MX2012004703A

MX2012004703A - Metodos y sistemas para purificar la neurotoxina botulinica no acomplejada.

Info

Publication number: MX2012004703A
Application number: MX2012004703A
Authority: MX
Inventors: Curtis L Ruegg
Original assignee: Revance Therapeutics Inc
Priority date: 2009-10-21
Filing date: 2010-10-20
Publication date: 2012-06-08
Also published as: CN104961812A; JP5951490B2; HK1175453A1; EP2490986A1; BR112012009227A2; CA2773396C; PH12012500549A1; EP2490986B2; HK1215951A1; SMT201800487T1; AU2010310749A1; HRP20181869T1; WO2011050072A1; US9469849B2; PT2490986T; KR101819129B1; EP2490986A4; LT2490986T; DK2490986T4; CO6551670A2

Abstract

Se proporcionan métodos y sistemas para la purificación cromatográfica de una neurotoxina botulinica. Estos métodos y sistemas permiten la purificación eficiente de la forma no acomplejada de la neurotoxina botulínica en un alto grado de pureza y rendimiento que pueda usarse como ingrediente activo en preparaciones farmacéuticas.

Description

MÉTODOS Y SISTEMAS PARA PURIFICAR LA NEUROTOXINA BOTULÍNICA NO ACOMPLEJADA Referencia Cruzada a Solicitudes Relacionadas La presente solicitud reclama el beneficio de prioridad de la Solicitud Provisional de los Estados Unidos Número 61/253,810. presentada el 21 de octubre de 2009. El contenido de esta Solicitud Provisional de los Estados Unidos se tiene aquí reproducido en su totalidad.

Campo de la Invención La presente invención se refiere generalmente a los métodos y sistemas cromatográficos para purificar una neurotoxina botulínica libre de cultivos celulares para producir un producto de alta pureza y alta potencia.

Antecedentes de la Invención La toxina botulínica es una proteína neurotóxica producida por la bacteria Clostridium botulinum, así como también por otras especies Clostridiales como por ejemplo la Clostridium butyricum y la Clostridium baraffi. La toxina bloquea la transmisión neuromuscular y produce una neuroparálisis en los seres humanos y animales, conocida como botulismo. La C. botulinum y sus esporas generalmente se encuentran en el suelo y en cadáveres de animales en grado de putrefacción y también puede crecer en contenedores de alimentos inadecuadamente esterilizados y sellados, lo cual es la causa de muchos casos de botulismo. Los síntomas del botulismo pueden incluir dificultad para caminar, tragar y hablar, y además pueden llegar a la parálisis de los músculos respiratorios y finalmente pueden producir la muerte.

La toxina botulínica tipo A es la sustancia natural más letal conocida por el hombre. Además del serotipo A, se han caracterizado otras seis toxinas botulinicas generalmente distintas a nivel inmunológico, a saber, los serotipos B, C^, D, E, F, y G de toxina botulínica. Los distintos serotipos pueden distinguirse por neutralización con los anticuerpos de tipo específico y varían en cuanto a la gravedad de la parálisis que producen y la especie animal que afectan principalmente. El peso molecular de la molécula proteica de la toxina botulínica, para cada uno de los serotipos de toxina botulínica conocidos, es de alrededor de 150 kD, compuesto de una cadena pesada de alrededor de 100 kD unida a una cadena liviana de alrededor de 50 kD. No obstante, las toxinas botulinicas son liberadas por las bacterias Clostridial como complejos de la toxina de 150 kD con una o más proteínas no tóxicas. Por ejemplo, la toxina botulínica tipo A existe en complejos de 900 kD, de 500 kD y de 300 kD (pesos moleculares aproximados).

A pesar de los efectos tóxicos conocidos, la toxina botulínica Tipo A se utiliza clínicamente para tratar varias indicaciones que incluyen por ejemplo, trastornos neuromusculares caracterizados por la hiperactividad del músculo esqueletal. Por ejemplo, BOTOX® es la marca comercial de un complejo de toxina botulínica tipo A disponible comercialmente a través de Allergan, Inc., de Irvine, California. La toxina botulínica tipo A se usa, por ejemplo, en el tratamiento esencial del blefaroespasmo, el estrabismo, la distonia cervical y las arrugas de la zona glabelar (facial). También se han usado otros serotipos clínicamente. Una toxina botulínica tipo B, por ejemplo, se ha indicado para uso en el tratamiento de la distonia cervical. Se cree que las toxinas botulínicas se unen con alta afinidad a la membrana presináptica de las neuronas motoras, se translocan dentro de la neurona y de ahí en más bloquean la liberación presináptica de la acetilcolina.

La toxina botulínica para uso clínico generalmente se aisla de un cultivo celular y se han usado varios métodos de purificación. Históricamente, la toxina es purificada en forma de complejo por una serie de pasos de precipitación y filtración de flujo tangencial. Ver, por ejemplo, Schantz E. J., et al, Properties and use of botulinum toxin and other microbial neurotoxins in medicine, Microbiol Rev 1992 March 56(l):80-99. Sin embargo, tales métodos han proporcionado rendimientos relativamente bajos, generalmente menores al 10% aproximadamente. Otros métodos han usado la exclusión por tamaño, el intercambio de iones y/o la cromatografía de afinidad. Ver, por ejemplo, Schmidt J. J., et al., Purification of type E botulinum neurotoxin by high-performance ion exchange chromatography, Anal. Biochem. 1986 July; 156(1 ):213-219; Simpson L. L . , et al., Isolation and characterization of the botulinum neurotoxins, Harsman S, ed. Methods in Enzymology. Vol. 165, Microbial Toxins: Tools in Enzymology San Diego, Calif: Academic Press; vol 165: pages 76-85 (1988); Kannan K. , et al., Methods development for the biochemical assessment of Neurobloc (botulinum toxin type B), Mov Disord 2000; 15(Suppl 2):20 (2000); Wang Y.C., The preparation and quality of botulinum toxin type A for injection (BTXA) and its clinical use, Dermatol Las Fací Cosm Surg 2002; 58 (2002); y U.S. Pat. Appl. Publ. No. 2003/0008367.

Sin embargo, otros métodos se han enfocado simplemente en una de las cadenas pesada o liviana de la toxina más que en la proteína de la toxina botulínica completa y biológicamente activa. Por ejemplo, una de estas cadenas está sintetizada individualmente por medios recombinantes. Ver, por ejemplo, Zhou L., et al., Expression and purification of the light chain of botulinum neurotoxin A: A single mutation abolishes its cleavage of SNAP-25 and neurotoxicity after reconstitution with the heavy chain, Biochemistry 1995; 34(46) : 15175-81 ( 1995 ) ; y Johnson S. K., et al., Scale-up of the fermentation and purification of the recombination heavy chain fragment C of botulinum neurotoxin serotype F, expressed in Pichia pastoris, Protein Ex r and Purif 2003; 32:1-9 (2003). Estos métodos, sin embargo, requieren pasos extra para reformar una proteína de la toxina botulínica completa y biológicamente activa.

Un método más reciente incluye el uso de cromatografía de interacción hidrofóbica, modo mixto y/o cromatografía de intercambio iónico para purificar la toxina botulínica como complejo. Ver por ejemplo, U.S. Pat. Números 7.452,697 y 7.354,740. las que se incorporan a la presente como referencia.

De acuerdo con ello, existe una necesidad en el estado de la técnica para hallar mejores métodos de purificación para aislar proteínas completas de la toxina botulínica en forma estable y biológicamente activas y no acomplejadas proteico. Por lo tanto, es objeto de la invención proporcionar composiciones y métodos que aborden estas y otras necesidades.

La discusión precedente se presenta solamente para proporcionar una mejor comprensión de la naturaleza de los problemas que enfrenta el estado de la técnica y de ninguna manera debería interpretarse como un reconocimiento de estado de la técnica previo, ni la cita de toda referencia en el presente documento debe interpretarse como reconocimiento de que dicha referencia constituye "la técnica anterior" a la presente solicitud.

Breve Descripción de la Invención La presente invención se refiere a los sistemas y métodos para purificar una toxina botulínica no acomplejada. En una modalidad, el método incluye purificar la toxina botulínica no acomplejada en estado crudo para obtener una toxina botulínica no acomplejada purificada. En esta modalidad, el método comprende cargar una columna de intercambio aniónico con la toxina botulínica no acomplejada en estado crudo para capturar la toxina botulinica no acomplejada en la columna de intercambio amónico; eluir la toxina botulínica no acomplejada con un tampón para dar un eluyente que incluya la toxina botulinica no acomplejada; cargar una columna de intercambio catiónico con el eluyente del intercambio aniónico a la columna para permitir la captura de la toxina botulínica no acomplejada; y eluir la toxina botulínica no acomplejada con otro tampón para dar uh eluyente, obteniendo a partir de allí una toxina botulínica no acomplejada purificada.

En algunas modalidades, el complejo de la toxina botulínica se obtiene a través de varios pasos cromatográficos. En algunas modalidades, un método para la obtención del complejo de la toxina botulínica comprende la obtención de una muestra compuesta por el complejo de la toxina botulínica; la carga de una columna de interacción hidrofóbica con la muestra para permitir la captura de la toxina, en donde la toxina botulínica capturada comprende el complejo de la toxina botulínica; y eluir la toxina botulínica compleja La toxina botulinica no acomplejada es luego disociada del complejo y purificada según el método descrito arriba. En algunas modalidades, la muestra se obtiene exponiendo un cultivo de fermentación que comprenda la toxina botulínica a un ácido para obtener un precipitado ácido que puede ser sujeto a pasos adicionales de purificación pre-cromatográfica, ejemplos no limitantes de esto incluyen filtración de flujo tangencial para concentrar el material ¡nsoluble del precipitado, digestión con nucleasas, clarificación por centrifugación y/o filtración.

En algunas modalidades, la muestra es sometida a una digestión con nucleasas antes de cargarla en la columna de interacción hidrofóbica. Preferentemente, las nucleasas son derivadas en un proceso libre de producto animal y, con mayor preferencia aún, todo el proceso de purificación está libre de producto animal o al menos sustancialmente libre de producto animal.

En algunas modalidades, la muestra a usarse en las separaciones cromatográficas es preferentemente un sobrenadante o fracción de filtración.

La toxina botulinica no acomplejada purificada comprende al menos uno de los tipos de toxina botulinica tipo A, B, Ci, D, F, F y G, y con preferencia una toxina botulinica tipo A con un peso molecular de aproximadamente 150 kD. En algunas modalidades preferidas, la toxina botulinica no acomplejada purificada tiene una pureza de al menos 98%; y/o tiene una actividad de al menos 200 LDso unidades/ng. En algunas modalidades, el método produce un rendimiento aproximado de al menos 2 mg/L de cultivo de fermentación. En otras modalidades, el método produce un rendimiento de aproximadamente 1 a 2 mg/L de cultivo de fermentación .

Estos y otros aspectos de la invención serán mejor comprendidos por referencia a la siguiente descripción detallada de la invención.

Breve Descripción de las Figuras La figura 1 es un diagrama de flujo general que compara una modalidad de un proceso según la presente invención para purificar directamente una toxina botulínica no acomplejada (figura 1A) con un proceso para purificar una toxina botulínica en complejo (figura 1 B).

Descripción Detallada de la Invención La presente invención se refiere a sistemas y métodos para purificar una toxina botulínica no acomplejada. En ciertas modalidades, el método comprende purificar una toxina botulínica no acomplejada en bruto cargando una columna de intercambio aniónico con la toxina no acomplejada en bruto para permitir la captura de la toxina botulínica no acomplejada por parte de la columna de intercambio aniónico. La toxina botulínica no acomplejada es luego eluída con tampón para dar un eluyente que comprenda la toxina botulínica no acomplejada. El eluyente de la columna aniónica se carga en una columna de intercambio catiónico para permitir la captura . de la toxina botulínica no acomplejada y la toxina no acomplejada es eluída con tampón, obteniéndose de ahí una toxina botulínica no acomplejada purificada.

En algunas modalidades, la invención permite la purificación de la toxina botulínica no acomplejada en una cantidad relativamente pequeña de pasos para producir alto rendimiento, alta pureza, y un producto de alta potencia. Los procesos y los sistemas dentro del alcance de la invención pueden usarse para producir eficientemente una toxina botulinica estable y no acomplejada a partir de cultivos de fermentación. En otras modalidades, el método además comprende proveer una muestra que comprenda el complejo de toxina botulinica y cargar una columna de interacción hidrofóbica con la muestra como para permitir la captura del complejo de toxina botulinica por parte de la columna de interacción hidrofóbica. El complejo de la toxina botulinica es luego eluído de la columna con tampón. La toxina botulinica no acomplejada en bruto es disociada del complejo de la toxina botulinica para obtener una mezcla que comprende la toxina botulinica no acomplejada en bruto. En esta modalidad, la mezcla que comprende la toxina no acomplejada en bruto es purificada para obtener toxina botulinica pura o sustancialmente pura según el método descrito precedentemente.

Un aspecto de la presente invención es el reconocimiento de que la composición farmacéutica que comprende la toxina botulinica no acomplejada como ingrediente activo puede proporcionar mayor pureza en comparación con una que comprenda una forma acomplejada. Las proteínas no tóxicas generalmente asociadas con un complejo de toxina botulinica pueden representar alrededor del 90% por peso del complejo. De este modo, proporcionar una toxina botulinica como un complejo necesariamente incluye al menos aproximadamente el 90% por peso de impurezas. En otras palabras, al menos aproximadamente del 80 al 90% por peso de la composición farmacéutica incluirá impurezas celulares derivadas que no son parte de la molécula activa ni son necesarias para su actividad biológica. Dichas impurezas, sin embargo, representan materiales derivados de células que cuando se administran a un paciente pueden aumentar el riesgo de reacciones inmunológicas no deseadas a la droga; pueden aumentar el riesgo de efectos secundarios no deseados; y/o pueden aumentar el riesgo de transmisión de agentes patógenos. Por el contrario, la alta pureza de un producto no acomplejada, que puede obtenerse por medio de los métodos y sistemas descritos en el presente documento, reduce la cantidad de impurezas de la célula huésped que pueden permanecer en la composición farmacéutica, reduciendo a partir de allí los riegos aledaños de reacciones y/o transmisión no deseadas. De acuerdo con ello, los procesos y sistemas descritos en el presente pueden proporcionar una toxina botulínica en una forma más apropiada para la preparación de composiciones farmacéuticas más seguras y puras.

Sin embargo, a diferencia de las formas acomplejadas, la toxina botulínica libre preparada de acuerdo con el método descrito en el presente no necesita ser estabilizada para su almacenamiento en productos derivados de la sangre. El complejo de la toxina botulínica tipo A, por ejemplo, generalmente se estabiliza en un excipiente que comprende albúmina, derivada de sangre humana. Por ejemplo, el BOTOX® consiste en un complejo de toxina botulínica tipo A purificada, seroalbúmina humana y cloruro de sodio presentados en forma seca al vacío. Lo mismo ocurre con Dysport y Xeomin. Mientras que el tamizado reduce la probabilidad de la contaminación con agentes patógenos, el uso de la sangre humana en preparaciones farmacéuticas generalmente aumenta el riesgo de la transmisión indeseada de ciertos agentes patógenos, por ejemplo, los agentes que no son o no pueden ser tamizados aún. En contraposición, la toxina botulínica libre preparada según la presente invención puede almacenarse de manera estable, como se enseña aquí, en sulfato de amonio. Además, en algunas modalidades preferidas, los métodos y sistemas de la presente invención están sustancial, esencial o totalmente libres de producto animal, como se discute aquí. La capacidad de almacenar también de manera estable el producto de la toxina sustancial, esencial o totalmente libre de producto animal, reduce además los riesgos potenciales asociados con los productos derivados de animales. De acuerdo con esto, los procesos y sistemas descritos aqui proporcionan una toxina botulínica en forma especialmente adecuada para las aplicaciones farmacéuticas en términos de seguridad, por ejemplo, donde la composición farmacéutica puede ser preparada y almacenada sustancial, esencial o totalmente libre de producto animal.

En ciertas modalidades preferidas, los procesos y sistemas descritos en el presente son escalables y/o cumplen con las normas cGMP. De acuerdo con esto, los métodos y sistemas descritos aquí pueden usarse a escala comercial e industrial para producir toxina botulínica no acomplejada para uso, por ejemplo, en composiciones farmacéuticas. Un proceso o sistema que cumple con las normas cGMP se refiere a uno que cumple con los requisitos regulatorios en cuanto a buenas prácticas de fabricación, según lo requerido por el Código de Reglamentos Federales de los Estados Unidos. En algunas modalidades preferidas, el producto de toxina botulínica no acomplejada es especialmente adecuado para la producción a gran escala debido a su fácil almacenamiento y manejabilidad, alta actividad, alta pureza, estabilidad y/o mejorada seguridad.

"La toxina botulínica" como es usada aquí se refiere a una molécula de proteína neurotóxica que puede ser producida por una bacteria Clostridial , como así también por formas de la misma producidas de manera recom inante. Una toxina botulínica recombinante puede tener la cadena liviana y/o la cadena pesada de la proteína de toxina sintetizada vía técnicas recombinantes, por ejemplo, por medio de una especie Clostridial y/o no Clostridial . En el presente documento el término "toxina botulínica" se usa indistintamente con las expresiones relacionadas "neurotoxina botulínica", "neurotoxina" o simplemente "toxina". El término "toxina botulínica" abarca a cualquiera de los serotipos A, B, Ci, D, E, F y G de la toxina botulinica y también incluye tanto la forma acomplejada como la forma no acomplejada.

La "forma acomplejada" implica un complejo de toxina botulinica que comprende una proteína de toxina botulinica (por ejemplo, la molécula de toxina con un peso molecular de alrededor de 150 kD) como asi también al menos una proteina nativa no tóxica asociada. Las proteínas no tóxicas que conforman los complejos generalmente incluyen la proteína no tóxica hemaglutinina y la proteína no tóxica no hemaglutinina. Es por esto que las formas acomplejadas pueden comprender una molécula de toxina botulinica (el componente neurotóxico) y una o más proteínas no tóxicas de hemaglutinina y/o una o más proteínas no tóxicas no hemaglutininas. En ciertas modalidades, el peso molecular del complejo es mayor de aproximadamente 150 kD. Por ejemplo, las formas acomplejadas de la toxina botulinica tipo A pueden tener pesos moleculares de aproximadamente 900 kD, aproximadamente 500 kD o aproximadamente 300 kD. Las formas acomplejadas de la toxina botulinica tipos B y pueden tener un peso molecular de 500 kD. Las formas acomplejadas de toxina botulinica tipo D pueden tener un peso molecular de aproximadamente 300 kD o aproximadamente 500 kD. Finalmente, las formas acomplejadas de toxina botulinica tipos E y F pueden tener un peso molecular de aproximadamente 300 kD.

La toxina botulinica "no acomplejada" se refiere a una proteína de toxina botulinica aislada, o esencial o su st a n c¡ a I me n te aislada, que tiene un peso molecular de aproximadamente 150 kD. Es decir que las formas "no acomplejadas" excluyen las proteínas no tóxicas, como por ejemplo las proteínas no tóxicas de hemaglutinina y las proteínas no tóxicas no hemaglutininas, normálmente asociadas con la forma acomplejada. En el presente documento, el término toxina botulinica "no acomplejada" y el término toxina botulinica "libre" se usan indistintamente. Todos los serotipos de la toxina producidos por las bacterias Clostridium botulinum nativas son sintetizados por las bacterias como proteínas inactivas de cadena simple que luego sen desprendidas o cortadas por las proteasas para convertirse en neuroactivas. La proteína comprende una cadena pesada de aproximadamente 100 kD unida por un enlace disulfuro a una cadena liviana de aproximadamente 50 kD.

Los complejos de toxina botulinica pueden disociarse en proteínas tóxicas y no tóxicas a través de varios medios incluyendo, por ejemplo, subir el pH a aproximadamente 7.0. tratando al complejo con glóbulos rojos a un pH de aproximadamente 7.3, y/o sometiendo el complejo a un proceso de separación, como por ejemplo cromatografía en columna en un tampón adecuado a un pH de aproximadamente 7 a aproximadamente 8.

La presente invención abarca sistemas y métodos que permiten la purificación de una toxina botulinica no acomplejada sin proteínas no tóxicas asociadas que convencionalmente se creían necesarias durante el proceso de purificación para mantener la estabilidad. En modalidades preferidas, los métodos y sistemas descritos en al presente documento facilitan la purificación de la toxina botulinica libre sin pérdida de estabilidad. Por "estabilidad" o "estable" se entiende que la molécula de la proteína de toxina botulinica retiene tanto a la cadena pesada de aproximadamente 100 kD y a la cadena liviana de aproximadamente 50 kD, unidas mutuamente por medio de un enlace disulfuro, y en una conformación que permite la actividad biológica.

En algunas modalidades, se opera un sistema especial dentro del alcance de la presente invención en conjunto con un método especial dentro del alcance de la presente invención. Un sistema dentro del alcance de la presente invención puede comprender una pluralidad (preferentemente una serie consecutiva) de columnas de cromatografías para usar con una pluralidad correspondiente (preferentemente una serie consecutiva) de pasos cromatográficos. Además, un sistema dentro del alcance de la presente invención puede comprender una pluralidad (preferentemente una serie consecutiva) de dispositivos no cromatográficos como por ejemplo aparatos de filtración y/o centrifugación, para usar con una pluralidad correspondiente (preferentemente una serie consecutiva) de pasos cromatográficos, por ejemplo, pasos pre-cromatográficos.

En modalidades preferidas, un proceso dentro del alcance de la presente invención comprende obtener una muestra que comprenda toxina botulínica de un cultivo de fermentación; someterlo a una cantidad de purificaciones pre-cromatográficas; y luego pasarlo a través de una pluralidad de columnas de cromatografía para obtener una toxina botulínica no acomplejada altamente purificada y muy potente. Dicha toxina botulínica libre purificada se usa en la preparación de composiciones farmacéuticas que comprenden la toxina botulínica libre como ingrediente activo.

Los pasos generales tanto para los procesos pre-cromatográficos y cromatográficos para algunas modalidades preferidas de la presente invención están ¡lustrados en la figura 1A. A los fines de poder realizarse una comparación, la figura 1B muestra un método convencional para obtener el complejo de la toxina botulínica purificada. Brevemente, la figura 1B describe un proceso que supone una filtración de profundidad en un cultivo de fermentación, seguido de filtración de flujo tangencial del filtrado obtenido (mediante ultramicrofiltración de 300kD); seguido de un paso de clarificación por centrifugación. El precipitado (fracción insoluble) resultante del paso de centrifugación es luego re-suspendido en cloruro de sodio y cargado en una columna de interacción hidrofóbica o de intercambio de iones. El paso de purificación cromatográfica se repite por lo menos tres veces para dar un eluyente final que contiene el complejo de la toxina botulínica tipo A de 900 kD.

Fermentación y Precipitación acida Como ilustra la figura 1A, la toxina botulínica no acomplejada generalmente es purificada a partir de un cultivo de fermentación. Un "cultivo de fermentación" según se usa aquí se refiere a un cultivo o medio que comprende células, y/o componentes de las mismas, que son sintetizados y/o han sintetizado al menos una toxina botulínica. Por ejemplo, las bacterias Clostridiales, tal como la Clostridium botulinum, puede cultivarse en placas de gelosa en un ambiente que propicie el crecimiento bacterial, como por ejemplo una atmósfera anaeróbica cálida. El paso por el cultivo generalmente permite obtener colonias Clostridiales con la morfología y otras cracterísticas deseables. Las colonias cultivadas seleccionadas pueden luego fermentarse en un medio adecuado para servir como cultivo de fermentación. Las células cultivadas pueden incluir especies no clostridiales como células huésped, como por ejemplo E. coli o células de levadura que pueden biosintetizar una toxina botulínica por medio de tecnología recombinante. Las condiciones adecuadas del cultivo de fermentación pueden depender de las células huésped usadas y son generalmente conocidas en el estado de la técnica.

En modalidades preferidas, puede permitirse que la fermentación progrese hasta el final para que las células estén maduras y hayan sintetizado una toxina botulínica. Él crecimiento de cultivos de Clostridium botulinum se completa luego de aproximadamente 24 a 36 horas. Luego de un cierto período adicional de tiempo, las bacterias generalmente se lisan y liberan al medio el complejo de toxina botulínica sintetizada en una forma compleja. Por ejemplo, durante una fermentación de aproximadamente 60 a 96 horas, la mayoría de las células de la bacteria Clostridium botulinum se someten a lisis y liberan el complejo de toxina botulínica tipo A.

En algunas modalidades, el cultivo de fermentación puede comprender uno o más productos animales como por ejemplo proteínas animales usadas en procedimientos convencionales de cultivos de fermentación. Por ejemplo, la toxina botulínica puede producirse a través de la fermentación anaeróbica de la Clostridium botulinum usando una versión modificada del conocido proceso de Schantz (Ver por ejemplo Schantz E. J., et al., Properties and use of botulinum toxin and other microbial neurotoxins in medicine, Microbiol Rev 1992 March; 56(1 ):80-99; Schantz E. J., et al., Preparation and characterization of botulinum toxin type A for human treatment, chapter 3 in Jankovíc J, ed. Neurological Disease and Therapy. Therapy with botulinum toxin (1994), New York, Marcel Dekker; 1994, pages 41-49, and; Schantz E. J., et al., Use of crystalline type A botulinum toxin ¡n medical research, in: Lewís G E Jr, ed. Biomedical Aspects of Botulism (1981) New York, Academic Press, pages 143-50. ambos incluidos en el presente para referenciar). Tanto el proceso de Schantz como el proceso de Schantz modificado para obtener una toxina botulinica usan productos animales, incluyendo un medio de carne cocida Bacto derivado de animales en el vial de cultivo y caseína en los medios de fermentación. Además, la técnica Schantz de purificación de toxina usa DNasa y RNasa de fuentes bovinas para hidrolizar ácidos nucleicos presentes en el cultivo de fermentación .

Sin embargo, la administración de un producto farmacéutico que contenga un ingrediente activo que fue purificado mediante un proceso que incluya productos derivados de animales puede someter a un paciente a un riesgo potencial de recibir varios agentes patógenos. Por ejemplo, puede haber priones en una composición farmacéutica que comprende productos derivados de animales contaminantes, como por ejemplo el prión responsable de la enfermedad de Creutzfeldt-Jacob. Como ejemplo adicional, existe riesgo de transmisión de una encefalopatía espongiforme (EE), como por ejemplo una encefalopatía espongiforme bovina (EEB) cuando se usan productos animales en el proceso de preparación de una composición farmacéutica. El uso de una toxina botulinica obtenida vía procesos libres de productos animales, sin embargo, reduce tales riesgos. Por lo tanto, en algunas modalidades preferidas, la invención proporciona un proceso que se encuentra libre de productos animales, o esencial o sustancialmente libre de productos animales (LPA). "Libre de producto animal", "esencialmente libre de producto animal", o "sustancia Imente libre de producto animal" abarcan, respectivamente, "libre de proteína animal", "esencialmente libre de proteína animal", o "sustancialmente libre de proteína animal" y ello significa respectivamente ausencia, ausencia esencial o ausencia substancial de productos derivados de animales, cuyos ejemplos sin limitación incluyen productos derivados de la sangre o reserva de sangre. El término "animal" se usa aquí en referencia a un mamífero (por ejemplo, un ser humano), un ave, reptil, anfibio, pez, insecto, araña u otra especie animal, pero excluye a los microorganismos, como bacterias y levaduras.

Un proceso libre de producto animal (o un proceso libre sustancial o esencialmente de producto animal) se refiere a un proceso que está total, substancial o esencialmente libre de productos, re-agentes y proteínas derivados de animales, como por ejemplo las ¡nmunoglobulinas, otros productos, subproductos o dígestas; productos cárnicos, subproductos de la carne, digestas de la carne; y leche o productos lácteos, subproductos o digestas. De acuerdo con ello, un ejemplo de un procedimiento de cultivo de fermentación libre de producto animal es un proceso de fermentación, como por ejemplo un cultivo bacteriano, que excluye sangre, carne y productos lácteos, subproductos y digestiones. Un proceso de fermentación libre de producto animal para obtener una toxina botulínica no acomplejada reduce la posibilidad de contaminación con virus, priones u otros agentes indeseables que pueden luego acompañar a la toxina cuando se administra a seres humanos.

Se describen los procedimientos de fermentación libres de producto animal usando cultivos Clostridium , por ejemplo, en las Patentes norteamericanas Nos. 7.452,697 y 7.354,740. incorporadas por medio del presente como referencia. Por ejemplo, el medio de crecimiento para la producción de la toxina botulinica puede comprender productos vegetales en lugar de productos derivados de animales, como por ejemplo productos de soja y/o la semilla desamargada de Lupinus campestris. Los medios de fermentación con base de soja para uso en un cultivo de fermentación libre de producto animal, por ejemplo, puede comprender un producto de soja, una fuente de carbono como por ejemplo la glucosa, sales como por ejemplo NaCI y KC1 , ingredientes que contengan fosfato como por ejemplo Na2HP04 y KH2P04, cationes divalentes como por ejemplo hierro y magnesio, polvo de hierro, aminoácidos como por ejemplo L-cisteína y L-tirosina y similares. Preferentemente, la soja es soja hidrolizada y la hidrolización ha sido realizada usando enzimas no derivadas de animales. Las fuentes de soja hidrolizada incluyen pero no se limitan a Hy-Soy (Quest International), peptona de soya (Gibco) Bac-soytone (Difco), AMISOY (Quest), NZ soy (Quest), NZ soy BL4, NZ soy BL7. SE50M (DMV International Nutritionals, Fraser, N.Y.), y SE50MK (DMV).

Como ilustra la figura 1A, en ciertas modalidades se obtiene una muestra que comprende la toxina botulinica de un cultivo de fermentación. Por ejemplo, después de un cierto período de fermentación, en cualquier medio libre de producto animal o libre de producto no animal, el complejo de toxina botulínica se libera al medio y puede cosecharse mediante precipitación. Por ejemplo, en algunas modalidades, como en el conocido proceso de Schantz, el medio de fermentación que comprende la toxina botulínica puede ser sometido a un precipitado ácido para alentar a que los complejos de toxina botulínica se asocien con restos celulares y formen un precipitado ácido. En algunas modalidades especialmente preferidas, puede agregarse una solución de ácido sulfúrico de 3 M aproximadamente al cultivo de fermentación para formar el precipitado ácido. Preferentemente, el pH se reduce aproximadamente a 3 - 4, más preferentemente a 3.2 - 3.8 aproximadamente, y aún más preferentemente a aproximadamente 3.5. En algunas modalidades, la temperatura del cultivo también se reduce, por ejemplo, a aproximadamente por debajo de 25°C, 24°C, 23°C, 22°C, 21°C, o 20°C. Estas condiciones mejoran más la relación de los complejos de toxina botulínica con restos celulares. El precipitado ácido formado comprenderá complejos de toxina botulínica ligados y puede usarse como material inicial en otros pasos de purificación, como por ejemplo en pasos de clarificación; donde el filtrado se descarta.

Por el contrario, el proceso convencional que se muestra en la figura 1 B no incluye un paso de precipitación ácida. Es decir, mientras que el proceso de depuración también comienza con un cultivo de fermentación que comprende un complejo de toxina botulínica, el medio de cultivo está sometido a una filtración de profundidad, y es el filtrado en vez de los restos celulares, lo que se usa en los siguientes pasos de purificación. En el proceso de la figura 1 B, se descartan los restos celulares en vez del filtrado, por cuanto, como se muestra en la figura 1A, el filtrado es descartado y los restos celulares (precipitado ácido), se usan para otros pasos de purificación, por ejemplo, en las purificaciones previas a la cromatografía discutidas a continuación.

Purificaciones previas a la Cromatografía En algunas modalidades, la muestra obtenida del medio de fermentación se somete a una o más purificaciones previas a la cromatografía. Estas purificaciones pueden incluir al menos una filtración de flujo tangencial, digestión con nucleasas, y centrifugación y/o filtración por clarificación, la figura 1A proporciona un ejemplo no limitante de un flujo de proceso que contiene una purificación pre-cromatográfica contemplada por la invención. Como se observa, en modalidades preferidas, los procedimientos pre-cromatográficos se realizan en un precipitado (o fracción insoluble) de un cultivo de fermentación que comprende la toxina botulínica, en vez de en el mismo cultivo de fermentación o en un filtrado derivado del mismo, como en el proceso ilustrado en la figura 1 B. Es decir, en modalidades preferidas de la invención, los pasos pre-cromatográficos (clarificación) comienzan con el precipitado de ácido (fracción in sol u ble) .

En algunas modalidades, la muestra (precipitado ácido o fracción insoluble) que comprende una toxina botulínica se somete a una filtración de flujo tangencial. La filtración de flujo tangencial es un proceso generalmente usado para clarificar, concentrar y/o purificar proteínas. A diferencia de la filtración de flujo normal, donde el fluido se mueve directamente hacia una membrana de filtrado bajo presión, en la filtración de flujo tangencial, el fluido se mueve tangencialmente a lo largo de, o en paralelo a la superficie de la membrana. La presión aplicada sirve para forzar una porción del fluido a través de la membrana de filtrado, al costado de filtrado, mientras que las partículas y las macromoléculas demasiado grandes para pasar por los poros de la membrana son retenidas. A diferencia del filtrado de flujo normal, sin embargo, los componentes retenidos no se acumulan en la superficie de la membrana sino que son barridos por el fluido de flujo tangencial. En ciertas modalidades preferidas, la filtración de flujo tangencial se usa para concentrar el material insoluble (restos celulares) con el cual el complejo botulínico está asociado, mientras permite que el filtrado pase por los poros de la membrana. (Ver, por ejemplo, la figura 1A.) Los parámetros de filtración de flujo tangencial, como por ejemplo el tamaño de los poros, el flujo de alimentación, la presión aplicada, etc. pueden ser seleccionados por aquellos capacitados en la técnica para concentrar restos celulares y producir una muestra más concentrada que comprenda el complejo de toxina botulinica. En algunas modalidades especialmente preferidas, por ejemplo, puede usarse una filtración de flujo tangencial con filtros que tengan un tamaño de poros de aproximadamente 0.1 pm.

En algunas modalidades, la muestra que comprende una toxina botulinica está sometida a digestión con nucleasas. La digestión con nucleasas puede facilitar la remoción de los componentes de ácido nucléico con el cual tienden a relacionarse los complejos de toxina botulinica. En ciertas modalidades preferidas, la digestión con nucleasas sigue a la filtración de flujo tangencial y es transportada en los restos celulares concentrados obtenidos a partir de ella. (Ver, por ejemplo, la figura 1A.) Por ejemplo, a la muestra de restos celulares concentrados se le puede ajustar su pH para permitir la actividad de las nucleasas y puede ser incubada con una o más nucleasas adecuadas, como por ejemplo las DNasas y/o RNasas que digieren (hidrolizan) el ADN y/o el ARN, respectivamente. Dependiendo de la enzima nucleasa usada, el pH adecuado puede ser de aproximadamente 5 a aproximadamente 7. preferentemente de aproximadamente 6. En algunas modalidades, la benzamídina es usada como un inhibidor de la proteasa para evitar la proteólisis de la toxina durante el paso de digestión con nucleasas. La nucleasa usada puede derivar de cualquier fuente adecuada, incluyendo fuentes animales y/o fuentes no animales.

En modalidades más preferidas, la nucleasa se obtiene de una fuente no animal, para obtener una nucleasa libre de producto animal y un proceso libre de producto animal. De acuerdo con ello, la presente invención abarca procesos y sistemas libres de producto animal (o sustancial o esencialmente procesos sistemas libres de producto animal) para purificar la toxina botulínica que comprenden el uso de nucleasas. Una nucleasa libre de producto animal puede producirse de manera recombinante, por ejemplo, usando bacterias recombinantes, levaduras u otros microorganismos adecuados, que han sido transformados para expresar una DNasa y/o RNasa para uso en un paso de digestión con nucleasas de acuerdo con los procesos descritos en la presente. La digestión con nucleasas generalmente reduce el contenido de ácido nucléico de la muestra, ya que los ácidos nucléicos de las células huésped se degradan y su remoción se facilita. Por ejemplo, los ácidos nucléicos hidrolizados y otras impurezas de bajo peso molecular pueden quitarse mediante pasos de purificación adicionales.

En ciertas modalidades, la muestra que comprende la toxina botulínica puede estar sometida a clarificación por centrifugación y/o filtración. La clarificación por centrifugación o filtración se refiere a pasos de centrifugación o filtración usados para quitar elementos sucios, como por ejemplo células enteras y Usadas y restos celulares, de la muestra, dando como resultado una muestra más clara desde el punto de vista de su medición. En ciertas modalidades, la centrifugación se realiza aproximadamente de 10.000xg a 30.000xg, con preferencia aproximadamente de 15.000xg a 20.000xg, y con mayor preferencia a aproximadamente 17.700xg. La filtración por clarificación generalmente comprenderá una filtración de flujo normal, también llamada filtración "sin salida", donde el fluido se mueve directamente hacia un medio de filtrado bajo presión, y las partículas demasiado grandes para pasar por los poros del filtro se acumulan en la superficie o dentro del medio mismo, mientras que las moléculas más pequeñas pasan al igual que el filtrado. En algunas modalidades especialmente preferidas, la muestra se mezcla con sulfato de amonio y la filtración de flujo normal se realiza usando un filtro con un tamaño de poro de entre 0.1 y 0.3 µ?? aproximadamente, y con mayor preferencia un tamaño de poro de aproximadamente 0.2 µ??. (Ver, por ejemplo, la figura 1A.) En ciertas modalidades especialmente preferidas, uno o más pasos de clarificación suceden al paso de la digestión con nucleasas. En algunas modalidades aún más preferidas, uno o más pasos de clarificación preceden la purificación por cromatografía.

Particularmente, en modalidades preferidas, el sobrenadante o filtrado clarificado proporciona la muestra que contiene la toxina botulínica para uso en pasos de purificación adicionales, como por ejemplo los pasos de purificación cromatográfica, en vez de la fracción insoluble, que se descarta. Esto se contrapone con el proceso esbozado en la figura 1B, donde el complejo de toxina botulínica está contenido en la fracción insoluble de los pasos pre-cromatográficos que no involucran el precipitado ácido, como por ejemplo, un precipitado de centrifugación, obtenido de la centrifugación pre-cromatográfica, y el sobrenadante se descarta.

Sin embargo, y nuevamente en contraste con el proceso esbozado en la figura 1B, los pasos cromatográficos en algunas modalidades de la invención no requieren un paso de filtración de flujo tangencial de un filtrado obtenido de cultivo de fermentación. Es decir que la muestra usada para la purificación cromatográfica en algunas modalidades de la invención no se obtiene por el sometimiento de una fracción soluble del cultivo de fermentación a la filtración de flujo tangencial. Más bien, en ciertas modalidades, la presente invención usa material insoluble (como por ejemplo un precipitado ácido), eliminando cualquier paso donde un filtrado de cultivo de fermentación es sometido a filtración de flujo tangencial en un intento por concentrar complejos solubles de toxina botulinica. De esta forma, en modalidades preferidas, los pasos pre-cromatográficos de la invención eliminan la necesidad de cualquiera de tales pasos, usando en su lugar ácido para precipitar los complejos de toxina deseados con otro material insoluble (restos celulares).

Pasos de purificación cromatográfica La figura 1A también ilustra los pasos de purificación cromatográfica conforme a ciertas modalidades de la presente invención. De conformidad con una modalidad de la invención, los métodos cromatóg raf icos para purificar una toxina botulínica no acomplejada comprenden el paso de una muestra que comprende toxina botulínica a través de una pluralidad de columnas de cromatografía para obtener una forma no acomplejada altamente purificada y potente de la neurotoxina.

En ciertas modalidades, se separa una toxina botulínica en complejo de otros componentes celulares utilizando una columna de interacción hidrofóbíca (ver, por ejemplo, figura 1A). Esta columna captura la toxina botulínica en forma acomplejada, mientras permite que las impurezas fluyan a través de la columna. La columna utilizada puede ser cualquier columna de interacción hidrofóbíca, conocida en el estado de la técnica, adecuada para tal fin, tal como la columna de Flujo rápido de butil-sefarosa o fenil-sefarosa HP, comercialmente disponible en GE Healthcare Life Sciences. En algunas modalidades, el método también comprende el acondicionamiento de la muestra para la cromatografía de interacción hidrofóbíca antes de cargarla en la columna. Por ejemplo, para el uso en la columna de Fenil-Sefarosa HP, la muestra puede combinarse con una solución de sulfato de amonio 0.5 M a pH 6, y fosfato 50 mM antes de la carga. Otras condiciones de columnas, tampones y pH que pueden utilizarse son las columnas como flujo rápido de butil-sefarosa con sustitución alta, flujo rápido de butil-sefarosa con sustitución baja, butil-sefarosa y octil-sefarosa; los tampones tales como acetato, citrato, ácido metanosulfónico, histidina, piperazina y malonato, cada uno en el rango de pH de aproximadamente 4.0 a aproximadamente 7.0. más preferentemente alrededor de 4.5 a alrededor de 6.5, e incluso más preferentemente alrededor de 5.5. Pueden determinarse otras condiciones de tampón y pH a fin de optimizar el rendimiento de una columna especifica utilizada, como se conoce en el estado de la técnica, sobre la base de la práctica provista en la presente. Sin ánimo de apegarse a la teoría, se cree que la separación implica la unión del complejo de la toxina a la resina a un pH inferior a 7. a fin de evitar la disociación en este paso, mientras permite que fluyan muchas impurezas derivadas de las células, tales como, por ejemplo, proteínas más pequeñas, ácidos nucléicos y demás.

Para eluir la toxina capturada (unida) de la columna de interacción hidrofóbica, puede utilizarse un tampón adecuado, como se conoce en el estado de la técnica. En algunas modalidades especialmente preferidas, se utiliza un gradiente descendente de sulfato de amonio. El rango de concentración del gradiente descendente puede oscilar de aproximadamente 0.6 M a aproximadamente 0.0 M, de aproximadamente 0.5 a aproximadamente 0.0 M, o de aproximadamente 0.4 a aproximadamente 0.0 M. Otros tampones eluyentes que pueden utilizarse incluyen, por ejemplo, gradientes descendentes de sulfato de sodio (Na2S04); cloruro de sodio (NaCI); cloruro de potasio (KCI); acetato de amonio (NH4OAc); y demás. Pueden identificarse las fracciones que contienen un pico de producto, como se conoce en el estado de la técnica. Por lo general, la fracción pico se encuentra, por ejemplo, cuando se utiliza sulfato de amonio, en un rango de concentración de aproximadamente 0.4 M a aproximadamente 0.0 M; más preferentemente de alrededor de 0.3 M a alrededor de 0.0 M; y más preferentemente sulfato de amonio de alrededor de 0.25 M a alrededor de 0.0 M, mientras que el pH se conserva a 6, aproximadamente, a fin de mantener el complejo. Es decir, las fracciones que contienen el complejo de toxina botulínica eluido pueden identificarse y utilizarse en los pasos de purificación subsiguientes.

En las modalidades preferidas, el complejo de toxina botulínica obtenido es disociado para dar una forma no acomplejada. En ciertas modalidades preferidas, el paso de disociación se lleva a cabo luego del paso de cromatografía de interacción hidrofóbica y/o antes de los pasos de cromatografía subsiguientes (Ver, por ejemplo, la Figura 1A) De la misma forma, en algunas modalidades preferidas, la presente invención abarca métodos y sistemas en los que la molécula objetivo de cromatografía difiere de un paso cromatográfico a otro. Es decir, en un paso cromatográfico inicial, el objetivo comprende un complejo de toxina botulínica, mientras que en los pasos cromatográficos subsiguientes, el objetivo comprende la toxina botulínica libre, disociada de proteínas no tóxicas como proteínas hemaglutinína y no hemaglutinina. En comparación, el proceso descrito en la figura 1B implica los pasos de cromatografía que están diseñados para purificar los complejos de toxina botulinica.

La disociación del complejo de toxina botulinica para producir la proteína de toxina botulinica no acomplejada puede lograrse de varias formas, por ejemplo, como se conoce en el estado de la técnica y/o como se describe en la presente. Por ejemplo, la disociación puede lograrse elevando el pH a aproximadamente 7.0; o, en modalidades en las que la purificación libre de proteína animal no sea necesaria, tratando el complejo con glóbulos rojos a un pH de aproximadamente 7.3.

En una modalidad preferida y para proporcionar toxina libre de producto animal, el complejo se somete a un proceso de separación basado en el ajuste del pH del complejo en un tampón adecuado. Los tampones adecuados incluyen, a titulo enunciativo, los tampones catiónicos, preferentemente aquellos que no interactuarán, o no interactuarán de forma considerable, con la columna de intercambio aniónico. Los tampones catiónicos adecuados incluyen, por ejemplo, Tris, bis-Tris, trietanolamina, N-metil d i et a no I a m i na . Un pH de entre 7 y 8,4 aproximadamente; más preferentemente de entre 7.4 y 8,2 aproximadamente; y más preferentemente un pH de aproximadamente 7.8 es, por lo general, adecuado para disociar el complejo a fin de liberar la toxina botulinica no acomplejada. En algunas modalidades especialmente preferidas, por ejemplo, el pH del eluyente de la columna de interacción hidrofóbica se eleva a aproximadamente 7.5, a 7.8 o preferentemente a aproximadamente 8,0. Por ejemplo, en algunas modalidades, el eluyente puede diluirse en un tampón Tris que tiene un pH de aproximadamente 7.8 para que el complejo se disocie en componentes indi iduales, incluida la proteína de toxina botulínica no acomplejada de 150 kD aproximadamente. La mezcla resultante que comprende los componentes disociados luego puede someterse a uño o más pasos de purificación cromatográfica adicionales, tales como los pasos cromatográficos de intercambio iónico, diseñados para capturar y, luego, purificar la toxina no acomplejada.

En ciertas modalidades, de acuerdo con la invención, la toxina botulínica no acomplejada puede purificarse utilizando uno o más pasos cromatográficos de intercambio iónico (Ver, por ejemplo, figura 1A). La cromatografía de intercambio iónico logra el fraccionamiento basado en la carga electrostática. La medida en la que una proteína determinada se une a la matriz de la columna es en función de la carga neta de la proteína, basada en su composición aminoácida individual y la carga de la matriz de la columna. Las columnas de intercambio de iones catiónicos tienen una matriz con carga positiva neta, mientras que las columnas de intercambio de iones aniónicos tienen una matriz con carga negativa neta. Las proteínas unidas pueden eluirse de forma selectiva de la columna utilizando un solvente (el eluyente) que contenga una sustancia cargada, tales como iones de sal, que compite con el soporte de la matriz cargada para unirse a las proteínas cargadas. De ese modo, las proteínas unidas pueden fraccionarse sobre la base de la fuerza de su carga. Como alternativa, las proteínas pueden eluirse mediante el ajuste del pH, que puede alterar la carga neta de la proteína, y así alterar su afinidad con la matriz cargada.

De conformidad con algunas modalidades preferidas de la invención, la mezcla que comprende la toxina botulíníca no acomplejada se carga en una columna de intercambio aniónico (Ver, por ejemplo, figura 1A). En particular, esta columna captura la toxina botulíníca en forma no acomplejada, de manera que la proteína tóxica y las proteínas no tóxicas disociadas pueden eluirse en fracciones separadas. La columna utilizada puede ser cualquier columna amónica conocida en el estado de la técnica como adecuada para separar proteínas cargadas; ejemplos de las cuales son, a título enunciativo, Q-Sefarosa HP, flujo rápido de Q-Sefarosa o Q-Sefarosa XL, comercialmente disponibles en GE Healthcare Life Sciences. En algunas modalidades especialmente preferidas, se utiliza una columna de Q-Sefarosa XL. En algunas modalidades, el método también comprende el acondicionamiento de la mezcla que comprende la toxina botulíníca no acomplejada para cromatografía de intercambio aniónica antes de cargarla en la columna. Por ejemplo, pueden determinarse condiciones de tampón y pH a fin de optimizar el rendimiento de la columna específica utilizada, como se conoce en el estado de la técnica, sobre la base de la práctica provista en la presente. Para carga y uso en la columna, por ejemplo, los tampones adecuados incluyen, a título enunciativo, los tampones catiónicos, los tampones preferentemente catiónicos que no interactuarán, o no interactuarán de forma considerable, con la columna de intercambio amónico. Los tampones catiónicos adecuados incluyen, por ejemplo, Tris, bis-Tris, trietanolamina, N-metil dietanolamina. Para cargar y equilibrar la columna, puede usarse un pH de entre 7.2 y 8.6 aproximadamente; más preferentemente de entre 7.4 y 8.2 aproximadamente; y más preferentemente un pH de alrededor de 7.8.

Para eluir la toxina capturada (ligada) y otros componentes disociados de la columna de intercambio aniónico, puede utilizarse un tampón adecuado, como se conoce en el estado de la técnica. Los ejemplos de tampones adecuados incluyen, entre otros, cloruro de sodio (NaCI) y cloruro de potasio (KCI). En algunas modalidades especialmente preferidas, se utiliza un gradiente ascendente de cloruro de sodio. Por ejemplo, puede utilizarse un tampón de cloruro de sodio que tiene un rango de concentración de aproximadamente 0.0 M a aproximadamente 0.4 M NaCI, más preferentemente de alrededor de 0.0 M a alrededor de 0.5 M NaCI, e incluso más preferentemente de alrededor de 0.0 M a alrededor de 0.6 M NaCI. Las impurezas separadas en distintas fracciones pueden incluir, por ejemplo, una o más proteínas no tóxicas del complejo disociado, tales como las proteínas hemaglutínina y/o no hemaglutinina no tóxicas. Pueden identificarse las fracciones que contienen una cresta de producto, como se conoce en el estado de la técnica. La cresta puede tener lugar, por ejemplo, a aproximadamente 8 mSem hasta aproximadamente 22 mSem, a un pH de entre aproximadamente 7.4 a aproximadamente 8.4, y preferentemente a aproximadamente 7.8, que corresponde a aproximadamente N a C 10.08 M a aproximadamente 0.18 M. A la inversa, pueden eluirse otras impurezas a aproximadamente 30 hasta aproximadamente 45 mSem, lo que corresponde a NaCI aproximadamente 0.25 M hasta aproximadamente 0.35 M.

Las fracciones que contienen la toxina botulínica no acomplejada eluida pueden identificarse para brindar un eluyente que comprende una toxina botulínica no acomplejada. La cresta puede identificarse por métodos, como se conoce en el estado de la técnica, por ejemplo, utilizando la cromatografía liquida de alta resolución (HPLC), análisis por Western Blot, ensayo de inmunoabsorción enzimática (ELISA), electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecil sulfato sódico (SDS-PAGE) no reducida, y demás. El SDS-PAGE bajo condiciones no reductoras, por ejemplo, puede identificar la banda de la toxina de aproximadamente 150 kDa, mientras que otras impurezas aparecerán en bandas correspondientes a moléculas más pequeñas. Este eluyente que comprende una forma no acomplejada puede luego someterse a otros pasos de purificación cromatográfica.

En una modalidad especialmente preferida, la pureza de la toxina es evaluada mediante SDS-PAGE. Como el especialista calificado apreciará, el análisis de SDS-PAGE puede realizarse en ausencia o presencia de agentes que dividen enlaces disulfuros presentes en la proteina (es decir, condiciones no reductoras o reductoras, respectivamente). Por ejemplo, con respecto a la toxina botulínica tipo A, la forma madura y activa de la molécula de la proteína de la toxina botulínica tipo A está comprendida por dos cadenas de polipéptidos de 100 kD y 50 kD, respectivamente, que se unen por medio de interacciones no covalentes, así como de un enlace disulfuro. Cuando la toxina botulínica tipo A producida por el proceso de invención se valora utilizando condiciones no reductoras, las moléculas de la proteína de la toxina botulínica tipo A migran como una banda de proteína individual de aproximadamente 150 kD, y la pureza medida, por lo general, es mayor al 98%. Cuando la cantidad de proteina de toxina botulínica tipo A cargada por canal de gel se mantiene dentro del rango dinámico del densitómetro , luego habrá algunas pocas bandas de impureza detectables que resulten en una pureza medida del 100%. Cuando la toxina botulínica tipo A se sobrecarga de manera que la banda de toxina principal se encuentra por encima del rango dinámico del densitómetro, entonces algunas bandas de impurezas menores pueden detectarse (tanto como el 1-2%).

Sin embargo, cuando el análisis de SDS-PAGE de la toxina botulínica tipo A se lleva a cabo bajo condiciones reductoras, entonces el enlace disulfuro de la toxina botulínica se rompe, y la proteína de la toxina botulínica tipo A mígra como dos componentes que tienen pesos moleculares de 100 kD y 50 kD, respectivamente. Cuando la proteína de la toxina botulínica tipo A se carga de manera tal que las especies principales se encuentran por encima del rango dinámico del densitómetro, y el SDS-page se ejecuta bajo condiciones de reducción, entonces las especies de impureza menores pueden detectarse con mayor facilidad. Por ejemplo, bajo estas condiciones, puede haber tanto como el 5% de las especies de 150 kD presentes, debido al procesamiento proteolitico incompleto durante el proceso de fermentación y recuperación. Bajo estas condiciones, el proceso de invención origina un producto de toxina (compuesto por las cadenas de polipéptidos activas y divididas de 100 kD y 50 kD) que, por lo general, es mayor al 90% del total de proteínas, y más probablemente, mayor al 95% del total de proteínas. Por lo cual, la pureza medida informada de la toxina depende de los detalles del método de SDS-PAGE empleado, como se describe en la presente. Asimismo, mientras que el ejemplo anterior concierne a la toxina botulínica tipo A, el especialista calificado apreciará que el análisis de SDS-PAGE descrito en la presente puede adaptarse fácilmente para evaluar la pureza de otros serotipos de toxina botulínica.

En ciertas modalidades, el eluyente de la columna amónica que comprende la toxina botulínica no acomplejada se carga en una columna de intercambio catiónico (Ver, por ejemplo, figura 1 A). En particular, esta columna también captura la toxina botulínica en forma no acomplejada, de manera que la proteína tóxica y las proteínas no tóxicas disociadas pueden eluirse en fracciones separadas. La columna utilizada puede ser cualquier columna catiónica, conocida en el estado de la técnica, adecuada para separar proteínas, ejemplos de las cuales incluyen, a título enunciativo, columna de sefarosa SP, incluido el flujo rápido de sefarosa SP HP o sefarosa SP, una columna mono S o una columna Source-S, tal como una columna Source-30S, o preferentemente, una columna Source-15S, ambas comercialmente disponibles en GE Healthcare Life Sciences. En algunas modalidades, el método también comprende el acondicionamiento del eluyente de las columnas de intercambio aniónico que comprenden la toxina botulínica no acomplejada para cromatografía de intercambio catiónica antes de cargarla en la columna. En algunas modalidades preferidas, el pH se ajusta para que el pH del eluyente que se carga en la columna permita una unión eficiente de la toxina libre en la columna. Por ejemplo, el pH puede mantenerse dentro de un rango de aproximadamente 4 a aproximadamente 8, preferentemente de aproximadamente 5 a aproximadamente 7.5, más preferentemente de alrededor de 6 a alrededor de 7. y más preferentemente de alrededor de 7. Además, en algunas modalidades, el eluyente de la columna aniónica puede tratarse para reducir la conducti idad antes de cargar a la columna de intercambio catiónico, por ejemplo, utilizando un tampón de fosfato de sodio, un ejemplo del cual es, a título enunciativo, un tampón de fosfato de sodio de aproximadamente NaH2P04 20 mM. Por ejemplo, el eluyente de la columna aniónica puede contener tanto como NaCI0.15 M, aproximadamente, para que la disolución en un tampón de alrededor de NaH2PC4 20 mM reduzca la conductividad. En algunas modalidades especificas, las conducti idad se reduce de aproximadamentel 2 mSem a 3.3 mSem aproximadamente. La dilución en tampón, diálisis u otros métodos conocidos en el estado de la técnica también pueden utilizarse para reducir la conductividad.

Para la carga y el uso en la columna, por ejemplo, los tampones adecuados incluyen, a titulo enunciativo, los tampones amónicos, los tampones preferentemente amónicos que no interactuarán, o no interactuarán de forma considerable, con la columna de intercambio catiónico. Los tampones aniónicos adecuados incluyen, por ejemplo, el ácido metanosulfónico, HEPES, y demás, y preferentemente, el tampón de fosfato de sodio. Para cargar y equilibrar la columna, puede usarse un pH de entre 4 y 8 aproximadamente; preferentemente de entre 5 y 7.5 aproximadamente; más preferentemente de 6 a 7 aproximadamente; y más preferentemente, un pH de alrededor de 6,8 a alrededor de 7.

Para eluir la toxina capturada (ligada) de la columna de intercambio catiónico de forma separada de otras proteínas no tóxicas disociadas y otras impurezas, puede utilizarse un tampón adecuado, como se conoce en el estado de la técnica. En algunas modalidades especialmente preferidas, se utiliza un gradiente ascendente de cloruro de sodio. Un rango de concentración adecuado para el gradiente del cloruro de sodio puede ser NaCI de aproximadamente 0.0 M a aproximadamente 1 M. Otras sales que pueden utilizarse incluyen, por ejemplo, cloruro de potasio, que puede utilizarse a un gradiente de concentración de KC1 de aproximadamente 0.0 M a aproximadamente 0.5 M. Pueden identificarse las fracciones que contienen un pico de producto, como se conoce en el estado de la técnica. La cresta puede tener lugar, por ejemplo de aproximadamente 18 a aproximadamente 25 mSem, lo que corresponde a NaCI aproximadamente 0.3 M a aproximadamente 0.4 M, a un pH de aproximadamente 6.7. Es decir, las fracciones que contienen la toxina botulinica no acomplejada eluida pueden identificarse para brindar un eluyente de la columna catiónica que comprende una toxina botulinica no acomplejada. En modalidades especialmente preferidas, el eluyente de la columna catiónica representa una toxina botulinica no acomplejada de alta pureza, en alto rendimiento y con alta actividad. Por el contrario, el proceso descrito en la figura 1B proporciona un complejo de toxina botulinica tipo A de 900 kD en el eluyente final.

Producto de toxina botulinica no acomplejada purificada Los métodos y sistemas descritos en la presente son útiles para brindar una toxina botulinica no acomplejada de alta pureza, en alto rendimiento y con alta actividad. Ver el Ejemplo 1 a continuación. El producto también se estabiliza fácilmente y se utiliza de forma conveniente para la preparación de composiciones farmacéuticas seguras.

En algunas modalidades preferidas, la toxina botulinica no acomplejada purificada es al menos pura en un 80%, aproximadamente, de manera preferida, al menos alrededor del 90% pura, más preferentemente al menos alrededor del 95% pura, incluso más preferentemente al menos alrededor del 98% pura, y más preferentemente, al menos alrededor del 99% pura, o hasta aproximadamente el 100% pura. "Toxina botulinica no acomplejada purificada" hace referencia a una molécula de proteína de toxina botulinica libre que se aisla, o se aisla de forma considerable, de otras proteínas e impurezas, que pueden de otra forma acompañar a la toxina botulinica no acomplejada, obtenida de un proceso de cultivo o fermentación. Una toxina botulinica no acomplejada purificada que, por ejemplo, es "80% pura" hace referencia a una proteína de toxina botulinica no acomplejada aislada, o aislada de forma considerable, donde la proteína tóxica comprende el 80% del total de proteínas presentes, según se determine por una metodología analítica adecuada o de otro tipo, ejemplos de las cuales se incluyen, a título enunciativo, SDS-PAGE, electroforesis capilar (CE) y HPLC. Por ejemplo, en algunas modalidades preferidas, el eluyente de la columna catiónica que comprende la toxina botulinica no acomplejada es al menos aproximadamente 99% puro y contiene menos de aproximadamente el 1% de proteínas de células huésped, que no son las toxinas botulínícas de aproximadamente 150 kD originalmente presentes.

En algunas modalidades preferidas, la toxina botulinica no acomplejada purificada tiene una actividad de al menos aproximadamente 150 LD5D unidades/ng, preferentemente al menos alrededor de 180 LD50 unidades/ng, más preferentemente al menos alrededor de 200 LD50 unidades/ng, incluso más preferentemente al menos alrededor de 210 LD50 unidades/ng, y más preferentemente aún de al menos alrededor de 220 LD50 unidades/ng. Una unidad de toxina botulinica se define como la dosis letal media (l_D50) al momento de la inyección intraperitoneal en ratones hembra Swiss Webster que pesan aproximadamente 18-20 gramos cada uno. En otras palabras, una unidad de toxina botulinica es la cantidad de toxina botulinica que mata el 50% de un grupo de ratones hembra Swiss Webster. "Actividad" se utiliza de forma indistinta en la presente, con expresiones relacionadas "actividad biológica", "potencia" y "toxicidad" para describir la acción de una toxina botulinica.

En modalidades preferidas, las toxinas botulínícas no acomplejadas obtenibles mediante procesos y sistemas descritos en la presente demuestran actividad biológica. Es decir, en modalidades preferidas, la actividad biológica o toxicidad del producto no se pierde mediante la purificación de acuerdo con las modalidades preferidas de la presente invención, a pesar de que las proteínas no tóxicas asociadas de forma nativa con la proteína tóxica se eliminan durante la purificación. En modalidades aún más preferidas, la potencia obtenida mediante el uso de un conjunto determinado de procesos y parámetros dentro del alcance de la invención es constante y/o reproducible. Por ejemplo, la medición de la potencia puede realizarse con menos de aproximadamente el 40% de variabilidad, preferentemente menos del 35% de variabilidad, aproximadamente, más preferentemente menos de aproximadamente el 30% de variabilidad, aún más preferentemente menos de aproximadamente el 25% de variabilidad, y lo más preferentemente, menos de aproximadamente el 20% de variabilidad.

En algunas modalidades preferidas, el proceso de purificación produce la toxina botulínica no acomplejada en alto rendimiento. Por ejemplo, el rendimiento obtenido de 30 L de un cultivo de fermentación puede ser al menos de alrededor de 30 mg, preferentemente al menos de alrededor de 40 mg, más preferentemente al menos de alrededor de 70 mg, aún más preferentemente al menos de alrededor de 80 mg, y más preferentemente al menos alrededor de 90 mg, lo que corresponde a un rendimiento de al menos aproximadamente 1 mg/L, preferentemente al menos alrededor de 1,3 mg/L, más preferentemente al menos de alrededor de 2,3 mg/L, aún más preferentemente al menos de alrededor de 2,7 mg/L, y más preferentemente al menos de alrededor de 3 mg/L, respectivamente. En modalidades aún más preferidas, el rendimiento obtenido mediante el uso de un conjunto determinado de procesos y parámetros dentro del alcance de la invención es reproducible. Por ejemplo, el rendimiento puede medirse con menos de aproximadamente el 40% de variabilidad, preferentemente menos del 35% de variabilidad, aproximadamente, más preferentemente menos de aproximadamente el 30% de variabilidad, aún más preferentemente menos de aproximadamente el 25% de variabilidad, y más preferentemente, menos de aproximadamente el 20% de variabilidad.

En algunas modalidades especialmente preferidas, la toxina botulínica no acomplejada purificada es estable durante la purificación con los procesos y sistemas descritos en la presente. Se creía que la eliminación de proteínas no tóxicas asociadas de un complejo de toxina botulínica, como el complejo de toxina botulínica tipo A, resulta en un producto de toxina botulínica notablemente inestable. No obstante, la presente invención brinda métodos y sistemas que pueden aislar de forma estable la toxina botulínica libre, sin proteínas no tóxicas asociadas que, de manera convencional, se creyeron necesarias durante el proceso de purificación para mantener la estabilidad, como se indicó con anterioridad.

En algunas modalidades preferidas, los métodos y sistemas descritos en la presente producen una toxina botulínica no acomplejada que requiere muy pocos pasos posteriores a la cromatografía, por ejemplo, en términos de mantenimiento de la estabilidad durante el almacenamiento, y en términos de aplicabilidad a usos farmacéuticos. Por ejemplo, como se conoce en el estado de la técnica, el sulfato de amonio puede agregarse a la toxina botulínica libre para preparar una suspensión de sulfato de amonio para almacenamiento. La composición que comprende la toxina botulínica libre y el sulfato de amonio puede almacenarse fácilmente en un refrigerador y, luego, recuperarse de manera simple para su uso en aplicaciones farmacéuticas. Efectivamente, la estabilidad, el alto rendimiento y la pureza, así como la potencia alta y consistente de la toxina obtenible mediante métodos descritos en la presente facilitan el uso farmacéutico del producto purificado, como se describe en mayor detalle a continuación.

Usos de la toxina botulínica no acomplejada purificada La toxina botulínica no acomplejada purificada, de conformidad con esta invención, puede utilizarse en la preparación de composiciones farmacéuticas que comprenden la toxina como un ingrediente activo para la administración a cualquier sujeto que reciba el beneficio de dichas composiciones farmacéuticas. En modalidades preferidas, los sujetos que recibirán tratamiento son mamíferos, preferentemente seres humanos. "Composición farmacéutica", como se utiliza en la presente, hace referencia a una fórmula en la que un ingrediente activo puede ser una toxina botulínica. La fórmula contendrá al menos un ingrediente adicional y será adecuada para la administración diagnóstica, terapéutica y/o cosmética para un sujeto, como un paciente humano. La composición farmacéutica puede ser liquida o sólida; y puede ser un sistema de componentes individuales o múltiples, por ejemplo, una composición liofilizada reconstituida con un diluyente, como la solución salina.

Otro aspecto de la invención estipula la administración de una molécula de toxina botulínica purificada a un paciente. "Administración" hace referencia en la presente al suministro de una composición farmacéutica a un sujeto o paciente. La composición farmacéutica puede administrarse mediante cualquier método conocido en el estado de la técnica, que incluye, por ejemplo, administración intramuscular (¡ m.), intradérmica, ¡ntranasal o subcutánea, administración intratecal, intracraneal, intraperitoneal (i.p.) o vías de administración tópica (transdérmíca) e implante (por ejemplo, de un dispositivo de liberación lenta). En ciertas modalidades preferidas, la toxina botulínica no acomplejada purificada se administra de manera tópica o mediante inyección en composiciones, según se describe en las Solicitudes de patente de los Estados Unidos No. 09/910.432; 10/793,138; 11/072,026; 11/073,307. 11/824,393, y 12/154,982, que se incorporan en la presente a modo de referencia en su totalidad En ciertas modalidades, las composiciones que comprenden la toxina botulínica no acomplejada en una suspensión de sulfato de amonio pueden integrarse fácilmente a una composición farmacéutica. Por ejemplo, una suspensión de sulfato de amonio que comprende una proteína de toxina botulínica no acomplejada puede centrifugarse para recuperar la proteína, y esta puede disolverse de nuevo, diluirse e integrarse con uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables. En ciertas modalidades, la composición farmacéutica puede comprender una toxina botulínica no acomplejada como un ingrediente farmacéutico activo, y además, puede comprender uno o más tampones, transportadores, estabilizadores, conservantes y/o agentes volumétricos. Las composiciones farmacéuticas pueden liofilizarse para convertirlas en polvo para su almacenamiento y reconstituirse para uso futuro. De la misma forma, los procesos y sistemas descritos en la presente pueden suministrar una toxina botulínica en una forma particularmente adecuada para aplicaciones farmacéuticas en términos de facilidad de preparación.

La composición farmacéutica puede utilizarse en aplicaciones terapéuticas, diagnósticas, de investigación y/o cosméticas. Por ejemplo, como se indicó con anterioridad, la toxina botulínica tipo A se utiliza clínicamente para tratar afecciones neuromusculares caracterizadas por hiperactividad músculo-esquelética, tales como el blefaroespasmo, el estrabismo, la distonía cervical y las arrugas de la zona glabelar (faciales). Asimismo, en ciertas aplicaciones, la toxina botulínica no acomplejada (de aproximadamente 150 kD) es la forma preferida para el tratamiento en seres humanos. Ver, por ejemplo, Kohl A., et al., Comparison of the effect of botulinum toxin A (Botox®) with the highly-purified neurotoxin (NT 201) in the extensor digitorum brevis muscle test, Mov Disord 2000; 15(Supl. 3): 165. De la misma forma, ciertas composiciones farmacéuticas de toxina botulínica se preparan preferentemente utilizando toxina botulínica no acomplejada, en oposición a un complejo de toxina botulínica.

EJEMPLOS Ejemplo 1: Comparación del Proceso Inventivo con el Proceso de Schantz Modificado Se compararon directamente purificaciones de una toxina botulínica no acomplejada tipo A usando procesos dentro del alcance de la presente invención ('proceso inventivo") con purificaciones basadas en el enfoque tradicional de Schantz y se modificaron posteriormente mediante la incorporación de pasos cromatográficos para proporcionar la forma no acomplejada (Proceso modificado de Schanlz "). Brevemente, se cultivaron y dejaron crecer bacterias Clostridium botulinum hasta que se completó la fermentación (generalmente entre aproximadamente 72 y 120 horas desde la inoculación al cultivo). Se usó luego un volumen de 30 L de cultivo de fermentación en cada uno de los siguientes procedimientos de purificación.

El proceso modificado de Schantz incluía la acidificación típica del cultivo de fermentación para precipitar la toxina, seguido por ultramicrofiltración (UF) y diafiltración (DF) para concentrar la toxina en bruto. Se agregaron DNasa y RNása a la toxina cosechada para digerir (hídrolízar) ácidos nucléícos, los que fueron luego quitados por un por un paso de UF adicional usando filtración de flujo tangencial (300kD UF). La toxina fue luego extraída con tampón de fosfato, seguido por tres pasos de precipitado secuencial. precipitado con etanol frío; precipitado con ácido hidroclorídrico y precipitado con sulfato de amonio donde los sobrenadantes en cada momento fueron normalmente descartados. Este procedimiento proporcionó un complejo de toxina botulínica tipo A de 900 kD, que luego fue sometido a pasos adicionales de cromatografía para obtener la toxina libre. Específicamente, el complejo de la toxina fue resolubilizado y sometido a absorción negativa en lotes en la resina DEAE. El eluyente fue luego tratado en una columna de intercambio aniónico de flujo por gravedad (DEAE-Sefarosa), seguido de una columna de intercambio catiónico de flujo por gravedad (CM-Sefarosa). Se determinó el rendimiento, se registró el lapso de tiempo que llevaba el proceso (sin contar el periodo de fermentación) y se midió la pureza de la toxina botulinica no acomplejada tipo A purificada mediante un análisis SDS-PAGE y se realizó un ensayo de potencia, por ejemplo, mediante las técnicas conocidas por las personas capacitadas en la técnica. Se repitió todo el proceso de Schantz modificado para tres lotes distintos, los lotes números 1, 2 y 3, y los resultados se registraron en la tabla 1 siguiente.

El proceso inventivo se usó con tres lotes diferentes, los lotes número 4, 5 y 6 de acuerdo con los sistemas y métodos descritos en la presente. Por corto tiempo, el cultivo de fermentación se sometió a la precipitación acida usando ácido sulfúrico 3M para reducir el pH a 3.5, a una temperatura por debajo de los 25°C. El precipitado ácido fue luego sometido a una filtración de flujo tangencial de 0.1 pm para concentrar la masa celular. El pH fue luego ajustado a 6 y se agregaron nucleasas para reducir el contenido de ácido nucléico de las células huésped, luego se realizó la clarificación y centrifugación para quitar restos celulares y una filtración sin salida a 0.2 pm con agregado de sulfato de amonio. El filtrado fue luego cargado directamente en la columna de interacción hidrofóbica, Fenil-Sefarosa HP (GE Life Sciences), eluído con un gradiente descendiente de sulfato de amonio y la cresta del producto se aisló. El eluyente fue luego diluido con tampón Tris a pH 7.8 para disociar el complejo de la toxina, el que luego se cargó en la columna de intercambio aniónico Q XL (GE Lifesciences) , se eludió con un gradiente ascendente de cloruro de sodio, y nuevamente se juntó la cresta del producto. Este eluyente fue luego diluido en un tampón con fosfato de sodio (para reducir la conductividad) y cargado en la columna de intercambio aniónico, Sefarosa Q XL (para los lotes No. 4 y No. 5), o en la columna de intercambio catiónico, Fuente-S (GE Life Sciences) (para el lote No. 6), nuevamente eluído con un gradiente ascendente de cloruro de sodio, y se juntó y almacenó la cresta del producto final. Este proceso produjo la toxina botulínica no acomplejada tipo A. Se determinó el rendimiento, se registró la extensión del tiempo del proceso (sin contar el período de fermentación), y se midió la pureza de la toxina mediante el análisis SDS-PAGE y se realizó un ensayo de su potencia, por ejemplo, mediante técnicas conocidas por personas capacitadas en la técnica. Los resultados también se registraron en la tabla 1 siguiente.

Tabla 1 Tal como indica la tabla 1, hubo una falla de lote con respecto al lote no. 2 en el proceso modificado de Schantz. El lote total falló dando un rendimiento cero. Hubo también una falla parcial de lote con respecto al loteno. 3. Allí la falla ocurrió en el paso del precipitado ácido hidroclórico, pero algún producto fue rescatado del sobrenadante normalmente descartado. El producto rescatado fue reprocesado con un paso de desviación, responsable del rendimiento reducido observado en comparación con el lote No.1 (4 mg en comparación con 11 mg) y la potencia reducida observada se comparó con el lote No.1 (173 LD50 unidades/ng en comparación con 255 LD50 unidades/ng).

Con respecto a los lotes usados con el proceso de la invención, el lote No. 4 mostró un rendimiento reducido, en comparación con el lote No.5 por ejemplo (43 mg en comparación con 99 mg) debido a una falla del sistema cromatográfico, constituida por un alto lavado con sal de una columna. Con la falla, hubo una elusión prematura de una porción de la toxina, dando como resultado el rendimiento reducido observado, pero también una mayor pureza (98.6 % de pureza en comparación con 95.3% de pureza).

El lote no. 6 representa los resultados de una modalidad altamente preferida de los procesos y sistemas de la presente invención, donde una columna de intercambio catiónico se usó en el tercer paso cromatográfico. Como indica la tabla 1, esta modalidad dio como resultado una mejor pureza en comparación con el lote no.5 por ejemplo (100% de pureza en comparación con 95.3% de pureza), mientras que el alto rendimiento (89 mg en comparación con 99 mg) y la alta potencia (250 LD50 unidades/ng en comparación con 252 LD50 unidades/ng) se mantuvieron.

Como también indica la tabla 1, la longitud total de la parificación puede reducirse en modalidades preferidas de la presente invención. Por ejemplo, el lote no.6 se purificó solamente en 4 días, en comparación con los 10 días que llevó purificar la toxina botulínica no acomplejada usando el método modificado de Schantz que incluía tres pasos cromatográficos adicionales luego del método convencional de Schantz.

Los resultados indican que los procesos y sistemas enseñados aquí pueden usarse para preparar altos rendimientos de una toxina botulínica no acomplejada, a una alta potencia y pureza, y sugieren que los métodos y sistemas descritos en el presente pueden encontrar uso en una purificación eficaz a gran escala e una toxina botulínica no acomplejada adecuada para ser usada, por ejemplo, como ingrediente activo en composiciones farmacéuticas.

Todas las referencias que incluyan solicitudes y publicaciones de patentes en el presente documento se incorporan como referencias en su totalidad y para todos los propósitos con el mismo alcance como si se indicara que cada publicación individual o patente o solicitud de patente fuera específica e individualmente incorporada por referencia en su totalidad para todos los fines. Pueden hacerse muchas modificaciones y variaciones a esta invención sin apartarse de su espíritu y alcance, como será evidente para todas aquellas personas capacitadas en la técnica. Las modalidades específicas descritas en la presente se ofrecen a modo de ejemplo solamente, y la invención estará limitada solamente por los términos de las reivindicaciones que se acompañan, conjuntamente con el alcance pleno de los equivalentes a los cuales dichas reivindicaciones otorgan derecho.

Claims

REIVINDICACIONES:

1. Un método para purificar una toxina botulinica no acomplejada, dicho método que comprende: (i) proporcionar una toxina botulinica no acomplejada en bruto; (ii) cargar la toxina botulinica no acomplejada en bruto en una columna de intercambio amónico de manera que permita la captura de dicha toxina por parte de la columna de intercambio a n i ó n i co ; (iii) eluir la toxina botulinica no acomplejada de la columna de intercambio amónico para producir un eluyente que incluya la toxina botulinica no acomplejada; (iv) cargar una columna de intercambio catiónico con el eluyente de la columna de intercambio aniónico como para permitir la captura de la toxina botulinica no acomplejada por parte de la columna de intercambio catiónico; y (v) eluir la toxina botulinica no acomplejada purificada de la columna de intercambio catiónico.

2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque se obtiene la toxina botulinica no acomplejada en bruto al obtener una muestra que contiene el complejo de la toxina botulinica; cargar una columna de interacción hidrofóbica con la muestra como para permitir la captura del complejo de la toxina botulínica por parte de la columna de interacción hidrofobica; eluir el complejo de la toxina botulínica de la columna cromatográfica de interacción hidrofobica; y disociar el complejo de la toxina botulínica para obtener una mezcla que comprenda la toxina botulínica no acomplejada en bruto.

3. El método de acuerdo con la reivindicación 2, caracterizado porque la muestra es un sobrenadante o un filtrado que contiene el complejo de la toxina botulínica.

4. El método de acuerdo con la rei indicación 2, en que la muestra se obtiene al: someter el cultivo de fermentación que contiene la toxina botulínica a una precipitación ácida para obtener un precipitado ácido; y realizar una filtración de flujo tangencial sobre el precipitado para concentrar el precipitado.

5. El método de acuerdo con la reivindicación 2, en que la muestra se obtiene sometiendo una fracción insoluble de un cultivo de fermentación a una filtración de flujo tangencial.

6. El método de acuerdo con la reivindicación 2, en que la muestra es sometida a digestión con nucleasas antes de cargarla en la columna de interacción hidrofobica.

7. El método de acuerdo con la reivindicación 6, en que la nucleasa deriva de un proceso libre de producto animal.

8. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en que el método es sustancialmente libre de producto animal.

9. El método de acuerdo con la reivindicación 1 , en que la toxina botulínica no acomplejada purificada comprende al menos uno de los tipos de toxina botulínica tipo A, B, Ci, D, F, F y G.

10. El método de acuerdo con la reivindicación 1 , en que la toxina botulínica no acomplejada purificada comprende una toxina botulínica tipo A.

11. El método de acuerdo con la reivindicación 1 , en que la toxina botulínica no acomplejada purificada es pura al menos en un 95%.

12. El método de acuerdo con la reivindicación 1 , en que la toxina botulínica no acomplejada purificada tiene una actividad de al menos 200 LD50 unidades/ng.

13. El método de acuerdo con la reivindicación 1 , en que el método produce un rendimiento de al menos aproximadamente 2 mg/ L de cultivo de fermentación.

14. El método de acuerdo con la reivindicación 1 en que la columna amónica se selecciona de un grupo que consiste en una Sefarosa Q HP, una Sefarosa Q de flujo rápido y una columna de Sefarosa Q XL, y caracterizado porque la columna catiónica se selecciona de un grupo que consiste en una columna Sefarosa SP, Sefarosa SP HP, Sefarosa SP de flujo rápido, Mono S, Fuente-S, Fuente-30S, y Fuente-15S.

15. El método de acuerdo con la reivindicación 1 , en que un tampón para la carga de la toxina botulínica no acomplejada en la columna aniónica es seleccionada de un grupo que consiste en Tris, bis-Tris, trietanolamina, y N-metilo dietanolamina.

16. El método de acuerdo con la reivindicación 15 en que el tampón es usado a un pH de 7.4 a 8,2.

17. El método de acuerdo con la reivindicación 1 en que un tampón para cargar la toxina botulínica no acomplejada en la columna catiónica se selecciona de un grupo que consiste en fosfato de sodio, MES y HEPES.

18. El método de acuerdo con la reivindicación 17 en que el tampón es usado a un pH de 6,0 a 7.0.

19. El método de acuerdo con la rei indicación 1 en que el pH de la columna aniónica es de 7.4 a 8,2.

20. El método de acuerdo con la reivindicación 1 en que el pH de la columna catiónica es de 6,0 a 7.0.

21. El método de acuerdo con la reivindicación 1 en que un gradiente para eluir la toxina botulínica no acomplejada de la columna aniónica se selecciona de un grupo que consiste en un gradiente ascendiente de cloruro- de sodio y un gradiente ascendiente de cloruro de potasio.

22. El método de acuerdo con la reivindicación 21 en que el gradiente se usa a un pH de 7.4 a 8,4.

23. El método de acuerdo con la reivindicación 1 en que un gradiente para eluir la toxina botulínica no acomplejada proteico de la columna catiónica se selecciona de un grupo que consiste en un gradiente ascendiente de cloruro de sodio y un gradiente ascendiente de cloruro de potasio.

24. El método de acuerdo con la reivindicación 23 en que el gradiente se usa a un pH de 6,0 a 7.0.