MX2013012242A

MX2013012242A - Proteina de fusion anticancerigena.

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Publication number: MX2013012242A
Application number: MX2013012242A
Authority: MX
Inventors: Sebastian Dominik Pawlak; Bartlomiej Maciej Zerek; Piotr Kamil Rózga; Jerzy Szsczepan Pieczykolan; Urszula Marta Szawlowska
Original assignee: Adamed Sp Zoo
Priority date: 2011-04-19
Filing date: 2012-04-19
Publication date: 2014-01-23
Also published as: EA201391546A1; BR112013025975A2; AU2012244654A1; WO2012143477A3; KR20140019828A; CA2832152A1; US20140031283A1; IL228731A0; EP2699592A2; WO2012143477A2; CN103562220A; ZA201308597B; PL394618A1; JP2014513943A; NZ617353A; PH12013501970A1; SG193925A1

Abstract

Una proteína de fusión que comprende el dominio (a) que es el fragmento funcional de una secuencia de proteína hTRAIL, fragmento el cual empieza con un aminoácido en una posición no menor que hTRAIL95, o un homólogo de dicho fragmento funcional que tiene por lo menos 70% de identidad de secuencia, y al menos un dominio (b) que es la secuencia de un péptido efector que tiene actividad anti-proliferativa contra células tumorales, en donde la secuencia del dominio (b) está unida al C-terminal o al N-terminal del dominio (a); la proteína de fusión se puede uasr para el tratamiento de enfermedades cancerosas.

Description

PROTEÍNA DE FUSIÓN ANTICANCERÍGENA MEMORIA DESCRIPTIVA La invención se refiere al campo de las proteínas de fusión terapéuticas, especialmente proteínas de fusión recombinante. Más concretamente, la invención se refiere a proteínas de fusión que comprenden el fragmento de una secuencia de la proteína soluble humana TRAIL y una secuencia de un péptido antiproliferativo, composiciones farmacéuticas que las contienen, su uso en terapia, especialmente como agentes anticancerígenos y a las secuencias de polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión, vectores de expresión que contienen las secuencias de polinucleótidos y las células hospederas que contienen estos vectores de expresión.

La proteína TRAIL, un miembro de la familia de las citoquinas (Ligando de inducción de apoptosis relacionada con el Factor de Necrosis Tumoral), también conocido como Apo2L (Apo2-ligando), es un potente activador de la apoptosis en las células tumorales y en células infectadas por un virus. TRAIL es un ligando que se presenta naturalmente en el cuerpo. La proteína TRAIL, su secuencia de aminoácidos, secuencias de codificación de ADN y sistemas de expresión de proteínas se describieron por primera vez en EP0835305A1.

La proteína TRAIL ejerce su actividad anticancerígena mediante la unión a los receptores 1 y 2 TRAIL de la superficie pro-apoptótica (TRAIL-R1/R2) y activación posterior de estos receptores. Estos receptores, también conocidos como DR4 y DR5 (receptor 4 de muerte y receptor 5 de muerte), son miembros de la familia del receptor TNF y se sobreexpresan por diferentes tipos de células cancerígenas. La activación de estos receptores puede inducir la trayectoria de señalización externa de la apoptosis independiente del gen p53 supresor, que por la caspasa-8 activada lleva a la activación de caspasas ejecutivas y asi a la degradación de ácidos nucleicos. La caspasa-8 liberada con la activación de TRAIL también puede causar la liberación de la proteína Bid y así la activación indirecta de trayectoria mitocondrial, la proteína Bid siendo trasladada a la mitocondria, donde estimula la liberación del citocromo C, así amplificando indirectamente la señal apoptótica de los receptores de muerte.

La TRAIL actúa selectivamente en células de tumor esencialmente sin inducir apoptosis en las células sanas que son resistentes a esta proteína. Por lo tanto, el enorme potencial de TRAIL se reconoció como un agente anticancerígeno que actúa en un amplio intervalo de diferentes tipos de células tumorales, incluyendo malignidades hematológicas y tumores sólidos, mientras deteriora las células normales y ejerce efectos secundarios potencialmente relativamente menores.

La proteína TRAIL es una proteína de membrana de tipo II con la longitud de 281 aminoácidos y su región extracelular compuesta por residuos de aminoácidos 1 14-281 en una escisión por proteasas forma una molécula sTRAIL soluble de tamaño de 20 kDa, que también es biológicamente activa. Ambas formas TRAIL y sTRAIL son capaces de activar la apoptosis a través de la interacción con los receptores de TRAIL presentes en las células diana. La fuerte actividad antitumor y muy baja toxicidad sistémica de la parte soluble de la molécula de TRAIL fue demostrada utilizando pruebas de líneas celulares. También, estudios clínicos humanos con la TRAIL soluble, humana, recombinante (rhTRAIL) que tiene la secuencia de aminoácidos que corresponde a los aminoácidos 1 14-281 de hTRAIL, conocido bajo el nombre de INN dulanermina, mostró también su buena tolerancia y ausencia de toxicidad limitante de dosis.

El fragmento de TRAIL más corto que 1 14-281 es también capaz de unirse a los receptores de muerte de membrana e inducir la apoptosis a través de estos receptores, como fue reportado recientemente para el mutante permutado circularmente recombinante de 122-281 hTRAIL por ejemplo en EP 1 688 498.

Los efectos tóxicos de la proteína TRAIL recombinante en células de hígado reportados a la fecha parecieron estar asociados con la presencia de modificación, es decir etiquetas de polihistidina, mientras el TRAIL sin etiqueta no mostró toxicidad sistémica.

Sin embargo, en el transcurso de investigación y desarrollo adicional pareció que muchas células de cáncer también mostraron resistencia primaria o adquirida a la TRAIL (vea por ejemplo WO2007/022214). Aunque el mecanismo de resistencia de la TRAIL no ha sido comprendido completamente, se cree que puede manifestarse a sí mismo en niveles diferentes de la trayectoria de apoptosis inducida por la TRAIL, variando del nivel de los receptores de superficie celular a las caspasas ejecutivas dentro de la trayectoria de señalización. Esta resistencia limita la utilidad de TRAIL como un agente contra el cáncer.

Además, en los ensayos clínicos en pacientes la eficacia real de TRAIL como una monoterapia resultó ser baja. Para superar esta baja eficiencia y la resistencia de los tumores a TRAIL, varias terapias de combinación con agentes radio- y quimioterapéuticos fueron diseñados, lo que resulta en un efecto apoptótico sinergístico (WO2009/002947; A. Almasan and A. Ashkenazi, Cytokine Growth Factor Reviews 14 (2003) 337-348; RK Srivastava, Neoplasis, Vol 3, No. 6, 2001 , 535-546, Soria JC et al., J. Clin. Oncology, Vol 28, No. 9 (2010), p. 1527-1533). El uso de rhTRAIL para el tratamiento de cáncer en combinación con agentes quimioterapéuticos convencionales seleccionados (paclitaxel, carboplatino) y anticuerpos monoclonales anti-VEGF se describen en WO2009/140469. Sin embargo, tal combinación implica necesariamente deficiencias bien conocidas de radioterapia o quimioterapia convencional.

Por otra parte, el problema relacionado con la terapia TRAIL ha demostrado ser su baja estabilidad y eliminación rápida del cuerpo después de la administración.

La proteína de fusión construida que contiene las secuencias de vasostatina inhibidor de la angiogénesis y TRAIL1 14-281 enlazada con un enlazador del sitio de escisión de metaloproteasa fue descrita exhibiendo un efecto de inducción de apoptosis en las células tumorales por A.l. Guo et al in Chínese Journal of Biochemistry and Molecular Biology 2008, vol. 24(10), 925-930.

La proteina de fusión construida que contiene secuencias de inhibidor de angiogénesis calreticulina y TRAIL 114-281 se describió exhibiendo un efecto de inducción de apoptosis en las células tumorales en CN1609124A.

CN 1256347C revela la proteína de fusión compuesta de kininogeno D5 60-148 y TRAII 114-281.

La proteína de fusión construida que contiene secuencias de inhibidor kininostatina, vastostatina y canstatina de angiogénesis unida a N- y C-terminal de TRAIL114-281 enlazado con el enlazador de codificación de GGGSGGSG se mencionan en Feng Feng-Yi "Phase I and Clinical Trial of Rh-Apo2L and Apo2L-Related Experimental Study", Ph.D. degree thesis, Chínese Peking Union Medical, 2006-10-01 ; http://www.lw23.com/lunwen_957708432.

La proteína de fusión construida que contiene secuencias tumstatina 183-230 de un inhibidor de angiogénesis tumstatina y TRAIL114-281 se describió exhibiendo inducción de apoptosis de células cancerígenas pancreáticas por N.Ren et al in Academic Journal of Second Military Medical University 2008, vol. 28(5), 676-478.

US2005/244370 y WO2004/035794 correspondiente describen el constructo de TRAIL95-281 como un dominio efector enlazado por un enlazador de péptido con parte extracelular de otro miembro de ligandos de la familia TNF CD40 como un dominio de unión de superficie celular. Se establece que la activación del constructo es a través del enlace de su parte CD40.

Shin J.N. et al., Experimental Cell Research, vol. 312, no. 19, 2006, p. 3892-3898), describieron proteínas de fusión construidas de sTRAIL e IL-18 con un sitio de escisión de metaloproteinasa de matriz introducido en el sitio de conexión como una proforma del TRAIL que puede ser activado y liberado en las áreas donde las metaloproteinasas se producen patológicamente, como el entorno del tumor. También se produjeron constructos de sTRAIL con IFN-gamma y endostatina pero no fueron caracterizados ni probados.

Uno de los objetivos en el tratamiento del cáncer es la inhibición de la proliferación de células tumorales (crecimiento). Las células con fenotipo maligno adquirido (debido a la mutación, las actividades de carcinógenos o trastornos de la reparación del ADN) pierden su capacidad para la diferenciación adecuada y adquieran la capacidad de infiltrarse. Los clones de células tumorales transcriben principalmente los genes que se asocian a un crecimiento rápido e invasividad, y las células tumorales se caracterizan, entre otros, por los disturbios en el control de la proliferación.

Es conocido el efecto beneficioso de la inhibición de la proliferación de células tumorales en el tratamiento del cáncer. Se han hecho intentos del uso clínico de las sustancias que inhiben o regulan el proceso de proliferación, tanto como una terapia contra el cáncer y una terapia contra el cáncer adjunto.

La inhibición de la proliferación celular tumoral puede lograrse de varias maneras, tal como por ejemplo como se describe en la revisión del artículo "Hallmarks of Cáncer: The Next Generation" (Cell, 2011 , 646-674). Existen proteínas antiproliferativas conocidas utilizadas en terapias contra el cáncer - como trastuzumab - un anticuerpo monoclonal que bloquea HER2 usado en pacientes con cáncer de mama con sobreexpresión de HER2. También se conoce una actividad antiproliferativa de muchas proteínas que todavía no se han encontrado que sean clínicamente útiles en el tratamiento de los cánceres humanos.

Por ejemplo, la actividad antiproliferativa de fetoproteína humana y sus fragmentos es conocida. Estudios detallados de las propiedades de los dominios de la proteína individual revelaron la presencia de estructuras localizadas dentro de la región de 34-aminoácidos que es responsable de la inhibición del crecimiento de las células dependientes de estradiol (Mizejewski et al., Mol. Cell. Endocrinol., 18:15-23, 1996). Un carboxílico terminal de esta región, que comprende ocho aminoácidos consecutivos, es el fragmento más importante y es capaz de inhibir el crecimiento de las células cancerosas (Mizejewski G., Cáncer Biotherapy & Radiopharmaceuticals, 22: 73-98, 2007).

Propiedades antiproliferativas de la proteína p21 AF1 también son conocidas. Se sintetizaron los péptidos cortos basados en la secuencia de aminoácidos de p21WAF1 ejerciendo potencial comparable para enlazar e inhibir el complejo D1-CDK4 y así detener el ciclo celular en fase G1 (Ball et al, Current Biology, 7:71-80, 1996).

También se sabe que la proteína DOC-2/DAB2 (expresada diferencialmente en cáncer-2 de ovario/2 discapacitados) es un potente inhibidor de la proliferación de las células de cáncer de próstata. Actúa suprimiendo las rutas de transmisión de MAPK quinasa al unirse a un número de sus elementos respectivos sub (c-Src, Grb2) (Zhou et al, J Biol Chem 276: 27793-27798, 2001 , Zhou et al, J Biol Chem, 278: 6936-6941 , 2003). Su componente esencial es un dominio rico en prolina presente en el carboxi-terminal DOC-2/DAB2 (Zhou et al., Cáncer Res, 66: 8954 - 8958, 2006).

La inhibición de ciclina-CDK4 de unión por la proteína p16 o un fragmento del mismo comúnmente se considera como un supresor de neoplasia (Fahraeus et al, Oncogene, 16: 587-596, 1998).

También hay una influencia conocida de ERK quinasa en el grado de proliferación de células tumorales (Handra-Luca A., et al, American Journal of Pathology. 2003; 163: 957-967). Es sabido que un fragmento de péptido de la proteína MEK-1 es un sustrato de ERK quinasa, y puede servir como su inhibidor selectivo (Bradley R. et al, The Journal of Biological Chemistry, 2002, 277, 8741 -8748).

También se sabe que la inhibición selectiva de la actividad de akt quinasa lleva a la inhibición de la proliferación celular y muerte celular tumoral (Hennessy B.T, et al, Nature Reviews Drug Discovery 2005, 4, 988 -1004).

También existen propiedades antiproliferativas conocidas de Phe-Trp-Leu-Arg-Phe-Thr hexapéptido, que consta en la inhibición de la asociación de E2F y DP e inhibición directa de E2F de unión a ADN (Janin Y. L, Amino Acids, 25: 1 - 40, 2003).

La inhibición de depolimerización de fibras de tubulina, previene la separación de cromatidas hija en mitosis y causar trastornos en la migración de cromosomas también resulta en trastornos del proceso de proliferación (Xiao et al., J. Cell Mol. Med., 2010).

El efecto sinergístico de la proteína melitina con la actividad de la proteína TRAIL se mostró (Wang et al., JBC Journal of Biological Chemistry, 284, 3804-3813).

La inhibición de la actividad de telomerasa y acumulación en la membrana mitocondrial por las proteínas que son fragmentos de defensina de abeja y sus análogos también se muestra (Iwasaki et al., Biosci. Biotechnol. Biochem., 73:683-687, 2009).

También se sabe que las lasioglosinas, péptidos cargados positivamente aislados del veneno de abeja Lasioglossum laticeps, ejerce actividad citotóxica contra las células tumorales (Cerovsky et al., Chembiochem, 2009, 10: 2089-2099).

También se sabe que la inhibición de interacciones RasGAP -Aurora B, por ejemplo por aptameros de proteína del dominio SH3, ejercen influencia inhibidora en la proliferación de células cancerígenas (Pamonsinlapatham P. et al., PLoS ONE 3 (8): e2902, 2008).

El impacto de la inhibición de las quinasas dependientes del ciclo de la célula, por ejemplo la quinasa CDK 4, por ejemplo con el péptido p16, que es el fragmento del producto génico p16INK4A, es conocido también (Derossi D, et al., J Biol Chem. 269:10444-10450, 1994).

Son también conocidas las propiedades antiproliferativas de la proteína Pep27, la unión de la cual por los receptores celulares resulta en la fosforilación de una quinasa histidina, que provoca la desfosforilación del factor efector VncR y consecuentemente conduce a la inhibición de las vías autocatalíticas y muerte celular (Dong Gun Lee et al., Cáncer Cell International 2005, 5:21 ).

Muchas de las sustancias antiproliferativas están actualmente en diferentes etapas de las investigaciones, incluyendo ensayos clínicos. Sin embargo, las terapias conocidas destinadas a inhibir la proliferación tienen muchas desventajas bien conocidas. Por ejemplo, hay efectos adversos tales como complicaciones tromboembólicas, hemoptisis y sangrado de los pulmones. Muchos fármacos antiproliferativos demuestran también escasa biodisponibilidad y efectos secundarios tóxicos.

La seguridad de los fármacos anti-antiproliferativos tiene una importancia especial debido a un uso prolongado y la falta de selectividad de la terapia. Una fuerte necesidad de un agente terapéutico eficaz y la naturaleza de las enfermedades oncológicas requieren un procedimiento de registro simplificado para tal grupo de fármacos, por lo tanto es imposible conocer todos los efectos secundarios y las desventajas del fármaco. Aunque, contrariamente a la quimioterapia, que se dirigen a todas las células de proliferación rápida, fármacos antiproliferativos de péptido están dirigidos a las proteínas quinasas y fosfatasas responsables de desencadenar cascadas de fosforilación y desfosforilación de proteínas o en sus sustratos u otras proteínas que participan en el curso del ciclo celular, que se traduce en una reducción de la toxicidad del tratamiento. Sin embargo, se desconoce aún la terapia anticancerigena dirigida a inhibir la proliferación garantizando selectividad contra las células del tumor. Por lo tanto hay una necesidad de nuevos tratamientos contra el cáncer antiproliferativas con mejores características toxicológicas.

La presente invención proporciona una solución de este problema proporcionando proteínas de fusión novedosas que comprenden un dominio derivado de TRAIL y un dominio de péptido corto efector que tiene actividad antiproliferativa y no incluye fragmentos TRAIL, en donde el péptido efector potencializa o complementa la acción de TRAIL.

Las proteínas según la invención se dirigen selectivamente a las células cancerosas, donde los elementos de la proteína ejercen sus efectos, en particular el péptido efector inhibe la proliferación de células del tumor. La entrega de las proteínas de la invención en el entorno del tumor permite minimizar la toxicidad contra las células sanas en el cuerpo, así como los efectos secundarios y reducir la frecuencia de la administración. Además, la terapia dirigida con el uso de proteínas según la invención permite evitar el problema de la baja eficiencia de las terapias antiproliferativas no específicas conocidas previamente causadas por una alta toxicidad y por la necesidad de administrar dosis altas.

Resultó que en muchos casos las proteínas de fusión de la invención son más potentes que TRAIL soluble y sus variantes incluyendo un fragmento de la secuencia. Hasta ahora, los péptidos efectores conocidos utilizados en la proteína de fusión de la invención no se han utilizado en la medicina como tal por la cinética desfavorable, rápida degradación por proteasas no específicas o acumulación en el cuerpo causada por la falta de secuencia apropiada de activación de las rutas, que es necesario para permitir la correcta acción del péptido efector en el sitio objetivo. La incorporación de los péptidos efectores en la proteína de fusión permite su entrega selectiva al sitio donde su acción es deseable. Además, la unión del péptido efector aumenta la masa de la proteína, resultando en la vida media prolongada y mayor retención de proteína en el tumor y su mayor eficacia. Además, en muchos casos, las proteínas de fusión novedosas también superan la resistencia natural o inducida a TRAIL.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La invención ahora se describirá en detalle con referencia a los dibujos.

La figura 1 presenta una estructura esquemática de las proteínas de fusión de la invención según el ejemplo 1 , ejemplo 2, ejemplo 3, ejemplo 4 y ejemplo 5.

La figura 2 presenta una estructura esquemática de las proteínas de fusión de la invención según el ejemplo 6, ejemplo 7, ejemplo 8, ejemplo 8A, Ej. 9 y ejemplo 10.

La figura 3 presenta una estructura esquemática de las proteínas de fusión de la invención según el ejemplo 1 1 , ejemplo 12, ejemplo 13, ejemplo 14, y ejemplo 15.

La figura 4 presenta una estructura esquemática de las proteínas de fusión de la invención según el ejemplo 16, ejemplo 17, ejemplo 18, ejemplo 19, y ejemplo 20.

La figura 5 presenta una estructura esquemática de las proteínas de fusión de la invención según el ejemplo 21 , ejemplo 22, ejemplo 23, ejemplo 24, y ejemplo 25.

La figura 6A y 6B muestran los espectros de dicrosimo circular para rhTRAIL95-281 y proteínas de fusión de Ej. 1a y Ej. 2a (Figura 6A), y Ej. 8a y rhTRAIL114-281 (Figura 6B) expresado en elipticidad específica.

La figura 7 presenta los cambios de volumen del tumor (% dé etapa inicial) en ratones Crl:CD1-Foxn1 nu cargados con cáncer de colon HCT1 16 tratado con proteína de fusión de la invención del Ej. 2a en comparación con rhTRAIL 114-281 La figura 8 presenta los valores de inhibición del crecimiento tumoral (%TGI) en ratones Crl:CD1 -Foxn1nu 1 cargados con cáncer de colon HCT1 16 tratados con la proteína de fusión de la invención de Ej. 2a en comparación con rhTRAIL114-281 .

La figura 9 presenta los cambios de volumen del tumor (% de etapa inicial) en ratones Crl:CD1-Foxn1 nu cargados con cáncer de pulmón NCI-H460-Luc2 tratados con la proteina de fusión de la invención del Ej 2a en comparación con rhTRAIL114-281.

La figura 10 presenta los valores de inhibición del crecimiento del tumor (%TGI) en ratones Crl:CD1-Foxrj7nu 1 cargados con el cáncer de pulmón NCI-H460-Luc2 tratados con la proteina de fusión de la invención del Ej. 2a en comparación con rhTRAIL1 14-281.

La figura 1 1 presenta los cambios del volumen del tumor(% de la etapa inicial) en ratones Crl:SHO-PrkdcscldHrhr cargadas con cáncer de colon HCT1 16 tratados con la proteina de fusión de la invención del Ej. 8a en comparación con rhTRAIL114-281.

La figura 12 presenta los valores de inhibición de crecimiento tumoral (%TGI) en ratones Crl:SHO-PrkdcscidHrhr cargados con cáncer de colon HCT1 16 tratados con la proteína de fusión de la invención del Ej. 8a en comparación con rhTRAIL114-281.

La figura 1 1 A presenta los cambios del volumen del tumor (% de etapa inicial) en ratones Crl:SHO-Prkdcsc,dHrhr cargados con cáncer de colon HCT1 16 tratados con la proteina de fusión de la invención del Ej. 8b en comparación con rhTRAIL114-281.

La figura 12A presenta los valores de inhibición del crecimiento tumoral (%TGI) en ratones Crl:SHO-PrkdcscidHrhr cargados con cáncer de colon HCT1 16 tratados con la proteína de fusión de la invención del Ej. 8b en comparación con rhTRAIL114-281.

La figura 13 presenta los cambios del volumen del tumor(% de la etapa inicial) en ratones Crl:SHO-Prkdcsc,dHrhr cargados con cáncer de colon SW620 tratados con la proteína de fusión de la invención del Ej. 8b en comparación con rhTRAIL114-281.

La figura 14 presenta los valores de inhibición de crecimiento tumoral (%TGI) en ratonesCrl:SHO-PrkdcscidHrhr cargados con cáncer decolon SW620 tratados con la proteína de fusión de la invención del Ej. 8b en comparación con rhTRAIL1 14-281.

La figura 15 presenta los cambios del volumen del tumor (% de la etapa inicial) en ratones Crl:SHO-PrkdcscldHrhr cargados con cáncer de colon Colo205 tratados con la proteína de fusión de la invención del Ej. 8b en comparación con rhTRAIL114-281.

La figura 16 presenta los valores de inhibición de crecimiento del tumor (%TGI) en ratones Crl:SHO-PrkdcscldHrhr cargados con cáncer de colon Colo205 tratados con la proteína de fusión de la invención del Ej. 8 en comparación con rhTRAIL114-281.

La figura 17 presenta los cambios del volumen del tumor (% de etapa inicial) en ratones Crl:SHO-PrkdcscldHrhr cargados con cáncer de hígado HepG2 tratados con la proteína de fusión de la invención del Ej. 8b en comparación con rhTRAIL114-281.

La figura 18 presenta los valores de inhibición del crecimiento del tumor (%TGI) en ratones Crl:SHO-PrkdcscidHrhr cargados con cáncer de hígado HepG2 tratados con la proteína de fusión de la invención del Ej. 8b en comparación con rhTRAIL1 14-281.

La figura 19 presenta los cambios del volumen del tumor (% de etapa inicial en ratones Crl:SHO-PrkdcscldHrhr cargados con cáncer de hígado NCI-H460 tratados con la proteína de fusión de la invención del Ej. 8b en comparación con rhTRAIL114-281.

La figura 20 presenta los valores de inhibición del crecimiento del tumor (%TGI) en ratones Crl:SHO-PrkdcscldHrhr cargados con cáncer de pulmón NCI-H460 tratados con la proteína de fusión de la invención del Ej. 8b en comparación con rhTRAIL114-281.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La invención se refiere a una proteína de fusión que comprende: - el dominio (a) que es el fragmento funcional de una secuencia de proteína hTRAIL soluble, dicho fragmento empieza con un aminoácido en una posición no menor que hTRAIL95, o un homólogo de dicho fragmento funcional que tiene por lo menos 70% de identidad de secuencia, y al menos un dominio (b) que es la secuencia de un péptido efector que tiene actividad anti-proliferativa contra las células tumorales, en donde la secuencia del dominio (b) está unida al C-terminal y/o N-terminal del dominio (a).

El término "el fragmento soluble funcional de una secuencia de hTRAIL soluble" debe ser comprendido como denotando cualquiera de tal fragmento de hTRAIL soluble que es capaz de inducir la señal apoptótica en células mamíferas con la unión a sus receptores en la superficie de las células.

También será apreciado por una persona experta que la existencia de por lo menos 70% de homología de la secuencia de TRAIL es conocida en la técnica.

Debe ser comprendido que el dominio (b) del péptido efector en la proteína de fusión de la invención no es ni la proteína hTRAIL ni una parte o fragmento de proteína hTRAIL.

El término "péptido" de acuerdo con la invención deben ser comprendido como una molécula construida de la pluralidad de aminoácidos enlazados por medio de un enlace peptidico. Así, el término "péptido" según la invención incluye oligopéptidos, polipéptidos y proteínas.

En la presente invención se presentarán las secuencias de aminoácidos de los péptidos de una manera convencional adoptada en la técnica en la dirección del N-terminal (N-terminal) del péptido hacia su C-terminal (C-terminal). Cualquier secuencia asi tendrá su N-terminal en el lado izquierdo y el C-terminal en el lado derecho de su presentación lineal.

La proteína de fusión de la invención incorpora al menos un dominio (b) del péptido efector, unido en el C-terminal y/o en el extremo N-terminal de dominio (a).

En una modalidad particular, el dominio (a) es el fragmento de la secuencia hTRAIL, comenzando con un aminoácido del intervalo de hTRAIL95 a hTRAIL121 , inclusivo y terminando con el aminoácido hTRAIL 281.

En particular, el dominio (a) puede ser seleccionado del grupo que consiste de secuencias correspondientes a hTRAIL95-281 , hTRAIL1 14-281 , hTRAIL1 19-281 , hTRAIL120-281 -hTRAIL121-281. Será evidente para aquellos especializados en la técnica que hTRAIL95-281 , hTRAIL114-281, hTRAIL119-281 y hTRAILI 20-281 -hTRAILI 21-281 representan un fragmento de la proleína humana TRAIL a partir del aminoácido marcado con el número 95, 114, 119, 120 y 121 , respectivamente y terminando con el último aminoácido 281 , en la conocida secuencia de hTRAIL publicado en GenBank bajo el No. de acceso P50591.

En otra modalidad particular, el dominio (a) es un homólogo del fragmento funcional de la secuencia de proteína soluble hTRAIL iniciando en la posición del aminoácido no inferior a hTRAIL95 y terminando en el aminoácido hTRAIL281 , la secuencia de la cual es al menos en 70%, preferiblemente en un 85%, idéntica a la secuencia original.

En variantes específicas de esta modalidad el dominio (a) es un homólogo del fragmento seleccionado del grupo que consiste de secuencias correspondientes a hTRAIL95-281 , hTRAIL114-281 -hTRAIL1 16-281 , hTRAIL120-281 y hTRAIL121-281.

Debe entenderse que un homólogo del fragmento hTRAIL es una variación/ modificación de la secuencia de aminoácidos de este fragmento, en donde al menos un aminoácido es cambiante, incluyendo 1 aminoácido, 2 aminoácidos, 3 aminoácidos, 4 aminoácidos, 5 aminoácidos, 6 aminoácidos y no más de 15% de los aminoácidos, y en donde un fragmento de la secuencia modificada ha preservado la funcionalidad de la secuencia hTRAIL, es decir, la capacidad de unión a los receptores celulares de superficie de muerte e induciendo apoptosis en células de mamíferos. Modificación de la secuencia del aminoácido puede incluir, por ejemplo, sustitución, supresión o adición de aminoácidos. La modificación de la secuencia de aminoácidos puede incluir, por ejemplo, la sustitución, la supresión, y/o la adición de aminoácidos.

Preferiblemente, el homólogo del fragmento de hTRAIL que tiene la secuencia modificada muestra afinidad modificada a los receptores DR4 de muerte (TRAIL-R1 ) o DR5 (TRAIL-R2) en comparación con el fragmento nativo de hTRAIL.

El término "afinidad modificada" se refiere a la afinidad aumentada y/o la afinidad con selectividad alterada del receptor.

Preferiblemente, el homólogo del fragmento de hTRAIL que tiene la secuencia modificada muestra una secuencia de afinidad aumentada a los receptores DR4 de muerte y DR5 comparado al fragmento nativo de hTRAIL.

Especialmente preferiblemente, el homólogo del fragmento de hTRAIL que tiene la secuencia modificada muestra una afinidad aumentada al receptor DR5 de muerte en comparación con el receptor DR4 de muerte, es decir una selectividad DR5/DR4 aumentada.

También preferiblemente, el homólogo del fragmento de hTRAIL que tiene la secuencia modificada que muestra una selectividad aumentada hacia los receptores DR4 de muerte y/o DR5 en relación con la afinidad hacia los receptores DR1 (TRAIL-R3) y/o DR2 (TRAIL-R4).

Las modificaciones de hTRAIL que tienen como resultado una afinidad y/o selectividad aumentada hacia los receptores de muerte DR4 y DR5 son conocidos por los expertos en la técnica, por ejemplo de la publicación Tur V, van der Sloot AM, Reís CR, Szegezdi E, Cool RH, Samali A, Serrano L, Quax WJ.. DR4-selective tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) variants obtained by structure-based design. J. Biol. Chem. 2008 Jul 18;283(29):20560-8, que describe la mutación de D218H que tiene selectividad aumentada hacia DR4, o Gasparian ME, Chernyak BV, Dolgikh DA, Yagolovich AV, Popova EN, Sycheva AM, Moshkovskii SA, Kirpichnikov MP. Generation of new TRAIL mutants DR5-A and DR5-B with improved selectivity to death receptor 5, Apoptosis: 2009 Jun;14(6):778-87, que describe la mutación de D269H que tiene una afinidad reducida hacia DR4. Los mutantes de hTRAIL que tienen como resultado una afinidad aumentada hacia un receptor seleccionado de DR4 y DR5 comparado con los receptores DR1 y DR2 y una afinidad aumentada hacia el receptor DR5 en comparación con DR4 también son descritos en WO2009077857 y WO2009066174.

Las mutaciones adecuadas son una o más mutaciones en las posiciones de hTRAL nativo seleccionado del grupo formado por aminoácidos 131 , 149, 159, 193, 199, 201 , 204, 204, 212, 215, 218 y 251 , en particular, las mutaciones que implican la sustitución de un aminoácido con un aminoácido básico como la lisina, histidina o arginina o aminoácidos como el ácido aspargico o ácido glutámico. Particularmente una o más mutaciones seleccionadas del grupo que consiste en G131 R, G131 K, R149I, R149M, R149N, R149K, S159R, Q193H, Q193K, N199H, N199R, K201H, K201R, K204E, K204D, K204L, K204Y, K212R, S215E, S215H, S215K, S215D, D218Y, D218H, K251 D, K251 E y K251Q, como se describe en WO2009066174, pueden ser especificadas.

Las mutaciones adecuadas son también una o más mutaciones en las posiciones de hTRAIL nativo seleccionado del grupo formado por aminoácidos 195, 269 y 214, particularmente las mutaciones que implican la sustitución de un aminoácido con un aminoácido básico como la lisina, histidina o arginina. Especialmente una o más mutaciones seleccionadas del grupo que consiste en D269H, E195R, y T214R, como es descrito en WO2009077857, pueden ser especificadas.

En una modalidad particular, se selecciona el dominio (a) que es un homólogo del fragmento de hTRAIL de mutante D218H de la secuencia nativa TRAIL, como se describe en WO2009066174, o el mutante Y189N R191 K-Q193R-H264R-I266R-D269H de la secuencia nativa TRAIL, tal corno se describe en Gasparian ME et al. Generation of new TRAIL mutants DR5-A and DR5-B with improved selectivity to death receptor 5, Apoptosis. 2009 Jun; 14(6): 778-87.

Según la invención, la proteína de fusión comprende como el péptido efector un péptido anti-proliferativo, que tiene actividad anti-proliferativa contra células tumorales, es decir, efecto inhibitorio sobre la proliferación de células de tumor.

Debe entenderse que "la proliferación de células de tumor" se refiere al paso de la división celular y el crecimiento en un ciclo de la célula del tumor y el péptido efector tiene la actividad anti-proliferativa en relación con el crecimiento de las células tumorales como tal.

Por lo tanto, la "proliferación de células del tumor" que inhiben el efecto no abarca la inhibicióin de la proliferación de células endoteliales como un paso de la angiogénesis. Los péptidos efectores tienen actividad anti-angiogénica, es decir, actividad de inhibición de crecimiento de las células endoteliales son por lo tanto excluidas del ámbito de los péptidos efectores según la invención.

Específicamente, los péptidos efectores seleccionados del grupo que consiste de calreticulina, tumstatina 183-230, kinínógeno D5, vasostatina, kininostatina y canstatina no son considerados por la invención.

Según la invención, el péptido efector puede ejercer su efecto antiproliferativo contra células tumorales de diferentes maneras, como por ejemplo seleccionado del grupo siguiente: supresión de las rutas de transmisión de MAPK quinasas (proteínas quinasas activadas por mitógenos), por ejemplo mediante el bloqueo de receptor FGF-2 (receptor 2 del factor de crecimiento básico del fibroblasto, también conocido como bFGF, FGF2 o receptores de FGF-ß) o péptido DD2 derivado de la proteína DAB2; - inhibición del crecimiento de las células dependientes de estradiol, por ejemplo por fetoproteína humana o su fragmento; - detener el ciclo celular en la fase G1 , como por la inhibición de complejo de ciclina D1-CDK4 (quinasa 4 dependiente de ciclina); - ruptura enzimática de la arginina, como por ejemplo por arginina deiminasa de Mycoplasma arginini; inhibición de las quinasas de ciclo celular, como la inhibición de CDK4/5/6 quinasa (quinasas ciclina-dependientes), o inhibición de la activación de ERK quinasas (quinasas reguladas con la señal extracelular) o inhibición de co-activación de Akt quinasa (también conocida como proteina quinasa B (PKB), una proteina quinasa específica de serina/treonina); inhibición del factor de transcripción E2F (factores de transcripción (TF) en eucariotas superiores) en asociación con las proteínas DP (también conocida como factor de transcripción DP, socio de dimerización E2F); - inhibición de asociación/polimerización de las fibras tubulina; inhibición de la actividad de telomerasa; - inhibición de la RasGAP (proteína GTPasa-activator para GTPasas Ras-similar) - interacciones de Aurora B quinasa o activación de la quinasa histidina; y perturbar el equilibrio iónico a través de la membrana celular.

En una modalidad de la invención el péptido efector del dominio (b) puede ser un péptido capaz de suprimir las vías de transmisión de APK quinasas. Un ejemplo es un análogo del dominio de unión del receptor FGF-2 que es responsable por el bloqueo del receptor FGF-2 y en la inhibición de la consecuencia del crecimiento del tumor. En particular, tal péptido efector puede ser un péptido de 16 aminoácidos presentado por SEQ ID NO: 26 en la lista de secuencias adjunta.

Otro péptido efector de esta modalidad de la invención puede ser un fragmento de la proteína DOC-2/DAB2. En particular, tal péptido efector puede ser un péptido de 18 aminoácidos DD2- un dominio rico en prolina presente en la terminal carboxilo del DOC-2/DAB2, presentada por SEQ ID NO: 30 en el listado de secuencias adjunta, que participa en la supresión de las vías de transmisión de las MAPK quinasas mediante la unión a un número de sus elementos respectivos sub (c-Src, Grb2).

En otra modalidad de la invención el péptido efector del dominio (b) puede ser un péptido capaz de inhibición del crecimiento de las células dependientes de estradiol, por ejemplo fetoproteína humana o su fragmento. En particular, tal péptido efector puede ser un fragmento 34-amino ácido de alfa-fetoproteína humana presentada por SEQ ID NO: 27 en la lista de secuencias adjunta. Otro péptido efector de esta modalidad puede ser un fragmento de 8-amino ácido de alfa-fetoproteína humana, localizado en el fragmento C-terminal de SEQ ID NO: 27 y presentado por SEQ ID NO: 28 en la lista de secuencias adjunta.

En otra modalidad de la invención el péptido efector del dominio (b) puede ser un péptido capaz de detener el ciclo celular en la fase G1 , como por la inhibición de complejo de ciclina D1-CDK4. En particular, tal péptido efector puede ser un péptido p16 troyano, o su fragmento, inhibiendo la actividad de las quinasas CDK4 y CDK6. En particular, tal péptido efector -un fragmento del producto génico p16INK4A - es presentado por SEQ ID NO: 32 en la lista de secuencias adjunta . Tal péptido efector puede ser también otro fragmento de péptido p16 troyano - un fragmento del producto génico p16INK4A fusionado con un dominio de transporte de 17 aminoácidos de antennapedia (Derossi D, AH Joliot, G Chassaings, A Prochiantz, J Biol Chem. 269:10444-10450,1994), presentado como SEQ ID NO: 33 en la lista de secuencias adjunta.

En otra modalidad de la invención el péptido efector del dominio (b) puede ser un péptido capaz de una ruptura enzimática de la arginina, como por ejemplo por arginina deiminasa del Mycoplasma arginini. En particular, tal péptido efector es presentado por SEQ ID NO: 31 en el listado de secuencias adjunto.

En otra modalidad de la invención el péptido efector del dominio (b) puede ser un péptido capaz de inhibición de las quinasas del ciclo celular, tales como un inhibidor de CDK4/5. En particular, tal péptido efector puede ser un fragmento de proteina p21WAF1 , como un fragmento de ácido 20 aminoácidos de la proteina p21WAF1 presentado por SEQ ID NO: 29 en la lista de secuencias adjunta.

Otro péptido efector de esta modalidad puede ser un péptido -inhibidor de la activación de ERK. En particular, tal péptido efector puede ser un fragmento de proteína MEK-1 , tal como presentado por SEQ ID NO: 34 en el listado de secuencias adjunto.

Otro péptido efector de esta modalidad puede ser un péptido -coactivador de Akt quinasa. En particular, tal péptido efector - un fragmento N-terminal de dominio PH de la proteína TCL1 - es presentado por SEQ ID NO: 35 en la lista de secuencias adjunta.

En otra modalidad de la invención el péptido efector del dominio (b) puede ser un péptido capaz de inhibición del factor de transcripción E2F en asociación con proteínas DP. En particular, tal péptido efector - un hexapéptido Phe-Trp-Leu-Arg-Phe-Thr - es presentado por SEQ ID NO: 36 en la lista de secuencias adjunta. Otro péptido efector del dominio (b) puede ser un péptido que es un análogo del dominio de unión FGF-2. En particular, tal péptido efector - un péptido del aminoácido 8 que bloquea el receptor FGF-2 -es presentado por SEQ ID NO: 41 en la lista de secuencias adjunta. · "¦ En otra modalidad de la invención el péptido efector del dominio (b) puede ser un péptido capaz de inhibición de la asociación/ polimerización de las fibras de tubulina. Tal péptido efector puede ser un fragmento de tubulina responsable para la formación de estructuras heterodímeros, contribuyendo a la inhibición de la polimerización de las fibras de tubulina. En particular, tal péptido efector - un fragmento de 13-aminoácidos de tubulina -es presentado por SEQ ID NO: 37 en el listado de secuencias adjunto y el otro péptido efector - un fragmento de 10-aminoácidos de tubulina - es presentado por SEQ ID NO: 38 en la lista de secuencias adjunta.

En otra modalidad de la invención el péptido efector del dominio (b) puede ser un péptido capaz de inhibir la actividad de la telomerasa. Tal péptido efector puede ser un péptido basado en la secuencia de una abeja defensina responsable de la inhibición de la actividad de la telomerasa. En particular, tal péptido efector - un péptido del aminoácido 6 C2 basado en la secuencia de una abeja defensina - es presentado por SEQ ID NO: 40 en el listado de secuencias adjunto. Otro péptido efector de esta modalidad puede ser un péptido lasioglosina presente en el veneno de la abeja. En particular, tal péptido efector - lasioglosina LL-2 - es presentado por SEQ ID NO: 42 en el listado de secuencias adjunto En otra modalidad de la invención el péptido efector del dominio (b) puede ser un péptido capaz de inhibir las interacciones de RasGAP -Aurora B o la activación de histidina quinasa. En particular, tal péptido efector - un dominio SH3 de unión del péptido de aminoácido-13 de RasGAP - es presentado por SEQ ID NO: 43 en el listado de secuencias adjunto. Otro péptido efector de esta modalidad puede ser un péptido que después de la unión por receptores de células provoca la fosforilación de la histidina quinasa, que a su vez conduce a la desfosforilación del factor efector VncR. En particular, tal péptido efector - un análogo del péptido Pep27 - es presentado por SEQ ID NO: 44 en el listado de secuencias adjunto.

En otra modalidad de la invención el péptido efector del dominio (b) puede ser un péptido capaz de perturbar el equilibrio iónico a través de la membrana celular. En particular, tal péptido efector melitina - es presentado por SEQ ID NO: 39 en el listado de secuencias adjunto.

En las modalidades específicas de la proteina de fusión de la presente invención, el péptido efector es seleccionado del grupo que consta de: - SEQ ID NO:26 (péptido de 16-aminoácidos que bloquea el receptor FGF-2), - SEQ ID NO:27 (un fragmento de alfa-fetoproteína), - SEQ ID NO: 28 (un fragmento C-terminal de alfa-fetoproteína), - SEQ ID NO:29 (un fragmento de la proteína p21WAF1), - SEQ ID NO:30 (un péptido DD2 de la proteína DAC-2/DAB-2), - SEQ ID NO:31 (una arginina desiminasa), - SEQ ID NO:32 (un fragmento del péptido p16), - SEQ ID NO: 33 (un fragmento del péptido p16 fusionado con un dominio de transporte de 17-aminoácidos de antenapedia), - SEQ ID NO:34 (un fragmento de MEK-1 ), - SEQ ID NO:35 (un fragmento del dominio PH de la proteina TCL1), - SEQ ID NO:36 (un inhibidor de hexapéptido de E2F), - SEQ ID NO:37 (un inhibidor de polimerización de tubulina), - SEQ ID NO:38 (un inhibidor de polimerización de tubulina), - SEQ ID NO:39 (melitina), - SEQ ID NO:40 (inhibidor de telomerasa C2 sintético), - SEQ ID NO:41 (un inhibidor de 8-aminoácidos de interacciones con FGF-2R), - SEQ ID NO:42 (lasioglosina LL-2), - SEQ ID NO:43 (un inhibidor de Aurora RG27 quinasa), y - SEQ ID NO:44 (un análogo de Pep27).

En la unión a receptores TRAIL presentes en la superficie de las células cancerígenas, la proteína de fusión ejercerá un efecto doble. El dominio (a), que es un fragmento funcional de TRAIL o su homólogo con funcionalidad conservada, ejercerá su actividad agonística conocida, es decir, la unión a los receptores de muerte sobre la superficie celular y la activación de la vía extrínseca de la apoptosis. El péptido efector del dominio (b) de la proteína de fusión será capaz potencialmente de ejercer su acción intracelular en paralelo a la actividad del dominio TRAIL por inhibición si la proliferación de las células tumorales.

Si la proteina de fusión comprende una secuencia de escisión reconocida por una proteasa, el péptido efector podría ser previamente escindido del fragmento del TRAIL por metaloproteinasas o uroquinasas sobreexpresadas en el entorno del tumor.

En la proteína de fusión de la invención, efecto antitumoral del TRAIL potencialmente podría mejorarse medíante la activación de otros elementos que afectan la proliferación de las células, tal como por ejemplo la inhibición del crecimiento de las células dependientes de estradiol, la inhibición del complejo de D1-CDK4 ciclina, supresión de vías de transmisión de MAPK quinasas, ruptura enzimática de arginina, inhibición de quinasa de CDK4/5/6, inhibición de la activación de ERK quinasa, inhibición de la coactivation de Akt quinasa, inhibición de la asociación de transcripción del factor E2F con proteínas DP, inhibición de la asociación de fibras de tubulina, inhibición de la actividad de telomerasa, la inhibición de las interacciones RasGAP-Aurora B o activación de hisfidina quinasa.

En una de las modalidades de la invención, el dominio (a) y el dominio (b) están enlazados por lo menos por un dominio (c) que comprende la secuencia de un sitio de disociación reconocido por las proteasas presentes en el ambiente de la célula, especialmente en el ambiente de la célula de tumor. El enlace del dominio (a) con el dominio (b) por por lo menos un dominio (c) significa que entre los dominios (a) y (b) más de un dominio (c) puede estar presente, en particular uno o dos dominios (c).

El sitio de escisión de proteasa se puede seleccionar de: - una secuencia reconocida por la metaloproteasa MMP,; en particular (Pro Leu Gly Leu Ala Gly Glu Pro/PLGLAGEP) designada como SEQ ID NO:45, o (Pro Leu Gly lie Ala Gly Glu /PLGIAGE) o (Pro Leu Gly Leu Ala Gly GluPro /PLGLAGEP); - una secuencia reconocida por uroquinasa uPA, en particular Arg Val Val Arg (RWR) designada como SEQ ID NO: 46 o un fragmento del mismo, con el cual el último aminoácido de la secuencia a la cual se unen forma SEQ ID NO:46, , , y sus combinaciones.

En una de las modalidades de la invención, el sitio de disociación de proteasa es una combinación de la secuencia reconocida por la metaloproteasa MMP y la secuencia reconocida por uPA uroquinasa, situados uno al lado del otro en cualquier orden.

En una modalidad, el dominio (c) es una combinación de MMP/uPA, tal como SEQ ID NO: 45/ SEQ ID NO: 46, o una combinación de uPA/MMP, tal como SEQ ID NO: 46/SEQ ID NO: 45.

Las proteasas metaloproteasa MMP y uPA uroquinasa son sobreexpresadas en el ambiente de tumor. La presencia de la secuencia reconocida por la proteasa permite la escisión del dominio (a) del dominio (b), es decir, la liberación del dominio efector (b) y así su activación.

La presencia del sitio de disociación de proteasa, permitiendo la liberación rápida del péptido efector, aumenta las oportunidades de transportar el péptido al lugar de su acción antes de que ocurra la degradación aleatoria de la proteína de fusión por las proteasas en la célula.

Además, se puede conectar un dominio de transporte (d) a un dominio (b) del péptido efector de la proteína de fusión de la invención.

El dominio (d) puede ser por ejemplo seleccionado del grupo que consiste de: (d1 ) una secuencia de poliarginina se transporta a través de la membrana celular, que consiste de 6, 7, 8, 9, 10 u 1 1 residuos de Arg, (d2) un fragmento del dominio de proteína antenapedia (SEQ ID NO: 48) como un transporte de dominio a través de la membrana celular, (d3) otro fragmento de dominio de la proteína antenapedia (SEQ ID NO: 49) como un transporte de dominio a través de la membrana celular, y combinaciones de los mismos.

La combinación de dominios (d1 ) (d2) y (d3) puede comprender, en particular, la combinación de (d1 )/(d2), (d1 )/(d3) o (d1)/(d2)/(d3).

Además, la combinación de dominios (d1 ), (d2) y (d3) pueden incluir dominios situados al lado del otro y conectados a un extremo del dominio (b) y/o dominios relacionados con diferentes extremos del dominio (b).

Debe entenderse que en el caso cuando la proteína de fusión tiene tanto el dominio de transporte (d) unido al dominio (b) y dominio (c) del sitio de escisión entre dominios (a) y (b), entonces el dominio (c) se encuentra de tal manera que después de la escisión del dominio de transporte de constructo (d) permanece unido al dominio (b). En otras palabras, si la proteína de fusión contiene el dominio transporte (d) y el dominio de sitió de escisión (c), entonces el dominio (d) se encuentra entre el dominio (b) y dominio (c), o se encuentra en el extremo del dominio (b) opuesto al lugar de unión de dominio (d).

La invención no comprende tal como una variante en qué dominio (d) se encuentra entre el dominio (c) y el dominio (a), este es el caso cuando después de la escisión del dominio de transporte de constructo permanece unido al dominio TRAIL.

El dominio de translocación que constituye un fragmento del dominio de proteina antenapedia (SEQ ID NO: 48) asi como otro fragmento de dominio de la proteina antenapedia (SEQ NO. 49) es capaz de translocación a través de las membranas celulares (Derossi D, AH Joliot, G Chassaings, A Prochiantz, J Biol Chem. 269: 10444-10450 (1994) y puede ser utilizado para introducir el péptido efector a los compartimentos de la célula tumoral.

La secuencia (d1 ) que transporta a través de las membranas celulares pueden ser cualquier secuencia conocida en la técnica que comprende de varios residuos de arginina, translocación del péptido efector de la membrana celular al citoplasma de la célula objetivo (D., Hea, H., Yangb, Q., Lina, H., Huang, Arg9-péptido facilita la incorporación de una inmunotoxina anti-CEA y potencializa su citotoxicidad especifica a las células objetivo, The international Journal of Biochemistry & Cell Biology 37 (2005) 192-205; Shiroh Futaki et al JBC, Vol. 276, No. 8, Emitida el 23 de febrero, pp. 5836-5840, 2001).

Otros péptidos de penetración de la celular útil se describen en F. Said Hassane et al Cell. Mol. Life Sci. DOI 10.1007/s00018-009-0186-0.

Aparte de los principales elementos funcionales de la proteína de fusión y el o los dominios del sitio de escisión, las proteínas de fusión de la invención pueden contener una secuencia/secuencias neutras de un enlazador de glicina-cisteína-alanina estérica flexible (separador). Estos enlazadores/espaciadores son bien conocidos y descritos en la literatura. Su incorporación en la secuencia de la proteina de fusión está destinada a proporcionar el correcto plegamiento de proteínas producidas por el procedimiento de su sobre-expresión en las células hospederas.

En particular, el enlazador estérico flexible puede ser SEQ ID NO:47, que es una combinación de residuos de cisteína y alanina. En otra modalidad el enlazador estérico flexible puede ser una combinación de residuos de glicina y serina como por ejemplo un fragmento Gly Gly Gly Ser Gly / GGGSG o cualquier fragmento del mismo actuando como enlazador estérico, por ejemplo Gly Gly Gly/GGG.

En otra modalidad, el enlazador estérico flexible puede ser cualquier combinación de enlazadores que consiste en la SEQ ID NO: 47 y residuos de glicina y serina, como por ejemplo un fragmento Gly Gly Gly Ser Gly /GGGSG o cualquier fragmento de los mismos actuando como un enlazador estérico, por ejemplo un fragmento Gly Gly Gly /GGG. En tal caso el enlazador estérico puede ser una combinación de residuos de cisteína, glicina y alanina, como por ejemplo Cys Ala Ala Cys Ala Ala Ala Cys Gly Gly Gly / CAACAAACGGG.

En otra modalidad, el enlazador estérico flexible puede ser una secuencia Gly Gly Gly Cys Ala Ala Ala Cys Ala Ala Cys Gly Ser Gly / GGGCAAACAACGSG (SEQ ID NO:77) o cualquier combinación de éstos.

En una modalidad, el enlazador estérico flexible puede seleccionarse también de residuos de aminoácidos individuales, tales cómo residuos de cisteína individuales.

Modalidades particulares de la invención son proteínas de fusión seleccionadas del grupo formado por las proteínas representadas por SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, y SEQ ID NO: 6 que comprende como el péptido efector antiproliferativo el fragmento del aminoácido 34 de la fetoproteína humana representada por SEQ ID NO: 27.

Otra modalidad específica de la invención son las proteínas de fusión seleccionadas del grupo que consta de las proteínas presentadas por SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 7 que comprende como el péptido efector antiproliferativo el fragmento del aminoácido 8 de la fetoproteína humana representada por SEQ ID NO: 28.

Otra modalidad específica de la invención son las proteínas de fusión seleccionadas del grupo que consta de las proteínas presentadas por SEQ ID NO: 8 y SEQ ID NO: 9, que comprende como el péptido efector el péptido derivado de p21WAF representado por SEQ ID NO: 29.

Otra modalidad específica de la invención es la proteína de fusión representada por SEQ ID NO: 10, que comprende como el péptido efector un análogo de 16-aminoácidos de dominio de unión del receptor FGF-2 representado por SEQ ID NO: 26.

Otra modalidad específica de la invención es la fusión representada por SEQ ID NO: 1 1 , que comprende como el péptido efector DD2 de la proteína DOC-2/DAB2 representada por SEQ ID NO: 30.

Otra modalidad específica de la invención es la proteína de fusión representada por SEQ ID NO: 12, que comprende como el péptido efector una arginina desiminasa de Mycoplasma arginini representada por SEQ ID NO: 31.

Otra modalidad especifica de la invención es la proteína de fusión representada por SEQ ID NO: 13, que comprende como el péptido efector un fragmento del péptido p16 representado por SEQ ID NO: 32.

Otra modalidad especifica de la invención es la proteína de fusión representada por SEQ ID NO: 13, que comprende como el péptido efector un fragmento del péptido p16 fusionado con un dominio de transporte de 17-aminoácidos de antenapedia representada por SEQ ID NO: 33.

Otra modalidad específica de la invención es la fusión representada por SEQ ID NO: 14, que comprende como el péptido efector un fragmento de la proteína MEK-1 representado por SEQ ID NO: 34.

Otra modalidad específica de la invención es la proteína de fusión representada por SEQ ID NO: 15, que comprende como el péptido efector un fragmento N-terminal de dominio PH de la proteína TCL1 representada por SEQ ID NO: 35.

Otra modalidad específica de la invención es la proteína de fusión representada por SEQ ID NO: 16, que comprende como el péptido efector un hexapéptido Phe-Trp-Leu-Arg-Phe-Thr representado por SEQ ID NO: 36.

Otra modalidad específica de la invención es la proteína de fusión representada por SEQ ID NO: 17, que comprende como el péptido efector un fragmento de 13-aminoácidos de tubulina representado por SEQ ID Otra modalidad especifica de la invención es la proteína de fusión representada por SEQ ID NO: 18, que comprende como el péptido efector un fragmento de 10-aminoácidos de tubulina representado por SEQ ID NO: 39.

Otra modalidad especifica de la invención es la proteina de fusión representada por SEQ ID NO: 19, que comprende como el péptido efector melitina representado por SEQ ID NO: 39.

Otra modalidad especifica de la invención es la proteina de fusión representada por SEQ ID NO: 20, que comprende como el péptido efector un péptido de 6-aminoácidos C2 basado en la secuencia de abeja defensina representada por SEQ ID NO: 40.

Otra modalidad especifica de la invención es la proteina de fusión representada por SEQ ID NO: 21 , que comprende como el péptido efector el péptido de 8-aminoácidos de unión al ligando FGF-2 representado por SEQ ID NO: 41.

Otra modalidad especifica de la invención es la proteina de fusión representada por SEQ ID NO: 22, que comprende como el péptido efector el péptido de 15-aminoácidos lasioglosina LL2 representado por SEQ ID NO: 42.

Otra modalidad específica de la invención es la proteína de fusión representada por SEQ ID NO: 23, que comprende como el péptido efector el péptido de 13-aminoácidos de unión al dominio SH3 de RasGAP representado por SEQ ID NO: 43.

Otra modalidad especifica de la invención es la proteína de fusión representada por SEQ ID NO: 25, que comprende como el péptido efector el análogo del péptido Pep27 representado por SEQ ID NO: 44.

Una descripción detallada de la estructura de las proteínas de fusión representativas mencionadas antes se muestra en las figuras 1 a 5, y en los ejemplos presentados antes.

De acuerdo con la presente invención, por la proteína de fusión significa una molécula de proteína única que contiene dos o más proteínas o sus fragmentos, covalentemente enlazadas a través del enlace de péptido dentro de sus cadenas de péptido respectivas, sin enlazadores químicos adicionales.

La proteína de fusión también puede ser descrita alternativamente como un constructo de proteína o una proteína quimérica. De acuerdo con la presente invención, los términos "constructo" o "proteína quimérica", si se utilizan, debe entenderse como refiriéndose a la proteína de fusión, como se define anteriormente.

Para una persona con experiencia en la técnica será evidente que la proteína de fusión así definida puede ser sintetizada por métodos conocidos de la síntesis química de péptidos y proteínas.

La proteína de fusión puede ser sintetizada por métodos de síntesis de péptido químico, especialmente usando las técnicas de síntesis de péptido en fase sólida usando resinas adecuadas como portadores. Tales técnicas son convencionales y son conocidas en la técnica, y descritas entre otros en las monografías, tales como por ejemplo Bodanszky and Bodanszky, The Practice of Peptide Synthesis, 1984, Springer- Verlag, New York, Stewart et al., Solid Phase Peptide Synthesis, 2a Edición, 1984, Pierce Chemical Company.

La proteína de fusión puede ser sintetizada por los métodos de síntesis química de péptidos como una proteína continua. Alternativamente, los fragmentos individuales (dominios) de proteína pueden ser sintetizados por separado y luego combinados junto con un péptido continuo a través de un enlace de péptido, por condensación del término amino de un fragmento de péptido del término carboxilo del segundo péptido. Dichas técnicas son convencionales y bien conocidas.

Para la verificación de la estructura del péptido resultante, métodos conocidos del análisis de la composición de aminoácido de los péptidos pueden utilizarse, tal como la técnica de espectrometría de masas de alta resolución para determinar el peso molecular del péptido. Para confirmar los secuenciadores de proteína de secuencia de péptido también pueden ser utilizados, los cuales secuencialmente degradan el péptido e identifican la secuencia de aminoácidos.

Preferiblemente, sin embargo, la proteína de fusión de la invención es una proteína recombinante, generada por métodos de expresión génica de una secuencia de polinucleótido que codifica la proteína de fusión en las células hospederas.

Un aspecto adicional de la invención es la secuencia de polinucleótido, especialmente la secuencia de ADN que codifica una proteina de fusión como se define anteriormente.

Preferiblemente, la secuencia de polinucleótido, particularmente ADN, de acuerdo con la invención, que codifica la proteína de fusión como se define anteriormente, es una secuencia optimizada para expresión en E. coli.

Otro aspecto de la invención también es un vector de expresión que contiene la secuencia de polinucleótido, particularmente la secuencia de ADN de la invención como se define anteriormente.

Otro aspecto de la invención es también una célula hospedera que comprende un vector de expresión como se define anteriormente.

Una célula hospedera preferida para la expresión de proteínas de fusión de la invención es una célula de E. coli.

Métodos para la generación de proteínas recombinantes, incluyendo proteínas de fusión, son bien conocidos. En resumen, esta técnica consiste en la generación de la molécula de polinucleótido, por ejemplo molécula de ADN que codifica la secuencia de aminoácido de la proteina objetivo y dirige la expresión de la proteína objetivo en el hospedera. Entonces, la proteína objetivo que codifica la molécula de polinucleótido se incorpora en un vector de expresión adecuado, lo que asegura una eficiente expresión del polipéptido. El vector de expresión recombinante después se introduce en las células hospederas para la transfección/transformacion, y como un resultado se produce una célula hospedera transformada. Esto es seguido por un cultivo de células transformadas para sobre-expresar la proteina objetivo, ia purificación de proteínas obtenidas y, opcionalmente corte por la escisión de secuencias de etiqueta utilizadas para la expresión o purificación de la proteína.

Técnicas adecuadas de expresión y purificación se describen, por ejemplo en la monografía Goeddel, Gene Expression Technology, Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990), and A. Staron et al. , Advances Mikrobiol. , 2008, 47, 2, 1983- 1995.

Cósmidos, plásmidos o virus modificados pueden ser utilizados como vectores de expresión para la introducción y la réplica de secuencias de ADN en células hospederas. Normalmente se utilizan plásmidos como vectores de expresión. Plásmidos adecuados son bien conocidos y comercialmente disponibles.

El vector de expresión de la invención comprende una molécula de polinucleótido que codifica la proteína de fusión de la invención y las secuencias de regulación necesarias para la transcripción y traducción de la secuencia de codificación incorporada en una célula hospedera adecuada. La selección de secuencias reguladoras es dependiente del tipo de células hospederas y pueden realizarse fácilmente por una persona con experiencia en la técnica. Ejemplos de dichas secuencias reguladoras son promotores transcripcionales y potenciadores o secuencia de unión de polimerasa de ARN, secuencia de unión de ribosoma, que contiene la señal de inicio de transcripción, insertada antes de la secuencia de codificación, y secuencia terminadora de transcripción, insertada después de la secuencia de codificación. Además, dependiendo de la célula hospedera y el vector utilizado, otras secuencias pueden ser introducidas en el vector de expresión, tal como el origen de replicación, sitios de restricción de ADN adicionales, potenciadores y secuencias que permiten la inducción de transcripción.

El vector de expresión también comprenderá una secuencia del gen marcador, que confiere el fenotipo definido a la célula transformada y permite la selección específica de las células transformadas. Además, el vector también puede contener una segunda secuencia marcadora que permite distinguir las células transformadas con un plásmido recombiriante que contiene secuencia de codificación insertada de la proteína objetivo de aquellas que han tomado el plásmido sin inserto. Más frecuentemente, se usan marcadores de resistencia a antibióticos usuales, sin embargo, cualquiera de otros genes reporteros conocidos en el campo se pueden usar, cuya presencia en una célula (en vivo) puede determinarse fácilmente usando técnicas de auto-radiografía, espectrofotometría o bio y quimioluminiscencia. Por ejemplo, dependiendo de la célula hospedera, pueden ser utilizados los genes reporteros tales como ß-galactosidasa, ß-glucuronidasa, luciferasa, cloramfenicol acetiltransferasa o proteína fluorescente verde.

Además, el vector de expresión puede contener la secuencia de señal, proteínas de transportación al compartimiento celular apropiado, por ejemplo periplasma, donde se facilita el plegamiento. Adicionalmente una secuencia de codificación de una marca/etiqueta, tal como HisTag unida al N-terminal o GST unida al C-terminal, puede estar presente, lo que facilita la purificación posterior de la proteina producida utilizando el principio de afinidad, a través de la cromatografía de afinidad en una columna de níquel. Secuencias adicionales que protegen la proteína contra la degradación proteolítica en las células hospederas, así como secuencias que aumentan su solubilidad también pueden estar presentes.

Elemento auxiliar unido a la secuencia de la proteína objetivo puede bloquear su actividad, o ser perjudicial por otra razón, tal comó por ejemplo debido a su toxicidad. Dicho elemento se debe ser removido, que puede lograrse mediante escisión enzimática o química. En particular, una etiqueta HisTag de seis histidinas u otros marcadores de este tipo unidos para permitir la purificación de la proteína por cromatografía de afinidad deben removerse, debido a su efecto descrito en la toxicidad hepática de la proteína TRAIL soluble. Los sistemas de expresión heteróloga basados en varias células hospederas bien conocidas se pueden usar, incluyendo las células procariotas: bacterias, tales como Escherichia coli o Bacillus subtilis, levaduras como Saccharomyces cervisiae o Pichia pastoris, y líneas celulares eucariotas (insecto, mamífero, planta).

Preferiblemente, debido a la facilidad de cultivo y manipulación genética, y una cantidad grande de producto obtenido, el sistema de expresión de E. coli es utilizado. En consecuencia, la secuencia de polinucleótidos que contiene la secuencia diana que codifica la proteiná de fusión de la invención será optimizada para la expresión en E. coli, es decir, contendrá en la secuencia codones óptimos para la expresión en E. coli, seleccionados de las posibles variantes de secuencia conocidas en el estado de la técnica. Además, el vector de expresión contendrá los elementos descritos antes convenientes para E. coli unidos a la secuencia de codificación.

Por consiguiente, en una modalidad preferida de la invención una secuencia de polinucleótido que comprende una secuencia que codifica una proteína de fusión de la invención, optimizada para la expresión en E. coli es seleccionada del grupo de secuencias de polinucleótido que consiste en: SEQ ID NO: 50; SEQ ID NO: 51 ; SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53; SEQ ID NO: 54; SEQ ID NO: 55; SEQ ID NO: 56; SEQ ID NO: 57; SEQ ID NO: 58; SEQ ID NO: 59; SEQ ID NO: 60, y SEQ ID NO: 61 ; SEQ ID NO: 62; SEQ ID NO: 63; SEQ ID NO: 64; SEQ ID NO: 65; SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67; SEQ ID NO: 68; SEQ ID NO: 69; SEQ ID NO: 70; SEQ ID NO: 71 ; SEQ ID NO: 72; SEQ ID NO: 73; SEQ ID NO: 74 y SEQ ID NO: 76. que codifica una proteína de fusión que tiene una secuencia de aminoácido correspondiente a secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste de secuencias de aminoácido, respectivamente: SEQ ID NO: 1 ; SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 5; SEQ ID NO: 6; SEQ ID NO: 7; SEQ ID NO: 8; SEQ ID NO: 9; SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 1 1 ; SEQ ID NO: 12; SEQ ID NO: 13; SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO. 15; SEQ ID NO: 16; SEQ ID NO: 17; SEQ ID NO: 18; SEQ ID NO: 19; SEQ ID NO: 20; SEQ ID NO: 21 ; SEQ ID NO: 22; SEQ ID NO: 23; SEQ ID NO: 24; SEQ ID NO: 25 y SEQ ID NO: 75.

En una modalidad preferida, la invención proporciona también un vector de expresión adecuado para la transformación de E. coli, que comprende la secuencia de polinucleótidos seleccionada del grupo de secuencias de polinucleótido SEQ ID NO: 50 a SEQ ID NO: 74 y SEQ ID NO: 76 indicado antes, así como la célula E. coli transformada con tal vector de expresión.

La transformación, es decir, la introducción de una secuencia de ADN en las células hospederas bacterianas, particularmente E. coli, generalmente se realiza en las células competentes, preparadas para torriar el ADN por ejemplo por el tratamiento con iones de calcio a baja temperatura (4°C) y luego se somete a la descarga de calor (a 37-42°C) o por electroporación. Tales técnicas son bien conocidas y determinadas generalmente por el fabricante del sistema de expresión o son descritas en la literatura y manuales para trabajo de laboratorio, tal como Maniatis et al., Molecular Cloning. Cold Spring Harbor, N.Y., 1982).

El procedimiento de sobreexpresión de las proteínas de fusión de la invención en el sistema de expresión de E. coli será descrito posteriormente.

La invención también proporciona una composición farmacéutica que contiene la proteína de fusión de la invención como se define anteriormente como un ingrediente activo y un portador farmacéuticamente aceptable adecuado, diluyente y componentes auxiliares convencionales. La composición farmacéutica contendrá una cantidad efectiva de la proteína de fusión de la invención y componentes auxiliares farmacéuticamente aceptables disueltos o dispersados en un portador o diluyente, y estará preferiblemente en forma de una composición farmacéutica formulada en una forma de dosis unitaria o formulación que contiene una pluralidad de dosis. Formas farmacéuticas y métodos de su formulación, así como otros componentes, portadores y diluyentes son conocidos para la persona con experiencia y se describen en la literatura. Por ejemplo, se describen en la monografía Remington's Pharmaceutical Sciences, ed. 20, 2000, Mack Publishing Company, Easton, USA.

Los términos "portador farmacéuticamente aceptable, diluyente, e ingrediente auxiliar" comprende cualquier solvente, medio de dispersión, agentes tensoactivos, antioxidantes, estabilizadores, conservadores (por ejemplo, agentes antibacterianos, agentes antifúngicos), agentes isotonizantes, conocidos en la técnica. La composición farmacéutica de la invención puede contener varios tipos de portadores, diluyentes y excipientes, dependiendo de la ruta elegida de la administración y forma de dosificación deseada, tal como formas liquida, sólida y aerosol para oral, parenteral, inhalada, tópica, y si la forma debe ser estéril para la ruta de administración tal como por inyección. La ruta preferida de administración de la composición farmacéutica de acuerdo con la invención es parenteral, incluyendo las rutas de inyección tales como intravenosa, intramuscular, subcutánea, intraperitoneal, intratumoral, o por infusiones intravenosas sencillas o continuas.

En una modalidad, la composición farmacéutica de la invención puede ser administrada por inyección directamente al tumor. En otra modalidad, la composición farmacéutica de la invención puede administrarse por vía intravenosa. En aún otra modalidad, la composición farmacéutica de la invención puede ser administrada por vía subcutánea o intraperitoneal. Una composición farmacéutica para la administración parenteral puede ser una solución o dispersión en un medio acuoso o no acuoso farmacéuticamente aceptable, regulada de pH a un pH adecuado e ¡so-osmótico con fluidos del cuerpo, si es necesario, y también puede contener antioxidantes, reguladores de pH, agentes bacteriostáticos y sustancias solubles, que hacen la composición compatible con los tejidos o sangre del destinatario. Otros componentes, que pueden incluirse en la composición, son por ejemplo agua, alcoholes tal como etanol, polioles tal como glicerol, propilenglicol, polietilenglicol líquido, lípídos tal como triglicéridos, aceites vegetales, liposomas. La fluidez apropiada y el tamaño de partículas de la sustancia pueden ser proporcionadas revistiendo sustancias, tales como lecitina, y agentes tensoactivos, tales como polisorbatos de hidroxipropil celulosa, y similares.

Los agentes de isotonización adecuados para las composiciones parenterales líquidas son, por ejemplo, azúcares tales como glucosa, y cloruro de sodio, y sus combinaciones.

Alternativamente, la composición farmacéutica para la administración por inyección o infusión puede ser en una forma de polvo, tal como un polvo liofilizado para reconstitución inmediatamente antes de usarlo en un portador adecuado tal como, por ejemplo, agua estéril libre de pirógenos.

La composición farmacéutica de la invención para la administración parenteral también puede tener la forma de administración nasal, incluyendo soluciones, rociadores o aerosoles. Preferentemente, la forma para administración intranasal será una solución acuosa y será isotónica o regulada de pH o mantenida con el pH de aproximadamente 5.5 a aproximadamente 6.5, con el fin de mantener un carácter similar a las secreciones nasales. Además, contendrá conservantes o estabilizadores, tal como en las preparaciones intranasales bien conocidas.

La composición puede contener varios antioxidantes que retrasan la oxidación de uno o más componentes. Además, para prevenir la acción de los microorganismos, la composición puede contener varios agentes antibacterianos y antimicóticos, incluyendo, por ejemplo, y no limitado a, parabenos, clorobutanol, timerosal, ácido sórbico, y sustancias conocidas semejantes de este tipo. En general, la composición farmacéutica de la invención puede incluir, por ejemplo al menos aproximadamente 0.01% en peso del ingrediente activo. Más particularmente, la composición puede contener el ingrediente activo en la cantidad de 1 % a 75% en pesó de la unidad de composición, o por ejemplo del 25% al 60% del peso, pero no limitado a los valores indicados. La cantidad real de la dosis de la composición de acuerdo con la presente invención administrada a los pacientes, incluyendo al hombre, será determinada por factores físicos y fisiológicos, tal cómo el peso corporal, la severidad de la condición, el tipo de enfermedad a ser tratada, intervenciones terapéuticas previas o concomitantes, el paciente y la ruta de administración. Una dosis unitaria adecuada, la dosis total y la concentración del ingrediente activo en la composición son para ser determinadas por el médico tratante.

La composición por ejemplo puede ser administrada en una dosis de aproximadamente 1 microgramo/kg de peso corporal a aproximadamente 1000 mg/kg de peso corporal del paciente, por ejemplo en el intervalo de 5 mg/kg de peso corporal a 100 mg/kg de peso corporal o en el intervalo de 5 mg/kg de peso corporal a 500 mg/kg de peso corporal. La proteína de fusión y las composiciones que la contienen exhiben anticancerígenos o antitumorales y pueden ser utilizadas para el tratamiento de enfermedades cancerígenas. La invención también proporciona el uso de la proteína de fusión de la invención como fue definido antes para tratar enfermedades de cáncer en mamíferos, incluyendo humanos. La invención también proporciona un método para el tratamiento de enfermedades neoplásicas/cáncer en mamíferos, incluyendo los humanos, que comprende la administración a un sujeto que necesita de dicho tratamiento una cantidad efectiva anti-neoplásica/anticancerígina de la proteína de fusión de la invención como se define antes, opcionalmente en la forma de la composición farmacéuticamente.

La proteína de fusión de la invención puede ser utilizada para el tratamiento de las malignidades hematológicas, tal como leucemia, granulomatosís, mieloma y otras malignidades hematológicas. La proteína de fusión también puede ser utilizada para el tratamiento de tumores sólidos, tales como cáncer de mama, cáncer de pulmón, incluyendo cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer de colon, cáncer pancreático, cáncer ovárico, cáncer de vejiga, cáncer de próstata, cáncer de riñon, cáncer de cerebro, y similares. La ruta de administración apropiada de la proteína de fusión en el tratamiento del cáncer en particular será la ruta parenteral, que consiste en la administración de la proteína de fusión de la invención en la forma de inyecciones o infusiones, en la composición y forma apropiada para esta ruta de administración. La invención se describirá con más detalle en los siguientes procedimientos generales y ejemplos de proteínas de fusión específica.

Procedimiento general para la sobre-expresión de la proteína de fusión Preparación de un plásmido La secuencia de aminoácido de la proteína de fusión diana fue utilizada como una plantilla para generar una secuencia de ADN que lo codifica, comprendiendo codones optimizados para la expresión en Escherichia coli. Este procedimiento permite aumentar la eficiencia de un paso adicional de la síntesis de proteínas objetivo en Escherichia coli. La secuencia de nucleótido resultante después se sintetiza automáticamente. Adicionalmente, los sitios de escisión de enzimas de restricción Ndel (en los extremos 5' de la cadena principal) y Xhol (en el extremo 3' de la cadena principal) se agregan al gen resultante que codifica la proteina objetivo. Estos se utilizan para clonar el gen en el vector pET28a (Novagen). También se pueden utilizar para clonar el gen que codifica la proteína a otros vectores. La proteina diana expresada de este constructo puede ser equipada opcionalmente en el N-terminal con una etiqueta de polihistidina (seis histidinas), precedida por un sitio reconocido por trombina, que sirvió posteriormente a su purificación a través de cromatografía de afinidad. Algunos objetivos se expresaron sin alguna etiqueta, en particular sin la etiqueta histidina, y aquellos fueron purificados posteriormente en sefarosa SP. La exactitud del constructo resultante se confirma en primer lugar por análisis de restricción de plásmidos aislados utilizando las enzimas Ndel y Xhol, seguido por secuenciado automático del marco de lectura completa de la proteína objetivo. Los cebadores utilizados para el secuenciamiento fueron complementarios a las secuencias de promotor T7 (5'-TAATACGACTCACTATAGG-3') y terminador T7 (5'-GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3 *) presente en el vector. El plásmido resultante fue utilizado para la sobreexpresión de la proteína de fusión diana en una cepa comercial de E.coli, que fue transformada según las recomendaciones del fabricante. Las colonias obtenidas en el medio de selección (LB agar, canamicina 50 µg/ml, 1 % de glucosa) se utilizan para la preparación de un cultivo de toda la noche en medio líquido LB complementado con canamicina (50 9 Gp?) y 1% de glucosa. Después de aproximadamente 15 horas de crecimiento en la incubadora de agitación, los cultivos se utilizan para inocular el cultivo adecuado.

Sobreexpresión y purificación de proteínas de fusión -procedimiento general A Medio LB con canamicina (30 µg/ml) y 100 µ? de sulfato de zinc se inoculan con el cultivo durante la noche. El cultivo se incuba a 37°C hasta la densidad óptica (OD) de 600 nm alcanzada 0.60-0.80. Después se añade IPTG a la concentración final en el intervalo de 0.25 - 1 mM. Después de la incubación (3.5 - 20h) con agitación a 25°C el cultivo fue centrifugado por 25 min a 6,000 g. Las perlas bacterianas fueron resuspendidas en un regulador de pH que contenía KH2P04 50 mM, NaCI 0.5 M, imidazol 10 mM, pH 7.4. La suspensión se sónica en hielo durante 8 minutos (40% de amplitud, pulso de 15 segundos, intervalo de 10 s). El extracto resultante se clarifica por centrifugación durante 40 minutos a 20000 g, 4°C. Resina de Ni-Sefarosa (GE Healthcare) se pre-trata por el equilibrio con regulador de pH, que se utiliza para la preparación del extracto de células bacterianas. La resina después se incuba durante la noche a 4°C con el sobrenadante obtenido después de la centrifugación del extracto. Después se carga en columna de cromatografía y se lava con 15 a 50 volúmenes de regulador de pH de 50 mM KH2P04, NaCI 0.5 M, imidazol 20 mM, pH 7.4. La proteína obtenida fue eluida de la columna utilizando gradiente de imidazol en regulador de pH de KH2P04 50 mM con NaCI 0.5 M, pH 7.4. Se analizan las fracciones obtenidas por SDS-PAGE. Las fracciones adecuadas fueron combinadas y dializadas durante la noche a 4°C contra regulador de pH de Tris 50 mM, pH 7.2, NaCI 150 mM, L-arginina 500 mM, ZnS04 0.1 mM, Tween 20 al 0.01 %, y al mismo tiempo 10 Histag, en caso de estar presente, fue disociado con trombina (1:50). Después de la escisión, la trombina se separó de la proteína de fusión objetivo expresada con la etiqueta His por medio de la purificación usando una resina benzamidina sefarosaTM. La purificación de las proteínas de fusión diana expresadas sin Histag fue realizada en SP Sepharosa. La pureza del producto se analiza mediante electroforesis de SDS-PAGE (Maniatis et al, Molecular Cloning. Cold Spring Harbor, NY, 1982).

Sobreexpresión y purificación de proteínas de fusión -procedimiento general B El medio de LB con kanamicina (30 pg/ml) y sulfato de zinc 100 µ? fue inoculado con cultivo durante la noche. Los cultivos se incuban a 37°C hasta la densidad óptica (OD) de 600 nm alcanzada 0.60-0.80. Después IPTG se agrega a la concentración final en el intervalo de 0.5-1 mM. Después de incubación por 20h con agitación a 25°C el cultivo fue centrifugado por 25 min a 6000 g. Las células bacterianas después de la sobreexpresión fueron interrumpidas en una Prensa francesa en un regulador de pH que contenía K2P04 50 mM, NaCI 0.5 M, imidazol 10 mM, betamercaptoetanol 0.5 mMM, PMSF 0.5 mM (fluoruro de fenilmetilsulfonilo), pH 7.8. El extracto resultante se clarifica por centrifugación durante 50 minutos a 8000 g. La resina de Ni-sefarosa se incuba durante toda la noche con el sobrenadante obtenido. Después la resina con proteína unida se empaca en la columna de cromatografía. Para lavar las fracciones que contenían proteínas de no unión, la columna fue lavada con 15 a 50 volúmenes de regulador de pH KH2P04 50 mM, NaCI 0.5 M, imidazol 10 mM, beta-mercaptoetanol 5 mM, PMSF 0.5 mM (fluoruro fenilmetilsulfonilo), pH 7.8. Entonces, para lavar la mayoría de las proteínas que se unen específicamente al lecho, la columna fue lavada con un regulador de pH que contenía KH2P04 50 mM, NaCI 0.5 M, imidazol 500 mM, gliceol al 10%, PMSF 0.5 mM, pH 7.5. Se analizan las fracciones obtenidas por SDS-PAGE (Maniatis et al, Molecular Cloning. Cold Spring Harbor, NY, 1982). Las fracciones que contenían la proteína diana fueron combinadas y, si la proteína fue expresada con etiqueta de histidina, disociadas con trombina (1 U por 4 mg de proteína, 8h a 16°C) para remover la etiqueta de polihistidina. Entonces las fracciones se dializan contra regulador de pH de formulación (500 mM L-arginina, 50 mM Tris, 2.5 mM ZnS04, pH 7.4).

Además en esta descripción las proteínas originalmente expresadas con la etiqueta de histidina que fue posteriormente removida se designan como a) en el Ej. No. Las proteínas que fueron expresadas originalmente sin etiqueta de histidina son designadas como b) en el ejemplo No.

EJEMPLO 1 La proteína de fusión de SEQ ID NO: 1 La proteina de SEQ ID NO: 1 es una proteína de fusión con la longitud de 203 aminoácidos y la masa de 23.3 kDa, en la cual en el N-terminal de la secuencia TRAIL114-281 un fragmento de 34-aminoácidos de fetoproteína humana (SEQ No. 27) se une como un péptido efector. Entre el péptido efector y la secuencia del TRAIL se incorpora una secuencia del sitio de escisión reconocido por uPA uroquinasa (SEQ ID NO: 46) debido a que el péptido efector experimentará una escisión en el entorno del tumor.

La estructura de la proteína de fusión es mostrada esquemáticamente en la figura 1 y su secuencia de aminoácidos y la secuencia que codifica al ADN que comprende los codones optimizados para la expresión en E. coli es, respectivamente, SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 50 como es mostrado en el Listado de Secuencia adjunto.

La secuencia de aminoácido SEQ ID NO: 1 de la estructura descrita antes fue utilizada como una plantilla para generar su secuencia de ADN de codificación SEQ ID NO: 50. Se genera un plásmido que contiene la secuencia codificante de ADN y la sobreexpresión de la proteina de fusión se lleva a cabo de acuerdo con los procedimientos generales descritos anteriormente. La sobreexpresión se realizó de acuerdo con el procedimiento general A, usando E. coli BL21 (DE3) o cepas Tuner(DE3)pLysS de Novagen. La proteína se separa por electroforesis de acuerdo con el procedimiénto general descrito antes.

EJEMPLO 2 La proteína de fusión de SEQ ID NO: 2 La proteína de SEQ ID NO: 2 es una proteina de fusión con una longitud de 178 aminoácidos y la masa de 20.5 kDa, donde en el N-terminal de la secuencia TRAIL114-281 un fragmento de 8-aminoácidos de la fetoproteina humana (SEQ ID NO: 28) se une como un péptido efector. Entre el péptido efector y la sepuencia del TRAIL se incorpora una secuencia del sitio de escisión reconocido por uPA uroquinasa (SEQ ID NO: 46) debido a que el péptido efector experimentará una escisión en el entorno del tumor.

La estructura de la proteina de fusión es mostrada esquemáticamente en la figura 1 y su secuencia de aminoácidos y la secuencia que codifica al ADN que comprende los codones optimizados para la expresión en E. coli es, respectivamente, SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 51 como es mostrado en el Listado de Secuencia adjunto.

La secuencia de aminoácido SEQ ID NO: 2 de la estructura descrita antes fue utilizada como una plantilla para generar su secuencia de ADN de codificación SEQ ID NO: 51. Se genera un plásmido que contiene la secuencia codificante de ADN y la sobreexpresión de la proteína de fusión se lleva a cabo de acuerdo con los procedimientos generales descritos anteriormente. La sobreexpresión se realizó de acuerdo con el procedimiento general B, usando la cepa E. coli BL21 (DE3) de Novagen. La proteina se separa por electroforesis de acuerdo con el procedimiento general descrito antes.

EJEMPLO 3 La proteína de fusión de SEQ ID NO: 3 La proteína de SEQ ID NO: 3 es una proteína de fusión con la longitud de 179 aminoácidos y la masa de 20.5 kDa, en el cual en el C-terminal de la secuencia de TRAIL121-281 un fragmento 8-aminoácidos de fetoproteína humana (SEQ ID NO: 28) se une como un péptido efector. Entre el péptido efector y la secuencia de TRAIL se incorporan consecutivamente juntas entre sí, las secuencias de los sitios de escisión reconocidos por metaloproteasa MMP (SEQ ID NO: 45) y uroquinasa uPA (SEQ ID NO: 46) debido a que el péptido efector experimentará escisión en el entorno del tumor.

La estructura de la proteína de fusión es mostrada esquemáticamente en la figura 1 y su secuencia de aminoácidos y la secuencia que codifica al ADN que comprende los codones optimizados para la expresión en E. coli es, respectivamente, SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 52 como es mostrado en el Listado de Secuencia adjunto.

La secuencia de aminoácido SEQ ID NO: 3 de la estructura descrita antes fue utilizada como una plantilla para generar su secuencia de ADN de codificación SEQ ID NO: 52. Se genera un plásmido que contiene la secuencia codificante de ADN y la sobreexpresión de la proteina de fusión se lleva a cabo de acuerdo con los procedimientos generales descritos anteriormente. La sobreexpresión fue realizada según el procedimiento general A, utilizando la cepa E. coli BL21 (DE3) de Novagen. La proteína se separa por electroforesis de acuerdo con el procedimiento general descrito antes.

EJEMPLO 4 La proteína de fusión de SEQ ID NO: 4 La proteína de SEQ ID NO: 4 es una proteína de fusión con la longitud de 204 aminoácidos y la masa de 23.2 kDa, en el cual en el C-terminal de la secuencia de TRAIL121-281 un fragmento 34-aminoácídos de fetoproteína humana (SEQ ID NO: 27) se une como un péptido efector. Entre el péptido efector y la secuencia de TRAIL se incorporan consecutivamente juntas entre si, las secuencias de los sitios de escisión reconocidos por metaloproteasa P (SEQ ID NO: 45) y uroquinasa uPA (SEQ ID NO: 46) debido a que el péptido efector experimentará escisión en el entorno del tumor.

La estructura de la proteína de fusión es mostrada esquemáticamente en la figura 1 y su secuencia de aminoácidos y la secuencia que codifica al ADN que comprende los codones optimizados para la expresión en E. coli es, respectivamente, SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 53 como es mostrado en el Listado de Secuencia adjunto.

La secuencia de aminoácido SEQ ID NO: 4 de la estructura descrita antes fue utilizada como una plantilla para generar su secuencia de ADN de codificación SEQ ID NO: 53. Se genera un plásmido que contiene la secuencia codificante de ADN y la sobreexpresión de la proteina de fusión se lleva a cabo de acuerdo con los procedimientos generales descritos anteriormente. La sobreexpresión se realizó de acuerdo con el procedimiento general B, usando la cepa E. coli BL21 DE3pLysSRIL de Stratagene o la cepa Tuner (DE3) de Novagen. La proteina se separa por electroforesis de acuerdo con el procedimiento general descrito antes.

EJEMPLO 5 La proteína de fusión de SEQ ID NO: 5 La proteína de SEQ ID NO: 5 es una proteina de fusión con la longitud de 230 aminoácidos y la masa de 26 kDa, en donde en el N-terminal de la secuencia TRAIL95-281 un fragmento de 34-aminoácidos de la fetoproteína humana (SEQ ID NO: 27) se une como un péptido efector. Entre el péptido efector y la secuencia de TRAIL se incorporan consecutivamente juntas entre si, las secuencias de los sitios de escisión reconocidas por uroquinasa uPA (SEQ ID NO: 46) y MMP de metaloproteasa (SEQ ID NO: 45) debido a que el péptido efector experimentará una escisión en el entorno del tumor.

La estructura de la proteína de fusión es mostrada esquemáticamente en la figura 1 y su secuencia de aminoácidos y la secuencia que codifica al ADN que comprende los codones optimizados para la expresión en E. coli es, respectivamente, SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 54 como es mostrado en el Listado de Secuencia adjunto.

La secuencia de aminoácido SEQ ID NO: 5 de la estructura descrita antes fue utilizada como una plantilla para generar su secuencia de ADN de codificación SEQ ID NO: 54. Se genera un plásmido que contiene la secuencia codificante de ADN y la sobreexpresión de la proteína de fusión se lleva a cabo de acuerdo con los procedimientos generales descritos anteriormente. La sobreexpresión se realizó de acuerdo al procedimiento general A, usando la cepa E. coli Tuner (DE3) de Novagen. La proteina se separa por electroforesis de acuerdo con el procedimiento general descrito antes.

EJEMPLO 6 La proteína de fusión de SEQ ID NO: 6 La proteína de SEQ ID NO: 6 es una proteína de fusión con la longitud de 238 aminoácidos y la masa de 26.7 kDa, en donde en el C-terminal de la secuencia TRAIL95-281 un fragmento de 34-aminoácidos de la fetoproteína humana (SEQ ID NO: 27) se une como un péptido efector. Entre el péptido efector y la secuencia de TRAIL se incorporan consecutivamente juntas entre sí, las secuencias de los sitios de escisión reconocidos por metaloproteasa MMP (SEQ ID NO: 45) y uroquinasa uPA (SEQ ID NO: 46) debido a que el péptido efector experimentará una escisión en el entorno del tumor. Entre la secuencia de TRAIL y la secuencia del sitio de escisión reconocido por metaloproteasa MMP la proteina de fusión contiene además una cisteína flexible - enlazador de alanina (SEQ ID NO: 47).

La estructura de la proteína de fusión es mostrada esquemáticamente en la figura 2 y su secuencia de aminoácidos y la secuencia que codifica al ADN que comprende los codones optimizados para la expresión en E. coli es, respectivamente, SEQ ID NO: 6 y SEQ ID NO: 55 como es mostrado en el Listado de Secuencia adjunto.

La secuencia de aminoácido SEQ ID NO: 6 de la estructura descrita antes fue utilizada como una plantilla para generar su secuencia de ADN de codificación SEQ ID NO: 55. Se genera un plásmido que contiene la secuencia codificante de ADN y la sobreexpresión de la proteína de fusión se lleva a cabo de acuerdo con los procedimientos generales descritos anteriormente. La sobreexpresión se realizó de acuerdo al procedimiento general A, usando la cepa E. coli Tuner (DE3) de Novagen. La proteína se separa por electroforesis de acuerdo con el procedimiento general descrito antes.

EJEMPLO 7 La proteína de fusión de SEQ ID NO: 7 La proteína de SEQ ID NO: 7 es una proteína de fusión con la longitud de 213 aminoácidos y la masa de 24.1 kDa, en donde en el C-terminal de la secuencia TRAIL95-281 un fragmento de 8-aminoácidos de la fetoproteína humana (SEQ ID NO: 28) se une como un péptido efector. Entre el péptido efector y la secuencia de TRAIL se incorporan consecutivamente juntas entre si, las secuencias de los sitios de escisión reconocidas por metaloproteasa MMP (SEQ ID NO: 45) y uroquinasa uPA (SEQ ID NO: 46) debido a que el péptido efector experimentará una escisión en el entorno del tumor. Entre la secuencia de TRAIL y la secuencia del sitio de escisión reconocido por metaloproteasa MMP la proteína de fusión contiene además una cisteína flexible - enlazador de alanina (SEQ ID NO: 47).

La estructura de la proteína de fusión es mostrada esquemáticamente en la Fig. 2 y su secuencia de aminoácidos y la secuencia que codifica al ADN que comprende los codones optimizados para la expresión en E. coli es, respectivamente, SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO. 56 como es mostrado en el Listado de Secuencia adjunto.

La secuencia de aminoácido SEQ ID NO: 7 de la estructura descrita antes fue utilizada como una plantilla para generar su secuencia de ADN de codificación SEQ ID NO: 56. Se genera un plásmido que contiene la secuencia codificante de ADN y la sobreexpresión de la proteína de fusión se lleva a cabo de acuerdo con los procedimientos generales descritos anteriormente. La sobreexpresión se realizó de acuerdo al procedimiento general A, usando la cepa E. coli Tuner (DE3) de Novagen. La proteína se separa por electroforesis de acuerdo con el procedimiento general descrito antes.

EJEMPLO 8 La proteína de fusión de SEQ ID NO: 8 La proteína de SEQ ID NO: 8 es una proteína de fusión con la longitud de 191 aminoácidos y la masa de 23 kDa, en donde en el N-terminal de la secuencia TRAIL95-281 un fragmento de 20-aminoácidos del péptido derivado de la proteína p21WAF (SEQ ID NO: 29) se une como un péptido efector. Además, en el C-terminal de la proteína efectora hay unido un fragmento del dominio de la proteína antenapedia (SEQ ID NO: 49) como una secuencia de transporte, que ayuda en la penetración de la membrana celular y transporte de la proteína de fusión dentro de la célula. Entre la secuencia de transporte y la secuencia de TRAIL se incorporan consecutivamente juntas entre sí, las secuencias de los sitios de escisión reconocidas por uroquinasa uPA (SEQ ID NO: 46) y MMP de metaloproteasa (SEQ ID NO: 45) debido a que el péptido efector experimentará una escisión en el entorno del tumor.

La estructura de la proteína de fusión es mostrada esquemáticamente en la Fig. 2 y su secuencia de aminoácidos y la secuencia que codifica al ADN que comprende los codones optimizados para la expresión en E. coli es, respectivamente, SEQ ID NO: 8 y SEQ ID NO: 57 como es mostrado en el Listado de Secuencia adjunto.

La secuencia de aminoácido SEQ ID NO: 8 de la estructura descrita antes fue utilizada como una plantilla para generar su secuencia de ADN de codificación SEQ ID NO: 57. Un plásmido que contiene la secuencia codificante de ADN en dos versiones, una que permite expresar la etiqueta His y un sitio reconocido por trombina y la segunda sin alguna etiqueta se generó y la sobreexpresión de la proteína de fusión se realizó de acuerdo con los procedimientos generales descritos antes. La sobreexpresión fue realizada según el procedimiento general A, utilizando la cepa de E. coli Tuner(DE3) de Novagen. La proteína se separa por electroforesis de acuerdo con el procedimiento general descrito antes.

EJEMPLO 8A La proteína de fusión de SEQ ID NO: 75 La proteína de SEQ ID NO: 75 es una proteína de fusión que tiene la longitud de 212 aminoácidos y la masa de 24.13 kDa, en donde en el N-terminal de la secuenciaTRAILI 20-281 un fragmento de 20-aminoácidos del péptido derivado de la proteína p21WAF (SEQ ID NO: 29) se une como un péptido efector. Además, en el C-terminal de la proteína efectora hay unido un fragmento del dominio de la proteína antenapedia (SEQ ID NO. 49) como una secuencia de transporte, que ayuda en la penetración de la membrana celular y transporte de la proteína de fusión dentro de la célula. Entre la secuencia de transporte y la secuencia de TRAIL se incorporan consecutivamente juntas entre sí, las secuencias de los sitios de escisión reconocidas por uroquinasa uPA (SEQ ID NO: 46) y MMP de metaloproteasa (SEQ ID NO: 45) debido a que el péptido efector experimentará una escisión en el entorno del tumor. Además entre el sitio de escisión de metaloproteasa y la secuencia de TRAIL la proteina de fusión contiene adicionalmente un enlazador flexible (SEQ ID NO: 77).

La estructura de la proteína de fusión es mostrada esquemáticamente en la figura 2 y su secuencia de aminoácidos y la secuencia que codifica al ADN que comprende los codones optimizados para la expresión en E. coli es, respectivamente, SEQ ID NO: 75 y SEQ ID NO: 76 como es mostrado en el Listado de Secuencia adjunto.

La secuencia de aminoácido SEQ ID NO: 75 de la estruptura descrita antes fue utilizada como una plantilla para generar su secuencia de ADN de codificación SEQ ID NO: 76. Un plásmido que contiene la secuencia codificante de ADN en dos versiones, una que permite expresar la etiqueta His y un sitio reconocido por trombina y la segunda sin alguna etiqueta se generó y la sobreexpresión de la proteína de fusión se realizó de acuerdo con los procedimientos generales descritos antes. La sobreexpresión fue realizada según el procedimiento general A, utilizando la cepa de E. coli Tuner(DE3) de Novagen. La proteína se separa por electroforesis de acuerdo con el procedimiento general descrito antes.

EJEMPLO 9 La proteina de fusión de SEQ ID NO: 9 La proteína de SEQ ID NO: 9 es una proteína de fusión que tiene la longitud de 231 aminoácidos y la masa de 26.5 kDa, en donde en el C-terminal de la secuencia TRAIL95-281 un fragmento de 20-aminoácidos del péptido derivado de la proteína p21WAF (SEQ ID NO: 29) se une como un péptido efector. Entre el péptido efector y la secuencia de TRAIL se incorporan consecutivamente juntas entre sí, las secuencias de los sitios de escisión reconocidas por metaloproteasa MMP (SEQ ID NO: 45) y uroquinasa uPA (SEQ ID NO: 46) debido a que el péptido efector experimentará una escisión en el entorno del tumor. Entre la secuencia de TRAIL y la secuencia de los sitios de escisión la proteina de fusión contiene adicionalmente una cisteína flexible - enlazador de alanina (SEQ ID NO: 47). Además, en el C-terminal de la proteína efectora hay unido un fragmento del dominio de la proteína antenapedia (SEQ ID NO: 49) formando un fargmento C-terminal del constructo entero como una secuencia de transporte que ayuda en la penetración de la membrana celular y el transporte de la proteína de fusión en la célula.

La estructura de la proteína de fusión es mostrada esquemáticamente en la figura 2 y su secuencia de aminoácidos y la secuencia que codifica al ADN que comprende los codones optimizados para la expresión en E. coli es, respectivamente, SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 58 como es mostrado en el Listado de Secuencia adjunto.

La secuencia de aminoácido SEQ ID NO: 9 de la estructura descrita antes fue utilizada como una plantilla para generar su secuencia de ADN de codificación SEQ ID NO: 58. Se genera un plásmido que contiene la secuencia codificante de ADN y la sobreexpresión de la proteina de fusión se lleva a cabo de acuerdo con los procedimientos generales descritos anteriormente. La sobreexpresión fue realizada según el procedimiento general A, utilizando la cepa de E. coli Rosetta (DE3) de Novagen. La proteína se separa por electroforesis de acuerdo con el procedimiento general descrito antes.

EJEMPLO 10 La proteína de fusión de SEQ ID NO: 10 La proteina de SEQ ID NO: 10 es una proteína de fusión que tiene la longitud de 200 aminoácidos y la masa de 22.8 kDa, en donde en el N-terminal de la secuencia TRAIL120-281 un fragmento de 16-aminoácidos del análogo de péptido derivado del dominio de unión al receptor FGF-2 (SEQ ID NO: 26) se une como un péptido efector. Entre el péptido efector y la secuencia de TRAIL se incorporan consecutivamente juntas entre sí, las secuencias de los sitios de escisión reconocidas por uroquinasa uPA (SEQ ID NO: 46) y MMP de metaloproteasa (SEQ ID NO: 45) debido a que el péptido efector experimentará una escisión en el entorno del tumor. Entre la secuencia de TRAIL y la secuencia de los sitios de escisión la proteína de fusión contiene adicionalmente una cisteína flexible - enlazador de alanina (SÉQ ID NO: 47). Adicionalmente, entre la secuencia del sitio de escisión y la secuencia de enlazador flexible así como entre la secuencia del enlazador flexible y dominio TRAIL se incorpora un enlazador que consta de dos residuos de glicina ayuda en la estabilización de la estructura trimérica.

La estructura de la proteína de fusión es mostrada esquemáticamente en la figura 2 y su secuencia de aminoácidos y la secuencia que codifica al ADN que comprende los codones optimizados para la expresión en E. coli es, respectivamente, SEQ ID NO: 10 y SEQ ID NO: 59 como es mostrado en el Listado de Secuencia adjunto.

La secuencia de aminoácido SEQ ID NO: 10 de la estructura descrita antes fue utilizada como una plantilla para generar su secuencia de ADN de codificación SEQ ID NO: 59. Se genera un plásmido que contiene la secuencia codificante de ADN y la sobreexpresión de la proteina de fusión se lleva a cabo de acuerdo con los procedimientos generales descritos anteriormente. La sobreexpresión fue realizada de acuerdo con el procedimiento general A, utilizando la cepa de E. coli BL21 (DE3) de Novagen. La proteína se separa por electroforesis de acuerdo con el procedimiento general descrito antes.

EJEMPLO 11 La proteína de fusión de SEQ ID NO: 11 La proteína de SEQ ID NO: 1 1 es una proteína de fusión que tiene la longitud de 233 aminoácidos y la masa de 26.5 kDa, en donde en el C-termínal de la secuencia TRAIL95-281 un fragmento de 18-aminoácidos de péptido DD2 derivado de DOC-2/DAB2 (SEQ ID NO: 30) se une como un péptido efector. Entre el péptido efector y la secuencia de TRAIL se incorporan consecutivamente junto a las demás secuencias de los sitios de escisión reconocidos por metaloproteasa M P (SEQ ID NO: 45) y uroquinasa uPA (SEQ ID NO: 46) debido a que el péptido efector experimentará una escisión en el entorno del tumor. La secuencia del péptido efector tiene unido en su N-terminal el dominio de transporte de poli-arginina que consta de 7 residuos Arg. La secuencia de transporte ayuda en la penetración de la membrana celular y transporte de la proteína de fusión en la célula. Entre la secuencia de TRAIL y la secuencia de los sitios de escisión la proteína de fusión contiene además un enlazador de cisteína - alanina - glicina CAACAAACGGG.

La estructura de la proteína de fusión es mostrada esquemáticamente en la figura 3 y su secuencia de aminoácidos y la secuencia que codifica al ADN que comprende los codones optimizados para la expresión en E. cóli es, respectivamente, SEQ ID NO: 1 1 y SEQ ID NO: 60 como es mostrado en el Listado de Secuencia adjunto.

La secuencia de aminoácido SEQ ID NO: 11 de la estructura descrita antes fue utilizada como una plantilla para generar su secuencia de ADN de codificación SEQ ID NO: 60. Se genera un plásmido que contiene la secuencia codificante de ADN y la sobreexpresión de la proteína de fusión se lleva a cabo de acuerdo con los procedimientos generales descritos anteriormente. La sobreexpresión se realizó de acuerdo con el procedimiento general A, usando E. coli BL21 (DE3) o cepas Tuner(DE3)pLysS de Novagen. La proteína se separa por electroforesis de acuerdo con el procedimiento general descrito antes.

EJEMPLO 12 La proteína de fusión de SEQ ID NO: 12 La proteína de SEQ ID NO: 12 es una proteína de fusión que tiene la longitud de 590 aminoácidos y la masa de 66.7 kDa, en donde en el C-terminal de la secuencia TRAIL121-281 una arginina desiminasa de Mycoplasma arginini (SEQ ID NO: 31) se une como un péptido efector. Entre el péptido efector y la secuencia de TRAIL se incorporan consecutivamente junto a las demás secuencias de los sitios de escisión reconocidos por metaloproteasa MMP (SEQ ID NO: 45) y uroquinasa uPA (SEQ ID NO: 46) debido a que el péptido efector experimentará una escisión en el entorno del tumor. Entre la secuencia de TRAIL y la secuencia de los sitios de escisión de metaloproteasa la proteína de fusión contiene además un enlazador flexible que consta de residuos de glicina y serina Gly Gly Ser Gly. Entre la secuencia del sitio de escisión de uroquinasa y la secuencia de la proteína efectora la proteína de fusión contiene además un enlazador de glicina serina flexible Gly Gly Gly Ser Gly.

La estructura de la proteína de fusión es mostrada esquemáticamente en la figura 3 y su secuencia de aminoácidos y la secuencia que codifica al ADN que comprende los codones optimizados para la expresión en E. coli es, respectivamente, SEQ ID NO: 12 y SEQ ID NO: 61 como es mostrado en el Listado de Secuencia adjunto.

La secuencia de aminoácido SEQ ID NO: 12 de la estructura descrita antes fue utilizada como una plantilla para generar su secuencia de ADN de codificación SEQ ID NO: 61. Se genera un plásmido que contiene la secuencia codificante de ADN y la sobreexpresión de la proteína de fusión se lleva a cabo de acuerdo con los procedimientos generales descritos anteriormente. La sobreexpresión fue realizada de acuerdo con el procedimiento general A, utilizando la cepa de E. coli BL21 (DE3) de Novagen. La proteina se separa por electroforesis de acuerdo con el procedimiento general descrito antes.

EJEMPLO 13 La proteina de fusión de SEQ ID NO: 13 La proteína de SEQ ID NO: 13 es una proteína de fusión que tiene la longitud de 187 aminoácidos y la masa de 21.6 kDa, en donde en el N-terminal de la secuencia TRAIL95-281 un péptido de 10-aminoácidos de la proteína p16 (SEQ ID NO: 32) se une como un péptido efector. Entre el péptido efector y el N-terminal del dominio TRAIL se incorporan consecutivamente juntas entre sí otras secuencias de los sitios de escisión reconocidos por uroquinasa uPA (SEQ ID NO: 46) y MMP de metaloproteasa (SEQ ID NO: 45) debido a que el péptido efector experimentará una escisión en el entorno del tumor. La secuencia del péptido efector tiene unido en su C-terminal una secuencia de transporte (SEQ ID NO: 49) que consta del fragmento del fragmento de dominio de proteína antenapedia. La secuencia de transporte ayuda en la penetración de la membrana celular y transporte de la proteína de fusión en la célula.

La estructura de la proteína de fusión es mostrada esquemáticamente en la figura 3 y su secuencia de aminoácidos y la secuencia que codifica al ADN que comprende los codones optimizados para la expresión en E. coli es, respectivamente, SEQ ID NO: 13 y SEQ ID NO: 62 como es mostrado en el Listado de Secuencia adjunto.

La secuencia de aminoácido SEQ ID NO: 13 de la estructura descrita antes fue utilizada como una plantilla para generar su secuencia de ADN de codificación SEQ ID NO: 62. Se genera un plásmido que contiene la secuencia codificante de ADN y la sobreexpresión de la proteína de fusión se lleva a cabo de acuerdo con los procedimientos generales descritos anteriormente. La sobreexpresión se realizó de acuerdo con el procedimiento general B, usando la cepa E. coli B.21 (DE3) de Novagen o la cepa BL21 DE3pLysSRIL de Stratagene. La proteína se separa por electroforesis de acuerdo con el procedimiento general descrito antes.

EJEMPL0 14 La proteína de fusión de SEQ ID NO: 14 La proteína de SEQ ID NO: 14 es una proteína de fusión que tiene la longitud de 203 aminoácidos y la masa de 23.6 kDa, en donde en el C-terminal de la secuencia TRAIL121-281 un fragmento de 13-aminoácidos de la proteína MEK-1 - un inhibidor de activación de ERK (SEQ ID NO: 34) se une como un péptido efector. Entre el C-terminal de TRAIL y el dominio del péptido efector se incorporan consecutivamente juntas entre si las secuencias de los sitios de escisión reconocidas por metaloproteasa MMP (SEQ ID NO: 45) y uroquinasa uPA (SEQ ID NO: 46) debido a que el péptido efector experimentará una escisión en el entorno del tumor. La secuencia del péptido efector tiene unida en su N-terminal una secuencia de transporte (SEQ ID NO: 48) que consta de un fragmento del dominio de proteína antenapedia. La secuencia de transporte ayuda en la penetración de la membrana celular y transporte de la proteína de fusión en la célula. Entre la secuencia de TRAIL y la secuencia de los sitios de escisión la proteina de fusión contiene además un enlazador flexible de glicina - cisteína GS.

La estructura de la proteína de fusión es mostrada esquemáticamente en la figura 3 y su secuencia de aminoácidos y la secuencia que codifica al ADN que comprende los codones optimizados para la expresión en E. coli es, respectivamente, SEQ ID NO: 14 y SEQ ID NO: 63 como es mostrado en el Listado de Secuencia adjunto.

La secuencia de aminoácido SEQ ID NO: 14 de la estructura descrita antes fue utilizada como una plantilla para generar su secuencia de ADN de codificación SEQ ID NO: 63. Se genera un plásmido que contiene la secuencia codificante de ADN y la sobreexpresion de la proteína de fusión se lleva a cabo de acuerdo con los procedimientos generales descritos anteriormente. La sobreexpresion se realizó de acuerdo con el procedimiento general B, usando la cepa E. coli B.21 (DE3) de Novagen o la cepa BL21 DE3pLysSRIL de Stratagene. La proteína se separa por electroforesis de acuerdo con el procedimiento general descrito antes.

EJEMPLO 15 La proteína de fusión de SEQ ID NO: 15 La proteína de SEQ ID NO: 5 es una proteína de fusión con una longitud de 205 aminoácidos y la masa de 24 kDa, en donde en el C-terminal de la secuencia TRAIL121-281 un fragmento N-terminal de 15-aminoácidos del dominio PH de la proteína TCL1 - que actúa como coactivador Akt (SÉQ ID NO: 35) se une como un péptido efector. Entre el dominio TRAIL y el péptido efector se incorporan consecutivamente juntas entre si, las secuencias de los sitios de escisión reconocidas por metaloproteasa MMP (SEQ ID NO: 45) y uroquinasa uPA (SEQ ID NO: 46) debido a que el péptido efector experimentará una escisión en el entorno del tumor. La secuencia del péptido efector tiene unida en su N-terminal una secuencia de transporte (SEQ ID NO: 48) que consta del fragmento del fragmento de dominio de proteína antenapedia. La secuencia de transporte ayuda en la penetración de la membrana celular y transporte de la proteína de fusión en la célula. Entre la secuencia de TRAIL y la secuencia de los sitios de escisión la proteína de fusión contiene además un enlazador flexible de glicina - cisteína GS.

La estructura de la proteína de fusión es mostrada esquemáticamente en la Fig. 3 y su secuencia de aminoácidos y la secuencia que codifica al ADN que comprende los codones optimizados para la expresión en E. coli es, respectivamente, SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 64 como es mostrado en el Listado de Secuencia adjunto.

La secuencia de aminoácido SEQ ID NO: 15 de la estructura descrita antes fue utilizada como una plantilla para generar su secuencia de ADN de codificación SEQ ID NO: 64. Se genera un plásmido que contiene la secuencia codificante de ADN y la sobreexpresión de la proteína de fusión se lleva a cabo de acuerdo con los procedimientos generales descritos anteriormente. La sobre expresión se realizó de acuerdo con el procedimiento general B, usando E. coli B.21 (DE3) o cepas Tuner (DE3) de Novagen. La proteína se separa por electroforesis de acuerdo con el procedimiento general descrito antes.

EJEMPLO 16 La proteína de fusión de SEQ ID NO: 16 La proteína de SEQ ID NO: 16 es una proteína de fusión que tiene una longitud de 183 aminoácidos y la masa de 21.2 kDa, en donde en el N-terminal de la secuencia TRAIL121-281 un hexapéptido que actúa como un inhibidor de E2F (SEQ ID NO: 36) se une como un péptido efector. Entre el péptido efector y el dominio TRAIL se incorporan consecutivamente juntas entre sí, las secuencias de los sitios de escisión reconocios por uroquinasa uPA (SEQ ID NO: 46) y MMP de metaloproteasa (SEQ ID NO: 45) debido a que el péptido efector experimentará una escisión en el entorno del tumor. Además, la secuencia del péptido efector tiene unida en su C-terminal una secuencia de transporte (SEQ ID NO: 49) que consta del fragmento del fragmento de dominio de proteína antenapedia. La secuencia de transporte ayuda en la penetración de la membrana celular y transporte de la proteína de fusión en la célula.

La estructura de la proteína de fusión es mostrada esquemáticamente en la figura 4 y su secuencia de aminoácidos y la secuencia que codifica al ADN que comprende los codones optimizados para la expresión en E. co/ es, respectivamente, SEQ ID NO: 16 y SEQ ID NO: 65 como es mostrado en el Listado de Secuencia adjunto.

La secuencia de aminoácido SEQ ID NO: 16 de la estructura descrita antes fue utilizada como una plantilla para generar su secuencia de ADN de codificación SEQ ID NO: 65. Se genera un plásmido que contiene la secuencia codificante de ADN y la sobreexpresión de la proteína de fusión se lleva a cabo de acuerdo con los procedimientos generales descritos anteriormente. La sobreexpresión se realizó de acuerdo con el procedimiento general B, usando E. coli B.21 (DE3) o las cepas Tuner (DE3) de Novagen. La proteína se separa por electroforesis de acuerdo con el procedimiento general descrito antes.

EJEMPLO 17 La proteína de fusión de SEQ ID NO: 17 La proteína de SEQ ID NO: 17 es una proteína de fusión con una longitud de 190 aminoácidos y la masa de 22.3 kDa, en donde en el N-terminal de la secuencia TRAIL121-281 un fragmento de 13-aminoácidos de tubulina (SEQ ID NO: 37) se une como un péptido efector. Entre el péptido efector y el N-terminal del dominio TRAIL se incorporan consecutivamente juntas entre sí otras secuencias de los sitios de escisión reconocidos por uroquinasa uPA (SEQ ID NO: 46) y MMP de metaloproteasa (SEQ ID NO: 45) debido a que el péptido efector experimentará una escisión en el entornó del tumor. Además, la secuencia del péptido efector tiene unido en su C-terminal una secuencia de transporte que consta de 6 residuos de arginina; La secuencia de transporte ayuda en la penetración de la membrana celular y transporte de la proteína de fusión en la célula.

La estructura de la proteína de fusión es mostrada esquemáticamente en la figura 4 y su secuencia de aminoácidos y la secuencia que codifica al ADN que comprende los codones optimizados para la expresión en E. coli es, respectivamente, SEQ ID NO: 17 y SEQ ID NO: 66 como es mostrado en el Listado de Secuencia adjunto.

La secuencia de aminoácido SEQ ID NO: 17 de la estructura descrita antes fue utilizada como una plantilla para generar su secuencia de ADN de codificación SEQ ID NO: 66. Se genera un plásmido que contiene la secuencia codificante de ADN y la sobreexpresión de la proteína de fusión se lleva a cabo de acuerdo con los procedimientos generales descritos anteriormente. La sobreexpresión se realizó de acuerdo con el procedimiento general B, usando E. coli B.21 (DE3) o las cepas Tuner (DE3) de Novagen. La proteína se separa por electroforesis de acuerdo con el procedimiento general descrito antes.

EJEMPLO 18 La proteína de fusión de SEQ ID NO: 18 La proteína de SEQ ID NO: 18 es una proteína de fusión con una longitud de 187 aminoácidos y la masa de 21.7 kDa, en donde en el N-termínal de la secuencia TRAIL121-281 un fragmento de 10-aminoácidos de tubulina (SEQ ID NO: 38) se une como un péptido efector. Entre el péptido efector y el N-terminal del dominio TRAIL se incorporan consecutivamente juntas entre sí otras secuencias de los sitios de escisión reconocidos por uroquinasa uPA (SEQ ID NO: 46) y MMP de metaloproteasa (SEQ ID NO: 45) debido a que el péptido efector experimentará una escisión en el entorno del tumor. Además, la secuencia del péptido efector tiene unido en su C-terminal una secuencia de transporte que consta de 6 residuos de arginina. La secuencia de transporte ayuda en la penetración de la membrana celular y transporte de la proteína de fusión en la célula.

La estructura de la proteína de fusión es mostrada esquemáticamente en la figura 4 y su secuencia de aminoácidos y la secuencia que codifica al ADN que comprende los codones optimizados para la expresión en E. coli es, respectivamente, SEQ ID NO: 18 y SEQ ID NO: 67 como es mostrado en el Listado de Secuencia adjunto.

La secuencia de aminoácido SEQ ID NO: 18 de la estructura descrita antes fue utilizada como una plantilla para generar su secuencia de ADN de codificación SEQ ID NO: 67. Se genera un plásmido que contiene la secuencia codificante de ADN y la sobreexpresión de la proteina de fusión se lleva a cabo de acuerdo con los procedimientos generales descritos anteriormente. La sobreexpresión se realizó de acuerdo con el procedimiento general B, usando E. coli B.21 (DE3) o las cepas Tuner (DE3) de Novagen. La proteína se separa por electroforesis de acuerdo con el procedimiento general descrito antes.

EJEMPLO 19 La proteína de fusión de SEQ ID NO: 19 La proteína de SEQ ID NO: 19 es una proteína de fusión que tiene una longitud de 22.54 kDa, en donde en el N-terminal de la secuencia TRAIL121-281 una melitina (SEQ ID NO: 39) se une como un péptido efector. Entre el péptido efector y el N-terminal del dominio TRAIL se incorporan consecutivamente juntas entre sí otras secuencias de los sitios de escisión reconocidos por uroquinasa uPA (SEQ ID NO: 46) y MMP de metaloproteasa (SEQ ID NO: 45) debido a que el péptido efector experimentará una escisión en el entorno del tumor.

La estructura de la proteína de fusión es mostrada esquemáticamente en la figura 4 y su secuencia de aminoácidos y la secuencia que codifica al ADN que comprende los codones optimizados para la expresión en E. coli es, respectivamente, SEQ ID NO: 19 y SEQ ID NO: 68 como es mostrado en el Listado de Secuencia adjunto.

La secuencia de aminoácido SEQ ID NO: 19 de la estructura descrita antes fue utilizada como una plantilla para generar su secuencia de ADN de codificación SEQ ID NO: 68. Se genera un plásmido que contiene la secuencia codificante de ADN y la sobreexpresion de la proteína de fusión se lleva a cabo de acuerdo con los procedimientos generales descritos anteriormente. La sobreexpresion se realizó de acuerdo con el procedimiento general B, usando E. coli B.21 (DE3) o las cepas Tuner (DE3) de Novagep. La proteína se separa por electroforesis de acuerdo con el procedimiento general descrito antes.

EJEMPLO 20 La proteína de fusión de SEQ ID NO: 20 La proteína de SEQ ID NO. 20 es una proteína de fusión que tiene la longitud de 184 aminoácidos y la masa de 21.4 kDa, en donde en el N-terminal de la secuencia TRAIL121-281 un péptido de 6-aminoácídós C2 derivados de abeja defensina (SEQ ID NO: 40) se une como un péptido efector. Entre el péptido efector y el N-terminal del dominio TRAIL se incorporan consecutivamente juntas entre sí otras secuencias de los sitios de escisión reconocidos por uroquinasa uPA (SEQ ID NO: 46) y MMP de metaloproteasa (SEQ ID NO: 45) debido a que el péptido efector experimentará una escisión en el entorno del tumor. Además, la secuencia del péptido efector tiene unido en su C-terminal una secuencia de transporte que consta de 6 residuos de arginina. La secuencia de transporte ayuda en la penetración de la membrana celular y transporte de la proteína de fusión en la célula.

La estructura de la proteína de fusión se muestra esquemáticamente en la figura 4 y su secuencia de aminoácidos y la secuencia codificante de ADN que comprende codones optimizados para la expresión en E. coli son, respectivamente, SEQ ID NO: 20 y SEQ ID NO: 69 como es mostrado en el Listado de Secuencia adjunto.

La secuencia de aminoácido SEQ ID NO: 20 de la estructura descrita antes fue utilizada como una plantilla para generar su secuencia de ADN de codificación SEQ ID NO: 69. Se genera un plásmido que contiene la secuencia codificante de ADN y la sobreexpresión de la proteína de fusión se lleva a cabo de acuerdo con los procedimientos generales descritos anteriormente. La sobreexpresión se realizó de acuerdo con el procedimiento general B, usando E. coli B.21 (DE3) o las cepas Tuner (DE3) de Novagen. La proteína se separa por electroforesis de acuerdo con el procedimiento general descrito antes.

EJEMPLO 21 La proteína de fusión de SEQ ID NO: 21 La proteína de SEQ ID NO: 21 es una proteína de fusión con una longitud de 189 aminoácidos y la masa de 21.4 kDa, en donde en el N-terminal de la secuencia TRAIL121-281 hay unidas dos secuencias repetidas de péptido de 8-aminoácidos de unión al ligando FGF-2 (SEQ ID NO: 41 ) como un péptido efector. Entre las secuencias del péptido efector se incorporan consecutivamente juntas entre sí, las secuencias de los sitios de escisión reconocidas por uroquinasa uPA (SEQ ID NO: 46) y MMP de metaloproteasa (SEQ ID NO: 45) debido a que el péptido efector experimentará una escisión en el entorno del tumor. Además, entre el segundo péptido efector y la secuencia del dominio TRAIL se incorporó un enlazador que consta de dos residuos de glicina que ayuda en la estabilización de la estructura trimérica La estructura de la proteína de fusión es mostrada esquemáticamente en la figura 5 y su secuencia de aminoácidos y la secuencia que codifica al ADN que comprende los codones optimizados para la expresión en E. coli es, respectivamente, SEQ ID NO: 21 y SEQ ID NO: 70 como es mostrado en el Listado de Secuencia adjunto.

La secuencia de aminoácido SEQ ID NO: 21 de la estructura descrita antes fue utilizada como una plantilla para generar su secuencia de ADN de codificación SEQ ID NO: 70. Se genera un plásmido que contiene la secuencia codificante de ADN y la sobreexpresion de la proteína de fusión se lleva a cabo de acuerdo con los procedimientos generales descritos anteriormente. La sobreexpresion se realizó de acuerdo con el procedimiento general B, usando E. coli B.21 (DE3) o las cepas Tuner (DE3) de Novagen. La proteína se separa por electroforesis de acuerdo con el procedimiento general descrito antes.

EJEMPLO 22 La proteína de fusión de SEQ ID NO: 22 La proteína de SEQ ID NO: 22 es una proteína de fusión que tiene la longitud de 188 aminoácidos y la masa de 21.6 kDa, en donde en el N-terminal de la secuencia TRAIL119-281 un péptido de 15-aminoácidos lasioglosina LL2 (SEQ ID NO: 42) se une como un péptido efector. Entre las secuencias del péptido efector y el N-terminal del dominio TRAIL se incorporan consecutivamente juntas entre sí, las secuencias de los sitios de escisión reconocidas por uroquinasa uPA (SEQ ID NO: 46) y MMP de metaloproteasa (SEQ ID NO: 45) debido a que el péptido efector experimentará una escisión en el entorno del tumor.

La estructura de la proteína de fusión es mostrada esquemáticamente en la figura 5 y su secuencia de aminoácidos y la secuencia que codifica al ADN que comprende los codones optimizados para la expresión en E. coli es, respectivamente, SEQ ID NO: 22 y SEQ ID NÓ: 71 como es mostrado en el Listado de Secuencia adjunto.

La secuencia de aminoácido SEQ ID NO: 22 de la estructura descrita antes fue utilizada como una plantilla para generar su secuencia de ADN de codificación SEQ ID NO: 71. Se genera un plásmido que contiene la secuencia codificante de ADN y la sobreexpresión de la proteína de fusión se lleva a cabo de acuerdo con los procedimientos generales descritos anteriormente. La sobreexpresión se realizó de acuerdo con el procedimiento general B, usando E. coli B.21 (DE3) o las cepas Tuner (DE3) de Novagerí. La proteína se separa por electroforesis de acuerdo con el procedimiento general descrito antes.

EJEMPLO 23 La proteína de fusión de SEQ ID NO: 23 La proteína de SEQ ID NO: 23 es una proteína de fusión que tiene la longitud de 193 aminoácidos y la masa de 21.6 kDa, en donde en el N-terminal de la secuencia TRAIL121-281 un péptido de 13-aminoácidos que actúa como un inhibidor de las interacciones RasGAP - Aurora B (SEQ ID NO: 43) se une como un péptido efector. Entre la secuencia del péptido efector y el dominio TRAIL se incorporan consecutivamente juntas entre si, las secuencias de los sitios de escisión reconocidas por uroquinasa uPA (SEQ ID NO: 46) y MMP de metaloproteasa (SEQ ID NO: 45) debido a que el péptido efector experimentará una escisión en el entorno del tumor. Además, la secuencia del péptido efector tiene unido en su C-terminal una secuencia de transporte que consta de 8 residuos de arginina. La secuencia de transporte ayuda en la penetración de la membrana celular y transporte de la proteina de fusión en la célula. Además, entre la secuencia del sitio de escisión de metaloproteasa y la secuencia del dominio TRAIL se incorpora un residuo de cisteina que ayuda en la estabilización de la estructura trimérica.

La estructura de la proteina de fusión es mostrada esquemáticamente en la figura 5 y su secuencia de aminoácidos y la secuencia que codifica al ADN que comprende los codones optimizados para la expresión en E. coli es, respectivamente, SEQ ID NO: 23 y SEQ ID NO: 72 como es mostrado en el Listado de Secuencia adjunto.

La secuencia de aminoácido SEQ ID NO: 23 de la estructura descrita antes fue utilizada como una plantilla para generar su secuencia de ADN de codificación SEQ ID NO: 72. Se genera un plásmido que contiene la secuencia codificante de ADN y la sobreexpresión de la proteína de fusión se lleva a cabo de acuerdo con los procedimientos generales descritos anteriormente. La sobreexpresión se realizó de acuerdo con el procedimiento general B, usando E. coli B.21 (DE3) o las cepas Tuner (DE3) de Novagen. La proteína se separa por electroforesis de acuerdo con el procedimiento general descrito antes.

EJEMPLO 24 La proteína de fusión de SEQ ID NO: 24 La proteína de SEQ ID NO: 24 es una proteina de fusión que tiene la longitud de 243 aminoácidos y la masa de 27.8 kDa, en donde én el C-terminal de la secuencia TRAIL95-281 un fragmento de 38-aminoácidós del péptido p16 fusionado con un dominio de transporte de 17-aminoácidos de anteanapedía (SEQ ID NO: 33) se une como un péptido efector. Entre la secuencia del péptido efector y el dominio TRAIL se incorporan consecutivamente juntas entre sí, las secuencias de los sitios de escisión reconocidas por metaloproteasa MMP (SEQ ID NO: 45) y uroquinasa uPA (SEQ ID NO: 46) debido a que el péptido efector experimentará una escisión en el entorno del tumor. Además, entre la secuencia de TRAIL y la secuencia del sitio de escisión reconocido por metaloproteinasa MMP se incorpora un enlazador flexible cisteína - alanina (SEQ ID NO: 47).

La estructura de la proteína de fusión es mostrada esquemáticamente en la figura 5 y su secuencia de aminoácidos y la secuencia que codifica al ADN que comprende los codones optimizados para la expresión en E. coli es, respectivamente, SEQ ID NO. 24 y SEQ ID NO: 73 como es mostrado en el Listado de Secuencia adjunto.

La secuencia de aminoácido SEQ ID NO: 24 de la estructura descrita antes fue utilizada como una plantilla para generar su secuencia de ADN de codificación SEQ ID NO: 73. Se genera un plásmido que contiene la secuencia codificante de ADN y la sobreexpresión de la proteína de fusión se lleva a cabo de acuerdo con los procedimientos generales descritos anteriormente. La sobreexpresión se realizó de acuerdo al procedimiento general A, usando la cepa E. coli Tuner (DE3) de Novagen. La proteína se separa por electroforesis de acuerdo con el procedimiento general descrito antes.

EJEMPLO 25 La proteína de fusión de SEQ ID NO: 25 La proteína de SEQ ID NO: 25 es una proteína de fusión que tiene la longitud de 199 aminoácidos y la masa de 23.4 kDa, en donde en el N-terminal de la secuencia TRAIL120-281 el análogo del péptido Pep27 (SEQ ID NO: 44) se une como el péptido efector. Entre las secuencias del péptido efector y el N-term¡nal del dominio TRAIL se incorporan consecutivamente juntas entre sí, las secuencias de los sitios de escisión reconocidas por uroquinasa uPA (SEQ ID NO: 46) y MMP de metaloproteasa (SEQ ID NO: 45) debido a que el péptido efector experimentará una escisión en el entorno del tumor.

La estructura de la proteína de fusión es mostrada esquemáticamente en la figura 5 y su secuencia de aminoácidos y la secuencia que codifica al ADN que comprende los codones optimizados para la expresión en E. coli es, respectivamente, SEQ ID NO: 25 y SEQ ID NO: 74 como es mostrado en el Listado de Secuencia adjunto.

La secuencia de aminoácido SEQ ID NO: 25 de la estructura descrita antes fue utilizada como una plantilla para generar su secuencia de ADN de codificación SEQ ID NO: 74. Se genera un plásmido que contiene la secuencia codificante de ADN y la sobreexpresión de la proteína de fusión se lleva a cabo de acuerdo con los procedimientos generales descritos anteriormente. Se realizó la sobreexpresión de acuerdo con el procedimiento general B, usando E. coli BL21 (DE3) o la cepa E. coli Tuner (DE3) de Novagen. La proteína se separa por electroforesis de acuerdo con el procedimiento general descrito antes.

EJEMPLO 26 Examen de actividad anti-tumor de las proteínas de fusión El examen de actividad anti-tumor de las proteínas de fusión fue llevado a cabo in vitro en un ensayo de citotoxicidad en líneas celulares de tumor y en ratones in vivo. Para propósitos de comparación, la proteína rhTRAIL.114-281 y placebo fueron utilizados. 1. Medición de dicroísmo circular La calidad de las preparaciones de las proteínas de fusión en términos de sus estructuras se determinó por el dicroismo circular (CD) para el Ej. 1a, Ej. 2a, y Ej. 8a.

El dicroismo circular pará la determinación de las estructuras secundarias y conformación de las proteínas. El método de CD utiliza la actividad óptica de las estructuras de proteína, manifestado en la rotación del plano de polarización de luz y la aparición de polarización elíptica. El espectro de CD de las proteínas en el ultravioleta (UV) lejano proporciona datos precisos en la conformación de la cadena de polipéptido principal.

Las muestras de la proteína a ser analizada, después de la formulación en un regulador de pH que consta de 50 mM Tns-HCI pH 8.0; 100 mM NaCI, 10% glicerol, 0.1 mM ZnCI2, 80 mM sacarosa, 5mM DTT, se dializaron en las bolsas de diálisis (Sigma-Aldrich) con un corte de 12 kDa. La diálisis fue realizada contra 100 veces exceso de regulador de pH (v/v) comparado con las preparaciones de proteina con agitación durante varias horas a 4o C. Después de que la diálisis fuera completada, cada preparación fue centrifugada (25,000 rpm, 10 min., 4°C) y los sobrenadantes apropiados fueron recolectados. La concentración de la proteina en las muestras así obtenida fue determinada por el método de Bradford.

La medición de dicroismo circular para las proteínas en el intervalo de concentración de 0.1-2.7 mg/ml se realizó en un espectropolarímetro Jasco J-710, en una cubeta de cuarzo con una vía óptica de 0.2 mm o 1 mm. La medición se realizó bajo el flujo de nitrógeno en 7 l/minuto, que permitió realizar la medición en el intervalo de longitud de Onda de 195 a 250 nm. Los parámetros de la medición: resolución espectral de - 1 nm; ancho medio del haz de luz 1 nm; sensibilidad 20 mdeg, el tiempo que promedia para una longitud de onda - 8 s, velocidad de escáner 10 nm/min.

Los resultados fueron presentados como el promedio de tres mediciones. Los espectros circulares de dicroismo para rhTRAILI 14r281 , y las proteínas del ejemplo 1a, Ej. 2a y Ej. 8a se presentaron en las figuras 6A-6B.

Los espectros obtenidos fueron analizados numéricamente en el intervalo de 193-250 nm utilizando software de CDPro. Los puntos para los que el voltaje en el fotomultiplicador excedió 700 V fueron omitidos, debido a la muy baja relación de señal a ruido en este intervalo de longitud de onda.

Los datos obtenidos sirvieron para cálculos de contenido de estructuras secundarias particulares en las proteínas analizadas con el uso del software de CDPro (Cuadro 1 ).

CUADRO 1 Contenido de estructuras secundarias en las proteínas analizadas * Valor obtenido en la base de la estructura cristalina 1 D4V La molécula de control (rhTRAIL 14-281) muestra un espectro CD característico para las proteínas con las estructuras tipo hoja-ß predominantemente (elipticidad resumida severamente un mínimo en la longitud de onda de 220 nm). Esto confirma el cálculo de los componentes de estructura secundarios, sugiriendo un número marginal de elementos a-helicoídal.

El resultado obtenido también es consistente con los datos de la estructura cristalina de la proteína hTRAIL, y característica de las proteínas de fusión del Ej. de la invención 1a, Ej. 2a y Ej., en donde los elementos beta constituyen el 32-44% de su estructura.

En el caso de todas las modalidades, los espectros de dicroismo se caracterizaron un mínimo en la longitud de onda 220 nm.

Ya que los péptidos pequeños unidos a TRAIL constituyen una pequeña porción de la proteína y no necesitan crear una estructura secundaria definida, las proteínas analizadas no difieren de forma significativa de la proteína de inicio. 2. Pruebas en líneas celulares in vitro Lineas celulares CUADRO 2 Líneas celulares adherentes CUADRO 3 Células no adherentes Prueba de citotoxicidad MTT El ensayo MTT es un ensayo colorimétrico usado para medir la proliferación, viabilidad y citotoxicidad de las células. Consiste en la descomposición de una sal de de amarillo de tetrazolio MTT (bromuro de 4,5- dimetil-2-tiazolil)-2,5-difeniltetrazolio) al tinte púrpura insoluble en agua formazan por reductasa 1 de succionato-tetrazolio de enzima mitocondrial. Reducción de MTT se produce solamente en las células vivas. El análisis de los datos consiste en determinar la concentración de IC50 de la proteína (en ng/MI) en la que ocurre 50% de reducción en el número de células en la población tratada comparada con las células de control. Los resultados fueron analizados utilizando el software GraphPad Prims 5.0. La prueba se realiza de acuerdo con las descripciones de la literatura (Cell's, JE, (1998). Cell Biology, a Laboratory Handbook, second edition, Academic Press, San Diego; Yang, Y., Koh, LW, Tsai, JH., (2004); Involvement of viral and chemical factors with oral cáncer in Taiwan, Jpn J Clin Oncol, 34 (4), 176-183).

El medio de cultivo celular fue diluido hasta una densidad definida (104 - 105 células por 100 µ?). Entonces 100 µ? de suspensión celular apropiadamente diluida fue aplicada a una placa de 98 pozos por triplicado. De esta manera las células se incubaron durante 24 horas a 37°C en 5% o 10% CO2, dependiendo en el medio usado, y después a las células (en 100 µ? de medio) 100 µ? adicionales del medio que contiene varias concentraciones de las proteínas probadas se añadieron. En el caso de la combinación de la proteína efectora hTRAIL1 14-281 y p21WAF, 100 µ? del medio que contiene la mezcla de la proteína efectora hTRAIL114-281 y p21WAF en relación molar 1 :1 se añadió. Después de la incubación de las células con las proteínas probadas durante el período de las siguientes 72 horas, que equivale a 3-4 veces la división celular, el medio con la proteína de prueba fue agregado con 20 mi de solución de trabajo de MTT [5 mg/ml] y la incubación fue continuada por 3 h a 37°C en 5% de C02. Entonces el medio con solución de MTT fue removido, y los cristales de formazan fueron disueltos agregando 100 µ? de DMSO. Después de agitación, la absorbancia fue medida a 570 nm (filtro de referencia de 690 nm).

Prueba de citotoxicidad EZ4U Fue utilizada la prueba de EZ4U (Biomedica) para probar la actividad citotóxica de las proteínas en líneas celulares no adherentes. La prueba es una modificación del método MTT, en donde se forma formazan en la reducción de sal de tetrazolio es soluble en agua. El estudio de viabilidad celular fue llevado a cabo después de incubación de 72 horas continuas de las células con proteína (siete concentraciones de proteina, cada una por triplicado). En esta base fueron determinados los valores de IC5o (como un promedio de dos experimentos independientes) utilizando el software de GraphPad Prism 5. Las células de control se incubaron con solvente solamente.

Los resultados de las pruebas de citotoxicidad in vitro se resumieron como valores IC50 (ng/ml), que corresponde a la concentración de la proteína en donde el efecto citotóxico de las proteínas de fusión se observa en el nivel del 50% con respecto a las células de control tratadas solamente con solvente. Cada experimento representa el valor promedio de por lo menos dos experimentos independientes realizados por triplicado. Como un criterio de falta de actividad de preparaciones en el límite del IC50 de 2000 ng/ml fue adoptado. Las proteínas de fusión con un valor de IC5o por encima de 2000 se consideran inactivas.

Las células seleccionadas para esta prueba incluyen las líneas celulares tumorales que son resistentes naturalmente a la proteína TRAIL (el criterio de las resistencia natural a TRAIL: IC50 para la proteina TRAIL > 2000), así como líneas celulares tumorales sensibles a la proteína TRAIL y resistente a la línea de doxorrubicina MES-SA/DX5 como una línea resistente a los medicamentos anticancerígenos convencionales.

La línea celular indiferenciada de HUVEC fue utilizada como una línea de célula de control de salud para la evaluación del efecto/toxicidad de las proteínas de fusión en células no de cáncer.

Los resultados obtenidos confirman la posibilidad de superar la resistencia de las lineas celulares a TRAIL por administración de ciertas proteínas de fusión de la invención a células naturalmente resistentes a TRAIL. Cuando las proteínas de fusión de la invención se administraron a las células sensibles a TRAIL, en algunos casos una potenciación clara y fuerte de la potencia de acción se observó, que se manifestó en valores reducidos de IC50 de la proteína de fusión en comparación con IC50 para el TRAIL solamente. Además, la actividad citotóxica de la proteína de fusión dé la invención en las células resistentes al medicamento doxorrubicina anticancerígeno clásico se obtuvo, y en algunos casos es más fuerte que la actividad de TRAIL solamente.

Los valores de IC50 sobre 2000 obtenidos para las líneas celulares no cancerígenas muestran la ausencia de efectos tóxicos asociados con el uso de proteínas de la invención para las células saludables, lo que indica la toxicidad sistémica baja potencial de la proteína.

Los resultados obtenidos para la combinación del péptido efector hTRAIL1 14-281 y p21WAF que consta de una mezcla de hTRAIL1 14-281 y péptido efector derivado de 20-aminoácidos p21WAF (síntesis de fase sólida habitual) en una relación molar 1 :1 , en comparación con los resultados obtenidos para la proteína de fusión del Ej. 8b (que comprende hTRAIL121 -281 y péptido efector derivado de 20-aminoácidos p21WAF) y con los resultados obtenidos para la molécula sencilla de hTRAIL114-281 y la molécula sencilla del péptido efector derivado de p21WAF revelaron las propiedades ventajosas de la proteína de fusión sobre sus constituyentes sencillos y su combinación, La proteina de fusión del Ej. 8b supera la resistencia a TRAIL de la línea celular A549. En el caso de las líneas celulares sensibles TRAIL la proteína de fusión de Ej. 8b revela actividad citotóxica más alta que las moléculas sencillas de hTRAIL114-281 y el péptido derivado de p21WAF, Determinación de la actividad citotóxica de las preparaciones de la proteína seleccionada contra el panel extendido de las líneas celulares tumorales El cuadro 4 presenta los resultados de las pruebas de la actividad citotóxica in vitro para las proteínas de fusión seleccionadas de la invención contra un amplio panel de células tumorales de diferentes órganos, correspondientes al amplio intervalo de cánceres más comunes.

Los resultados experimentales se presentan como un valor medio ± desviación estándar (SD). Todos los cálculos y las gráficas fueron preparados utilizando el software GraphPad Prims 5.0.

Los valores de IC50 obtenidos confirman la alta actividad citotóxica de las proteínas de fusión y así su utilidad potencial en el tratamiento de cáncer.

CUADRO 4 Análisis de actividad citotoxica de preparaciones de proteína seleccionadas contra el panel amplio de líneas de células tumorales CUADRO 4 (CONTINUACIÓN) CUADRO 4 (CONTINUACIÓN) CUADRO 4 (CONTINUACIÓN) CUADRO 4 (CONTINUACIÓN) CUADRO 4 (CONTINUACIÓN) CUADRO 4 (CONTINUACIÓN) CUADRO 4 (CONTINUACIÓN) CUADRO 4 (CONTINUACIÓN) CUADRO 4 (CONTINUACIÓN) 2. Efectividad antitumoral de proteínas de fusión in vivo en xenoinjertos La actividad antitumoral de preparaciones de proteína se probó en un modelo de ratón de cáncer de colon humano HCT1 6, cáncer de colon humano Colo205, modelo de cáncer de colon humano SW620, modelo de cáncer de hígado humano HepG2, y modelos de cáncer de hígado humano NCI-H460 y NCI-H460-Luc2.

Las proteínas probadas para la actividad antitumoral en xenoinjertos expresados originalmente con la etiqueta histidina que posteriormente se removió se designan como a) en el Ej. No. Las proteínas que fueron expresadas originalmente sin etiqueta de histidina son designadas como b) en el ejemplo No.

Células Las células HCT116 (en ratones Crl:CD1-Foxnru 1), Colo205, NCI-H460, NCI-H460-Luc2 se mantuvieron en medio RPMI 1640 (Hyclbhe, Logan, UT, USA) mezclado en la relación de 1 :1 con Optí-MEM ((Invitrogen, Cat.22600-134) complementado con 10% de suero de ternero fetal y 2 mM glutamina. En el día del injerto de los ratones, las células fueron separadas del soporte lavando las células con tripsina (Invitrogen), entonces las células fueron centrifugadas a 1300 rpm, 4o C, 8 min., suspendidas en búfer de HBSS (medio de Hanks), contadas y diluidas a la concentración de 25x106 células/ml.

El HCT 16 (en ratones Crl:SHO-PrkdcscidHrhr) se mantuvo alternativamente en medio de McCoy (Hyclone, Logan, UT, USA) complementado con 10% de suero de ternero fetal y 2 mM glutamina. En el día del injerto de los ratones, las células fueron separadas del soporte lavando las células con tripsina (Invitrogen), entonces las células fueron centrifugadas a 1300 rpm, 4° C, 8 min., suspendidas en búfer de HBSS (medio de Hanks), contadas y diluidas a la concentración de 25x106 células/ml.

Las células SW620 se mantuvieron en DMEM (HyClone, Logan, UT, USA) complementado con 10% de suero d eternero fetal y 2 mM glutamina. En el día del injerto de los ratones, las células fueron separadas del soporte lavando las células con tripsina (Invitrogen), entonces las células fueron centrifugadas a 1300 rpm, 4o C, 8 min., suspendidas en búfer de HBSS (medio de Hanks), contadas y diluidas a la concentración de 25x106 células/ml.

Las células HepG2cells fueron mantenidas en MEM (HyClone, Logan, UT, USA) suplementadas con 10% suero bovino fetal y 2 mM glutamina. En el día del injerto de los ratones, las células fueron separadas del soporte lavando las células con tripsina (Invitrogen), entonces las células fueron centrifugadas a 1300 rpm, 4o C, 8 min., suspendidas en búfer de HBSS (medio de Hanks), contadas y diluidas a la concentración de 25x106 células/ml.

Ratones El examen de la actividad antitumoral de proteínas de la invención se conduce en ratones sin pelaje CD de 7-9 semanas de edad (Crl:CD1 -Foxn1nu 1 ) oo 4-6 semanas de edad Crl:SHO-PrkdcscidHrhr obtenidos de Charles River Alemania. Los ratones se mantienen bajo condiciones libres de patógenos específicas con libre acceso a los alimentos y agua desmineralizada (ad libitum). Todos los experimentos con animales se llevan a cabo de acuerdo con las líneas guía: "Interdiscíplínary Principies and Guidelines for the Use of Animáis in Research, Marketing and Education" issued by the New York Academy of Sciences' Ad Hoc Committee on Animal Research and were approved by the IV Local Ethics Committee on Animal Experímentation in Warsaw (No. 71/2009).

Transcurso v evaluación de los experimentos Modelo de cáncer de colon humano Ratones CD-sin pelaje (Crl:CD1 -Foxn1nu 1 ) Modelo HCT1 16 En el día 0 ratones Crl:CD1 -Foxn1nu 1 fueron injertados subcutáneamente (se) en el lado derecho con 5x106 de células HCT1 16 suspendidas en 0.2 mi de HBSS amortiguado por medio de una jeringa con una aguja de 0.5 x25 mm (Bogmark). Cuando los tumores alcanzaron el tamaño de~ 55-68 mm3 (día 8), los ratones fueron aleatorizados para obtener el tamaño promedio de tumores en el grupo de ~ 63 mm3 y asignados a grupos de tratamiento. Los grupos de tratamiento fueron administrados con las preparaciones de proteínas de fusión de la invención del Ej. 2a (10 mg/kg) y rhTRAIL.1 14-281 (10 mg/kg) como una comparación. Las preparaciones se administraron de forma intravenosa (i.v.) siguiendo el esquema 10 aplicaciones diariamente con un descanso de dos días después de las primeras 5 aplicaciones. Cuando un grupo terapéutico alcanzó el tamaño promedio de tumor de ~ 1000 mm3, los ratones fueron sacrificados por interrupción de la médula espinal. El grupo de control, recibió rhTRAIL1 14-281.

Los resultados experimentales obtenidos en ratones Crl:CD1-Foxn1nu cargados con cáncer de colon HCT1 16 tratados con proteínas de fusión de la invención del ejemplo 2a y comparativamente con rhTRAIL114-281 se muestran en la figura 7 como un diagrama de cambios del volumen del tumor y en la figura 8 que muestra inhibición del crecimiento tumoral (%TGI) como el porcentaje de control.

Los resultados experimentales obtenidos en ratones Crl:CD1-Foxn1nu cargados con cáncer de colon HCT 16 tratados con proteiná de fusión de la invención del Ej. 2a y comparativamente con rhTRAIL1 14-281 se muestran en la figura 7 como un diagrama de cambios del volumen del tumor y en la figura 8 que muestra inhibición del crecimiento tumoral (%TGI) corrió el porcentaje de control.

Los resultados de los experimentos presentados en las gráficas en las Figuras 7 y 8 muestran que administración de la proteína de fusión de la invención del ejemplo 2a causó inhibición del crecimiento tumoral HCT1 16, con TGI 71.2% en relación con el control en el día 27 del experimento. Para rhTRAIL1 14-281 utilizado como la referencia comparativa, un efecto inhibitorio leve en el crecimiento de las células de tumor fue obtenido con respecto al control, con TGI en el nivel de 44%. Así, las proteínas de fusión de la invención ejercen un efecto mucho más fuerte comparadas con la TRAIL sóla.

En el día 0 ratones Crl:CD1 -Foxní"ü 1 fueron injertados subcutáneamente (se) en el lado derecho con 5x106 de células HCT1 16 suspendidas en 0.2 mi de HBSS amortiguado por medio de una jeringa con una aguja de 0.5 x25 mm (Bogmark). Cuando los tumores alcanzaron el tamaño de~ 50-1 10 mm3 (día 23), los ratones fueron aleatorízados para obtener el tamaño promedio de tumores en el grupo de ~ 85 mm3 y asignados a grupos de tratamiento. Los grupos de tratamiento fueron administrados: con las preparaciones de proteínas de fusión de la invención del ejemplo 8a (10 mg/kg) y rhTRAIL1 14-281 (10 mg/kg) como una comparación. Las preparaciones fueron administradas intravenosamente (i.v.) diario durante diez días. Cuando un grupo terapéutico alcanzó el tamaño promedio de tumor de ~ 1000 mm3, los ratones fueron sacrificados por interrupción de la médula espinal. El grupo de control, recibió rhTRAIL1 14-281.

Los resultados experimentales obtenidos en ratones Crl:CD1- Foxn1nu cargados con cáncer de colon HCT1 6 tratados con proteínas de fusión de la invención del ejemplo 8a y comparativamente con rhTRAIL1 14-281 se muestran en la figura 1 1 como un diagrama de cambios del volumen del tumor y en la figura 12 que muestra inhibición del crecimiento tumoral (%TGI) como el porcentaje de control.

Los resultados experimentales obtenidos en ratones Crl:CD1-Foxn1nu cargados con cáncer de colon HCT1 16 tratados con proteiria de fusión de la invención del Ej. 8a y comparativamente con rhTRAIL114-281 se muestran en la figura 1 1 como un diagrama de cambios del volumen del tumor y en la figura 12 que muestra inhibición del crecimiento tumoral (%TGI) como el porcentaje de control.

Los resultados de los experimentos presentados en las gráficas en las Figuras 11 y 12 muestran que administración de la proteina de fusión de la invención del ejemplo 8a causó inhibición del crecimiento tumoral HCT1 16, con TGI 53.3 en relación con el control en el día 31 del experimento. Para rhTRAIL1 14-281 utilizado como la referencia comparativa, un efecto inhibitorio leve en el crecimiento de las células de tumor fue obtenido con respecto al control, con TGI en el nivel de 21.8%. Así, las proteínas de fusión de la invención ejercen un efecto mucho más fuerte comparadas con la TRAIL sola.

Ratones Crl:SHO-PrkdcscldHr' Modelo HCT116 En el día 0 los ratones Crl:SHO-PrkdcscidHrhr fueron injertados subcutáneamente (se) en el lado derecho con 5x106 de HCT116 células suspendidas en 0.1 mi 3:1 mezcla de regulador de pH HBSS:Matrigel por medio de una jeringa con una aguja de 0.5 x25 mm (Bogmark). Cuando los tumores alcanzan un tamaño de 71-432 mm3 (día 13), los ratones se asignaron al azar para obtener el tamaño promedio de tumores en el grupo de -180 mm3 y asignados a los grupos de tratamiento. Los grupos de tratamiento fueron administrados con las preparaciones de proteínas de fusión de la invención del ejemplo 8b (50 mg/kg), y rhTRAIL1 14-281 (65 mg/kg) como una comparación contra el regulador de pH de formulación (50 mM Trizma Base, 200 mM NaCI, 5 mM glutationa, 0.1 mM ZnCI2, 10% glicerol, 80 mM sacarosa, pH 8.0). Las preparaciones se administraron por vía intravenosa (/'.</.) siguiendo el esquema 10 aplicaciones diarias con un descanso de dos días después de las primeras aplicaciones.

Cuando un grupo terapéutico alcanzó el tamaño promedio de tumor de ~ 1000 mm3, los ratones fueron sacrificados por interrupción de la médula espinal. El grupo de control, recibió rhTRAIL114-281.

Los resultados experimentales obtenidos en ratones Crl:SHO-Prkdcsc,dHrhr cargados con cáncer de colon HCT1 16 tratados con la proteína de fusión de la invención del Ej.8b, y comparativamente con rhTRAIL1 14-281 se muestran en la figura 1 1A como un diagrama de cambios del volumen del tumor, y en la figura 12A que muestra inhibición del crecimiento del tumor (%TGI) como el porcentaje de control.

Los resultados de los experimentos presentados en las gráficas en las figuras 1 A y 12A muestran que la administración de la proteína de fusión de la invención Ej.8b causó la inhibición del crecimiento tumoral HCT1 16, con TGI 70% relativo con el control en el día 24 del experimento. Para rhTRAIL1 14-281 utilizado como la referencia comparativa, un efecto inhibitorio leve en el crecimiento de las células de tumor fue obtenido con respecto al control, con TGI en el nivel de 38%. De esta amanera, la proteína de fusión de la invención ejerce un efecto mucho más fuerte en comparación con rhTRAIL114-281 solamente.

Modelo SW620 En el día 0 los ratones Crl:SHO-PrkdcscldHrhr se injertaron por vía subcutánea (se) en el lado derecho con 5x106 de células SW620 suspendidas en 0.1 mi 3:1 de mezcla de regulador de pH HBSS:Matrigel por medio de una jeringa con una aguja 0.5 x25 mm (Bogmark). Cuando los tumores alcanzan un tamaño de 280-340 mm3 (día 17), los ratones se asignaron al azar para obtener el tamaño promedio de tumores en el grupo de -320 mm3 y asignados a los grupos de tratamiento. Los grupos de tratamiento se administraron con las preparaciones de las proteínas de fusión de la invención de Ej.8b (40 mg/kg), y rhTRAIL114-281 (30 mg/kg) como una comparación contra el regulador de pH de formulación (5 mM NaH2P04, 95 mM Na2HP04l 200 mM NaCI, 5 mM glutationa, 0.1 mM ZnCI2, 10% glicerol, 80 mM sacarosa, pH 8.0). Las preparaciones fueron administradas intravenosamente (i.v.) seis veces cada segundo día. Cuando un grupo terapéutico alcanzó el tamaño promedio de tumor de ~ 1000 mm3, los ratones fueron sacrificados por interrupción de la médula espinal. El grupo de control, recibió rhTRAM 14-281.

Los resultados experimentales obtenidos en ratones CrLSHO-Prkdcsc,dHrhr cargados con cáncer de colon SW620 tratado con la proteina de fusión de la invención del Ej. 8b, y comparativamente con rhTRAIL114-281 se muestran en la figura 13 como un diagrama de cambios del volumen del tumor, y en la figura 14 que muestra la inhibición del crecimiento tumoral (%TGI) como el porcentaje de control.

Los resultados de los experimentos presentados en las gráficas en las Figuras 13 y 14 muestran que la administración de la proteína de fusión de la invención del ejemplo 8b causó inhibición del crecimiento tumoral SW620, con TGI 44% relativo con el control en el día 31 del experimento. Para rhTRAIL114-281 utilizado como la referencia comparativa, un efecto inhibitorio leve en el crecimiento de las células de tumor fue obtenido con respecto al control, con TGI en el nivel de -9%. Así, las proteínas de fusión de la invención ejercen un efecto mucho más fuerte comparadas con la rhTRAIL 114-281 sola.

Modelo Colo205 En el día 0 los ratones Crl:SHO-PrkdcscidHrhr se injertaron por vía subcutánea (se) en el lado derecho con 5x106 de células Colo205 suspendidas en 0.1 mi 3:1 mezcla de regulador de pH HBSS:Matrigel por medio de una jeringa con una aguja 0.5 x25 mm (Bogmark). Cuando los tumores alcanzan un tamaño de 108-128 mm3 (día 13), los ratones se asignaron al azar para obtener el tamaño promedio de tumores en el grupo de -1 15 mm3 y asignados a los grupos de tratamiento. Los grupos de tratamiento se administraron con las preparaciones de las proteínas de fusión de la invención de Ej.8b (30 mg/kg), y rhTRAIL1 14-281 (30 mg/kg) como una comparación contra el regulador de pH de formulación (5 mM NaH2P0 , 95 mM Na2HP04, 200 mM NaCI, 5 mM glutationa, 0.1 mM ZnCfe, 10% glicerol, 80 mM sacarosa, pH 8.0). Las preparaciones fueron administradas intravenosamente (i.v.) seis veces cada segundo día. Cuando un grupo terapéutico alcanzó el tamaño promedio de tumor de ~ 1000 mm3, los ratones fueron sacrificados por interrupción de la médula espinal. El grupo de control, recibió rhTRAIL1 14-281.

Los resultados experimentales obtenidos en ratones Crl:SHO-PrkdcscldHrhr cargados con cáncer de colon Colo205 tratados con la proteína de fusión de la invención del Ej. 8b, y comparativamente con rhTRAIL114-281 se muestran en la figura 15 como un diagrama de cambios del volumen del tumor, y en la figura 16 que muestra la inhibición del crecimiento tumoral (%TGI) como el porcentaje de control.

Los resultados de los experimentos presentados en las gráficas en las Figuras 15 y 16 muestran que la administración de la proteina de fusión de la invención del ejemplo 8b causó inhibición del crecimiento tumoral Colo205, con TGI 97.6 % relativo con el control en el día 33 del experimento. Para rhTRAIL1 14-281 utilizado como la referencia comparativa, un efecto inhibitorio leve en el crecimiento de las células de tumor fue obtenido con respecto al control, con TGI en el nivel de 18.8%. Así, las proteínas de fusión de la invención ejercen un efecto mucho más fuerte comparadas con la rhTRAIL114-281 sola.

Modelo de cáncer de hígado Ratones Crl:SHO-PrkdcsciqHr' Modelo HepG2 En el día 0 los ratones Crl:SHO-PrkdcscidHrhr se injertaron por vía subcutánea (se) en el lado derecho con 7x106 de células HepG2 suspendidas en 0.1 mi 3:1 mezcla de regulador de pH HBSS.Matrigel por medio de una jeringa con una aguja de 0.5 x25 mm (Bogmark). Cuando los tumores alcanzaron el tamaño de~ 313-374 mm3 (día 19), los ratones fueron aleatorizados para obtener el tamaño promedio de tumores en el grupo de -340 mm3 y asignados a grupos de tratamiento. Los grupos de tratamiento fueron administrados con las preparaciones de proteínas de fusión de la invención del ejemplo 8b (30 mg/kg) y rhTRAIL114-281 (30 mg/kg) como una comparación contra el regulador de pH de formulación (5 mM NaH2PQ4, 95 mM Na2HP04, 200 mM NaCI, 5 mM glutationa, 0.1 mM ZnCI2, 10% glicerol, 80 mM sacarosa, pH 8.0) como un control. Las preparaciones fueron administradas intravenosamente (i.v.) seis veces cada segundo día. Cuando un grupo terapéutico alcanzó el tamaño promedio de tumor de ~ 1000 mm3, los ratones fueron sacrificados por interrupción de la médula espinal. El grupo de control, recibió rhTRAIL1 14-281.

Los resultados experimentales obtenidos en ratones Crl:SHO-PrkdcscldHrhr cargados con cáncer de hígado HepG2 tratados con la proteina de fusión de la invención del ejemplo 8b y comparativamente con rhTRA|L114-281 se muestran en la figura 17 como un diagrama de cambios del volumen del tumor, y en la figura 18 que muestra inhibición del crecimiento tumoral (%TGI) como el porcentaje de control.

Los resultados de los experimentos presentados en las gráficas en las figuras 17 y 18 muestran que la administración de las proteínas de fusión de la invención del ejemplo 8b causó inhibición del crecimiento tumoral HepG2, con TGI 65.7% en relación con el control en el día 33 del experimento. Para rhTRAIL1 14-281 utilizado como la referencia comparativa, un efecto inhibitorio leve en el crecimiento de las células de tumor fue obtenido con respecto al control, con TGI en el nivel de 12.6%. Asi, las proteínas de fusión de la invención ejercen un efecto mucho más fuerte comparadas con la rhTRAIL1 14-281 sola.

Modelo de cáncer de pulmón Ratones: Crl:CD1-Foxn7n" 1 Modelo NCI-H460-Luc2 En el día 0 los ratones Crl:CD1-Foxn1 nu Ifueron injertados por vía subcutánea (se) en el lado derecho con 5x106 de células NCI-H460-Luc2 suspendidas en 0.1 mi de regulador de pH HBSS por medio de una jeringa con una aguja de 0.5 x25 mm (Bogmark). Cuando los tumores alcanzaron el tamaño de- 20-233 mm3 (día 16), los ratones fueron aleatorizados para obtener el tamaño promedio de tumores en el grupo de ~ 110 mm3 y asignados a grupos de tratamiento. Los grupos de tratamiento fueron administrados con las preparaciones de proteínas de fusión de la invención del ejemplo 2a (20 mg/kg) y rhTRAIL1 14-281 (10 mg/kg) como una comparación contra el regulador de pH de formulación f16 (19 mM NaH2P0 , 81 mM Na2HP04, 50 mM NaCI, 5 mM glutationa, 0.1 mM ZnCl2, 10% glicerol, pH 7.4) como un control. Las preparaciones se administran ; pdr vía intravenosa (i.v.) seis veces cada segundo día. Cuando un grupo terapéutico alcanzó el tamaño promedio de tumor de ~ 1000 mm3, los ratones fueron sacrificados por interrupción de la médula espinal. El grupo de control, recibió rhTRAIL1 14-281.

Los resultados experimentales obtenidos en los ratones Crl:SHO-PrkdcscídHrhr cargados con cáncer de pulmón NCI-H460-Luc2 tratado con proteína de fusión de la invención del Ej. 2a y comparativamente con rhTRAIL1 4-281 se muestran en la figura 9 como un diagrama de cambios del volumen del tumor, y en la figura 10 que muestra la inhibición del crecimiento del tumor (%TGI) como el porcentaje del control.

Los resultados de los experimentos presentados en las gráficas en las Figuras 9 y 10 muestran que la administración de la proteína de fusión de la invención del ejemplo 2a causó inhibición del crecimiento tumoral NCI-H460-Luc2, con TGI 81.3% en relación con el control en el día 30 del experimento. Para rhTRAIL1 14-281 utilizado como la referencia comparativa, un efecto inhibitorio leve en el crecimiento de las células de tumor fue obtenido con respecto al control, con TGI en el nivel de 53.1 %. Asi, las proteínas de fusión de la invención ejercen un efecto mucho más fuerte comparadas con la rhTRAIL1 14-281 sola.

Ratones: Crl:SHO-PrkdcscidHrhr Modelo NCI-H460 En el día 0 los ratones Cr SHO-PrkdcscidHrhr se injertaron por vía subcutánea (se) en el lado derecho con 5x106 de células NCI-H460 suspendidas en 0.1 mi de regulador de pHHBSS por medio de una jeringa con una aguja 0.5 x25 mm (Bogmark). Cuando los tumores alcanzan el tamaño de -150-178 mm3 (día 13), los ratones se asignaron al azar para obtener el tamaño promedio de los tumores en el grupo de -160 mm3 y asignado a los grupos de tratamiento. Los grupos de tratamiento fueron administrados con las preparaciones de proteínas de fusión de la invención del ejemplo 8b TRP5 (30 mg/kg) y rhTRAIL1 14-281 (30 mg/kg) como una comparación contra el regulador de pH de formulación (5 mM NaH2P04, 95 mM Na2HP04, 200 mM NaCI, 5 mM glutationa, 0.1 mM ZnCI2, 10% glicerol, 80 mM sacarosa, pH 8.0) como un control. Las preparaciones fueron administradas intravenosamente (i.v.) seis veces cada segundo día. Cuando un grupo terapéutico alcanzó el tamaño promedio de tumor de ~ 1000 mm3, los ratones fueron sacrificados por interrupción de la médula espinal. El grupo de control, recibió rhTRAIL114-281.

Los resultados experimentales obtenidos en los ratones CrLSHO-Prkdc^Hr11' cargados con cáncer de pulmón NCI-H460 tratado con la proteina de fusión de la invención del Ej.8b y comparativamente con rhTRAIL1 14-281 se muestran en la figura 19 como un diagrama de cambios del volumen de tumor, y en la figura 20 que muestra la inhibición del crecimiento tumoral (%TGI) como el porcentaje de control.

Los resultados de los experimentos presentados en las gráficas en las Figuras 19 y 20 muestran que la administración de la proteína de fusión de la invención del ejemplo 8b causó inhibición del crecimiento tumoral NCI-H460, con TGI 61 % relativo con el control en el día 28 del experimento. Para rhTRAIL1 14-281 utilizado como la referencia comparativa, un efecto inhibitorio leve en el crecimiento de las células de tumor fue obtenido con respecto al control, con TGI en el nivel de 17.5%. Así, las proteínas de fusión de la invención ejercen un efecto mucho más fuerte comparadas con la rhTRAIL114-281 sola.

Las proteínas de fusión probadas no causan efectos secundarios significantes que se manifiestan por una disminución del peso corporal de los ratones (es decir, menos del 10% del peso corporal de línea de base). Esto muestra baja toxicidad sistémica de la proteína.

Claims

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Una proteína de fusión que comprende: un dominio (a) que comprende el fragmento funcional de una secuencia de proteína hTRAIL soluble empezando con un aminoácido en una posición no menor que hTRAIL95, o un homólogo de dicho fragmento funcional que tiene por lo menos 70% de identidad de secuencia, y al menos un dominio (b) que es la secuencia de un péptido efector que tiene actividad anti-proliferativa contra las células tumorales, y en donde la secuencia del dominio (b) está unida al C-terminal y/o N-terminal del dominio (a).

2. - La proteína de fusión de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada además porque el dominio (a) comprende un fragmento de secuencia de proteína hTRAIL soluble (SEQ ID NO: 78) iniciando con un aminoácido en el intervalo de hTRAIL95 a hTRAIL121, inclusive, y terminando con el aminoácido 281.

3. - La proteína de fusión de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizada además porque el dominio (a) se selecciona del grupo que consta de hTRAIL95-281 , hTRAIL114-281 , hTRAIL119-281 , hTRAIL120-281 , y hTRAIL121-281.

4. - La proteína de fusión de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada además porque el dominio (b) se selecciona del grupo que consta de: péptido de 16-aminoácidos de bloqueo del receptor FGF-2 de SEQ ID NO: 26; fragmento de 34 aminoácidos de fetoproteina humana de SEQ ID NO: 27; fragmento de 8-aminoácidos de fetoproteína humana de SEQ ID NO. 28; péptido derivado de p21WAF de SEQ ID NO: 29; péptido DD2 de proteína DOC-2/DAB2 de SEQ ID NO: 30; arginina desiminasa de Mycoplasma arginini de SEQ ID NO: 31 ; fragmento de péptido p16 de SEQ ID NO: 32; fragmento de péptido p16 fusionado con un dominio de transporte de 17-aminoácidos de antenapedia de SEQ ID NO: 33; fragmento de la proteína MEK-1 de SEQ ID NO: 34; fragmento N-terminal de domino PH de la proteína TCL1 de SEQ ID NO: 35; hexapéptido Phe-Trp-Leu-Arg-Phe-Thr de SEQ ID NO: 36; fragmento de tubulina de 13-aminoácidos de SEQ ID NO: 37; fragmento de tubulina de 10-aminoácidos de SEQ ID NO: 38; melitina de SEQ ID NO: 39; péptido de 6-aminoácidos C2 derivado de abeja defensina de SEQ, No. 40; péptido de 8-aminoácidos de unión al ligando FGF-2 de SEQ ID NO: 41 ; péptido lasioglosina LL2 de 15-aminoácidos de SEQ ID NO: 42; péptido de 13-aminoácidos de unión al dominio SH3 RasGAP de SEQ ID NO: 43; análogo del péptido Pep27 de SEQ ID NO: 44.

5. - La proteína de fusión de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada además porque entre el dominio (c) que comprende un sitio de escisión de proteasa, seleccionado de una secuencia reconocida por metaloproteasa MMP, una secuencia reconocida por uroquinasa uPA, y sus combinaciones.

6. - La proteina de fusión de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada además porque la secuencia reconocida por metaloproteasa MMP es SEQ ID NO: 45, y la secuencia reconocida por uPA uroquinasa es SEQ ID NO: 46.

7. - La proteína de fusión de conformidad con las reivindicaciones 5 o 6, caracterizada además porque el dominio (c) es una combinación de secuencias reconocidas por metaloproteasa MMP y uroquinasa uPA situada una al lado de otra.

8. - La proteína de fusión de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizada además porque el dominio (b) se une además con un dominio de transporte (d) seleccionado del grupo que consta de: (d1) un fragmento del dominio de la proteína antenapedia de SEQ ID NO: 48, (d2) un fragmento del dominio de la proteína antenapedia de SEQ ID NO: 49, (d3) secuencia de poliarginina de transporte a través de una membrana celular, que consta de residuos 6, 7, 8, 9, 10 u 11 Arg, y combinaciones de los mismos.

9. - La proteína de fusión de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada además porque la secuencia (d) se localiza en el C-terminal o en el N-terminal de la proteína de fusión.

10. - La proteína de fusión de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada además porque la secuencia de transporte (d) se localiza entre los dominios (b) y (c).

1 1. - La proteína de fusión de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada además porque la secuencia (d) se localiza en el C-terminal de la protelna de fusión.

12.- La proteína de fusión de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 5 a 11 , que comprende adicionalmente un enlazador estérico flexible entre los dominios (a), (b), (c) y/o (d).

13 - La proteina de fusión de conformidad con la reivindicación 11 , caracterizada además porque el enlazador estérico flexible se selecciona del grupo que consta de SEQ ID NO: 47, secuencia Gly Gly Ser, secuencia Gly Gly Gly Ser Gly, dos residuos de glicina Gly Gly, residuos de cisteína Cys, y sus combinaciones.

14.- La proteína de fusión de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consta de SEQ ID NO: 1 ; SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 5; SEQ ID NO: 6; SEQ ID NO: 7; SEQ ID NO: 8; SEQ ID NO: 9; SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 11 ; SEQ ID NO: 12; SEQ ID NO: 13; SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16; SEQ ID NO: 17; SEQ ID NO: 18; SEQ ID NO: 19; SEQ ID NO: 20; SEQ ID NO: 21 ; SEQ ID NO: 22; SEQ ID NO: 23; SEQ ID NO: 24; SEQ ID NO: 25, y SEQ ID NO: 75.

15. - La proteina de fusión de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada además porque es una proteína recombinante.

16. - Una secuencia de polinucleótidos, que codifica la proteína de fusión como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14,

17. - La secuencia de polinucleótido de conformidad con la reivindicación 16, caracterizada además porque se optimiza para la expresión genética en E. coli.

18. - La secuencia de polinucleótido de conformidad con la reivindicación 17, caracterizada además porque se selecciona del grupo que consiste de SEQ ID NO: 50; SEQ ID NO: 51 ; SEQ ID NO: 52; SEQ ID NO: 53; SEQ ID NO: 54; SEQ ID NO: 55; SEQ ID NO: 56; SEQ ID NO: 57; SEQ ID NO: 58; SEQ ID NO: 59; SEQ ID NO: 60; SEQ ID NO: 61 ; SEQ ID NO: 62; SEQ ID NO: 63; SEQ ID NO: 64; SEQ ID NO: 65; SEQ ID NO: 66; SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68; SEQ ID NO: 69; SEQ ID NO: 70; SEQ ID NO: 71 ; SEQ ID NO: 72; SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74, y SEQ ID NO: 76.

19. - Un vector de expresión, que comprende la secuencia de polinucléotidos de cualquiera de las reivindicaciones 16 a 18.

20. - Una célula hospedera, que comprende el vector de expresión tal como se define en reivindicación 19.

21 - La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 20, caracterizada además porque es una célula de E. coli.

22 - Una composición farmacéutica, que comprende como un ingrediente activo la proteína de fusión como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en combinación con un portador farmacéuticamente aceptable.

23.- La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 22, caracterizada además porque está en una forma para la administración parenteral.

24. - La proteina de fusión de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, para usarse en el tratamiento de enfermedades neoplásicas en mamíferos, incluyendo humanos.

25. - El uso de la proteína de fusión como se define en las reivindicaciones 1 a 15, o la composición farmacéutica como se define en las reivindicaciones 22 o 23, en la preparación de un medicamento para tratar enfermedades cancerígenas en un mamífero, incluyendo un ser humano.