11 12 de carga* Resina Ácido Ácido Acetato MES 25itM, HEPES CHES 1M, Tris 50nM, Tris 50ttM, Tris 50 nM, acético acético 50 NaA 25 pH 6.0 25rrM, pH pH 9.7 NaCl 0.1M, NaCl 0.25M, NaCl 0.1M, 50 p?, nM, NaCl nM, pH 7.0 MPD 40%, pH MPD 30%, pH MPD 20%, pH NaCl 0.1 0.1M, pH 4.0 5.0 8.0 8.0 8.0 M, pH 2.9 ConcentraControl 0.066 0.064 0.070 0.129 0.073 * Condiciones de carga que desarrollaron ción de 745 0.058 0.057 0.073 0.104 0.077 la precipitación: Elución con 746 0.154 0.208 0.296 0.320 0.249 HEPES 50 nM, NaCl 0.5M, 1-propanol al 25%, pH 7.0.

Hac 100 mM, 747 0.123 0.147 0.274 0.324 0.255 Tris 50 nM , NaCl 0.5M, IPA 25%, pH 8.6 mg/ml 748 0.123 0.151 0.264 0.304 0.257 HEPES 50 nM, NaCl 0.5M, ter-butanol al 25%, pH 7.0 749 0.098 0.175 0.275 0.321 0.280 ,750. 0.096 0.194 0.226 0.311 0.187 751 0.102 0.219 0.285 0.355 0.254 Condiciones 1 2 3 4 5 6 10 11 12 de carga* Resina Ácido Ácido Acetato MES 25nM, HEPES CHES 1M, Tris 50nM, Tris 50nM, Tris 50 nM, acético acético 50 NaA 25 pH 6.0 25nM, pH pH 9.7 NaCl 0.1M, NaCl 0.25M, NaCl 0.1M, 50 itM, nM, NaCl nM, pH 7.0 MPD 40%, pH MPD 30%, pH MPD 20%, pH NaCl 0.1 O.m, pH 4.0 5.0 8.0 8.0 8.0 M, pH 2.9 Elución de Control 0 0 0 -1 0 10 Hac 100 mM, 745 1 1 0 -1 0 K 746 3 3 1 1 1 747 6 6 2 1 1 748 6 6 2 2 2 749 6 4 2 1 1 750 1 2 1 1 0 751 1 1 1 1 0 Condiciones 1 2 3 4 5 6 10 11 12 de carga* Resina Ácido Ácido Acetato MES 25rtM, HEPES CHES 1M, Tris 50rrM, Tris 50nM, Tris 50 nM, acético acético 50 NaA 25 pH 6.0 25nM, pH pH 9.7 NaCl 0.1 , NaCl 0.25M, NaCl 0.1M, 50 itM, p?, NaCl irM, pH 7.0 MPD 40%, pH MPD 30%, pH MPD 20%, pH NaCl 0.1 0.1M, pH 4.0 5.0 8.0 8.0 8.0 M, pH 2.9 Gnd 4M, NaAc Control 0.029 0.023 0.025 0.031 0.021 10 50 mM, pH 4, 745 0.024 0.026 0.026 0.027 0.021 concentra746 0.135 0.162 0.100 0.070 0.068 ción tira, 747 0.150 0.150 0.111 0.065 0.074 ' mg/ml 748 0.177 0.229 0.140 0.091 0.105 749 0.141 0.196 0.126 0.079 0.093 750 0.044 0.087 0.072 0.060 0.046 751 0.046 0.089 0.070 0.053 0.044 Serán evidentes otras modalidades de la invención para aquéllos expertos en la técnica a partir de una consideración de la especificación o práctica de la invención descrita en la presente. Se propone que la especificación y los ejemplos se consideren sólo como ejemplo, con el alcance y espíritu verdadero de la invención que se indica por las siguientes reivindicaciones. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (89)

1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Medio cromatográfico, caracterizado porque comprende una resina de cromatografía derivatizada con un péptido que es al menos 75% homólogo a una porción de una proteína que es un miembro de la superfamilia de TGF-ß.
2. 2. Medio cromatográfico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el miembro es un TGF-ß, un factor de diferenciación de crecimiento (GDF) , una proteína morfogénica ósea, una activina, o una inhibina.
3. 3. Medio cromatográfico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el péptido es una molécula sustancialmente completa de la proteína.'
4. 4. Medio cromatográfico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el péptido es al menos 75 % homólogo a una porción de un péptido de dedo-1 del miembro .
5. 5. Medio cromatográfico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el péptido es al menos 80 % homólogo a una porción de un péptido de dedo-1 del miembro .
6. 6. Medio cromatográfico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el péptido es al menos 85 % homólogo a una porción de un péptido de dedo-1 del miembro .
7. 7. Medio cromatográfico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el péptido es al menos 90 % homólogo a una porción de un péptido de dedo-1 del miembro .
8. 8. Medio cromatográfico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el péptido es al menos 95 % homólogo a una porción de un péptido de dedo-1 del miembro .
9. 9. Método para purificar una muestra que incluye un factor de crecimiento que es un miembro de la superfamilia de TGF-ß, caracterizado porque comprende: proporcionar una columna de cromatografía que contiene una resina de cromatografía derivatizada con un péptido que es al menos 75 % homólogo a una porción de una proteína que es un miembro de la superfamilia de TGF-ß; cargar la columna con la muestra bajo condiciones en las cuales el factor de crecimiento tiende a agregarse; y eluir el factor de crecimiento de la columna bajo condiciones en las cuales el factor de crecimiento tiende a solubilizarse .
10. 10. Método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque el péptido no es una porción del factor de crecimiento.
11. 11. Método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque el miembro es un TGF-ß, un factor de diferenciación de crecimiento (GDF) , una proteina morfogénica ósea, una activina, o una inhibina.
12. 12. Método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque el péptido es una molécula sustancialmente completa de la proteina.
13. 13. Método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque el péptido es al menos 75 % homólogo a una porción de un péptido de dedo-1 del miembro.
14. 14. Método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque el péptido es al menos 80 % homólogo a una porción de un péptido de dedo-1 del miembro.
15. 15. Método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque el péptido es al menos 85 % homólogo a una porción de un péptido de dedo-1 del miembro.
16. 16. Método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque el péptido es al menos 90 % homólogo a una porción de un péptido de dedo-1 del miembro.
17. 17. Método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque el péptido es al menos 95 % homólogo a una porción de un péptido de dedo-1 del miembro.
18. 18. Medio cromatográfico, caracterizado porque comprende : una resina de cromatografía derivatizada con un péptido que es al menos 75 % homólogo a una porción de un péptido de dedo-1 de un miembro de la superfamilia de TGF-ß.
19. 19. Medio cromatográfico de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque el péptido es al menos 80 % homólogo a la porción.
20. 20. Medio cromatográfico de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque el péptido es al menos 90 % homólogo a la porción.
21. 21. Medio cromatográfico de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque el péptido es al menos 95 % homólogo a la porción.
22. 22. Medio cromatográfico de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque el miembro es un TGF-ß, un factor de diferenciación de crecimiento (GDF) , una proteina morfogénica ósea, una activina, o una inhibina.
23. 23. Solución de proteínas morfogénicas óseas en un solvente, caracterizada porque comprende: una concentración predeterminada de una proteína morfogénica ósea predeterminada; y una concentración predeterminada de un péptido que es al menos 75 % homólogo a una porción de un péptido de dedo-1 de un miembro de la superfamilia de TGF-ß.
24. 24. Solución de conformidad con la reivindicación 23, caracterizada porque el miembro de la superfamilia de TGF-ß no es la proteína morfogénica, ósea, predeterminada.
25. 25. Solución de conformidad con la reivindicación 23, caracterizada por el miembro de la superfamilia de TGF-ß es la proteina morfogénica ósea, predeterminada.
26. 26. Solución de conformidad con la reivindicación 23, caracterizada porque el miembro es un TGF-ß, un factor de diferenciación de crecimiento (GDF) , una proteina morfogénica ósea, una activina, o una inhibina.
27. 27. Solución de conformidad con la reivindicación 23, caracterizada porque el péptido es al menos 80 % homólogo a la porción.
28. 28. Solución de conformidad con la reivindicación 23, caracterizada porque el péptido es al menos 85 % homólogo a la porción.
29. 29. Solución de conformidad con la reivindicación 23, caracterizada porque el péptido es' al menos 90 % homólogo a la porción.
30. 30. Solución de conformidad con la reivindicación 23, caracterizada porque el péptido es al menos 95 % homólogo a la porción.
31. 31. Método para estabilizar una solución de la proteina morfogénica ósea, caracterizado porque comprende: adicionar una concentración predeterminada de un péptido que es al menos 75 % homólogo a una porción de un péptido de dedo-1 de un miembro de la superfamilia de TGF-ß a una solución de la proteina morfogénica ósea.
32. 32. Método de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque el miembro de la superfamilia de TGF-ß no es la proteina morfogénica, ósea, predeterminada.
33. 33. Método de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque el miembro de la superfamilia de TGF-ß es la proteina morfogénica, ósea, predeterminada.
34. 34. Método de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque el miembro es un TGF-ß, un factor de diferenciación de crecimiento (GDF) , una proteina morfogénica, ósea, una activina, o una inhibina.
35. 35. Método de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque el péptido es al menos 80 % homólogo a la porción.
36. 36. Método de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque el péptido es al menos 85 % homólogo a la porción .
37. 37. Método de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque el péptido es al menos 90 % homólogo a la porción .
38. 38. Método de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque el péptido es al menos 95 % homólogo a la porción .
39. 39. Composición, caracterizada porque comprende: un péptido que es al menos 75 % homólogo a una porción de un péptido de dedo-1 de un miembro de la superfamilia de TGF-ß; y un portador.
40. 40. Composición de conformidad con la reivindicación 39, caracterizada porque el portador es un solvente, un gel, un polímero, hueso desmineralizado, una sutura, una malla quirúrgica, una cerámica, una micela, o cualquier combinación de los anteriores.
41. 41. Composición de conformidad con la reivindicación 39, caracterizada porque el portador es una solución amortiguadora.
42. 42. Composición de conformidad con la reivindicación 39, caracterizada porque el portador comprende colágeno.
43. 43. Composición de conformidad con la reivindicación 39, caracterizada porque el portador es una esponja de colágeno.
44. 44. Composición de conformidad con la reivindicación 39, caracterizada porque el portador es un material basado en celulosa .
45. 45. Composición de conformidad con la reivindicación 39, caracterizada porque el portador comprende uno o más de 'alquilcelulosa (incluyendo hidroxialquilcelulosa) , incluyendo metilcelulosa, etilcelulosa, hidroxietilcelulosa, hidroxipropil-celulosa, hidroxipropil-metilcelulosa , y carboximetilcelulosa .
46. 46. Composición de conformidad con la reivindicación 39, caracterizada porque el portador comprende poligliconato, ácido hialurónico, ácido polilácetico, poli (etilenglicol) , alginato de sodio, poli (etilenglicol) , óxido de polioxietileno, polímero de carboxivinilo, y poli (alcohol vinílico) .
47. 47. Composición de conformidad con la reivindicación 39, caracterizada porque el péptido se estabiliza por uno o más de un poli (propilenglicol ) conjugado, un grupo sialilo conjugado, una cadena de polisialilo conjugada, incorporación de aminoácidos modificados, incorporación de aminoácidos no naturales, enlaces covalentes inter-cadena, enlaces covalentes intra-cadena, enlaces no covalentes inter-cadena, enlaces no covalentes inter-cadena, y un mejorador de presentación.
48. 48. Composición de conformidad con la reivindicación 39, caracterizada porque el miembro es un TGF-ß, un factor de diferenciación de crecimiento (GDF) , una proteína morfogénica ósea, una activina, o una inhibina.
49. 49. Composición de conformidad con la reivindicación 39, caracterizada porque el miembro es BMP-2, BMP-12, BMP-9, GDF-19, BMP-3, BMP-15, GDF-9, GDF-3, BMP-4, un TGF-ß, o GDF-8.
50. 50. Composición de conformidad con la reivindicación 39, caracterizada porque el péptido es al menos 80 % homólogo a la porción.
51. 51. Composición de conformidad con la reivindicación 39, caracterizada porque el péptido es al menos 85 % homólogo a la porción.
52. 52. Composición de conformidad con la reivindicación 39, caracterizada porque el péptido es al menos 90 % homólogo a la porción.
53. 53. Composición de conformidad con la reivindicación 39, caracterizada porque el péptido es al menos 95 % homólogo a la porción.
54. 54. Composición, caracterizada porque comprende: un péptido que es al menos 75 % homólogo a una porción de un péptido de dedo-1 de un miembro de la superfamilia de TGF-ß; y un agente que incrementa la estabilidad in vivo del péptido con respecto a la eliminación de un animal.
55. 55. Composición de conformidad con la reivindicación 54, caracterizada porque el agente comprende etileno-acetato de vinilo, polianhidridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres, y ácido poliláctico.
56. 56. Composición de conformidad con la reivindicación 54, caracterizada porque el agente es un sistema de distribución microencapsulado o una suspensión liposómica. •
57. 57. Composición de conformidad con la reivindicación 54, caracterizada porque el agente es un poli (alquilenglicol ) .
58. 58. Composición de conformidad con la reivindicación 54, caracterizada porque el agente se une de manera covalente o no covalente al péptido, y en donde el agente se selecciona de un poli (alquilenglicol) , grupo sialilo, cadena de poli ( sialilo) , metilo, sulfato, un aminoácido no natural, un beta-residuo, un intensificador de presentación, o un residuo de aminoácido que tiene un grupo tiol, un aceptador de enlace de hidrógeno,. o un donador de enlace de hidrógeno.
59. 59. Composición de conformidad con la reivindicación 54, caracterizada porque el miembro es un TGF-ß, un factor de diferenciación de crecimiento (GDF) , una proteina morfogénica ósea, una activina, o una inhibina.
60. 60. Composición de conformidad con la reivindicación 54, caracterizada porque el miembro es BMP-2, BMP-12, BMP-9, GDF-19, B P-3, BMP-15, GDF-9, GDF-3, BMP-4, un TGF-ß, o GDF-8.
61. 61. Composición de conformidad con la reivindicación 54, caracterizada porque el péptido es al menos 80 % homólogo a la porción.
62. 62. Composición de conformidad con la reivindicación 54, caracterizada porque el péptido es al menos 85 % homólogo a la porción.
63. 63. Composición de conformidad con la reivindicación 54, caracterizada porque el péptido es al menos 90 % homólogo a la porción.
64. 64. Composición de conformidad con la reivindicación 54, caracterizada porque el péptido es al menos 95 % homólogo a la porción.
65. 65. Método de ensayo, caracterizado porque comprende : poner en contacto una población de células con un péptido que es al menos 75 % homólogo a una porción de un péptido de dedo-1 de un miembro de la superfamilia de TGF-ß; y detectar un cambio en una característica de las células cuando el péptido está presente versus cuando el péptido está ausente.
66. 66. Método de ensayo de conformidad con la reivindicación 65, caracterizado porque el miembro es un TGF-ß, un factor de diferenciación de crecimiento (GDF) , una proteína morfogénica ósea, una activina, o una inhibina.
67. 67. Método de ensayo de conformidad con la reivindicación 65, caracterizado porque el péptido es al menos 80 % homólogo a la porción.
68. 68. Método de ensayo de conformidad con la reivindicación 65, caracterizado porque el péptido es al menos 85 % homólogo a la porción.
69. 69. Método de ensayo de conformidad con la reivindicación 65, caracterizado porque el péptido es al menos 90 % homólogo a la porción.
70. 70. Método de ensayo de conformidad con la reivindicación 65, caracterizado porque el péptido es al menos 95 % homólogo a la porción.
71. 71. Método de ensayo de conformidad con la reivindicación 65, caracterizado porque la característica se selecciona de un estado en un ciclo celular, expresión de un gen o proteina, una característica fenotípica visible o medible, un nivel de expresión de un gen o proteína, y la traducción de una señal desde un receptor.
72. 72. Método de ensayo de conformidad con la reivindicación 65, caracterizado porque además comprende poner en contacto las células con una proteína que es un miembro de la superfamilia de TGF-ß.
73. 73. Método de ensayo de conformidad con la reivindicación 65, caracterizado porque el péptido se restringe en una configuración particular.
74. 74. Método de ensayo, caracterizado porque comprende : poner en contacto una población de receptores con una cantidad conocida de un péptido que es al menos 75 % homólogo a un péptido de dedo-1 de una porción de un miembro de la superfamilia de TGF-ß; detectar un cambio en la cantidad de péptido que no está unido a los receptores.
75. 75. Método de ensayo de conformidad con la reivindicación 74, caracterizado porque el péptido se restringe en una configuración particular.
76. 76. Método de ensayo de conformidad con la reivindicación 74, caracterizado porque además comprende poner en contacto los receptores con una proteína que es un miembro de la superfamilia de TGF-ß.
77. 77. Método de ensayo de conformidad con la reivindicación 74, caracterizado porque el miembro es un TGF-ß, un factor de diferenciación de crecimiento (GDF) , una proteina morfogénica ósea, una activina, o una inhibina.
78. 78. Método de ensayo de conformidad con la reivindicación 74, caracterizado porque el péptido es al menos 80 % homólogo a la porción.
79. 79. Método de ensayo de conformidad con la reivindicación 74, caracterizado porque el péptido es al menos 85 % homólogo a la porción.
80. 80. Método de ensayo de conformidad con la reivindicación 74, caracterizado porque el péptido es al menos 90 % homólogo a la porción.
81. 81. Método de ensayo de conformidad con la reivindicación 74, caracterizado porque el péptido es al menos 95 % homólogo a la porción.
82. 82. Método de ensayo, caracterizado porque comprende : poner en contacto una población de receptores con una cantidad conocida de un . péptido que es al menos 75 % homólogo a un péptido de dedo-1 de una porción de un miembro de la superfamilia de TGF-ß y una molécula pequeña; y detectar un cambio en la cantidad de péptido que no está unida a los receptores cuando la molécula pequeña está presente versus cuando la molécula pequeña está ausente.
83. 83. Método de ensayo de conformidad con la reivindicación 82, caracterizado porque el péptido se restringe en una configuración particular.
84. 84. Método de ensayo de conformidad con la reivindicación 82, caracterizado porque además comprende poner en contacto los receptores con una proteina que es un miembro de la superfamilia de TGF-ß.
85. 85. Método de ensayo de conformidad con la reivindicación 82, caracterizado porque el miembro es un TGF-ß, un factor de diferenciación de crecimiento (GDF) , una proteina morfogénica ósea, una activina, o una inhibina.
86. 86. Método de ensayo de conformidad con la reivindicación 82, caracterizado porque el péptido es al menos 80 % homólogo a la porción.
87. 87. Método de ensayo de conformidad con la reivindicación 82, caracterizado porque el péptido es al menos 85 % homólogo a la porción.
88. 88. Método de ensayo de conformidad con la reivindicación 82, caracterizado porque el péptido es al menos 90 % homólogo a la porción.
89. 89. Método de ensayo de conformidad con la reivindicación 82, caracterizado porque el péptido es al menos 95 % homólogo a la porción.