MX2013013277A - Composiciones inunogenicas de la glucoproteina g de los virus hendra y nipah. - Google Patents

Composiciones inunogenicas de la glucoproteina g de los virus hendra y nipah.

Info

Publication number
MX2013013277A
MX2013013277A MX2013013277A MX2013013277A MX2013013277A MX 2013013277 A MX2013013277 A MX 2013013277A MX 2013013277 A MX2013013277 A MX 2013013277A MX 2013013277 A MX2013013277 A MX 2013013277A MX 2013013277 A MX2013013277 A MX 2013013277A
Authority
MX
Mexico
Prior art keywords
hendra
virus
glycoprotein
immunogenic composition
hev
Prior art date
Application number
MX2013013277A
Other languages
English (en)
Other versions
MX352604B (es
Inventor
Martin Elhay
Christopher C Broder
jin-an Huang
Original Assignee
Zoetis Llc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Zoetis Llc filed Critical Zoetis Llc
Publication of MX2013013277A publication Critical patent/MX2013013277A/es
Publication of MX352604B publication Critical patent/MX352604B/es

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/155—Paramyxoviridae, e.g. parainfluenza virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56983—Viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
    • A61K2039/541—Mucosal route
    • A61K2039/544—Mucosal route to the airways
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/545—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the dose, timing or administration schedule
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
    • A61K2039/552—Veterinary vaccine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55505—Inorganic adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55561—CpG containing adjuvants; Oligonucleotide containing adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55577—Saponins; Quil A; QS21; ISCOMS
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
    • A61K2039/575—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2 humoral response
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/24011—Poxviridae
    • C12N2710/24111—Orthopoxvirus, e.g. vaccinia virus, variola
    • C12N2710/24141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/24143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18211—Henipavirus, e.g. hendra virus
    • C12N2760/18222—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18211—Henipavirus, e.g. hendra virus
    • C12N2760/18234—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
    • G01N2333/08—RNA viruses
    • G01N2333/115—Paramyxoviridae, e.g. parainfluenza virus
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2469/00—Immunoassays for the detection of microorganisms
    • G01N2469/20—Detection of antibodies in sample from host which are directed against antigens from microorganisms

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Biophysics (AREA)

Abstract

Composiciones inmunogénicas de los virus Hendra y Nipah y métodos de uso de las mismas. La invención también se relaciona con métodos para diferenciar sujetos vacunados con las composiciones inmunogénicas de la invención de aquellos infectados con los virus Hendra y/o Nipah.

Description

COMPOSICIONES IN UNOGÉNICAS DE LA GLUCOPROTEÍNA G DE LOS VIRUS HENDRA Y NIPAH CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con composiciones inmunogénicas y de vacunas que comprenden una glucoproteína G del virus Hendra (HeV) y/o del virus Nipah (NiV) y con métodos de uso relacionados con ellas.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Recientemente, los brotes recurrentes del NiV que dan como resultado cantidades significativas de decesos de humanos se han vuelto problemático (véase, por ejemplo, Butler (2000) Nature 429, 7). El HeV también es conocido por causar decesos de humanos y animales y está estrechamente relacionado con el NiV, tanto genéticamente como inmunológicamente. Actualmente no existen vacunas o fármacos terapéuticos para la prevención de una infección o enfermedad causada por el virus Nipah o el virus Hendra. Tanto el virus Nipah como el virus Hendra son agentes prioritarios de categoría C del National Institute of Allergy and Infectious Disease, de los EE.UU., de preocupación de biodefensa. Además, dado que estos virus son agentes zoonóticos, de Nivel de Seguridad Biológica 4 (BSL-4), la producción de vacunas y/o diagnóstico, de manera segura es muy costoso y difícil. Por consiguiente, persiste la necesidad de vacunas y fármacos de diagnóstico para el virus Nipah o para el virus Hendra que permitan la producción de alto rendimiento de vacunas y/o fármacos de diagnóstico.
Los Paramixovirus, tales como HeV y NiV, tienen dos grandes glucoproteínas ancladas en membrana en la envoltura de la partícula viral. Se requiere una glucoproteína para la unión del virión a los receptores sobre las células huésped y se denomina proteína hemaglutinina-neuramínidasa (HN) o proteína hemaglutinina (H), y la otra es la glucoproteína (G), que no presenta actividades de hemaglutinación o neuraminidasa. La unión de las glucoproteínas son proteínas de membrana tipo II, donde el extremé amino (N) de la molécula está orientada hacia el citoplasma y el extreme cárboxilo terminal (C) de la proteína es extracelular. La otra glucoproteína importante es la glucoproteína de fusión (F), que es una glucoproteína trimérica de la envoltura fusogénica clase I que contiene dos regiones de repeticiones de heptadas (HR) y un péptido de fusión hidrofóbica. HeV y NiV infectan las células por un proceso de fusión a membrana independiente del pH en las células huésped receptivas por la acción conjunta de unión de su glucoproteína G y glucoproteína F después de la unión al receptor. La función primaria de la glucoproteína G de unión de HeV y NiV es conectarse a los receptores apropiados sobre las superficies de las células huésped, que en el caso de la mayoría de los paramixovirus bien caracterizados son unidades de ácido siálico. Las glucoproteínas G de HeV y NiV emplean los receptores de proteínas de la célula huésped, efrina B2 y/o efrina B3, y se han desarrollado anticuerpos que bloquean la unión viral por la glucoproteína G (WO2006137931 , Bishop (2008) J. Virol. 82: 11398-11409). Además, se han desarrollado vacunas que también emplean la glucoproteína G como un medio para generar una respuesta inmunoprotectora contra una infección por HeV y NiV (WO20091 17035).
La reactividad en el sitio de la dosis constituye una gran preocupación en ambos usos veterinario y humano de Quil A en las preparaciones de vacunas. Una manera de evitar esta toxicidad de Quil A es el uso de complejos inmunostimulantes (Rajput (2007) J. Zhejiang Univ. Sci. B, 8: 153-161 ). Esto se debe primariamente a que Quil A es menos reactiva cuando se incorpora en complejos inmunoestimulantes, porque su asociación con el colesterol en el complejo reduce su capacidad para extraer colesterol de las membranas celulares y por ende sus efectos líticos de las células. Además, se requiere una menor cantidad de Quil A para generar un nivel similar de efecto adyuvante. Las propiedades inmunomoduladoras de las saponinas Quil A y los beneficios de la adición que derivará de estas saponinas cuando se incorporan en un complejo inmunoestimulante fueron descritos en WO2000041720.
La combinación de las glucoproteínas G de HeV y/o NiV con complejos inmunoestimulantes en una vacuna individual representa un avance en el desarrollo de vacunas eficaces contra HeV y NiV dado el potencial de una inmunorreactividad mejorada con menos efectos secundarios por el adyuvante cuando estos componentes se administran combinados.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN La invención abarca una composición inmunogénica que comprende proteína G de virus Hendra y/o Nipah, un complejo ¡nmunoestimulante (ISC) y uno o más excipientes en una cantidad eficaz para suscitar la producción de anticuerpos neutralizantes contra los virus Hendra y/o Nipah luego de la administración a un sujeto. En algunas formas de realización, la composición inmunogénica comprende una saponina, un fosfolípido, y un esteroide.
En algunas formas de realización, la glucoproteína G soluble de virus Hendra consiste en los aminoácidos 73 a 604 de la glucoproteína G de Hendra nativa (SEQ ID NO: 2). En algunas formas de realización, la glucoproteína G soluble de virus Hendra es codificada por una secuencia de nucleótidos que comprende a los nucleótidos 64 a 1662 de SEQ ID NO: 16. En algunas formas de realización, la proteína G de virus Hendra soluble está presente en forma de dímero donde cada subunidad del dímero de glucoproteína G soluble de virus Hendra está conectada por una o más uniones disulfuro. En algunas formas de realización, la proteína G de virus Hendra soluble está presente en forma de tetrámero. En algunas formas de realización, la forma de tetrámero existe como un dímero de dímeros conectados de manera no covalente y/o conectados por una o más uniones disulfuro. La concentración de proteína G de virus Hendra soluble puede ser de entre aproximadamente 5 y 100 [iglm\ en la composición inmunogénica.
En algunas formas de realización, la saponina se aisla de Quillaja saponaria Molina y se puede seleccionar entre QH-A, QH-B, QH-C o QS21. En algunas formas de realización, el fosfolípido se selecciona entre el grupo que consiste en fosfatidil colina (PC), dipalmitoil fosfatidil colina (DPPC), ácido fosfatídico (fosfatidato) (PA), fosfatidiletanolamina (PE), fosfatidilserina (PS), fosfatidilinositol (Pl) fosfato de fosfatidilinositol (PIP), bisfosfato de fosfatidilinositol (PIP2), trifosfato de fosfatidilinositol (PIP3), fosforilcolina (SPH), ceramida fosforiletanolamina (Cer-PE) y ceramida fosforilglicerol. En algunas formas de realización la saponina es Quil A, el fosfolípido es DPPC y el esferoide es colesterol y la proporción de Quil A:DPPC:colesterol en la composición es 5:1 :1 en peso.
La invención también abarca un método para producir un anticuerpo con respuesta neutralizante contra un virus Hendra y/o Nipah en un sujeto que comprende administrar al sujeto la composición inmunogénica que se describe aquí en una cantidad y con una duración eficaz para producir el anticuerpo con respuesta neutralizante. En algunas formas de realización, el anticuerpo con respuesta neutralizante reduce la reproducción del virus Hendra y/o Nipah en el sujeto y también puede reducir la propagación del virus Hendra y/o Nipah en el sujeto. En algunas formas de realización, el sujeto ha sido expuesto a un virus Hendra y/o Nipah mientras que en otras formas de realización, el sujeto padece una infección por virus Hendra y/o Nipah. En algunas formas de realización, la invención abarca un método para producir un anticuerpo con respuesta neutralizante contra un virus Hendra en un sujeto que comprende administrar al sujeto la composición inmunogénica que se describe aquí en una cantidad y con una duración eficaz para producir el anticuerpo con respuesta neutralizante. En algunas formas de realización, la invención abarca un método para producir un anticuerpo con respuesta neutralizante contra un virus Nipah en un sujeto que comprende administrar al sujeto la composición inmunogénica que se describe aquí en una cantidad y con una duración eficaz para producir el anticuerpo con respuesta neutralizante.
En algunas formas de realización, la composición inmunogénica se administra por vía intramuscular. En algunas formas de realización, la composición inmunogénica se administra en múltiples dosis y la primera dosis es seguido de una segunda dosis por lo menos entre aproximadamente 21 días y aproximadamente 28 días después de la primera dosis. En algunas formas de realización, cada dosis contienen aproximadamente 50 o aproximadamente 100 pg de proteína G de virus Hendra soluble.
La invención también abarca un método para diferenciar a un sujeto vacunado con la composición inmunogénica que se describe aquí de un sujeto expuesto a un virus Hendra y/o Nipah que comprende detectar la presencia de un anticuerpo en una muestra biológica aislada del sujeto contra por lo menos una de cualquiera de las siguientes proteínas virales de HeV y/o NiV que se selecciona entre el grupo que consiste en proteína de fusión (F), proteína de matriz (M), fosfoproteína (P), proteína grande (L) y proteína de nucleocápside (N).
Las composiciones inmunogénicas y los métodos de la invención se pueden administrar a un sujeto tal como un ser humano, caballo, vaca, oveja, cerdo, cabra, pollo, perro o gato.
La invención también abarca un método para producir un anticuerpo con respuesta neutralizante contra un virus Hendra y/o Nipah en un sujeto humano que comprende administrar al sujeto una composición inmunogénica que comprende una glucoproteína G soluble de virus Hendra en una cantidad y con una duración eficaz para producir el anticuerpo con respuesta neutralizante. En algunas formas de realización, la composición inmunogénica también comprende un coadyuvante.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 muestra la temperatura rectal con el transcurso del tiempo para caballos a los que se les administró glucoproteína soluble recombinante de virus Hendra (sG) a 50 o 100 pg/dosis adyuvado con 250 pg de complejo inmunoestimulante seguido de exposición a virus Hendra vivo el día 0.
La Figura 2 muestra la frecuencia cardiaca con el transcurso del tiempo para caballos a los que se les administró glucoproteína soluble recombinante de virus Hendra (sG) a 50 o 100 pg/dosis adyuvado con 250 pg de complejo inmunoestimulante seguido de exposición a virus Hendra vivo el día 0.
La Figura 3 muestra un esquema para la preparación de un complejo inmunoestimulante.
La Figura 4 muestra un esquema de un diagrama de calendario de vacunación con sGHeV y exposición a NiV. Las fechas de vacunación con sGHeV, exposición a NiV y eutanasia se indican con flechas. Se tomaron muestras de sangre y hisopado los días -42, -7, 0, 3, 5, 7, 10, 14, 21 y 28 luego de la exposición según se indica (*). El texto en gris denota la línea de tiempo de la exposición (fila superior); el texto negro denota la línea de tiempo de la vacunación (fila inferior). Se muestra el número de sujetos de mono verde africano (AGM) para cada grupo de dosis de vacuna y un sujeto de control.
La Figura 5 muestra la curva de supervivencia de sujetos infectados con NiV. Los datos de los sujetos de control (n=2) y sujetos vacunados con sGHeV (n=9) se utilizaron para generar la curva de supervivencia de Kaplan-Meier. El control incluyó datos de un sujeto de control histórico adicional. Los sujetos vacunados recibieron 10 pg, 50 pg o 100 pg de sGHeV administrado subcutáneamente dos veces. El tiempo promedio hasta la etapa final de la enfermedad fue de 11 días en sujetos de control mientras que todos los sujetos vacunados sobrevivieron hasta la eutanasia al final del estudio.
La Figura 6 muestra la inmunoglobulina específica de NiV y HeV (Ig) en sujetos vacunados. Se recolectaron suero e hisopados nasales de sujetos vacunados y se evaluaron las respuestas de IgG, IgA y IgM usando ensayos multiplex con microesferas para sGHeV, y sGNiV. Se analizaron los sueros o hisopados de sujetos en el mismo grupo de dosis de vacuna (n=3) individualmente y se calculó la mediana de las medias de las intensidades de fluorescencia de las microesferas (M.F.I.) que se muestra en el eje Y. Las barras de error representan el error estándar de la media. La Ig específica para sG del suero se muestra en negro (sGHeV (triángulos abiertos), sGNiV (triángulos sólidos)) y la IgA específica de sG de mucosas se muestra en símbolos grises (sGHeV (triángulos abiertos), sGNiV (triángulos sólidos)).
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Vacuna y composiciones inmunoqénicas La vacuna y composición inmunogénica de la presente invención induce por lo menos una de varias respuestas inmunes humorales y celulares en un sujeto a quien se ha administrado la composición o es eficaz para intensificar por lo menos una respuesta inmune contra por lo menos una cepa de HeV y/o NiV, de manera tal que la administración es apropiada para propósitos de vacunación y/o prevención de la infección por HeV y/o NiV por una o más cepas de HeV y/o NiV. La composición de la presente invención suministra a un sujeto que lo necesita, una glucoproteina G, incluyendo a las glucoproteínas G solubles de HeV y/o NiV y un complejo inmunoestimulante (ISC) que actúa como un coadyuvante. En algunas formas de realización, la cantidad de glucoproteina G incluye, pero de manera o taxativa, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45. 50, 75, 100, 150, 200 o 250 pg por mi que también puede contener 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275 o 300 pg por mi de ISC. En algunas formas de realización, la cantidad de glucoproteina G es de 5, 50 o 100 y la cantidad de ISC es de 250 pg por mi.
A Proteínas G de HeV y NiV En algunas formas de realización, la vacuna y las composiciones inmunogénicas comprenden una o más glucoproteínas G de HeV y/o NiV que se describen aquí. El término proteína se utiliza aquí ampliamente para que incluya a los polipéptidos o a fragmentos de los mismos. Como ejemplo, y de manera no taxativa, una glucoproteina G de HeV puede encontrarse en forma soluble y puede comprender a los aminoácidos 73-604 de la secuencia de aminoácidos para una glucoproteina G de HeV en Wang (2000) J. Viral. 74, 9972-9979 (véase también Yu (1998) Virology 251 , 227-233). También como ejemplo y de manera no taxativa, una glucoproteina G de NiV puede encontrarse en forma soluble y puede comprender a los aminoácidos 71-602 de la secuencia de aminoácidos para una glucoproteína G de NiV en Harcourt (2000) Virology 271 : 334-349, 2000 (véase también Chua (2000) Science, 288, 1432-1 ).
En general, las formas solubles de las glucoproteínas G de HeV y NiV comprende a todo el ectodominio (por ejemplo extracelular) o una parte del mismo de la glucoproteína G de HeV o NiV y generalmente se producen por supresión de todo el dominio transmembrana de la glucoproteína G o parte del mismo y toda la cola citoplasmática de la glucoproteína G o parte de la misma. Como ejemplo, una glucoproteína G soluble puede comprender al ectodominio completo de una glucoproteína G de HeV o NiV. También como ejemplo, y de manera no taxativa, una glucoproteína G soluble puede comprender a todo el ectodominio o una parte del mismo y parte del dominio transmembrana de una glucoproteína G de HeV o NiV.
Las glucoproteínas G solubles de HeV o NiV de la invención, generalmente retienen una o más características de la correspondiente glucoproteína viral nativa, tal como la capacidad de ¡nteractuar con el receptor viral de la célula huésped o de unirse al mismo, se puede producir en forma o formas oligomérica(s), o la capacidad de suscitar anticuerpos (incluyendo, pero de manera no taxativa, a: anticuerpos virales neutralizantes) capaces de reconocer a la glucoproteína G nativa. Algunos ejemplos de características adicionales incluyen, pero de manera no taxativa, a: la capacidad de bloquear o prevenir la infección de una célula huésped. Se puede utilizar metodología convencional para evaluar una o más de las características de las glucoproteínas G solubles de HeV o NiV.
Como ejemplo, y de manera no taxativa, un polinucleótido que codifica una glucoproteína G soluble de HeV puede comprender una secuencia de polinucleótidos que codifica aproximadamente a los aminoácidos 73-604 de la secuencia de aminoácidos para una glucoproteína G de HeV en Wang (2000) J. Viral. 74, 9972-9979 (SEQ ID NO: 2). También como ejemplo, y de manera no taxativa, un polinucleótido que codifica una glucoproteína G soluble de HeV puede comprender a los nucleotidos 9129 a 10727 de la secuencia de polinucleótidos para una glucoproteína G de HeV en Wang (2000) J. Viral. 74, 9972-9979. Además, también se puede utilizar la secuencia de polinucleótidos optimizada por codones que codifica aproximadamente a los aminoácidos 73-604 de la secuencia de aminoácidos para una glucoproteína G de HeV (SEQ ID NO: 2). En algunas formas de realización, dichas secuencias optimizadas por codones comprenden a los nucleotidos 64 a 1662 de SEQ ID NO: 16 o consisten en los mismos. En otras formas de realización adicionales, las secuencias optimizadas por codones comprenden SEQ ID NO: 16 o consisten en la misma, que incluye a los nucleotidos que codifican una secuencia directriz lg<.
Como ejemplo, y de manera no taxativa, una glucoproteína G de NiV puede encontrarse en forma soluble y puede comprender a los aminoácidos 71-602 de la secuencia de aminoácidos para la glucoproteína G de NiV en Harcourt (2000) Virology 271 , 334-349. Algunos ejemplos no taxativos de secuencias que se pueden utilizar para construir una glucoproteína G soluble de NiV se pueden ver en Harcourt (2000) Virology 271 , 334-349. Para derivar los polinucleótidos y polipéptidos de la invención, generalmente, se pueden utilizar las secuencias de la glucoproteína G de cualquier aislado o cepa de virus Nipah.
Como ejemplo, y de manera no taxativa, un polinucleótido que codifica una glucoproteína G soluble de NiV puede comprender una secuencia de polinucleótidos que codifica aproximadamente a los aminoácidos 71-602 de la secuencia de aminoácidos para una glucoproteína G de NiV en Harcourt (2000) Virology 271 , 334-349. También como ejemplo, y de manera no taxativa, un polinucleótido que codifica una glucoproteína G soluble de NiV puede comprender a los aminoácidos 234-2042 de la secuencia de polinucleótidos para una glucoproteína G de NiV en Harcourt (2000) Virology 271 , 334-349 (SEQ ID NO: 4). Además, también se puede utilizar la secuencia de polinucleótidos optimizada por codones que codifica aproximadamente a los aminoácidos 71-602 de la secuencia de aminoácidos para una glucoproteína G de NiV.
En las composiciones inmunogénicas y la vacuna de la invención se pueden utilizar los equivalentes funcionales de dichas glucoproteínas G. Como ejemplo y de manera no taxativa, los polipéptidos funcionalmente equivalentes poseen una o más de las siguientes características: la capacidad de interactuar con el receptor viral de la célula huésped o de unirse al mismo, se puede producir en forma o formas dimérica(s) o tetramérica(s), la capacidad de suscitar anticuerpos (incluyendo, pero de manera no taxativa, a: anticuerpos virales neutralizantes de HeV y/o NiV) capaces de reconocer a la glucoproteína G nativa y/o la capacidad de bloquear o prevenir la infección de una célula huésped.
En algunas formas de realización, la glucoproteína G puede encontrarse en forma dimérica y/o tetramérica. Dichos dímeros dependen de la formación de uniones disulfuro formadas entre residuos cisterna de la glucoproteína G. Dichas uniones disulfuro puede corresponder a aquellas formadas en la glucoproteína G nativa (por ejemplo, la localización de las cisternas permanece sin cambios) cuando se expresan en la superficie de HeV o NiV o puede ser alteradas en la presencia o la localización (por ejemplo por alteración de la localización de cisteína(s) en la secuencia de aminoácidos) de la glucoproteína G de manera tal de formar diferentes formas diméricas y/o tetraméricas de la glucoproteína G que intensifica la antigenicidad. Adicionalmente, formas no dimerizadas ni tetramerizadas también se encuentran dentro de la invención, nuevamente tomando en consideración que la glucoproteína G presenta numerosos epitopos dependientes de la conformación (es decir que surge de una estructura tridimensional terciaria) y que la preservación muchos de dichos epitopos naturales es altamente preferida de manera tal de conferir una respuesta neutralizante a un anticuerpo.
Las composiciones inmunogénicas y la vacuna para HeV de la invención pueden contener proteínas de longitud variable pero incluyen a los residuos de aminoácidos 73 a 604 de SEQ ID NO: 2. En una forma de realización de la presente invención, las proteínas del envoltorio de la invención son por lo menos aproximadamente 85, 90, 91 , 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, o 99% idénticas a la glucoproteína de HeV de SEQ ID NO: 2 (incluyendo a los aminoácidos 73 a 604). Por lo tanto, las glucoproteínas G de HeV de la invención comprenden fragmentos inmunogénicos de la glucoproteína G nativa de HeV con un número suficiente de aminoácidos para producir epitopos conformacionales. Algunos ejemplos no taxativos de fragmentos inmunogénicos incluyen secuencias de aminoácidos que pueden tener por lo menos 530, 531 , 532, 533, 534 o 535 o más aminoácidos de longitud. En algunas formas de realización, la glucoproteína G de HeV comprende o consiste en SEQ ID NO: 2 o construcciones sintéticas que además comprenden una secuencia directriz IgK (SEQ ID NO: 15).
Las composiciones inmunogénicas y vacuna para NiV de la invención pueden contener proteínas de longitud variable pero incluyen a los residuos de aminoácidos 71 a 602 de SEQ ID NO: 4. En una forma de realización de la presente invención, las proteínas de envoltorio de la invención son por lo menos aproximadamente 85, 90, 91 , 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, o 99% idénticas a la glucoproteína de NiV de SEQ ID NO: 4 (incluyendo a los aminoácidos 71 a 602). Por lo tanto, las glucoproteínas G de NÍV de la invención comprenden fragmentos inmunogénicos de la glucoproteína G nativa de NiV con un número suficiente de aminoácidos para producir epitopos conformacionales. Algunos ejemplos no taxativos de fragmentos inmunogénicos incluyen secuencias de aminoácidos que pueden tener por lo menos 528, 529, 530, 531 , 532, o 533 o más aminoácidos de longitud. En algunas formas de realización, la glucoproteína G de NiV comprende a la SEQ ID NO: 4 o consiste en la misma, o construcciones sintéticas que además comprenden una secuencia directriz.
Los fragmentos inmunogénicos que se describen aquí contendrán por lo menos un epitopo del antígeno y muestran antigenicidad para HeV y/o NiV y son capaces de elevar una respuesta inmune cuando se presentan en una construcción apropiada, tal como por ejemplo cuando se fusionan a otros antígenos HeV y/o NiV o se presentan en un vehículo, donde la respuesta inmune se dirige contra el antígeno nativo. En una forma de realización de la presente invención, los fragmentos inmunogénicos contienen por lo menos 20 aminoácidos contiguos del antígeno para HeV y/o NiV, por ejemplo, por lo menos 50, 75, o 100 aminoácidos contiguos del antígeno para HeV y/o NiV.
Las formas de realización de glucoproteína G de HeV y NiV también incluyen un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos con una identidad de por lo menos 85, 90, 91 , 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100% con las glucoproteínas G nativas de HeV o NiV, donde dicha secuencia del polipéptido puede ser idéntica a la secuencia de aminoácidos de la glucoproteína G nativa de HeV o NiV o puede incluir hasta un cierto número entero de alteraciones de los aminoácidos en comparación con la secuencia de aminoácidos de la proteína G nativa de HeV o NiV, donde dichas alteraciones se seleccionan entre el grupo que consiste en: supresión, sustitución (incluyendo sustitución conservativa y no conservativa), o inserción de por lo menos un aminoácido, y donde dichas alteraciones pueden ocurrir en las posiciones amino- o carboxi-terminales de la secuencia de polipéptido de referencia o en cualquier sitio entre aquellas posiciones terminales, intercalada ya sea individualmente entre los aminoácidos de la secuencia de referencia o en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de aminoácidos de la glucoproteína G nativa de HeV o NiV.
La identidad de secuencia o la homología a nivel de la secuencia de aminoácidos se puede determinar por un análisis BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) usando el algoritmo que emplean los programas: blastp, blastn, blastx, tblastn y tblastx (Altschul (1997) Nucleic Acids Res. 25, 3389-3402 y Karlin (1990) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 87, 2264-2268) que se ajustan para la búsqueda de similitudes de secuencia. El enfoque que utiliza el programa BLAST consiste en considerar primero segmentos similares, con brechas (no contiguos) y sin brechas (contiguos), entre una secuencia desconocida ("query") y una base de datos de secuencias, luego evaluar la significancia estadística de todas las correspondencias que se identifiquen y por último resumir solo aquellas correspondencias que satisfagan un umbral de significancia preseleccionado. Para ver una exposición de los problemas básicos en la búsqueda de similitudes en bases de datos de secuencias, véase Altschul (1994) Naturaleza Genetics 6, 1 19-129. Los parámetros de búsqueda para los histogramas, descripciones, alineaciones, esperado (es decir, el umbral de significancia estadística para informar correspondencias con bases de datos de secuencia), corte, matriz y filtrado (baja complejidad) son la configuración predeterminada. La matriz de puntaje predeterminada que utilizan blastp, blastx, tbiastn, y tbiastx es la matriz BLOSUM62 (Henikoff (1992) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89, 10915-10919), recomendada para secuencias desconocidas ("query") de más de 85 aminoácidos de longitud.
La vacuna y las composiciones inmunogénicas de la presente invención además pueden comprender proteínas G de HeV y/o NiV adicionales provenientes de diferentes cepas que además pueden potenciar los métodos de inmunización de la invención.
B. Complejos Inmunoestimulantes Generalmente la presente invención provee composiciones inmunogénicas, incluyendo composiciones de vacuna, que comprenden formas solubles de la glucoproteína G de HeV y/o NiV, proteína del envoltorio, en combinación con un complejo inmunoestimulante (ISC) y métodos para usar dichas composiciones para prevenir y tratar infecciones por HeV y/o NiV en un sujeto. En la presente invención, la vacuna y/o la composición inmunogénica comprende un complejo inmunoestimulante que actúa como un coadyuvante. Según se usa aquí, "coadyuvante" se refiere a un agente que, aunque no tiene ningún efecto antigénico específico en sí mismo, puede estimular el sistema inmune, incrementando la respuesta a un antígeno.
El ISC presenta varias características que la hacen un coadyuvante ideal para ciertas aplicaciones: Ahorro de antígeno: Como se hace notar por ejemplo en Wee (2008) Mucosal Immunol. 1 , 489-496 en situaciones donde la disponibilidad del antígeno es limitada o los costos del antígeno son altos, se sabe que el ISC permite un ahorro del antígeno de tanto como entre 10 y 100 veces. Más probablemente esto se debe a una combinación de mayor eficiencia o un mecanismo de acción más apropiado en comparación con otros coadyuvantes.
Presentación cruzada: Como se hace notar por ejemplo en Schnurr (2009) J. immunol. 182, 1253-1259, la presentación de antígeno por células presentadoras del antígeno (APCs) usualmente sigue una de dos vías. El antígeno extraño usualmente es envuelto por las APCs y luego es procesado y re-expresado sobre la superficie de la APC en el contexto de moléculas de Complejo Mayor de Histocompatibilidad (MHC) de clase II. Luego, los mismos pueden ser percibidos por los linfocitos y, si están presentes los factores/señales co-est¡mulantes correctos, responderán a los mismos, según sea apropiado. Los autoantígenos o antígenos de cáncer y antígenos virales normalmente se procesan y expresan en el contexto de las moléculas de clase I ya que las mismas están presentes en el citoplasma de las APCs. Una inmunidad eficaz al cáncer y a los antígenos virales requiere acceso a la vía de la clase I. Esto ocurre naturalmente durante la infección viral o la homeostasis celular (celular renovación de antígenos internos). Los antígenos (virales o propios) que se introducen como vacunas necesitan encontrar su camino desde el exterior de la célula a la maquinaria de la célula que procesa el antígeno y entrar de la vía de clase II a la vía de la clase I. Esto puede ocurrir naturalmente en células dendríticas (DCs - APCs especialistas) o se puede obtener por vacunación con antígenos mezclados con ISC como coadyuvante. Este proceso de antígeno derivado externamente encuentra su camino dentro de la vía de la clase I de presentación del antígeno que se denomina presentación cruzada. El mecanismo preciso por el cual esC realiza la presentación cruzada del antígeno no se ha dilucidado por completo pero puede basarse en la perturbación por la membrana de los componentes del ISC.
Respuestas humoral v mediada por las células: Como se resalta, por ejemplo en Maraskovsky (2009) Immunol. Cell Biol. 87, 371-376), en virtud del mecanismo de acción de ISC intervienen los brazos tanto humoral como celular del sistema inmune adaptativo. En algunas especies esto establece un paralelo con el perfil de las citoquinas estimuladas por vacunación con este coadyuvante. Las respuestas inmunes de Tipo 1 caracterizadas por la expresión de lnterleuquina-2 y IFN-gamma y la protección contra patógenos intracelulares (bacterias, protozoario y virus) y las respuestas de tipo 2 caracterizadas por la expresión de lnterleuquina-4 y generación de anticuerpo neutralizante para inmunidad relacionada con anti-toxinas y antipatógenos. El ISC provee un perfil de citoquinas balanceado entre dichos dos extremos que permiten mayor amplitud de la respuesta inmune. Adicionalmente, varios estudios han mostrado que el ISC puede ser eficaz si las vacunas se administran por vía intranasal. Esto permite la sensibilización de las superficies de la mucosa y de esa manera provee inmunidad relevante al sitio de entrada del patógeno, lo que es particularmente relevante en este caso (inmunidad de la mucosa), véase también Sjólander (2001 ) Vaccine 19, 4072-4080.
Criterios de elaboración por esterilización por filtración y consistencia: El tamaño de la partícula de ISC tiene normalmente un diámetro de 40 nm que le permite pasar a través de los filtros que se utilizan para esterilizar los preparados en una etapa tardía de la formulación. Adicionalmente, la tendencia natural de las saponinas triterpenoides que se encuentran en Quil A a asociarse con el colesterol y los fosfolípidos se ha aprovechado para desarrollar métodos para la elaboración de ISC. Las especies de Quil A que no forman partículas de ISC se separan del producto final por diálisis. Al controlar las proporciones de los componentes se géneros un producto consistente a partir de un espectro heterogéneo de saponinas Quil A. Esta proporción es importante porque la desviación permite obtener estructuras que no son partículas características de 40 nm (hélices, hojas etc.). La naturaleza que le permite fluir libremente del coloide de ISC y la posibilidad de medirlo usando microscopía de transmisión electrónica, HPLC y otras técnicas hacen que este coadyuvante se pueda usar para desarrollar ensayos de liberación y otras medidas de calidad.
Por lo tanto, en base a lo anterior, en algunas formas de realización, la formulación de un complejo inmunoestimulante con una cantidad óptima de glucoproteína G incluye una saponina, un fosfolípido y una molécula esferoide. En algunas formas de realización, la proporción molar de saponina, fosfolípido, molécula esteroide en una proporción de 5:1 :1. Un complejo inmunoestimulante puede contener, por ejemplo, entre 5 y 10% en peso de saponina, entre 1 y 5% de molécula esteroide y fosfolípido y donde el resto comprende glucoproteína G. La glucoproteína G se puede incorporar al complejo inmunoestimulante ya sea directamente o por acoplamiento químico a una proteína vehículo (por ejemplo proteína quimérica o de fusión) luego de la incorporación de la proteína a complejos inmunoestimulantes. Se debería entender que la referencia a un complejo inmunoestimulante incluye la referencia a derivados, equivalentes químicos y análogos de los mismos. En algunas formas de realización, el ISC se mezcla por separado de la glucoproteína G de HeV y/o de NiV y luego la glucoproteína G se mezcla con el ISC. En algunas formas de realización, la glucoproteína G se mezcla directamente con la saponina, el fosfolípido y la molécula esferoide.
En algunas formas de realización, la . saponina para utilizar en la presente invención es Quil A y/o sus derivados. Quil A es un preparado de saponina aislado del árbol sudamericano Quillaja saponaria Molina y el primero en describirlo con una actividad coadyuvante fue Dalsgaard (1974) Saponin adjuvants, Archiv. für die gesamte Virusforschung, Vol. 44, Springer Verlag, pp. 243-254. Se han aislado fragmentos de Quil A purificados por HPLC que retienen la actividad coadyuvante sin la toxicidad asociada a Quil A (EP 0362278), por ejemplo QS7 y QS21 (que también se conocen como QA7 y QA21 ). QS21 es una saponina natural derivado de la corteza de Quillaja saponaria Molina que induce a los linfocitos T citotóxicos CD8+ (CTL), células Th1 y una respuesta predominante al anticuerpo lgG2a y es una saponina que se utiliza en el contexto de la presente invención. Otras saponinas apropiadas para utilizar en el ISC incluyen, pero de manera no taxativa, a: las subfracciones QH-A, QH-B y QH-C de Quil A, aquellas provenientes de especies diferentes de Quillaia saponaria tales como aquellas de los géneros Panax (ginseng), Astragalus, Achyranthes, soja, Acacia y Codonopsis. En algunas formas de realización, la saponina se aisla de una especie diferente de Quillaia saponaria.
Algunos ejemplos no taxativos de fosfolípidos para utilizar en las composiciones inmunogénicas y la vacuna de la invención incluyen moléculas con estructuras de diacilglicéridos y fosfosfingolípidos. Algunos ejemplos no taxativos de fosfolípidos con estructuras de diacilglicéridos incluyen ácido fosfatídico (fosfatidato) (PA), fosfatidiletanolamina (cefalina) (PE), fosfatidilcolina (lecitina) (PC), dipalmitoil fosfatidilcolina (DPPC) o fosfatidilserina (PS). Otro ejemplo no limitante de fosfolípidos con estructuras de diacilglicéridos incluyen fosfoinositidas. Algunas fosfoinositidas indicativas incluyen, pero de manera no taxativa, a: fosfatidilinositol (Pl), fosfato de fosfatidilinositol (PIP), bisfosfato de fosfatidilinositol (PIP2) o trifo$fato de fosfatidilinositol (PIP3). Algunos ejemplos no taxativos de fosfoesfingolípidos incluyen: ceramida fosforilcolina (esfingomielina) (SPH), ceramida fosforiletanolamina (esfingomielina) (Cer-PE) o ceramida fosforilglicerol.
Las moléculas esferoides para utilizar en las composiciones inmunogénicas y la vacuna de la invención incluyen moléculas que incorporan a un esferoide como parte de su estructura. Algunos ejemplos no taxativos de moléculas esferoides incluyen colesterol, pregnenolona, 17-alfa-hirdroxi pregnenolona, deshidroepiandrosterona, androstenodiol, progesterona, 17-alfa-hidroxi progesterona, androstenodiona, testosterona, dihidroxi testosterona, desoxicorticosterona, 11-desoxicorticosterona, cortisol, corticosterona, aldosterona, estrona, estradiol o estriol.
En algunas formas de realización, los complejos inmunoestimulantes son típicamente, pero de manera no taxativa: estructuras similares a jaulas pequeñas de 30-40 nm de diámetro. En algunas formas de realización, la formulación de un complejo inmunoestimulante tiene una proporción molar de Quil A, colesterol, fosfatidilcolina y glucoproteína G de 5:1 :1. Un complejo inmunoestimulante puede contener, por ejemplo, entre 5 y 10% en peso de Quil A, entre 1 y 5% de colesterol y fosfolípidos y donde el resto comprende glucoproteína G. La glucoproteína G se puede incorporar al complejo inmunoestimulante ya sea directamente o por acoplamiento a una proteína vehículo (por ejemplo una proteína quimérica o de fusión) luego de la incorporación de la proteína a los complejos inmunoestimulantes. Se debería entender que la referencia a un complejo inmunoestimulante incluye la referencia a derivados, equivalentes químicos y análogos de los mismos. Por ejemplo, la referencia a un derivado de un complejo inmunoestimulante incluye la referencia a un complejo inmunoestimulante en el cual uno o más de: Quil A, colesterol, fosfatidilcolina o la proteína, por ejemplo, han sido suprimidos, sustituidos por un componente además de Quil A, colesterol, fosfatidilcolina o proteína, o donde estos se agrega(n) al complejo. El equivalente funcional de un complejo inmunoestimulante puede ser un complejo inmunoestimulante en el cual se han reemplazado uno o más de sus cuatro componentes por un equivalente funcional. En algunas formas de realización de la presente invención, se ha suprimido el componente de glucoproteína G del complejo inmunoestimulante. Este tipo de complejo inmunoestimulante se denomina aquí un complejo inmunoestimulante libre de proteínas.
En algunas formas de realización, la presente invención incluye, pero de manera o taxativa, una composición inmunogénica que comprende una proteína G de HeV o NiV aislada capaz de inducir la producción de un antisuero neutralizante con reactividad cruzada contra múltiples cepas de HeV y/o NiV in vitro y un coadyuvante que comprende Quil A, DPPC y colesterol, por ejemplo donde la composición contiene: 5, 50 o 100 pg de proteína G de HeV o NiV soluble, y cantidades apropiadas de Quil A, DPPC, y colesterol. Otras formas de realización indicativas adicionales de complejos ¡nmunoestimulantes, y de la preparación de los mismos, se describen en EP 0242380B1 y EP 0180564B1 , y también WO2000041720 (véase, por ejemplo, las páginas 3 y 9 de dicho documento, refiriéndose a: Cox & Coulter (1992) Advances in Adjuvant Technology and Application in Animal Parasite Control Utilizing Biotechnology, Capítulo 4, Yong (ed.), CRC Press; Dalsgard (1974) Gesamte Virusforsch, 44, 243-254; Memoria descriptiva de las Patentes australianas Nos. 558258, 589915, 590904 y 632067. Véanse también los protocolos representativos descritos en la Patenté U.S. 6.506.386, y las referencias de dicho documento al hecho bien conocido de que se puede utilizar un complejo inmunoestimulante donde el antígeno de la proteína se incluye en el complejo inmunoestimulante cuando se forma (véase EP 0109942B1 ), o como alternativa, se proveen complejos ¡nmunoestimulantes preformados que luego se mezclan con una alícuota de antígeno que se agrega por separado para formar la vacuna (véase EP 0436620B1 ). Como se reconocerá generalmente, el antígeno de la proteína también puede estar unido covalentemente al complejo inmunoestimulante (véase nuevamente EP 0180564B1 ). Como también es bien reconocido en el arte, los complejos inmunoestimulantes se pueden administrar por vacunación de la mucosa (véase Mowat (1991 ) Immunology 72, 317-322) y los complejos inmunoestimulantes de la presente invención se pueden mejorar adicionalmente para la vacunación mucosa por inclusión de proteínas dirigidas hacia la membrana (WO 9730728).
En algunas formas de realización, la presente invención incluye, pero de manera o taxativa, una composición inmunogénica que comprende una proteína G de HeV o NiV aislada que es capaz de inducir la producción de un anti-suero neutralizante con reactividad cruzada contra múltiples cepas de HeV y/o NiV in vitro y un coadyuvante que comprende Quil A, DPPC y colesterol, por ejemplo donde la composición contiene: 5, 50 o 100 pg de proteína G de HeV o NiV soluble, y cantidades apropiadas de Quil A, DPPC, y colesterol. Otras formas de realización indicativas adicionales de complejos inmunoestimulantes se describen en WO2000041720.
En otra forma de realización de la invención, la vacuna y las composiciones inmunogénicas pueden formar parte de una composición farmacéutica. Las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden contener vehículos farmacéuticamente aceptables apropiados que comprenden excipientes y auxiliares que faciliten el procesamiento de los compuestos activos para dar preparados que se pueden utilizar para la administración farmacéutica al sitio de acción.
C. Excipientes Las composiciones inmunogénicas y la vacuna de la invención también pueden comprender vehículos farmacéuticamente aceptables, excipientes y/o estabilizantes (véase por ejemplo Remington: The Science and practice of Pharmacy (2005) Lippincott Williams), en la forma de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. Los vehículos, excipientes, o estabilizantes aceptables son no tóxicos para los receptores a las dosificaciones y concentraciones que se utilizan, y pueden comprender amortiguadores de pH tales como fosfato, citrato, y otros ácidos orgánicos; antioxidantes que incluyen ácido ascórbico y metionina; conservantes (tales como la sal sódica de mercurio((o-carboxifenil)tio)etilo (TIOMERSAL), cloruro de octadecildimetilbencil amonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio; fenol, alcohol butílico o bencílico; alquil parabenos tales como metil o propil parabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; y m-cresol); proteínas, como por ejemplo albúmina de suero, gelatina, o inmunoglobulinas; polímeros hidrofílicos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina, o lisina; monosacáridos, disacáridos, y otros carbohidratos que incluyen: glucosa, mañosa, o dextranos; agentes quelantes tales como EDTA; azúcares tales como sacarosa, manltol, trehalosa o sorbitol; contraiones formadores de sales tales como sodio; complejos con metales (por ejemplo complejos Zn-proteína); y/o tensioactivos no iónicos tales como polietilenglicol (PEG), TWEEN o PLURONICS.
Las composiciones de la invención se puede presentar en dosificaciones suspendidas en cualquier vehículo farmacéutico o vehículo apropiado en un volumen suficiente para contener la dosificación. Generalmente, el volumen final, incluyendo a vehículos, coadyuvantes, y otros similares, típicamente será de por lo menos 1 ,0 mi. El límite superior está regido por el carácter práctico de la cantidad que se desea administrar, generalmente entre no más de aproximadamente 0,5 mi y aproximadamente 2,0 mi.
Métodos de Uso La invención abarca métodos para prevenir y/o tratar la infección por virus Hendra y/o Nipah que comprenden administrar las composiciones inmunogénicas y la vacuna de la invención a cualquier sujeto mamífero. La inmunidad activa suscitada por la vacunación con una glucoproteína G de HeV y/o de NiV con los coadyuvantes que se describen aquí puede cebar o reforzar una respuesta inmune celular o humoral. Una cantidad eficaz de la glucoproteína G de HeV y/o de NiV o fragmentos antigénicos de la misma se puede preparar como una mezcla con un coadyuvante para preparar una vacuna.
La invención abarca métodos para prevenir y/o tratar una infección por virus Hendra y/o Nipah en un sujeto humano que comprenden administrar una composición inmunogénica y/o vacuna que comprende una glucoproteína G de HeV y/o de NiV soluble o combinaciones de las mismas ya sea por sí misma o en combinación con por lo menos un coadyuvante apropiada para utilizar en seres humanos. Los coadyuvantes apropiados para utilizar en seres humanos se pueden utilizar solos o en combinación. Algunos ejemplos de coadyuvantes apropiados para utilizar en seres humanos incluyen, pero de manera no taxativa, a: sales de aluminio. Algunos ejemplos de sales de aluminio incluyen, pero de manera no taxativa, a: hidróxido de aluminio, gel de hidróxido de aluminio (Alhidrogel™), fosfato de aluminio, alumbre (sulfato de potasio y aluminio), o sales mixtas de aluminio. Algunos ejemplos adicionales de coadyuvantes apropiados para utilizar en seres humanos incluyen, pero de manera no taxativa, a: emulsiones agua-en-aceite, emulsiones aceite-en-agua, y AS04 (combinación de hidróxido de aluminio y monofosforil lípido A) y oligodesoxinucleótidos CpG. Los oligodesoxinucleótidos CpG son oligonucleótidos sintéticos que contienen dinucleótídos CpG sin metilar en contextos de secuencias particulares (motivos CpG). Dichos motivos CpG están presentes en una frecuencia 20 veces mayor en el ADN bacteriano en comparación con el ADN de mamíferos. Los oligodesoxinucleótidos CpG son reconocidos por el receptor 9 de tipo Toll (TLR9) causando fuertes efectos inmunoestimulantes.
La administración de una vacuna o composición inmunogénica que comprende glucoproteína G de HeV y/o de NiV con uno o más coadyuvantes que se describen aquí, se puede realizar con propósitos ya sea profilácticos o terapéuticos. En un aspecto de la presente invención la composición es útil para propósitos profilácticos. Cuando se suministra con propósitos profilácticos, la composición de vacuna se suministra antes de cualquier detección o síntoma de infección por HeV y/o NiV. La administración profiláctica de una cantidad eficaz del(de los) compuesto(s) sirve para prevenir o atenuar cualquier infección subsiguiente por HeV y/o NiV.
Cuando se suministra con propósitos terapéuticos, la vacuna se suministra en una cantidad eficaz al detectar un síntoma de infección real. Se dice que una composición es "farmacológicamente aceptable" si su administración puede ser tolerada por un receptor. Se dice que una composición con dichas características se administra en una "cantidad terapéuticamente o profilácticamente eficaz" si la cantidad que se administra es fisiológicamente significativa. Una vacuna o composición inmunogénica de la presente invención es fisiológicamente significativa si su presencia da como resultado un cambio detectable de la fisiología de un paciente receptor, por ejemplo, intensificando una respuesta inmune humoral o celular ampliamente reactiva a una o más cepas de HeV y/o NiV. No es necesario que la protección que se provee sea absoluta (es decir, no es necesario prevenir o erradicar totalmente la infección por HeV o NiV), con la condición de que haya una mejora estadísticamente significativa con relación a una población de control. La protección se puede limitar a mitigar la severidad o rapidez del inicio de los síntomas de la enfermedad.
Una vacuna o composición inmunogénica de la presente invención puede conferir resistencia a múltiples cepas de HeV y/o NiV. Según se usa aquí, se dice que una vacuna previene o atenúa una infección si su administración a un sujeto da como resultado una atenuación (es decir, supresión) ya sea en total o parcial de un síntoma o una condición de la infección, o la inmunidad total o parcial a la infección del individuo.
Se puede administrar por lo menos una vacuna o composición inmunogénica de la presente invención por cualquier medio con el que se obtenga el propósito que se desea alcanzar, usando una composición farmacéutica de las que se describen aquí. Por ejemplo, la administración de una composición con dichas características se puede realizar por diversas rutas parenterales tales como las rutas subcutánea, intravenosa, intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intranasal, transdérmica, o bucal. En una forma de realización de la presente invención, la composición se administra subcutáneamente. La administración parenteral se puede realizar por inyección de un bolo o por perfusión gradual durante el transcurso de un tiempo.
Un régimen típico para prevenir, suprimir, o tratar una enfermedad o condición que puede ser aliviada por una respuesta inmune celular por una inmunoterapia celular activa específica, comprende la administración de una cantidad eficaz de una composición de vacuna según se la describió anteriormente, administrándola como un único tratamiento, o repitiendo como dosificaciones de refuerzo, durante un período de entre hasta una semana y aproximadamente 24 meses. Algunos ejemplos no taxativos incluyen una primera dosis seguida de una segunda dosis aproximadamente por lo menos 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23 o 24 días después de la primera dosis (día 0). La cantidad de la dosis de la composición inmunogénica o de vacuna puede ser menor que la primera dosis que se administra el día 0, la misma que esta, o mayor que la misma.
De acuerdo con la presente invención, una "cantidad efectiva" de una vacuna o composición inmunogénica es suficiente para obtener un efecto biológico que se desea, en este caso por lo menos uno de: respuesta inmune celular o humoral a una o más cepas de HeV y/o NiV. Se entiende que la dosificación eficaz dependerá de la edad, el sexo, la salud, y el peso del sujeto, el tipo de tratamiento concurrente, si es que se aplica alguno, la frecuencia de tratamiento, y la naturaleza del efecto que se desea. Los rangos de dosis eficaces que se dan a continuación sin intenciones de limitar la invención y representan ejemplos de rangos de dosis que pueden ser apropiados para administrar las composiciones de la presente invención. Sin embargo, la dosificación se puede ajusfar al sujeto individual, según lo entiende y lo puede determinar alguien con experiencia en el arte, sin experimentación excesiva.
Los receptores de la vacuna y las composiciones inmunogénicas de la presente invención pueden ser cualquier sujeto que pueda adquirir inmunidad específica para HeV y/o NiV mediante una respuesta inmune celular o humoral, donde la respuesta celular es mediada por una proteína MHC de clase i o clase ii. Entre los mamíferos, los receptores pueden ser mamíferos de los órdenes Primata (que incluye a seres humanos, chimpancés, simios y monos). En una forma de realización de la presente invención se provee un método para tratar seres humanos con la vacuna o las composiciones inmunogénicas de la invención. Los sujetos pueden estar infectado con HeV y/o NiV o pueden proveer un modelo de infección por HeV o NiV, como en los estudios experimentales. En algunas formas de realización, el sujeto es un mamífero doméstico incluyendo, pero de manera no taxativa, a: un caballo, vaca, buey, búfalo de agua, oveja, cerdo (Mingyi (2010) Vet. Res. 41 , 33), cabra, perro (Biosecurity Alert - Hendra Virus Update, 27 de julio de 2011 , Press Reléase, Biosecurity Queensland) o gato. En algunas formas de realización, el sujeto es a ave de corral, incluyendo a un pollo.
Las vacunas de la presente invención también proveen protección cruzada contra la infección por virus Nipah a las dosis que se utilizan para proteger contra la infección por virus Hendra y de esa manera también se provee una vacunación eficaz contra el virus Nipah.
Se debería entender que la referencia a una respuesta inmune eficaz es una referencia a una respuesta inmune que permite obtener ya sea directa o indirectamente un efecto profiláctico o terapéutico beneficioso. En el caso donde el inmunogeno comprende una glucoproteína G de HeV o NiV de las que se describió aquí, donde una respuesta con dichas características incluye la reducción o el bloqueo de la reproducción viral y/o la propagación viral y/o la reducción de los síntomas de la enfermedad en un animal. Se debería entender que dicha eficacia es una medida funcional y no se define como referencia al título del anticuerpo anti-HeV y/o anti-NiV solo porque la presencia del anticuerpo en circulación solo no es necesariamente indicativa de la capacidad de dicho anticuerpo en circulación de bloquear la reproducción y la propagación viral.
También como ejemplo, y de manera no taxativa, si se está administrando un polipéptido soluble de proteína G de la invención para aumentar la respuesta inmune en un sujeto infectado con Hendra o Nipah o que se sospecha que ha sido infectado con dichos virus y/o si los anticuerpos de la presente invención se están administrando como una forma de inmunoterapia pasiva, la composición también puede comprender, por ejemplo, otros agentes terapéuticos (por ejemplo, agentes antivirales).
En el Ejemplo 4 se proporciona información sobre ciertas composiciones preferidas para uso en la vacunación de caballos. Con respecto a otros animales que pueden ser infectados con el virus Hendra, y que por lo tanto justifican que la vacunación proteja a ambos los animales y por lo tanto los seres humanos, tanto contra Hendra como de la infección por el virus Ñipan, la siguiente información es de aplicación general y puede ser adaptada fácilmente por los expertos en la técnica. En términos generales, las mascotas (perros y gatos) de manera de garantizar aproximadamente 25 microgramos de antígeno de Hendra, y pueden beneficiarse de un adyuvante de CAI en un rango de 25-150 microgramos, y la relación de saponina, fosfolípidos y esterales preferida es entre 5:01 :01 para las composiciones ISC para el uso de cualquiera de las especies componentes como se describe en este documento. Para las mascotas, se prefiere que la dosis final sea de aproximadamente 1 mi. También se puede usar PolygenTM (MVP Technologies), un adyuvante basado en copolímeros, en preferiblemente aproximadamente 5-15 % (v/v).
En general, para grandes animales (ovejas, vacas, cerdos, etc) son aplicables las cantidades dosificadas de antígeno y adyuvante (y el volumen final de dosificación) que se divulgan en la presente para los caballos, es decir, 50 a 100 microgramos de antígeno, y por lo general se pueden usar alrededor de 250 microgramos de ISC, el volumen de 1-3 mi finales, por ejemplo). En lo que se refiere de cerdos, una formulación alternativa y eficaz de adyuvante comprende (para aproximadamente la misma cantidad de antígeno) una mezcla de ISC y polisacárido iónico, específicamente 100 mg de dextrano DEAE y 800 microgramos de CAI en 1-3 mi de volumen final de dosis (también 5 : 01 :01 de Quil A : fosfatidil colina : colesterol (véase WO 2000/41720)) Diferenciación de los animales vacunados La invención también abarca métodos para diferenciar los animales vacunados de los animales sanos expuestos o infectados por el virus de Hendra y/o NiV. Durante la infección viral, VHE y NiV expresan proteínas adicionales distintas de la glucoproteína G (G), que incluyen la proteína de fusión (F), proteína de matriz (M), fosfoproteína (P), proteína grande (L) y la proteína de la nucleocápside (N). Estas proteínas adicionales tienen el potencial de inducir respuestas inmunes en animales en forma de anticuerpos que se unen a estas proteínas o la inmunidad de las células T. El nivel de respuesta de anticuerpos a estas otras proteínas que normalmente se puede medir por ensayos tales como el ensayo inmunológico ligado a enzima (EIA). Las formulaciones inmunogénicas y vacunas de la presente invención, en algunas realizaciones, contienen sólo glucoproteína G como antígeno del virus de Hendra y/o el antígeno del NiV y por lo tanto inducien respuestas inmunes con anticuerpos sólo a la glucoproteína G del virus de Hendra y/o NiV. Los animales vacunados con las composiciones inmunogénicas descritas en esté documento, que posteriormente se infectan con HeV o NiV construirán una respuesta inmune de refuerzo a la glucoproteína G, pero también presentarán cambios de presentación de anticuerpos contra otras proteínas HeV y NiV que difieren de la glucoproteína G. Por lo tanto, es posible medir la presencia de anticuerpos frente a cualquiera de la proteína de fusión (F), proteína de matriz (M), fosfoproteina (P), proteína grande (L) y la proteína de la nucleocápside (N) en un EIA para determinar la presencia o ausencia de anticuerpos específicos para estas proteínas en muestras de suero. Si se detectan anticuerpos contra cualquiera de estas otras proteínas (es decir, distintos de la glucoproteína G), entonces el animal ha estado expuesto a HEV y/o NiV. Como alternativa, si no se encuentran anticuerpos para estas otras proteínas y se detectan sólo anticuerpos que se unen a la proteína G, entonces el animal sólo ha sido vacunado Los EIA de la presente invención son altamente específicos y altamente selectivos en la detección y diferenciación entre los animales infectados con el virus de Hendra y/o NiV y animales sanos que han sido vacunados con las composiciones inmunogénicas descritas en la presente. La presente invención puede utilizar una variedad de procedimientos de ensayo incluyendo ELISA en entornos homogéneos y heterogéneos. Los procedimientos de ensayo pueden llevarse a cabo en muestras tales como sangre, suero, leche, o cualquier otro fluido corporal que contenta anticuerpos En algunas formas de realización, los anticuerpos utilizados en los EIA pueden competir únicamente con anticuerpos inducidos por la vacunación con la glucoproteína G, pero no los anticuerpos inducidos en animales por infección con el virus de Hendra y/o NiV. Esto permite no sólo el diagnóstico serológico de la infección por VHE y NiV, sino también la diferenciación de la vacunación y la infección en un solo ensayo. El procedimiento de EIA se puede realizar en muestras estándar de suero sanguíneo o de cualesquier fluidos o secreciones corporales que contienen anticuerpos. El procedimiento de EIA puede emplear cualquiera de los anticuerpos monoclonales y/o policlonales contra la glucoproteína G y cualquier otro virus de Hendra y/o NiV proteína viral (por ejemplo, proteína de fusión (F), proteína de matriz (M), fosfoproteína (P), proteína grande (L) y proteína de la nucleocápside (N) ya que tales proteínas no están presentes en animales sanos vacunados que no han sido expuestos a HEV y/o NiV). El EIA puede llevarse a cabo en cualquier cantidad de equipos fijos o portátiles - manuales, semi-automáticos o el robóticos automatizados para ELISA disponibles en el comercio, con o sin la asistencia de software o hardware para la reducción de análisis de datos. En algunas formas de realización, los métodos de diferenciar los animales sanos vacunados de los animales sanos expuestos a, o infectados con virus de Hendra y/o NiV pueden llevarse a cabo en una muestra biológica aislada de un mamífero doméstico entre los que se incluyen, no taxativamente, caballos, vacas, ovejas, cerdos, cabras, perros o gatos. En algunas formas de realización, el sujeto es un ave de corral, incluyendo un pollo. En algunas formas de realización, el sujeto es un ser humano.
Ejemplos Los siguientes ejemplos solamente ¡lustran determinadas y no todas las formas de realización de la invención y, por consiguiente, no deberían considerarse como limitantes del alcance de la invención.
Ejemplo 1 : Construcciones de vectores Se construyeron vectores para expresar la HeV G o la NiV G de cola eliminada transmembrana/citoplasmática. El ADNc clonado de las proteínas HeV o NiV G de longitud completa se amplificó por PCR para generar fragmentos de aproximadamente 2600 nucleótidos que codifican la proteína G HeV o NiV de cola eliminada del dominio transmembrana/citoplasmática.
Se sintetizaron los siguientes cebadores de oligonucleótidos para la amplificación de HeV G. sHGS: 5'- GTCGACCACCATGCAAAATTACACCAGAACGACTGATAAT-3' (SEQ ID N°: 5). sHGAS: 5 -GTTTAAACGTCGACCAATCAACTCTCTGAACATTG GGCAGGTATC-3'. (SEQ ID N°: 6).
Se sintetizaron los siguientes cebadores de oligonucleótidos para la amplificación de NiV G. sNGS: 5'- CTCGAGCACCATGCAAAATTACACAAGATCAACAGACAA-3' (SEQ ID N°: 7). sNGAS: 5'-CTCGAGTAGCAGCCGGATCAAGCTTATGTACATT GCTCTGGTATC-3'. (SEQ ID N°: 8).
Todas las reacciones de PCR se condujeron usando la ADN polimerasa Accupol (PGS Scientifics Corp) con los siguientes ajustes: 94 °C durante 5 minutos inicialmente y luego 94°C por 1 minuto, 56°C por 2 minutos, 72°C por 4 minutos; 25 ciclos. Estos cebadores generaron un producto de PCR para el sHeV G ORF flanqueado por sitios Sal 1 y para el sNiV G ORF flanqueado por sitios Xho 1. Los productos de la PCR se purificaron sobre gel (Qiagen). Después de la purificación sobre gel, se subclonaron sHeV G y sNiV G en un vector TOPO (Invitrogen).
Se adquirió PSectag2B (Invitrogen) y se modificó para contener una marca de péptido S o una marca de epitope myc. Se sintetizaron oligonucleótidos superpuestos que codificaban la secuencia para el péptido S y las sobreextensiones Kpn 1 y EcoR1 digeridas.
SPEPS: 5'- CAAGGAGACCGCTGCTGCTAAGTTCGAACGCCAGCACATGGATT CT-3' (SEQ ID N°: 9). SPEPAS: 5'AATTAGAATCCATGTGCTGGCGTTCGAACTT AGCAGCAGCGGTCTCCTTGGTAC-3'. (SEQ ID N°: 10).
Se sintetizaron oligonucleótidos superpuestos que codificaban la secuencia para la marca de epitope myc y las sobreextensiones Kpn 1 y EcoR1 digeridas.
MTS: 5'-CG AAC AAAAG CTCATCTCAG AAG AG G ATCTG-3' (SEQ ID N°: 1 1 ). MTAS 5 -AATTCAGATCCTCTTCTGAGATGAGCTTTTGTTCGGTAC-3' (SEQ ID N°: 12).
Se mezclaron 64 pmol de SPEPS y 64 pmol de SPEPAS y se calentaron a 65°C durante 5 minutos y se enfriaron lentamente a 50°C. Se mezclaron 64 pmol de MTS y 64 pmol de MTAS y se calentaron a 65°C durante 5 minutos y se enfriaron lentamente a 50°C. Las dos mezclas se diluyeron y clonaron en el pSecTag2B digerido con Kpn1-EcoR1 para generar el pSecTag2B modificado con el péptido S' o el pSecTag2B modificado con el epitope myc. Todas las construcciones fueron examinadas inicialmente mediante digestión por restricción y además se verificaron por secuenciación.
La construcción TOPO sG se digirió con Sal 1 purificado sobre gel (Qiagen) y se subclonó en marco en el sitio Xho 1 del pSecTag2B modificado con el péptido S o el pSecTag2B modificado con el epitope myc. Todas las construcciones fueron examinadas inicialmente mediante digestión por restricción y además se verificaron por secuenciación.
Las construcciones de directriz IgK-péptido S-s HeVG (sGs-tag) y directriz Igi -marca myc-sHeVG (sGmyC.tag) se subclonaron luego en el vector versátil de Vaccinia, pMCO2. Se sintetizó el oligonucleótido con la secuencia: 5'-?????????????6????????????????6???-3· (SEQ ID N°: 13) y se usó en combinación con el oligonucleótido sHGAS para amplificar por PCR a las construcciones sGs-tag y sGmyc-tag. Todas las reacciones de PCR se condujeron usando la ADN polimerasa Accupol (PGS Scientifics Corp) con los siguientes ajustes: 94°C durante 5 minutos inicialmente y luego 94°C por 1 minuto, 56°C por 2 minutos, 72°C por 4 minutos; 25 ciclos. Estos cebadores generaron productos de PCR flanqueados por sitios Sal 1. Los productos de la PCR se purificaron sobre gel (Qiagen). Después de la purificación sobre gel, sGs.tag y sGmyc-tag fueron subclonados en un vector TOPO (Invitrogen). Ambos sG S-tag y sG myc-tag fueron digeridos con Sal 1 y subclonados en el sitio Sal 1 del pMC02. Todas las construcciones fueron examinadas inicialmente mediante digestión por restricción y además se verificaron por secuenciación. A continuación se generó una secuencia de nucleótidos de codones optimizados para facilitar la producción en líneas de células eucariotas, que se muestra en la SEQ ID N°: 16.
Ejemplo 2. Producción de una proteína G soluble con virus Vaccinia En el proceso de producción de las proteínas, se usaron construcciones genéticas que contenían las secuencias que habían sido sometidas a una optimización a nivel de los codones para, generar vectores basados en virus de viruela recombinantes (virus Vaccinia, cepa WR). Los virus de viruela recombinantes se recuperaron con procedimientos convencionales, sobre la base de una selección con tk y una coloración con GUS. En resumen, se transfectaron células CV-1 con una fusión entre pMCO2 y una proteína G soluble del HeV o con una fusión entre pMCO2 y una proteína G soluble del NiV, mediante el uso de un conjunto de elementos apropiado para poner en práctica una transfección mediada por fosfato de calcio (Promega). Las monocapas que se obtuvieron se infectaron con un virus Vaccinia de la cepa salvaje Western Reserve (WR), con una multiplicidad de infección (MOI) de 0,05 PFU/célula. Después de 2 días, se recolectaron los pellets que comprendían las células para usarlos como reservas madre de los virus recombinantes en bruto, que luego se usaron para infectar las células TK", en presencia de 25 pg/ml de 5-bromo-2'-desoxiuridina (BrdU, de Calbiochem). Una vez transcurridas 2 horas, el virus fue reemplazado por un recubrimiento de EMEM-10 que comprendió 1 % de una agarosa caracterizada por un punto de fusión bajo (LMP, de Life Technologies) y 25 µg/ml de BrdU. Después de incubar durante 2 días, se aplicó un recubrimiento adicional de EMEM-10 que comprendió 1% de agarosa LMP, 25 pg/ml de BrdU y 0,2 mg/ml de ácido 5-bromo-4-cloro-3-indolil-p-D-glucurónico (X-GLUC, de Clontech). En un período de 24-48 horas, fue posible observar placas azules, las cuales fueron recolectadas y posteriormente fueron sometidas a dos procedimientos de purificación adicionales, que estuvieron basados en una selección doble en placas. Luego se amplificaron los virus Vaccinia recombinantes vKB16 (que comprendió la fusión con la proteína G soluble del HeV) y vKB22 (que comprendió la fusión con la proteína G soluble del NiV) y se los purificó de acuerdo con métodos convencionales. En resumen, los virus Vaccinia recombinantes pueden purificarse en placas, en un cultivo de células, por medio de una precipitación con una almohadilla de sacarosa en una ultracentrífuga o con un análisis basado en una titulación en placas. Se verificó la expresión de la fusión que comprendió la fusión con la proteína G soluble del HeV en los lisados celulares y en los sobredantes de los cultivos. Ejemplo 3. Producción de una proteína G soluble con células 293F Se usaron construcciones genéticas que contenían las secuencias que habían sido sometidas a una optimización a nivel de los codones para transformar células 293F (de Invitrogen) y obtener líneas de células estables en las que se expresara una glucoproteína G soluble del HeV. Para poner en práctica la transformación y la expresión de la glucoproteína G soluble del HeV, también podrían haberse usado células CHO-S (de Invitrogen). Las células transformadas fueron sembradas en un frasco apropiado para cultivar tejidos de 162 cm2, con 35 mi de DMEM-10, donde se permitió que se adhirieran, y se las cultivó a 37°C con 5-8% de CO2 durante varios días. Cuando las células alcanzaron un estado de confluencia, se las distribuyó entre múltiples frascos que comprendieron DMEM-10 más 150 pg/ml de higromicina B (30 mi por frasco). Una vez que las células alcanzaron una confluencia de 70-80% en estos frascos, se las sometió a dos lavados con 30 mi de PBS, se agregaron 20 mi del medio 293 SFM II (de Invitrogen) y se realizó una incubación a 37°C durante la noche, en presencia de 5-8% de C02. Al día siguiente, las células fueron transferidas a frascos Erlenmeyer que comprendían 200 mi del medio SFM II. Se permitió que las células se desarrollaran a 37°C durante 5-6 días, en presencia de 5-8% de CO2 y con agitación a 125 rpm, hasta que comenzaron a morir, momento en el cual se recolectó el sobrenadante.
El medio en cada frasco Erlenmeyer fue centrifugado a 3500 rpm durante 30 minutos. Se transfirió el sobrenadante a botellas para centrífuga de 250 mi y se realizó una centrifugación a 10000 rpm durante una hora. Se recolectó el sobrenadante resultante y se agregó un inhibidor de las proteasas de acuerdo con las recomendaciones del fabricante, en combinación con Tritón X-100, en una concentración final de 0,1%. Posteriormente, se sometió el sobrenadante a una filtración a través de una membrana de 0,2 pm con una afinidad baja por las proteínas.
La proteína G soluble del HeV se purificó por medio de una cromatografía de afinidad en una columna de agarosa con la proteína S. Para ello, se cargó un lecho de 20 mi de agarosa con la proteína S (de Novagen) en una columna XK 26 (de GE Healthcare) y se lavó la columna con 10 veces el volumen del lecho de un amortiguador de unión/lavado apropiado (que comprendió NaCI 0,15 M, Tris-HCI 20 mM y 0,1% de Tritón X-100 y que tuvo un pH de 7,5). El sobrenadante resultante, que comprendía la proteína G soluble del HeV, fue aplicado sobre la columna con una velocidad de flujo de 3 ml/minuto. Se lavó la columna con 10 veces el volumen del lecho (200 mi) del amortiguador de unión/lavado que se ha descripto, y luego se realizó un lavado con 6 veces el volumen del lecho (120 mi) del amortiguador de unión/lavado diferente (que comprendió NaCI 0, 5 M y Tris-HCI 20 mM y que tuvo un pH de 7,5).
Se desactivó la bomba y se permitió que el amortiguador dé lavado se escurriera hasta que alcanzara la superficie de las esferas, momento en el cual se agregaron 30 mi de un amortiguador de elución apropiado (que comprendió ácido cítrico 0,2 M y que tuvo un pH de 2). Se recolectó la primera fracción de 10 mi que atravesó la columna (que debería haber comprendido el amortiguador de lavado) y se incubaron las esferas con el amortiguador de lavado durante 10 minutos. Posteriormente, se colocaron 15 mi de la fracción eluida en un tubo para centrífuga cónico y estéril de 50 mi que contenía 25 mi de un amortiguador de neutralización apropiado (que comprendió Tris 1 M y que tuvo un pH de 8). Se fijó un pH neutro y se repitió tres veces el procedimiento de elución e incubación. Se combinaron todas las fracciones eluidas neutralizadas y se realizó una concentración hasta alcanzar un volumen aproximado de 4 mi. La proteína G soluble del HéV que se recolectó (4 mi) fue purificada a través de una membrana de 0,2 µp? con una afinidad baja por las proteínas (un filtro para jeringas Acrodisc de 13 mm, con una membrana HT Tuffryn de 0,2 pm).
Puede emplearse una filtración a través de un gel para purificar la proteína G soluble del HeV en una medida mayor. Una vez realizado un análisis para controlar la calidad y para confirmar la pureza y el estado oligomérico, pueden combinarse las alícuotas que comprenden los tetrámeros con los dímeros, los dímeros y los monómeros de la proteína G soluble del HeV para almacenarlas a -80°C.
Ejemplo 4. Preparación de una formulación para una vacuna En la figura 3 se provee un esquema donde se resume la preparación del complejo de ¡nmunoestimulación (ISC), que se describe con mayor detalle a continuación.
En el paso 1 , se prepara una solución que comprende 90 g/l de decanoíl-n-metilglucamida (el detergente Mega-10) en agua para inyección (WFI). La solución se calienta para asegurar la disolución total del detergente Mega 10, y luego se usa de inmediato en el paso 2 o se esteriliza por medio de una filtración.
En el paso 2, se prepara una solución que comprende 25 g/l de colesterol y 25 g/l de dipalmitoíl fosfatidil colina (DPPC) disolviendo estos componentes en una solución madre apropiada del detergente Mega 10. La solución se calienta para disolver todos los componentes, y luego se usa de inmediato en el paso 3 o se esteriliza por medio de una filtración.
En el paso 3, se prepara una solución salina isotónica amortiguada, que comprende un amortiguador a base de fosfato 10 mM con un pH de 6,2 ± 1 (BIS), con WFI, y se la somete a una filtración para esterilizarla si no se la usa de inmediato.
En el paso 4, se prepara una solución de Quil A en BIS, en una concentración final de 100 g/l, y se la somete a una filtración para esterilizarla si no se la usa de inmediato.
En el paso 5, el ISC se formula en un recipiente con una temperatura controlada (22-37°C), con agitación, mediante la adición consecutiva de BIS precalentado, colesterol/DPPC en una solución del detergente Mega÷10 (160 ml/l) y una solución de Quil A (200 ml/l). Se lleva el volumen de la reacción hasta el valor deseado mediante la adición de BIS.
En el paso 6, se equilibra la temperatura de la formulación completa hasta alcanzar el valor deseado (27°C, con un rango de operación aceptable de 22-37°C) y se incuba durante 15 minutos con agitación para facilitar la formación del ISC. La solución que comprende el ISC se somete a un procesamiento adicional en el paso 7 o se esteriliza por medio de una filtración para prepararla para un almacenamiento intermedio.
En el paso 7, la mezcla de reacción que comprende el ISC se depura por medio de una diálisis (con una membrana Hidrosart de 30 kDa, de Sartorius AG Goettingen), donde se realiza un mínimo de 20 cambios de volumen con BIS, en presencia de una temperatura controlada (de 27°C, con un rango de operación aceptable de 21-37°C), de manera tal de eliminar los componentes que no han formado complejos.
En el paso 8, el ISC dializado se concentra hasta aproximadamente el doble por medio de una ultrafiltración, donde se emplea la misma membrana que se usa en la diálisis. El sistema de filtración se lava con BIS para obtener el volumen original del ISC.
En el paso 9, el ISC se filtra a través de un tamiz de acetato de celulosa de 0,22 pm y se transfiere a un recipiente de almacenamiento estéril.
En el paso 10, el ISC combinado con el coadyuvante se almacena a 2-8°C hasta que se decide usarlo en la formulación de la vacuna.
Finalmente, se combina el complejo de inmunoestimulación (250 pg/ml) con una cantidad apropiada de una glucoproteína G soluble del HeV (por ejemplo, 5, 50 ó 100 pg/ml) y se ajusta el volumen con BIS.
Ejemplo 5. Primer experimento clínico en caballos Como vacuna de prueba 1 , se usó una glucoproteína soluble recombinante del virus Hendra (sG) en una cantidad de 100 pg por dosis, con 250 pg de un complejo de inmunoestimulación como coadyuvante. El volumen fue ajustado en 1 mi por dosis con solución salina.
Como vacuna de prueba 2, se usó una glucoproteína soluble recombinante del virus Hendra (sG) en una cantidad de 50 pg por dosis, con 250 pg de un complejo de inmunoestimulación como coadyuvante. El volumen fue ajustado en 1 mi por dosis con solución salina.
Como vacuna de prueba 3, se usó una glucoproteína soluble recombinante del virus Hendra (sG) en una cantidad de 5 pg por dosis, con 250 pg de un complejo de inmunoestimulación como coadyuvante. El volumen fue ajustado en 1 mi por dosis con solución salina.
Los datos serológicos y los datos relacionados con la protección ante los desafíos se obtuvieron en dos lotes de caballos que fueron tratados con las vacunas que comprendían los antígenos en las concentraciones más altas (50 o 100 pg por dosis).
En el análisis serológico, se inmunizaron dos caballos con dos dosis de la vacuna (100 g de la proteína sG con el ISC), con una separación de 21 días. Mediante el análisis serológico que se realizó antes de la estimulación y después del desafío, fue posible confirmar que se produjo una seroconversión en el HeV merced a la inducción por parte de la vacuna (tabla 1). El nivel de los anticuerpos neutralizadores que se determinó antes del desafío con el virus fue comparable al nivel de protección que se había observado en gatos que habían sido expuestos a una dosis del virus Nipah que de otro modo habría resultado letal. En el caballo al que solamente se le administró el coadyuvante (el control negativo), no se observó el desarrollo de anticuerpos contra el HeV antes del desafío con el virus.
Tabla 1 De esta manera, cada caballo fue expuesto a un HeV vivo en una instalación de contención BSL4, 27 días después de recibir la inmunización de refuerzo. El virus fue administrado por vía intranasal (a razón de 1 x 106 la TCID5o) y oral (a razón de 1 x 106 la TCID50). En el momento del desafío y durante el período de observación posterior, la identidad del caballo de control no fue conocida por el personal que participación en esta parte del trabajo.
Cuando se realizó la observación clínica del caballo V1 , se determinó que su estado fue bueno durante el período de observación que siguió a la exposición al HeV, aparte de la infección localizada que se produjo en el sitio de ingreso, es decir, la hinchazón en la yugular que se produjo en el sitio donde se había insertado el catéter, que se observó el 8o día después del desafío. Esto no fue asociado a un signo propio de una enfermedad. El caballo fue sometido a una eutanasia por elección el 9o día después del desafío con el virus. Por medio de un análisis post-mortem genérico, fue posible confirmar la presencia de un lipoma mesentérico de 10 cm (lo cual fue un descubrimiento incidental) y de una dilatación ligera en los vasos linfáticos en el extremo ventral de los lóbulos pulmonares y cardiacos izquierdos, que fue atribuida al barbiturato. En el análisis inicial de los tejidos de este caballo, no se hallaron evidencias de lesiones o antígenos propios del HeV.
Observaciones clínicas para V2: Este caballo desarrolló una descarga nasal transitoria leve el día 3, pero por lo demás permaneció bien hasta una elevación de la temperatura el día 6 asociado con una reacción inflamatoria localizada en el sitio del catéter yugular implantado. El catéter se retiró, pero la lesión continuó aumentando de tamaño y el caballo se estaba volviendo bastante irritable de modo que al día siguiente (día 7) la yegua fue tratada con penicilina de acción prolongada. Tanto su temperatura como su temperamento habían vuelto a la normalidad para el día 8 y se optó por sacrificarla. Las anomalías observadas con el examen postmortem general se restringían a una leve dilatación de los vasos linfáticos en la punta ventral del lóbulo pulmonar cardíaco derecho que fue atribuido al barbiturato. La selección inicial de tejidos no presentó evidencia de lesiones o del antígeno HeV en este caballo; actualmente se está completando un examen exhaustivo.
Observaciones clínicas para V3: Este caballo desarrolló una descarga nasal transitoria leve el día 4, pero luego permaneció bien hasta un aumento de la temperatura el día 6 sin signos localizados. Su frecuencia cardíaca también había aumentado y presentaba una ligera reacción de la piel que era consistente con una deshidratación leve y un aspecto recogido. Este conjunto de signos es típico de una infección por HeV aguda bajo las condiciones de laboratorio. Su temperatura y frecuencia cardíaca continuó aumentando durante las siguientes 12 horas (Figuras 1 y 2), estaba ligeramente deprimida y entonces se optó por sacrificarla por razones humanitarias el día 7. En el momento del examen postmortem había una dilatación moderadamente severa de los vasos linfáticos sobre el lóbulo cardíaco del pulmón con compromiso de 8-10 cm ventrales acompañado de engrasamiento pleural y edema.
El examen histológico indicó vasculitis pulmonar con necrosis fibrinoide de los vasos vasculares, edema del septo interlobular y alveolitis necrotizante focal. Había una extensa deposición de antígeno HeV en el endotelio y la media de los vasos sanguíneos en el pulmón; las meninges; el parénquima cerebral; el ganglio trigémino; los nodulos linfáticos submandibulares, bronquiales, inguinales y renales; el bazo; el hígado; el corazón; el paladar blando; las glándulas adrenales; los glomérulos renales; el intestino delgado y grueso; el ovario; la faringe y los cornetes así como los centros germinales en el bazo y miocitos cardíacos ocasionales. La médula espinal, la bolsa gutural, la vejiga y el polo olfatorio del cerebro eran negativos. La histología y la inmunohistología eran consistentes con una infección por HeV peraguda.
Análisis molecular de las muestras clínicas. No hubo evidencia de propagación de HeV en ninguna muestra biológica recolectada de los caballos V1 y V2 inmunizados durante todo el período de observación clínica. Específicamente, no se recuperó genoma de hisopados nasales profundos o de la sangre en cualquier día después de la exposición.
Por el contrario, en el caballo V3 no inmunizado, se detectó genoma viral en los hisopados nasales del día 3 después del desafío. Los valores de Ct decrecientes en días de muestreo sucesivos sugieren una replicación viral en el tracto respiratorio superior y es consistente con las observaciones anteriores del laboratorio de los autores después de la exposición de caballos naíve al HeV Redlands 2008. El hallazgo de genoma viral en sangre inmediatamente antes del comienzo de la fiebre, y en todas las secreciones a partir de ese momento, coincidente con el reconocimiento más temprano de otros signos clínicos, tal como depresión, también es consistente con las observaciones anteriores.
Tabla 2 Muestras de postmortem. Una PCR TaqMan (gen HeV N) permitió confirmar la replicación del virus del desafío en V3 (Control) con diseminación de infección a múltiples tejidos (Tabla 3). Los mayores niveles de replicación se encontraron en pulmón, bazo, riñon, miocardio y los tejidos linfoides asociados con el tracto respiratorio superior e inferior como se informó previamente. No hubo evidencia de replicación viral en los tejidos de los caballos inmunizados (V1 y V2).
Tabla 3 Serología después del desafío. Los caballos inmunizados V1 y V2 no mostraron refuerzo en el título después del desafío con HeV (Tabla 4). Estos es consistente con una replicación no significativa del virus del desafío en estos animales. No se detectaron anticuerpos en el caballo V3 control en el momento de la eutanasia el día 7 después del desafío. Se consideró que no hubo tiempo suficiente entre la exposición al virus y la muerte de este animal para la generación de anticuerpos detectables, y es consistente con observaciones anteriores en el laboratorio de los autores con HeV Redlands en caballos.
Tabla 4 Dos caballos (V1 y V2) que fueron vacunados con 100 de sG + adyuvante ISC en un régimen de sensibilización-refuerzo seroconvirtieron a HeV antes de la exposición a HeV. Un caballo (V3) que solamente recibió ISC permaneció seronegativo para el virus del desafío.
Después del desafío con una dosis por lo demás letal de HeV, los caballos inmunizados permanecieron clínicamente bien durante todo el período de observación, que sobrepasó que tiempo de inicio de todos los casos de HeV inducidos experimentalmente en caballos. El caballo sin evidencia serológica de inmunidad (V3) fue sacrificado después que desarrolló signos clínicos consistentes con HeV agudo. No se detectó un refuerzo del título de anticuerpo después del desafío en caballos inmunizados, lo cual es consistente con ausencia de replicación del virus del desafío en estos animales.
No hubo evidencia de propagación viral en los caballos inmunizados, como lo reflejan los resultados negativos de la PCR en todas las muestras clínicas diarias. En el control no inmunizado, se detectó genoma viral en los hisopados nasales del día 3 después de la exposición al virus, en sangre inmediatamente antes del comienzo de la fiebre y en todas las muestras clínicas desde el momento en que se estableció la fiebre. Este patrón de propagación es consistente con el observado en los caballos na'ive expuestos al HeV en un estudio anterior realizado en estas instalaciones.
No hubo evidencia de replicación viral HeV en ningún tejido de los caballos inmunizados recolectados en el examen postmortem, después de la eutanasia durante lo que se esperaría hubiera sido el período de infección aguda. Por el contrario, el genoma y antígeno HeV estaban distribuidos en todos los tejidos del caballo control según un patrón consistente con una infección por HeV aguda, y también se identificó una vasculopatía típica de una infección por HeV.
Ejemplo 6: Segundo estudio clínico en caballos Se inmunizaron tres caballos, cada uno con dos dosis de vacuna (50 pg de sG con ISC) separados 21 días entre sí. La serología de postsensibilización y predesafío confirmó una seroconversión inducida por la vacuna a HeV (Tabla 5). Los niveles de anticuerpos neutralizantes predesafío del virus eran comparables a los observados como protectores en gatos expuestos a una dosis por lo demás letal del virus Nipah estrechamente relacionado y de caballos expuestos a HeV en el primer estudio clínico descrito en la presente. Un caballo que solamente recibió adyuvante no desarrolló anticuerpos contra HeV antes del desafío viral de los caballos inmunizados (no se muestran los datos).
Tabla 5 Por lo tanto, cada caballo inmunizado fue expuesto al HeV vivo en una instalación de contención BSL4 27 días después de recibir la inmunización de refuerzo. El virus se administró por vía intranasal (1 x 106 TCID50) y oral (1 x 106 TCID50). Se emplearon cuatro cobayos en este estudio como controles de patogenicidad con la esperanza que por lo menos uno de ellos cedería a la enfermedad del HeV. Un cobayo fue expuesto a 50.000 TCID50 HeV por la ruta intraperitoneal.
Observaciones clínicas para V4: Este caballo permaneció clínicamente bien durante el período de observación después de la exposición al HeV, y la temperatura y la frecuencia cardíaca permanecieron dentro de los límites normales. Se optó por sacrificar al caballo el día 8 después del desafío viral. No se notaron anomalías en el examen postmortem general. La selección inicial de tejidos no presentó evidencia de lesiones o del antígeno HeV en este caballo; actualmente se está completando un examen exhaustivo.
Observaciones clínicas para V5: Este caballo permaneció clínicamente bien durante el período de observación después de la exposición al HeV, y la temperatura y la frecuencia cardíaca permanecieron dentro de los límites normales (Figura 2). Se optó por sacrificar al caballo el día 7 después del desafío viral. No se notaron anomalías en el examen postmortem general. La selección inicial de tejidos no presentó evidencia de lesiones o del antígeno HeV en este caballo; actualmente sé está completando un examen exhaustivo.
Observaciones clínicas para V6: Este caballo permaneció clínicamente bien durante el período de observación después de la exposición al HeV, y la temperatura y la frecuencia cardíaca permanecieron dentro de los límites normales (Figura 2). Se optó por sacrificar al caballo el día 9 después del desafío viral. No se notaron anomalías en el examen postmortem general. La selección inicial de tejidos no presentó evidencia de lesiones o del antígeno HeV en este caballo; actualmente se está completando un examen exhaustivo.
Cobayos: Uno de los 4 cobayos (N° 3) comenzó a perder peso el día 3 después del desafío con HeV. La pérdida de peso continuó hasta el día 5 cuando el animal presentó signos neurológicos (inclinación de la cabeza, temblores) y fue sacrificado. Las anomalías en el examen postmortem se restringían a edema de los tejidos conectivos retroperitoneales.
El examen histológico mostró que hubo vasculitis pulmonar, vásculitis de los vasos sanguíneos perirrenales, ooforitis y encefalitis no supurante asociada con la deposición del antígeno del HeV. La histología y la inmunohistología eran consistentes con una infección aguda por HeV y confirmaron la patogenicidad del virus del desafío.
No hubo evidencia de propagación del HeV en ninguna muestra biológica recolectada de V4, V5 o V6 durante todo el período de observación clínica salvo en un hisopado rectal de V6 el día 3 en el cual se observó un valor de Ct (gen HeV N) de 36,2 en el TaqMan PCR en una de dos cavidades replicadas, donde la segunda cavidad no presentó amplificación (Tabla 6). Específicamente, no se recuperó genoma de hisopados nasales profundos o de la sangre en cualquier día después de la exposición.
Tabla 6 Muestras de postmortem. No hubo evidencia de replicación viral en los tejidos de los caballos inmunizados V4, V5 o V6. En un cobayo (N° 3), se detectó el genoma viral en sangre (Ct 34,2), en cerebro, en pulmón y en bazo el día 5 después del desafío, corroborando así los hallazgos clínicos, histológicos e inmunohistológicos de una infección por HeV aguda en este animal (Tabla 7).
Tabla 7 Serología después del desafío. Los caballos inmunizados V4, V5 y V6 no mostraron refuerzo en el título después del desafío con HeV (Tabla 8). Estos es consistente con una replicación no significativa del virus del desafío en estos animales.
Tabla 8 Tres caballos (V4, V5 y V6) que fueron vacunados con 50 \ig de sG + adyuvante ISC en un régimen de sensibilización-refuerzo seroconvirtieron a HeV antes de la exposición a HeV. Un caballo que solamente recibió ISC permaneció seronegativo para el virus del desafío.
Después del desafío con una dosis por lo demás letal de HeV, los caballos inmunizados permanecieron clínicamente bien durante todo el período de observación, que sobrepasó que tiempo de inicio de todos los casos de HeV inducidos experimentalmente en caballos. Un cobayo usado como control de patogenicidad fue sacrificado después que desarrollara signos clínicos consistentes con un HeV agudo. No se detectó un refuerzo del título de anticuerpo después del desafío en caballos inmunizados, lo cual es consistente con ausencia de replicación del virus del desafío en estos animales.
No hubo evidencia de propagación viral en los caballos inmunizados, como lo reflejan los resultados negativos de la PCR en todas las muestras clínicas diarias, salvo una réplica de un hisopado rectal de V6 del día 3. Actualmente se está repitiendo esta prueba; si se encontraran resultados similares una explicación posible es que esto representa un nivel bajo de inoculo residual. En un cobayo no inmunizado, se detectó genoma viral en los principales órganos y en sangre el día 5 después de la exposición al virus.
No hubo evidencia de replicación viral HeV en ningún tejido de los caballos inmunizados recolectados en el examen postmortem, después de la eutanasia durante lo que se esperaría hubiera sido el período de infección aguda. Por el contrario, el genoma y antígeno HeV estaban distribuidos en todos los tejidos del cobayo susceptible según un patrón consistente con una infección por HeV aguda, y también se identificó una vasculopatía típica de una infección por HeV en este animal.
Ejemplo 7: Estudio clínico en primates para el virus Nipah Estadística. Los estudios en animales, en particular los estudios en primates no humanos, con un nivel de bioseguridad 4 (BSL-4) restringe severamente el número de sujetos animales, el volumen de las muestras biológicas que se pueden obtener y la capacidad para repetir ensayos de manera independiente y por lo tanto limita el análisis estadístico. En consecuencia, los datos se presentan como la media o la mediana calculada a partir de muestras replicadas, no de ensayos replicados, y las barras de error representan la desviación estándar entre réplicas.
Virus. El virus NiV-Malaysia (GenBank, Acceso N" AF212302) se obtuvo de la Special Pathogens Branch of Centers for Disease Control and Prevention, Atlanta, Georgia. El NiV se propagó y se tituló en células Vero como se describe para el HeV en Rockx et al., (2010) J. Viral. 84, 9831.
Formulación de la vacuna. Se emplearon tres formulaciones de vacuna contra sGHeV (10 g, 50 g o 100 ig). La producción y purificación del sGHeV se efectuó como se describió previamente en Pallister (2011 ) Vaccine 29, 5623. Cada formulación de vacuna también contenían Allhidrogel™ (Accurate Chemical & Scientific Corporation) y el oligodesoxinucleótido CpG (ODN) 2006 (Invivogen) que contiene un esqueleto todo de fosforotioato. Las dosis de vacuna que contienen una cantidad fija de ODN 2006, cantidades variables de sGHeV y ion de aluminio (a una relación ponderal de 1 :25) se formularon de la siguiente manera: Dosis 100 ug: 100 ug de sGHeV, 2,5 mg del ion de aluminio y 150 ug de ODN 2006; Dosis de 50 ug: 50 ug de sGHeV, 1 ,25 mg del ion de aluminio y 150 ug de ODN 2006; Dosis de 10 ug: 5 ug de sGHeV, 250 ug de ion de aluminio y 150 ug de ODN 2006. Para todas las dosis, primero se mezclaron Alhidrogel™ y sGHeV antes de agregar ODN 2006. Cada dosis de vacuna se ajustó en 1 mi con PBS y las mezclas se incubaron en una rueda rotatoria a temperatura ambiente durante por lo menos dos a tres horas antes de la inyección. Cada sujeto recibió la misma dosis de 1 mi para la sensibilización y el refuerzo y todas las dosis de vacuna se administraron mediante inyección intramuscular.
Animales. Se alojaron diez monos verdes africanos adultos jóvenes (AGM) (Clorocebus aetiops), que pesaban 4-6 kg (Three Springs Scientific Inc.) en jaulas individuales. Los sujetos fueron anestesiados mediante inyección intramuscular de ketamina (10-15 mg/kg) y vacunados con sGHeV el día -42 (sensibilización) y el día -21 (refuerzo). Tres sujetos recibieron dos dosis de 10 ug (AGM 16, AGM 17, AGM 18), tres sujetos recibieron dos dosis de 50 ug (AGM 13, AGM 14, AGM 15), tres animales recibieron dos dosis de 100 ug (AGM 10, AGM 1 1 , AGM 12) y un sujeto (AGM 9) sólo recibió adyuvante. El día 0, los sujetos fueron anestesiados y luego inoculados por vía intratraqueal con 1 ? 05 TCID50 (mediana de la dosis de cultivo de tejido infeccioso) de NiV en 4 mi de medio esencial mínimo de Dulbecco (DMEM) (Sigma-Aldrich). Los sujetos fueron anestesiados para los exámenes clínicos incluyendo temperatura, frecuencia respiratoria, radiografías de tórax, extracción de sangre e hisopados de las mucosas nasal, oral y rectal los días 0, 3, 5, 7, 10, 14, 21 y 28 de postinfección (p.i.). El sujeto control (AGM 9) tuvo que ser sacrificado de acuerdo con los puntos finales humanitarios aprobados el día 10 de postinfección. Todos los demás sujetos sobrevivieron hasta el final del estudio y fueron sacrificados el día 28 de postinfección. En la necropsia, se recolectaron diversos tejidos para virología e histopatología. Los tejidos muestreados incluyen: conjuntiva, amígdalas, oro/nasofaringe, mucosa nasal, tráquea, bronquio derecho, bronquio izquierdo, lóbulo pulmonar superior izquierdo, lóbulo pulmonar medio derecho, lóbulo pulmonar inferior derecho, lóbulo pulmonar superior derecho, lóbulo pulmonar medio derecho, lóbulo pulmonar inferior derecho, nodulo linfático bronquial (LN), corazón, hígado, bazo, riñon, glándulas adrenales, páncreas, yeyuno, colon transverso, cerebro (frontal), cerebro (cerebelo), tallo cerebral, médula espinal cervical, glándula pituitaria, LN mandibular, LN salival, LN inguinal, LN axilar, LN mesentérica, vejiga urinaria, testículos u ovarios, médula ósea femoral. La vacunación se realizó según la contención BSL-2. En la Figura 4 se muestra una línea de tiempo del programa de vacunación, días de desafío y de recolección de muestras biológicas.
Vacunación y desafío con NiV. Previamente, se ha demostrado que la inoculación ¡ntratraqueal de los AGMs con 105 TCID50 (mediana de la dosis de cultivo de tejido infeccioso) de NiV causó un resultado uniformemente letal (Rockx et al. (2010) J. Virol. 84, 9831). Se observó enfermedad clínica rápidamente progresiva en estos estudios; los signos clínicos incluyeron depresión severa, enfermedad respiratoria que conduce a una dificultad respiratoria aguda, enfermedad neurológica severa y movilidad severamente reducida; y el tiempo hasta alcanzar los criterios de punto final humanos aprobados para la eutanasia, que variaba entre 7 y 12 días. En este caso, se buscó determinar si la vacunación con sGHeV podía prevenir la infección y enfermedad por NiV en AGMs. Se mezclaron dosis de 10, 50 ó 10O.pg de sGHeV con alúmina y unidades CpG como se describe en los métodos. Cada formulación de vacuna se administró por vía subcutánea a tres sujetos el día 0 (sensibilización) y nuevamente el día 21 (refuerzo) y un sujeto control (AGM 9) recibió sensibilización y refuerzo con adyuvante solamente los mismos días. El día 42, todos los sujetos fueron inoculados por vía intratraqueal con 105 TCID50 de NiV. El sujeto control (AGM 9) mostró pérdida de apetito, cambios de comportamiento sostenidos severos (depresión, actividad disminuida, postura encorvada), disminución en el número de plaquetas y un aumento gradual en la frecuencia respiratoria en la etapa final de la enfermedad. A continuación, el AGM 9 desarrolló dificultad respiratoria aguda y tuvo que ser sacrificado de acuerdo con los puntos finales humanitarios aprobados el día 10 de postínfección. Por el contrario, ninguno de los sujetos vacunados tuvo la enfermedad clínica y todos sobrevivieron hasta el final del estudio. En la Figura 5 se muestra un gráfico de supervivencia de Kaplan-Meier.
Enfermedad mediada por NiV en el sujeto control. Los cambios patológicos generales en el sujeto control eran consistentes con los observados previamente en los AGMs infectados con NiV (Geisbert et al. (2010) PLoS One 5, e10690). Se observó esplenomegalia y congestión de los vasos sanguíneos sobre la superficie del cerebro y todos los lóbulos pulmonares eran húmedos y pesados. No se recuperó ARN del NiV ni virus infeccioso de las muestras de sangre de AGM 9 y no hubo evidencia de viremia. El AGM 9 presentó niveles significativos de IgM específica de NiV y también niveles detectables de IgG e IgA específicas de NiV. Un análisis adicional de las muestras de tejido reveló un tropismo tisular extensivo de NiV similar a la infección de NiV dispersa observada previamente en los AGMs (Geisbert et al. (2010) PLoS One 5, e10690). El AGM 9 tenía ARN de NiV en la mayoría de los tejidos como se indica y se recuperó virus infeccioso de numerosos tejidos. Las lesiones significativas incluyeron neumonía intersticial, encefalitis subaguda y necrosis y hemorragia de la pulpa esplénica blanca. Los espacios alveolares estaban llenos de fluido de edema, fibrina, desechos cariorrécticos y celulares, y macrófagos alveolares. La encefalitis multifocal se caracterizó por expansión del espacio de Virchow-Robins por cantidades moderadas de linfocitos y unos pocos neutrófilos. Cantidades menores de estas células inflamatorias se extendía dentro del parénquima adyacente. Numerosas neuronas estaban hinchadas y vacuoladas (degeneración) o estaban fragmentadas con cariolisis (necrosis). Los centros germinales multifocales de folículos en la pulpa esplénica blanca estaban desplazados por hemorragia y fibrina, así como pequeñas cantidades de neutrófilos y desechos celulares y cariorrécticos. Estos hallazgos eran consistentes con necrosis y pérdida de los centros germinales en el bazo. Había cantidades extensas de antígeno viral en el tallo cerebral, lo cual resalta el daño extensivo que el NiV causa en el sistema nervioso central.
Protección de los sujetos vacunados con sGHeV. Todos los especímenes biológicos, incluyendo todas las muestras de sangre recolectadas después del desafío y todos los tejidos recolectados en la necropsia, eran negativos para el ARN de NiV y no se aisló virus infeccioso de ningún espécimen. En un examen más detallado de las secciones de tejido de los sujetos vacunados, la arquitectura del tejido parecía normal y no se detectó el antígeno NiV en ningún tejido usando técnicas inmunohistoquímicas. Para desmenuzar aún más los mecanismos de protección generados por la vacuna, se midieron los valores en suero y mucosa de IgM, IgG e IgA específicas de sGNiV y sGHeV, así como los títulos de neutralización de NiV y HeV en suero en los animales vacunados. Según se demuestra en la Figura 6, siete días antes del desafío, los sujetos que recibieron la dosis más baja de sGHeV tenían niveles detectables en suero de IgM específica del antígeno y el nivel más alto de IgG en suero específica de sGHeV. Los sujetos que recibieron 50 µg de sGHeV también tenían niveles detectables de IgM en suero y sus niveles más altos de IgG en suero siete días antes del desafío. Los sujetos que recibieron la dosis alta no presentaron niveles detectables de IgM en suero y los niveles de IgG en suero eran significativamente menores el día -7 en comparación con los otros dos grupos. El día del desafío con NiV, los niveles de IgG suero en los sujetos de la dosis alta habían aumentado y todos los sujetos vacunados presentaron niveles similares de IgG. Los niveles de IgM en suero no cambiaron en ningún sujeto después del desafío con NiV. Los niveles de IgG en suero disminuyeron en los sujetos que recibieron media dosis el día del NiV desafío y los niveles de IgG disminuyeron en los sujetos con dosis baja justo después del desafío con NiV. Notablemente, los niveles de IgG aumentaron en estos dos grupos para el día 3 y el día 5 p.i. pero nunca sobrepasaron los niveles de IgG presentes siete días antes del desafío y en ambos grupos los títulos disminuyeron significativamente para el día 28 p.i..
A la inversa, los niveles de IgG en suero en el grupo de la dosis alta permanecieron altos y alcanzaron su punto más alto el día 28 p.i.. La IgA en suero específica del antígeno era detectable en todos los sujetos después de la vacunación; sin embargo, los niveles eran muy bajos y los niveles de predesafío y postdesafío no parecían significativamente diferentes (Figura 6). Se detectó un aumento mínimo en la IgA específica del antígeno en mucosa en los hisopados nasales de los sujetos de dosis baja el día 14 p.i.; sin embargo, los niveles eran tan bajos que estos anticuerpos de la mucosa probablemente no cumplían ningún rol en prevenir la dispersión del NiV después del desafío. Los resultados de las pruebas de neutralización de suero (SNTs) se muestran en la Tabla 9. Para todos los sujetos vacunados, el título de neutralización específica de HeV permaneció igual o disminuyó para el día 28 p.i. y el título de neutralización específica de NiV no cambió significativamente para el día 7 p.i., aún en los sujetos que presentaron el título más bajo antes del desafío. Un sujeto de la dosis baja y uno de la dosis alta presentaba un aumento log en el título de NiV SNT para el día 14 p.i. y un sujeto de la dosis del medio mostró un aumento log en el título de NiV SNT para el día 21 p.i. En todos los demás animales vacunados, los cambios en el título SNT eran inconsistentes (el título aumentaba y luego disminuía) o insignificantes (el título aumentó en 3-4 veces pero no más que un log). Finalmente, la seroconversion en la glucoproteína de fusión (F) de la envoltura de NiV se midió en los sujetos vacunados después del desafío NiV. Los niveles mínimos de IgM anti-NiV F en suero fueron detectados en los sujetos de dosis baja y media el día 10 y el día 21 p.i., respectivamente, y estos valores bajos de M.F.I. sugieren una débil respuesta de anticuerpos primaria después del desafío con NiV. La IgM anti-NiV-F en suero no fue detectada en los sujetos de dosis altas lo cual sugiere que estos animales tenían poco o ningún virus circulante después del desafío.
Ejemplo 8: Estudio clínico en primates para el virus Hendra Se condujo un segundo estudio clínico en AGM para evaluar la vacunación y el desafío con el virus Hendra. Se utilizó la misma formulación que en el Ejemplo 7 como vacuna pero también se comparó con otro grupo que recibió sGHeV con Alhidrogel™ solamente como adyuvante (sin ODN 2006). Los animales fueron vacunados el día -21 , recibieron el refuerzo el día O y el desafío el día 21. A menos que se Indique de otra manera, todas las condiciones eran las mismas que las del Ejemplo 7. A continuación, se describe un resumen experimental: Resultado: Todos los animales (n = 4) en ambos grupos (A y B) sobrevivieron al desafío con el virus Hendra después se haber sido inoculados por vía intratraqueal con 105 TCID50 del virus Hendra. Los sujetos control murieron el día 8. No se observó enfermedad clínica en ninguno de los sujetos vacunados y permanecieron saludables y en buen estado hasta el punto final del estudio.
Otras formas de realización y usos de la invención serán evidentes para los especialistas en el arte a partir de considerar la Descnpción y la práctica de la invención divulgadas en la presente. Todas las referencias citadas en la presente, incluyendo todas las publicaciones, patentes y solicitudes de patente de los EE.UU. y de otros países, se incorporan específicamente y por completo en la presente a modo de referencia. Se considera que la Descripción y los ejemplos solamente se ofrecen a modo de ejemplo, donde el verdadero alcance y espíritu de la invención están indicados por las siguientes reivindicaciones.

Claims (30)

REIVINDICACIONES
1. Una composición inmunogénica, que comprende una glucoproteína G de los virus Hendra y/o Nipah, un complejo inmunoestimulante (ISC) y uno o más excipientes en una cantidad eficaz para la producción de anticuerpos neutralizantes contra los virus Hendra y/o Nipah después de su administración a un sujeto.
2. La composición inmunogénica de la reivindicación 1 , en donde el ISC comprende una saponina.
3. La composición inmunogénica de la reivindicación 1 , en donde el ISC además comprende un fosfolípido y un esteroide.
4. La composición inmunogénica de la reivindicación 1 , en donde la glucoproteína G soluble del virus Hendra consiste en los aminoácidos 73 a 604 de la glucoproteína G de Hendra nativa (SEQ ID N°: 2).
5. La composición inmunogénica de la reivindicación 4, en donde la glucoproteína G soluble del virus Hendra es codificada por una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 64 a 1662 de la SEQ ID N°: 16.
6. La composición inmunogénica de la reivindicación 1 , en donde la glucoproteína G soluble del virus Hendra está presente en una forma dimérica.
7. La composición inmunogénica de la reivindicación 6, en donde cada subunidad del dímero de gíucoproteína G soluble del virus Hendra está unida mediante uno o más enlaces disulfuro.
8. La composición inmunogénica de la reivindicación 1 , en donde la gíucoproteína G soluble del virus Hendra está presente en una forma tetramérica.
9. La composición inmunogénica de la reivindicación 1 , en donde la concentración de gíucoproteína G soluble del virus Hendra es de entre aproximadamente 5 y aproximadamente 100 pg/ml.
10. La composición inmunogénica de la reivindicación 1 , en donde la saponina se aisla de Quillaja saponaria Molina.
1 1. La composición inmunogénica de la reivindicación 10, en donde la saponina es QH-A, QH-B, QH-C o QS21.
12. La composición inmunogénica de la reivindicación 1 , en donde el fosfolípido se selecciona del grupo que consiste en fosfatidilcolina (PC), dipalmitoil fosfatidilcolina (DPPC), ácido fosfatídico (fosfatidato) (PA), fosfatidiletanolamina (PE), fosfatidilserina (PS), fosfatidilinositol (Pl), fosfato de fosfatidilinositol (PIP), bifosfato de fosfatidilinositol (PIP2), trifosfato de fosfatidilinositol (PIP3), fosforilcolina (SPH), ceramida-fosforiletanolamina (Cer-PE) y ceramida-fosforilglicerol.
13. La composición inmunogénica de la reivindicación 3, en donde la saponina es Quil A, el fosfolípido es DPPC y el esferoide es colestefol.
14. La composición inmunogénica de la reivindicación 11 , en donde la relación de Quil A : DPPC : colesterol en la composición es de 5:1 :1 en peso.
15. La composición inmunogénica de cualquiera de las reivindicaciones 1-14, en donde el sujeto es un ser humano, un caballo, una vaca, una oveja, un cerdo, una cabra, un pollo, un perro o un gato.
16. Un método para producir una respuesta de anticuerpo neutralizante contra un virus Hendra y/o Nipah en un sujeto, que comprende administrar al sujeto la composición inmunogénica de cualquiera de las reivindicaciones 1-15 en una cantidad y con una duración eficaces para producir la respuesta de anticuerpo neutralizante.
17. El método de la reivindicación 16, en donde la respuesta de anticuerpo neutralizante reduce la reproducción de los virus Hendra y/o Nipah en el sujeto.
18. El método de la reivindicación 16, en donde la respuesta de anticuerpo neutralizante reduces la propagación de los virus Hendra y/o Nipah en el sujeto.
19. El método de la reivindicación 16, en donde el sujeto ha estado expuesto a un virus Hendra y/o Nipah.
20. El método de la reivindicación 19, en donde el sujeto sufre de una infección por un virus Hendra y/o Nipah.
21. El método de la reivindicación 16, en donde la composición inmunogénica se administra por vía intramuscular.
22. El método de la reivindicación 16, en donde la composición inmunogénica se administra en múltiples dosis.
23. El método de la reivindicación 22, en donde la primera dosis es seguida por una segunda dosis por lo menos entre aproximadamente veintiún días y aproximadamente veintiocho días después de la primera dosis.
24. El método de la reivindicación 22, en donde cada dosis contiene aproximadamente 50 o aproximadamente 100 pg de glucoproteína G soluble del virus Hendra.
25. Un método para diferenciar un sujeto vacunado cón la composición inmunogénica de cualquiera de las reivindicaciones 1-16 de un sujeto expuesto a un virus Hendra y/o Nipah, que comprende detectar la presencia de un anticuerpo en una muestra biológica aislada del sujeto contra por lo menos una de cualquiera de las siguientes proteínas virales HeV y/o NiV seleccionadas del grupo que consiste en una proteína de fusión (F), una proteína de la matriz (M), una fosfoproteína (P), una proteína grande (L) y una proteína de la nucleocápside (N).
26. El método de cualquiera de las reivindicaciones 16-25, en donde el sujeto es un ser humano, un caballo, una vaca, una oveja, un cerdo, una cabra, un pollo, un perro o un gato.
27. El método de cualquiera de las reivindicaciones 16-25, en donde el virus es un virus Hendra.
28. El método de cualquiera de las reivindicaciones 16-25, en donde el virus es un virus Nipah.
29. Un método para producir una respuesta de anticuerpo neutralizante contra un virus Hendra y/o Nipah en un sujeto humano, que comprende administrar al sujeto una composición inmunogénica que comprende una glucoproteína G del virus Hendra soluble en una cantidad y con una duración eficaces para producir la respuesta de anticuerpo neutralizante.
30. El método de la reivindicación 29, en donde la composición inmunogénica además comprende un adyuvante.
MX2013013277A 2011-05-13 2012-05-14 Composiciones inmunogenicas de la glucoproteina g de los virus hendra y nipah. MX352604B (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201161485992P 2011-05-13 2011-05-13
PCT/US2012/037839 WO2012158643A1 (en) 2011-05-13 2012-05-14 Hendra and nipah virus g glycoprotein immunogenic compositions

Publications (2)

Publication Number Publication Date
MX2013013277A true MX2013013277A (es) 2014-09-22
MX352604B MX352604B (es) 2017-11-30

Family

ID=47177303

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
MX2013013277A MX352604B (es) 2011-05-13 2012-05-14 Composiciones inmunogenicas de la glucoproteina g de los virus hendra y nipah.
MX2017011701A MX392320B (es) 2011-05-13 2012-05-14 Composiciones inmunogenicas de la glucoproteina g de los virus hendra y nipah.

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
MX2017011701A MX392320B (es) 2011-05-13 2012-05-14 Composiciones inmunogenicas de la glucoproteina g de los virus hendra y nipah.

Country Status (17)

Country Link
US (1) US20150050305A1 (es)
EP (2) EP2707025B8 (es)
JP (4) JP2014516955A (es)
KR (2) KR20140053906A (es)
CN (2) CN104244974A (es)
AU (2) AU2012256000B2 (es)
CA (1) CA2836098C (es)
CL (1) CL2013003248A1 (es)
CO (1) CO6940373A2 (es)
ES (2) ES2639122T3 (es)
MX (2) MX352604B (es)
PH (1) PH12013502322A1 (es)
PT (1) PT2707025T (es)
RU (1) RU2681529C2 (es)
UA (1) UA114086C2 (es)
WO (1) WO2012158643A1 (es)
ZA (1) ZA201308701B (es)

Families Citing this family (35)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MX2012003126A (es) 2009-09-21 2012-06-19 Gilead Sciences Inc Procesos e intermedios para la preparacion de analogos de 1'-carbonucleosidos sustituidos.
ES2524356T3 (es) 2010-07-22 2014-12-05 Gilead Sciences, Inc. Métodos y compuestos para tratar infecciones provocadas por virus Paramyxoviridae
CA2837582C (en) * 2011-05-27 2021-03-02 Merial Limited Genetic vaccines against hendra virus and nipah virus
HK1224177A1 (zh) * 2013-09-05 2017-08-18 硕腾服务有限责任公司 Hendra和nipah病毒g糖蛋白免疫原性組合物
UA130246C2 (uk) * 2013-09-19 2025-12-31 Зоетіс Сервісіз Ллс Ад'ювант на основі олії
MX2016007870A (es) * 2013-12-16 2016-10-07 Zoetis Services Llc Composiciones inmunogenas de glucoproteina g de los virus hendra y nipah.
TWI687432B (zh) * 2014-10-29 2020-03-11 美商基利科學股份有限公司 絲狀病毒科病毒感染之治療
DK3785717T3 (da) 2015-09-16 2022-03-21 Gilead Sciences Inc Fremgangsmåder til behandling af coronaviridae-infektioner
AU2016341309A1 (en) 2015-10-22 2018-06-07 Modernatx, Inc. Cancer vaccines
EP3235908A1 (en) * 2016-04-21 2017-10-25 Ecole Normale Superieure De Lyon Methods for selectively modulating the activity of distinct subtypes of cells
AR109621A1 (es) * 2016-10-24 2018-12-26 Janssen Pharmaceuticals Inc Formulaciones de vacunas contra glucoconjugados de expec
US10682368B2 (en) 2017-03-14 2020-06-16 Gilead Sciences, Inc. Methods of treating feline coronavirus infections
CN108624602B (zh) * 2017-03-24 2020-10-16 华中农业大学 一株具有阻断活性的抗尼帕病毒g蛋白的单克隆抗体及其应用
CA3059777C (en) 2017-05-01 2023-02-21 Gilead Sciences, Inc. Crystalline forms of (s)-2-ethylbutyl 2-(((s)-(((2r,3s,4r,5r)-5-(4-aminopyrrolo[2,1-f] [1,2,4]triazin-7-yl)-5-cyano-3,4-dihydroxytetrahydrofuran-2-yl)methoxy)(phenoxy) phosphoryl)amino)propanoate
WO2019014247A1 (en) 2017-07-11 2019-01-17 Gilead Sciences, Inc. COMPOSITIONS COMPRISING POLYMERASE RNA INHIBITOR AND CYCLODEXTRIN FOR THE TREATMENT OF VIRAL INFECTIONS
KR20230039766A (ko) * 2017-12-20 2023-03-21 조에티스 서비시즈 엘엘씨 Hendra 및 Nipah 바이러스 감염을 대비한 백신
CN113631718A (zh) 2018-11-14 2021-11-09 旗舰先锋创新V股份有限公司 用于特定隔室货物递送的组合物和方法
CN110951922A (zh) * 2019-12-25 2020-04-03 中国动物卫生与流行病学中心 一种检测亨德拉病毒的raa引物探针及检测方法
JP2023512656A (ja) 2020-01-27 2023-03-28 ギリアード サイエンシーズ， インコーポレイテッド ＳＡＲＳ ＣｏＶ－２感染を治療するための方法
KR20220153619A (ko) 2020-03-12 2022-11-18 길리애드 사이언시즈, 인코포레이티드 1'-시아노 뉴클레오사이드의 제조 방법
CA3172483A1 (en) 2020-04-06 2021-10-14 Scott Ellis Inhalation formulations of 1'-cyano substituted carbanucleoside analogs
TW202203941A (zh) 2020-05-29 2022-02-01 美商基利科學股份有限公司 瑞德西韋之治療方法
PE20230618A1 (es) 2020-06-24 2023-04-14 Gilead Sciences Inc Analogos de nucleosido de 1'-ciano y usos de los mismos
IL300453A (en) 2020-08-27 2023-04-01 Gilead Sciences Inc COMPOSITIONS AND METHODS FOR THE TREATMENT OF VIRAL INFECTIONS
US20220193225A1 (en) * 2020-08-31 2022-06-23 Bruce Lyday Compositions and methods for sars-2 vaccine with virus replicative particles and recombinant glycoproteins
AU2022264328A1 (en) * 2021-04-27 2023-11-16 The Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine, Inc. Recombinant cedar virus chimeras
WO2022270656A1 (ko) * 2021-06-24 2022-12-29 진철 금 나노입자를 유효성분으로 포함하는 니파 바이러스의 예방 또는 치료용 조성물
KR20240154647A (ko) 2022-03-02 2024-10-25 길리애드 사이언시즈, 인코포레이티드 바이러스성 감염 치료를 위한 화합물 및 방법
US12357577B1 (en) 2024-02-02 2025-07-15 Gilead Sciences, Inc. Pharmaceutical formulations and uses thereof
CN116515865B (zh) * 2023-06-19 2025-11-14 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 一种以人复制缺陷腺病毒为载体的尼帕病毒病疫苗
CN116751266B (zh) * 2023-06-29 2024-08-20 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 一种亨尼帕病毒保护性抗原及其应用
KR102897866B1 (ko) * 2023-12-12 2025-12-11 대한민국(질병관리청 국립보건연구원장) 니파바이러스 재조합 g 단백질을 포함하는 백신 조성물
KR102900618B1 (ko) * 2024-08-01 2025-12-19 대한민국 니파바이러스 f 당단백질 유래 에피토프를 포함하는 펩타이드 및 이를 포함하는 백신 조성물
KR102900650B1 (ko) * 2024-08-01 2025-12-19 대한민국 니파바이러스 g 당단백질 유래 에피토프를 포함하는 펩타이드 및 이를 포함하는 백신 조성물
KR102864661B1 (ko) * 2024-12-20 2025-09-29 대한민국 니파바이러스 재조합 단백질을 포함하는 백신 조성물

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SE8205892D0 (sv) 1982-10-18 1982-10-18 Bror Morein Immunogent membranproteinkomplex, sett for framstellning och anvendning derav som immunstimulerande medel och sasom vaccin
SE8405493D0 (sv) 1984-11-01 1984-11-01 Bror Morein Immunogent komplex samt sett for framstellning derav och anvendning derav som immunstimulerande medel
EP0362278A4 (en) 1987-06-05 1990-05-14 Us Health Autocrine motility factors in cancer diagnosis and management.
NZ230747A (en) 1988-09-30 1992-05-26 Bror Morein Immunomodulating matrix comprising a complex of at least one lipid and at least one saponin; certain glycosylated triterpenoid saponins derived from quillaja saponaria molina
SE9600647D0 (sv) 1996-02-21 1996-02-21 Bror Morein Ny användning
AUPO517897A0 (en) * 1997-02-19 1997-04-11 Csl Limited Chelating immunostimulating complexes
GB9817052D0 (en) 1998-08-05 1998-09-30 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
AUPP807399A0 (en) 1999-01-08 1999-02-04 Csl Limited Improved immunogenic lhrh composition and methods relating thereto
US20050287170A1 (en) * 2002-12-11 2005-12-29 Hawaii Biotech, Inc. Subunit vaccine against West Nile viral infection
WO2005028673A1 (en) * 2003-09-22 2005-03-31 Institut Pasteur A method for detecting nipah virus and method for providing immunoprotection against henipaviruses
CN1882704A (zh) * 2003-09-22 2006-12-20 巴斯德研究院 尼帕病毒检测方法和提供抗汉尼巴病毒的免疫保护的方法
AU2005327194B2 (en) * 2004-07-09 2010-09-09 The Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine, Inc. Soluble forms of Hendra and Nipah virus G glycoprotein
AU2005333155B2 (en) 2005-03-14 2011-11-17 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Human monoclonal antibodies against Hendra and Nipah viruses
RS51324B (sr) * 2005-04-25 2010-12-31 Merial Ltd. Vakcine protiv nipah virusa
WO2009117035A1 (en) 2007-12-19 2009-09-24 The Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine, Inc. Soluble forms of hendra and nipah virus f glycoprotein and uses thereof

Also Published As

Publication number Publication date
EP2707025A4 (en) 2014-12-17
RU2013155470A (ru) 2015-06-20
EP2707025B1 (en) 2017-07-12
BR112013029309A2 (pt) 2017-06-20
RU2681529C2 (ru) 2019-03-07
MX392320B (es) 2025-03-24
JP2019142909A (ja) 2019-08-29
KR20200040899A (ko) 2020-04-20
CN104244974A (zh) 2014-12-24
CA2836098C (en) 2022-06-21
EP3251692A1 (en) 2017-12-06
ES2963147T3 (es) 2024-03-25
JP2017193537A (ja) 2017-10-26
PH12013502322A1 (en) 2014-01-06
BR112013029309A8 (pt) 2018-01-23
AU2012256000B2 (en) 2017-05-11
CL2013003248A1 (es) 2014-08-08
NZ617722A (en) 2016-03-31
HK1247833A1 (en) 2018-10-05
ES2639122T3 (es) 2017-10-25
EP2707025A1 (en) 2014-03-19
JP6898024B2 (ja) 2021-07-07
EP3251692B1 (en) 2023-09-27
UA114086C2 (xx) 2017-04-25
ZA201308701B (en) 2015-08-26
KR20140053906A (ko) 2014-05-08
US20150050305A1 (en) 2015-02-19
AU2017213501A1 (en) 2017-08-31
PT2707025T (pt) 2017-08-31
AU2012256000A1 (en) 2013-12-12
RU2019104307A (ru) 2019-04-15
CN110680913A (zh) 2020-01-14
EP2707025B8 (en) 2017-08-23
WO2012158643A1 (en) 2012-11-22
CO6940373A2 (es) 2014-05-09
CA2836098A1 (en) 2012-11-22
JP2018030862A (ja) 2018-03-01
MX352604B (es) 2017-11-30
JP2014516955A (ja) 2014-07-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP2707025B1 (en) Hendra and nipah virus g glycoprotein immunogenic compositions
US20160331829A1 (en) Hendra and nipah virus g glycoprotein immunogenic compositions
KR20130095251A (ko) 인플루엔자 백신
US20190083604A1 (en) Hendra and nipah virus g glycoprotein immunogenic compositions
RU2787820C2 (ru) Иммуногенные композиции гликопротеина g вирусов hendra и nipah
HK1196764B (en) Hendra and nipah virus g glycoprotein immunogenic compositions
HK1196764A (en) Hendra and nipah virus g glycoprotein immunogenic compositions
HK1247833B (en) Hendra and nipah virus g glycoprotein immunogenic compositions
NZ617722B2 (en) Hendra and nipah virus g glycoprotein immunogenic compositions
JP7370983B2 (ja) ヘンドラウイルス感染症及びニパウイルス感染症に対するワクチン
BR112013029309B1 (pt) Composições imunogênicas de glicoproteína g do vírus hendra e nipah

Legal Events

Date Code Title Description
FG Grant or registration