MX2012014152A - Metodos de deteccion de anticuerpos monoclonales para enzimas que confieren resistencia a acido 2, 4-diclorofenoxiacetico en plantas. - Google Patents

Abstract

Se describen anticuerpos monoclonales y métodos útiles para determinar y cuantificar la presencia de enzima de dioxigenasa de ariloxialcanoato.

Description

MÉTODOS DE DETECCIÓN DE ANTICUERPOS MONOCLONALES PARA ENZIMAS QUE CONFIEREN RESISTENCIA A ÁCIDO 2,4-DICLOROFENOXIACÉTICO EN PLANTAS Referencia Cruzada con Solicitud Relacionada La presente solicitud reclama el beneficio de la Solicitud de Patente Provisional Norteamericana 61/351,593, presentada el 4 de junio de 2010, cuya descripción está incorporada en su totalidad a la presente invención como referencia.

Antecedentes de la Invención El ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D) se encuentra en la clase de herbicidas de ácido fenoxi y ha sido utilizado en muchas cosechas monocotiledóneas tal como maíz, trigo y arroz para el control selectivo de malezas de hoja ancha sin dañar en forma severa las plantas de cosecha deseadas. 2,4-D es un derivado de auxina sintético que actúa para desregular la homeostasis de hormona de célula normal e impedir el crecimiento controlado, equilibrado; sin embargo, el modo de acción exacto de esta clase de herbicida aún no se comprende de manera total. Triclopir y fluroxipir son herbicidas de ácido piridiloxiacético que también actúan como una auxina sintética.

Estos herbicidas tienen diferentes niveles de selectividad en ciertas plantas (por ejemplo, las dicotiledóneas son más sensibles que las monocotiledóneas). El metabolismo diferencial por parte de diferentes plantas, es una explicación de los diversos niveles de selectividad. En general, las plantas metabolizan 2,4-D lentamente, de modo que la variación de la respuesta de la planta a 2,4-D, puede ser explicada de manera más probable a través de la actividad diferente en los sitios objetivos (WSSA, 2002; Herbicide Handbook 8o edición; Weed Science Society of America; Lawrence, KS pp. 492). El metabolismo de 2,4-D de la planta normalmente ocurre a través de un mecanismo de dos fases, normalmente hidroxilación seguido de conjugación con aminoácidos o glucosa (WSSA, 2002).

Con el tiempo, ciertas poblaciones microbianas estimuladas con 2,4-D, han desarrollado una trayectoria alternativa para degradar este xenobiótico que da como resultado la mineralización completa de 2,4-D. Las aplicaciones sucesivas del herbicida, selecciona los microbios que pueden utilizar el herbicida como una fuente de carbono y energía para crecimiento, proporcionándoles una ventaja competitiva en la tierra. Por esta razón, el 2,4-D actualmente formulado tiene una vida media en tierra relativamente corta, sin arrastrar efectos significativos en las cosechas subsecuentes.

Un organismo que ha sido investigado en forma extensa con respecto a su capacidad para degradar 2,4-D, es Ralstonia eutropha (Streber, y asociados; 1987; Análisis, clonación y expresión de alto nivel del gen de monooxigenasa de 2,4- diclorofenoxiacético tfdA de Alcaligenes eutrophns JMP134. J. Bacteriol. 169:2950-2955). El gen que codifica la enzima en el paso inicial de la trayectoria de mineralización es tfdA. Ver por ejemplo la Patente Norteamericana No. 6,153,401 y el Acceso GENBANK No. M16730. El producto de gen TfdA cataliza la conversión de 2,4-D a diclorofenol (DCP) a través de una reacción de dioxigenasa dependiente de a-cetoglutarato (Smejkal; y asociados.; 2001. Especificidad de substrato de la bacteria que se degrada mediante ácido clorofenoxialcanoico no es dependiente de los tipos del gen tfdA filogenéticamente relacionados. Biol. Fértil. Sois 33:507-513). DCP tiene poca actividad herbicida en comparación con 2,4-D. TfdA ha sido utilizado en plantas transgénicas para impartir resistencia a 2,4-D en plantas dicotiledóneas, tales como algodón y tabaco, las cuales son naturalmente sensibles a 2,4-D (Streber; y asociados.; 1989. Las plantas de tabaco transgénicas que expresan una enzima desintoxicante bacteriana son resistentes a 2,4-D. Bio/Technology 7:811-816.), y la Patente Norteamericana No. 5,608,147).

Se ha aislado un gran número de genes tipo tfdA que codifican enzimas con la capacidad de degradar 2,4-D de las bacterias de la tierra y sus secuencias depositadas en la base de datos de Genbank. Muchos homólogos de tfdA (>85% de identidad de aminoácido) tienen propiedades enzimáticas similares a tfdA. Sin embargo, existe un número de homólogos que tienen una identidad con tfdA (25 a 50%) significativamente menor, pero aún tienen los residuos característicos asociados con una dioxigenasa Fe+2 de dioxigenasa de alfa-cetoglutarato. Por lo tanto no es obvio cuales son las especificidades de substrato de estas dioxigenasas divergentes.

Un ejemplo único con baja homología para tfdA (31% de identidad de aminoácido) es sdpA de Delftia acidovorans (Kohler, H.P.E. 1999; Delftia acidovorans MH: un degradante de herbicida de ácido fenoxialcanoico versátil; J. Ind Microbiol and Biotech. 23:336-340. Westendorf, y asociados; 2002. Las dos dioxigenasas-a-cetoglutarato/dicloroprop enantioespecíficas de la proteína MC1 Delftia acidovorans y los datos de secuencia de Rdpa y SdpA. Microbiol. Res. 157:317-22.). Esta enzima ha mostrado catalizar el primer paso en la mineralización de (S)-diclorprop (y otros ácidos (S)-fenoxipropiónico) así como de 2,4-D (un ácido fenoxiacético) (Westendorfet y asociados; 2003. Purificación y caracterización de las dioxigenasas enantioespecíficas de Delftia acidovorans MC1 que inician la degradación de los herbicidas de fenoxipropionatos y fenoxiacetato. Acta Biotechnol. 23: 3-17).

Un gen de dioxigenasa de ariloxialcanoato optimizado por codón de planta, AAD-12, que codifica la enzima originalmente aislada de Delftia acidovorans, fue descrito primero para utilizarse como un rasgo de resistencia a herbicida en la Publicación Internacional WO 2007/053482, la cual está incorporada a la presente invención como referencia. El rasgo confiere tolerancia a 2,4-D y a herbicidas de piridiloxiacetato. El primer reporte de los frijoles de soya transformados que contienen el gen AAD-12, fue en la Solicitud de Patente Provisional Norteamericana No. 61/263950, incorporada a la presente invención como referencia.

Los compuestos que desarrollan y negocian los rasgos de ADN recombinantes para formular productos de semillas para plantación, implementan y se adhieren a estrictos planes de administración del producto. Estos planes de administración requieren el uso de métodos de detección de proteína cuantitativos y cualitativos validados para que el rasgo recombinante rastree la introgresión del rasgo y las actividades de producción de semillas, así como monitoreen la recolección de granos del rasgo. Estos métodos de detección deben ser lo suficientemente fáciles y robustos para ser utilizados bajo condiciones GLP y no GLP. Además los métodos deben ser lo suficientemente amigables para el usuario, de modo que sean fácilmente empleados por agricultores en el campo, comerciantes de granos en silo, y oficiales acostumbrados en las fronteras. Por consiguiente, son útiles y necesarios métodos de detección de proteína y equipos comerciales amigables para el usuario, de alta calidad y robustos.

Aunque los inmunoensayos son bien conocidos en la técnica, el desarrollo de métodos ELISA validados, de alta calidad, robustos (ensayos inmunoabsorbentes enlazados por enzima) que sean reproducibles para detectar un producto transgénico en particular en una formación de tejido de planta en instalaciones tanto de laboratorio como de campo no es ni trivial ni de rutina. Aún más desafiante es encontrar pares de anticuerpo que sean particularmente adecuados para el desarrollo de una tira de flujo lateral ELISA para detectar un evento transgénico AAD-12.

Breve Descripción de la Invención La presente invención proporciona un panel de anticuerpos monoclonales (mAbs) y las líneas de célula de hibridoma que producen. Las líneas fueron depositadas con la Recolección de Cultivo de Tipo Americano de Acuerdo con los términos del Tratado de Budapest. Estos mAbs son sorprendentemente bien adecuados para detectar un producto de gen de evento transgénico AAD-12 en una variedad de plantas y tejidos de planta. La presente invención proporciona además inmunoensayos cuantitativos y cualitativos que utilizan las inmunoglobulinas de la presente invención.

Descripción Detallada de la Invención La presente invención comprende anticuerpos que reaccionan con AAD-12 y los hibridomas que producen los mAbs. La tabla que se encuentra a continuación describe las designaciones de la línea de hibridoma y sus designaciones de depósito ATCC correspondientes.

La presente invención también incluye métodos para utilizar los mAbs para aislar o detectar AAD-12, en donde los métodos comprenden: a) inmovilizar el anticuerpo en una superficie; b) contactar el anticuerpo inmovilizado con una mezcla que contiene AAD-12; c) separar e inmovilizar el anticuerpo enlazado a AAD-12 de la mezcla; y d) recuperar AAD-12 eliminando el AAD-12 enlazado por anticuerpo del anticuerpo inmovilizado.

La presente invención también incluye un método para utilizar los anticuerpos reivindicados para identificar la presencia de AAD-12 en una muestra biológica que comprende: a) inmovilizar el anticuerpo en una superficie de ensayo; b) contactar la superficie de ensayo con un líquido que se sospecha contiene AAD-12, y lavar la superficie del ensayo con una solución adecuada; c) contactar la superficie del ensayo con un anticuerpo anti-AAD-12 etiquetado con un grupo de reporte y lavar la superficie de ensayo con una solución adecuada; d) detectar la presencia del grupo de reporte.

La presente invención incluye además un método analítico para la determinación cuantitativa de la enzima AAD-12 expresada en plantas transgénicas, especialmente frijol de soya y plantas de algodón. La proteína AAD-12 es extraída de muestras de frijol soya con una solución PBS (solución salina amortiguada por fosfato). El extracto es centrifugado; el sobrenadante acuoso es recolectado y diluido. Se incuba una alícuota de la muestra diluida con anticuerpo monoclonal anti-AAD-12 conjugado con enzimas en los depósitos de una placa recubierta con anticuerpo monoclonal o policlonal anti-AAD-12 en un formato ELISA de emparedado. Ambos anticuerpos en el par de emparedado, capturan la proteína AAD-12 en la muestra. Al final del período de incubación, los reactivos no enlazados son eliminados de la placa lavando con PBS. Se detecta la presencia de AAD-12 incubando el conjugado de la enzima con un substrato de enzima, generando un producto con color. Ya qué AAD-12 enlaza al emparedado de anticuerpo, el nivel de desarrollado de color es proporcional a la concentración de AAD-12 en la muestra (es decir, una menor concentración de proteína da como resultado menor desarrollo de color). La absorbancia en 450 nm menos la absorbancia en una longitud de onda de referencia (tal como 650 mm) se mide utilizando un lector de placa. Se estima una curva de calibración a partir de 7 concentraciones estándar utilizando una ecuación de regresión cuadrática. Este ELISA AAD-12 es específico y lo suficientemente sensible para la cuantificación de AAD-12 en los extractos de muestra del tejido de la planta. Además, los anticuerpos de la presente invención pueden ser utilizados para confirmar la presencia de AAD-12 utilizando un procedimiento de manchado Western estándar.

La preparación de anticuerpos contra proteínas de interés, es bien conocida en la técnica. Ver las Publicaciones de Galfre y Milstein, Métodos en Enzimología, Vol. 73, Academic Press, Nueva York (1981); James W. Goding, Anticuerpos Monoclonales: Principios y Práctica, Academic Press, Orlando, Florida (1986); Protocolos Actuales en Biología Molecular; F. M. Ausubel, y asociados, ed., Wiley I nterscience , Nueva York, (1987).

Para preparar anticuerpos reactivos con una proteína de interés, la proteína primero debe enriquecerse o purificarse. Las preparaciones antigénicas relativamente crudas de la proteína, pueden ser utilizadas para propósitos de inmunización. Sin embargo, se requiere una proteína altamente purificada para determinar en forma precisa si los hibridomas están produciendo la recabación después de los anticuerpos monoclonales, o para ensayar los tituladores de anticuerpo del suero inmune.

Una vez que se ha aislado AAD-12, los anticuerpos específicos para AAD-12 pueden ser elevados a través de métodos convencionales que son bien conocidos en la técnica. Las inyecciones repetidas en un huésped de elección, durante un período de semanas o meses, provocará una respuesta inmune y dará como resultado títuladores de suero anti-AAD-12 significativos. Los huéspedes preferidos son especies de mamífero, y las especies más altamente preferidas son conejos, cabras, ovejas y ratones. Se puede procesar la extracción de sangre de dichos animales inmunizados a través de métodos establecidos para obtener antisuero (anticuerpos policlonales) que reacciona con AAD-12. El antisuero posteriormente puede ser purificado mediante afinidad mediante absorción para AAD-12 de acuerdo con técnicas conocidas en el arte. El antisuero purificado mediante afinidad puede ser purificado en forma adicional aislando la fracción de inmunoglobulina dentro del antisuero utilizando procedimientos conocidos en la técnica. El material resultante será una población heterogénea de inmunoglobulinas que reaccionan con AAD-12.

Los mAbs anti-AAD-12 se preparan fácilmente utilizando AAD-12 purificado. Los métodos para producir mAbs han sido practicados durante varias décadas y son bien conocidos para los expertos en la técnica. Las inyecciones intraperitoneales o subcutáneas repetidas de AAD-12 en adyuvante, desarrollarán una respuesta inmune en la mayor parte de los animales, especialmente ratones. Se eliminaron B-linfocitos hiperinmunizados del animal y se fusionaron con una línea de célula de parte de fusión adecuada con la capacidad de ser cultivada en forma indefinida. Numerosas líneas de célula de mamífero son partes de fusión adecuadas para la producción de hibridomas. Muchas de dichas líneas están comercialmente disponibles en ATCC y en proveedores comerciales.

Una vez fusionados, los hibridomas son cultivados en un medio de crecimiento selectivo durante una a dos semanas. Los sistemas de selección están disponibles para eliminar mielomas de fusión no fusionados y fusiones entre células de mieloma del cultivo de hibridoma mezclado. La elección del sistema de selección depende de la cepa de ratón inmunizado y la parte de fusión de mieloma utilizada. El sistema de selección AAT, descrito por Taggart y Samloff, Science 219, 1228 (1982), puede ser utilizado; sin embargo, el sistema de selección HAT (hipoxantina, aminopterina, timidina), descrito por Littlefield, Science 145, 709 (1964), es preferido debido a su compatibilidad con células de ratón y partes de fusión antes mencionadas.

Posteriormente el medio de crecimiento agotado es clasificado con respecto a secreción mab inmunoespecífica. Los procedimientos de ensayo inmunoabsorbente enlazado por enzimas son los más adecuados para este propósito; aunque, también son aceptables ensayos radioinmune adaptados para clasificación de volumen grande. Las clasificaciones múltiples diseñadas para reducir en forma consecutiva el número considerable de cultivos irrelevantes o menos deseados, se debe llevar a cabo para aislar el pequeño porcentaje de mAbs de la presente invención. Los cultivos que secretan mAbs que reaccionan con AAD-12, fueron isotipificados utilizando ensayos comercialmente disponibles.

Los cultivos de hibridoma que secretan los mAbs AAD-12 después de sought deben ser subclonados varias veces para establecer la capacidad de monoclonación y estabilidad. Los métodos bien conocidos para subclonar cultivos de célula no adherente, eucariótica, incluyen dilución limitante, agarosa blanda y técnicas de clasificación celular activada por fluorescencia. Después de cada subclonación , los cultivos resultantes deben ser ensayados nuevamente para la secreción de anticuerpo e isotipo para asegurar que se ha establecido un cultivo de secreción de anticuerpo estable.

Los anticuerpos anti-ADD-12 reivindicados pueden ser inmovilizados a una superficie, de modo que parte del sitio de enlace de anticuerpo permanezca expuesta y con la capacidad de enlazar AAD-12. Una amplia clasificación de esquemas para inmovilizar los anticuerpos ha sido desarrollada durante algunas décadas pasadas. La inmovilización se puede lograr mediante acoplamiento covalente del anticuerpo directamente en la superficie deseada o mediante puenteo del anticuerpo a la superficie.

El acoplamiento de CNBr y carbodiimida de anticuerpos a gránulos basados en polisacárido, tal como Sepharose® (Pharmacia, Pistcataway, NJ) son ilustrativos de esquemas de acoplamiento directo que son consistentes con la presente invención. Los acoplamientos directos generalmente no orientan los anticuerpos en alguna forma en particular; sin embargo, algunos tipos de acoplamientos directos tienen la capacidad de orientar en forma reproducible el anticuerpo en la sustancia de inmovilización.

Los esquemas de acoplamiento preferidos orientan el anticuerpo, de modo que sus regiones de enlace de antígeno permanezcan expuestas. Uno de dichos esquemas utiliza el carbohidrato natural encontrado en las cadenas pesadas del anticuerpo. Al oxidar primero las porciones de carbohidrato a los aldehidos correspondientes, reaccionando posteriormente el aldehido con un grupo amino primario en la superficie, es posible enlazar el anticuerpo en una orientación conveniente.

Muchos tipos de puente son posibles e incluyen pequeños enlazadores orgánicos que enlazan en forma covalente el anticuerpo a la sustancia inmovilizante. Dichos brazos espaciadores son aceptables y preferentemente no deben interactuar con proteínas una vez que se ha formado el puente.

La descripción anterior no pretende en forma alguna limitar el alcance de la presente invención. Otros numerosos esquemas bien conocidos para enlazar anticuerpos a sustancias de inmovilización son consistentes con la presente invención.

Es bien sabido que los anticuerpos etiquetados con un grupo de reporte pueden ser utilizados para identificar la presencia de antígenos en una variedad de medios. Los anticuerpos etiquetados con radioisótopos, han sido utilizados por décadas en ensayos radioinmune para identificar, con gran precisión y sensibilidad, la presencia de antígenos en una variedad de fluidos biológicos. Más recientemente, se han utilizado anticuerpos etiquetados con enzima como un sustituto de los anticuerpos radioetiquetados en el ELISA popular.

Los anticuerpos de la presente invención se pueden enlazar a una sustancia de inmovilización tal como un depósito de poliestireno o partícula y utilizarse en inmunoensayos para determinar si AAD-12 está presente en una muestra de prueba. En esta modalidad de la presente invención, una muestra es contactada con la superficie de inmunoafinidad y se deja incubar. Después de un paso de lavado, cualquier AAD-12 que ha sido enlazada a la superficie de inmunoafinidad, es detectado contactando la superficie con otro anticuerpo de la presente invención etiquetado con un grupo de reporte.

El uso de tiras de flujo laterales o tiras inmunocromatográficas con los anticuerpos y métodos de ensayo reivindicados, es consistente con la presente invención. Los ensayos de flujo lateral son bien conocidos en la técnica. Ver por ejemplo la Patente Norteamericana US 6,485,982. En este modelo se pueden utilizar pruebas de flujo lateral para detección cualitativa o semi-cuantitativa de AAD-12 solo, o en forma simultánea con materiales para análisis. Las pruebas de flujo lateral son las más simples de utilizar de todos los formatos de prueba aquí descritos, y son particularmente útiles en preparaciones de campo, en donde el material de planta es rápidamente extractado en una solución, y probado en una tira de flujo lateral. En este modo, es únicamente necesario colocar la tira de flujo lateral en una muestra líquida o aplicar la muestra líquida a la tira de flujo lateral y leer los resultados después de un período de tiempo. Todas las pruebas de flujo lateral deben incorporar ya sea una línea de control de procedimiento o una línea de control de muestra que se utiliza para validar el resultado de la prueba. Por consiguiente la aparición de dos líneas, indica un resultado positivo, en tanto que una prueba negativa válida produce únicamente la línea de control. Si únicamente aparece la línea de prueba, o si no aparece alguna línea, es inválida.

Una tira de prueba de flujo lateral típica, consiste en cuatro componentes principales; una almohadilla de muestra en la cual se aplica la muestra de prueba, una almohadilla de conjugado que contiene anticuerpos de la presente invención conjugados a las partículas con color (normalmente partículas de oro coloidal o microesferas de látex); una membrana de reacción tal como una membrana de nitrocelulosa hidrofóbica o de acetato de celulosa en la cual un anticuerpo diferente de la presente invención es inmovilizado en una línea a través de la membrana como una zona de captura o línea de prueba; y, un depósito de desecho designado para extraer la muestra a través de la membrana de reacción mediante acción capilar.

Los componentes de la tira de flujo lateral normalmente se fijan a un material de soporte inerte, y se pueden presentar en un formato de varilla simple o dentro de un estuche de plástico con una puerta para muestras y una ventana de reacción que muestra las zonas de captura y control. En otro modo de la modalidad de ensayo, se seca una muestra de prueba que se sospecha contiene AAD-12 sobre una superficie, formando una muestra de prueba inmovilizada. Posteriormente un anticuerpo etiquetado de la presente invención, se pone en contacto con la muestra de la prueba inmovilizada y se deja incubar. Si la muestra contiene AAD-12, el anticuerpo etiquetado enlazará al AAD-12 inmovilizado. Este método también se puede llevar a cabo utilizando un anticuerpo no etiquetado de la presente invención, seguido de un anticuerpo secundario etiquetado que enlaza a un anticuerpo de la presente invención, el cual ya está enlazado a AAD-12. Después del lavado, se mide la muestra de prueba inmovilizada para detectar la presencia de cualesquiera grupos de reporte.

Los grupos de reporte normalmente son enzimas tal como fosfatasa alcalina, peroxidasa de rábano o beta-D-galactosidasa. Los substratos adecuados producen un cambio de color cuando se hacen reaccionar con la enzima. Al hacer esto, las medidas de la intensidad de color pueden ser cuantificadas utilizando un espectrofotómetro. Si el grupo de reporte es un radioisótopo, se puede utilizar un instrumento de detección de rayos gamma o'beta adecuado, para cuantificar el grupo de reporte. La intensidad del grupo de reporte se correlaciona directamente con la cantidad de AAD-12 en la muestra de prueba.

Los ejemplos que se encuentran a continuación ayudarán a describir como se practica la presente invención, e ilustrarán las características de los anticuerpos anti-ADD-12 y ensayos reivindicados.

EJEMPLO 1 Preparación de Inmunogen La proteína AAD-12 fue extractada de tejido de hoja liofilizado eliminado de frijol soya transgénico en un amortiguador a base de PBST (Solución Salina Amortiguada por Fosfato con 0.05% de Tween 20, pH 7.4) con estabilizadores agregados, y se recolectaron las proteínas solubles en el sobrenadante después de la centrifugación. El sobrenadante se filtró y las proteínas solubles se dejaron enlazar a cuentas de Phenyl Sepharose™ (PS) (GE Healthcare). Después de una hora de incubación, las cuentas PS fueron lavadas con PBST y las proteínas enlazadas fueron eluidas con agua Milli-Q™. Se agregó cloruro de sodio para incrementar la conductividad y las proteínas purificadas mediante PS fueron cargadas en una columna de inmunoafinidad anti-AAD-12 que había sido conjugada con un anticuerpo policlonal específico de AAD-12 elevado contra AAD-12 recombinante, producido en Pseudomonas fluorescens. Las proteínas no enlazadas fueron recolectadas de la columna y la columna se lavó en forma extensa con PBS enfriado previamente (solución salina amortiguada con fosfato, pH 7.4). Las proteínas enlazadas fueron eluidas de la columna con un amortiguador 3.5 M NaSCN. 50 mM Tris™, pH 8.0. Se revisaron AAD-12 derivado de microbios y AAD-12 derivado de frijol soya mediante SDS-PAGE y manchado Western.

El AAD-12 derivado de microbios, la banda de proteína mayor, tal como se visualiza en el gel SDS-PAGE manchado con Coomassie, fue de aproximadamente 32 kDa. Tal como se espera, la proteína AAD-12 derivada de planta correspondiente fue idéntica en tamaño a la proteína derivada de microbio. En forma predecible, las fracciones purificadas por la planta contenían una menor cantidad de impurezas no-inmunorreactivas además de la proteína AAD-12. Las proteínas purificadas en conjunto fueron referidas de igual manera en la columna mediante interacciones débiles con la matriz de columna.

El AAD-12 derivado de microbios y el extracto derivado de plantas mostró una señal positiva de tamaño esperado en el manchado Western utilizando un anticuerpo policlonal anti-AAD-12. En el análisis de manchado Western AAD-12, no se observaron proteínas inmunorreactivas en el extracto de control negativo (frijol soya nativo) y no se observaron proteínas de tamaño alterno (agregados o productos de degradación) en las muestras de la planta transgénica.

EJEMPLO 2 Preparación de Hibridoma Los ratones fueron inmunizados con AAD-12 y se utilizaron técnicas de fusión para preparar un panel de hibridomas que expresa los anticuerpos monoclonales AAD-12. La muestra de medio de cultivo de tejido agotado fueron eliminadas en forma aséptica de cada depósito que contiene un cultivo de hibridoma y ensayada para reactividad AAD-12 utilizando el siguiente método ELISA de captura de anticuerpo. Se recubrieron depósitos de microtitulación con una solución de 1 a 10 pg/mL de AAD-12 purificado. Los depósitos fueron lavados y las muestras de medio de tejido agotado se colocaron en los depósitos y se dejaron incubar. Los depósitos fueron lavados y se agregó antisuero anti-ratón de cabra etiquetado con peroxidasa y se dejó incubar. Las placas se lavaron, se agregó el substrato para desarrollar una reacción de color y las placas se leyeron para OD (densidad óptica). Los depósitos con lecturas OD de alto nivel fueron mapeados nuevamente a depósitos de cultivo que contienen los hibridomas. Los cultivos positivos de anticuerpo AAD-12, fueron clasificados en forma continua para la producción de anticuerpos, para asegurar la estabilidad de crecimiento y la producción de anticuerpo conforme se expandieron los cultivos. Se llevaron a cabo varias vueltas de la clonación de dilución limitante para establecer la monoclonalidad real de cada cultivo. Se llevaron a cabo ensayos adicionales en los clones positivos de anticuerpo, para determinar la capacidad de adaptación de cada anticuerpo para utilizarse en los métodos de detección cuantitativo reivindicados en la presente invención para uso en campo con material de plantas.

EJEMPLO 3 ELISA cuantitativo Este ejemplo es un método para la determinación cuantitativa de AAD-12 en tejidos de frijol soya utilizando anticuerpos y métodos de la presente invención. El rango cuantitativo de la curva estándar dé calibración es de 0.25 ng/mL a 10 ng/mL en amortiguador. El nivel de proteína de AAD-12 en semilla de frijol soya, hoja (V5 y V10), raíz y forraje en las etapas R3, se puede determinar con un límite de cuantificación (LOQ) de 1.0 ng/mg y un límite de detección (LOD) de 0.5 ng/mg.

Las sustancias de prueba fueron muestras de tejido de frijol soya representativa que fueron modificadas en forma genética para expresar la proteína AAD-12, y el frijol soya de control no transgénico de la variedad Maverick. Los tejidos, que se describen a continuación, fueron recolectados del invernadero.

Lista de muestras de frijol soya no transgénico No. de Grupo de Descripción de muestra Tejido Muestra 081008-001-0001 Forraje (planta completa; control no transgénico hojas y tallo; R3) 081008-004-0001 Raíz (R3) control no transgénico 081008-009-0001 Semilla control no transgénico 081008-010-0001 Hojas (V5) control no transgénico 081008-011-0001 Hojas (V10) control no transgénico Lista de muestras de frijol soya transgénico No. de Grupo de Tejido Descripción Muestra 081008-003-0001 Forraje (planta completa; AAD-12 hojas y tallo; R3) 081008-006-0001 Raíz AAD-12 081008-007-0001 Hojas (R7) AAD-12 081008-012-0001 Semilla AAD-12 081008-013-0001 Hojas (V5) AAD-12 081008-014-0001 Hojas (V10) AAD-12 Las sustancias de referencia que se encuentran a continuación empleadas en este estudio, fueron una proteína AAD-12 purificada utilizada como un estándar de calibración y como material de fortificación en el análisis ELISA, una proteína AAD-12 purificada y una proteína AAD-12 purificada utilizada para probar la reactividad cruzada.

Proteína Número de Sustancia Pureza o Referencia de Prueba Concentración CryIF 104301 0.164 mg/mL BIOT033236 AAD-1 105930 0.1805 mg/mL ?????9-203007 CryIAc 102337 0.26 mg/mL BIOT08-162946 AAD-12 030732 0.2 mg/mL BIOT09-203009 PAT 105742 0.3 mg/mL BIOT063302 Cry35Ab1 104066 0.128 mg/mL BIOT08-162948 Cry34Ab1 104874 0.248 mg/mL BIOT09-203014 Las sustancias de prueba y referencia fueron almacenadas en congeladores con temperatura monitoreada y se eliminaron únicamente para la preparación y análisis de la muestra. En síntesis, la proteína AAD-12 fue extractada de muestras de frijol soya (V5, V10, forraje y raíz) con PBST (solución salina amortiguada por fosfato que contiene 0.05% Tween™ 20) con ovoalbúmina al 0.75% (OVA) (PBST/OVA). La proteína AAD-12 fue extractada de semillas de frijol soya con una solución PBS que contiene 0.05% Tween™ 20 (PBST) y 0.1% Tritón™ X-100.

El extracto fue centrifugado y se recolectó el sobrenadante acuoso, se diluyó y ensayó utilizando una ELISA AAD-12 específico. Se incubó una alícuota de la muestra diluida con anticuerpo 539B470.2 monoclonal anti-AAD-12 conjugado con enzima en los depósitos de una placa recubierta con anticuerpo policlonal AAD-12 en un formato ELISA de emparedado. Ambos anticuerpos en el par de emparedado, capturaron AAD-12 en la muestra. Al final del período de incubación, se eliminaron los reactivos no enlazados de la placa lavando con PBST. Se detectó la presencia de AAD-12, incubando el conjugado de enzima enlazado por anticuerpo con un substrato de enzimas, que genera un producto con color. Ya que AAD-12 se enlazó en el emparedado del anticuerpo, el nivel de desarrollo de color fue proporcional a la concentración de AAD-12 en la muestra (es decir, una menor concentración de proteína da como resultado un menor desarrollo de dolor). La reacción de color se detuvo agregando una solución ácida y la absorbancia en 450 nm menos absorbancia en 650 nm, fue medida utilizando un lector de placa. Se estimó una curva de calibración de 7 concentraciones estándar utilizando una ecuación de regresión cuadrática con un coeficiente de determinación de >0.990. Este ensayo AAD-12 ELISA fue altamente específico para la cuantificación de proteína AAD-12.

EJEMPLO 4 Validación de ensayo El rango cuantitativo preliminar del método fue establecido independientemente durante el desarrollo del método y un estudio de pre-validación. Las concentraciones estándar proporcionaron el más bajo porcentaje de error promedio de los puntos de concentración determinados. El límite de detección (LOD) y el límite de cuantificación (LOQ) para la determinación de AAD-12 en cada tejido, fue definida en forma empírica sobre las bases de parámetros de ensayo (absorbancia, fondo y rango lineal), interferencias de matriz y/o dosis que constituyen la curva estándar. También fueron soportadas a través de métodos estadísticos siguiendo el método de Keith y asociados. (Keith, L. H., Crummett, W., Deegan, J., Jr., Libby, R. A., Taylor, J. K., Wentler, G. 1983. Principios de Análisis Ambiental, Anal. Chem., 55, 2210-2218) y probando cada muestra de control fortificada con 5 ng/mL (0.5 ng/mg) de proteína AAD-12.

La reactividad cruzada de esta ELISA AAD-12 para las proteínas no objetivo CryIF, CryIAc, Cry34Ab1 , Cry35Ab1, PAT y AAD-1 fue probada en este estudio. Estas proteínas fueron preparadas en concentraciones de 1 pg/mL y 10 pg/mL en PBST/OVA. En la misma placa, se generó como una referencia una curva estándar AAD-12. La respuesta OD para las proteínas no objetivo fue interpolada a partir de la curva estándar AAD-12, y el porcentaje de reactividad cruzada se calculó utilizando la siguiente fórmula, % reactividad cruzada = 100 x (concentración medida mediante curva estándar AAD-12/concentración teórica de proteína objetivo).

Los extractos de la muestra (matriz) de cada tejido de frijol soya (diluciones 1X, 5X y 10X) del control negativo, fueron fortalecidos con diferentes concentraciones para crear curvas estándar. Las curvas estándar fortalecidas con matriz, fueron interpoladas de una curva estándar no fortalecida corrida en la misma placa. Una diferencia además del 15% entre lo observado (una curva estándar no fortalecida utilizada para interpolar las concentraciones estándar fortalecidas-matriz) y teórica (concentración de la curva estándar fortalecida-matriz) para cada nivel de concentración estándar, fue considerada indicativa de un efecto de matriz potencial.

Se llevó a cabo una serie de cinco extracciones en tejidos de frijol soya transgénico conocidos por expresar AAD-12. En síntesis, se agregaron 15 mL de amortiguador a la muestra de tejido (15 mg) y se extractaron tal como se describió anteriormente. Después de la extracción y centrifugación, se eliminó la solución extractada mediante una pipeta. Después del primer extracto, se agregó una alícuota de 200 µ? de amortiguador y se mezcló con la muestra, se centrifugó y el sobrenadante se eliminó y se agregó a la primera solución de extracción. Se agregaron otros 1.5 mL de amortiguador al tejido, y se repitió el proceso de extracción. Este procedimiento fue repetido tres veces más para obtener 5 extracciones consecutivas. La concentración de AAD-12 en cada extracción fue determinada utilizando el ELISA AAD-12. Se estudiaron al menos cinco réplicas para cada muestra de prueba. La eficacia aparente del proceso de extracción de tejido fue determinada mediante comparación de la proteína AAD-12 en el primer extracto relativa a la proteína AAD-12 total en los cinco extractos.

La precisión del método fue determinada midiendo la recuperación de la proteína AAD-12 de las matrices de control negativo fortalecidas con niveles bajos (0.5 ng/mg DW), de punto medio (1 y 4 ng/mg DW) y altos (8 ng/mg DW) de proteína AAD-12. Se analizó un mínimo de cinco réplicas por cada concentración. La precisión del ensayo estuvo indicada como el porcentaje de recuperación. Las recuperaciones entre 67 a 120% se consideraron aceptables.

La precisión del método se determina utilizando los resultados de las muestras de control de frijol de soya fortificada analizadas a través de dos analistas en varios días. Se fortificaron los extractos de la muestra de control con tres niveles de estándar AAD-12 (0.25 ng/mg, 0.5 ng/mg, 4 ng/mg y 8 ng/mg). Cada nivel de extracto fortificado, fue corrido por triplicado en cada placa ELISA. La concentración de recuperación promedio, la desviación estándar (stdev) y el porcentaje de coeficiente de variación (%CV), se calcularon para cada una de las muestras.

Se probaron muestras positivas (hoja y forraje V5 (planta completa)) también para precisión. La concentración anticipada promedio, la desviación estándar (stdev) y el porcentaje de coeficiente de variación (%CV), fueron calculados para cada muestra. Durante el día se calculó la precisión.

El propósito de este experimento fue verificar que el estándar de proteína AAD-12 y la proteína AAD-12 en los extractos de planta, exhibieron una respuesta general similar en el ELISA. Esto se realizó para todos los tejidos transgénicos, evaluando el acuerdo de los resultados de la dilución de un extracto simple interpolado para el rango cuantitativo de la curva estándar. El coeficiente de variación de los resultados interpolados de todas las diluciones cuantificables fue calculado para cada tipo de tejido.

Se probaron los tejidos de semilla, hoja, forraje (planta completa) y raíz para surgimientos positivos falsos y negativos falsos. Se analizaron quince muestras de control no fortificadas y quince muestras fortificadas en 0.25 ng/mg para cada tejido, para determinar los rangos positivos falsos y negativos falsos. Ocurre un resultado positivo falso cuando el residuo en o arriba del LOD establecido, se encuentra en una muestra conocida por ser libre de materiales de análisis. Un negativo falso ocurre cuando no se detecta residuo en la muestra fortificada en el LOD.

Las lecturas ELISA fueron registradas a partir de un Lector de M icroplaca de Dinámicas Moleculares utilizando el programa de software SOFTmax. Los datos de la concentración se transfirieron a SAS, JMP o Microsoft Excel para cálculos de promedio, porcentaje de error, promedio estadístico, desviación estándar, y %CV.

El límite de detección (LOD) de un inmunoensayo se define como la concentración de material para análisis que proporciona una respuesta que tiene una diferencia estadísticamente significativa de la respuesta de una muestra de material para análisis cero. El límite de cuantificación (LOQ) o el rango de operación de un ensayo, generalmente se define como las concentraciones más altas y más bajas que se pueden determinar con un grado de precisión aceptable. En este estudio, el LOD y LOQ dirigido para la determinación de AAD-12 en cada tejido, fueron definidos en forma empírica sobre la base de los parámetros de ensayo (tal como absorbancia, fondo, proporción de señal a ruido y rango lineal), interferencias de la matriz y las concentraciones de curva estándar. Los LOD y LOQ también se determinaron a través de métodos estadísticos estándar. Después de los lineamientos establecidos, se calcularon el LOD y LOQ utilizando la desviación estándar de los resultados de recuperación 0.5 ng/mg. El LOQ fue calculado como diez veces la desviación estándar (10s), y el LOD fue calculado como tres veces la desviación estándar (3s) de los resultados del análisis de un mínimo de 5 muestras por matriz. Los resultados calculados y el LODs y LOQs objetivo para cada tejido, se resumen en la tabla que se encuentra a continuación.

Síntesis de cálculo LOD y LOQ de una ELISA AAD-12 en tejido de frijol soya Nivel Recuperación LOD LOQ Desviaciones Tejido fortalicido promedio 3 xs objetivo 10 x s objetivo estándar ng/mg ng/mg ng/mg ng/mg Forraje (Planta 0.5 0.29 0.06 0.18 0.5 0.60 1.0 completa) Raíz 0.5 0.30 0.05 0.15 0.5 0.50 1.0 Hoja V5 0.5 0.32 0.05 0.15 0.5 0.50 1.0 Semilla 0.5 0.36 0.03 0.03 0.5 0.10 1.0 Hoja V10 0.5 0.46 0.03 0.03 0.5 0.10 1.0 El LOD objetivo es de 0.5 ng/mg para todas las matrices de frijol soya. El LOQ objetivo es 1.0 ng/mg para todas las matrices de frijol soya.

Se probaron para reactividad cruzada diversas proteínas relevantes tales como CryIF, CryIAc, Cry34Ab1, Cry35Ab1, PAT y AAD-1. No se observó reactividad cruzada en las concentraciones probadas para estas proteínas (10,000 ng/mL).

Los resultados de las pruebas de matriz se resumen en la siguiente tabla.

Síntesis de Efectos de Matriz Dilución de matriz3 Dilución más baja Tejido SGN# 1X 5X 10X con/sin efecto de matriz Hoja V5 081008-010-0001 Sí No No 1:5 Hoja V10-12 081008-011-0001 Sí No No 1:5 Forraje R3 081008-001-0001 Sí No No 1:5 (planta completa) Raíz R3 081008-004-0001 No No No 1:2 Semilla R8 081008-009-0001 Sí Sí No 1:10 "Sí" representó que una curva estándar fue afectada por la matriz cuando el porcentaje de error promedio entre los valores observados históricos de los siete niveles de concentración estándar, es mayor a 15%. "No" representó que los no efectos por la matriz o el porcentaje de error promedio entre los valores observados y teóricos de los siete niveles de concentración estándar es menor a 15%.

Una diferencia mayor al 15% entre los promedios observados y teóricos para cualesquiera de los siete niveles de concentración estándar, se consideró una indicación de un efecto de matriz. No se observó efecto de matriz en la raíz en el nivel de fortalecida-matriz 1X. No se encontraron efectos de matriz en el nivel de fortalecida-matriz sin que 5X para hoja V5, hoja V10, forraje (planta completa). Sin embargo, se encontraron efectos de matriz en la semilla en el nivel 5X. Para cuantificación AAD-12 en tejidos de frijol soya, se recomendó una dilución de al menos 2X para la raíz; una dilución de al menos 5X se recomendó para la hoja V5, la hoja V10 y el forraje; y se recomendó una dilución de al menos 10X para la semilla.

Es importante la determinación de los niveles de proteína AAD-12 total en una muestra, para revisar la eficacia de la extracción. Se trataron muestras positivas con amortiguador de extracción cinco veces consecutivas, y la concentración de proteína AAD-12 en cada extracto fue determinada mediante ELISA. La eficacia de extracción aparente estuvo basada en la cantidad de proteína AAD-12 en la primera extracción relativa a la cantidad total de AAD-12 en las cinco extracciones. Las eficiencias de extracción de la proteína AAD-12 de tejidos de frijol soya se muestran en la tabla que se encuentra más adelante.

Síntesis de Eficiencia de Extracción de AAD-12 de tejido de frijol soya Muestra SGÑ# Eficiencia de Desviación CV% % Rango Extracción Estándar EE Promedio (%) Forraje (Planta 081008-003-0001 93.7 1.1 1.1 92.3 a 95.2 completa) Raíz 081008-006-0001 90.0 0.4 0.5 89.6 a 90.6 Hoja V5 081008-013-0001 97.2 0.2 0.3 96.9 a 97.6 Semilla 081008-012-0001 85.8 5.6 6.6 79.1 a 91.1 Hoja V10 081008-014-0001 93.3 1.4 1.5 91.1 a 94.7 Las eficiencias de extracción para el forraje (planta completa), raíz, semilla, hoja V5 y hoja V10 fluctuaron de 85.8 a 97.2%.

Los niveles de recuperación promedio de AAD-12 de todos los tejidos cuando se fortificaron en niveles que igualan a LOQ, los puntos medios y altos de la curva estándar, se muestran en la tabla que se encuentra a continuación.

Síntesis de Resultados de Precisión Matriz Nivel de Fortificación Rango de Recuperación CV% n 1 / \ \ '«>/ ng/mg ng/mLa Promedio Rango jrraje (Planta 8 80 71 59 a 77 9.4 5 Completa) 4 40 70 60 a 79 9.5 5 1 10 67 57 a 76 10.3 5 0.5 5 58 46 a 77 15.8 5 0.5 a 8 5 a 80 66 46 a79 14.4 20 Raíz 8 80 72 66 a 77 6.0 5 4 40 71 64 a 76 6.2 5 1 10 69 62 a 76 ' 7.9 5 0.5 5 61 51 a 76 13.0 5 0.5 a 8 5 a 80 68 51 a 77 11.1 20 Hoja V5 8 80 75 66 a 80 7.4 5 4 40 76 67 a 83 8.6 5 1 10 73 66 a 82 7.8 5 0.5 5 65 53 a 78 12.9 5 0.5 a 8 5 a 80 72 53 a 83 11.2 20 Semilla 8 80 75 72 a 77 2.4 5 4 40 75 74 a 77 1.6 5 1 10 74 72 a 76 2.4 5 0.5 5 73 71 a 75 2.6 5 0.5 a 8 5 a 80 74 71 a 77 2.4 20 Hoja V10 8 80 9 97 a 101 1.8 5 4 40 100 92 a 105 5.2 5 1 10 96 94 a 99 2.8 5 0.5 5 93 91 a 94 1.4 5 0.5 a 8 5 a 80 97 91 a 105 4.3 20 a Las muestras fueron diluidas 10X antes del Fortalecidas en el nivel LOQ o superior, la hoja V5, la hoja V10 y la semilla tuvieron un porcentaje de 67 a 100 dentro de la especificación del 67 a 120% para la recuperación promedio con un porcentaje de coeficiente de varianzas (%CVs) en o debajo de 16%.

Se revisaron las precisiones de ensayo y la robustez utilizando extractos de hoja V5 y forraje (planta completa) que contienen cuatro niveles de proteína AAD-12. Los niveles fueron 8 ng/mg, 4 ng/mg, 0.5 ng/mg y 0.25 ng/mg. La precisión intra-día del ensayo, fue menor o igual a 6.3%, 10.8%, 9.6% y 15.0% para el extracto de hoja V5 fortificado en 8, 4, 0.05 y 0.25 ng/mg, respectivamente. La precisión intra-día del ensayo fue menor o igual a 3.5%, 13.1%, 10.1% y 10.9% para el extracto de forraje (planta completa) fortificado en 8, 4, 0.5 y 0.25 ng/mg, respectivamente. También se probaron para la robustez del ensayo las muestras positivas de hoja V5 y forraje. La precisión intra-día del ensayo fue menor o igual a 9.7% y 19.7% para la hoja V5 y planta completa, respectivamente.

La precisión inter-ensayo de todos los días y de los analistas fue del 4.6%, 10.1%, 6.4% y 12.9%) para los extractos V5 fortificados en 8, 4, 0.5 y 0.25 ng/mg, respectivamente. La precisión inter-ensayo de todos los días y analistas fue de 6.0%, 10.5%, 6.4% y 10.1%> para los extractos de forraje fortificados en 8, 4, 0.5 y 0.25 ng/mg, respectivamente. La robustez inter-ensayo durante los días y de los analistas fue 11.3% y 14.1% para hoja V5 y forraje positivo, respectivamente.

La equivalencia de la respuesta de sustancia de prueba y estándar en el ELISA AAD-12, se demostró utilizando hasta ocho diluciones en serie de extractos de tejidos positivos AAD-12. Para cada extracto de tejido, cinco o más de las diluciones se desplomaron con un rango cuantitativo de la curva estándar, y el %CV de los resultados cuantificados fue menor al 20%.

Las muestras de control no fortificadas (espacios en blanco de la matriz) y las muestras fortificadas en 0.25 ng/mg (LOD = 0.5 ng/mg), fueron analizadas para determinar el rango positivo falso y negativo falso. No hubieron positivos falsos de las muestras de control no fortificadas, y no se reportaron negativos falsos de las muestras fortificadas con LOD analizadas en este estudio.

En síntesis, el método fue validado en el rango de concentración de 1.0 a 8.0 ng mg en peso seco (DW), y tiene un límite validado de cuantificación (LOQ) en todos los tejidos de fríjol soya de 1.0 ng/mg DW, y un límite de detección (LOD) en todo el tejido de frijol soya de 0.5 ng/mg DW. Se recuperó la proteína AAD-12 en niveles aceptables de todos los tejidos. El ensayo validado es específico para la proteína AAD-12, cuando se compara con las proteínas no objetivo probadas en estudios previos. La cuantificación de proteína AAD-12 en tejidos de frijol soya, se recomienda una dilución de 2X o mayor para raíz, se recomienda una dilución de 5X o mayor para hoja V5, hoja V10 y forraje, y se recomienda una dilución de 10X o mayor para la semilla. Además, la proteína AAD-12 fue extractada de manera eficiente de todos los tejidos de frijol soya. El ensayo mostró tener una exactitud y precisión aceptables, y no se observaron resultados positivos falsos o negativos falsos debajo del LOD objetivo. Este método ELISA AAD-12, ha demostrado ser adecuado para medidas cuantitativas de la proteína AAD-12 en tejido de frijol soya.

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo monoclonal que enlaza específicamente a una enzima de dioxigenasa de ariloxialcanoato (AAD-12), seleccionado del grupo de anticuerpos que consisten en 539B181.2, 539B470.2, 539B489.2, 539B304.2 y 539B478.2.

2. El anticuerpo monoclonal tal como se describe en la reivindicación 1, producido por el hibridoma que tiene una designación de 539B 181.2.

3. El anticuerpo monoclonal tal como se describe en la reivindicación 1, producido por el hibridoma que tiene una designación de 539B470.2.

4. El anticuerpo monoclonal tal como se describe en la reivindicación 1, producido por el hibridoma que tiene una designación de 539B498.2.

5. El anticuerpo monoclonal tal como se describe en la reivindicación 1, producido por el hibridoma que tiene una designación de 539B304.2.

6. El anticuerpo monoclonal tal como se describe en la reivindicación 1, producido por el hibridoma que tiene una designación de 539B478.2.

7. Una línea de célula de hibridoma que produce un anticuerpo monoclonal tal como se describe en la reivindicación 1, caracterizada porque está depositada en la Recolección de Cultivo de Tipo Americano (ATCC) bajo los Números de Acceso seleccionados del «grupo que consiste en PTA-10919, PTA-10920, PTA-10921, PTA-10922 y PTA-10923.

8. El hibridoma tal como se describe en la reivindicación 7, depositado bajo el Número de Acceso ATCC PTA-10919.

9. El hibridoma tal como se describe en la reivindicación 7, depositado bajo el Número de Acceso ATCC PTA-10920.

10. El hibridoma tal como se describe en la reivindicación 7, depositado bajo el Número de Acceso ATCC PTA-10921.

11. El hibridoma tal como se describe en la reivindicación 7, depositado bajo el Número de Acceso ATCC PTA-10922.

12. El hibridoma tal como se describe en la reivindicación 7, depositado bajo el Número de Acceso ATCC PTA-10923.

13. Un método para identificar la presencia de una enzima AAD-12, en donde el método comprende: a) inmovilizar un primer anticuerpo monoclonal tal como se describe en la reivindicación 1 en una superficie de ensayo, posteriormente lavar la superficie de ensayo. b) contactar la superficie de ensayo con un líquido que se sospecha contiene AAD-12 durante un período de tiempo suficiente para permitir el enlace después de lavar la superficie de ensayo; c) contactar la superficie de ensayo con un segundo anticuerpo diferente tal como se describe en la reivindicación 1, conjugado para un grupo de reporte durante un período de tiempo suficiente para permitir el enlace del segundo anticuerpo monoclonal conjugado, posteriormente lavar la superficie de ensayo; y d) detectar la presencia o ausencia del grupo de reporte.

14. Un método para la determinación cuantitativa de una enzima AAD-12, en donde el método comprende: a) inmovilizar un antisuero AAD-12 en una superficie de ensayo; b) contactar la superficie de ensayo con un líquido que se sospecha contiene AAD-12 durante un período de tiempo suficiente para permitir el enlace, posteriormente lavar la superficie de enlace; c) contactar la superficie de ensayo con un segunda anticuerpo diferente tal como se describe en la reivindicación 1, conjugado para un grupo de reporte durante un período de tiempo suficiente para permitir el enlace del segundo anticuerpo monoclonal conjugado, posteriormente lavar la superficie de ensayo; y d) cuantificar la presencia del grupo de reporte, mediante comparación con una curva de calibración.

15. El método tal como se describe en la reivindicación caracterizado porque el anticuerpo monoclonal conjugado B470.2.