MX2011002402A - Formulacion de anticuerpo novedosa. - Google Patents

Formulacion de anticuerpo novedosa.

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Hanns-Christian Mahler
Oliver Boris Stauch
Ulla Grauschopf
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Hoffmann La Roche
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Abstract

Esta invención se refiere a una formulación farmacéutica de un anticuerpo contra P-Selectina, un procedimiento para la preparación y usos de la formulación.

Description

FORMULACION DE ANTICUERPO NOVEDOSA Descripción de la Invención La presente invención se refiere a una formulación farmacéutica de un anticuerpo contra P-Selectina, un procedimiento para la preparación y usos de la formulación.
En un primer aspecto, la invención se refiere a una formulación farmacéutica que comprende: 1 a 200 mg/ml de un anticuerpo; 1 a 100 mM de un regulador de pH; 0.001 a 1% de un agente tensioactivo; (a) 10 a 500 mM de un estabilizador; o (b) 10 a 500 mM de un estabilizador y 5 a 500 mM de un agente de tonicidad; o (c) 5 a 500 mM de un agente de tonicidad; a un pH en el intervalo de 4.0 a 7.0, en donde el anticuerpo es un anticuerpo contra P- Selectina, La formulación de conformidad con la invención puede estar en forma líquida, en forma liofilizada o en forma líquida reconstituida a partir de una forma l,iofilizad .
Los anticuerpos contra P-Selectina se conocen, v.gr., de la patente de E.U.A. 4, 783, 399, WO 93/06863, Geng et al (J. Biol. Chem., 266 (1991) 22313-22318), WO 93/21956 y WO 2005/100402.
Ref . : 217810 Anticuerpos ilustrativos contra P-Selectina se describen en el documento O 2005/100402 e incluyen anticuerpos que se caracterizan porque la secuencia de aminoácidos de cadena pesada variable CDR3 de ese anticuerpo se selecciona del grupo que consiste de las secuencias de CDR3 de cadena pesada SEQ ID NO: 38, 39, 40, 41 ó 42.
Los anticuerpos preferidos se caracterizan porque i) comprenden una cadena pesada variable y una cadena ligera variable, caracterizados porque la cadena pesada variable comprende secuencias de CDR CDR1, CDR2 y CDR3, y CDR1 se selecciona del grupo que consiste de SEQ ID NOs : 29, 30, 31, 32, CDR2 se selecciona del grupo que consiste de SEQ ID NOs : 33, 34, 35, 36, 37, CDR3. se selecciona del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 38, 39, 40, 41, 42, en donde esas CDRs se seleccionan independientemente unas de otras, ii) la cadena ligera variable comprende secuencias de CDR CDR1, CDR2 y CDR3 , y CDR1 se selecciona de SEQ ID NOs : 43, 44, CDR2 se selecciona de SEQ ID NOs : 45, 46 y CDR3 se selecciona de SEQ ID NOs: 47, 48, 49, 50, 51, 52 en donde esas CDRs se seleccionan independientemente unas de otras, iii) contiene como CDRs de cadena pesada las CDRs de SEQ ID NO: 2 y como CDRs de cadena ligera las CDRs de SEQ ID NO: 1, como CDRs de cadena pesada las CDRs de SEQ ID NO: 4 y como CDRs de cadena ligera las CDRs de SEQ ID NO: 3, como CDRs de cadena pesada las CDRs de SEQ ID NO: 6 y como CDRs de cadena ligera las CDRs de SEQ ID NO: 5, como CDRs de cadena pesada las CDRs de SEQ ID NO: 8 y como CDRs de cadena ligera las CDRs de SEQ ID NO: 7, como CDRs de cadena pesada las CDRs de SEQ ID NO: 10 y como CDRs de cadena ligera las CDRs de SEQ ID NO: 9, como CDRs de cadena pesada las CDRs de SEQ ID NO: 12 y como CDRs de cadena ligera las CDRs de SEQ ID NO: 11, como CDRs de cadena pesada las CDRs de SEQ ID NO: 14 y como CDRs de cadena ligera las CDRs de SEQ ID NO: 13, como CDRs de cadena pesada las CDRs de SEQ ID NO: 16 y como CDRs de cadena ligera las CDRs de SEQ ID NO: 15, como CDRs de cadena pesada las CDRs de SEQ ID NO: 18 y como CDRs de cadena ligera las CDRs de SEQ ID NO: 17, como CDRs de cadena pesada las CDRs de SEQ ID NO: 20 y como CDRs de cadena ligera las CDRs de SEQ ID NO: 19, o como CDRs de cadena pesada las CDRs de SEQ ID NO: 22 y como CDRs de cadena ligera las CDRs de SEQ ID NO: 21, iv) el anticuerpo se une a P-selectina y comprende una región pesada y ligera variable independientemente seleccionada del grupo que consiste de el dominio variable de cadena pesada definido por la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2 y el dominio variable de cadena ligera definido por SEQ ID NO:l; el dominio variable de cadena pesada definido por la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 4 y el dominio variable de cadena ligera definido por SEQ ID NO: 3; el dominio variable de cadena pesada definido por la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 6 y el dominio variable de cadena ligera definido por SEQ ID NO: 5; el dominio variable de cadena pesada definido por la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 8 y el dominio variable de cadena ligera definido por SEQ ID NO: 7; el dominio variable de cadena pesada definido por la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 10 y el dominio variable de cadena ligera definido por SEQ ID NO: 9; el dominio variable de cadena pesada definido por la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 12 y el dominio variable de cadena ligera definido por SEQ ID NO: 11; el dominio variable de cadena pesada definido por la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 14 y el dominio variable de cadena ligera definido por SEQ ID NO: 13; el dominio variable de cadena pesada definido por la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 16 y el dominio variable de cadena ligera definido por SEQ ID NO: 15; el dominio variable de cadena pesada definido por la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 18 y el dominio variable de cadena ligera definido por SEQ ID NO: 17; el dominio variable de cadena pesada definido por la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 20 y el dominio variable de cadena ligera definido por SEQ ID NO: 19; el dominio variable de cadena pesada definido por la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 22 y el dominio variable de cadena ligera definido por SEQ ID NO: 21, v) . la región variable de cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos independientemente seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 y 22, vi) la región variable de cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos independientemente seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 y 21.
Las secuencias de CDR se pueden determinar de conformidad con la definición estándar de Kabat et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a. ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991) . Las CDRs en cada cadena son separadas por aminoácidos del marco de trabajo. Las CDRs de SEQ ID NO: 1-22 se muestran en SEQ ID NO: 29-52.
En una modalidad, el anticuerpo se caracteriza por unirse a la P-selectina y no unirse al receptor de factor de complemento Clq y/o Fe . Estos anticuerpos no producen la citotoxicidad dependiente de complemento (CDC) y/o citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (7ADCC) .
Preferiblemente, este anticuerpo se caracteriza porque se une a P-selectina, contiene una parte de Fe derivada de origen humano y no se une a factor de complemento Clq. Muy preferiblemente, este anticuerpo es un anticuerpo humano o humanizado.
En otra modalidad, el anticuerpo se caracteriza porque las cadenas constantes son de origen humano. Esas cadenas constantes son bien conocidas en la técnica más avanzada y, v.gr., son descritas por Kabat (véase, v.gr., Johnson y Wu, Nucleic Acids Res. 28 (2000) 214-218). Por ejemplo, una región constante de cadena pesada humana útil comprende una secuencia de aminoácidos independientemente seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 24, 25, 26, 27 y 28. Por ejemplo, una región constante de cadena ligera humana útil comprende una secuencia de aminoácidos de una región constante de cadena ligera kappa de SEQ ID NO: 23.
El término "unión a P-selectina" , como se usa aquí, significa la unión del anticuerpo a P-selectina ya sea en una prueba de BIAcore (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Suecia) o en una prueba de ELISA en la cual ya sea P-selectina purificada o transfectantes de CHO de P-selectina son revestidos sobre placas de microtitulación.
En la prueba de BIAcore, el anticuerpo se une a una superficie y la unión de P-selectina se mide por resonancia de plasmón de superficie (SPR) . La afinidad de la unión se define por los términos ka (constante de velocidad para la asociación del -< anticuerpo del complejo el anticuerpo/antígeno) , kd (constante de disociación) , y KD (kd/ka) . En otra modalidad adicional, los anticuerpos muestran una KD de 10~8 o menos, preferiblemente de aproximadamente 10"11 a 10"9 M (véase ejemplos). Por consiguiente, el anticuerpo preferido es como el que se describió anteriormente, en donde el anticuerpo se une a P-selectina con un valor de KD menor que 10"8 M en una prueba de BIAcore, preferiblemente en donde el intervalo de KD es 10"11 a 10"9 M.
Preferiblemente, el anticuerpo es de subtipo humano IgGl o IgG4.
Muy preferiblemente, el anticuerpo se caracteriza porque el anticuerpo es un anticuerpo de la subclase humana IgGl, que contiene por lo menos una mutación en L234, L235, D270, N297, E318, K320, K322, P331 y/o P329 o un anticuerpo de la subclase humana IgG4 , que contiene por lo menos una mutación en L235 y S228 (numeración de conformidad con índice de EU) .
En la P-selectina purificada por ELISA específica de P-selectina es revestida sobre placas de microtitulación y la unión del anticuerpo a P-selectina es detectada con una IgG anti-humana biotinilada y los pasos usuales de una prueba de ELISA. Los valores de EC50 en esta prueba varían preferiblemente entre 0.002 y 0.03 g/ml en células de CHO de P-selectina, es decir, los anticuerpos preferidos son aquellos, en donde los valores de EC50 para unión a P-selectina están en el intervalo de 0.002 a 0.03 g/ml en células CHO que presentan P-selectina en una prueba de ELISA. En una prueba en la cual transíectantes de CHO que expresan P-selectina son revestidos sobre la placa de microtitulación, los valores de EC50 varían entre 0.01 y ?.?dµ?/?t??, preferiblemente entre 0.01 y 0.04 pg/ml.
Los valores de EC50 en transfectantes de E- y L-selectina están preferiblemente por arriba de 100 ug/ml. Los anticuerpos preferidos se caracterizan porque se unen por lo menos 1000 veces más específicamente a P-selectina que a E-y/o L-selectina como se mide por valores de EC50 en una prueba de ELISA, en donde P- y E-y/o L-selectina son revestidos sobre la placa de microtitulación.
Los anticuerpos son preferiblemente capaces de unirse a P-selectina en presencia del fragmento aa 60-75 de P-selectina (secuencia P16109 de Swiss-Prot) y/o no inhiben competitivamente la unión de un anticuerpo secretado por una línea celular designada acceso a ATCC No. HB1 1041 a P-selectina.
Los anticuerpos preferiblemente no inhiben la interacción de P-selectina con glicoproteína de membrana de plaquetas GPIb en un formato de prueba de ELISA. En la glicocalicina de ELISA, la porción extracelular soluble de GPIba fue inmovilizada sobre los pozos de las placas de microtitulación, como se describe (Romo et al, J Exp Med 190:803 (1999), y la unión de P-selectina purificada después de preincubación con la P-selectina HuMabs fue detectada con un anticuerpo policlonal anti-p-selectina .
El anticuerpo preferido se caracteriza porque no' se une a la proteína C3 , muy preferiblemente se caracteriza porque no produce citotoxicidad dependiente de complemento (CDC) . Además, el anticuerpo se puede caracterizar porque no se une a receptores de Fcy en células efectoras NK. Preferiblemente, el anticuerpo se caracteriza porque es un anticuerpo de la subclase humana IgGl, que contiene por lo menos una mutación en L234, L235, D270, N297, E318, K320, K322, P331 y/o P329 o un anticuerpo de la subclase humana IgG4 , que contiene por lo menos una mutación en L235 y S228 (numeración de conformidad con índice de EU) . El anticuerpo preferido se caracteriza porque no produce citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) .
Los anticuerpos más preferidos se caracterizan porque se unen a P-selectina y porque comprenden una región variable independientemente seleccionada del grupo que consiste del dominio variable de cadena ligera definido por la secuencia de aminoácidos SEQ ID N0:1 y el dominio variable de cadena pesada definido por SEQ ID NO: 2; el dominio variable de cadena ligera definido por la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 3 y el dominio variable de cadena pesada definido por SEQ ID NO : 4 ; el dominio variable de cadena ligera definido por la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 5 y el dominio variable de cadena pesada definido por SEQ ID NO: 6; el dominio variable de cadena ligera definido por la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 7 y el dominio variable de cadena pesada definido por SEQ ID NO: 8; el dominio variable de cadena ligera definido por la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 9 y el dominio variable de cadena pesada definido por SEQ ID NO: 10; el dominio variable de cadena ligera definido por la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 11 y el dominio variable de cadena pesada definido por SEQ ID NO: 12; el dominio variable de cadena ligera definido por la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 13 y el dominio variable de cadena pesada definido por SEQ ID NO: 14; el dominio variable de cadena ligera definido por la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 15 y el dominio variable de cadena pesada definido por SEQ ID NO: 16; el dominio variable de cadena ligera definido por la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 17 y el dominio variable de cadena pesada definido por SEQ ID NO: 18; el dominio variable de cadena ligera definido por la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 19 y el dominio variable de cadena pesada definido por SEQ ID NO: 20; y el dominio variable de cadena ligera definido por la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 21 y el dominio variable de cadena pesada definido por SEQ ID NO: 22.
Preferiblemente, los anticuerpos comprenden el dominio variable de cadena ligera definido por la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 3 y el dominio variable de cadena pesada definido por SEQ ID NO: 4.
Los anticuerpos preferidos se caracterizan porque los anticuerpos son de la subclase humana IgG4 o comprenden por lo menos una mutación de aminoácidos que no causa unión a factor de complemento Clq. Estos anticuerpos variantes comprenden, por ejemplo, la secuencia de aminoácidos independientemente seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 25 O SEQ ID NO: 26 y SEQ ID NO: 28.
Un anticuerpo anti-P-selectina "variante", se refiere aquí a una molécula que difiere en secuencia de aminoácidos de una secuencia de aminoácidos de anticuerpo anti-P-selectina "progenitor" en virtud de la adición, deleción y/o sustitución de uno o más residuo (s) de aminoácidos en la secuencia de anticuerpo progenitor. Preferiblemente, la variante comprende una o más substitución (es) de aminoácido (s) en una o más región (es) constante (s) o variable (s) del anticuerpo progenitor, muy preferiblemente en la región constante. Por ejemplo, la variante puede comprender por lo menos uno, v.gr., de aproximadamente uno a aproximadamente diez, y preferiblemente de aproximadamente dos a aproximadamente cinco, sustituciones en una o más regiones variables del anticuerpo progenitor. Ordinariamente, la variante tendrá una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos 90% de identidad de secuencia de aminoácidos con las secuencias de dominio constante y/o variable del anticuerpo, muy preferiblemente por lo menos 95%, y muy preferiblemente aún por lo menos 99%.
La identidad u homología con respecto a esta secuencia se define aquí como el porcentaje de residuos de aminoácidos en la secuencia candidata que son idénticos con los residuos del anticuerpo progenitor, después de alinear las secuencias e introducir espacios, si es necesario, para lograr el por ciento máximo de identidad de secuencia. Ninguna de las extensiones, delecipnes o inserciones N-terminal, C-terminal, o internas en la secuencia de anticuerpo se debe considerar como que afecta la identidad u homología de secuencia. La variante retiene la capacidad para unirse a P-selectina humana y preferiblemente tiene propiedades, que son superiores a las del anticuerpo progenitor. Por ejemplo, la variante puede tener una afinidad de unión más fuerte , capacidad incrementada para tratar una enfermedad asociada con isquemia de extremidades crítica o enfermedad oclusiva arterial periférica (CLI/PAOD) .
El anticuerpo variante de interés particular aquí es uno que despliega por lo menos aproximadamente 4 veces, incremento en actividad inhibidora en la prueba de adhesión cuando se compara con el anticuerpo progenitor debido a la eliminación de la unión a los receptores de Fcy.
El anticuerpo "progenitor" aquí es uno, que es codificado por una secuencia de aminoácidos usados para la preparación de la variante. Preferiblemente, el anticuerpo progenitor tiene una región de marco de trabajo humana y, si está presente, tiene región (es) constantes de anticuerpo humano. Por ejemplo, el anticuerpo progenitor puede ser un anticuerpo humanizado o humano.
Los anticuerpos de conformidad con la invención incluyen, además de los anticuerpos que tienen "modificaciones de secuencias conservativas", modificaciones de secuencias de nucleótidos y aminoácidos, que no afectan o alteran las características antes mencionadas del anticuerpo de conformidad con la invención. Las modificaciones pueden ser introducidas por técnicas estándares conocidas en el campo, tales como mutagénesis dirigida al sitio y mutagénesis mediada por PCR. Las sustituciones de aminoácidos conservativas incluyen aquellas en las cuales el residuo de aminoácido es reemplazado por un residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral similar. Las familias de residuos de aminoácidos que tienen cadenas laterales similares han sido definidas en la técnica. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (v.gr., lisina, arginina, histidina) , cadenas laterales ácidas (v.gr., ácido aspártico, ácido glutá ico) , cadenas laterales polares no cambiadas (v.gr., glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína, triptofano) , cadenas laterales no polares (v.gr., alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina) , cadenas laterales beta-ramificadas (v.gr., treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (v.gr., tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina) . Por lo tanto, un residuo de aminoácido no esencial predicho en un anticuerpo anti-P-selectina humano puede ser preferiblemente reemplazado por otro residuo de aminoácido de la misma familia de cadena lateral.
Las sustituciones de aminoácidos se pueden realizar por mutagénesis con base en modelado molecular como se describe en Riechmann et al, Nature 332 (1988) 323-327 y Queen et al, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 86 (1989) 10029-10033.
Anticuerpos preferidos adicionales comprenden una región constante de cadena ligera as definida por SEQ ID NO: 23.
Anticuerpos preferidos adicionales son aquellos definidos como IgGlvl (PVA-236; GLPSS331 como se especifica por E233P; L234V; L235A; delta G236; A327G; A330S; P331S) , IgGlv2 (L234A; L235A) y IgG4vl (S228P; L235E) .
Descripción del listado de secuencias SEQ ID NO: 1 LC1004-001 cadena ligera, dominio variable de HuMab 1004-001 SEQ ID NO: 2 LC1004-001 cadena pesada, dominio variable de HuMab 1004-001 SEQ ID NO: 3 LC 1004-002 cadena ligera, dominio variable de HuMab 002 SEQ ID NO: 4 LC 1004-002 cadena pesada, dominio variable de HuMab 002 SEQ ID NO: 5 LC 1004-003 cadena ligera, dominio variable de HuMab 003 SEQ ID NO: 6 LC 1004-003 cadena pesada, dominio variable de HuMab 003 SEQ ID NO:7 LC 1004-004 cadena ligera (I), dominio variable de HuMab 004 (I) SEQ ID NO: 8 LC 1004-004 cadena pesada (I), dominio variable de HuMab 004 (I) SEQ ID NO: 9 LC 1004-004 cadena ligera (II), dominio variable de HuMab 004 (II) SEQ ID NO:10 LC 1004-004 cadena pesada (II), dominio variable de HuMab 004 (II) SEQ ID NO: 11 Cadena ligera, dominio variable de HuMab 005 SEQ ID NO: 12 Cadena pesada, dominio variable de HuMab 005 SEQ ID NO: 13 Cadena ligera, dominio variable de HuMab 010 (I) SEQ ID NO: 14 Cadena pesada, dominio variable de HuMab 010 (I) SEQ ID NO: 15 Cadena ligera, dominio variable de HuMab 010 (II) SEQ ID NO: 16 Cadena pesada, dominio variable de HuMab 010 (II) SEQ ID NO: 17 Cadena ligera, dominio variable de HuMab 010 (III) SEQ ID NO: 18 Cadena pesada, dominio variable de HuMab 010 (III) SEQ ID NO: 19 Cadena ligera, dominio variable de HuMab 011 SEQ ID NO: 20 Cadena pesada, dominio variable de HuMab 011 SEQ ID NO: 21 Cadena ligera, dominio variable de HuMab 017 SEQ ID NO: 22 Cadena pesada, dominio variable de HuMab 017 SEQ ID NO: 23 región constante de cadena ligera SEQ ID NO: 24 región constante de cadena pesada ?? SEQ ID NO: 25 región constante de cadena pesada ?? PVA236/ GLPSS331 (IgGlvl) SEQ ID NO: 26 región constante de cadena pesada ?? L234A/L235A (IgGlv2) SEQ ID NO: 27 región constante de cadena pesada ?4 SEQ ID NO: 28 región constante de cadena pesada ?4 S228/L235E (IgG4 l) SEQ ID NO: 29-32 Cadena pesada CDR1 SEQ ID NO: 33-37 Cadena pesada CDR2 SEQ ID NO: 38-42 Cadena pesada CDR3 SEQ ID NO: 43-44 Cadena ligera CDR1 SEQ ID NO: 5-46 Cadena ligera CDR2 SEQ ID NO: 47-52 Cadena ligera CDR3 En una modalidad, la" presente invención provee una formulación en donde el anticuerpo está presente en una cantidad en el intervalo de 10 a 150 mg/ml, preferiblemente de 10 a 50 mg/ml. Los anticuerpos monoclonales antagonísticos contra P-selectina pueden ser producidos por líneas de células de hibridoma. Las líneas de células de hibridoma preferidas son hu-Mab<P-selectina>LC 1004-001 (anticuerpo HuMab 001) hu- ab<P-selectina>LC 1004-002 (anticuerpo HuMab 002) y hu-Mab<P-selectina>LC 1004-017 (anticuerpo HuMab 017) , que fueron depositados, bajo el Tratado de Budapest sobre el reconocimiento internacional del depósito de microorganismos para los propósitos de procedimiento de patente, en Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ) , Alemania : Los anticuerpos útiles en las formulaciones de conformidad con la invención son preferiblemente producidos por medios recombinantes , v.gr., por aquellos descritos en el documento WO2006/072564. Estos métodos son ampliamente conocidos en la técnica más avanzada y comprenden expresión de proteína en células procarióticas y eucarióticas con aislamiento subsecuente del polipéptido de anticuerpo y usualmente purificación a una pureza farmacéuticamente aceptable. Para la expresión de proteína, los ácidos nucleicos que codifican cadenas ligera y pesada o fragmentos de las mismas son insertados en vectores de expresión por métodos estándares. La expresión se lleva a cabo en células hospederas procarióticas o eucarióticas apropiadas como Células CHO, células NSO, células SP2/0, células HEK293, células COS, levadura o células de E. coli, y el anticuerpo es recuperado de las células (sobrenadante o células después de lisis) por técnicas estándares que incluyen tratamiento con material alcalino/SDS , formación de banda de CsCl, cromatografía en columna, electroforesis sobre gel de agarosa y otros bien conocidos en la técnica, v.gr., como se describe en el documento 02006/07256 .
El término "regulador de pH" , como se usa aqui, denota un excipiente farmacéuticamente aceptable, que estabiliza el pH de una preparación farmacéutica. Los reguladores de pH adecuados son bien conocidos en la técnica y se pueden encontrar en la literatura. Los reguladores de pH farmacéuticamente aceptables preferidos comprenden pero no se limitan a reguladores de pH de histidina, reguladores de pH de citrato, reguladores de pH de succinato, reguladores de pH de acetato y reguladores de pH de fosfato. Los reguladores de pH aun más preferidos comprenden L-histidina o mezclas de L-histidina y clorhidrato de L-histidina con ajuste de pH con un ácido o una base conocida en la técnica. Los reguladores de pH antes mencionados se usan generalmente en una cantidad de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 100 mM, preferiblemente de aproximadamente 5 mM a aproximadamente 50 mM y muy preferiblemente de aproximadamente 10-20 mM. Independientemente del regulador de pH usado, el pH se puede ajustar a un valor que comprende aproximadamente 4.0 a aproximadamente 7.0 y preferiblemente a aproximadamente 5.0 a aproximadamente 6.5 y muy preferiblemente aun aproximadamente 5.5 a aproximadamente 6.0 con un ácido o base conocido en la técnica, v.gr., ácido clorhídrico, ácido acético, ácido fosfórico, ácido sulfúrico y ácido cítrico, hidróxido de sodio e hidróxido de potasio..
El término "agente tensioactivo" como se usa aquí, denota un excipiente farmacéuticamente aceptable que se usa para proteger formulaciones de proteína contra estreses mecánicos como agitación y esfuerzo cortante. Ejemplos de agentes tensioactivos farmacéuticamente aceptables incluyen esteres de ácido graso de polioxietilensorbitán (Tween) , éteres alquílicos de polioxitileno (Brij ) , éteres de alquilfenilpolioxietileno (Triton-X) , copolímero de polioxietileno-polioxipropileno (Poloxamer, Pluronic) . , y dodecil sulfato de sodio (SDS) . Los esteres de ácido graso de polioxietilensorbitán preferidos son polisorbato 20, (vendido bajo el nombre comercial Tween 20™) y polisorbato 80 (vendido bajo el nombre comercial Tween 80™) . Los copolímeros de polietileno-polipropileno preferidos son aquellos vendidos bajo los nombres Pluronic ® F68 o Poloxamer 188™, los éteres de alquílicos de polioxietileno preferidos son aquellos vendidos bajo la marca comercial Brij™. Los ésteres de alquilfenilpolioxitileno preferidos se venden bajo el nombre comercial Triton-X. Cuando se usa polisorbato 20 (Tween 20 ) y polisorbato 80 (Tween 80™) se usan generalmente en un intervalo de concentración de aproximadamente 0.001 a aproximadamente 1%, preferiblemente de aproximadamente 0.005 a aproximadamente 0.1% y muy preferiblemente de aproximadamente 0.01% a aproximadamente 0.04% p/v (peso/volumen) .
El término "estabilizador" « denota un excipiente farmacéuticamente aceptable, que protege al ingrediente farmacéutico activo y/o la formulación contra degradación química y/o física durante la fabricación, almacenamiento y aplicación. Las vías de degradación física y química de agentes farmacéuticos de proteína se revisan en Cleland et al. (1993), Crit Rev Ther Drug Carrier Syst 10(4): 307-77, Wang (1999) Int J Pharm 185(2): 129-88, Wang (2000) Int J Pharm 203(1-2): 1-60 and Chi et al. (2003) Pharm Res 20(9): 1325-36. Los estabilizadores incluyen pero no se limitan a azúcares, aminoácidos, polioles, ciclodextrinas , v.gr., hidroxipropil-p-ciclodextrina, sulfobutiletil-ß-ciclodextrina, ß-ciclodextrina, polietilenglicoles , v.gr., PEG 3000, PEG 3350, PEG 4000, PEG 6000, albúmina, albúmina de suero humano (HSA) , albúmina de suero de bovino (BSA) , sales, v.gr., cloruro de sodio, cloruro de magnesio, cloruro de calcio, quelatadores , v.gr., EDTA como se define más adelante. Como se mencionó antes, los estabilizadores pueden estar presentes en la formulación en una cantidad de aproximadamente 10 a aproximadamente 500 mM, preferiblemente en una cantidad de aproximadamente 10 a aproximadamente 300 mM y muy preferiblemente en una cantidad de aproximadamente 100 mM a aproximadamente 300 mM.
El término "azúcar", como se usa aquí, denota un monosacárido o un oligosacárido . Un monosacárido es un carbohidrato monomérico que no es hidrolizable por ácidos, que incluyen azúcares simples y sus derivados, v.gr., amino azúcares. Ejemplos de monosacáridos incluyen glucosa, fructosa, galactosa, mañosa, sorbosa, ribosa, desoxirribosa, ácido neuramínico. Un oligosacárido es un carbohidrato que consiste de más de una unidad de sacárido monomérico conectada mediante enlaces glicosídicos ya sea ramificados o en cadena. Las unidades de sacárido monomérico dentro de un oligosacárido pueden ser idénticas o diferentes. Según el número de unidades de sacárido monomérico, el oligosacárido es un di, tri, tetra, penta- sacárido y así sucesivamente. A diferencia de los polisacáridos , los monosacáridos y oligosacáridos son solubles en agua. Ejemplos de oligosacáridos incluyen sacarosa, trehalosa, lactosa, maltosa y rafinosa. Los azúcares preferidos son sacarosa y trehalosa, muy preferida es la trehalosa.
El término "aminoácido", como se usa aquí, denota una molécula orgánica farmacéuticamente aceptable que posee una porción amino-localizada en la posición a a un grupo carboxílico. Ejemplos de aminoácidos incluyen arginina, glicina, ornitina, lisina, histidina, ácido glutámico, ácido asparágico, isoleucina, leucina, alanina, fenilalanina, tirosina, triptofano, metionina, serina, prolina. Los aminoácidos generalmente se usan en una cantidad de aproximadamente 10 a 500 mM, preferiblemente en una cantidad de aproximadamente 10 a aproximadamente 300 mM y muy preferiblemente en una cantidad de aproximadamente 100 a aproximadamente 300 mM.
El término "polioles", como se usa aquí, denota alcoholes farmacéuticamente aceptables con más de un grupo hidroxilo. Los polioles adecuados comprenden pero no se limitan a manitol, sorbitol, glicerina, dextrano, glicerol, arabitol, propilenglicol , polietilenglicol y combinaciones de los mismos. Los polioles se pueden usar en una cantidad de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 500 mM, preferiblemente en una cantidad de 10 a aproximadamente 300 mM y muy preferiblemente en una cantidad de aproximadamente 100 a aproximadamente 300 mM.
Un subgrupo dentro de los estabilizadores son lioprotectores . El término "lioprotector" denota excipientes farmacéuticamente aceptables, que protegen al ingrediente activo lábil (v.gr., una proteína) contra condiciones desestabilizadoras durante el proceso de liofilización, almacenamiento subsecuente y reconstitución. Los lioprotectores comprenden pero no se limitan al grupo que consiste de azúcares, polioles (tales como v.gr., alcoholes de azúcar) y aminoácidos. Los lioprotectores preferidos se pueden seleccionar del grupo que consiste de azúcares tales como sacarosa, trehalosa, lactosa, glucosa, mañosa, maltosa, galactosa, fructosa, sorbosa, rafinosa, ácido neuramínico, azúcares de amino tales como glucosamina, galactosamina, n-metilglucosamina ( "Meglumina" ) , polioles tales como manitol y sorbitol, y aminoácidos tales como arginina y glicina o mezclas de los mismos. Los lioprotectores generalmente se usan en una cantidad de aproximadamente 10 a 500 mM, preferiblemente en una cantidad de aproximadamente 10 a aproximadamente 300 mM y muy preferiblemente en una cantidad de aproximadamente 100 a aproximadamente 300 mM.
Un subgrupo dentro de los estabilizadores son los antioxidantes. El término "antioxidante" denota excipientes farmacéuticamente aceptables, que previenen la oxidación del ingrediente farmacéutico activo. Los antioxidantes comprenden pero no se limitan a ácido ascórbico, glutatión, cisteína, metionina, ácido cítrico, EDTA. Los antioxidantes se pueden usar en una cantidad de aproximadamente 0.01 a aproximadamente 100 mM, preferiblemente en una cantidad de 5 a aproximadamente 50 mM y muy preferiblemente en una cantidad aproximadamente de 5 a aproximadamente 20 mM.
El término "agentes de tonicidad" , como se usa aquí, denota agentes de tonicidad farmacéuticamente aceptables. Los agentes de tonicidad se usan para modular la tonicidad de la formulación. La formulación puede ser hipotónica, isotónica o hipertónica. La isotonicidad en general se refiere a la presión osmótica en relación con una solución usualmente relativa a la del suero de sangre humana. La formulación de conformidad con la invención puede ser hipotónica, isotónica o hipertónica, pero preferiblemente será isotónica. Una formulación isotónica es líquido o líquido reconstituido de una forma sólida, v.gr. , de una forma liofilizada y denota una solución que tiene la misma tonicidad que otra solución con la cual es comparada, tal como una solución de sal fisiológica y el suero sanguíneo. Los agentes de tonicidad adecuados comprenden pero no se limitan a cloruro de sodio, cloruro de potasio, glicerina y cualquier componente del grupo de aminoácidos, azúcares, en particular glucosa. Los agentes de tonicidad generalmente se usan en una cantidad de aproximadamente 5 mM a aproximadamente 500 mM.
Dentro de los estabilizadores y agentes de tonicidad hay un grupo de compuestos que pueden funcionar en ambas formas, es decir, pueden ser al mismo tiempo un estabilizador y un agente de tonicidad. Ejemplos de los mismos se pueden encontrar en un grupo de azúcares, aminoácidos, polioles, ciclodextrinas , polietilenglicoles y sales. Un ejemplo para un azúcar que puede ser al mismo tiempo un estabilizador y un agente de tonicidad es la trehalosa .
Las composiciones también pueden contener adyuvantes tales como conservadores, agentes humectantes, agentes emulsionantes y agentes dispersantes. La prevención de la presencia de microorganismos puede ser asegurada por procedimientos de esterilización así como por la inclusión de varios agentes antibacterianos y antimicóticos, por ejemplo, parabeno, clorobutanol , fenol, ácido sórbico, y similares. Los conservadores generalmente se usan en una cantidad de aproximadamente 0.001 a aproximadamente 2% (p/v) . Los conservadores comprenden pero no se limitan a etanol, alcohol bencílico, fenol, m-cresol, p-clor-m-cresol , metil o propil parabenos, cloruro de benzalconio.
El término "líquido" como se usa aquí, en conexión con la formulación de conformidad con la invención denota una formulación que es líquida a una temperatura de por lo menos aproximadamente 2 a aproximadamente 8°C bajo presión atmosférica.
El término "liofilizado" , como se usa aquí, en conexión con la formulación de conformidad con la invención denota una formulación que es fabricada por métodos de secado por congelamiento conocidos en la técnica como tales. El solvente (v.gr., agua) es removido por congelamiento después de sublimación bajo vacío y desorción de agua residual a temperatura elevada. El liofilizado usualmente tiene una humedad residual de aproximadamente 0.1 a 5% (p/p) y está presente como un polvo o uña torta estable física. El liofilizado se caracteriza por una disolución rápida después de la adición de un medio de reconstitución.
El término "formulación reconstituida" , como se usa aquí en conexión con la formulación de conformidad con la invención, denota una formulación que es liofilizada y re-disuelta por la adición de medio de reconstitución. El medio de reconstitución comprende pero no se limita a agua para inyección (WFI) , agua bacteriostática para inyección (BWFI) , soluciones de cloruro de sodio (v.gr., 0.9% (p/v) de NaCl) , soluciones de glucosa (v.gr., 5% de glucosa), agente tensioactivo, que contienen :soluciones (v.gr., 0.01% de polisorbato 20), una solución regulada en su pH (v.gr., soluciones reguladas en su pH con fosfato) .
Las formulaciones de conformidad con la invención tienen propiedades nuevas e inventivas que causan un beneficio para un paciente que padece asma o una enfermedad alérgica.
La invención además comprende el uso de una formulación de conformidad con la invención para la fabricación de un medicamento para tratamiento de asma.
Una composición de la presente invención se puede administrar por una variedad de métodos conocidos en la técnica. Como lo apreciará un experto en la técnica, la vía y/o modo de administración dependerán de los resultados deseados .
Para administrar una composición de la invención por ciertas vías de administración, puede ser necesario diluir la composición en un diluyente. Los diluyentes farmacéuticamente aceptables incluyen solución salina, glucosa, solución de Ringer y soluciones reguladoras de pH acuosas .
Las frases "administración parenteral" y "administrado parenteralmente", como se usa aquí, significan modos de administración distintos a la administración enteral y tópica, usualmente por inyección, e incluye sin limitación, inyección e infusión intravenosa, intramuscular, intraarterial , intratecal, ; intracapsular, intraorbital , intracardiaca, intradérmica , intraperitoneal , intratraqueal , subcutánea, subcuticular, intraarticular, subcapsular, subaracnoidea, intraespinal, epidural e intraesternal .
La composición debe ser estéril y fluida al grado que la composición es suministrable mediante jeringa. Además del agua, el vehículo puede ser una solución salina isotónica regulada en su pH, etanol, poliol (v.gr., glicerol, polietilenglicol y polietilenglicol líquido, y similares) y mezclas adecuadas de los mismos.
La formulación de conformidad con la invención se puede administrar por vía intravenosa (i.v.), subcutánea (s.c.) o cualquier otro medio de administración parenteral tal como aquellos conocidos en la técnica farmacéutica.
La formulación de conformidad con la invención se puede preparar por métodos conocidos en la técnica, v.gr., ultrafiltración, diafiltración, diálisis, adición y mezclado, liofilización, reconstitución y combinaciones de las mismas. Ejemplos de preparaciones de formulaciones de conformidad con la invención se pueden encontrar a continuación.
Ejemplos Ejemplo 1 Preparación de formulaciones liquidas huMAb-P-Selectina preparada y fermentada y purificada como se describe en el documento WO2005/100402 se proveyó a una concentración de aproximadamente 22 a 27 mg/ml en un regulador de pH de histidina 20 mM a un pH de aproximadamente 6.0 o en un regulador de pH de acetato 20 mMa un pH de aproximadamente 5.2.
Para la preparación de las formulaciones líquidas, de huMAb-P-Selectina, los excipientes (v.gr., trehalosa) se añadieron como soluciones de abastecimiento 2-10 veces a la solución de anticuerpo. El agente tensioactivo después se añadió a una solución de abastecimiento de 2 a 200 veces o como agente tensioactivo puro. Finalmente, la concentración de proteína se ajustó con un pH a la concentración de hu Ab-P-Selectina final de aproximadamente 15 mg/ml.
Todas las formulaciones fueron filtradas en forma estéril a través de filtros de unión de proteína baja de 0.22 µ?a y se llenaron asépticamente con atmósfera de nitrógeno en frascos de vidrio de 6 mL estériles cerrados con tapones de goma revestidos con ETFE (copolímero de etileno y tetrafluoroetileno) y casquillos de aluminio. El volumen de llenado fue de aproximadamente 2.4 mL. Estas formulaciones se almacenaron a diferentes condiciones climáticas de ICH (5°C, 25°C y 40°C) para diferentes intervalos de tiempo y fueron sometidas a estrés al agitar (una semana a una frecuencia de agitación de 200 min"1 a 5°C) y métodos de estrés de congelamiento-descongelamiento. Las muestras fueron analizadas antes y después de aplicar las pruebas de estrés por los métodos analíticos 1) espectrofotometría de UV, y 2) cromatografía de exclusión de tamaño (SEC, por sus siglas en inglés) .
Se usó cromatografía de exclusión de tamaño (SEC) para detectar especies de peso molecular alto solubles (agregados) y productos de hidrólisis de peso molecular bajo (LM , por sus siglas en inglés) en las formulaciones. El método se realizó en un instrumento Water Alliance 2795 HPLC equipado con una columna TOSOH BIOSCIENCE TSK G3000 SWXL. Monómero intacto, agregados y productos de hidrólisis se separaron por un perfil de elución isocrático, mediante el uso de 0.2M de K2HP04/KOH, 0.25M de KCL , pH 7.0 como fase móvil, y se detectaron a una longitud de onda de 280nm. La espectroscopia de UV, usada para determinación de contenido de proteína, se realizó en un espectrofotómetro Varían Cary Bio UV en un intervalo de longitud de onda de 240 nm a 400 nm. Muestras de proteína netas se diluyeron a aproximadamente 0.5 mg/ml con el regulador de pH de la formulación correspondiente. La concentración de proteína se calculó de conformidad con la ecuación 1.
Ecuación 1 : Contenido de proteína = La absorción de luz UV a 280 nm se corrigió para dispersión de luz a 320 nm y se multiplicó por el factor de dilución, que se determinó a partir de las masas pesadas y densidades de la muestra neta y el regulador de pH de dilución. El numerador se dividió por el producto de la longitud de trayectoria del tubo d y el coeficiente de extinción e.
Tabla 1 Ejemplo 2 Preparación de formulaciones liofilizadas y formulaciones liquidas reconstituidas a partir de formulaciones liofilizadas huMAb-P-Selectina preparada y fermentada y purificada como se describe en el documento WO 2005/100402 se proveyó a una concentración de aproximadamente 22 a 27 mg/ml en un regulador de pH de 20 mM de histidina a un pH de aproximadamente 6.0, o en un regulador de pH de 20 mM de succinato a un pH de aproximadamente 5.2, y se liofilizó mediante el uso del ciclo de secado por congelamiento reportado en la tabla 2.
Tabla 2 Ciclo de secado por congelamiento tipo I El producto se enfrió primero de temperatura ambiente a aproximadamente 5°C (pre-enfriamiento) , seguido por un paso de congelamiento a -40 °C con una velocidad de enfriamiento de placa de aproximadamente l°C/min, seguido por un paso de mantenimiento a -40°C durante aproximadamente 2 horas. El primer paso de secado se realizó a una temperatura de placa de aproximadamente -25°C y una presión de cámara de aproximadamente 80 µbar durante aproximadamente 65 horas. Subsecuentemente, el segundo paso de secado empieza con una rampa de temperatura de 0.2°C/min de -25°C a 25°C, seguido por un paso de mantenimiento a 25°C durante por lo menos 5 horas a una presión de cámara de aproximadamente 80 µba .
La liofilización se llevó a cabo en un secador por congelamiento Usifroid SMH-90 LN2 (Usifroid, Maurepas, Francia) . Todas las tortas liofilizadas tuvieron un contenido de agua residual de aproximadamente 0.1 a 2.0% como se determinó por el método de Karl-Fischer. Las muestras de secado por congelamiento se incubaron a diferentes temperaturas para diferentes intervalos de tiempo.
Las formulaciones liofilizadas se reconstituyeron a un volumen final de 5.3 mi con agua para inyección (WFI) lo que dio una formulación isotónica con una concentración de anticuerpo de aproximadamente 15 mg/ml. El tiempo de reconsti ución de las tortas secadas por congelamiento estuvo por abajo de 1 min. El análisis de las muestras reconstituidas se realizó inmediatamente después de la reconstitución, o después de un período de incubación de 24 horas de la muestra líquida reconstituida a 25°C.
Las muestras se analizaron por 1) espectrofotometría de UV y 2) cromatografía de exclusión de tamaño (SEC) .
Tabla 3 Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (10)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:
1. Una formulación farmacéutica caracterizada porque comprende : 1 a 200 mg/ml de un anticuerpo; 1 a 100 mM de un regulador de pH; 0.001 a 1 % de un agente tensioactivo; (a) 10 a 500 mM de un estabilizador; o (b) 10 a 500 mM de un estabilizador y 5 a 500 mM de un agente de tonicidad; o (c) 5 a 500 mM de un agente de tonicidad; a un pH en el intervalo de 4.0 a 7.0, en donde el anticuerpo es un anticuerpo contra P-selectina.
2. La formulación de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque es una formulación líquida o una formación liofilizada o una formulación líquida reconstituida a partir de una formulación liofilizada.
3. La formulación de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizada porque la concentración de anticuerpo está en el intervalo de 10 mg/ml a 150 mg/ml.
4. La formulación de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada porque el estabilizador es trehalosa.
5. La formulación de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada porque el agente tensioactivo es polisorbato.
6. La formulación de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizada porque el regulador de pH es un regulador de pH de histidina.
7. La formulación de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizada porque comprende un agente de tonicidad.
8. La formulación de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizada porque el agente de tonicidad es trehalosa.
9. La formulación de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque comprende: 1 a 50 mg/ml de huMAb-P-selectina, 20 mM de L-histidina HC1, 240 mM de trehalosa, 0.02% de polisorbato 20, a pH 6.0; o 1 a 50 mg/ml de huMAb-P-selectina, 20 mM de acetato de sodio, 140 mM de trehalosa, 75 mM de glicina, 0.04% de polisorbato 20, a pH 5,2; o 1 a 50 mg/ml de huMAb-P-selectina, 20 mM de L-histidina HC1, 240 mM de trehalosa, 0.02% de polisorbato 20, a H 6.0; o 1 a 50 mg/ml de huMAb-P-selectina, 20 raM de succinato, 240 mM de trehalosa, 20 mM de arginina, 0.02% de polisorbato 20, a pH 6.0.
10. El uso de una formulación de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20 para la preparación de un medicamento útil para tratar asma o alergia.
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