MX2014004331A - Regulacion de expresion de receptor a traves la liberacion de los factores de trascripcion artificiales. - Google Patents

Abstract

La invención se relaciona con un factor de transcripción artificial que comprende una proteína de dedo de zinc polidactílica dirigida específicamente a un promotor de gen receptor fusionado a un dominio de proteína inhibidor o activador, una secuencia de localización nuclear, y un dominio de transducción de proteína. En los ejemplos particulares de esos promotores del gen receptor regulan la expresión del receptor A endotelial, receptor de B endotelial, el receptor 4 similar a Toil o el receptor de IgE de alta afinidad. Los factores de transcripción artificiales dirigidos a los receptores A o B de la endotelina son útiles en el tratamiento de enfermedades moduladas por la endotelina, como enfermedades cardiovasculares, y, en particular, enfermedades de los ojos, por ejemplo, oclusión de la vena retinal, oclusión de la arteria retinal, edema macular, neuropatía óptica, coriorretinopatía serosa central, retinitis pigmentosa, neuropatía óptica hereditaria de Leber, y similares. Los factores de transcripción artificiales dirigidos contra el receptor 4 similar a Toll o receptor de IgE son útiles para el tratamiento de trastornos autoinmunes, y similares, y trastornos alérgicos, respectivamente.

Description

REGULACION DE EXPRESION DE RECEPTOR A TRAVES LA LIBERACION DE LOS FACTORES DE TRANSCRIPCION ARTIFICIALES CAMPO DE LA INVENCION La invención se relaciona con factores de transcripción artificiales que comprenden una proteina de dedo de zinc polidactilica que hace blanco específicamente en un promotor del qen receptor fusionado a un dominio inhibidor o activador, una secuencia de localización nuclear, y un dominio de transducción de proteína, y su uso en el tratamiento de enfermedades moduladas por la unión de factores específicos a esos receptores.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION Los factores de transcripción artificiales (ATFs) son propuestos como herramientas útiles para modular la expresión de genes (Sera T., 2009 Adv Drug Deliv Rev 61, 513-526) . Muchos factores de transcripción naturales, que influyen sobre la expresión ya sea a través de la represión o activación de transcripción de genes, poseen dominios específicos complejos para el reconocimiento de una cierta secuencia de ADN. Esto los hace blanco no atractivos para la manipulación hace si uno pretende modificar su especificidad y el genes blanco. Sin embargo, una cierta clase de factores de transcripción contiene varios llamados dominios de dedo de zinc (ZF) , los cuales son modulares y por lo tanto son asi susceptibles a la modificación genética. Los dedos de zinc son motivos de unión de ADN cortos (30 aminoácidos) que hacen blanco fácil independientemente en tres pares de bases de ADN. Una proteina que contiene varios de esos dedos de zinc es de este modo capaz de reconocer secuencias de ADN más grandes. Una proteina de dedos de zinc hexamérica (ZFP) reconoce un blanco de ADN de 18 pares de bases (pb) el cual es casi único en todo el genoma humano. Inicialmente aunque en un contexto completamente independiente, análisis más a fondo revelaron alguna especificidad de contexto para los dedos de zinc (Klug A., 2010, Annu Rev Biochem 79, 213-231). La mutación de ciertos aminoácidos en la superficie de reconocimiento de dedos de zinc que altera la especificidad de unión de los módulos de ZF dio como resultado bloques de construcción de ZF definidos para la mayoría de 5'-GNN-3', 5'-CNN-3', 5'-ANN-3', y algunos codones 5'-TNN-3' (por ejemplo, los llamados módulos de Barbas, véase Dreier B., Barbas C.F. 3er et al., 2005, J. Biol. Chem. 280, 35588-35597) . Aunque el trabajo inicial sobre los factores de transcripción artificiales se concentró sobre un diseño de ración basado en la combinación de dedos de zinc preseleccionadas con una secuencia blanco de 3 pb conocida, la realización de una cierta especificidad de contexto de los dedos de zinc necesita la generación de bibliotecas de dedos de zinc grandes las cuales son interrogadas usando métodos sofisticados como un híbrido de bacteriano o levadura, presentación de fago, presentación o selección in vivo de ribosomas compartimentalizada usando análisis con FACS.

Usando esas proteínas de dedos de zinc artificiales, los sitios de ADN dentro del genoma humano pueden ser localizados con alta especificidad. De este modo, esas proteínas de dedos de zinc son herramientas ideales para transportar dominios de proteína con actividad de transcripción-moduladora a secuencias promotoras específicas dando como resultado la modulación de la expresión de un gen de interés. Los dominios adecuados para la selección de la transcripción son el dominio asociado de Krueppel (KRAB) como el dominio KRAB N-terminal (SEQ ID NO: 1) o C-terminal (SEQ ID No: 2), el dominio interactuante Sin3 (SID, SEQ ID No: 3) y el dominio represor ERF (ERD, SEQ ID NO: 4), mientras que la activación de la transcripción de un gen es lograda a través de los dominios de del virus del herpes simple VP16 (SEQ ID No: 5) o VP64 (repetición tetramérica de VP16, SEQ ID NO: 6) (Beerli R.R. et al., 1998, Proc Nati Acad Sci USA 95, 14628-14633) . Además, se considera que los dominios de proteína transcripcionalmente activos definidos por la ontología genética GO: 0001071 (http : //amigo . geneontology . org/cgi-bin/amigo/term_details? Term=GO: 0001071) para lograr la regulación transcripcional de proteínas blanco.

Un gran porcentaje de todos los blancos de fármacos conocidos son moléculas receptoras que bien son estimuladas o bloqueadas por la acción de fármacos de molécula pequeña con actividades con frecuencia fuera del blanco. Los ejemplos de esos receptores son el receptor de histamina Hl o adrenoreceptores alfa- y beta-, pero en general las proteínas definidas por ontologia genética GO:0004888 y GO:0004930.

Aunque los fármacos de molécula pequeña no siempre son capaces de hacer blanco de manera selectiva en un cierto miembro de una familia de proteínas dada debido a la alta conservación de características específicas, los productos biológicos ofrecen gran especificidad como lo muestran los fármacos novedosos basados en anticuerpos. Sin embargo, virtualmente todos los productos biológicos a la fecha actúan extracelularmente .

Los factores de transcripción artificiales mencionados anteriormente especialmente serán adecuados para influenciar la transcripción genética en una forma terapéuticamente útil. Sin embargo, la liberación de esos factores en el sitio de acción -el núcleo- no es fácilmente lograda, incluyendo de este modo la utilidad de los métodos de factor de transcripción artificial terapéuticos, por ejemplo dependiendo de la liberación retroviral con todas las deseventajas de este método, como la inmunogenicidad y el potencial para la transformación celular (Lund C.V. et al., 2005, Mol Cell Biol 25, 9082 - 9091) .

Los llamados dominios de transducción de proteínas (PTDs), mostraron promover la translocación de proteína a través de la membrana plasmática hacia el citosol/nucleoplasma. Los péptidos cortos, como el péptido TAT derivado de VIH (SEQ ID NO: 7) y otros mostraron inducir una absorción macropinocitótica independiente del tipo celular de proteínas de carga (Wadia J.S. et al, 2004, Nat. Med. 10, 310-315) . Tras el arribo al citosol, esas proteínas de fusión mostraron tener actividad biológica. De manera interesante, aún las proteínas mal plegadas pueden volverse funcionales después de la transducción de la proteína muy probablemente a través de la acción de chaperones intracelulares .

El sistema endotelial vasoactivo juega un papel importante en la patogénesis de varias enfermedades. Las endotelinas, por un lado, están implicadas en la regulación del suministro de sangre, y por otro lado, son los protagonistas principales en la cascada de eventos inducidos por hipoxia. La endotelina está por ejemplo implicada en el rompimiento de la barrera sanguínea-cerebral o sanguínea-retinal y en la neovascularización . La endotelina está implicada además en la neurodegeneración y también en la regulación del umbral de la sensación del dolor o aún en la sensación de sed. La endotelina también está implicada en la regulación de la presión intraocular.

La acción de la endotelina es mediada por sus receptores cognados, principalmente el receptor de endotelina A, usualmente localizado sobre las células del músculo liso que rodean los vasos sanguíneos. La influencia del sistema de endotelina -sistémica o localmente- es de interés para el tratamiento de muchas enfermedades como las hemorragias subaracnoideal o cerebral. La endotelina también influye sobre el curso de la esclerosis múltiple. La endotelina contribuye a la hipertensión (pulmonar) , pero también a la hipotensión arterial, cardiomiopatía y al síndrome de Raynaud, angina variante y otras enfermedades cardiovasculares. La endotelina está implicada en la nefropatía diabética y la retinopatía diabética. En el ojo juega además un papel en la neurodegeneración glaucomatosa, oclusión de la vena retinal, artritis de células gigantes, retinitis pigmentosa, degeneración de macular relacionada con la edad, coriorretinopatía serosa central, Morbus Leber, síndrome de Susac, hemorragias infraoculares, gliosis epirretinal y ciertas otras condiciones patológicas.

El ojo es un órgano exquisito que depende fuertemente de una perfusión balanceada y suficiente para satisfacer su alta demanda de oxígeno. La falla en la provisión de un suministro de oxígeno suficiente y adecuado causa isquemia-daño por reperfusión conduciendo a activación glial y daño neuronal como se observa en pacientes con glaucoma con enfermedad en progreso a pesar de la presión intraocular normal o normalizada. El suministro de sangre insuficiente también conduce a la hipoxia causando neovascularización difundida con el potencial de daño retinal adicional como es evidente durante la retinopatia diabética o degeneración macular relacionada con la edad. La perfusión del tejido del ojo está bajo un control complejo y depende de la presión sanguínea, presión intraocular, así como de factores locales que modulan el diámetro del vaso. Esos factores locales son por ejemplo las endotelinas mencionadas, péptidos cortos con una actividad vasoconstrictora fuerte. Tres isoformos de las endotelinas (ET-1, ET-2, y ET-3) son producidos por la enzima convertidora de endotelina a partir de moléculas precursoras secretadas por células endoteliales localizadas en la pared de los vasos sanguíneos. Se conocen dos receptores cognados para la ET madura, ETRA y ETRB. Mientras que el ETRA se localiza en las células del músculo liso que forman las paredes del vaso y promueven vasoconstricción, el ETRB es expresado sobre células endoteliales y actúa como vasodilatador promoviendo la liberación de óxido nítrico, causando de este modo la relajación del músculo liso. El ETRA y ETRB pertenecen a una clase grande de citorreceptores helicoidales transmembranales acoplados a proteína G. La unión de ET a ETRA o ETRB da como resultado la activación de la proteína G, activando de este modo un incremento en la concentración de calcio intracelular y causando por lo tanto un arreglo amplio de reacciones celulares .

La influencia del sistema ET farmacológicamente puede probarse útil en casos donde los niveles de ET estén elevados y las ETs actúen en una forma dañina, como durante la oclusión de la vena retinal, neurodegeneración glaucomatosa, retinitis pigmentosa, artritis de células gigantes, coriorretinopatía serosa central, esclerosis múltiple, neuritis óptica, artritis reumatoide, síndrome de Susac, retinopatía por radiación, gliosis epirretinial, fibromialgia y retinopatía diabética. Hasta este punto, la desregulación de ETRA ayudará a modular el curso de la enfermedad. Pero bajo ciertas circunstancias, la sobrerregulación de ETRA y por lo tanto un incremento de la sensibilidad hacia la ET puede ser deseable, por ejemplo, para promover la cicatrización de heridas de corneales durante la recuperación de trauma corneal o úlcera corneal.

Además, la señalización mediada por ETRB está conectada a los procesos patofisiológicos, por ejemplo, durante el mantenimiento de las células no diferenciadas cancerosas y crecimiento del tumor. Además, la sobrerregulación de ETRB está asociada con la neurodegeneración glaucomatosa mientras que la inhibición de ETRB mostró actuar como neuroprotectora durante el glaucoma. Además, el ETRB es sobrerregulado durante la inflamación. De este modo, la modulación farmacológica del ETRB a través de un factor de transcripción especifico será útil en el tratamiento del cáncer, la prevención de la neurodegeneración y la modulación de procesos inflamatorios.

Los componentes de la pared celular bacteriana como los lipopolisacáridos (LPS) juegan un papel importante en la patogénesis de varias enfermedades. La presencia de LPS en el cuerpo apunta a una infección bacteriana que necesita ser resuelta por el sistema inmune. Puesto que los LPS son un componente general de las bacterias gram negativas, los LPS constituyen una la llamada señal de peligro que puede activar al sistema inmune. Los LPS son reconocidos por el receptor 4 similar a Toll (TLR4) , un miembro de la familia más grande de receptores similares a Toll implicados en el reconocimiento de diferentes señales de peligro o patrones moleculares asociados con patógenos (PAMPs) asociados con infecciones bacterianas o virales. Aunque el reconocimiento de LPS como señal de peligro es una parte importante de la inmunidad innata, la sobreestimulación o estimulación prolongada del receptor de TLR4 está relacionada con una variedad de condiciones patológicas asociadas con la inflamación crónica. Los ejemplos son varias enfermedades hepáticas como la enfermedad hepática alcohólica, enfermedad de hígado graso no alcohólica, esteatohepatitis no alcohólica, infección por el virus de la hepatitis B o C (VHC) crónica, y coinfección con VIH-VHC. Otras enfermedades asociadas con la señalización de TLR4 son la artritis reumatoide, arterieesclerosis, psoriasis, enfermedad de Crohn, uveítis, queratitis asociada con lentes de contacto e inflamación corneal. Además, la señalización mediada por TLR4 está implicada en el progreso y resistencia del cáncer a la quimioterapia.

La influencia farmacológica en el reconocimiento de LPS y TLR4 puede probar ser útil para enfermedades asociadas con inflamación crónica debido a la activación inapropiada de TLR4. De este modo, la desregulación de la proteína TLR4 a través de la acción de un factor de transcripción artificial regulador negativo específico dirigido al promotor de TLR4 ayudará a modular el resultado de la enfermedad a través de la ruptura del ciclo vicioso de la inflamación crónica causada por LPS.

Las inmunoglobulinas del isotipo E (IgE) son parte del sistema inmune adaptable y por ejemplo están implicadas en la protección contra infecciones, pero también en la transformación neoplásica. La IgE es ligada por el receptor de IgE de alta afinidad (FCER1) localizado sobre los mastocitos y basófilos. La unión de IgE a FCER1 seguida por la reticulación de esos complejos vía antígenos específicos llamados alérgenos conduce a la liberación de varios factores de los mastocitos y basófilos que causan la respuesta alérgica. Entre esos factores se encuentran la histamina, leucotrienos , varias citoquinas, asi como lisozima, triptasa o ß-hexosaminidasa . La liberación de esos factores está asociada con enfermedades alérgicas como la rinitis alérgica, asma, eccema y la anafilaxis.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION La invención se relaciona con un factor de transcripción artificial que comprende una proteina de dedo de zinc polidactilica que hace blanco específicamente en un promotor del receptor fusionado a un dominio de proteína inhibidor o activador, una secuencia de localización nuclear, y un dominio de transducción de proteína, y con una composición farmacéutica que comprenden ese factor de transcripción artificial. Además, la invención se relaciona con el uso de esos factores de transcripción artificial para modular la reacción de células a estímulos externos y a otras moléculas de señalización solubles, y en el tratamiento de enfermedades moduladas por la unión de efectores específicos a esos receptores.

En una modalidad particular, el promotor del gen receptor es el promotor del receptor de endotelina A. En otra modalidad particular, la invención se relaciona con un factor de transcripción artificial para usarse para influenciar la respuesta celular a la endotelina, para hacer disminuir o incrementar los niveles del receptor de endotelina, y para usarse en el tratamiento de enfermedades moduladas por la endotelina, en particular para usarse en el tratamiento de enfermedades oculares.

De igual modo la invención se relaciona con un método para tratar una enfermedad modulada por endotelina que comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un factor de transcripción artificial de la invención a un paciente que necesite de la misma.

En otra modalidad particular la invención se relaciona con un intermediario del factor de trascripción artificial que comprende una proteina de dedo de zinc polidactilica que está dirigida específicamente al promotor del receptor de endotelina A fusionado a un dominio de proteína inhibidor o activador y una secuencia de localización nuclear.

En otra modalidad particular, el promotor del gen receptor es el promotor del receptor de endotelina B. En otra modalidad particular la invención se relaciona con un factor de transcripción artificial para usarse para influencia la respuesta celular a la endotelina, para hacer disminuir o incrementar los niveles de receptor de endotelina B, y para usarse en el tratamiento de enfermedades moduladas por la endotelina, en particular para usarse en el tratamiento en enfermedades de los ojos. De igual modo la invención se relaciona con un método para tratar una enfermedad modulada por endotelina que comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un factor de transcripción adicional de la invención a un paciente que necesite del mismo .

En otra modalidad particular la invención se relaciona con un intermediario de factor de transcripción artificial que comprende una proteina de dedo de zinc polidactilica dirigido específicamente al promotor del receptor de endotelina B fusionado a un dominio de proteína inhibidor o activador y una secuencia de localización nuclear .

En otra modalidad particular, el promotor del gen receptor es el promotor del receptor 4 similar a Toll. En otra modalidad particular la invención se relaciona con un factor de transcripción artificial para usarse para influenciar la respuesta celular a lipopolisacárido, para hacer disminuir o incrementar los niveles del receptor 4 similar a Toll, y para usarse en el tratamiento de enfermedades moduladas por liposacárido, en particular para usarse en el tratamiento de enfermedades de los ojos. De forma similar la invención se relaciona con un método para tratar una enfermedad modulada por lipopolisacárido que comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un factor de transcripción artificial de la invención a un paciente que necesite del mismo.

En otra modalidad particular la invención se relaciona con un intermediario del factor de transcripción artificial que comprende una proteina de dedo de zinc polidactilica dirigido específicamente al promotor del receptor 4 similar a Toll fusionado a un dominio de proteína inhibidor o activador y una secuencia de localización nuclear .

En otra modalidad particular, el promotor del gen receptor es el promotor de la subunidad alfa del receptor de inmunoglobulina épsilon de alta afinidad. En otra modalidad particular la invención se relaciona con un factor de transcripción artificial para influenciar la respuesta celular a la inmunoglobulina E (IgE), para hacer disminuir o incrementar los niveles de receptor de Ige de alta afinidad, y para usarse en el tratamiento de enfermedades moduladas por IgE, en particular para usarse en el tratamiento de enfermedades de los ojos. De igual modo la invención se relaciona con un método para tratar una enfermedad modulada por IgE que comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un factor de transcripción artificial de la invención a un paciente que necesite del mismo .

En otra modalidad particular la invención se relaciona con un intermediario del factor de transcripción artificial que comprende una proteina de dedo de zinc polidactilica dirigido específicamente al promotor de la subunidad alfa del receptor de inmunoglobulina épsilon de alta afinidad fusionado a un dominio de proteína inhibidor o activador y una secuencia de localización nuclear.

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS Figura 1: alteración de la sensibilidad celular por regulación expresión del receptor Un factor de transcripción artificial que contiene una proteína de dedo de zinc hexamérica (ZF) dirigido específicamente a un promotor (P) del gen receptor (RG) fusionado a un dominio inhibidor/activador (RD = dominio regulador) así como una secuencia de localización nuclear (NLS) es transportado hacia las células por la acción de un dominio de transducción de proteína (PTD) como TAT u otros. Dependiendo del dominio regulador de la transcripción, la expresión del gen receptor se incrementa (+) o se suprime (-) dando como resultado un aumento o disminución de la sensibilidad celular hacia el agonista (A) del receptor (Rl, R2 o R3), respectivamente.

Figura 2: Región del promotor de receptor de endotelina A humano (ETRA) Se muestra la región no traducida 5' del gen de ETRA que contiene el promotor de ETRA putativo. Se resaltan el inicio de la transcripción (marcado con +1) y los sitios blanco (TS) de 15 pb y 18 pb potenciales para los factores de transcripción artificiales (subrayados y marcados con TS-855, TS-555, TS-487, TS-447, TS-306, TS-230, TS-103, TS-37, TS+74) .

Figura 3: Región del promotor del receptor 4 similar a Toll (TLR4) humano Se muestra la región no traducida 5' del gen de TLR4 que contiene el promotor de TLR4. Se resaltan el inicio de la transcripción (marcado con +1) , el codón de inicio y el marco de lectura abierta del primer exón (letras en negritas) y los sitios blanco de 18 pb potenciales para los factores de transcripción artificiales específicos (subrayados y marcados con TS-276, TS-55, TS+113) .

Figura 4 : Región o promotora del receptor A de IgE de alta afinidad (FCER1A) humano Se muestra la región 5' del gen FCER1A que contiene el promotor constitutivo, proximal. Se resaltan el inicio de la transmisión (marcado con +1), el codón de inicio y el marco de lectura abierta del primer exón (letras en negritas) y los sitios blanco de 18 pb potenciales para los factores de transcripción artificiales específicos (subrayados y marcados con TS-147 y TS+17) .

Figura 5: Región del promotor del receptor de endotelina B (ETRB) humano.

Se muestra la región 5' del gen ETRB que contiene el promotor de ETRB. Se resaltan el inicio de la transmisión (marcado con +1) , y los sitios blanco de 18 pb potenciales para los factores de transcripción artificiales específicos (subrayados y marcados con TS-1149 y TS-487). Puesto que se reportan varios sitios de inicio de la transcripción alternativo (Arai H. et al., 1993, J Biol Chem 268, 3463-70; Tsutsumi M. et al., 1999, Gene 4, 43-9) el sitio de inicio de la traducción fue elegido como punto de referencia para nombrar los sitios blanco.

Figura 6: Factores de transcripción artificial A) Varias proteínas de dedo de zinc fueron clonadas en tres plásmidos diferentes. Los sitios únicos de las enzimas de restricción se muestran resaltando el diseño modular de los diferentes plásmidos de expresión. Los constructos de ADN resultantes codificaron para las siguientes proteínas de fusión: KRAB-NLS-6ZFP-3xmyc (SEQ ID NO: 8), SID-NLS-6ZFP-3xmyc, NLS-6ZFP-GGSGGS (SEQ ID NO: 9) enlazante-KRAB A-3xmyc, y NLS-6ZFP-GGSGGS enlazante-VP64-3xmyc .

Figura 7: Regulación de la actividad del receptor de endotelina A (ETRA) humano por factores de transcripción artificiales A074A, A074E, A074R y A074V (A) Represión dependiente de factor de transcripción artificial de la expresión de la proteina activada por el promotor de ETRA. Se muestra el resultado de un ensayo de receptor de luciferasa (RLuA = actividad relativa de luciferasa, en % con relación al control C) después de la expresión de A074A (SEQ ID NO: 10), A074E (SEQ ID NO: 11), A074R (SEQ ID NO: 12), y A074V (SEQ ID NO: 13) dirigida contra los sitios blancos dentro del promotor de ETRA. C = proteina fluorescente amarilla (YFP) como control.

(B) A074Vp (SEQ ID NO: 14), la proteina A074V transducible, no inhibe la proliferación de células HeLa en comparación con el control B (células tratadas con amortiguador). RP = proliferación relativa en % del control.

(C) A074Vp no inhibe la proliferación de células de músculo liso uterino humano (hUtS C) en comparación con el control B (células tratadas con amortiguador) .

(D) A074Vp bloquea la contracción dependiente de ET-1 dependiente de hUtSMC. Las hUtSMC fueron incrustadas en retículas de colágeno tridimensionales. C = células tratadas con amortiguador como control. B = células tratadas con amortiguador y ET-1. A074Vp = células tratadas con A074Vp y ET-1. RLA = área de retícula relativa en % del control C. Los detalles se describen más adelante.

Figura 8: Mejora de la actividad del promotor de ETRA controlada por factores de transcripción artificiales AQ74Ra y AQ74Va (A) La expresión activada por el promotor del ETRA de reportero de luciferasa se incrementa después de la expresión de los factores de transcripción artificial activantes A074Ra (SEQ ID NO: 15) y A074Va (SEQ ID NO: 16). RLuA = actividad relativa de luciferasa, en % con relación al control C, YFP.

(B) el tratamiento con A074Vap (SEQ ID NO: 17) no inhibe la proliferación de células hUtSMCs. A074Vp proporcionado como proteina no es tóxico a las células hUtSMCs y no tiene un impacto negativo sobre la proliferación celular. B = células tratadas con amortiguador. RP = proliferación relativa en % del control.

Figura 9: Represión de la actividad del promotor del receptor de endotelina B (ETRB) humana por A01149N y AQ1149P La expresión del factor de transcripción artificial A01149N (SEQ ID NO: 18) y A01149P (SEQ ID NO: 19) reprime la actividad del promotor de ETRB en comparación con el YFP (control C) en un ensayo de reportero de luciferasa. RLuA = actividad relativa de luciferasa, en % con relación al control C.

Figura 10: Modulación de la actividad del receptor 4 similar a Toll (TLR4) humano por A055B y A055E (A) La expresión de A055B (SEQ ID NO: 20) y A055E (SEQ ID NO: 21) bloquea la actividad del promotor de TLR4 en comparación con YFP (control C) en un ensayo de reportero de luciferasa. RLuA = actividad relativa de luciferasa, en % con relación al control C.

(B) La secreción dependiente de TLR4, inducida por LPS de interleucina (IL)-6 es interrumpida después de la expresión A055B en células U937 similares a macrofagos.

(C) El tratamiento con A055Bp (SEQ ID NO: 22) no inhibe la proliferación de células HeLa. RP = proliferación relativa en % de control. B = células tratadas con amortiguador. RP = proliferación relativa en % del control.

Figura 11: El receptor de IgE de alta afinidad es regulado por A0147A (A) La expresión activada por el promotor de las subunidad alfa (FCER1A) del receptor de IgE de alta afinidad de un reportero de luciferasa es inhibida en células RBL-2H3 basófilas de rata después de la expresión A0147A (SEQ ID NO: 23) . RLuA = actividad relativa de la luciferasa, en % con relación al control C, YFP.

(B) El A0147Ap (SEQ ID NO: 24) no inhibe la proliferación de células HeLa. B = células tratadas con amortiguador. RP = proliferación relativa en % del control.

C) El tratamiento con A0147Ap inhibe la unión de IgE humana a células KU812F basófilas humanas en aproximadamente 80%. IgEB = capacidad de unión de IgE a FCER1 determinada por citometria de flujo usando IgE humana e IgE anti-humana de ratón marcada con FITC, en % en comparación con las células tratadas con amortiguador como control (B) .

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION La invención de relaciona con un factor de transcripción artificial que comprende una proteina de dedo de zinc polidactilica dirigida específicamente a un promotor de gen receptor proporcionado a un dominio de proteína inhibidor o activador, una secuencia de localización nuclear, y un dominio de transducción de proteína, y composiciones farmacéuticas que comprenden ese factor de transcripción artificial .

El tratamiento de muchas enfermedades se basa en la modulación de la señalización del receptor celular. Los ejemplos son la presión sanguínea alta donde los bloqueadores beta inhiben la función de los receptores adrenérgicos beta, depresión donde los bloqueadores de la absorción de serotonina incrementan la concentración de agonista y de este modo la señalización del receptor de serotonina o glaucoma donde los análogos de prostaglandina activa no receptores de prostaglandina haciendo disminuir a su vez la presión intraocular, tradicionalmente, las moléculas pequeñas, ya sea en forma de agonistas o antagonistas de receptor son usadas para impactar la señalización del receptor para propósitos terapéuticos. Sin embargo, la señalización del receptor celular también puede ser influenciada por la modulación directa de la expresión de la proteina receptora.

Los procesos patológicos susceptibles a la modulación directa de los niveles de expresión del receptor son, por ejemplo, los siguientes: pacientes con insuficiencia cardiaca congestiva debido a enfermedad cardiaca congénita se beneficiarán de la sobrerregulación de los adrenoceptores beta, puesto que la desregulación de este receptor en el miocardio está asociada con el riesgo de insuficiencia cardiaca postoperativa . En la enfermedad de Parkinson, el tratamiento con medicamento dopaminérgico suprime la disponibilidad de receptores de dopamina, de este modo, la sobrerregulación del receptor de dopamina mejorará la eficiencia del medicamento dopaminérgico. En la epilepsia, la expresión insuficiente de receptores de canabinoide en el hipocampo está implicada en la etiología de la enfermedad, de este modo, la sobrerregulación del recetor de canabinoide será una terapia disponible para pacientes epilépticos.

Para enfermedades genéticas causadas por haploinsuficiencia de una proteína receptora, como el receptor del factor del crecimiento I similar a la insulina que causa retardo del crecimiento, pero también otras, la activación adicional del gen receptor funcional restante será benéfica para el paciente. Además y entre otras, la inducción y perpetuación de la autoinmunidad patológica está relacionada con la señalización inapropiada de receptores similares a Toll. De este modo, la desregulación de receptores similares a Toll rompe el circulo vicioso de varias enfermedades autoinmunes. En enfermedades alérgicas, la prevención de la señalización mediada por IgE a través del receptor de IgE de alta afinidad es útil para manejar reacciones alérgicas. En el cáncer, la desregulación de los receptores del factor del crecimiento o sobrerregulación de los receptores de la matriz extracelular son benéficos para la prevención del progreso del tumor.

Entre las moléculas receptoras se encuentran proteínas de la llamada familia de proteínas del receptor acoplado a proteína G (GPCR) o proteínas de siete dominios transmembranales, caracterizadas por siete dominios transmembranales que se anclan al receptor en la membrana plasmática y una cascada de señalización dependiente de la proteína G. Los ejemplos de esas proteínas son los receptores A y B para la endotelina. Otras proteínas receptoras se anclan vía una sola región transmembranal , por ejemplo el receptor para lipopolisacárido . El receptor 4 similar a Toll, o varios receptores de citoquinas como receptor de IL-4. Otros receptores consisten de complejos de proteína multiméricos, por ejemplo, el receptor de alta afinidad para anticuerpos IgE que consiste de cadenas alfa, beta y gamma, o el receptor de célula T que consiste de cadenas alfa, beta, gamma, delta, épsilon y zeta. De este modo, resumindas bajo el término "molécula receptora" se encuentran proteínas de diferentes familias de proteínas con modos de acción muy diferentes .

Los receptores considerados en la presente invención son moléculas receptoras humanas codificadas por HTR1A, HTR1B, HTR1D, HTR1E, HTR1F, HTR2A, HTR2B, HTR2C, HTR4 , HTR5A, HTR5BP, HTR6, HTR1, CHRM1 , CHRM2, CHRM3, CHRM4 , CHRM5, ADORA1, ADORA2A, ADORA2B, ADORA3, ADRA1A, ADRA1B, ADRA1D, ADRA2A, ADRA2Br ADRA2C, ADRB1, ADRB2, ADRB3, AGTR1 , AGTR2, APLNR, GPBAR1, NMBR, GRPR, BRS3, BDKRBl, BDKRB2, CNR1 , CNR2, CCR1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCRl, CCR8, CCR9, CCR10, CXCR1, CXCR2, CXCR3, CXCR4 r CXCR5, CXCR6, CXCRlr CX3CR1 , XCR1, CCKAR, CCKBR, C3AR1 , C5AR1 , GPR11', DRD1 , DRD2, DRD3, DRD4, DRD5, EDNRA, EDNRB, GPER, FPR1 , FPR2, FPR3, FFAR1 , FFAR2, FFAR3, GPR42, GALR1 , GALR2, GALR3, GHSR, FSHR, LHCGR, TSHR, GNRHR, GNRHR2, HRH1 , HRH2, HRH3, HRH4 , HCAR1 , HCAR2, HCAR3, KISS1R, LTB4R, LTB4R2, CYSLTR1 , CYSLTR2, OXER1 , FPR2, LPAR1 , LPAR2, LPAR3, LPAR4, LPAR5, S1PR1, S1PR2, S1PR3, S1PR4, S1PR5, MCHR1 , MCHR2, MC1R, MC2R, MC3R, MC4R, MC5R, MTNR1A, MTNR1B, MLNR, NMUR1 , NMUR2, NPFFR1 , NPFFR2, NPSR1 , NPBWR1, NPBWR2, NPY1R, NPY2R, PPYR1 , NPY5R, NPY6R, NTSR1, NTSR2, OPRD1, OPRK1 , OPRM1 , OPRL1, HCRTR1 , HCRTR2, P2RY1 , P2RY2, P2RY4, P2RY6, P2RY11, P2RY12, P2RY13, P2RY14, QRFPR, PTAFR, PR0KR1 , PR0KR2, PRLHR, PTGDR, PTGDR2, PTGER1 , PTGER2, PTGER3, PTGER4, PTGFR, PTGIR, TBXA2R, F2R, F2RL1 , F2RL2, F2RL3, RXFP1 , RXFP2, RXFP3, RXFP4 , SSTR1, SSTR2, SSTR3, SSTR4, SSTR5, TACR1 , TACR2, TACR3, TRHR, TAAR1 , UTS2R, AVPR1A, AVPR1B, AVPR2, OXTR, CCRL2, CMKLR1 , GPR1 , GPR3, GPR4 , GPR6, GPR12, GPR15, GPR17, GPR18, GPR19, GPR20, GPR21, GPR22, GPR25, GPR26, GPR21, GPR31, GPR32, GPR33, GPR34, GPR35, GPR31, GPR37L1, GPR39, GPR42, GPR45, GPR50, GPR52, GPR55, GPR61, GPR62, GPR63, GPR65, GPR68, GPR15, GPR78, GPR79, GPR82, GPR83, GPR84, GPR85, GPR87, GPR88, GPR101, GPR119, 03FAR1, GPR132, GPR135, GPR139, GPR141, GPR142, GPR146, GPR148, GPR149, GPR150, GPR151, GPR152, GPR153, GPR160, GPR161, GPR162, GPR171, GPR173f GPR174, GPR176, GPR182, GPR183, LGR4, LGR5, LGR6, LPAR6, MAS1, MASIL, MRGPRD, MRGPRE, MRGPRF, MRGPRG, MRGPRXl , MRGPRX2, MRGPRX3, MRGPRX4 , ???3, ???5, OXGR1 , P2RY8, P2RY10, SUCNR1 , TAAR2, TAAR3f TAAR4P, TAAR5, TAAR6, TAAR8, TAAR9, CCBP2, CCRL1, DARC, CALCR, CALCRL, CRHR1, CRHR2, GHRHR, GIPR, GLP1R, GLP2R, GCGR, SCTR, PTH1R, PTH2R, ADCYAP1R1 , VIPR1, VIPR2, BAI1 , ???2, ???3, CD97, CELSR1, CELSR2, CELSR3, ELTD1 , EMR1 , EMR2, EMR3, EMR4P, GPR56, GPR6 , GPR97, GPR98, GPR110, GPR111 r GPR112, GPR113, GPR114, GPR115, GPR116, GPR123, GPR124, GPR125, GPR126, GPR128, GPR133, GPR144, GPR157, LPHN1 , LPHN2, LPHN3, CASR, GPRC6A, GABBR1 , GABBR2, GRM1 , GRM2, GRM3, GRM4 , GRM5, GRM6, GRM7, GRM8, GPR156, GPR158, GPR179, GPRC5A, GPRC5B, GPRC5C, GPRC5D, TAS1R1 , TAS1R2, TAS1R3, FZD1 , FZD2, FZD3, FZD4 , FZD5, FZD6, FZD7, FZD8, FZD9, FZD10, SMO, GPR107, GPR137, 0R51E1, TPRA1, GPR143, THRA, THRB, RARA, RARB, RARG, PPARA, PPARD, PPARG, NR1D1, NR1D2, RORA, RORB, RORC, NR1H4, NR1H5P, NR1H3, NR1H2, VDR, NR1I2, NR1I3, HNF4A, HNF4G, RXRA, RXRB, RXRG, NR2C1 , NR2C2, NR2E1 , NR2E3, NR2F1 , NR2F2, NR2F6, ESR1 , ESR2, ESRRA, ESRRB, ESRRG, AR, NR3C1, NR3C2, PGR, NR4A1, NR4A2, NR4A3, NR5A1, NR5A2, NR6Al , NR0B1 , NR0?2, HTR3A, HTR3B, HTR3C, HTR3D, HTR3E, GABRA1 , GABRA2, GABRA3, GABRA4 , GABRA5, GABRA6, GABRB1 , GABRB2, GABRB3, GABRG1 , GABRG2, GABRG3, GABRD, GABRE, GABRQ, GABRP, GABRR1 , GABRR2, GABRR3, GLRA1 , GLRA2, GLRA3, GLRA , GLRB, GRIA1 , GRIA2, GRIA3, GRIA4 , GRID1 , GRID2, GRIK1 , GRIK2, GRIK3, GRIK4 , GRIK5, GRIN1 , GRIN2A, GRIN2B, GRIN2C, GRIN2D, GRIN3A, GRIN3B, CHRNA1 , CHRNA2, CHRNA3, CHRNA4, CHRNA5, CHRNA6, CHRNA7, CHRNA9, CHRNAl 0, CHRNB1 r CHRNB2, CHRNB3, CHRNB4 , CHRNG, CHRND, CHRNE, P2RX1 , P2RX2, P2RX3, P2RX4 , P2RX5, P2RX6, P2RX7, ZACN, AGER, TLR1 , T R2, TLR3, TLR4 , TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLR10, TLR11, LILRA1 , LILRA2, LILRA3, LILRA4 , LILRA5, LILRA6, LILRB1, LILRB2, LILRB3a , LILRB4, LILRB5, LILRB6, LILRB7, EGFR, ERBB2, ERBB3, ERBB4 , GFRal , GFRa2, GFRa3, GFRa 4 , NPR1 , NPR2, NPR3, NPR4, NGFR, NTRK1 , NTRK2, NTRK3, EGFR, ERB2, ERB3, ERB , INSR, IRR, IG1R, PDGFalpha, PDGFbeta, Fms, Kit, Flt3, FGFR1, FGFR2, FGFR3, FGFR4 , BFR2, VGR1 , VGR2, VGR3, EPA1, ???2, EPA3, EPA4, EPA5, ???7, ???8, EPB1 , ???2, ???3, ???4 , ???6, TrkA, TrkB, TrkC, UFO, TYR03, MERK, TIE1 , TIE2, RON, MET, DDR1, DDR2, RET, ROS, LTK, R0R1 , R0R2, RYK, ????, y KIT.

Los receptores adicionales considerados son receptores humanos que reconocen interleucina (IL)-l, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-ß, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-24, IL-25, IL-26, IL-27, IL-28, IL-29, IL-30, IL-31, IL-32, IL-33, IL-34, IL-35, IL-36, IL-37, IL-38, leptina, interferón-alfa, interferón-beta, interferón-gamma, factor de la necrosis tumoral alfa, linfotoxina, prolactina, oncostatina M, factor inhibidor de leucemia, factor regulador de colonias, inmunoglobulina A, inmunoglobulina D, inmunoglobulina G, inmunoglobulina M, inmunoglobulina E, antigeno de leucoteno humano (HLA) A, HLA-B, HLA-C, HLA-E, HLA-C, HLA-G, HLA-DP, HLA-DQ, HLA-DR, factor del crecimiento transformante alfa, factor del crecimiento transformante beta, factor del crecimiento nervioso, factor neurotrófico derivado del cerebro, neurotrofina-3, neurotrofina-4 , adrenomedulina, angiopoyetina, factor de motilidad autócrina, proteínas morfogenéticas óseas, eritropoyetina, factor del crecimiento fibroblástico, factor neurotrófico derivado de la línea celular glial, factor estimulador de la colonia granulocíticá, factor estimulador de la colonia de los macrófagos granulociticos, factor de diferenciación del crecimiento 9, factor del crecimiento de los hepatocitos, factor del crecimiento derivado de hepatoma, factor del crecimiento similar a la insulina, insulina, factor estimulante de la migración, miostatina, factor del crecimiento derivado de las plaquetas, trombopoyetina, factor del crecimiento endotelial vascular, factor del crecimiento placentario, y hormona del crecimiento.

Además se consideran receptores codificados por genes no humanos homólogos, por ejemplo, por genes porcinos, equinos, bovinos, felinos, caninos, o murinos, y receptores codificados por genes receptores de planta homólogos, por ejemplo, genes encontrados en plantas de cultivo como trigo, cebada, maíz, arroz, centeno, avena, soya, cacahuate, girasol, cártamo, lino, frijol, tabaco, o grasas de alimentación, y genes encontrados en plantas frutales como manzana, pera, plátano, frutos cítricos, uva o similares.

Los retrovirus tienen un potencial excepcionalmente alto de inmunogenicidad, limitando de este modo su uso en la aplicación repetida de un cierto tratamiento. Debido a la alta conservación de los módulos de dedo de zinc la reacción inmune será menor o estará ausente después de la aplicación de los factores de transcripción artificiales de la invención, o puede ser evitada o minimizada aún más por pequeños cambios a la estructura total eliminando la inmunogenicidad y reteniendo a la vez la unión al sitio blanco y de este modo la función. Además, se considera que la modificación de factores de transcripción artificiales de la invención con polietilenglicol reduce la inmunogenicidad. Además, la aplicación de factores de transcripción artificiales de la invención a órganos privilegiados inmunes, como el ojo y el cerebro evitará cualquier reacción inmune, e inducirá tolerancia de todo el cuerpo a los factores de transcripción artificiales. Para el tratamiento de enfermedades crónicas fuera de los órganos privilegiados inmunes, se considera la inducción de tolerancia inmune a través de la inyección intraocular.

La identificación de moléculas pequeñas para la modulación de la actividad del receptor depende en gran medida de procedimientos de selección extensivos y que consumen tiempo entre una amplia variedad de diferentes moléculas de diferentes clases y sustancias. Especialmente, el diseño racional, rápido de esos fármacos de molécula pequeña para una molécula receptora dada es muy desafiante. En contraste, los factores de transcripción artificiales de la invención pertenecen todos a la misma clase de sustancias con una composición total altamente definida. Dos factores de transcripción artificial basados en proteina de dedos de zinc hexaméricos son dirigidos a dos secuencias promotoras muy diversas tienen aún una identidad de secuencia de aminoácidos mínima del 85% con una estructura terciaria similar total y pueden ser generados vía un método estandarizado (como se describe más adelante) en una forma rápida y económica. De este modo, los factores de transcripción artificiales de la presente invención combinan una clase de molécula, una especificidad excepcionalmente alta para un conjunto muy amplio y diverso de blancos con composición similar total. Además, la formulación de factores de transcripción artificiales de la invención en fármacos puede depender de la experiencia previa para acelerar aún más el proceso de desarrollo del fármaco.

La liberación intracelular mediada por el dominio de transducción de proteínas (PTD) de los factores de transcripción artificiales es una nueva forma de tomar ventaja de la alta selectividad de productos biológicos para moléculas receptoras blanco en una forma novedosa. Aunque los fármacos convencionales modulan la actividad de ciertos receptores, los factores de transcripción artificiales alteran la disponibilidad de esas proteínas. Y puesto que los factores de transcripción artificiales están diseñados para actuar específicamente sobre la región de promotora de esos genes receptores, la invención permite ser blanco selectivamente aún en proteínas estrechamente relacionados. Esto se basa solamente en la conservación holgada de las regiones promotoras aún de proteínas estrechamente relacionadas. La liberación de factores de transcripción mediada la transducción de proteina es útil para modular la reacción de las células a estímulos externos, incluyendo pero sin limitarse a hormonas como por ejemplo la insulina, endotelina o péptidos inmunomoduladores como las interleucinas, quimiocinas y citocinas, asi como anticuerpos, antígenos y patrones moleculares. Pero también la respuesta celular hacia otras moléculas de señalización solubles como el glutamato o ácido gamma-aminobutírico y otros neurotransmisores puede ser modulada por este método. Tomando ventaja de la alta selectividad de los factores de transcripción artificiales de acuerdo con la invención, es posible aún hacer un blanco de manera específica en un tejido sobre la base de la expresión específica del tejido frecuente a ciertos números de una familia de proteína receptora dada.

La invención también se relaciona con el uso de esos factores de transcripción artificiales en el tratamiento de enfermedades moduladas por la unión de efectores específicos a receptores, para lo cual la proteína de dedo de zinc polidactílica está específicamente dirigida al promotor del gen receptor. De igual modo la invención se relaciona con un método para tratar enfermedades que comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un factor de transcripción artificial a un paciente que necesite del mismo, donde la enfermedad a ser tratada es modulada por la unión de efectores específicos a receptores, para lo cual la proteina de dedo de zinc polidactilica está específicamente dirigida al promotor del gen receptor.

Las proteínas de dedo de zinc polidactílicas consideradas son proteínas de dedo de zinc tetraméricas, pentaméricas, hexaméricas o heptaméricas . "Tetramérica", "pentamérica" , "hexamérica" y "heptamérica" significa que la proteína de dedo de zinc consiste de cuatro, cinco, seis, siete y estructuras de proteínas parciales, respectivamente, cada una de las cuales tiene especificidad de unión por un triplete de nucleotídico particular. Preferiblemente, los factores de transcripción artificiales comprenden una proteína de dedo de zinc hexamérica.

Selección de sitios blanco dentro de una región promotora dada .

La selección del sitio blanco es crucial para la generación con exitosa de un factor de transcripción artificial funcional. Para que un factor de transcripción artificial module la expresión del gen blanco in vivo, debe unirse a su sitio blanco en el contexto genómico del gen blanco. Esto necesita la accesibilidad del sitio blanco del ADN, lo que significa que el ADN cromosomal en esta región no está fuertemente compactado alrededor de las histonas en los nucleosomas y ninguna modificación del ADN como la metilación interfieren con la unión del factor de transcripción artificial. Aunque las partes grandes del genoma humano están fuertemente empaquetadas y transcripcionalmente inactivas, la vecindad intermedia del sitio de inicio de la transcripción (-1000 a + 200 pb) de un gen transcrito activamente debe ser accesible a los factores de transcripción endógenos y la maquinaria de la transcripción como las ARN polimerasas. De este modo, la selección de un sitio blanco en esta área de cualquier gen blanco objetivo aumentará en gran medida la tasa de éxito para la generación de un factor de transcripción artificial con la función deseada in vivo.

Selección de los sitios blanco dentro de la región promotora del receptor A de la endotelina humana (ETRA) Las proteínas de dedo de zinc hexaméricas (6ZFPs) dirigidas específicamente al promotor del receptor a la endotelina son determinadas analizando el gen ETRA humano como sigue: El gen ETRA humano (región genómica que contiene la región promotora SEQ ID NO: 25, región que codifica para la SEQ ID NO: 26) está comprendido de ocho exones separados por siete intrones (Hosoda K. et al., 1992, J. Biol. Chem. 267, 18797-18804) . El exón 1 y el intrón 1 se localizan en la región no codificadora 5' , el sitio de inicio de la transcripción se encuentra a 502 pb corriente arriba en codón de inicio de la traducción ATG.

La región promotora de ETRA de -1000 pb a +100 pb con relación al sitio de inicio de transcripción fue analizado por sitios blanco (GNN) 6 (Figura 2 y Tabla 1). Usando el software ZiFiT (Sander JD et al., 2010, Nucleic Acids Res 38, W462 - 468), fueron identificados TS-855 y TS+74 y los módulos de dedos de zinc de GNN del conjunto Barbas fueron elegidos para diseñar el ZFP-855A y ZFP+74A.

Aunque el diseño racional de la proteina de dedo de zinc basada en módulos de dedo de zinc preseleccionados es conocido, los métodos de selección basados en bibliotecas que contienen ZFP probaron ser superiores para la identificación de proteínas de dedos de zinc de alta afinidad. Por lo tanto, se selección una secuencia adicional (GNN) 6 (TS-103) , inicialmente excluida por el programa ZiFiT. Además, se seleccionaron otros sitios blanco de 18 pb que contenían tripletes de GNN o CNN entre TS-855 y TS+74. Además, se seleccionaron sitios blanco de 15 pb entre TS-855 y TS-306 para la selección de bibliotecas con 6ZFP.

Selección de sitios blanco dentro del receptor de la región promotora del receptor B de la endotelina humana (ETRB) Los sitios de unión para factores de transcripción artificiales para regular la expresión de ETRB fueron seleccionados como sigue: la región 5' del gen de ETRB (SEQ ID NO: 27) contiene sitios de inicio de la transcripción putativos en -1195, -817, -229 y -258 pb corriente arriba de el sitio de inicio de la traducción. Por lo tanto, se seleccionaron sitios blanco de 18 pb consistentes de triplete de GNN o CNN entre -1149 pb y -487 pb (véase la Figura 5) .

Selección de los sitios blanco dentro de la región promotora del receptor 4 similar al Toll (TLR4) Los sitios de unión potenciales de 18 pb para factores de transcripción artificiales que regulan la expresión de TLR4 consistentes de seis tripletes de G/CNN fueron seleccionados en la región 5' del gen de TLR4 (SEQ ID NO: 28) entre -276 pb y +113 pb con relación al sitio de inicio de la transcripción (véase la Figura 3).

Selección de sitios blanco dentro de la región promotora del receptor A de IgE de alta afinidad humana (FCERIA) Los sitios de unión de los factores de transcripción artificiales que regulan la expresión de FCERIA fueron seleccionados en la región 5' del gen de FCERIA (SEQ ID NO: 29) . El promotor de FCERIA humano contiene una región reguladora proximal de aproximadamente 200 pb corriente arriba del sitio del inicio de la transcripción, asi como una región distal más corriente arriba que contiene elementos que corresponden a IL-4 (Nishiyama C, 2006, Biosci Biotechnol Biochem 70 (1), 1-9). Los sitios de unión potenciales para factores de transcripción artificial que regulan FCER1A fueron seleccionados en la región reguladora proximal en -147 pb y +17 pb con relación al sitio de inicio de la transcripción .

Una selección del híbrido uno de levadura modificada (Y1H) para seleccionar proteínas de dedo de zinc hexaméricas Sobre la base del esquema de clonación de biblioteca publicado por González B. et al., 2010, Nat. Protoc 5, 791-810, el vector de lanzamiento de levadura pGADlO (pAN1025) fue modificado para permitir la generación eficiente de bibliotecas que codifican para la proteina de dedo de zinc. Para mejorar la eficiencia de la clonación, se efectuó el montaje inicial de bibliotecas que codifican para la proteina de dedos de zinc pBluescript seguido de la transferencia de las bibliotecas en pANl025. Usando la digestión secuencial y desfosforilación de ADN, se evitó la formación de módulos de dedo de zinc ligados cabeza-cabeza o cola-cola mejorando de este modo la cobertura efectiva de la biblioteca .

La selección de Y1H convencional tiene el propósito de identificar factores de transcripción para una secuencia de ADN dada de un grupo relativamente pequeño de proteínas naturales. La meta aquí fue seleccionar proteínas de dedo de zinc hexaméricas (6ZFPs) de un grupo muy grande de proteínas (alrededor de 16*106) , todas con el potencial de unirse al sitio blanco usado. Esto necesita el uso de presión de selección adicional para identificar 6ZFPs con la afinidad por el sitio blanco más alta. Aunque típicamente son usadas concentraciones de Aureobasidina A (AbA) a 200 ng/ml para análisis de Y1H convencionales, hasta 4000 ng/ml de AbA fueron útiles para mejorar la selección anterior, lo que normalmente es logrado con el sistema de Y1H empleado (MatchMaker Gold, Clontech) .

Para incrementar la presión de selección aún más y de este modo identificar 6ZFPs con una capacidad de unión aún mayor a un sitio blanco dado, el sistema Y1H fue modificado adicionalmente . Para la primera ronda de selección, las bibliotecas de factor de transcripción artificiales estaban contenidas en vectores de levadura sobre la base de 2 µ de origen de replicación. Esos vectores se replican de independientemente dentro de las células de levadura hasta aproximadamente 50 copias, conduciendo a una fuerte producción de 6ZFPs. Para una segunda ronda de selección, las bibliotecas de factor de transcripción artificial estaban contenidas en vectores de levadura sobre la base de un vector ARS/CEN bajo el número de copias, con un número de copias de 1-2/célula. Debido al nivel de expresión más bajo de las proteínas de dedos de zinc de la biblioteca, las selecciones de Y1H basadas en ARS/CEN combinadas con 4000 ng/ml de AbA son más sensibles y producen 6ZFPs con una mayor afinidad de unión por su secuencia blanco cognada.

Tabla 1: Sitios blanco dentro de la región del promotor ETRA y resultados de las selecciones de YlH a) Se muestran sitios blanco de promotor de ETRA (nombrada de acuerdo a su distancia al sitio de inicio de la transcripción) en la columna 1. b) La columna 2 nombra las ZFPs identificadas en una selección de Y1H para unirse a sitios blanco de promotor de ETRA. El esquema de nombrado es como sigue: ZFP seguido por el nombre del sitio blanco y una letra que designa a las diferentes ZFP aisladas en la selección o tamiz. c) La columna 3 muestra la constitución de las ZFPs tratando los módulos de dedos de zinc individuales de acuerdo con su preferencia de unión establecida. GM01 designa un módulo de dedo de zinc que preferiblemente se une a un triplete GAA, GM02 a GCA, G 03 a GGA, GM04 a G A, GM05 a GAC, GM06 a GCC, GM07 a GGC, GM08 a GTC, GM09 a GAG, GM10 a GCG, GM11 a GGG, GM12 a GTG, GM13 a GAT, GM14 a GCT, GM15 a GGT, GM16 a GTT, y además, CM01 a CAC, CM02 a CAA, CM03 a CAG, CM04 a CAT, CM05 a CCA, CM06 a CCC, CM07 al CCG CM08 a CCT, CM09 a CGA, CM10 a CGC, CM11 a CGG, CM12 a CGT, CM13 a CTA, C 14 a CTG y CM15 a CTT . d) La columna 4 se refiere a los IDs de secuencia de ZFPs identificadas para unirse a la secuencia del sitio blanco respectivo.

Tabla 2: Sitios blanco dentro del promotor de ETRB resultados de la selección de YlH -487 ZEB -4É37A GM03--CM11--CM14--CM12--GM16--GM13 109 GAGGTTCCCCTGCGGGGC ZEB -Ai ?7? GM07--CM11--CM14--CM06--GM16--GM09 110 (SEQ ID NO: 108) ZEB -Ai Í7C GM15--C 11--CM08--CM12--G 16--GM13 111 ZEB -45 Í7D GM03--CM11--CM15--CM12--G 16--GM09 112 ZEB -Ai 37E GM15--C 11--CM14--CM12--GM04--GM09 113 ZEB -Ai Í7F GM03--CM11--CM14--CM12--G 04--GM13 114 a) Se muestran sitios blanco de promotor de ETRB (nombrada de acuerdo a su distancia al sitio de inicio de la traducción) en la columna 1. b) La columna 2 nombra las ZFPs identificadas en una selección de Y1H para unirse a los sitios blanco de promotor de ETRB. El esquema de nombrado es como sigue: ZEP seguido por el nombre del sitio blanco y una letra que designa a las diferentes ZFP aisladas en el tamiz o selección . c) La columna 3 muestra la constitución de las ZFPs tratando los módulos de dedos de zinc individuales de acuerdo con su preferencia de unión establecida. GM01 designa un módulo de dedo de zinc que preferiblemente se une a un triplete de GAA, GM02 a GCA, GM03 a GGA, GM04 a GTA, GM05 a GAC, GM06 a GCC, G 07 a GGC, GM08 a GTC, GM09 a GAG, GM10 a GCG, GM11 a GGG, GM12 a GTG, GM13 a GAT, GM14 a GCT, GM15 a GGT, GM16 a GTT, y además, CM01 a CAC, CM02 a CAA, CM03 a CAG, CM04 a CAT, CM05 a CCA, CM06 a CCC, CM07 a CCG CM08 a. CCT, CM09 a CGA, CM10 a CGC, CM11 a CGG, CM12 a CGT, CM13 a CTA, CM14 a CTG, y CM15 a CT . d) La columna 4 se refiere a los IDs de secuencia de ZFPs identificadas para unirse a la secuencia del sitio blanco respectivo.

Tabla 3: Sitios blanco dentro del promotor de TRL4 y resultados de la selección de Y1H. -55 ZFP-55A GM07-C 15-C 12-GM09-GM01-GM13 126 GCTGTGGGGCGGCTCGAG ZFP-55B GM03 -CM09 -CM04 -GM16 -GM09 -GM07 127 (SEQ ID NO: 125) ZFP-55C GM07 -CM15 -C 06 -GM14 -GM06 -GM12 128 ZFP-55D GM13 -CM11 -C 04 -GM14 -GM04 -GM07 129 ZFP-55E GM06 -CM03 -CM12 -GM09 -GM01 -GM16 130 ZFP-55F GM07 -C 08 -C 05 -GM01 -GM09 -GM06 131 ZFP-55G GM13 -CM11 -CM11 -GM06 -GM02 -GM06 132 ZFP-55H GM04 -CM14 -CM05 -GM09 -GM09 -G 13 133 ZFP-55I GM07 -CM04 -CM15 -GM02 -GM12 -GM09 134 ZFP-55J GM06 -CM13 -C 04 -GM16 -GM09 -GM13 135 +113 ZFP+113A C 13 -G 07 -GM09 -G 03 -GM02 -GM06 137 ATGGCCTTCCTCTCCTGC ZFP+113B CM06 -GM13 -GM12 -GM02 -GM03 -GM12 138 (SEQ ID NO: 136) ZFP+113C CM11 -GM03 -GM09 -GM03 -GM08 -GM06 139 ZFP+113D CM06 -GM13 -G 07 -GM01 -GM11 -GM07 140 ZFP+113E CM06 -GM07 -G 03 -GM09 -GM07 -GM02 141 ZFP+113F CM04 -GM07 -G 02 -GM09 -GM07 -GM02 142 ZFP+113G CM14 -GM07 -GM03 -GM09 -GM07 -GM16 143 ZFP+113H CM12 -GM13 -GM09 -GM15 -GM02 -GM06 144 a) Se muestran sitios blanco de promotor de TRL4 (nombrada de acuerdo a su distancia al sitio de inicio de la traducción) en la columna 1. b) La columna 2 nombra las ZFPs identificadas en una selección de TRL4 para unirse a los sitios blanco de promotor de ETRB . El esquema de nombrado es como sigue: ZEP seguido por el nombre del sitio blanco y una letra que designa a las diferentes ZFP aisladas en el tamiz o selección . c) La columna 3 muestra la constitución de las ZFPs tratando los módulos de dedos de zinc individuales de acuerdo con su preferencia de unión establecida. GM01 designa un módulo de dedo de zinc que preferiblemente se une a un tripíete de GAA, GM03 a GGA, GM04 a GTA, GM05 a GAC, GM06 a GCC, GM07 a GGC, GM08 a GTC, GM09 a GAG, GM10 a GCG, GMll a GGG, GM12 a GTG, GM13 a GAT, GM14 a GCT, GM15 a GGT, GM16 a GTT, y además, CM01 a CAC, CM02 a CAA, CM03 a CAG, CM04 a CAT, CM05 a CCA, CM06 a CCC, CM07 a CCG CM08 a CCT, CM09 a CGA, CM10 a CGC, CM11 a CGG, CM12 a CGT, CM13 a CTA, CM14 a CTG, y CM15 a CT . d) La columna 4 se refiere a los IDs de secuencia de ZFPs identificadas para unirse a la secuencia del sitio blanco respectivo.

Tabla 4: Sitios blanco dentro del promotor de TRL4 y resultados de la selección de Y1H. a) Se muestran sitios blanco de promotor de FCER1A (nombrada de acuerdo a su distancia al sitio de inicio de la traducción) en la columna 1. b) La columna 2 nombra las ZFPs identificadas en una selección de TRL4 para unirse a los sitios blanco de promotor de FCERIA. El esquema de nombrado es como sigue: ZEP seguido por el nombre del sitio blanco y una letra que designa a las diferentes ZFP aisladas en el tamiz o selección. c) La columna 3 muestra la constitución de las ZFPs tratando los módulos de dedos de zinc individuales de acuerdo con su preferencia de unión establecida. GM01 designa un módulo de dedo de zinc que preferiblemente se une a un triplete de GAA, GM02 a GCA, GM03 a GGA, GM04 a GTA, GM05 a GAC, GM06 a GCC, GM07 a GGC, GM08 a GTC, GM09 a GAG, GM10 a GCG, GM11 a GGG, GM12 a GTG, GM13 a GAT, GM14 a GCT, GM15 a GGT, GM16 a GTT, y además, CM01 a CAC, CM02 a CAA, CM03 a CAG, CM04 a CAT, CM05 a CCA, CM06 a CCC, CM07 a CCG CM08 a CCT, CM09 a CGA, CM10 a CGC, CM11 a CGG, CM12 a CGT, CM13 a CTA, CM14 a CTG, y CM15 a CTT. d) La columna 4 se refiere a los IDs de secuencia de ZFPs identificadas para unirse a la secuencia del sitio blanco respectivo.

Los factores de trascripción artificiales de acuerdo con la invención comprenden una proteina de dedo de zinc basada en la composición del módulo de dedo de zinc mostrada en las Tablas 1 a 4, columna 3, donde hasta tres moléculas de dedo de zinc individuales son intercambiadas contra otros modelos de dedo de zinc con características de unión alternativas para modular la unión del factor de transcripción artificial a su secuencia blanco.

Los factores de trascripción artificiales de acuerdo con la invención comprenden una proteína de dedo de zinc basada en la composición del módulo de dedo de zinc mostrada en las Tablas 1 a 4, columna 3, donde son intercambiados aminoácidos individuales para minimizar la inmunogenicidad potencial reteniendo a la vez la afinidad de unión al sitio blanco pretendido.

Preferiblemente, los factores de trascripción artificiales de acuerdo con la invención comprenden una proteína de dedo de zinc de una secuencia seleccionada del grupo que comprende SEQ ID NO: 31 a SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39 a SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45 a SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54 a SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59 a SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66 a SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82 a SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 97 a SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 120 a SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 138 a SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 145 a SEQ ID NO: 153, SEQ ID NO: 155 a SEQ ID NO: 164, SEQ ID NO: 166 a SEQ ID NO: 173, SEQ ID NO: 175 a SEQ ID NO: 181, y SEQ ID NO: 183 a SEQ ID NO: 191.

De manera más preferible, los factores de trascripción artificiales de acuerdo con la invención comprenden una proteína de dedo de zinc pentamérica de la SEQ ID NO 135 o una proteina de dedo de zinc hexamérica de una secuencia de proteina seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO 33, 54, 56, 64, 68, 83, 84, 85, 97, 101, 114, 118, 122, 127, 133, 140, 142, 146, 147, 156, 159, 169, 171, 173, 175, 181, 184, 187, 189, y 191.

Se prefieren aún más, factores de trascripción artificiales que comprenden una proteina de dedo de zinc hexaméricas de la SEQ ID NO 135 o una proteina de dedo de zinc hexamérica de una secuencia de proteina seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO 56, 83, 85, 101, 114, 118, 127, 133, 140, 142, 146, 147, 156, 159, 175, y 181.

Se prefieren aún más factores de transcripción artificiales que comprenden proteínas de dedo de zinc hexaméricas de la SEQ ID NO 118, 127, 146, 156, o 175.

De manera aún más preferida en los factores de transcripción artificiales que comprenden proteínas de dedo de zinc hexaméricas SEQ ID NO 118, 127, 156, o 175.

Más preferido son los factores de transcripción artificiales que comprenden proteínas de dedo de zinc hexaméricos de la SEQ ID NO 118, 156, o 175.

Las proteínas de dedo de zinc polidactílicas son fusionadas a un dominio regulador, el cual es un dominio de proteína inhibidor o activador, los dominios de proteína inhibidores considerados son los dominios transcripcionalmente activos de proteínas definidas por la ontología genética GO: 0001071 como dominios de KRAB N-. terminal, KRAB C-terminal, SID y ERD, preferiblemente KRAB o SID. Los dominios de proteína activadora considerados son los dominios transcripcionalmente activos de proteínas definidas por la ontología genética GO: 0001071 como VP16 o VP64 (repetición tetramérica de VP16) , preferiblemente VP64.

Además de las proteínas de dedo de zinc polidac ilícas fusionadas a un dominio de proteína inhibidor o activador, los factores de transcripción artificiales de la invención comprenden una secuencia de localización nuclear (NLS) . Las secuencias de localización nuclear consideradas son motivos de aminoácido que confieren importancia nuclear a través de la unión a proteínas definidas por la ontología genética GO: 0008139, por ejemplo grupos de aminoácidos básicos que contienen un residuo de lisina seguido por un residuo de lisina o arginina, seguido por cualquier aminoácido, seguido por un residuo de lisina o arginina (secuencia de consenso K-K/R-X-K/R, Chelsky D. et al., 1989 Mol Cell Biol 9, 2487-2492) o el SV40 NLS, con el SV40 NLS siendo el preferido.

Los factores de transcripción artificiales de la invención comprenden además opcionalmente un dominio de transducción de proteína (PTD) . Los dominios de transcripción de proteína considerados son el péptido TAT derivado de VIH, el péptido HSV-1 VP22, el péptido sintético mT02 ( PVRRPRRRRRRK, SEQ ID NO: 163, Yoshikawa T. et al. 2009 Biomaterials 30, 3318-23) , el péptido sintético mT03 (THRLPRRRRRRK, SEQ ID NO: 164), el péptido R9 (RRRRRRRRR, SEQ ID NO: 165), el dominio de ANTP, y el antigeno protector/factor letal N terminal PTD, preferiblemente el TAT PTD.

Los factores de transcripción artificiales dirigidos a un promotor de gen receptor, pero sin el dominio de transcripción de proteina, también son objeto de la invención. Ellos son intermediarios para los factores de transcripción artificiales de la invención como se describió anteriormente .

Los factores de transcripción artificiales dirigidos a ETRA pero sin el dominio de transducción de proteina, también son un objeto de la invención. Ellos son intermediarios para los factores de transcripción artificiales de la invención como se definió aqui anteriormente .

Los factores de transcripción artificiales dirigidos al promotor de ETRB, pero sin el dominio de transducción de proteina, también son un objeto de la invención. Ellos son intermediarios para los factores de transcripción artificiales de la invención como se definió aqui anteriormente.

Los factores de transcripción artificiales al TLR4, pero sin dominio de transduccion de proteina, también son un objeto de la invención. Ellos son intermediarios para los factores de transcripción artificiales de la invención como se definió aquí anteriormente.

Los factores de transcripción artificiales dirigidos al promotor de FCER1A, pero sin el dominio de transduccion de proteina, también son un objeto de la invención. Ellos son intermediarios para los factores de transcripción artificiales de la invención como se definió aquí anteriormente.

Los dominios de los factores de transcripción artificiales de la invención pueden ser conectados por enlazantes flexibles cortos. Un enlazante flexible corto tiene de 2 a 8 aminoácidos, preferiblemente glicina y serina. Un enlazante particular considerado es GGSGGS (SEQ ID NO: 9) . Los factores de transcripción artificiales pueden contener además marcadores para facilitar su detección y procesamiento .

Actividad de los factores de transcripción artificiales en la regulación de la actividad del promotor del receptor Los módulos de dedo de zinc basados en transcripción artificial fueron construidos de acuerdo al esquema mostrado en la Figura 6 a partir de ZFPs (véanse las Tablas 1 a 4) seleccionado usando el tamiz de YIH para unirse específicamente a ciertos sitios blancos de los promotores del receptor. Esos factores de transcripción artificiales contenían dominios transcripcionalmente activos diferentes como el KRAB N-terminal, KRAB C-terminal, SID o VP64. Sobre la base de los datos publicados (Beerli R.R. et al., 1998 Proc Nati Acad Sci USA 95, 14628-14633), se predijo que KRAB así como los dominios SID actúan como represores transcripcionales , mientras que el VP64 media la actividad transcripcional . Para evaluar el potencial de los factores de transcripción artificiales (la fusión entre un 6ZFP y un dominio transcripcionalmente activo) para influenciar la transcripción controlada por el promotor del receptor, se empleó un ensayo de reportero de luciferasa. Hasta este punto, las células capaces de controlar la expresión de cierto promotor fueron contrafectadas con un plásmido de expresión de factor de transcripción artificial junto con un plásmido reportero dual. El plásmido reportero dual contenía el gen de luciferasa de Gaussia secretado bajo el control del promotor del receptor en cuestión junto con el gen para la fosfatasa alcalina secretada (SEAP) bajo el control del promotor de CMV constitutivo basado en los plásmidos NEG-PG04 y EFla-PG04 (GeneCopoeia, Rockville, MD) .

Muchos promotores presentan patrones de expresión específicos del tipo de célula sin expresión virtual en algunos tipos de célula y un alto nivel de expresión en otros tipos de célula. De este modo, la selección de un modelo de célula adecuada para estudios de regulación del promotor depende de la especificidad tisular de un promotor de receptor dado. En los casos mostrados aquí, las células HeLa, una linea celular de carcinoma de cerviz, son capaces de expresar el reportero de luciferasa del promotor de ETRA, ETRB o TLR . La expresión de luciferasa bajo el control del promotor de FCER1A no fue posible en células HeLa debido a la especificidad tisular de este promotor. Por lo tanto, fueron empleadas células RBL-2H3 de leucemia basófilas de rata para evaluar una función de transcripción artificial contra el promotor de FCER1A. Esta linea celular soportó la expresión del reportero de luciferasa controlado por un promotor de FCER1A y fue transfrectable con una eficiencia de aproximadamente el 50% usando nucleofección .

Esta cotransfección fue efectuada a una relación de ATF: reportero plásmido de 3:1 para asegurar la presencia de la expresión del factor de transcripción artificial (ATF) en células transfectadas con el plásmido reportero y luciferasa, y la actividad de SEAP fue medida de acuerdo a la recomendación del fabricante (GeneCopoeia, Rockville, MD) . Los valores de luciferasa fueron normalizados para la actividad de SEAP y comparados para controlar células que expresan proteina fluorescente amarilla (YFP) al 100%.

Midiendo la relación entre la actividad de la luciferasa y SEAP en sobrenadante de células transíectadas, fue posible la normalización de la expresión de la luciferasa controlada por el promotor del receptor para la expresión de SEAP en células transíectadas con plásmido de factor de transcripción artificial. Este método puede ser útil para considerar y normalizar las diferencias en la eficiencia de transfección entre diferentes experimentos y permitió la cuantificación de la regulación mediada por el factor de transfección artificial de un promotor de receptor dado.

Todos los estudios de expresión de luciferasa (Figuras 7A a 11A) fueron efectuados al menos tres veces por triplicado, promediados, comparados con células transíectadas control, expresados como actividad relativa de luciferasa (RLuA) en % del control y graficados con barras de error que describen la SEM.

La convención para nombrar factores de transcripción artificiales es la siguiente: los factores de transcripción artificiales expresados en células de mamífero usando un vector de expresión de mamífero y que consiste de una proteína de dedo de zinc (ZFP) , una secuencia de localización nuclear y un dominio regulador negativo como SID o KRAB (N- o C-terminal) son designados con las letras AO seguidas por un numero que representa un sitio blanco y una letra que identifica cierta ZFP usando el tamiz de Y1H. La adición de una letra minúscula "a" a este nombre designa un factor de transcripción artificial que comprende el dominio VP64 activador. La adición de una letra minúscula "p" designa una proteina de factor de transcripción artificial purificada producida en un sistema de expresión heterólogo y además de los dominios anteriormente mencionados que contiene el dominio de transduccion de proteina TAT y la marca o etiqueta de HA (SEQ ID NO: 166) .

La Figura 7A muestra la desregulación dependiente del factor de transcripción artificial de la expresión de luciferasa dependiente del promotor ETRA. Las células HeLa fueron cotransfectadas con un constructo de luciferasa de promotor ETRA/reportero de SEAP constitutivo como se describió anteriormente y plásmidos de expresión para A074A, A074E, A074R, A074V o proteina fluorescente amarilla (YFP) como control (marcada como C) . Esos factores de trascripción artificiales están dirigidos contra TS+74 del promotor de ETRA y contienen el dominio SID regulador negativo. Mientras que A074A y A074E suprimieron la expresión controlada por el promotor de ETRA en aproximadamente 70%, el A074R, y A074V son capaces de bloquear el promotor de ETRA a niveles básicos .

La Figura 8A resalta la versatilidad del método para generar factores de transcripción que hacen blanco en promotores del receptor. Intercambiando simplemente el dominio inhibidor SID en A074V o A074R contra el dominio activador VP64, podrían generarse factores de transcripción activadores capaces de reforzar la actividad transcripcional del promotor de ETRA en aproximadamente 400%.

Usando el mismo método, fueron construidos factores de transcripción artificiales que hacen blanco en el promotor del receptor de ETRB. La Figura 9A muestra la represión de la actividad del promotor de ETRB por A01149N y A01149P que contienen una ZFP dirigida contra el sitio blanco TS-1149 del promotor de ETRB (véase la Figura 2) así como un dominio de SID inhibidor. Las células HeLa fueron cotransfectadas con un constructo de luciferasa del promotor de ETRB/promotor de SEAP y los plásmidos de expresión para A01149N, A01149P o YFP como control. El A01149N suprimió la actividad del promotor de ETRB en aproximadamente 80%, mientras que A01149P bloqueó el promotor de ETRB casi a niveles básicos.

Para analizar la actividad de los factores de transcripción artificiales específicos de TLR4 A055B y A055E que consisten de una ZFP dirigida contra el sitio blanco TS-55 en el promotor de TLR4 (véase la Figura 3) y el dominio de KRAB inhibidor en el C-terminal, fue empleado el ensayo de luciferasa de Gaussia/reportero de SEAP. Como se muestra en la Figura 10, la expresión de A055B o A055E en células HeLa reprimió la expresión controlada por el promotor de TLR4 con A055B, bloqueando completamente la expresión de luciferasa en comparación con células transíectadas control que expresan YFP.

Para evaluar la actividad de factores de transcripción artificiales dirigidos contra el promotor de FCER1A, el A0147A fue expresado en células RBL-2H3 basófilas de rata junto con la luciferasa de Gaussia controlada o activada por el promotor de FCER1A y SEAP controlado por CMV como anteriormente. Este factor de transcripción artificial está dirigido contra el sitio blanco TS-147 y contiene un dominio de KRAB N-terminal. Las células RBL-2H3 fueron elegidas sobre la base de la especificidad tisular del promotor de FCER1A y la facilidad de transfección usando nucleoporación . Como se muestra en la figura 11, la expresión controlada por FCER1A en células RBL-2H3 que producen A0147A se redujo aproximadamente en 80% en comparación con las células control que expresan YFP (C) .

Tomadas juntas, la regulación mediada por el factor de transcripción artificial de la regulación controlada por el promotor del receptor es factible y es capaz de sobrerregular la expresión hasta un 400% o bloquear completamente la expresión dependiente del dominio regulador usado para la construcción del factor de transcripción artificial abriendo un posible intervalo regulador del orden de casi dos ordenes de magnitud.

Evaluación de los efectos tóxicos potenciales de factores de transcripción artificiales Aunque los factores de transcripción artificiales son seleccionados para un sitio blanco dado y aunque los sitios blanco elegidos fueran únicos dentro del genoma humano, los factores de transcripción artificiales pueden tener efectos fuera del blanco uniéndose a secuencias similares, ejerciendo por lo tanto efectos tóxicos. Esos efectos tóxicos pueden interferir potencialmente con ensayos funcionales de esos factores de transcripción artificiales. Para cualquier sitio blanco de 18 pb único dado, cualquier número de secuencias altamente similares puede ser identificado con una, dos o tres sustituciones. Aunque esas secuencias pueden permitir la unión de un factor de transcripción artificial y pueden conducir a efectos fuera del blanco, la mayoría de esos sitios fuera del blanco se localizan en otros lugares diferentes en la secuencias reguladoras de genes transcritos activamente, disminuyendo en gran medida el potencial de efectos fuera del blanco del tratamiento con factor de transcripción artificial. Para los siguientes experimentos, las células fueron tratadas con 1 µ? de proteína de factor de transcripción artificial transducible y la proliferación celular común medida de la toxicidad potencial fue evaluada usando el ensayo de MTS. Cada experimento fue efectuado por triplicado al menos tres veces; la proliferación de las células tratadas con factor, de transcripción artificial fue medida y expresada como % del control tratado con el amortiguador correspondiente. Puede notarse que, la adición de "p" a la designación del factor de transcripción artificial indica una proteina que contiene dominio de transcripción de proteina TAT, proteínas de dedo de zinc y un dominio regulador como SID, KRAB o VP64 más que un plásmido de expresión que codifica para factores de transcripción artificiales sin el dominio de transducción de proteína .

Como se muestra en la Figura 7B, el tratamiento de las células HeLa con 1 µ? de proteína A074Vp, la versión transducible de A074V, durante dos días no dio como resultado la pérdida de proliferación en comparación con las células tratadas con amortiguador. De manera similar, el tratamiento de hUtSMCs con A074Vp no fue tóxico a las células y no inhibió su proliferación (Figura 7C) . Además, la proteína de factor de transcripción artificial activante basada en ZFP-74V A074Vap no presentó ningún efecto tóxico sobre la proliferación de hUtSMC (Figura 8B) . Esos datos son consistentes con la unión fuera del blanco despreciable de ZFP-74V que contiene factores de transcripción artificiales en el genoma humano. De manera similar, ni el tratamiento de las células HeLa con el factor de transcripción artificial específico de TLR4 A055Bp (Figura 10C) o el A0147Ap específico de FCER1A (Figura 11B) dio como resultado la pérdida de proliferación. Tomados juntos, todos esos factores de transcripción artificiales probados son altamente específicos hacia su sitio de unión pretendido y no producen efectos fuera del blanco que puedan dar como resultado muerte celular o una disminución de la proliferación.

Análisis funcional de factores de transcripción artificiales usando ensayos de respuesta celular Para determinar la función del factor de transcripción artificial sobre promotores de receptor endógenos después de la liberación de proteína basada en TAT, se observó la respuesta celular al tratamiento con agonista de receptor entre el factor de transcripción artificial y células tratadas control.

Evaluación de la desregulación de ETRA después del tratamiento con factor de transcripción artificial Las células de músculo liso (SMCs) expresan ETRA y son capaces de contraerse después de la exposición a ET-1. Para medir la efectividad del factor de transcripción artificial antipromotor de ETRA A074V, fueron usadas células de músculo liso uterino humano (hütSMCs) como sistema modelo. Hasta este punto, las hütSMCs fueron incrustadas en retículas de colágeno tridimensionales y tratadas durante tres días con 1 µ? de A074Vp o control con amortiguador antes de la exposición de ET-1 de 0 o 100 nM. El tratamiento con proteina o amortiguador fue repetido cada 24 horas. Después del desprendimiento de las retículas de su soporte y la adición de ET-1, se observó la contracción de las retículas. Como se muestra en la Figura 7D, las retículas de control expuestas a ET-1 se contraen aproximadamente 78% en comparación con las retículas no tratadas con ET-1. En contraste, las retículas tratadas con A074V no se contrajeron significativamente en presencia de ET-1 cuando se compararon con retículas control no tratadas con ET-1. Esto es consistente con el blogueo completo de la contracción inducida por ET-1 de hUtSMCs después del tratamiento con A074Vp. Los datos mostrados en la Figura 7D representan el área de retícula promedio 9 horas después de la adición de ET-1 de tres experimentos independientes efectuados por sextuplicado. El análisis estadístico usando el pagúete de software SPSS que emplea un modelo univariable lineal general reveló un significado alto (** que representa p<0.001) para la acción bloqueadora de A074Vp.

Evaluación de la desregulación de TLR4 después del tratamiento con factor de transcripción artificial Los macrófagos expresan TLR4 se producen en respuesta a la unión de LPS a citocinas proinflamatorias TLR4 como IL-6. Las células U937 estimuladas con Forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) son un modelo ampliamente aceptado para células similares a macrófagos humanos. Para medir la efectividad del factor de transcripción artificial antipromotor de TLR4 A055B, las células U937 estimuladas con PMA que expresan A055B o YFP como control fueron desafiadas durante 8 horas con 0.5 ng/ml de LPS y fue medida la producción de IL-6 usando ELISA. Como se muestra en la Figura 10B, la expresión de A055B se redujo significativamente (p< 0.005) la secreción de IL-6 en comparación con células control en aproximadamente 25%. Tomando en consideración que la eficiencia de nucleofección de U937 es de aproximadamente 50%, lo que significa que A055B se expresó únicamente en esos experimentos en aproximadamente 50% de las células, la expresión real de la producción de IL-6 por A055B es del orden del 50%.

Evaluación de la función de FCER1 después del tratamiento con factor de transcripción artificial La unión de un anticuerpo IgE al receptor de IgE de alta afinidad heterodimérico FCER1 obre la superficie de macrófagos, mastocitos y basófilos es el primer paso en la activación de una respuesta alérgica en un individuo atópico. El encuentro con una alergia no conduce a la reticulación de moléculas de FCER1 cargadas con IgE que activan una cascada de señalización intracelular que da como resultado la liberación de mediadores alérgicos y citocinas. De este modo, la capacidad de IgE para unirse por ejemplo en los basófilos es un paso crucial en la respuesta alérgica. Para evaluar la capacidad de unión de IgE después del tratamiento con un factor de transcripción artificial dirigido contra el promotor de la subunidad alfa de FCER1, fueron tratadas células KU812F basófilas humanas diariamente durante 48 horas con 1 µ de A0147Ap o amortiguador. Después del tratamiento, fue medida la capacidad de unión de IgE usando citometria de flujo. La capacidad de unión de IgE promedio (IgEB) de células KU812F tratadas con A0147A de tres experimentos independientes se muestra en la Figura 11C. El tratamiento con A0147Ap redujo la capacidad de unión de IgE de las células basófilas en aproximadamente 80% en comparación con células tratadas control. De manera interesante, aunque el factor de transcripción artificial A0147Ap está dirigido únicamente contra la subunidad alfa del complejo del receptor de FCER1, la función de todo el receptor en términos de su capacidad para unirse a IgE se redujo en gran medida. De este modo, se espera que la reticulación de FCER1 inducida por el alérgeno se reduzca en gran medida, incrementando el umbral para la liberación del mediador alérgico. A diferencia de otros receptores, FCER1 es un complejo de proteina multimérica comprendido de subunidades, alfa, beta, y gamma codificadas por tres sitios genéticos diferentes. Únicamente el FCER1 montado correctamente que contiene una cadena alfa, beta y dos gamma, con la cadena alfa proporcionando el sitio de unión de IgE, es capaz de activar las respuestas alérgicas. De este modo, la desregulación de la expresión de la cadena alfa de FCER1 (FCER1A) por ejemplo con un factor de transcripción artificial adecuado evitará el montaje y función correcta de FCERl como un todo. Esta noción es soportada por el ratón FCER1A-/- donde es abolida la anafiláxis (Dombrowicz D., 1993, Cell 75, 969-976). De este modo, la dirección de la expresión de FCER1A usando la tecnología del factor de transcripción artificial es adecuada para abrogar reacciones alérgicas. Además, aunque los factores de transcripción artificiales son altamente específicos para un gen blanco, los receptores multiméricos en general son susceptibles a la inactivación mediada por el factor de transducción artificial.

Composiciones farmacéuticas La presente invención también se relaciona con composiciones farmacéuticas que comprenden un factor de trascripción artificial como se definió anteriormente. Las composiciones farmacéuticas consideradas son composiciones para administración sistémica parenteral, en particular administración intravenosa, composiciones para inhalación, y composiciones para administración local, en particular administración oftámica-tópica, por ejemplo como gotas para ojos, o administración intravitrea, subconj untival, parabulbar o retrobulbar, a animales de sangre caliente, especialmente humanos. Particularmente preferidas son las gotas para ojos y composiciones para administración intravitrea, subconj untival, parabulbar o retrobulbar. Las composiciones comprenden el ingrediente activo solo, o preferiblemente junto con un soporte farmacéuticamente aceptable. Se consideran además formulaciones de liberación lenta. La dosis del ingrediente activo depende de la enfermedad ha ser tratada y de la especie, su edad, peso y condición individual, los datos farmacocinéticos individuales y el modo de administración.

Se consideran además composiciones farmacéuticas útiles para administración oral, en particular composiciones que comprenden ingredientes activos encapsulados adecuadamente, o protegidos de otro modo contra la degradación en el intestino. Por ejemplo, esas composiciones farmacéuticas pueden contener un agente mej orador de la permeabilidad membranal, un inhibidor de la enzima proteasa, y envueltas por un recubrimiento entérico Las composiciones farmacéuticas comprenden de aproximadamente 1% hasta aproximadamente 95% de ingrediente activo. Las formas de dosis unitarias son, por ejemplo, ampolletas, frascos, inhaladores, gotas para ojos y similares .

Las composiciones farmacéuticas de la presente invención son preparadas en una forma conocida per se, por ejemplo por medio de procesos de mezclado, disolución o liofilización convencionales.

Se da preferencia al uso de soluciones del ingrediente activo, y también suspensiones o dispersiones, especialmente soluciones, dispersiones o suspensiones acuosas isotónicas las cuales, por ejemplo, en el caso de las composiciones liofilizadas que comprenden el ingrediente activo solo o combinado con un soporte, por ejemplo manitol, pueden ser reconstituidas antes de su uso. Las composiciones farmacéuticas pueden ser esterilizadas y/o pueden comprender excipientes, por ejemplo conservadores, estabilizadores, agentes humectantes y/o emulsionantes, solubilizantes , sales para regular la presión osmótica y/o amortiguadores y son preparadas en una forma conocida per se, por ejemplo por medio de procesos de disolución y liofilización. Las soluciones o suspensiones pueden comprender agentes que incrementen la viscosidad, típicamente carboximetilcelulosa sódica, carboximetilcelulosa, dextrano, polivinilpirrolidona, o gelatinas, o también solubilizadores, por ejemplo, Tween 80® (monooleato de polioxietilen (20) sorbitán) .

Las suspensiones en aceite comprenden como el componente de oleoso aceites vegetales, sintéticos, o semisintéticos comunes para propósitos de inyección. A ese respecto, puede hacerse mención de ésteres de ácidos grasos líquidos que contienen como el componente ácido un ácido graso de cadena larga que tiene de 8 a 22, especialmente de 12 a 22, átomos de carbono. El componente alcohólico de esos ésteres de ácido graso tiene un máximo de 6 átomos de carbono y es un alcohol monovalente o polivalente, por ejemplo un mono, di o trivalente, especialmente glicol o glicerol. Como mezclas de ésteres de ácido graso, los aceites vegetales como el aceite de semilla de algodón, aceite de almendras, aceite de oliva, aceite de ricino, aceite de ajonjolí, aceite de soya y aceite de nuez son especialmente útiles.

La fabricación de preparaciones inyectables usualmente se lleva a cabo bajo condiciones estériles, como llenado, por ejemplo, en ampolletas o frascos, y el sellado de los recipientes.

Para la administración parenteral, las soluciones acuosas del ingrediente activo en forma soluble en agua, por ejemplo de una sal soluble en agua, o suspensiones de inyección acuosas que contienen sustancias que incrementan la viscosidad, por ejemplo carboximetilcelulosa sódica, sorbitol y/o dextran, y, si se desea, estabilizadores, son especialmente adecuadas. El ingrediente activo, opcionalmente junto con los excipientes, también puede estar en forma de un liofilizado y puede ser preparado en una solución antes de la administración parenteral mediante la adición de disolventes adecuados .

Las composiciones para inhalación pueden ser administradas en forma de aerosol, como rocíos, nieblas o en forma de gotas. Los aerosoles son los preferidos de las soluciones o suspensiones que pueden ser liberadas con un inhalador de nebulizador de dosis medida, es decir, un dispositivo que proporciona una cantidad específica de medicamento a las vías aéreas o pulmones usando un propelente adecuado, por ejemplo, diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, dióxido de carbono u otro gas adecuado, en forma de una ráfaga corta de la medicina aerosolizada que es inhalada por el paciente. También es posible proporcionar rocíos en forma de polvo para inhalación con una base de polvo adecuada como lactosa o almidón .

Las gotas para ojos son preferiblemente soluciones acuosas isotónicas del ingrediente activo que comprenden agentes adecuados para hacer la composición isotónica con el fluido lagrimal (295-305 mOsm/1) . Los agentes considerados son cloruro de sodio, ácido cítrico, glicerol, sorbitol, manitol, etilenglicol, propilenglicol, dextrosa, y similares. Además las composiciones comprenden agentes amortiguadores, por ejemplo amortiguador de fosfato, amortiguador de fosfato- citrato, o amortiguador de Tris . (tris (hidroximetil ) aminometano) para mantener el pH entre 5 y 8, preferiblemente de 7.0 a 7.4. Las composiciones pueden contener además preservativos antimicrobianos, por ejemplo, parabenos, sales de amonio cuaternario, como cloruro de benzalconio, polihexametilenbiguanidina (PHMB) y similares. Las gotas para ojos pueden contener además goma de xantana para producir gotas para ojos similares a geles, y/u otros agentes para aumentar la viscosidad, como ácido hialurónico, metilcelulosa, alcohol polivinilico, o polivinilpirrolidona .

Uso de factores de transcripción artificiales en un método de tratamiento Además la invención se relaciona con factores de transcripción artificiales dirigidos al promotor del receptor de endotelina como se describió anteriormente para usarse para influir sobre la respuesta celular a la endotelina, para hacer disminuir o incrementar los niveles del receptor de endotelina, y para usarse en el tratamiento de enfermedades moduladas por la endotelina, en particular para usarse en el tratamiento de esas enfermedades de los ojos. De igual modo, la invención se relaciona con un método para tratar una enfermedad modulada por la endotelina que comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un factor de transcripción artificial dirigido al promotor del receptor de la endotelina a un paciente que necesite de lo mismo .

Las enfermedades moduladas por la endotelina son por ejemplo, enfermedades cardiovasculares como la hipertensión arterial, hipertensión pulmonar, insuficiencia cardiaca crónica, asi como la insuficiencia renal crónica. Además, antes, durante y después de la protección renal la aplicación del material radioopaco es lograda interrumpiendo la respuesta de la endotelina. Además, la esclerosis es impactada de manera negativa por el sistema de la endotelina.

Las enfermedades adicionales moduladas por la endotelina son enfermedad del riñon diabético o enfermedades de los ojos como la neurodegeneración glaucomatosa, desregulación vascular en la circulación de la sangre ocular, oclusión de la vena retinal, oclusión de la arteria retinal, edema macular, degeneración de macular relacionada con la edad, neuropatía óptica, coriorretinopatía serosa central, retinitis pigmentosa, síndrome de Susac, y neuropatía óptica hereditaria de Leber.

De igual modo, la invención se relaciona con un método para tratar una enfermedad modulada por la endotelina que comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un factor de transcripción artificial de la invención a un paciente que necesite de lo mismo. En particular, la invención se relaciona con un método para tratar la neurodegeneración glaucomatosa, desregulación vascular en la circulación sanguínea ocular, en particular con un método para tratar la oclusión de la vena retinal, oclusión de la arteria retinal, edema macular, neuropatía óptica, coriorretinopatía serosa central, retinitis pigmentosa, y neuropatía óptica hereditaria de Leber, que comprende administrar una cantidad efectiva de un factor de transcripción artificial de la invención a un paciente que necesite de lo mismo. La cantidad efectiva de un factor de transcripción artificial de la invención depende del tipo particular de enfermedad a ser tratada y de la especie, edad, peso, y condición individual, los datos farmacocinéticos individuales, y el modo de administración. Para la administración a los ojos, se prefiere una inyección vitrea mensual de 0.5 a 1 mg. Para la aplicación sistémica, se prefiere una inyección mensual de 10 mg/kg. Además, también se prefiere el implante de depósitos de liberación lenta en el humor vitreo.

Además la invención se relaciona con un factor de transcripción artificial dirigido al promotor del receptor de endotelina B como se describió anteriormente para usarse para influenciar la respuesta celular a la endotelina, para hacer disminuir o incrementar los niveles de receptores de endotelina B, y para usarse en el tratamiento de enfermedades moduladas por la endotelina, en particular, para usarse en el tratamiento de esas enfermedades. De igual modo la invención se relaciona con un método para tratar una enfermedad modulada por la endotelina que comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un factor de transcripción artificial dirigido al promotor del receptor B de endotelina a un paciente que necesite del mismo.

Las enfermedades moduladas por factores de transcripción artificiales dependientes de ET-1, mediados por ETRB son ciertos cánceres, trastornos relacionados con neurodegeneración e inflamación.

Además la invención se relaciona con un factor de transcripción artificial dirigido al promotor de TLR4 como se describió anteriormente para influenciarse para influir sobre la respuesta celular a LPS, para hacer disminuir o incrementar los niveles de TLR4, y para usarse en el tratamiento de enfermedades moduladas por LPS, en particular para usarse en el tratamiento de enfermedades de los ojos. De igual modo la invención se relaciona con un método para tratar una enfermedad modulada por LPS que comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un factor de transcripción artificial dirigida al promotor de TLR4 a un paciente que necesite del mismo. Las enfermedades moduladas por LPS son la artitis reumatoide, arterioesclerosis , psoriasis, enfermedad de Crohn, uveitis, queratitis asociada con lentes de contacto, inflamación de la córnea, resistencia de cánceres a la quimioterapia y similares .

Además la invención se relaciona con un factor de transcripción artificial dirigido al promotor de FCER1A como se describió anteriormente para usarse para influir sobre las respuesta celular a IgE o complejos de IgE-antigeno, para hacer disminuir o incrementar los niveles de FCERl, y para usarse en el tratamiento de enfermedades moduladas por IgE o complejos de IgE-antigeno, en particular para usarse en el tratamiento de enfermedades de los ojos.

De igual modo la invención se relaciona con un método para tratar una enfermedad modulada por IgE o complejos de IgE-antigeno que comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un factor de transcripción artificial dirigido al promotor de FCER1A a un paciente que necesite el mismo. Las enfermedades moduladas por IgE o complejos de IgE-antigeno son la rinitis alérgica, asma, eccema y anafiláxis y similares.

Uso de factores de transcripción artificiales en plantass Además la invención de relaciona con el uso de factores de transcripción artificiales dirigidos a receptores de plantas. Preferiblemente, el ADN que codifica para los factores de transcripción artificiales es clonado en vectores para la transformación de microorganismos que colonizan plantas o plantas. De manera alternativa, los factores de transcripción artificiales son aplicados directamente en composiciones adecuadas para aplicaciones tópicas a plantas.

Ejemplos Clonación de plásmidos de ADN Para todos los pasos de clonación, las endonucleasas de restricción y ADN ligasa T4 fueron compradas de New England Biolabs. La Fosfatasa Alcalina de Camarón (SAP) fue de Promega. La ADN Plolimerasa Pfx Platinum de alta fidelidad (Invitrogen) fue aplicada en todas las reacciones de PCR estándar. Los fragmentos de ADN plásmidos fueron agregados de acuerdo a las instrucciones del fabricante usando el equipo NucleoSpin Extract II, Equipo NucleoSpin Plásmido, o equipo NucleoBond Xtra Midi Plus (Macherey-Nagel) . Los oligonucleótidos fueron comprados de Sigma-Aldrich. Todas las secuencias de ADN relevantes de plásmido recién generados fueron verificadas por secuenciamiento (Microsynth) .

Diseño y clonación de dos proteínas de dedo de zinc hexaméricas (ZFP-855A y ZFP+74A) Para generar factores de transcripción artificiales que regulan la expresión de ETRA, se diseñó una proteina de fusión consistente de TAT-KRAB-ZFP y la secuencia de ADN optimizada por codón, correspondiente, fue obtenida a través de síntesis genética. Para la parte de ZFP de la proteína de fusión, se seleccionó la región promotora de ETRA humana (-1000 pb a +100 pb con relación al sitio de inicio de la transcripción; RefSeq DNA NG_013343) para sitios blanco de (GNN) 6 6ZFP potenciales usando el software ZiFiT (Sander J.D. et al., 2010, Nucleic Acids Res 38, W462-468; 2007, Nucleic Acids Res 35, W599-605) con los parámetros ajustados de "montaje modular" usando el llamado conjunto de "Módulos de Barbas". Para que el ZFP-855A pretendido se una al sitio blanco -855 (que comienza en -855 pb con relación al sitio de inicio de la transcripción) se construyó ZF59-ZF59-ZF72-ZF58-ZF71-ZF67 de acuerdo con Wright D.A. et al., 2006, Nat Protoc 1, 1637-1652. De igual modo ZF65-ZF62-ZF58-ZF65-ZF59-ZF59 para el ZFP+74A que se pretende se una al sitio blanco +74 (+74 pb con relación al sitio de inicio de la transcripción) .

Como dominio represor para el factor de transcripción artificial, se eligió el dominio de KRAB consistente de los aminoácidos 1-97 de la proteína KOXl humana (Beerli, R.R. et al., 1998, Proc Nati Acad Sci USA 95, 14628-14633). Para la elección del blanco nuclear, se incorporaron los aminoácidos PKKKRKV (SEQ ID NO: 167) (correspondiente al SV40 NLS) así como YKDDDDK (SEQ ID NO: 168) (marca FLAG) en la proteína de fusión. Los genes sintéticos que codifican para XhoI-NcoI-KRAB-NLS-FLAG-Spel-ZFP-855A-JíindIII y SpeI-ZFP+74A-Hir¡dIII (para reemplazar ZFP- ß 855A con ZFP+74A) fueron optimizados por codón y sintetizados por GenScript. El KRAB-NLS-FLAG- ZFP-855A y KRAB-NLS-FLAG-ZFP+74A insertados en pcDNA3 (-) (Invitrogen) después de cortar ambos insertos y el vector con Xhol /HindIII , dando como resultado pAN1021 y pAN1022, respectivamente.

Clonación de bibliotecas de proteínas de dedo de zinc hexamérica para plásmidos Varias bibliotecas de proteínas de dedo de zinc hexaméricas que contienen módulos de dedo de zinc (ZF) que se unen a GNN y/o CNN fueron clonadas de acuerdo con González B. et al., 2010, Nat Protoc 5, 791-810, con las siguientes mejoras. Las secuencias de ADN que codifican para los módulos de ZF GNN y CNN fueron sintetizadas e insertadas en pUC57 (GenScript) dando como resultado pANl049 y pAN1073, respectivamente. El montaje por paso de las bibliotecas de ZFP fue efectuado en el vector pBluescript SK (+) vector. Para evitar la inserción de módulos de ZF múltiples durante cada paso de clonación individual conduzca a proteínas no funcionales, el pBluescript (y sus productos derivados que contienen 1ZFP, 2ZFPs, o 3ZFPs) y pAN1049 o pAN1073 fueron incubados primero con una enzima de restricción y posteriormente tratados con SAP. Las enzimas fueron removidas con el equipo NucleoSpin Extract II antes de que fuese agregada la segunda endonucleasa de restricción.

La clonación de pBluescript-lZFPL fue efectuada tratando 5 g de pBluescript con Xhol, SAP y posteriormente Spel. Los injertos fueron generados incubando 10 µg de pAN1049 (liberación de 16 módulos de ZF GNN diferentes) o pAN1073 (liberación de 15 módulos de ZF CNN diferentes) con Spel, SAP y posteriormente Xhol. Para la generación del pBluescript-2ZFPL y pBluescript-3ZFPL, fueron cortados 7 µg de pBluescript-lZFPL o pBluescript-2ZFPL con Agel, desfosforilados y cortados con Spel. Los insertos fueron obtenidos aplicando Spel, SAP, y posteriormente Xmal a 10 µg de pAN1049 o pAN1073, respectivamente. La clonación del pBluescript-6ZFPL fue efectuada tratando 6 g de pBluescript-3ZFPL con Agel, SAP, y posteriormente Spel para obtener vectores cortados. Los insertos de 3ZFPL fueron liberados del pBluescript-3ZFPL incubando con Spel, SAP, y posteriormente Xmal .

Las reacciones de ligación para las bibliotecas que contienen uno, dos y tres ZFPs fueron ajustadas a una relación molar 3:1 de vector de inserción usando 200 ng de vector cortado, 400 U de ADN ligasa T4 en 20 µ? de volumen total a temperatura ambiente TA (temperatura ambiente) durante la noche. Las reacciones de ligación de las bibliotecas de proteínas de dedo de zinc hexamérica incluyeron 2000 ng de pBluescript-3ZFPL, 500 ng de inserto 3ZFPL, 4000 U de ADN ligasa T4 en 200 µ? de volumen total, los cuales fueron divididos diez veces en 20 µ? e incubados por separado a Ta durante la noche. Las porciones de las reacciones de ligación fueron transformadas en Escherichia coli por varios métodos dependiendo del número de clonas requeridas para cada biblioteca. Para la generación de pBluescript-lZFPL y pBluescript-2ZFPL, fueron usados directamente 3 µ? de reacción de ligación para la transformación por choque térmico de E. coli NEB 5-alfa. Las reacciones de ligación de pBluescript-3ZFPL fueron desalinizadas por diálisis durante 1 hora contra H20 de ADN usando filtros de VMWP de 0.05 µp? (Millipore) antes de la transformación en E. coli NEB 5-alfa electrocompetentes (electroporador EasyjecT Plus de EquiBio, cubetas de electroporación de 2.5 kV y 25 µG, 2 mm de Bio-Rad) . Las reacciones de ligación de las bibliotecas de pBluescript-6ZFP fueron aplicadas al equipo NucleoSpin Extract II y el ADN fue eluido en 15 µ? de agua desionizada. Se mezclaron aproximadamente 60 ng de ADN desalinizado con 50 µ? de E. coli electrocompetente NEB 10-beta (New England Biolabs) y la electroporación fue efectuada de acuerdo a lo mencionado por el fabricante usando EasyjecT Plus, 2.5 kV, 25 ]iF y cubetas de electroporación de 2 mm.

Fueron efectuadas electroporaciones múltiples para cada biblioteca y las células fueron reunidas agruparon directamente después de incrementar el tamaño de la biblioteca. Después de la transformación por choque térmico o electroporación, se aplicó medio SOC a las bacterias y después de 1 h de incubación a 37°C y 250 rpm, se usaron 30 µ? de cultivo SOC para diluciones en serie y cultivando sobre placas de LB que contenían ampicilina. Al siguiente día, se determinó el número total de clonas de la biblioteca obtenidas. Además, fueron elegidas diez clonas de cada biblioteca para aislar ADN plasmídico y para verificar la incorporación de insertos por digestión con enzimas de restricción. Al menos tres de esos plásmidos fueron secuenciados para verificar la diversidad de la biblioteca. El cultivo de SOC restante fue transferido a 100 mi de medio LB que contenía ampicilina y cultivados durante la noche a 37 °C y 250 rpm. Aquellas células fueron usadas para preparar ADN de Midi Plasmídico de cada biblioteca.

Para selecciones híbridas de una levadura, fueron transferidas bibliotecas de proteínas dedo de zinc hexaméricas a un vector presa compatible. Para ese propósito, el sitio de clonación múltiple de pGADlO (Clontech) fue modificado cultivando el vector con Xhol/EcoRI e insertando oligonucleótido OAN971 (TCGACAGGCCCAGGCGGCCCTCGAGGATATCATGATG ACTAGTGGCCAGGCCGGCCC, SEQ ID NO: 169) y OAN972 (AATTGGGCCGGC CTGGCCACTAGTCATCATGATATCCTCGAGGGCCGCCTGGGCCTG, SEQ ID NO: 170) . El vector resultante pAN1025 fue cortado y desfosforilado, los insertos de biblioteca 6ZFP fueron liberados del pBluescript-6ZFPL por Xhol/Spel. Las reacciones de ligación y electroforesis en E. coli electrocompetente 10-beta de NEB fueron efectuadas como describió anteriormente para la biblioteca de pBluescript-6ZFP .

Para las selecciones híbridas de una levadura con incremento de la sensibilidad, las bibliotecas de 6ZFP fueron transferidas en vector presa compatible. Para ese propósito, se ligó un fragmento Sphl de 1460bp de pAN1025 en pAN1373, un pRS315 modificado (Sikorski, R.S. y Hieter, P., 1989, Genetics 122 (1), 19-27) donde un fragmento de NarI, Apal fue reemplazado por oligonucleótidos recocidos OAN1143 (CGCCGCATGCATTCATGCAGGCC, SEQ ID NO: 200) y OAN1144 (TGCATGAATGCATGCGG, la SEQ ID NO: 201) . Esta modificación dio como resultado un vector híbrido de una levadura que contiene una baja copia de ARS/CEN en comparación con una alta copia de 2 µ de origen de replicacion compatible con el esquema de clonación de biblioteca descrito anteriormente.

Clonación de la región promotora del receptor para el ensayo de luciferasa y fosfatasa alcalina secretadas combinadas Fragmentos de ADN que contenían las regiones promotoras de ETRA, ETRB, TLR4 o FCER1A fueron clonados en pAN1485 (NEG-PG04, GeneCopeia) o pAN1486 (EFla-PG04, GeneCopeia) dando como resulto plásmidos reporteros que contenían luciferasa de Gaussia secretada bajo el control de un promotor de receptor y fosfatasa alcalina secretada bajo el control del promotor de CMV constitutivo permitiendo la normalización de la señal de luciferasa fosfatasa alcalina. En detalle, el promotor de ETRA fue aplicado de ADN genómico humano usando OAN981 (AATCGCGAGCTCCTTAAGAAACTGGCAGCTTCCACTT, SEQ ID NO: 202) y OAN982 ( ATCGCCTCGAGCTGCCGGGTCCGCGCGGCG, SEQ ID NO: 203) y clonado con Sacl/Xhol en pBluescript dando como resultado pAN1031. El promotor de ETRA fue cortado de pAN1031 usando XhoI/Klenow/BamHI y clonado en pAN1486 cortado con HindIII/KIenow/Bg/II dando como resultado pAN1492. El promotor de ETRB fue amplificado de ADN genómico humano usando OAN1232 (GCTAGCTGTCGACACATGGTGCGTGATAACTTGCCC, SEQ ID NO: 204) y OAN1233 (GCTAGCTGGTACCAGGCCTGCTGCTACCTG CTCCAGAAGGC, SEQ ID NO: 205) y clonado con Sacl/Kpnl en pBluescript dando como resultado pAN1432. El promotor de ETRB fue cortado de pAN1432 StuI/EcoRI y clonado en pAN1486 cortado con ífindIII KIenow/EcoRI dando como resultado pAN1489. El promotor de TLR4 fue amplificado de ADN genómico humano usando OAN1234 (GCTAGCTGTCGACATAAGCCAGTGACAAAAAGAT ACATAC, SEQ ID NO: 206) y OAN1235 (GCTAGCTGGTACCAGG CCTTATTTGATCTCTGTGGCTTCTTGAG, SEQ ID NO: 207) y clonado con Sall/Kpnl en pBluescript dando como resultado pAN1433. El fragmento promotor de TLR4 fue cortado de pAN1433 Stul/BamHI y clonado en . pAN1486 con tfindIII/Klenow/Bg/II dando como resultado pANl491. Otro promotor de TLR4 fue amplificado de pAN1491 usando OAN1249 (CTAGCTGATATCAGCTTAGCGGTTTAC ATGACTTGAC, SEQ ID NO: 208) y OAN1250 (CTAGCTAAGCTTCACGCAGGA GAGGAAGGCCATG, SEQ ID NO: 209) y clonado con EcoRV/fííndlII en pAN1486 dando como resultado pAN1509. El promotor de FCER1A fue amplificado de ADN genómico humano usando OAN1236 (GCTAGCTGTCGACTTAAATTCCTATTTATTAACCTTTTTAGC, SEQ ID NO: 210) y OAN1237 (GCTAGCTGGTACCAGGCCTGTCACCACCCACAGTAAAGGTTC, SEQ ID NO: 211) y clonado con Sacl/Kpnl en pBluescript dando como resultado pAN1434. El promotor de FCER1A fue cortado de pAN1434 con StuI/EcoRI y clonado en pAN1486 HindIII/KIenow/EcoRI dando como resultado pANl490. El promotor de FCER1A fue amplificado de pAN1490 usando OAN1261 (CTAGCTGATATCGCTAGCCATGCTCCTGAATATGTAT, SEQ ID NO: 212) y OAN1262 ( CTAGCTAAGCTTGGCAGGAGCCCTCTTCTTCATGGACTCCTGG, SEQ ID NO: 213) y clonado con EcoRV/JíindIII en pAN1485 dando como resultado pAN1515.

Clonación de plásmidos cebo Para cada plásmido cebo, se usaron un sitio blanco de 18 pb flanqueado por 21 pb tomadas de la secuencia corriente arriba y corriente debajo de la región promotora de ETRA, ETRB, TLR4 o FCER1A. Se incluyó un sitio Ncol para el análisis por restricción. Los oligonucleótidos fueron diseñados y recocidos de tal manera que produjeran sitios 5' HindIII y 3' Xhol los cuales permitieron la ligación directa en pAbAi (Clontech, ) cortado con HindIII /Xhol (Tabla 5) .

Tabla 5: Oligonucleótidos usados para clonar sitios blanco un vector pAbAi ETRB Clonación de factores de transcripción artificiales para transfección en mamíferos .

Para la generación del fragmento de DNA amplificó la marca X aI-£coRV-NNNNNN-XhoI-NNNNNN-AgeI-3xmyc-STOP-Notl-EcoRI, 3xmyc de pWS250 con ADN polimerasa Platinum Pfx, OAN1032 (AATCGCTCTAGAGATATCATATATCTCGAGATATATACCGGT GAGCAGAAACTCATCTCTG, SEQ ID NO: 203), y OAN1033 (GCGATTGAATTCGC GGCCGCTTACAGATCTTCCTCAGAGA, SEQ ID NO: 204), cortado con Xbal/EcoRI , ligado en pcDNA3(-) cortado con Xbal/EcoRI, dando como resultado pAN1109. El KRAB-NLS fue amplificado de pAN1021 usando ADN Polimerasa Platinum Pfx, OAN1034 (AATCGCGATATCATGGATG CTAAGTCCCTGA, SEQ ID NO: 205), y OAN1035 (GCGATTCTCGAGCCCCACTTTA CGTTTCTTTT, SEQ ID NO: 206) . El producto de la PCR fue cortado con EcoRV/Xhol y ligado en pAN1109 cortado con EcoRV/Xhol dando como resultado el pANlllO .

La secuencia de ADN de ZFP-855A fue amplificada de pAN1021 con ADN polimerasa Platinum Pfx, OAN1036 (AATCGCCTCGAGCCCGGGCCGGGTGAAAAGCCCTAT, SEQ ID NO: 207), OAN1037 (GCGATTACCGGTCTGTGCTGATGAGCCCC, SEQ ID NO: 208), digerido con Xhol/Agel y clonado en pANlllO cortado con Xhol/Agel para producir pANllll. De manera similar, el ZFP+74A fue amplificado de pAN1022 con OAN1038 (AATCGCCTC GAGCCCGGGCCAGGCGAAAAGCCCTAC, SEQ ID NO: 209) y OAN1039 (GCGATTA CCGGTCTGTGCTGAACTACCGCC, SEQ ID NO: 210), clonado en pANlllO y dando como resultado pAN1112.

ZFP-855A de pANllll fue reemplazado por los 6ZFPs apropiados (identificados por la selección híbrida de una levadura) usando la digestión con Xhol/Agel, por .ejemplo por ZFP-855C dando como resultado pAN1133.

Además, fue generado SID-NLS (el SID corresponde a los aminoácidos 1-36 del dominio de interacción Mad mSin3 de acuerdo con Beerli, R.R. et al., 1998, Proc Nati Acad Sci U S A 95, 14628-14633) recociendo OAN1096 (AATCGCGATATCATGGCGGCGGCGGTTCGG ATGAACATCCAGATGCTGCTGGA, SEQ ID NO: 211), OAN1097 (ATCCAGATGCTGCT GGAGGCGGCCGACTATCTGGAGCGGCGGGAGAGAGAAGCT, SEQ ID NO: 212), OAN1098 (GGTATGGTAACATGGAGGCATAACCATGTTCAGCTTCTCTCTCCCGC, SEQ ID NO: 213), OAN1099 (GCGATTCTCGAGCCCCACTTTACGTTTCTTTTTCGGGT ATGGTAACATGGAGG, SEQ ID NO: 214) en un primer paso de síntesis de ADN usando ADN polimerasa Platinum Pfx. Una alícuota de este producto de PCR puede ser usada como molde para el segundo paso de síntesis de ADN con ADN polimerasa Platinum Pfx, OAN1096, y OAN1099. El segundo producto de la PCR cortado con XhoI/EcoKV y usado para reemplazar KRAB-NLS en pANllll cortado con Xhol/EcoRV. El plásmido resultante pANl208 fue usado para reemplazar ZFP-855A con cualquier 6ZFP de selecciones de YIH después del tratamiento con Xhol/Agel.

Además, el orden de los dominios de proteína fue rearreglado de acuerdo con Gommans, W.M. et al., 2007, Mol Carcinog 46, 391-401 con el N-terminal seguido por NLS 6ZFP, la secuencia enlazante GGSGGS (SEQ ID NO: 9) , los aminoácidos 11-55 de KRAB humana y marca 3xmyc C-terminal. Primero, fue generado el fragmento de ADN AgeI-£coRI-NNNNNN-£amHI-3xmyc-STOP-Notl-fíindlII por PCR con pAN1133 como molde, ADN polimerasa Platinum Pfx, OAN1100 (GCGATTACCGGTGAATTCATATATGGATCCGAGCAGAAA CTCATCTCT, SEQ ID NO: 215), OAN1101 (GCGATTAAGCTTGCGGCCGCTTACAG ATCTTCCTCAGAGA, SEQ ID NO: 216), cortado con Agel/ffindlII, ligado en pAN1109 cortado con Agel/fíindlII produciendo pAN1183. El segundo lugar, fue creado el EcoRI enlazante de EcoRV-ATG-NLS- hoI-XmaI-ZFP-855C-AgeI-GGSGGS por PCR con pAN1133 como molde, ADN Polimerasa Pfx, OAN1104 (GCGATTGATATC ATGCCGAAAAAGAAACGTAAAG, SEQ ID NO: 217), OAN1105 (GCGATTGAATTCGCTGCCGCCGCTGCCGCCACCGG TATGAGTCCTCT, SEQ ID NO: 218) e insertado en pAN1183 usando la clonación con £coRI/£coRV para producir pAN1184. El tercer lugar, los aminoácidos 11-55 de KRAB humano fueron amplificados de pAN1133 con ADN Polimerasa Platinum Pfx, OAN1106 (GCGATTGAATTCC GCACACTGGTTACCT, SEQ ID NO: 219), OAN1107 (GCGATTGGATCCATAGCC CAGGCTAACC, SEQ ID NO: 220), cortado con EcoRI/Bamñl y ligado en pANH84 cortado con EcoRI/BamHI. El plásmido final pAN1185 fue usado para reemplazar ZFP-855C con cualquier 6ZFP de las selecciones de Y1H cortando con Xhol/Agél.

Para la clonación de ATFs activantes en dominio de KRAB en el C-terminal fue reemplazado por la secuencia que codifica para VP64 cortando con .EcoRI/BamHI e insertado un OAN1253 (SEQ ID NO: 221), OAN1254 (SEQ ID NO: 222), OAN1255 (SEQ ID NO: 223) y OAN1256 (SEQ ID NO: 224) recocido.

Selección del híbrido uno de levadura modificado (Y1H) Cepa de levadura y medios La Saccharomyces cerevisiae Y1H Gold fue comprada de Clontech, el medio YPD y agar YPD de Cari Roth. El medio de caída sintético (SD) contenía glucosa 20 g/1, Na2HP04 -2H20 6.8 g/1, NaH2P0 ·2?20 9.7 g/1 (todos de Cari Roth), suplementos de medio de caída sintéticos de levadura 1.4 g/1, base de nitrógeno de levadura 6.7 g/1, L-triptofano 0.1 g/1, L-leucina 0.1 g/1, L-adenina 0.05 g/1, L-histidina 0.05 g/1, uracilo 0.05 g/1 (todos de Sigma-Aldrich) . El medio SD-U contenía todos los componentes excepto uracilo, el SD-L fue preparado sin L-leucina. Las placas de agar SD no contenían fosfato de sodio, sino Agar Bacto (BD) 16 g/1. La Aureobasidina A (AbA) fue comprada de Clontech.

Preparación de las cepas de levadura cebo Aproximadamente 5 µg de cada plásmido cebo fueron linealizados con BstBI en un volumen total de 20 µ? y la mitad de la mezcla de reacción fue usada directamente para la transformación por choque térmico de S. cerevisiae Y1H Gold. Las células de levadura fueron usadas para inocular 5 mi de medio YPD un día antes de la transformación y se dejó crecer durante la noche en un rodillo ATA. Se diluyó un milímetro de este precultivo 1:20 con medio YPD fresco y se incubó a 30 °C, 225 rpm durante 2-3 h. Por cada reacción de transformación se cosechó un 1 DC>6oo por centrifugación, las células de levadura fueron lavadas una vez con 1 mi de agua estéril y una vez con 1 mi de TE/LiAc (Tris/HCl 10 mM, pH 7.5, EDTA 1 mM, acetato de litio 100 mM) . Finalmente, las células de levadura fueron suspendidas en 50 µ? de TE/LiAc y mezcladas con 50 µg de ADN de testículos de salmón de una sola hebra ( Sigma-Aldrich) , 10 µ? de plásmido cebo linealizado con BstBI (véase más arriba), y 300 µ? de PEG/TE/LiAc (Tris/HCl 10 mM, pH 7.5, 1 mM EDTA, acetato de litio 100 mM, 50% (p/v) de PEG 3350) . Las células y ADN fueron incubados en un rodillo durante 20 min a TA, posteriormente colocadas en un baño de agua a 42°C durante 15 min. Finalmente, las células de levadura fueron recolectadas por centrifugación, resuspendidas en 100 µ? de agua estéril y propagadas sobre placas de agar SD-U. Después de 3 días de incubación a 30°C fueron elegidas ocho clonas en crecimiento sobre SD-U de cada reacción de transformación para analizar su sensibilidad hacia la Aureobasidina A (AbA) . El precultivo se dejó crecer durante la noche sobre un rodillo a TA. Por cada cultivo, se midió la D060o y la D06oo=0-3 ajustada con agua estéril. De esta primera dilución fueron preparados cinco pasos de dilución 1/10 adicionales con agua estéril. Por cada clona de 5 µ? de cada paso de dilución se colocaron puntos sobre placas de agar que contenían SD-U, AbA SD-U 100 ng/ml, AbA SD-U 150 ng/ml, y AbA SD-U 200 ng/ml. Después de incubar durante 3 días a 30 °C, tres clonas crecieron bien sobre SD-U y al ser las más sensibles a AbA fueron elegidas para análisis adicional. La integración estable del plásmido cebo en el genoma de levadura fue verificada por (Clontech) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se usaron de una a tres clonas para la selección de Y1H subsecuente.

Transformación de la cepa de levadura cebo con biblioteca de proteína de dedo de zinc hexamérica 50 µ? de cultivo de cepa cebo de levadura fueron diluidos en 100 mi de medio de YPD e incubados a 30 °C y 225 rpm hasta ??d??^? · 6_2.0 (circa 20 h) . Las células fueron recolectadas por centrifugación en un rotor giratorio (5 min, 1500xg, 4°C). La preparación de las células electrocompetentes fue efectuada de acuerdo a Benatuil L. et al., 2010, Protein Eng Des Sel 23, 155-159. Para cada reacción de transformación, se mezclaron 400 µ? de células de levadura de cebo electrocompetentes con 1 de bibliotecas de 6ZFP que codifican para plásmidos presa e incubados sobre hielo durante 3 min. La suspensión célula-ADN fue transferida a una cubeta de electroporación de 2 mm preenfriada. Después de la electroporación (electroporador EasyjecT Plus, 2.5 kV y 25 µ? las células de levadura fueron transferidas a 8 mi de una mezcla de 1:1 de YPD: Sorbitol 1 M e incubadas a 30 °C y 225 rpm durante 90 min. Las células fueron recolectadas por centrifugación y resuspendidas en 1 mi de medio de SD-L. alícuotas de 50 µ? fueron esparcidas sobre placas de agar de SD-L de 10 cm que contenían 1000-4000 ng/ml de AbA. Además, se usaron 50 µ? de suspensión celular para producir diluciones 1/100 y 1/1000 y 50 µ? de células sin diluir y diluidas fueron cultivadas sobre SD-L. Todas las placas fueron incubadas a 30 °C durante 3 días. El número total de clonas obtenidas fue calculado a partir de las placas con transformantes diluidos. Mientras que las placas de SD-L con células sin diluir indican crecimiento de todos los transformantes. Las placas de SD-L que contienen AbA únicamente dieron como resultado formación de colonias si 6ZFP presa se une a su sitio blanco cebo exitosamente.

Verificación de las interacciones positivas y recuperación de los plásmidos presa que codifican para 6ZFP Para el análisis inicial, se tomaron cuarenta colonias de buen tamaño de placas de SD-L que contenían la concentración de AbA más alta y las células de levadura fueron rayadas nuevamente dos veces sobre SD-L con 3000-4000 ng/ml de AbA para obtener colonias individuales. Por cada clona, se usó una colonia para inocular 5 mi de medio SD-L y las células se dejaron crecer a TA durante la noche. Al siguiente día, se ajustó la D060o=0 · 3 con agua estéril, se prepararon cinco diluciones 1/10 adicionales y 5 µ? de cada paso de dilución fueron colocados como puntos sobre las placas de SD-L, AbA SD-L 1000 ng/ml, AbA SD-L 1500 ng/ml, AbA SD-L 2000 ng/ml, AbA SD-L 3000 ng/ml, y AbA SD-L 4000 ng/ml. Las clonas fueron calificadas de acuerdo a su capacidad para crecer sobre concentraciones de AbA altas. De las clonas que crecieron mejor se usaron 5 mi de precultivo de SD-L-inicial para centrifugar las células y para resuspenderlas en 100 µ? de agua o medio residual. Después de la adición de 50 U de liticasa ( Sigma-Aldrich, L2524) las células fueron incubadas durante 1 h a 30°C y 300 rpm sobre un agitador horizontal. Los esferoblastos generados fueron diluidos con 250 µ? de amortiguador Al del equipo NucleoSpin Plasmid, se agregó la punta de una espátula de perlas de vidrio (Sigma-Aldrich, G8772) y los tubos fueron mezclados vigorosamente por agitación vorticial durante 20 s. Se dejó que las perlas de vidrio sedimentaran y se transfirieron 250 µ? de sobrenadante al tubo fresco y se usaron para continuar con el protocolo del equipo NucleoSpin Plasmid estándar. Después de la elución con 50 µ? de de amortiguador de elución se transformaron 5 µ? de ADN plasmídico en E. coli DH5 alfa por transformación de choque térmico o electroporación . Fueron tomadas dos clonas individuales de placas de LB que contenían ampicilina, fueron aislados los plásmidos y los insertos de biblioteca secuenciados . Los resultados obtenidos fueron analizados por las secuencias de consenso de acuerdo con los 6ZFPs para cada sitio blanco.

Cultivo y transfecciones celulares Las células HeLa se hicieron crecer en Medio de Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado con glucosa 4.5 g/1, 10% de suero bobino fetal inactivado con calor, L-glutamina 2 mM, y piruvato de sodio 1 mM (todos de Sigma-Aldrich) en 5% C02 a 37 °C. Para el ensayo del receptor de luciferasa, fueron sembradas 7000 células HeLa/pozo en placas de 96 pozos. Al siguiente día, fueron efectuadas las cotransfecciones usando el reactivo de transfección Effectene (Qiagen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se usaron preparaciones Plasmid Midi que codifican para el factor de transcripción artificial y para luciferasa en una relación de 3:1. El medio fue reemplazado por 100 µ? por pozo de DMEM fresco 6 h y 24 h después de la transfección. Las células U937 (Sigma) y KU812F (Sigma) se hicieron crecer en medios RMPI-1640 suplementados con FBS 10%, glutamina 2 mM, y piruvato de sodio 1 mM. Las células U937 y KU812F fueron transfectadas por nucleofección usando el equipo Cell Line Nucleofector C (Amaxa) o el equipo Cell Line Nucleofector T (Amaxa) de acuerdo con las sugerencias del fabricante. Las células RBL-2H3 (DSMZ) se dejaron crecer en 70% de MEM/20% de RMPI-1640/10% de FBS inactivado con calor suplementado con glutamina 2 mM y piruvato 1 mM. Las células RBL-2H3 fueron nucleofectadas usando el equipo Cell line nucleofector T (Amaxa) .

Las células de músculo liso uterino humano primaria (hUtSMCs, PromoCell) se dejaron crecer de acuerdo con la sugerencias del distribuidor usando el medio de crecimiento de células de músculo liso 2.

Ensayo de la actividad de luciferasa/promotor de SEAP combinado Las células de HeLa o RBL-2H3 fueron cotransfectadas con un constructo de expresión de factor de transcripción artificial y un plásmido que contiene luciferasa de Gaussia secretada bajo el control del promotor de ETRA, ETRB, TLR4 o FCER1 y fosfatasa alcalina secretada bajo el control del promotor de CMV constitutivo (Secrete-Pair Dual Luminiscence Assay, GeneCopeia, Rockville, MD) . Dos días después de la transfección, los sobrenadantes del cultivo celular fueron recolectados y la actividad de luciferasa y actividad de SEAP fueron medidas usando el ensayo de luminiscencia Secrete-Pair Dual (GeneCopoeia) o el ensayo de gen reportero de SEAP (Roche) . La cotransfección de YFP-N1 (Clontech) en lugar de un constructo de expresión de factor de transcripción artificial sirvió como control. La actividad de luciferasa fue normalizada a la actividad de SEAP y expresada como porcentaje del control.

Ensayo de contracción de la retícula de células de músculo liso uterinas humanas (hütSMC) 250 µ? de colágeno bovino estéril (3.1 mg/ml; # 5005-B Nutacon) fueron mezclados con 30 µ? lOxPBS y 22.5 µ? de NaOH 0.1 N para alcanzar un de pH 7.4. Se agregaron 25000 hütSMCs en 200 µ? de medios SMC 2 del colágeno neutralizado, se mezcló suavemente, se transfirió a una placa de cultivo tisular de 24 pozos y se dejó polimerizar a 37°C, 5% de CO2 durante 45 minutos. Después la polimerización, se agregaron 500 µ? de medios crecimiento SMC 2. Para el tratamiento con factor de transcripción artificial, se agregó 1 µ? de A074V o una cantidad apropiada de amortiguador como control después de la polimerización y nuevamente después de 24 y 48 horas. 72 horas después de la polimerización, las retículas fueron desprendidas de la pared del vaso agitando suavemente o con la ayuda de una espátula y se agregaron 100 nM de ET-1 control de amortiguador. Las retículas fueron desplegadas y el área de retícula fue determinada por análisis de imágenes usando el software ImageJ.

Detección de IL-6 Fueron nucleofectadas lxlO6 células U937 con plásmidos de expresión para factores de transcripción artificiales específicos para TLR4 o vector control de conformidad con la recomendación del fabricante (Amaxa) . 1.25xl05 células de cada nucleofección fueron transferidas a placas de 12 pozos y estimuladas durante 48 horas con 100 nM de forbol-12-miristato-13-acetato (PMA, Sigma) antes de la estimulación con concentraciones de LPS variables durante 8 horas. La concentración de IL-ß fue analizada en los sobrenadantes de cultivo celular usando ELISA de IL-6 (Orgenium) de conformidad con la recomendación del fabricante .

Determinación fluj ocitométrica de la capacidad de unión de IgE Para determinar la unión de la IgE a las células KU812F, fueron lavadas 1 x 106 células una vez en 2 mi de amortiguador de FACS (ix PBS, 2% FBS) antes de resuspender en 0.5 mi de amortiguador de FACS. Se inocularon 2 x 105 células con 10 µg/ml de IgE humano (Abcam) durante 30 minutos, lavadas una vez con 500 µ? de amortiguador de FACS antes de la adición de anti IgE humana de ratón marcado con FITC (5 \ig/ l, Abcam) durante 30 minutos. Las muestras fueron lavadas una vez con 500 µ? de amotiguador de FACS y resuspendidas en 700 µ? de amortiguador de FACS. Las muestras fueron analizadas por citometria de flujo (Cyan ADP, Beckman Coulter) . Las células no teñidas y las células tratadas únicamente con anti IgE humana de ratón marcado con FITC fueron usadas como controles.

Determinación de la proliferación celular usando el ensayo MTS. 7000 células HeLa o hUtSMCs fueron sembradas en placas de 96 pozos en 100 µ? de medios y tratadas con factores de transcripción artificiales específicos o controles de amortiguador apropiados durante 48 o 72 horas, respectivamente. Para determinar la proliferación celular, se usó el ensayo de proliferación celular no radiactivo acuoso CellTiter 96 (Promega) de conformidad con las recomendaciones del fabricante. Los experimentos efectuados por triplicado fueron repetidos independientemente al menos tres veces.

Producción de proteina de factor de transcripción artificial E. coli BL21 (DE3) transformada con plásmido de expresión para un factor de transcripción artificial dado se hicieron crecer en 1 1 de medio LB suplementado con 100 µ? de ZnCl2 hasta una DOs0o de entre 08 y 1, y se indujo con 1 mM de IPTG durante dos horas. Las bacterias fueron cosechadas por centrifugación, el lisado bacterial fue preparado por sonicación, y los cuerpos de inclusión fueron purificados.

Hasta este punto, los cuerpos de inclusión fueron recolectados por centrifugación (5000 g, 4°C, 15 minutos) y lavados tres veces en 20 mi de amortiguador de unión (HEPES 50 mM, NaCl 500 mM, imidazol 10 p??, pH 7.5). Los cuerpos de inclusión purificados fueron solubilizados sobre hielo durante una hora en 30 mi de amortiguador de unión A (HEPES 50 mM, NaCl 500 mM, imidazol 10 mM, GuHCl 6M, pH 7.5). Los cuerpos de inclusión solubilizados fueron centrifugados durante 40 minutos a 4°C y 13000 g y filtrados a través de un filtro PVDF de 0.45 µp?. Los factores de transcripción artificiales marcados con His fueron purificados usando columnas His-Trap en un (GeHealthcare) usando amortiguador de unión A y amortiguador de elución B (HEPES 50 mM, NaCl 500 mM, imidazol 500 mM, GuHCl 6M, pH 7.5). Las fracciones que contenían factor de transcripción artificial purificado fueron reunidas y dializadas a 4°C durante la noche con amortiguador S (Tris-HCl 50 mM, NaCl 500 mM, arginina 200 mM, ZnCl2 100 mM, GSH 5 mM, GSSG 0.5 mM, glicerol al 50 %, pH 7.5) en el caso de que el factor de transcripción artificial contenga un dominio de SID, o contra amortiguador K (Tris-HCl 50 mM, NaCl 300 mM, arginina 500 mM, ZnCl2 100 mM, GSH 5 mM, GSSG 0.5 mM, glicerol al 50%, pH 8.5) para el dominio KRAB que contiene factores de transcripción artificiales. Después del análisis, las muestras de proteínas fueron centrifugadas a 14000 rpm durante 30 minutos a 4 °C y filtradas de manera estéril usando puntas de filtro Millex-GV 0.22 0,22 µp? (Millipore) .

Análisis estadístico El análisis estadístico fue efectuado empleando la prueba t de Student, donde fue apropiado (Excel, Microsoft Cooperation) o un modelo univariado lineal general usando SPSS (IBM) . Todos los experimentos mostrados son los promedios de tres experimentos independientes con las barras de error representando la DEM.

Claims (26)

REIVINDICACIONES

1. Un factor de transcripción artificial que comprende una proteina de dedo de zinc polidactilica dirigida específicamente a un promotor de gen receptor fusionado a un dominio de proteína inhibidor o activador, una secuencia de localización nuclear, y un dominio de transducción.

2. El factor de transcripción artificial de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el promotor del gen receptor es el promotor del receptor A de la endotelina.

3. El factor de transcripción artificial de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el promotor del gen receptor es el promotor del receptor B de la endotelina .

4. El factor de transcripción artificial de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el promotor del gen del receptor es el promotor del receptor 4 similar a Toll.

5. El factor de transcripción artificial de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el promotor del gen del receptor es el promotor FCERIA.

6. El factor de transcripción artificial de conformidad con la reivindicación 1, 2, 3, 4 ó 5, caracterizado porque comprende una proteína de dedo de zinc hexamérica .

7. El factor de transcripción artificial de conformidad con la reivindicación 2, 3, 4 ó 5, caracterizado porque comprende una proteina de dedo de zinc de una secuencia promotora seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 31 a SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39 a SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45 a SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54 a SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59 a SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66 a SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82 a SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 97 a SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 120 a SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 138 a SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 145 a SEQ ID NO: 153, SEQ ID NO: 155 a SEQ ID NO: 164, SEQ ID NO: 166 a SEQ ID NO: 173, SEQ ID NO: 175 a SEQ ID NO: 181, y SEQ ID NO: 183 a SEQ ID NO: 191.

8. El factor de transcripción artificial de conformidad con la reivindicación 2, 3, 4 ó 5, caracterizado porque comprende una proteina de dedo de zinc de una secuencia de proteina seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO 56, 83, 85, 101, 114, 118, 127, 133, 140, 142, 146, 147, 156, 159, 175, y 181.

9. El factor de transcripción artificial de conformidad con la reivindicación 2, 3, 4 ó 5, caracterizado porque comprende un promotor de dedo de zinc de la SEC ID No 118, 133, 156, o 175.

10. El factor de transcripción artificial de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque la proteina con dedo de zinc está fusionada a un dominio de proteina inhibidora.

11. El factor de transcripción artificial de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque el dominio de proteina inhibidor es el KRAB N-terminal de la SEQ ID NO: 1, el KRAB C-terminal de la SEQ ID NO: 2, el SID de la SEC ID No: 3, o el ERD de SEQ ID NO: 4.

12. El factor de transcripción artificial de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque la proteina de dedos de zinc se fusiona a un dominio de proteina activador.

13. El factor de transcripción artificial de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque el dominio de proteina activador es VP16 de la SEQ ID NO: 5 o VP64 de SEQ ID NO: 6.

14. El factor de transcripción artificial de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, caracterizado porque las secuencias de localización nuclear son un grupo de aminoácidos básicos que contienen la secuencia de consenso K-K/R-X-K/R o SV40 NLS de la SEC ID NO: 196.

15. El factor de transcripción artificial de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, caracterizado porque el dominio de transducción de proteina es el péptido TAT derivado de VIH de la SEQ ID NO: 7, el péptido VP22 de HSV-1, el péptido sintético mT02 de la SEQ ID NO: 192, el péptido sintético mt03 de la SEQ ID NO: 193, el péptido R9 de la SEQ ID NO: 194, el dominio de ANTP, o el antigeno protector/factor letal N terminal DPT.

16. Un factor de transcripción artificial, caracterizado porque comprende una proteina de dedo de zinc polidactilica dirigida específicamente al promotor del receptor A de endotelina fusionado a un dominio de proteína inhibidor o activador y una secuencia de localización nuclear .

17. Un factor de transcripción artificial, caracterizado porque comprende una proteína de dedo de zinc polidactilica dirigida específicamente al promotor del receptor B de endotelina fusionado a un dominio de proteína inhibidor o activador y una secuencia de localización nuclear .

18. Un factor de transcripción artificial, caracterizado porque comprende una proteína de dedo de zinc polidactilica dirigida específicamente al promotor del receptor 4 similar a Toll de endotelina fusionado a un dominio de proteína inhibidor o activador y una secuencia de localización nuclear.

19. Un factor de transcripción artificial, caracterizado porque comprende una proteína de dedo de zinc polidactilica dirigida específicamente al promotor FCER1A fusionado a un anticuerpo a un dominio de proteina inhibidor o activador y una secuencia de localización nuclear.

20. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende un factor de transcripción artificial de conformidad con las reivindicaciones 1 a 19.

21. El factor de transcripción artificial de conformidad con las reivindicaciones 1 a 19 para usarse en la modulación de la reacción de células a estímulos externos y a otras moléculas de señalización solubles.

22. El factor de transcripción artificial de conformidad con las reivindicaciones 1 a 19 para usarse en el tratamiento de enfermedades moduladas por la unión de efectores específicos a receptores, para lo cual la proteína de dedo de zinc polidactílica está dirigida específicamente al promotor del gen receptor.

23. El factor de transcripción artificial de conformidad con las reivindicaciones 2 ó 6 a 16 para usarse para influenciar la respuesta celular a la endotelina, para hacer disminuir o incrementar los niveles de receptor A de endotelina, y para usarse en el tratamiento de enfermedades moduladas por la endotelina.

24. El factor de transcripción artificial de conformidad con las reivindicaciones 3, 6 a 15 ó 17 para usarse para influir sobre la respuesta celular a la endotelina, para hacer disminuir o incrementar los niveles de receptor B de endotelina, y para usarse en el tratamiento de enfermedades moduladas por la endotelina.

25. El factor de transcripción artificial de conformidad con las reivindicaciones 4, 6 a 15 ó 18 para usarse para influir sobre la respuesta celular a lipopolisacárido, para hacer disminuir o incrementar los niveles de receptor 4 similar a Toll, y para usarse en el tratamiento de enfermedades moduladas por lipopolisacárido.

26. El factor de transcripción artificial de conformidad con las reivindicaciones 5 a 15 ó 19 para usarse para influir en la respuesta celular a IgE, para hacer disminuir o incrementar los niveles de receptores de IgE, y para usarse en el tratamiento de enfermedades moduladas por la IgE.