MX2009001702A

MX2009001702A - Metodos y composiciones para la conservacion y/o preparacion de un organo o tejido para trasplante.

Info

Publication number: MX2009001702A
Application number: MX2009001702A
Authority: MX
Inventors: Jack Finkelstein Jr; C Neil Lyons
Original assignee: Regenerx Biopharmaceuticals
Priority date: 2006-08-18
Filing date: 2007-08-06
Publication date: 2009-03-26
Also published as: WO2008024195A3; US20100278934A1; IL196995A0; JP2010501486A; AU2007288410A1; CN101505782A; EP2061491A2; WO2008024195A2; KR20090049605A; CA2660928A1

Abstract

Un método para la conservación o preparación de un órgano o tejido para trasplante para un sujeto, el cual incluye la administración a un sujeto, órgano o tejido que requiere dicho tratamiento, de una cantidad efectiva de una composición que incluye un agente polipéptido que incluye timosina beta 4 (TB4), una isoforma, análogo o derivado de TB4 que tiene actividad biológica de TB4, una variante de TB4 con terminación N que tiene actividad biológica de TB4, una variante TB4 con terminación C que tiene actividad biológica de TB4, LKKTET o una variante conservativa de ésta, LKKTNT o una variante conservativa de ésta, KLKKTET o una variante conservativa de ésta, LKKTETQ o una variante conservativa de ésta, sulfóxido de TB4, TB4ala, TB9, TB10, TB11, TB12, TB13, TB14, TB15, gelsolin, proteína de unión de vitamina D (DBP), profilin, cofilin, adsevertin, propomiosin, fincilin, depactin, Dnasel, vilin, fragmin, severin, proteína de recubrimiento, ß-actinin o acumentin, o un agente de estimulación que estimule la producción de dicho agente polipéptido en dicho órgano o tejido, o una variante conservativa de éste, en dicho órgano o tejido.

Description

COMPOSICIONES Y MÉTODOS PARA LA CONSERVACIÓN Y/O PREPARACIÓN DE UN ÓRGANO O TEJIDO PARA TRASPLANTE Campo de la Invención La presente invención se relaciona con el campo de la conservación y/o preparación de un órgano o tejido para trasplante.

Antecedentes de la Invención La presente solicitud reivindica el beneficio de la solicitud de patente provisional de los Estados Unidos de América número 60/838,383, presentada el 18 de agosto de 2006.

La hipotermia se utiliza en la mayoría de los métodos de conservación de órganos y tejidos, y ha demostrado ser aplicada de manera más efectiva controlando el ambiente extracelular de las células directamente, y el medio ambiente intracelular de manera indirecta, durante la exposición al frío. El control del ambiente extracelular de las células para optimizar la conservación se basa en diferentes estrategias que incluyen ya sea almacenamiento frió estático (o conservación por inundación), o perfusión continua de baja temperatura. Estas estrategias requieren de una variedad de planteamientos para control intervencionista del ambiente extracelular con el propósito de optimizar la conservación, y de aquí elementos de diseño diferentes para las soluciones utilizadas para realizar estas estrategias. En principio, el almacenamiento o conservación por inundación en frío está basada en la premisa de que la reducción de la temperatura a cerca pero no por debajo del punto de congelación (por ejemplo, aproximadamente 0 °C) excluye la necesidad de soportar el metabolismo en algún grado importante, y de que la distribución correcta de agua e iones entre los compartimientos intracelulares y extracelulares puede mantenerse por medios físicos más que por medios metabólicos. Durante un periodo en el que las bombas metabólicas están inactivas, la fuerza de impulsión para el flujo de iones transmembrana es la diferencia en el equilibrio iónico entre el fluido intracelular y extracelular. La fuerza de impulsión para la absorción de agua (hinchamiento celular) son los iones intracelulares impermeant. De esta manera pueden prevenirse o restringirse los cambios mediante la manipulación del ambiente extracelular para anular los potenciales gradientes químicos.

Sobre esta base se han concebido y evaluado una variedad de soluciones de inundación o de lavado de órganos y tejidos para almacenamiento en frío. Estas soluciones con frecuencia son referidas como soluciones "intracelulares" debido a su semejanza, en algunos aspectos, al fluido intracelular. Los elementos de diseño principales de las soluciones para inundación "intracelular" han consistido en ajustar el equilibrio iónico (notablemente de los cationes monovalentes) y en elevar la osmolalidad mediante la inclusión de un soluto impermeant para equilibrar la presión osmótica intracelular responsable de la absorción del agua. Sin embargo, un factor importante para la eficacia de las soluciones para inundación en frió puede ser la prevención de edema celular mediante la inclusión de solutos impermeant puesto que se ha establecido que los desequilibrios iónicos, especialmente el agotamiento de potasio, son susceptibles de revertirse de manera rápida y fácil. Estos métodos estabilizan los órganos y tejidos durante aproximadamente 4-36 horas. Antes del año 1988, una solución estándar para la conservación clínica de órganos y tejidos era la solución de Collins, la cual incluía fosfato de potasio, sulfato de magnesio y glucosa. En años recientes, sin embargo, está ha sido sustituida ya sea por una versión modificada denominada "Euro-Collins" en la que se omite el sulfato de magnesio, o de manera más extendida por la solución de la University of Wisconsin (UW solution) en la cual la mayoría del anión del fosfato ha sido reemplazado con lactobionato, y en la cual la glucosa ha sido reemplazada con rafmosa. Estas moléculas mucho más grandes parecen mejorar la protección en contra de los efectos adversos de la hinchazón celular durante el almacenamiento hipotérmico, en comparación con las soluciones anteriores. Existe en la técnica la necesidad de composiciones y métodos mejorados para la conservación y preparación de órganos y tejidos para trasplante.

Compendio de la Invención De acuerdo con un aspecto, un método y composición para la conservación y/o preparación de un órgano o tejido, para su trasplante a un sujeto, involucra la administración a un órgano, tejido o un sujeto, de una cantidad efectiva de una composición que comprende un agente polipéptido que comprende timosina beta 4 (TB4), una isoforma, análogo o derivado de TB4 que tenga actividad biológica de TB4, una variante de TB4 con terminación N que tenga actividad biológica de TB4, una variante de TB4 con terminación C que tenga actividad biológica de TB4, LKKTET o una variante conservativa de ésta, LKKTNT o una variante conservativa de ésta, KLKKTET o una variante conservativa de ésta, LKKTETQ o una variante conservativa de ésta, sulfóxido de TB4, TB4ala, TB9, TB10, TB 1 1, TB 12, TB13, TB14, TB 15, gelsolin, proteína de unión de vitamina D (DBP), profílin, cofílin, adsevertin, propomiosin, fincilin, depactin, Dnasel, vilin, fragmin, severin, proteína de recubrimiento, ß-actinin o acumentin, o un agente de estimulación que estimule la producción de dicho polipéptido, o una variante conservativa de éste, en dicho órgano o tejido, a fin de conservar y preparar un órgano o tejido para trasplante.

Descripción Detallada de la Modalidades Preferidas de la Invención Sin estar ligados a ninguna teoría específica, los polipéptidos secuestradores de actina tales como la timosina beta 4 (?ß4 o TB4) y otros agentes que incluyen polipéptidos o fragmentos de polipéptidos secuestradores de actina que contienen la secuencia de aminoácidos LKKTET o LKKTNT o variantes conservativas de éstas, conservan y preparan un órgano o tejido para trasplante. La timosina beta 4 se identificó inicialmente como una proteína que es sobre-regulada durante la migración y diferenciación de células endoteliales in vitro. La timosina beta 4 fue aislada originalmente a partir del timo y es un polipéptido ubicuo de 43 aminoácidos y 4.9 kDa, identificada en una variedad de tejidos. Se le han atribuido varios papeles a esta proteína incluyendo un papel en una diferenciación y migración de célula endotelial, diferenciación de célula T, secuestro de actina, vascularización y curación de heridas. Una composición de acuerdo con la invención puede ser administrada a un órgano o tejido el cual está presente dentro o fuera de un donador de trasplante o receptor de trasplante. De acuerdo con una modalidad, la invención es un método para la conservación y/o preparación de un órgano o tejido para trasplante para un sujeto, el cual comprende la administración a un órgano o tejido fuera de un sujeto una cantidad efectiva de una composición que comprende un agente polipéptido que comprende timosina beta 4 (TB4), una isoforma, análogo o derivado de TBA que tiene actividad biológica de TB4, una variante de TB4 con terminación N que tenga actividad biológica de TB4, una variante de TB4 con terminación C que tenga actividad biológica de TB4, LKKTET o una variante conservativa de ésta, LKKTNT o una variante conservativa de ésta, KLKKTET o una variante conservativa de ésta, LKKTETQ o una variante conservativa de ésta, sulfóxido de TB4, TB4ala, TB9, TB 10, TB1 1, TB12, TB13, TB14, TB15, gelsolin, proteína de unión de vitamina D (DBP), profilin, cofílin, adsevertin, propomiosin, fíncilin, depactin, Dnasel, vilin, fragmin, severin, proteína de recubrimiento, ß-actinin o acumentin, el cual puede ser un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos LKKTET o LKKTNT, o una variante conservativa de éstas, la cual conserva y/o prepara un órgano o tejido para trasplante. El agente polipéptido preferiblemente es Timosina ß4, y/o isoformas de ?ß4, análogos o derivados de ésta. Los ejemplos que incluyen polipéptidos que contienen la secuencia de aminoácidos son KLKKTET, LKKTETQ, variantes de ?ß4 con terminación N y variantes de ?ß4 con terminación C. La invención también puede utilizar ?ß4 oxidada. De acuerdo con otras modalidades, el agente polipéptido es diferente a la timosina beta 4 o a la ?ß4 oxidada. De acuerdo con otra modalidad, la invención consiste en un método para la conservación y/o preparación de un órgano o tejido para trasplante a un sujeto, el cual es ya sea un donador o un receptor de trasplante, el cual comprende la administración a un órgano o tejido dentro de un sujeto una cantidad efectiva de una composición que comprende un agente polipéptido que comprende timosina beta 4 (TB4), una isoforma, análogo o derivado de TB4 que tiene actividad biológica de TB4, una variante de TB4 con terminación N que tenga actividad biológica de TB4, una variante de TB4 con terminación C que tenga actividad biológica de TB4, LKKTET o una variante conservativa de ésta, LKKTNT o una variante conservativa de ésta, KLKKTET o una variante conservativa de ésta, LKKTETQ o una variante conservativa de ésta, sulfóxido de TB4, TB4ala, TB9, TB10, TB1 1 , TB12, TB13, TB14, TB15, gelsolin, proteína de unión de vitamina D (DBP), profílin, cofílin, adsevertin, propomiosin, fíncilin, depactin, Dnasel, vilin, fragmin, severin, proteína de recubrimiento, ß-actinin o acumentin, el cual puede ser un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos LKKTET o LKKTNT, o una variante conservativa de éstas, la cual conserva y/o prepara un órgano o tejido para trasplante. El agente polipéptido preferiblemente es Timosina ß4, y/o isoformas de ?ß4, análogos o derivados de ésta. Los ejemplos incluyen polipéptidos que contienen la secuencia de aminoácidos KLKKTET, LKKTETQ, variantes de ?ß4 con terminación N y variantes de ?ß4 con terminación C. La invención también puede utilizar ?ß4 oxidada. De acuerdo con otras modalidades, el agente polipéptido agente anti-microbiano es diferente a la timosina beta 4 o a la ?ß4 oxidada. El órgano puede incluir pero no limitarse a piel, corazón, hígado, riñon, páncreas, intestino delgado o pulmones. El tejido puede incluir, pero no se limita a, piel, corazón, válvulas cardiacas, hueso, médula ósea, vasos sanguíneos, y sangre para transfusión. Las composiciones que pueden ser usadas de acuerdo con la presente invención incluyen un agente polipéptido que comprende timosina beta 4 (TB4), una isoforma, análogo o derivado de TB4 que tiene actividad biológica de TB4, una variante de TB4 con terminación N que tenga actividad biológica de TB4, una variante de TB4 con terminación C que tenga actividad biológica de TB4, LKKTET o una variante conservativa de ésta, LKKTNT o una variante conservativa de ésta, KLKKTET o una variante conservativa de ésta, LKKTETQ o una variante conservativa de ésta, sulfóxido de TB4, TB4ala, TB9, TB10, TB11, TB12, TB13, TB14, TB15, gelsolin, proteína de unión de vitamina D (DBP), profilin, cofilin, adsevertin, propomiosin, fmcilin, depactin, Dnasel, vilin, fragmin, severin, proteína de recubrimiento, ß-actinin o acumentin, por ejemplo agentes de polipéptido tales como Timosina ß4 (?ß4), y/o isoformas, análogos o derivados de ?ß4, incluyendo ?ß4 oxidada, variantes de ?ß4 con terminación N y/o variantes de ?ß4 con terminación C, polipéptidos o fragmentos de polipéptidos que comprenden o consisten esencialmente en la secuencia de aminoácidos LKKTET o LKKTNT, o variantes conservativas de esta, los cuales conservan y/o preparan un órgano o tejido para trasplante. La solicitud de patente internacional PCT/US99/17282, la cual se incorpora a la presente como referencia, describe isoformas de ?ß4 las cuales pueden ser útiles de acuerdo con la presente invención, así como también la secuencia de aminoácidos LKKTET o LKKTNT, o variantes conservativas de éstas, las cuales pueden ser utilizadas con modalidades de la presente invención. La solicitud de Patente Internacional No. PCT/GB99/00833 (WO 99/49883), incorporada aquí como referencia, describe Timosina ß4 oxidada la cual puede ser utilizada de acuerdo con modalidades de la presente invención. Aunque la presente invención es descrita principalmente aquí con respecto a ?ß4 e isoformas de ?ß4, deberá entenderse que la siguiente descripción tiene la intención de ser igualmente aplicable a la secuencia de aminoácidos LKKTET o LKKTNT, polipéptidos y fragmentos que comprenden o consisten esencialmente en LKKTET o LKKTNT, variantes conservativas de estas, las cuales conservan y preparan un órgano o tejido para trasplante, y/o isoformas de ?ß4, análogos o derivados, que incluyen variantes de ?ß4 con terminación N, variantes de ?ß4 con terminación C y antagonistas de ?ß4. La invención también puede utilizar ?ß4 oxidada. Una solución de trasplante conocida es la solución de la University of Wisconsin, la cual puede contener, por ejemplo, KH2P04 (25 mmol/L), MgS04 (5 mmol/L. Rafinosa (30 mmol/L), Almidón de Pentafracción de Hidroxietilo (50 g/L), Penicilina (200,000 U/L), Insulina (40 U/L), Dexametasona (16 mg/dL), Lactobionato K (100 mmol/L), Hormona Estimulante del Glutation (3 mmol/L), Adenosina 5 (mmol/L), Allopurinol (1 mmol/L), Na (25 mmol/L) y K (125 mmol/L). Un agente de polipéptido tal como la timosina ß4, y/o isoformas de ?ß4 pueden agregarse a dicha solución en cantidades, por ejemplo, dentro del intervalo de aproximadamente 0.001 a 50% en peso. Otra solución para transplante conocida es la solución Euro-Collins la cual puede contener, por ejemplo, Sodio (10 raM), Cloruro (15 mM), Potasio (1 15 mM), Bicarbonato (10 mM), Fosfato (50 mM) y Glucosa (195 mM). Un agente de Polipétido tal como timosina ß4 (?ß4), y/o isoformas de ?ß4 pueden agregarse a dicha solución en cantidades, por ejemplo, dentro del intervalo de aproximadamente 0.001 a 50% en peso. En una modalidad, la invención provee un método para la conservación y/o preparación de un órgano o tejido para trasplante, para un sujeto, el cual comprende la administración a un órgano o tejido fuera de un sujeto, una cantidad efectiva de una composición que comprende un agente polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos LKKTET o LKKTNT, una variante conservativa de ésta, o un agente estimulante que estimula la producción, en dicho órgano o tejido de un polipéptido de LKKTET o LKKTNT, o una variante conservativa de ésta, a fin de conservar y/o preparar el órgano o tejido para trasplante.

En otra modalidad, la invención provee un método para la conservación y preparación de un órgano o tejido para trasplante, el cual comprende la administración a un órgano o tejido dentro de un sujeto, de una cantidad efectiva de una composición que comprende un agente polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos LKKTET o LKKTNT, una variante conservativa de ésta, o un agente estimulante que estimula la producción, en dicho órgano o tejido, de un polipéptido de LKKTET o LKKTNT, o una variante conservativa de ésta, en dicho órgano o tejido, a fin de conservar y/o preparar el órgano o tejido para trasplante. El órgano puede incluir pero no limitarse a piel, corazón, hígado, riñon, páncreas, intestino delgado o pulmones. El tejido puede incluir, pero no se limita a, piel, corazón, válvula cardiaca, hueso, médula ósea, vasos sanguíneos, y sangre para transfusión. En una modalidad, la invención provee un método para la conservación y/o preparación de un órgano o tejido para trasplante, para un sujeto, poniendo en contacto un órgano o tejido con una cantidad efectiva de una composición la cual contiene un agente polipéptido tal como se describe aquí. El contacto puede ser directo o de manera sistémica. Ejemplos de la administración directa incluyen, por ejemplo, poner en contacto el tejido, por medio de aplicación directa con una solución, loción, pomada, gel, crema, pasta, rocío, suspensión, dispersión, hidrogel, ungüento, espuma o aceite que comprende un agente polipéptido tal como se describe aquí mismo. La administración del agente puede incluir el almacenamiento estático en frío, la perfusión continua a baja temperatura, o cualquier otro método apropiado, preferiblemente a una temperatura dentro de un intervalo de aproximadamente -5 °C a aproximadamente 10 °C, más preferiblemente dentro de un intervalo de temperatura de aproximadamente -1 °C a aproximadamente 6 °C, todavía más preferiblemente dentro de un intervalo de temperatura de aproximadamente 0 °C a aproximadamente 5 °C, llevado a cabo mediante perfusión, inyección, infusión, de manera tópica, o una combinación de éstas usando una composición que contiene un agente polipéptido como se describe aquí mismo, en una solución de trasplante, o un portador farmacéuticamente aceptable que puede comprender agua para inyección. Han sido identificadas muchas isoformas de ?ß4 que tienen aproximadamente 70%, o aproximadamente 75%, o aproximadamente 80% o más de homología con la secuencia de aminoácidos conocida de la ?ß4. Tales isoformas incluyen, por ejemplo, ?ß43'3, ?ß9, ?ß??, ?ß? ?, ?ß12, ?ß13, ?ß14 y ?ß15. De igual manera que la ?ß4, se ha demostrado que las isoformas ?ß?? y ?ß15, secuestran la actina. Las ?ß4, ?ß?? y ?ß15, así como estas otras isoformas comparten una secuencia de aminoácidos, LKKTET o LKKTNT, que parece estar involucrada en la mediación del secuestro o la unión de la actina. Si bien no se desea estar ligado a ninguna teoría particular, la actividad de los agentes de polipéptido como los que se describen aquí puede deberse, cuando menos en parte, a la actividad anti-inflamatoria de dichos agentes. La ?ß4 también puede modular la polimerización de la actina (por ejemplo, parece ser que la ß-timosina despolimeriza la F-actina mediante el secuestro de la actina G libre). La capacidad de la ?ß4 para modular la polimerización de la actina puede deberse a su capacidad de unirse a o de secuestrar la actina a través de la secuencia LKKTET o LKKTNT. De esta manera, como con la ?ß4, otras proteínas que son anti-inflamatorias y/o se unen o secuestran a la actina, o que modulan la polimerización de la actina, incluyendo a las isoformas de la ?ß4 que tienen la secuencia de aminoácidos LKKTET o LKKTNT, son probablemente efectivas, solas o en combinación con la ?ß4, como se establece aquí mismo. Por lo tanto, se contempla de manera específica que polipéptidos conocidos de LKKTET o LKKTNT como se describe aquí mismo, incluyendo isoformas de la ?ß4, tales como la ?ß43"3, ?ß9, ?ß??, ?ß? ? , ?ß412, ?ß13, ?ß14 y ?ß15, así como también las isoformas de la ?ß4 que aún no han sido identificadas, serán útiles en los métodos de la invención, tejido u órgano. Como tales, los polipéptidos de LKKTET o LKKTNT como se describe aquí mismo, incluyendo isoformas de la ?ß4 son útiles en los métodos de la invención, incluyendo los métodos llevados a la práctica en un sujeto, tejido u órgano. La invención por lo tanto además provee composiciones que comprenden polipéptidos de LKKTET o LKKTNT como se describe aquí mismo, incluyendo la ?ß4, así como también las isoformas de ?ß4, tales como ?ß43'3, ?ß9, ?ß??, ?ß? ?, ?ß12, ?ß13, ?ß14 y ?ß15, y un portador farmacéuticamente aceptable y/o para trasplante. Además, otras proteínas o agentes que tienen actividad anti-inflamatoria y/o capacidad de secuestrar o de unirse a la actina, o que pueden movilizar la actina o modular la polimerización de la actina, como se demuestra en un ensayo adecuado de secuestro, unión, movilización o polimerización, o como se identifica mediante la presencia de una secuencia de aminoácidos que media la unión de la actina, tal como LKKTET o LKKTNT, por ejemplo, pueden de manera similar ser empleados en los métodos de la invención. Tales proteínas pueden incluir al gelsolin, proteína de unión de la vitamina D (DBP), profílin, cofilin, depactin, Dnasel, vilin, fragmin, severin, proteína de recubrimiento coronal, ß-actinin, y acumentin, por ejemplo. En virtud de que tales métodos incluyen aquellos que se practican en un sujeto, la invención además provee composiciones que comprenden gelsolin, proteína de unión de la vitamina D (DBP), profílin, cofilin, depactin, Dnasel, vilin, fragmin, severin, proteína de recubrimiento coronal, ß-actinin, y acumentin como se establece aquí mismo. De esta manera, la invención incluye el uso de un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos LKKTET o LKKTNT y variantes conservativas de éstas. Como se utiliza aquí, el término "variante conservativa" o las variaciones gramaticales de ésta, denotan el reemplazo de un residuo aminoácido por otro residuo biológicamente similar. Los ejemplos de las variantes conservativas incluyen el reemplazo de un residuo hidrofóbico tal como isoleucina, valina, leucina o metionina, por otro, el reemplazo de un residuo polar por otro, tal como la substitución de arginina por lisina, ácido glutámico por ácido aspártico, o glutamina por asparragina, y similares. La ?ß4 ha sido ubicada en una cantidad de tejidos y tipos de células y, de esta forma, agentes que estimulen la producción de un polipéptido de LKKTET o LKKTNT tal como la ?ß4 u otro agente de polipéptido como se describe aquí mismo, pueden agregarse a, o comprender, una composición para efectuar la producción de un agente de polipéptido a partir de un tejido y/o una célula. Tales agentes de estimulación pueden incluir miembros de la familia de factores de crecimiento, tales como el factor de crecimiento similar a insulina (IGF-1), factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), factor de crecimiento epidemial (EGF), factor beta de crecimiento de transformación (TGF-ß), factor de crecimiento de fibroblastos básicos (bFGF), timosina al (Tal) y factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF). Más preferiblemente, el agente de estimulación es el factor beta de crecimiento de transformación (TGF-ß) u otros miembros de la súper familia del TGF-ß.

De acuerdo con una modalidad, se trata un sujeto, órgano o tejido con un agente de estimulación que estimula la producción en el sujeto, órgano o tejido de un agente de polipéptido como se define aquí mismo. Adicionalmente, otros agentes que ayuden en la conservación y preparación de un órgano o tejido para trasplante pueden ser agregados a una composición conjuntamente con un agente de polipéptido como se describe aquí mismo. Por ejemplo, y de ninguna manera en forma de limitación, un agente de polipéptido como se describe aquí mismo solo o en combinación puede ser agregado en combinación con uno o más de los siguientes agentes: antibióticos, VEGF, KGF, FGF, PDGF, TGF-ß, IGF-1, IGF-2, IL-1, protimosina a y/o timosina al en una cantidad efectiva. La invención también incluye una composición que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de un agente de polipéptido como se describe aquí mismo en un portador farmacéuticamente aceptable y/o para trasplante. La dosis real de reactivo, formulación o composición que proporciona tratamiento puede depender de muchos factores, incluyendo la talla y salud del órgano, tejido o sujeto. Sin embargo, las personas con conocimientos normales en la técnica pueden usar cualquier método adecuado tal como aquellos que se conocen en la técnica para la determinación de la dosis apropiada para su uso. Las formulaciones adecuadas pueden incluir un agente de polipéptido como se describe aquí mismo en una concentración dentro del intervalo de aproximadamente 0.001 a 50% en peso, más preferiblemente dentro del intervalo de aproximadamente 0.01 a 0.1% en peso, más preferiblemente aproximadamente 0.05% en peso. Los planteamientos descritos aquí mismo involucran varias rutas de administración o repartición de un agente de polipéptido como se describe aquí mismo, incluyendo cualesquiera técnicas de administración convencionales (por ejemplo, pero no limitadas a, perfusión, inyección, infusión o de manera tópica) a un sujeto. Los métodos y composiciones que utilizan o contienen un agente polipéptido como se describió aquí mismo pueden estar formuladas en composiciones farmacéuticas mediante su mezcla con excipientes o portadores no tóxicos y farmacéuticamente aceptables y/o para trasplante.

La invención incluye el uso de anticuerpos que interactúan con, mejoran o inhiben un agente de polipéptido como se describió aquí mismo. Se proveen anticuerpos que consisten esencialmente en anticuerpos monoclonales acumulados con diferentes especificidades epitópicas, así como también distintas preparaciones de anticuerpos monoclonales. Los anticuerpos monoclonales son preparados a partir de fragmentos de la proteína que contienen antígeno, mediante métodos que se conocen bien por aquellos capacitados en la técnica como se describe en el documento PCT/US99/17282, supra. El término anticuerpo como se utiliza en esta invención significa que incluye anticuerpos monoclonales y policlonales. En todavía otra modalidad, la invención provee un método de tratamiento de un sujeto mediante la administración de una cantidad efectiva de un agente de estimulación que modula la expresión de genes. El término "modular" se refiere a la inhibición o supresión de la expresión cuando un agente de polipéptido como se describe aquí mismo es sobre expresado, y la inducción de la expresión cuando un agente de polipéptido como se describió aquí mismo es hipo expresado. El término "cantidad efectiva" significa aquella cantidad de agente de estimulación que es efectiva en la modulación de la expresión de genes de un agente de polipéptido como se describió aquí mismo, resultando en la conservación y/o preparación de un órgano o tejido para trasplante. Un agente de estimulación que modula la expresión de genes de un agente de polipéptido como se describió aquí mismo puede ser un poli nucleótido, por ejemplo. El poli nucleótido puede ser un antisentido, un agente triplex, o una ribozima. Por ejemplo, puede utilizarse un antisentido dirigido a la región de gen estructural o a la región promotora de un agente de polipéptido como se describió aquí mismo. El agente de estimulación el cual modula la expresión de genes de un agente de polipéptido como se describió aquí mismo también puede ser un pequeño ARNs de interferencia (siRNA). En otra modalidad, la invención provee un método para la utilización de compuestos que modulan la actividad de un agente de polipéptido como se describió aquí mismo. Los compuestos que afectan la actividad de un agente de polipéptido como se describió aquí mismo (por ejemplo, antagonistas y agonistas) incluyen polipéptidos, péptido miméticos, polipéptidos, compuestos químicos, minerales tales como el zinc y agentes biológicos.

Un método de tamisaje para un agente de estimulación como se definió aquí mismo comprende el poner en contacto un órgano o tejido para trasplante, con un compuesto candidato; y medir la actividad en dicho tejido de un polipéptido de LKKTET o LKKTNT, en donde un aumento de actividad de dicho péptido en dicho tejido u órgano, en comparación con un nivel de actividad de dicho polipéptido en un tejido u órgano correspondiente que carece de dicho compuesto candidato, indica que dicho compuesto es capaz de inducir dicho agente de estimulación.

Ejemplo 1 Materiales y Métodos Se obtuvieron células suturales hepáticas humanas HSC a partir de una mezcla de células de hígado adquiridas en ADMET Technologies después de la separación en un OptiPrep® Density Gradient Médium (Sigma). Se cultivaron hasta confluencia y posteriormente se colocaron en placa a una densidad de 250,000 células/plato de 60 milímetros y se cultivaron en MEM complementado con 10% de suero fetal de bovino, 1% de aminoácidos no esenciales y antibióticos. Las células fueron mantenidas en cultivo durante aproximadamente 48 horas y cuando era semi-confluentes se privaron de suero durante toda la noche usando MEM complementado con 1% de albúmina, antibióticos y 1% de aminoácidos no esenciales. Se extrajo el ARN con Trizol (Invitrogen) y se realizó RT-PCR usando cebadores. Se utilizó la expresión de GAPDH como control. Todos los experimentos se realizaron por duplicado.

Resultados El análisis PCR del ARN extraído a partir de HSC cultivadas durante 24 horas con diferentes concentraciones de ?ß4 reveló que la expresión del ARN de a-SMA, un marcador de HSC diferenciadas, y de ARNm de ß-catenin y de GSK 3ß, miembros de gen de la vía de Wnt que pueden estar involucrados en su diferenciación, se incrementó cuatro veces, 3 veces y 2.5 veces respectivamente. En muchas instancias, el incremento fue dependiente de la dosis. Se obtuvo la máxima expresión de a-SMA con 1 µg/ml de ?ß4, en tanto que el máximo aumento en el ARNm de ß-catenin se logró con 1 ng/ml. La expresión de otro marcador de la diferenciación de HSC, a saber: receptor de PDGF-ß, fue inhibida en una forma que dependía de la dosis (75% con 1 µ^p?? de ?ß4). De manera interesante, la expresión de ARNm de HGF, una citosina antifibrogénica conocida que juega un papel en la regeneración de hepatocito, aumentó 4 veces con 1 mg/ml de ?ß4. El Factor de Crecimiento de Hepatocito (HGF) es un factor trófico para hepatocitos. Lo anterior demuestra que la ?ß4 sobre regula la expresión de HGF por células suturales hepáticas. Se prepararon co-cultivos de HSC de rata y hepatocitos de humano. Se incubaron controles con medio normal definido de manera hormonal utilizado para hepatocitos. Los cultivos experimentales recibieron más de 100 ng/ml de ?ß4 en el mismo medio de cultivo. Las células fueron cosechadas después de una semana usando colagenasa y tripsina. Se separaron los hepatocitos de las HSC mediante centrifugación de baja velocidad y las células se contaron y utilizaron para extracción de ARN total. Los hepatocitos proliferaron y aumentaron en número después de una semana en cultivo. Se determinó la pureza de las fracciones celulares después de teñido con anticuerpos de anti-albúmina humana (las HSC de rata son negativas). Se utilizó ARN para RT-PCR y se analizó la expresión de genes específicos de hígado usando cebadores humanos. Se utilizaron cebadores de rata para determinar el grado de contaminación de las HSC de rata.

Claims

Reivindicaciones 1. Un método para conservar o preparar un órgano o tejido para trasplante, el cual comprende el poner en contacto el órgano o tejido con una composición que comprende un agente polipéptido que comprende timosina beta 4 (TB4), una isoforma, análogo o derivado de TBA que tiene actividad biológica de TB4, una variante de TB4 con terminación N que tiene actividad biológica de TB4, una variante de TB4 con terminación C que tiene actividad biológica de TB4, LKKTET o una variante conservativa de ésta, LKKTNT o una variante conservativa de ésta, KLKKTET o una variante conservativa de ésta, LKKTETQ o una variante conservativa de ésta, sulfóxido de TB4, TB4ala, TB9, TB10, TB11, TB12, TB13, TB14, TB15, gelsolin, proteína de unión de vitamina D (DBP), profílin, cofílin, adsevertin, propomiosin, fincilin, depactin, Dnasel, vilin, fragmin, severin, proteína de recubrimiento, ß-actinin o acumentin, o un agente de estimulación que estimule la producción de dicho agente polipéptido en dicho órgano o tejido, o una variante conservativa de éste, en dicho órgano o tejido, a fin de conservar o preparar dicho órgano o tejido para trasplante.
2. El método de la reivindicación 1, en donde dicho contacto es fuera del cuerpo de un sujeto.
3. El método de la reivindicación 1, en donde dicho contacto es dentro del cuerpo de un sujeto.
4. El método de la reivindicación 1, en donde dicho órgano o tejido es sometido a perfusión con dicha composición mientras está dentro del cuerpo de un sujeto.
5. El método de la reivindicación 4, en donde dicho cuerpo es un donador de dicho órgano o tejido.
6. El método de la reivindicación 4, en donde dicho cuerpo es de un receptor de dicho órgano o tejido.
7. El método de la reivindicación 4, en donde dicho tejido es piel, corazón, válvula cardiaca, hueso, médula ósea, vasos sanguíneos, o sangre para transfusión.
8. El método de la reivindicación 1, en donde dicho órgano es corazón, hígado, riñon, páncreas, intestino delgado o pulmón.
9. El método de la reivindicación 1, en donde dicha composición conserva dicho órgano o tejido para trasplante.
10. El método de la reivindicación 1, en donde dicho agente polipéptido es un polipéptido recombinante o sintético.
11. El método de la reivindicación 1, en donde dicha composición comprende ?ß4 o una isoforma de ?ß4.
12. El método de la reivindicación 1, en donde dicho agente polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos KLKKTET, la secuencia de aminoácidos LKKTETQ, una variante de ?ß4 con terminación N, una variante de ?ß4 con terminación C, o una isoforma de ?ß4.
13. El método de la reivindicación 1, en donde dicha composición está formulada para ser administrable ya sea de forma directa o de manera sistémica.
14. El método de la reivindicación 1, en donde dicha composición está formulada para ser administrable de manera directa y en forma de una formulación de solución, gel, crema, pasta, loción, rocío, suspensión, dispersión, ungüento, hidrogel, pomada, espuma o aceite.
15. El método de la reivindicación 1, en donde dicho agente polipéptido está formulado para ser administrable a dicho órgano o tejido mediante almacenamiento estático en frío o mediante perfusión continua a baja temperatura, a una temperatura dentro de un intervalo de aproximadamente -5 °C a aproximadamente 10 °C, a través de perfusión, inyección, infusión, de manera tópica o por una combinación de éstas. 16 El método de la reivindicación 1, en donde dicha composición además comprende una solución acuosa y cuando menos uno de fosfato de potasio, sulfato de magnesio, glucosa, lactobionato o rafínosa. 17. Una composición para conservar o preparar un órgano o tejido para trasplante, la cual comprende un agente polipéptido que comprende timosina beta 4 (TB4), una isoforma, análogo o derivado de TBA que tiene actividad biológica de TB4, una variante de TB4 con terminación N que tiene actividad biológica de TB4, una variante de TB4 con terminación C que tiene actividad biológica de TB4, LKKTET o una variante conservativa de ésta, LKKTNT o una variante conservativa de ésta, KLKKTET o una variante conservativa de ésta, LKKTETQ o una variante conservativa de ésta, sulfóxido de TB4, TB4ala, TB9, TB10, TB11, TB 12, TB13, TB14, TB15, gelsolin, proteína de unión de vitamina D (DBP), profilin, cofilin, adsevertin, propomiosin, fíncilin, depactin, Dnasel, vilin, fragmin, severin, proteína de recubrimiento, ß-actinin o acumentin, o un agente de estimulación que estimule la producción de dicho agente polipéptido en dicho órgano o tejido, o una variante conservativa de éste, dicha composición además comprendiendo una solución acuosa y cuando menos uno de fosfato de potasio o lactobionato, y cuando menos uno de glucosa o rafinosa. 18. La composición de la reivindicación 17, la cual comprende ?ß4 o una isoforma de ?ß4. 19. La composición farmacéutica de la reivindicación 17, la cual comprende ?ß4. 20. El método de la reivindicación 1, en donde dicha composición comprende ?ß4.