MX2010010456A - Deteccion y enumeracion de microorganismos. - Google Patents
Deteccion y enumeracion de microorganismos.Info
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Abstract
Un método para detectar y enumerar microorganismos viables en una muestra sospechada de contener los microorganismos (1) poner en contacto los microorganismos de la muestra con cuando menos un compuesto de reparación y un medio de crecimiento, y (2) detectar y cuantificar los microorganismos viables, en el que los microorganismos son de la especia Legionella pneumophila, y en el que el compuesto de reparación directa o indirectamente ocasiona un efecto sobre el metabolismo para reducir el esfuerzo oxidante del microorganismo. La invención también incluye un equipo para detectar y enumerar de manera más precisa microorganismos viables de la especie Lehgionella pneumophila en una muestra sospechada de contener dichos microorganismos.
Description
DETECCIÓN Y ENUMERACIÓN DE MICROORGANISMOS
La presente invención se relaciona con un método para detectar y enumerar microorganismos viables de la especie Legionella pneumophila en una muestra. La invención también incluye un equipo apropiado para uso en dicho método. Este método y equipo permite que los microorganismos viables se cuantifiquen más rápidamente.
Las bacterias Legionella son ubicuos en ambientes húmeros o mojados tales como tierra y habitantes acuáticos no marinos. También se pueden encontrar en instalaciones de agua caliente y fria, torres de enfriamiento y sistemas de acondicionamiento de aire y humidificadores de agua.
Las Letgionella, especialmente Legionella penumophila, son patógenos que pueden ocasiona una neumoniua bacterial aguda, generalmente conocida como "enfermedad de legionarios", que frecuente es letal para individuos infectados .
Tradicionalmente la detección y enumeración de Legionella penumophila se logran mediante cultivo de célula. Este método de puede lograr midiendo bacterias curables usando cuenta de placa o midiendo micro colonias que emplean un método de membrana de filtro. Estas técnicas evalúan las bacterias viables y su capacidad de formar una colonia o
micro colonia. Desafortunadamente, estos métodos usualmente requieren entre 3 y 10 días a fin de permitir que las colonias o micro colonias se formen. Cuando las instalaciones de agua todavía están en operación hay un riesgo inaceptable de infección humana durante este tiempo.
Otros métodos para detectar microorganismos de Legionella totales incluyen técnicas PCR (Reacción en Cadena de Polimerasa) . La PCR emplea polimerasa de ADN para amplificar una pieza de ADN mediante replicación enzimática in Vitro. Durante la progresión de la técnica el ADN generado se usa como una plantilla para réplica que ocasiona una reacción en cadena en la que la plantilla de ADN se amplifica exponencialmente . La PCR permite que una sola o pocas copias de una pieza de ADN se amplifiquen generando millones o más copias de la pieza de ADN. Típicamente dicho método se describe por Diederen y col., J. Med Microbiol. 2007, enero: 56 (Pt 1) :9 .101.
Sin embargo, una desventaja de PCR es que las muestras tienden a contener inhibidores de reacción de polimerización y, por lo tanto, no proporcionan consistentemente resultados cuantitativos. Además, la técnica se basa en un paso de purificación de ADN previo que puede resultar en pérdida de ADN con baja estimación consecuente de
la Legionella presente. Hasta cierto grado estas desventajas se superan mediante PCR de tiempo real que es cuantitativa. Sin embargo, la técnica no puede distinguir entre células viables y células no viables.
Otra técnica es hibridización fluorescente in situ
(FISH) en la que una sonda oligonucleotidica etiquetada mediante una substancia fluorescente penetra hacia las células de bacterias. Cuando los ácidos nucleicos ribosomales (rRNA) tienen la secuencia correcta a la sonda conocida como la meta, la sonda se fijará sola a su meta y no se removerá mediante cualquier paso de lavado subsecuente. La bacteria en la que la sonda se fija emitirá entonces una señal fluorescente. Esta señal fluorescente puede luego cuantificarse mediante técnicas tales como citometria de flujo, citometria de fase sólida, o microscopía epifluoscente . Una técnica FISH típica se describe por Dutil S y col J Appl Microbiol. Mayo de 2006, 100 ( 5 ): 955-63. Sin embargo, usar la técnica FISH sola el número total de Legionella pneumophila viable podría detectarse pero desafortunadamente el método no pudo identificar exclusivamente solamente aquellas bacterias de Legionella penumophila capaces de dividirse y en consecuencia hacer una colonia .
Un método adicional para enumerar Legionella pneumophila viable involucra ChemChrome V6 y se describe por Delgado-Viscogliosi y col Appl Environ Micribiol. Julio 2005: 71 (7) :4086-96. Este método permite la cuantificación de Legionella penumophila asi como discriminación entre bacterias viables y no viables. Combina detección especifica de células de Legionella usando anticuerpos y marcados de viabilidad bacterial (ChemChrome V6) y empleando microscopía epifluorescente para la enumeración. Sin embargo, aún cuando esta técnica distingue entre células viables y no viables no es capaz de identificar separadamente aquellas bacterias que forman colonia.
US 20070218522 describe métodos y composiciones para detectar y cuantificar Legionella viable y otras bacterias aeróbicas heterotróficas, el método incluye el uso de platinas de inmersión que incluyen un medio absorbente, substancias que promueven el crecimiento y selectivas de crecimiento para rápida detección y cuantificación de micro colonias de Legionella. Esta técnica no enumera las bacterias dañadas.
EP 1329515 se relaciona con un método para probar la presencia de microorganismos en un ambiente gaseoso que comprende peróxido de hidrógeno llevando el ambiente gaseoso
hacia contacto con un medio de crecimiento de agar que comprende una sal de ácido pirúvico y permitiendo del desarrollo de colonias de los microorganismos.
Las técnicas que involucran el crecimiento de colonias en un medio de crecimiento, tal como una placa de agar de nutriente, generalmente se considera que son más precisas. Consecuentemente, el método de cuenta de placa permanece la selección preferida de método para obtener la cuenta viable total. Esto generalmente significa aplicar una muestra sospechada de contener el microorganismo hacia una placa que contiene un fuente nutriente sólida o medio de crecimiento. Dicha técnica generalmente se refiere como enchapado. Mediante cuenta viable total damos a entender el número total de bacterias capaces de proporcionar una población discernible por el observador. Típicamente esto significará una colonia visible sobre la superficie de un medio de crecimiento tal como placa de agar de nutriente.
Sin embargo, los microorganismos tales como Legionella penumophila en el ambiente puede someterse a uno o más esfuerzos que impiden que el microorganismo crezca y se multiplique en su situación ambiental. Estos microorganismos tensados no se dividirían en absoluto ni formarían una colonia visible bajo condiciones de cultivo normales. En el
ambiente una proporción de células de microorganismos generalmente se tensará debido a condiciones ambientales, tales como muerte por hambre, presencia de biocida, choque térmico y desecación. Además, estas células pueden estar en un estado fisiológico vulnerable en el que la técnica de enchapado de los microorganismos puede exacerbar el tensado de esas células de microorganismos ya tensados debido a la presencia de oxígeno atmosférico. Además esto conduciría a muerte artificial de la bacteria tensada conduciendo a un cálculo bajo de la cuenta viable total.
Además, el bajo cálculo de Legionella penumophila viable con método de enchapado podría hacerse peligroso con respecto a su patogenicidad.
Desde los años de 1970 se ha reportado que limpiadores de especies de oxígeno reactivo (ROS) debe usarse para limitar el efecto de esfuerzo oxidante durante el proceso de enchapado. Esto fue reportado por Speck y col, la reparación y enumeración de coliformes dañadas mediante un procedimiento de enchapado, Appl Micriobiol 29, 549-59 (1975); Martin y col Catalase: su efecto en enumeración microbiana. Appl Environ Microbiol 32, 731-4 81976); Brewer y col Efectos benéficos de catalasa o piruvato en una técnica de número más probable para la detección de Staphylococcus
aureus. Appl Environ Microbiol 34, 797-800 (1977); McDonald y coll., Recuperación mejorada de Escherichia coli dañada por compuestos que degradan peróxido de hidrógeno o bloquean su formación. Appl Environ Microbiol 45, 360-5 81983); Marthi y col) Efectos de resucitación de catalasa en bacterias llevadas por el aire. Appl. Environ Microbiol 57, 2775-6 (1991); Busch y Donnelly Desarrollo de un caldo de reparación-enriquecimiento para resucitación de Listeria monocytogenes y Listeria innocua dañados por calor. Appl Environ Microbiol 58, 14-20 (1992); y Dukan y col, Defensa de esfuerzo oxidante y deterioro de células de Escherichia coli arrestadas en crecimiento. J Biol Chem 274, 26027-32 (1999).
Sin embargo, en todos los casos arriba mencionados los inventores de la presente invención creen que el ROS se podria reducir mediante una ruta directa en la que el compuesto reacciona químicamente con ROS.
Bérubé y col, "Detección e identificación rápida de Legionella pneumophila mediante inmunoensayo de membrana", Appolied and Environmental Microbiology, 1989, 55, 1640-1641 describe la detección e identificación de Legionella peneumoiphila mediante un ensayo de inmunomancha usando un anticuerpo monoclonal. No se proporciona medio para tratar con el problema de bacterias dañadas.
Un articulo por Pine y col (Papel de ácidos ceto y enzimas de limpieza de oxigeno reducido en el crecimiento de especie Legionella. J Clin Microbiol 23, 33-42 81986)) describe la necesidad de la adición de ácidos ceto y enzima de limpieza de oxigeno reducido es para optimizar el desarrollo de Legionella pneumophila y sugiere usar estos materiales en el medio usado para enumeración convencional de este microorganismo.
Sin embargo, el uso de ácidos ceto y enzima de limpieza de oxigeno reducida sola es insuficiente para reparar células de Legionella pneumophila tensadas para repararse y permitir enumeración precisa. Esto es especialmente asi cuando se usa un medio de crecimiento especifico para Legionella Penumophila, tal como medio de agar de extracto de levadura de carbón tamponado (BCYE) . De hecho, no existe dato disponible relacionado con la optimización de un medio convencional útil para la enumeración precisa de Legionella peneumophila.
De esta manera, un objetivo de la presente invención es encontrar un método para enumerar de manera precisa Legionella peneumophila. Esto es especialmente asi con respecto a su método convencional usando la técnica de enchapado.
De esta manera, de conformidad con la presente invención proporcionamos un método para detectar y enumerar microorganismos viables en una muestra sospechada de contener dichos microorganismos.
(1) poniendo en contacto los microorganismos de la muestra con cuando menos un compuesto de reparación y un medio de crecimiento, y
(2) incubar el producto del paso (1), y
(3) detectar y cuantificar los microorganismos viables,
en el que los microorganismos son de la especie Legionella penumophila, y en donde el compuesto de reparación ocasiona directa o indirectamente un efecto sobre el metabolismo para reducir el esfuerzo oxidante del microorganismo.
Mediante esfuerzo oxidante damos a entender un desequ8ilibrio entre la concentración de ROS (producción de endógeno o aducción de exógeno) y la capacidad de los microorganismos de destoxificar fácilmente los intermediarios reactivos o reparar eficientemente el daño resultante. Esta interrupción de los procesos metabólicos normales del microorganismo pueden ocasionar efectos tóxicos debido a la formación de radicales libres y agentes oxidantes, tales como peróxidos, que pueden conducir a daño a los componentes de
las células de microorganismos, por ejemplo ADN, proteínas o lípidos .
Ocasionar un efecto sobre el metabolismo del microorganismo significa ocasionar cambios a procesos químicos internos naturales dentro de la célula de microorganismo
La referencia a endógenamente significa cambios ocasionados dentro de la célula de microorganismo para reducir esfuerzo oxidante. Esto podría, pr ejemplo, ser cambios a los procesos metabólicos dentro del microorganismo. También puede incluir remoción de ROS dentro de la célula de microorganismo.
Deseablemente el compuesto de reparación podría ser o incluir cuando menos un compuesto que inhiba la formación de y/o degrade a ROS. En general, esto se lograría mediante modificación del metabolismo.
Sin embargo, el compuesto de reparación puede ser o incluir cuando menos un compuesto que inhiba indirectamente la formación de y/o degrade el ROS. Dicho compuesto que ejerce un efecto indirecto en el ROS puede hacer esto interfiriendo con el metabolismo del microorganismo. Dicho compuesto se puede considerar como reducir indirectamente ROS endógenamente por ejemplo durante la respiración aeróbica.
Hemos encontrado que el presente método induce la reparación de células de Legionella pneumophila tensadas y de esta manera proporciona de manera más precisa una cuenta viable total. Inesperadamente también hemos encontrado que el método reduce la cantidad de tiempo de incubación requerido. En general, encontramos que el método puede reducir el tiempo de incubación por varias horas y en algunos casos cuando menos un dia. En algunos casos el método de la presente invención puede reducir el tiempo de incubación en hasta varios días, v. gr., hasta cinco días, en comparación con el método convencional.
Inesperadamente, también encontramos que el método inventivo puede ocasionar una reducción de microorganismos de interferencia, es decir, aquellos microorganismos distintos a la Legionella pneumophila.
El método de la presente invención deseablemente involucra poner en contacto células de microorganismo de Legionella peneumophila tensadas con cuando menos un compuesto que inhibe la formación de y/o reduce y/o remueve ROS y esto tiende a inducir reparación de las células tensadas .
El microorganismo Legionella peneumophila se puede ocasionar directamente en contacto con el compuesto de
reparación durante la recolección de la muestra. De esta manera el recipiente hacia el que la muestra de agua, que se cree que contiene el microorganismo, se recoge puede ya contener el compuesto de reparación. Alternativamente una vez que una muestra de agua que contiene la Legionella peneumophila se ha recogido se puede diluir con agua de dilución que contiene compuesto de reparación para propósito de análisis. En una alternativa adicional, la muestra, opcionalmente habiendo sido diluida, se puede poner en contacto con el medio de crecimiento que contiene el compuesto de reparación o el compuesto de reparación se puede aplicar después de poner en contacto el microorganismo con el medio de desarrollo.
Una forma de esta invención deseablemente involucra poner en contacto la muestra con un medio de reparación, de preferencia un medio de reparación no selectivo, que contiene el compuesto de reparación y luego llevar este a contacto con un medio de crecimiento, de preferencia un medio de crecimiento selectivo. De preferencia el medio de reparación es un líquido y más preferentemente un caldo. Cuando el medio de reparación es un líquido esto se refiere apropiadamente como un método de reparación líquido. Típicamente en un método de reparación líquido la muestra se introduce primero
en un medio liquido que contiene el compuesto de reparación. Idealmente, el método de reparación liquido permite que las bacterias tensadas se reparen en un medio liquido no selectivo. De preferencia el método de reparación liquido empleará un caldo Comcel medio liquido. En general el medio liquido que contiene los microorganismos se habrá reparado antes de la transferencia al medio de crecimiento o se repararía durante contacto con el medio de crecimiento. Más preferentemente, el medio de crecimiento es un medio de crecimiento selectivo. Típicamente el medio líquido que contiene los microorganismos se colocarán en placas hacia el la placa de medio de crecimiento selectivo tal como una placa de medio de crecimiento de agar selectivo.
En una alternativa el paso (1) de formación comprende poner en contacto la muestra con un medio de crecimiento, de preferencia un medio de crecimiento no selectivo que contiene el compuesto de reparación, y luego poner este en contacto con un medio de reparación que también contiene el compuesto de reparación. De preferencia, el medio de reparación es un medio de reparación no selectivo, más preferentemente un sólido, y particularmente de preferencia un medio de crecimiento de agar selectivo. Cuando el medio de reparación es un sólido este se denominaría un método de
reparación sólido. Típicamente el método de reparación sólido involucrará poner en contacto la muestra con un medio de crecimiento no selectivo que contiene el compuesto de reparación. Subsecuentemente este se puede poner en contacto con un medio de crecimiento selectivo que contiene el compuesto de reparación. En esta forma los ingredientes selectivos y el compuesto o compuestos, que impide la formación, reduce o remueve el ROS, se difundirá a través hacia el medio no selectivo. Deseablemente el medio de crecimiento no selectivo puede ser un medio de crecimiento de agar no selectivo. Apropiadamente en esta forma la muestra se puede colocar en platinas hacia cualquier agar no selectivo y luego el medio de crecimiento de agar selectivo que contiene el compuesto o compuestos que impiden la formación, reduce o remueve el ROS se tiende sobre el medio de crecimiento de agar no selectivo.
En una forma alternativa adicional, la muestra se puede aplicar a un medio de crecimiento selectivo que ya contiene el compuesto de reparación. Dicho medio de crecimiento selectivo puede ser un medio de crecimiento de agar selectivo. El enchapado de la muestra se puede llevar a cabo como se describe previamente.
En una forma alternativa adicional, la muestra se
puede recoger de agua en la forma de un aerosol. Típicamente el aerosol puede estar colocado en una torre de enfriamiento o acondicionador de aire. Deseablemente el agua condensada del aerosol antes de la prueba de conformidad con el método de la presente invención. En una forma preferida alternativa el paso (1) comprende poner en contacto la muestra de aerosol con agua en dilución que contiene un medio de reparación, de preferencia un medio de reparación no selectiva que contiene el compuesto de reparación, y luego llevar hacia contacto con un medio de crecimiento también contiene el compuesto de reparación.
En todas las formas antes mencionadas de la invención, el medio de crecimiento debe ser apropiado para crecimiento de Legionella penumophila. Los tipos de medio de crecimiento apropiados están documentados en la literatura y son bien conocidos a la persona experta. Normalmente el medio de crecimiento debe contener carbono activado y cisteína.
Se prefiere que el medio de crecimiento selectivo es un medio de crecimiento de agar selectivo y más preferentemente es un medio de crecimiento de agar de extracto de levadura de carbón tamponada (BCYE) . El medio de crecimiento BCYE se haría selectivo mediante la adición de suplemento antibiótico. Un medio de crecimiento BCYE
altamente deseable con antibiótico se conoce como GVPC (Glicina, Vancomicina, Polimixina B, Cicloheximida) .
El método de enchapado está documentado en la literatura y es bien conocido por la persona experta. Típicamente el método involucrará aplicar una cantidad de estas muestras de agua hacia gel de agar que se ha colocado en un plato Petri. Este se puede denotar un método de plato Petri o un método de enchapado en agar. La meta del enchapado en agar es dispersar una alícuota, típicamente 100 ul de agua que se sospecha que contiene el microorganismo, denominada una suspensión bacterial, hacia un medio sólido en un plato Petri. Cuentas de vidrio o un raspador de célula se puede usar para dispersar la suspensión bacterial sobre la placa de agar. Después de dispersar, la mayor parte de líquido es absorbido por el agar y una capa delgada con bacteria permanece sobre la superficie de agar. Mediante incubación, la bacteria crece en la forma de colonias desarrolladas sobre la superficie de agar. La incubación ocurrirá a una temperatura mejor apropiada para el microorganismo, que está bien documentada en la literatura y es conocida por la persona experta. Típicamente la temperatura será entre 30°C y 50°C por ejemplo alrededor de 37 °C.
El compuesto de reparación se debe añadir en una
cantidad efectiva para reducir el esfuerzo oxidante del microorganismo. De preferencia esta será una cantidad efectiva para reducir o substancialmente remover el ROS en la célula de microorganismo.
En una forma preferida de la invención, el compuesto de reparación incluye cuando menos ácido tioglicólicoo sales del mismo. Deseablemente, el ácido tioglicólico está en la forma de tioglicolato y usualmente en la forma de la sal de sodio. El ácido tioglicólico o sales limpian exógenamente el ROS. De preferencia la cantidad de ácido tioglicólico o sales presentes en un medio a una concentración de entre 0.01 a 1% en peso (calculado como tioglicolato) .
En otra modalidad preferida de la invención el compuesto de reparación incluye cuando menos un compuesto seleccionado del grupo que consiste en catalasa, ácido ascórbico (o sal del mismo), ácido metabisulforoso (o sal del mismo), sulfóxido de dimetilo (DMSO) , ácido 3,3'-tiodipropiónico (TDPA) (o sal del mismo) y ácido pirúvico (o sal del mismo. Estos compuestos se han encontrado reducen o remueven ROS. Cuando se usan ácido ascórbico o ácido pirúvico se usan están de preferencia presentes en el medio a una concentración de entre 0.01 a 1% en peso calculado como la
sal de sodio. DMSO se usa de preferencia a una concentración entre 0.01 y 0.1% en peso y catalasa está deseablemente presente a una concentración en la escala de 0.001 a 0.1% en peso. El ácido pirúvico, especialmente piruvato de sodio, es particularmente preferido.
En una forma más preferida de la invención, el medio de reparación o medio de crecimiento comprenderá tanto ácido tioglicólico (o sal) y cuando menos uno del grupo seleccionado de catalasa, ácido ascórbico (o sal del mismo) , ácido metabisulfuroso (o sal del mismo) , sulfóxido de dimetilo (DMSO), ácido 3, 3' -tiodipropiónico (TDPA) (o sal del mismo) y ácido pirúvico (o sal del mismo) . La combinación de tioglicolato y piruvato de sodio es especialmente preferida.
En el caso en donde el compuesto de reparación puede ser o incluir cuando menos un compuesto que inhibe indirectamente la formación de y/o degrada el ROS, el compuesto puede ocasionar niveles reducidos de ROS interfiriendo con el metabolismo del microorganismo. Típicamente, estos compuestos incluirán aminoácidos o sus sales. Un compuesto particularmente preferido es ácido glutámico o sal de glutamato.
En una forma preferida todavía adicional de la invención, el compuesto de reparación incluirla ácido
glutámico o sal de glutamato, especialmente la sal de sodio. En general, la cantidad de ácido glutámico o glutamato será entre 0.01 y 5% en peso calculado como la sal de sodio.
Es particularmente preferido que el compuesto de reparación incluirá tanto ácido pirúvico o piruvato (especialmente la sal de sodio) junto con ácido glutámico o glutamato (especialmente como la sal de sodio) . Esta combinación de ácido pirúvico o piruvato con ácido glutámico o glutamato parece inducir un efecto sinergistico en que permite una estimación superior (y por lo tanto, cálculo más preciso) de Legionella cultivable que cualquier compuesto respectivamente usado solo. Además se ha encontrado que esta combinación ocasiona una reducción adicional de fase de retraso durante el desarrollo de la Legionella pneumophila, en particular en un medio liquido. Esta reducción o fase de retraso en medio liquido resulta en una reducción del tiempo requerido para obtener una colonia visible sobre la placa de agar .
Deseablemente, la cantidad de piruvato y glutamato será como se manifestó anteriormente. Es particularmente preferido que la relación de glutamato a piruvato será en la escala entre 1:1 y 50:1, especialmente entre 5:1 y 20:1 y más especialmente entre 7:1 y 15:1.
El glutamato no es conocido por ser un antioxidante. Sin embargo, parece que el glutamato indirectamente reducirá la producción endógena de ROS naturalmente formado durante el crecimiento o sus consecuencias en macromoléculas (oxidación ) .
Sin estar limitados a la teoría, se piensa que el ácido glutámico cambia el metabolismo de Legionella aumenta el efecto de piruvato y que esta interferencia con el metabolismo de Legionella indirectamente inhibe la formación y/o degrada el ROS intracelular .
También puede ser deseable incluir un ácido ceto y/o una enzima de limpieza de oxígeno reducida con el medio de reparación y/o medio de crecimiento. Un ácido ceto y/o una enzima de limpieza de oxígeno reducido y no se considera un compuesto de reparación de conformidad con la presente invención. Sin embargo, puede ser benéfico incluir uno o ambos de estos compuestos con cualquiera de los compuestos de reparación antes mencionados o combinaciones de los mismos.
Detectar y cuantificar los microorganismos viables se pueden llevar a cabo mediante cualquiera de la técnica conocida se- documenta en la literatura. Típicamente esto significará contar las colonias visibles de la superficie del medio de crecimiento, tal como la placa de agar nutriente.
El método de conformidad con la presente invención facilita la determinación cuantitativa precisa para la existencia de Legionella pneumophila. Además el tiempo de incubación se puede reducir significativamente. El método es apropiado para detectar Legionella pneumophila en muestras derivadas de cualquiera del grupo seleccionado de aguas de enfriamiento industriales, aguas para beber, y aguas naturales .
La presente invención también incorpora un equipo para detectar de manera precisa y enumerar microorganismos viables de la especie Legionella pneumophila en una muestra sospechada de contener dichos microorganismos que comprende:
(1) cuando menos un compuesto de reparación,
(2) un medio de crecimiento,
(3) un medio para incubación
(4) un medio para detectar y cuantificar los microorganismos .
en los que el compuesto de reparación ocasiona directa o indirectamente un efecto sobre el metabolismo para reducir tensión oxidante del microorganismo.
en donde los microorganismos son de la especia Legionella peneumophila, y en donde el compuesto de reparación ocasiona directa o indirectamente un efecto sobre
el metabolismo para reducir la tensión oxidante del microorganismo .
El equipo también puede contener cualquiera de las modalidades descritos con respecto al primer aspecto de la invención.
El equipo es apropiado para uso con el método de la presente invención y permite enumeración más precisa de Legionella pneumophila.
Los siguientes ejemplos ilustran la invención.
Ejemplo 1
Una suspensión de Legionella pneumophila se añadió a 5 frascos que contienen 50 mi de tampón de fosfato estéril (PBS) a concentración final de 108 bacteria/ml. Una solución biocida se añadió para obtener las concentraciones finales en la escala de 10 a 30 mg/L: Un matraz se realizó en paralelo y sirvió como control sin biocida. El biocida usado es un THPS (sulfato de (tetraquis (hidroximetil) fosfonio) .
Después de la homogeneización, todas las suspensiones se incubaron a 37+l°C, en la oscuridad y con agitación durante 60 min. El biocida se eliminó mediante 2 lavadas en PBS 85,000 x g 10 min) antes de la cuenta bacterial. La dilución en serie se hace y 2 alícuotas de 100 ul de la misma dilución se coloca en placas en placa de agar
de BYCE suplementado con 0.1% de piruvato.
Los resultados se muestran en la figura 1. La figura 1 muestra la enumeración de Legionella Pneumophila cultivable después de tratamiento de biocida en medio de BCYE (cuadros) y medio de BCYE más 0.1% de piruvato (diamantes) . La presencia del biocida es introducir tensión del microorganismo. Los resultados muestran que la presencia de piruvato a cuenta de microorganismo muy superior se logra en donde los microorganismos se tensan. En ausencia de biocida los microorganismos están sin tensar. En este caso, se puede ver que la presencia y ausencia de piruvato proporciona el mismo resultado. Esto demuestra que la presente del piruvato en microorganismos tensados de Legionella pneumophila se reparan y de esta manera se proporciona una lectura más precisa.
Ejemplo 2
Una suspensión de Legionella pneumophila se añadió a 1 matraz que contiene 50 mi de tampón de fosfato estéril (PBS) a concentración final de 108 baceteria/ml . Una solución biocida se añadió para obtener una concentración final de 15 mg/L: El biocida usado es un THPS (sulfato de tetraquis (hidroximetil) fosfonio) .
Después de la homogeneización, la suspensión se incubó a 37+l°C, en la oscuridad y con agitación durante 60 min. El biocida se eliminó mediante 2 lavados en PBS (5,000 x g 10 min) antes de la cuenta bacterial. La dilución en serie se hizo y 2 alícuotas de 100 ul de la misma dilución se enchapan en una placa de agar de CBYE, BCYE suplementado con 0.1% de piruvato, BCYE suplementado con 0.1% de piruvato y 1% de ácido glutámico y BCYE suplementado con 1% de ácido glutámico. Los resultados se muestran en la figura 2. La figura 2 muestra la relación entre el número de Legionella cultivable obtenido en medio convencional (BCYE) y número de Legionella curable obtenida en medio suplementado con 2 compuestos descritos en esta patente (Piruvato y Ácido Glutámico) .
La adición de piruvato en el medio convencional
(BCYE) conduce a un aumento de Legionella cultivable detectada después de tratamiento de biocida (número de Legionella cultivable en "BCYE + Piruvato" es 45 veces superior que el número de medio convencional de Legionella cultivable) . La adición de ácido glutámico solo en el medio convencional (BCYE) conduce a una disminución de Legionella cultivable detectada después de tratamiento de biocida (x 0.2). Sorprendentemente, la adición de piruvato y ácido
glutámico condujo a un aumento en Legionella cultivable, con un número mayor que aquel observado con compuestos solos. Esto demuestra que la presencia del piruvato tensó microorganismos de Legionella pneumophila es más rápida con adición de ácido glutámico y de esta manera se proporciona una lectura más precisa.
Ejemplo 3:
Una suspensión de Legionella pneumophila se añadió a 1 matraz que contiene 1 L de tampón de fosfato estéril (PBS) a concentración final de 2 x 102 bacteria/L. Después de concentración por filtración, 2 alícuotas de 100 ul de la misma suspensión se colocan en placas sobre placa de agar de GVPC (GVPC) , GVPC suplementado con 0.1% de piruvato y 1% de ácido glutámico (GVPC+X) . Los números de colonia se contaron a 0, 3, 5, y 10 días después de la incubación a 37°C. Los resultados se muestran en la Figura 3. A 3 días de incubación, ninguna colonia fue visible en medio de GVPC cuando 300 colonias se pudieron enumerar ya en medio suplementado de GVPC. A 5 y 10 días de incubación, 100 colonias se pudieron enumeran en GVPC en donde 300 colonias se pudieron enumerar en medio suplementado de GVPCD. Usando medio suplementado, las colonias se pudieron detectar cuando menos 2 días antes de aquella enumerada en GTVPC convencional
Ejemplo 4
Una muestra ambiental que contiene Legionella cultivable se concentró mediante filtración. Del concentrado, 2 alícuotas de 100 ul de la misma suspensión se colocan en placa de agar GVPC (GVPC) , GVPC suplementado con 0.1% de piruvato y 1% de ácido glutámico (GVPC+X) . Los números de colonia se contaron 5 días después de la incubación a 37 °C. En este caso, ningunas colonias de Legionella se pudieron enumerar en medio convencional (GVPC) en donde 17 colonias de colonias de No-Legionella se pudieron enumerar. En contraste, cuando menos 10 colonias de Legionella se pudieron enumeran en medio Suplementado (GVPC+X) , en donde solamente 2 colonias de No-legionella se enumeraron. Esto se muestra en la Figura 4.
Ejemplo 5
Una suspensión de Legionella pneumophila se añadió a 1 matraz que contiene 50 mi de tampón de fosfato estéril (PBS) a concentración final de 108 bacteria/ml. Una solución biocida se añadió para obtener una concentración final de 15 mg/1. El biocida usado es un THPS (sulfato de tetraquis (hidroximetil9fosfonio) .
Después de homogeneización, la suspensión se incubó a 37+l°C, en la oscuridad y con agitación durante 60 min. El
biocida se eliminó mediante 2 lavadas con PBS (5,000 x g: 10 min) antes de la cuenta bacterial. La dilución en serie se hace ya sea en PBS o PBS suplementado con 0.5% de piruvato. De cada tampón de dilución (con o sin adición de piruvato), 2 alícuotas de 100 ul de la misma dilución se colocan en placas en placa de agar BCYE, BCY suplementado con 0.1% de piruvato. Los resultados se muestran en la Figura 5. La figura 5 muestra el número de Legionella pneumophila cultivable en medio convencional (BCYE) y el número de Legionella pneumophila curable obtenida en medio convencional suplementado con piruvato después de dilución en PBS (barra raspada) o PBS + Piruvato (barra oscura) .
Como ya se observó, la adición de piruvato en el medio convencional (BCYE) conduce a un aumento de Legionella peneumophila cultivable detectada después de tratamiento con biocida, cuando PBS solamente se usa para diluir la solución. Sorprendentemente, la adición de piruvato en el tampón de dilución conduce a un aumento de Legionela pneumophila cultivable detectada en medio convencional (BCYE) , pero también en medio convencional suplementado con piruvato. Esto demuestra que la presencia del piruvato en tampón de dilución permite más L. Peneumophila tensada reparada.
Claims (15)
1. - Un método para detectar y enumerar microorganismos viables en una muestra sospechada de contener los microorganismos (1) poner en contacto los microorganismos de la muestra con cuando menos un compuesto de reparación y un medio de crecimiento, y (2) incubar el producto del paso (1), y (39 detectar y cuantificar los microorganismos viables en el que los microorganismos son de la especia Legionella pneumophila, y en el que el compuesto de reparación ocasiona directa o indirectamente un efecto sobre el metabolismo para reducir la tensión oxidante del microorganismo.
2. - Un método de conformidad con la reivindicación 1, en el que el compuesto de reparación es un compuesto que inhibe la formación de y/o degrada ROS.
3. - Un método de conformidad con la reivindicación 1 o reivindicación 2, en el que el paso (1) comprende poner en contacto la muestra con un medio de reparación, de preferencia un medio de reparación no selectivo, que contiene el compuesto de reparación y luego poner este en contacto con un medio de crecimiento, de preferencia un medio de crecimiento selectivo.
4.- Un método de conformidad con la reivindicación 3 en el que el medio de reparación es un liquido, de preferencia un caldo.
5.- Un método de conformidad con cualqu8iera de las reivindicaciones anteriores, en el que el paso (1) comprende poner en contacto la muestra con un medio de crecimiento, de preferencia un medio de crecimiento no selectivo, y luego llevar este a contacto con un medio de reparación qu3 contiene el compuesto de reparación.
6. - Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el medio de reparación es un medio de reparación selectivo, de preferencia un sólido, y más preferentemente un medio de crecimiento de agar selectivo.
7. - Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el paso (1) comprende poner en contacto la muestra con un medio de crecimiento que contiene el compuesto de reparación.
8.- Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el medio de crecimiento es extracto de levadura de carbón tamponado (BCYE) o medio de crecimiento de agar de GVPC.
9. - Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el compuesto de reparación comprende ácido tioglicólico (o sal del mismo) .
10. - Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el compuesto de reparación comprende cuando menos un compuesto seleccionado del grupo que consiste de catalasa, ácido ascórbico (o sal del mismo), ácido metabisulfuroso (o sal del mismo), 1 sulfóxido de dimetilo (DMSO) , ácido 3, 3' -tiodipropiónico (TDPA) (o sal del mismo) y ácido pirúvico (o sal del mismo.).
11. - Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el compuesto de reparación comprende ácido tioglicólico (o sal del mismo) y ácido pirúvico (o sal del mismo) .
12. - Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el compuesto de reparación comprende ácido glutámico (o sal del mismo) .
13. - Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el compuesto de reparación comprende ácido glutámico (o sal del mismo) y ácido pirúvico (o sal del mismo) .
14. - Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el medio de reparación y/o medio de crecimiento incluye un ácido ceto y/o una enzima de limpieza de oxigeno reducido.
15.- Equipo para detectar y enumerar de manera más precisa microorganismos viables de la especia Legionella pneumophila en una muestra sospechada de contener los microorganismos, que comprende: (1) cuando menos un compuesto de reparación, (2) un medio de crecimiento, (3) un medio para incubación (4) un medio de para detectar y cuantificar los microorganismos en el que los microorganismos son de la especie Legionella pneumophila y en el que el compuesto de reparación ocasiona directa o indirectamente un efecto sobre el metabolismo para reducir e4sfuerzo oxidante del microorganismo.
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