MX2014006286A - Tratamientos con isoxazol para diabetes. - Google Patents

Tratamientos con isoxazol para diabetes.

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Jay Schneider
Doug Frantz
Hector Aguilar
Melanie Cobb
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Univ Texas
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Abstract

La presente invención se refiere a compuestos y métodos para inducir la síntesis y secreción de insulina de células beta pancreáticas. Los métodos pueden tener lugar in vitro, ex vivo, tal como en aislados de un tejido mamífero de adulto o in vivo. Los compuestos y métodos aquí descritos pueden tener uso en el tratamiento de diabetes.

Description

TRATAMIENTOS DE ISOXAZOL PARA DIABETES Solicitudes Relacionadas La presente solicitud reclama el beneficio de prioridad de las Solicitudes Provisionales Norteamericanas Series Nos. 61/563,419, presentada el 23 de noviembre de 2011, y 61/566,056, presentada el 2 de diciembre de 2011, cuyos contenidos totales están incorporados a la presente invención como referencia.
La presente invención se elaboró con soporte gubernamental de acuerdo con NIH P60 DK079626, R37 DK34128 y R01 DK55310 otorgado por National Institutes of Health (Instituto Nacional de Salud). El gobierno tiene ciertos derechos en la presente invención. 1. Campo de la Invención La presente invención se refiere de manera general a los campos de la biología celular, biología de desarrollo y medicina. Más particularmente, se refiere a métodos y composiciones que se relacionan con el estímulo de producción de insulina y tratamiento de diabetes. 2. Antecedentes de la Invención Casi un tercio de la población de adultos de los Estados Unidos de América está en riesgo de diabetes tipo 2 debido a la tolerancia anormal de glucosa o a la glucosa en ayuno anormalmente alta (Genuth et al., 2003). La diabetes tipo 2 está incrementada en un rango alarmante y ahora se encuentra no únicamente en adultos, sino también en niños con sobrepeso crónico. Las células ß pancreáticas desempeñan un papel único en la homeostasis de glucosa, secretando insulina cuando se elevan las concentraciones de glucosa y otros nutrientes en la circulación (Newgard and McGarry, 1995). La insulina facilita la utilización y almacenamiento adecuado de los nutrientes en la mayor parte de los tejidos. Las células beta son vulnerables a nutrientes persistentes en exceso por tensión de secreción. Durante el desarrollo de diabetes tipo 2, las células beta pancreáticas se vuelven progresivamente incapaces de producir y secretar suficiente insulina para evitar la hiperglucemia (Genuth et al., 2003; Muoio and Newgard, 2008; Rutter and Parton, 2008). Las estrategias de identificación para mantener euglucemia son esenciales para limitar la diabetes y sus consecuencias destructivas (Halban et al., 2010; Borowiak and Melton, 2009).
Los nutrientes regulan la producción de insulina en varios pasos en la trayectoria biosintética además de su secreción, incluyendo disociación de preprohormona, traducción y transcripción (Redmon et al., 1994; Xu et al., 1998; Wicksteed et al., 2007; Steiner et al., 2009; Goodge and Hutton, 2000). Los eventos inmediatos para rellenar la insulina secretada implican la traducción del mARN existente y el procesamiento de hormonas. En una escala de tiempo mayor, la transcripción de gen de insulina nuevo mantiene el conjunto de mARN para la traducción en demanda.
La transcripción de gen de insulina se regula a través de la cooperación de un grupo de factores de transcripción sensibles a glucosa expresados en una forma restringida por el tejido (Ohneda et al., 2000; Aramata et al., 2005). Entre los más importantes de éstos, el factor BETA2 de hélice de lazo básico (bHLH) (también conocido como NeuroDI), el factor de homeodominio PDX-1, y el factor de cierre de leucina básico MafA han mostrado activar sinérgicamente el promotor de gen de insulina y son esenciales para la transcripción de gen de insulina estimulada por glucosa. Las mutaciones en PDX-1 y BETA2 han estado ligadas con la diabetes de generación en la madurez de jóvenes (MODY) y se clasifican como genes MODY4 y MODY6, respectivamente (Habener and Staffers, 1998; Vaxillaire and Froguel, 2008).
Se requiere BETA2 durante el desarrollo neuronal para la diferenciación de células progenitoras neuronales en el sistema nervioso central y periférico (Kageyama et al., 1997; Chae et al., 2004). BETA2 también tiene un papel esencial en el desarrollo de células neuroendócrinas en otros órganos incluyendo pulmón, intestino y páncreas. En los adultos, la función principal de BETA2 está en las células ß pancreáticas, aunque también se requiere para la neurogénesis continua en la región CA1 hipocampa! del cerebro. La familia de neurogenina (Ngn) de las proteínas bHLH son reguladores de transcripción directos de BETA2 durante desarrollo neuronal y pancreático (Huang et al., 2000; Sommer ef al., 1996). Aunque Ngn1 y 2 actúan exclusivamente en los linajes neuronales, Ngn3 es el miembro de familia que induce la expresión de BETA2 en células ß pancreáticas. Varios estudios han reportado que la expresión de uno o más de estos factores ayuda a promover la diferenciación de células endócrinas pancreáticas de varias poblaciones de células madre (Borowiak and Melton, 2009; Gasa ef al., 2004). Sin embargo, no se ha comprendido el rol preciso desempeñado en el desarrollo pancreático.
Breve Descripción de la Invención Por lo tanto, de acuerdo con la presente invención, se proporciona un método para inducir la producción y/o secreción de insulina a partir de una célula ß de isleto, en donde el método comprende contactar la célula con un compuesto de la fórmula (I): en donde: Ri es fenilo sustituido o no sustituido, tiofenilo sustituido o no sustituido o un sustituyente de la fórmula (A): en donde: R4, R5 y R6 cada uno son independientemente hidrógeno, hidroxi, halo, ciano, nitro; o alquil(c=io), aril(C=i2), aralqu¡l(C=i5), heteroaril(C=i2), acil(C=io) o una versión sustituida de cualquiera de estos grupos; y G es O, -NH o S; R2 es: hidrógeno, hidroxi, halo o nitro; o alquil(C=io)> alquenil(C=io)> alquinil(C=io), alcoxi(C=io), alqueniloxi(C=io), alquiniloxi(c=io), aril(C=i2)> aralquil(c=i5), acil(C=io)> o una versión sustituida de cualquiera de estos grupos; o -C(0)R7, -OC(0)R7, -OC(0)OR7, -C(0)NR8R9, -OC(0)NR8R9, -NR8OR9 o -S03R7; en donde R7 es hidrógeno, alquil(C=io), aril(C=i2), aralquil(c=i5); R8 y Rg cada uno son independientemente hidrógeno, alquil(csio). aril(Csi2). aralquil(C=is). o tomados juntos, son alcanodiil(cs6); R3 es -NH-0-alquil(C=io), -NHOH, -ORi0 o -NR R12, en donde, Río es hidrógeno, sustituido o no sustituido alquil(C=io), sustituido o no sustituido alquenil(C=io), alquinil(C=io) sustituido o no sustituido, aril(C¾i2) sustituido o no sustituido, o aralquil(C=i5) sustituido o no sustituido; Rn y R12 cada uno son independientemente hidrógeno, alquil(C=io) sustituido o no sustituido, alquenil(C=io) sustituido o no sustituido, alquinil(C= o) sustituido o no sustituido, a ri I (C= 12) , o aralquil(Csi5); o Rn y R12 se toman juntos para formar alcanodiil(c=6), -CH2CH2N HCH2CH2- o -CH2CH2OCH2CH2-; o Rn y R12 se toman juntos para formar alcanod¡il(Cs6); o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos.
En combinaciones particulares, R1 es un sustituyente de la fórmula (A), además G puede ser S, y además R , R5 o R6 pueden ser hidrógeno, incluyendo cuando R4, R5 y R6 cada uno son hidrógeno.
En cualquiera de las modalidades anteriores, R2 puede ser hidrógeno.
En cualquiera de las modalidades anteriores, R3 puede ser -NR R12, incluyendo en donde R12 o R13 son ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo o ciclohexilo, y en particular en donde R12 o R13 son ciclopropilo.
El método puede emplear además un compuesto de la fórmula (II): en donde: R11 y R 2 ambos son hidrógeno; o R,, es hidrógeno y R12 es alquil, c=io) sustituido o no sustituido, alquenil(c=io) sustituido o no sustituido, alquinil (c=io) sustituido o no sustituido, o bencilo; o R1 ( y R 2 tomados juntos son -CH2CH2CH2-, -C H 2C H 2 C H 2C H 2- , - C H 2C H 2 C H C H 2 C H 2 - , -CH2CH2NHCH2CH2- o -CH CH2OCH2CH2-¡ R4, R5 y R6 cada uno son independientemente: hidrógeno, halo, hidroxi, ciano, nitro; o alquil(c=io), aril(C=i2), aralquil(Csi5), heteroaril(Csi2), acil(Csio) o una versión sustituida de cualquiera de estos grupos; y G es O, NH o S, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. En donde G es S, R4, R5 o R6 puede ser en particular hidrógeno, incluyendo en donde R4, R5 y R6 cada uno son hidrógeno.
En cualquiera de las modalidades anteriores, Rn puede ser hidrógeno.
En cualquiera de las modalidades anteriores, R12 puede ser ciclopropilo o un alcohol alifático(C=io) o un poliol alifático(C=io)- Un ejemplo particular del compuesto es: o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
En cualquiera de las modalidades anteriores, la célula se localiza en un sujeto animal.
En cualquiera de las modalidades anteriores, la célula se contacta ex vivo.
En otra modalidad, se proporciona un método para tratar diabetes en un sujeto, en donde el método comprende administrar al sujeto un compuesto de la fórmula (I): en donde: R es fenilo sustituido o no sustituido, tiofenilo sustituido o no sustituido o un sustituyente de la fórmula (A): en donde: R4, R5 y R6 cada uno son independientemente hidrógeno, hidroxi, halo, ciano, nitro; o alquil(C=io), aril(c=i2), aralquil(C=i5), heteroaril(Csi2), acil(Csio) o una versión sustituida de cualquiera de estos grupos; y G es O, -NH o S; hidrógeno, hidroxi, halo o nitro; o a Iq u i l(Csi o) . alquenil(Csio), a Iq u i n i I (Csi o> . alcoxi(C=io), alqueniloxi(C=io), alquiniloxi(C=io), a ri l(C=i 2> , aralquil(csi5). acil(C=io), o una versión sustituida de cualquiera de estos grupos; o -C(0)R7, -OC(0)R7, -OC(0)OR7, -C(0)NR8R9, -OC(0)NR8R9, -NR8OR9, o -S03R7; en donde R7 es hidrógeno, a Iq u i I (C= 1 o) , aril(Csi2), aralquil(C=i5); R8 y Rg cada uno son independientemente hidrógeno, alquil(C=io), aril(Csi2), aralquil(C=i5), o tomados juntos son alcanodiil(c=6); R3 es -NH-O-alquil(C=i0), -NHOH, -OR10 o -NR11R12, en donde R10 es hidrógeno, alquil(C=io) sustituido o no sustituido, alquenil(c=io) sustituido o no sustituido, alquinil(C=io) sustituido o no sustituido, a r i I (C= 12 sustituido o no sustituido o aralquil(C=i5) sustituido o no sustituido; R11 y R12 cada uno son independientemente hidrógeno, alquil(C=io) sustituido o no sustituido, alquenil(C=io) sustituido o no sustituido, a Iq u i n i I (C= 1 o> sustituido o no sustituido, a ri I (C= 12) . o aralquil(C=i5); o R y R12 se toman juntos para formar alcanodiil(C=6), -CH2CH2N HCH2CH2- o -CH2CH2OCH2CH2-; o R y R12 se toman juntos para formar alcanodiil(Cí6); o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos.
En combinaciones particulares, es un sustituyente de la fórmula (A), además G puede ser S, y además R4, R5 o R6 pueden ser hidrógeno, incluyendo en donde R4, R5 y R6 cada uno son hidrógeno.
En cualquiera de las modalidades anteriores, R2 puede ser hidrógeno.
En cualquiera de las modalidades anteriores, R3 puede ser -NR Ri2, incluyendo en donde R12 o R13 son ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo o ciclohexilo, y en particular en donde R12 o R13 son ciclopropilo.
El método puede emplear además un compuesto de la fórmula (II): en donde: R11 12 ambos son hidrógeno; o R es hidrógeno y Ri2 es alquil(C=io) sustituido o no sustituido, alquenil(C=10) sustituido o no sustituido, alquinil(C=io) sustituido o no sustituido, o bencilo; o Rn y R12 tomados juntos son -CH2CH2CH2-, -C H 2 C H 2 C H 2 C H 2 - - C H 2C H 2 C H 2 C H 2 C H 2- -CH2CH2N HCH2CH2- o -CH2CH20CH2CH2-¡ R4) R5 y R6 cada uno son independientemente: hidrógeno, halo, hidroxi, ciano, nitro; o alquil(C=io), aril(c=i2), aralquil(C=i5), heteroaril(C=i2)- acil(C=io) o una versión sustituida de cualquiera de estos grupos; y G es O, NH o S, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. Cuando G es S, R4, R5 o R6 puede ser un hidrógeno en particular, incluyendo en donde R , R5 y R6 cada uno son hidrógeno.
En cualquiera de las modalidades anteriores, Rn puede ser hidrógeno.
En cualquiera de las modalidades anteriores, R12 puede ser ciclopropilo o un alcohol alifático(C=io) o un poliol alifático(C=io)- Un ejemplo particular del compuesto es: o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
En cualquiera de las modalidades anteriores, la célula se localiza en un sujeto animal.
En cualquiera de las modalidades anteriores, la célula se contacta ex vivo.
Un método para tratar diabetes en un sujeto comprende (a) contactar una célula ß de isleto ex vivo con un compuesto de la fórmula (I) y (b), administrando la célula ß de isleto al sujeto, en donde la fórmula (I) es: en donde: Ri es fenilo sustituido o no sustituido, tiofenilo sustituido o no sustituido o un sustítuyente de la fórmula (A): en donde: R4, Rs y Re cada uno son independientemente hidrógeno, hidroxi, halo, ciano, nitro; o alquil(C=io), a ril (C= 12) , aralquil(C=i5), heteroaril(c=i2), acil(C=io) o una versión sustituida de cualquiera de estos grupos; y G es O, -NH o S; R2 es: hidrógeno, hidroxi, halo o nitro; o alquil(C=io). alquenil(C=io)> alquinil(C=io), alcoxi(C=io), alqueniloxi(C=io), alquiniloxi(csio), aril(Csi2), aralquil(C=i5), acil(Csio). o una versión sustituida de cualquiera de estos grupos; o -C(0)R7) -OC(0)R7l -OC(0)OR7, -C(0)NR8R9, -OC(0)NR8R9, -NR8OR9 o -SO3R7; en donde R7 es hidrógeno, alquil(C=io), aril(C=i2), aralq uM(C=i5); R8 y Rg cada uno son independientemente hidrógeno, alquil(c=io), aril(C=i2), aralquil(C=i5), o tomados juntos son alcanodiil(c=6); R3 es -NH-O-alquil(C=i0), -NHOH, -OR10 o -NRf 1R12, en donde R10 es hidrógeno, alquil(C=io) sustituido o no sustituido, alquenil(c=io) sustituido o no sustituido, alquinil(C=io) sustituido o no sustituido, a r i I (C= 1 ) sustituido o no sustituido o aralquil(C=is) sustituido o no sustituido; R11 y R12 cada uno son independientemente hidrógeno, alquil(C=io) sustituido o no sustituido, alquen¡l(C=io) sustituido o no sustituido, alquinil(C=io) sustituido o no sustituido, a rí l{C=12) o aralquil(c=i5); o R y R12 se toman juntos para formar alcanodiil(c=6), -CH2CH2NHCH2CH2- o -CH2CH2OCH2CH2-; o R,, y R12 se toman juntos para formar alcanodiil(c=6); o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos.
En combinaciones particulares, R1 es un sustituyente de la fórmula (A), además G puede ser S, y además R4, R5 o R6 pueden ser hidrógeno, incluyendo en donde R4, R5 y Re cada uno son hidrógeno.
En cualquiera de las modalidades anteriores, R2 puede ser hidrógeno.
En cualquiera de las modalidades anteriores, R3 puede ser -NRn i2, incluyendo en donde R12 o R13 son ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo o ciclohexilo, y en particular en donde R12 o R13 son ciclopropilo.
El método puede emplear además un compuesto de la fórmula (II): en donde: R11 y R12 ambos son hidrógeno; o R es hidrógeno y R 2 es alquil(C=io) sustituido o no sustituido, alquenil(C=io) sustituido o no sustituido, alq u i n il<c=i o) sustituido o no sustituido o bencilo; o Rn y R12 tomados juntos son -CH2CH2CH2-, -CH2CH2CH2CH2-, -CH2CH2CH2CH2CH2-, -CH2CH2N HCH2CH2- o -CH2CH2OCH2CH2-; R , R5 y R6 cada uno son independientemente: hidrógeno, halo, hidroxi, ciano, nitro; o alquil(Csio). aril(C=i2), aralquil(C=i5)> heteroaril(C=i2), acil(C=io) o una versión sustituida de cualquiera de estos grupos; y G es O, NH o S, o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos. En donde G es S, R4, R5 o R6 pueden ser hidrógeno en particular, incluyendo en donde R4, R5 y Re cada uno son hidrógeno.
En cualquiera de las modalidades anteriores, R puede ser hidrógeno.
En cualquiera de las modalidades anteriores, R12 puede ser ciclopropilo o un alcohol a I if ático(C=i o> o un poliol alifático(csio).
Un ejemplo particular del compuesto es: o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
Aún en otra modalidad, se proporciona un método para reactivar una célula ß de isleto, en donde el método comprende contactar la célula con un compuesto de la fórmula (I): en donde: R es fenilo sustituido o no sustituido, tiofenilo sustituido o no sustituido o un sustituyente de fórmula (A): en donde: R4, R5 y R6 cada uno son independientemente hidrógeno, hidroxi, halo, ciano, nitro; o alquil(Csio). aril(C=i2), aralquil(C=i5), heteroaril(C=i2), acil(C=io) o una versión sustituida de cualquiera de estos grupos; y G es O, -NH o S; R2 es: hidrógeno, hidroxi, halo o nitro; o alqu¡l(C=io), alquenil(C=io), a I q u i n i I {C=i o> , alcoxi(C=io), alqueniloxi(C=io), alquiniloxi(csio), aril C=i 2) , aralquil(C=i5), acil(C=io), o una versión sustituida de cualquiera de estos grupos; o -C(0)R7, -OC(0)R7, -0C(0)0R7, -C(0)NR8R9, -OC(0)NR8R9l -NR8OR9 o -SO3R7; en donde, R7 es hidrógeno, alquil(C=10), aril(C=i2), aralquil(C=i5); R8 y Rg cada uno son independientemente hidrógeno, alquil(c=io), a ri I C= 12) , aralquil(C=i5), o tomados juntos son alcanodiil(C=6); R3 es -NH-O-alquil(C=i0), -NHOH, -OR10 o -NRnR 2, en donde R10 es hidrógeno, alquil(C=io) sustituido o no sustituido, alquenil(C=io) sustituido o no sustituido, alqu¡n¡l(C=10) sustituido o no sustituido, a ri l(C= 12) sustituido o no sustituido o aralquil(c=is) sustituido o no sustituido; R11 y R12 cada uno son independientemente hidrógeno, alquil(C=io) sustituido o no sustituido, alquenil(C=io) sustituido o no sustituido, alquinil(C=io) sustituido o no sustituido, a ri I (C= 12) , o aralquil(c=i5); o Rt1 y R12 se toman juntos para formar alcanodiil(C=6), -CH2CH2NHCH2CH2- o -CH2CH2OCH2CH2-; o R„ y R12 se toman juntos para formar alcanodiil(C=6); o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos.
En combinaciones particulares, R1 es un sustituyente de la fórmula (A), además G puede ser S, y además R4, R5 o R6 pueden ser hidrógeno, incluyendo en donde R4, R5 y R6 cada uno son hidrógeno.
En cualquiera de las modalidades anteriores, R2 puede ser hidrógeno.
En cualquiera de las modalidades anteriores, R3 puede ser -NRnRi2, incluyendo en donde R12 o R13 son ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo o ciclohexilo, y en particular en donde R12 o R13 son ciclopropilo.
El método puede emplear además un compuesto de la fórmula (II): en donde: R11 y R12 ambos son hidrógeno; o R es hidrógeno y R12 alquil(c=io) es sustituido o no sustituido, alquenil(C=io) sustituido o no sustituido, alquinil(C=10) sustituido o no sustituido o bencilo; o R y R12 tomados juntos son -CH2CH2CH2-, -CH2CH2CH2CH2-, -CH2CH2CH2CH2CH2"» -CH2CH2NHCH2CH2~, o -CH2CH20CH2CH2~ R4, R5 y R6 cada uno son independientemente: hidrógeno, halo, hidroxi, ciano, nitro; o alquil(C=io)> aril(Csi2), aralquil(Csi5), heteroaril(C=i2), acil (c=io) o una versión sustituida de cualquiera de estos grupos; y G es O, NH o S, o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos. En donde G es S, R4, R5 o R6 pueden ser hidrógeno en particular, incluyendo en donde R4, R5 y Re cada uno son hidrógeno.
En cualquiera de las modalidades anteriores, R1( puede ser hidrógeno.
En cualquiera de las modalidades anteriores, R12 puede ser ciclopropilo o un alcohol alifático(c=io) o un poliol alifático(C=io)- Un ejemplo particular del compuesto es: o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
En cualquiera de las modalidades anteriores, la célula se localiza en un sujeto animal. En cualquiera de las modalidades anteriores, la célula se contacta ex vivo.
También se proporciona un compuesto que tiene fórmula: Opcionalmente se formula como una composición que comprende el compuesto disperso en un amortiguador, un transportador, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable.
Los términos "contactado" y "expuesto", cuando se aplican a una célula, se utilizan en la presente invención para describir el proceso a través del cual se proporciona un compuesto de la presente invención a una célula objetivo o se coloca en una yuxtaposición directa con una célula objetivo.
El término "efectivo", tal como se utiliza en la presente especificación y/o reivindicaciones (por ejemplo, "una cantidad efectiva", significa adecuado para lograr un resultado deseado, esperado o proyectado.
El término "tratamiento" y "tratar" tal como se utiliza en la presente invención se refiere a la administración o aplicación de un agente terapéutico a un sujeto, o el desempeño de un procedimiento o modalidad en un sujeto con el propósito de obtener un beneficio terapéutico de una enfermedad o condición relacionada con la salud.
El término "beneficio terapéutico" o "terapéuticamente efectivo" tal como se utiliza a lo largo de la presente solicitud, se refiere a cualquier cosa que promueva o incremente el bienestar de un sujeto con respecto al tratamiento médico de una condición. Esto incluye pero no se limita a la reducción en la frecuencia o severidad de los signos o síntomas de una enfermedad.
Se contempla específicamente que cualquier limitación descrita con respecto a una modalidad de la presente invención, puede aplicar a cualquier modalidad de la presente invención. Además, se puede utilizar cualquier combinación de la presente invención en cualquier método de la misma, y cualquier método de la misma se puede utilizar para producir o utilizar cualquier combinación de la presente invención.
El uso del término "o" en las reivindicaciones se utiliza para significar "y/o" a menos que se indique explícitamente para referirse a alternativas únicamente, o las alternativas son mutuamente exclusivas, aunque la descripción soporta una definición que se refiere a únicamente alternativas y "y/o".
A lo largo de la presente solicitud, el término "aproximadamente" se utiliza para indicar que un valor incluye la desviación de error estándar del dispositivo y/o método que está siendo empleado para determinar el valor.
Tal como se utiliza en la presente especificación, el término "un" o "uno, una" puede significar uno o más, a menos que se exprese claramente lo contrario. Tal como se utiliza en la presente invención en las reivindicaciones, cuando se utiliza junto con la palabra "que comprende", las palabras "un" o "uno, una" pueden significar uno o más de uno. Tal como se utiliza en la presente invención, el término "otro" puede significar al menos un segundo o más.
Otros objetos, características y ventajas de la presente invención pueden ser apreciados a partir de la siguiente descripción detallada de la invención. Sin embargo deberá quedar entendido que la descripción detallada y los ejemplos específicos, aunque indican modalidades preferidas de la presente invención, se proporcionan únicamente a manera de ilustración, ya que los expertos en la técnica podrán apreciar a partir de esta descripción detallada, varios cambios y modificaciones dentro de la esencia y alcance de la presente invención .
Breve Descripción de los Dibujos Las figuras que se encuentran a continuación forman parte de la presente especificación, y están incluidas para demostrar en forma adicional ciertos aspectos de la presente invención. La presente invención podrá ser mejor comprendida a través de la referencia a uno o más de estos dibujos en combinación con la descripción detallada de las modalidades específicas aquí presentadas.
Figuras 1A-E. Isx (LSH-1) induce la expresión de insulina y factores de transcripción en isletos humanos cultivados primarios. (Figura 1A) Los isletos humanos primarios que habían sido cultivados en RPMI 160 durante 6 meses, fueron tratados con vehículo o 40 µ? Isx durante 1 o 2 días. La expresión de insulina humana o los genes de glucagon se evaluó mediante RT-PCR cuantitativo Taqman. (Figura 1B) La secreción de insulina medida mediante ELISA durante 24 horas de isletos tratados con Isx o vehículo durante 1 o 2 días. (Figura 1C) El contenido de insulina total de los isletos cultivados durante 3 meses y los isletos frescos, cada uno tratados durante 48 horas con Isx o DMSO. (Figura 1 D) El curso de tiempo de inducción de gen pancreático en isletos cultivados durante 1 año tratados con DMSO (8 días) o 40 µ? Isx durante 2, 4 u 8 días. (Figura 1 E) El manchado inmunohistoquímico utilizando anticuerpos contra insulina, BETA2, Neurogenin3 (Ngn3) y MafA de isletos cultivados durante 2 meses y tratados con Isx o vehículo durante 48 horas. Los núcleos se mancharon con DAPI.
Figuras 2A-E. Isx (LSH-1) activa la expresión de insulina e incrementa la función de célula ß en células MIN6. (Figura 2A) Relación de respuesta-dosis de células MIN6 tratadas con 5 a 80 µ? Isx durante 24 horas o DMSO (0.08% - similar a la concentración más alta de Isx). Los Usados de célula completa (40 Mg) se sometieron a inmunomanchado utilizando anticuerpos contra BETA2/NeuroD1 , MafA, PDX-1 , pERK1/2 (pT183/pY185), histonas aciladas AcH4-K5K8K12K16 y AcH3K9 e histona total H3. (Figura 2B) RT-PCR cuantitativo de la expresión de gen de insulina 1 e insulina 2 de múrido en células MI6 tratadas con Isx durante 24 horas como en la figura 2A. (Figura 2C) GSIS en 15 minutos de células MIN6 tratadas previamente con Isx o vehículo durante 48 horas en la presencia o ausencia del inhibidor MEK1/2 U0126 durante 24 horas. (Figura 2D) Contenido de insulina medido mediante ELISA en células MIN6 tratadas con Isx durante 24 o 48 horas. (Figura 2E) GSIS inducido mediante glucosa, aminoácidos (AA) y Exendin-4 (Ex-4) individualmente o en combinación en células MIN6 tratadas previamente con Isx durante 48 horas.
Figuras 3A-E. Isx (LSH-1) activa los factores de transcripción que regulan la expresión de gen de insulina v la producción de insulina. (Figura 3A) Actividad reportera del promotor de insulina en células HEK293 transfectadas con BETA2, MafA, PDX-1 o (figura 3B) WT MafA o MafA muíante, tratado con Isx o vehículo durante 24 horas. (Figura 3C) Inmunomanchado de inmunoprecipitados anti-acetil utilizando Usina (Ac-K) y anti-BETA2 de células que sobreexpresan myc-BETA2. (Figura 3D) Análisis de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) de la asociación de MafA y BETA2 (figura 3E) con el promotor de insulina en células IN6 en respuesta a la estimulación de glucosa de 10 minutos.
Figuras 4A-G. Isx (LSH-1) es un activador HAT. (Figura 4A) Inmunomanchados de histonas acetiladas en células MIN6 tratadas previamente con los inhibidores indicados durante 16 horas y posteriormente tratadas con vehículo o Isx. (Figuras 4B-C) Actividades de HDAC (figura 4B) y HAT (figura 4C) en 50 pg de proteína de extracto nuclear de células MIN6 tratadas con Isx o DMSO durante 24 horas. Se agregó tricoestatina A (TSA; 2 µ?) como control positivo. También se incluyó extracto nuclear HeLa como un control positivo. (Figuras 4D-E) HAT actividades de extractos nucleares de células MIN6 sin (figura 4D) o con (figura 4E) expresión de p300 durante 48 horas, tratados previamente con Isx o 10 µ? U0126 durante 24 horas. (Figura 4F) ChIP análisis de la asociación de p300 con el promotor de gen de insulina en células MIN6 al momento de la estimulación con glucosa (Gluc) después de tratamiento previo con Isx y/o U0126 durante 24 horas. Se llevaron a cabo análisis estadísticos utilizando prueba t del estudiante como en las figuras 1A-E. *P < 0.05; **P < 0.01. (Figura 4G) Vista simplificada de acciones de Isx.
Figuras 5A-E. Expresión de gen inducida por Isx (LSH-1) en cultivos de isleto humano. (Figura 5A) Estructura del compuesto principal N-ciclopropil-5-(tiofen-2-il)isoxazol-3-carboxamida (Isx) utilizado en este estudio. (Figura 5B) Expresión de perfiles de factores de isleto relevantes mediante análisis PCR Sybr-Green qPCR de isletos humanos cultivados durante 1 año como en la figura 1D. (Figura 5C) Manchado inmunohistoquímico de insulina en isletos humanos cultivados durante 2 meses. Los núcleos se mancharon con DAPI. (Figura 5D) I nmunomanchado de extractos de células completas de isletos humanos cultivados durante seis meses tratados con vehículo (DMSO) o Isx durante 24 horas. (Figura 5E) Isletos humanos cultivados durante 6 meses se trataron con DMSO (Veh) o Isx durante 48 horas. Para implicar las trayectorias de señalización que se requieren para el incremento conducido por isoxazol en la función de célula ß, medido como GSIS, también se trataron los isletos tratados con isoxazol con vehículo (Veh), 10 µ? U0126 (U), 10 µ? Nifedipina-BAPTA (N-B) o 0.1 µ? de wortmanina (W) durante la duración del tratamiento con isoxazol.
Figura 6. Curso de tiempo de tratamiento Isx (LSH-1) en células MIN6. Inmunomanchado de extractos de células completas de células MIN6 crecidas durante 24 horas en DMEM completo que contiene 4.5 mM de glucosa y tratados con 20 µ? de Isx a partir de 15 minutos hasta 24 horas. Se trató el control (0 min) con DMSO durante 24 horas.
Figuras 7A-C. Transfecciones temporales y ensayos reporteros de insulina en células HEK293. (Figura 7A) Beta2:myc, Pdx-1:myc y MafA:myc se transfectaron individualmente o en combinación en células HEK293 junto con el promotor de insulina 1 de rata (-410, + 1), reportero de luciferasa (pGL3-rlns). La actividad basal del promotor se evaluó mediante transfección del vector de pcADN vacío solo. Las células transfectadas se trataron con vehículo o 20 µ? de isoxazol durante 24 horas. Se utilizó la luciferasa sv40-Renilla como un control interno. (Figura 7B) Se determinó la expresión de los factores recombinantes Beta2:myc, Pdx-1:myc y MafA:myc transfectados en células HEK293 como en la (figura 7A), mediante inmunomanchado utilizando anticuerpos NeuroDI, PDX-1 y cMaf. (Figura 7C) Perfil de expresión de WT transfectado y MafA:myc muíante en células HEK 293 tratadas con vehículo o isoxazol durante 24 horas.
Figuras 8A-D. Isx (LSH-1) estimuló la actividad HAT. (Figura 8A) Efecto combinado de tratamiento Isx durante 24 horas y WT ERK2 (W) o K52R ERK2 con muerte de quinasa (R) en las actividades HAT de p300 y (figura 8B) otros HATs, CBP, PCAF y GCN5-L2, transfectadas en células HEK293. Efectos específicos de Isx en GSIS en células MIN6 (figura 8C) y actividad promotora Nkx2.5 en células progenitoras P19 (figura 8D) en comparación con inhibidores HDAC tales como Trichostatin A (TSA) o ácido valproico (VPA) después de tratamiento durante 48 horas.
Figura 9. Estructuras de compuesto de isoxazol.
Figura 10. Ensayo de reportero utilizando la actividad de reportero a insulina de rata en MIN6 (línea de células beta).
Figura 11. Ensayo de respuesta-dosis utilizando actividad de reportero de insulina de rata en MIN6.
Figura 12. Inducción de expresión de insulina endógena en células MIN6 con compuestos Isx.
Figura 13. Ensayo de reportero de promotor de insulina. El reportero de luciferasa de promotor de insulina se transfectó en células MIN6 tratadas con diversas moléculas de isoxazol o DMSO (vehículo) durante 24 horas.
Figuras 14A-B. (Figura 14A) Tratamiento agudo de células MIN6 con derivados Isx 20 µ? indujo un influjo de calcio intracelular rápido en comparación con DMSO solo. (Figura 14B) Secreción de insulina medida mediante ELISA después de estimulación aguda con derivados Isx 20 µ? en la presencia de 4 o 20 mM de glucosa o con 20 mM de glucosa más 1x aminoácidos.
Figuras 15A-B. Señalización (figura 15A) y secreción de insulina después de 30 minutos (figura 15B) en respuesta a varios secretagogos en células MIN6 tratados previamente con 1 µ? de LSH-097 durante 48 horas.
Figura 16. Influjo de calcio intracelular en células MIN6 tratadas previamente con DMSO (vehículo) o derivados Isx 5 µ? LSH-001, LSH-018 y LSH-097 durante 30 horas.
Figuras 17A-B. (Figura 17A) Diseño experimental utilizando células MIN6 tratadas con control BSA o 1 mM FFA (Oleato:Palmitato 2:1, 3 días, seguido de tratamiento con 5 µ LSH-18 el último día. La función de célula beta se evaluó mediante (figura 17A), activación de ERK1/2 inducida por glucosa y (figura 17B) secreción de insulina inducida por glucosa.
Figuras 18A-B. Perfil de expresión de gen. (Figura 18A) Determinación del perfil de expresión de gen mediante qPCR de isletos humanos cultivados durante 2 meses y tratados con derivados Isx 10 µ (LSH-1, LSH-18, LSH-18, LSH-20, LSH-49) durante 7 días. (Figura 18B) Determinación de la función de célula beta mediante secreción de insulina inducida por glucosa durante 1 hora.
Figura 19. Estructuras de moléculas de isoxazol Descripción Detallada de la Invención La presente invención supera las deficiencias de la técnica anterior, proporcionando compuestos que inducen la expresión y secreción de insulina, así como tratar la diabetes. Los inventores identificaron previamente una familia de moléculas pequeñas de isoxazol 3,5-disustuidas (Isx), mediante la clasificación de una biblioteca química en células madre pluripotentes de ratón para la activación que codifica el factor de transcripción de horneo dominio Nkx2.5 (Sadek et ah, 2008).
Descubrieron en estudios colaterales que Isx, aunque originalmente considerada como una molécula pequeña cardiogénica, tuvo fuerte actividad neurogénica en varios tipos de células progenitoras neurales (Schneider et at, 2008). Esta actividad fue transmitida en parte a través de la inducción química de la expresión de BETA2/NeuroD1. Debido a la importancia de BETA2 en el desarrollo del páncreas y la producción de insulina en células ß pancreáticas, en este estudio los inventores revisaron los efectos de Isx en las propiedades de las células ß. Descubrieron que esta molécula incrementa la producción de insulina y la función de la célula ß, y restaura la producción de insulina mediante isletos humanos después de cultivo ex vivo a largo plazo. También proporciona caracterización del cambio generado por Isx para mejorar los comportamientos esenciales de las células ß. Estos, y otros aspectos de la presente invención, se establecen con detalle más adelante.
A. Compuestos de la Presente Invención Los compuestos de la presente invención pueden considerarse como derivados de isoxazoles. Los siguientes compuestos son representativos de ciertos compuestos de la presente invención: un compuesto de la fórmula (I): en donde X es O o NH, Y es S o O y R es H, un alquilo sustituido o no sustituido, tal como d-C6 alquilo o C3-C6 cicloalquilo, o un alquenilo sustituido o no sustituido, tal como C2-C6 alquenilo, un alquinilo sustituido o no sustituido, tal como C2-C6 alquinilo, o un estereoisómero, solvato, hidrato, o sal farmacéuticamente aceptable de los mismos. En ciertas modalidades, con respecto a los compuestos de la fórmula (I), existe la provisión de que siempre y cuando X sea O, entonces R debe ser un C3-C6 cicloalquilo sustituido o no sustituido; y/o si X es NH, entonces R no debe ser C1-C6 alquilo sustituido con pirazinilo; un compuesto de la fórmula (la), (Ib), o (le): en donde Ri es fenilo sustituido o no sustituido, pirrolilo no sustituido, piridilo no sustituido, furanilo no sustituido, tienilo no sustituido, benzofuranilo no sustituido, benzo[b]tiofenilo no sustituido, o tiazolilo no sustituido. Cualquiera de estos sustituyentes R1 puede ser sustituido también ; un compuesto de la fórmula (II): en donde: Ri es un fenilo sustituido o no sustituido, tiofenilo sustituido o no sustituido o un sustituyente de la fórmula (A): en donde: RA, RB, y Re cada uno son seleccionados independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, halógeno, Ci-Ce alquilo, C3-C6 cicloalquilo, arilo, ciano, nitro, y un grupo carbonilo; y G es O, -NH, o S; R2 es hidrógeno, hidroxi, halógeno, nitro, arilo, alquilo, alcoxi, alquenilo, alqueniloxi, alquinilo, alquiniloxi, aralquilo, -CHO, -C(0)R9) - OC(0)R9, -OC(0)OR9, -0(CN)OR9, -C(O)NR9R10, -OC(O)NR9R10, -NR9OR5, o -S03R9; en donde R9 y R10 cada uno son independientemente hidrógeno, alquilo, arilo, o aralquilo; R3 es -NH-O-alquilo, -NH-OH, -OR,, o -NR Ri2, en donde Rn y R12 cada uno son independientemente hidrógeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, o aralquilo; o R y R12 juntos forman un grupo cíclico; o Rn y R 2 junto con el nitrógeno al cual se enlazan forman un grupo cíclico; X es O o -NR13, en donde R13 es hidrógeno, alquilo, arilo, o aralquilo; o un estereoisómero, solvato, hidrato, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; y un compuesto que tiene la fórmula (V): en donde: el anillo ABD comprende dos enlaces dobles no adyacentes; A, B y D cada uno son independientemente S, N, O, C, -NR14, -CR 5, o -CR15R16, en donde R14 es hidrógeno, halógeno, alquilo, arilo, o aralquilo; y R15 y R-ie cada uno son independientemente hidrógeno, hidroxi, halógeno, nitro, arilo, alquilo, alcoxi, alquenilo, alqueniloxi, alquinilo, alquiniloxi, aralquilo, -CHO, -C(0)R9, -OC(0)R9, -OC(0)OR9, -0(CN)OR9, -C(O)NR9R10, -OC(O)NR9R10, -NR9OR5, o -S03R9; en donde Rg y R10 cada uno son independientemente hidrógeno, alquilo, arilo, o aralquilo, siempre que al menos dos de A, B y D comprendan S, N, o O; i es alquilo, -CH = CH-arilo, o arilo; y R3 es alquilo, arilo, aralquilo, -OR , o -NR4R5, en donde: R4 y R5 cada uno son independientemente hidrógeno, alquilo, arilo, o aralquilo; o R4 y R5 juntos forman un grupo cíclico; o R y R5 junto con el nitrógeno al cual se adhieren ambos forman un grupo cíclico. En ciertas modalidades con respecto a los compuestos de la fórmula (V), existe la provisión de que los compuestos de la fórmula (Va) sean excluidos: en donde R18 es alquilo, tal como alquilo o ciclopentilo, o alquenilo inferior, tal como alquenilo o alilo inferior, y G es O o S.
B. Definiciones Químicas Cuando se utiliza dentro del contexto de un grupo químico, "hidrógeno" significa -H; "hidroxi" significa -OH; "oxo" significa =0; "halo" significa independientemente -F, -Cl, -Br o -I; "amino" significa -NH2 (ver más adelante para definiciones de grupos que contienen el término amino, por ejemplo, alquilamino); "hidroxiamino" significa -NHOH; "nitro" significa - N02; ¡mino significa =NH (ver más adelante para definiciones de grupos que contienen el término imino, por ejemplo, alquilimino); "ciano" significa -CN; "isocianato" significa -N = C = 0; "azido" significa -N3; en un contexto monovalente "fosfato" significa -OP(0)(OH)2 o una forma desprotonada del mismo; en un contexto divalente "fosfato" significa OP(0)(OH)0- o una forma desprotonada del mismo; "mercapto" significa -SH; y "tio" significa =S.
Dentro del contexto de las fórmulas químicas, el símbolo "-" significa un enlace simple, " = " significa un enlace doble, y "=" significa un enlace triple. El símbolo " " representa un enlace opcional, el cual si está presente es ya sea en forma simple o doble. El símbolo representa un enlace simple o un enlace doble. Por lo tanto, por ejemplo, la estructura incluye las estructuras . Tal como lo comprenderán los expertos en la técnica, ningún átomo de anillo forma parte de más de un enlace doble. El símbolo "»??? n> cuanc|0 se extrae perpendicularmente a través de un enlace, indica un punto de adhesión del grupo. Se observó que el punto de adhesión normalmente se identifica en esta forma para grupos más grandes con el objeto de ayudar al lector a identificar rápidamente y en forma no ambigua el punto de adhesión. El símbolo ""¦¦ß "significa un enlace simple en donde el grupo adherido al extremo grueso de la cuña está "fuera de la página". El símbolo "??????" significa un enlace simple en donde el grupo adherido al extremo grueso de la cuña está "dentro de la página". El símbolo ">???" significa un enlace simple en donde la conformación (ya sea R o S) o la geometría no está definida (por ejemplo, ya sea E o Z).
Cualquier valencia no definida en un átomo de una estructura mostrada en la presente solicitud, representa implícitamente un átomo de hidrógeno enlazado al átomo. Cuando se ilustra un grupo "R" como un "grupo flotante" en un sistema de anillo, por ejemplo, en la fórmula: entonces R puede reemplazar cualquier átomo de hidrógeno adherido a cualquier de los átomos de anillo, incluyendo un hidrógeno, ilustrado, implicado o expresamente definido, siempre que se forma una estructura estable. Cuando un grupo "R" se ilustra como un "grupo flotante" en un sistema de anillo fusionado, como por ejemplo en la fórmula: entonces R puede reemplazar cualquier hidrógeno adherido a cualquier átomos de anillo de cualquiera de los anillos fusionados, al menos que se especifique de otra forma. Los hidrógenos reemplazables incluyen hidrógenos ilustrados (por ejemplo, el hidrógeno adherido al nitrógeno en la formula anterior), hidrógenos implicados (por ejemplo, un hidrógeno de la fórmula anterior que no se muestra pero se entiende como que está presente), hidrógenos expresamente definidos, e hidrógenos opcionales cuya presencia depende de la identidad de un átomo de anillo (por ejemplo, un hidrógeno adherido al grupo X, cuando X es igual a -CH-), siempre que se forme una estructura estable. En el ejemplo ilustrado, R puede residir ya sea el anillo de 5 miembros o el anillo de 6 miembros del sistema de anillos fusionado. En la fórmula anterior, la letra en subíndice "y" inmediatamente después del grupo "R" encerrada en un paréntesis, representa una variable numérica. A menos que se especifique de otra forma, esta variable puede ser 0, 1, 2, o cualquier entero mayor a 2, únicamente limitado por el número máximo de átomos de hidrógeno reemplazables del anillo o sistema de anillo.
Para los grupos y clases que se encuentran más adelante, los siguientes subíndices en paréntesis definen además el grupo/clase como se indica: "(Cn)" define el número exacto (n) de átomos de carbono en el grupo/clase. "(C=n)" definiendo el número máximo (n) de átomos de carbono que pueden estar en el grupo/clase, con el número mínimo tan pequeño como sea posible para el grupo en cuestión, por ejemplo, quedará entendido que el número mínimo de átomos de carbono en el grupo "alquenil(c=8)" o la clase "alqueno(c=8)" es dos. Por ejemplo, "alcoxi(c=io)" designa los grupos alcoxi que tienen de 1 a 10 átomos de carbono (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10, o cualquier rango que se pueda derivar de ahí (por ejemplo, 3 a 10 átomos de carbono). (Cn-n') define tanto el número mínimo (n) como máximo (?') de átomos de carbono en el grupo. Similarmente, "alquil(C2-io)" designa grupos alquilo que tienen de 2 a 10 átomos de carbono (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10, o cualquier rango que se derive (por ejemplo, 3 a 10 átomos de carbono)).
El término "saturado" tal como se utiliza en la presente invención, significa el compuesto o grupo ya modificado que no tiene un enlace doble carbono-carbono o enlaces triples carbono-carbono, excepto como se indica a continuación. El término no excluye enlaces múltiples de carbono-heteroátomo, por ejemplo un enlace doble de oxígeno a carbono o un enlace doble de nitrógeno a carbono. Además, no se excluye un enlace doble de carbono-carbono que pueda ocurrir como parte del tautomerismo ceto-enol o tautomerismo imina/enamina.
El término "alifático" cuando se utiliza sin el modificar "sustituido" significa que el compuesto/grupo así modificado es un compuesto o grupo de hidrocarburo acíclico o cíclico, pero no aromático (alicíclico). En compuestos/grupos alifáticos, los átomos de carbono pueden unirse juntos en cadenas rectas, cadenas ramificadas o anillos no aromáticos. Los compuestos/grupos alifáticos pueden ser saturados, esto es unidos por enlaces simples (alcanos/alquilo) , o insaturados con uno o más enlaces dobles (alquenos/alquenilo) o con uno o más enlaces triples (alqu inos/alquinilo). Cuando se utiliza el término "alifático" sin el modificador "sustituido", únicamente están presentes átomos de carbono e hidrógeno. Cuando se utiliza el término con el modificador "sustituido", se han reemplazado de manera independiente uno o más átomos de hidrógeno mediante -OH, -F, -Cl, -Br, -I, -NH2, -N02, "C02H, -C02CH3, -CN, -SH, -OCH3, -OCH2CH3, -C(0)CH3, -N(CH3)2, -C(0)NH2, -OC(0)CH3, o -S(0)2NH2.
El término "alquilo" cuando se utiliza sin el modificador "sustituido" se refiere a un grupo alifático saturado monovalente con un átomo de carbono como el punto de adhesión, una estructura lineal o ramificada ciclo, cíclica o acíclica, y sin átomos además de carbono e hidrógeno. Por lo tanto, tal como se utiliza en la presente invención cicloalquilo es un subconjunto de alquilo. Los grupos -CH3 (Me), -CH2CH3 (Et), -CH2CH2CH3 (n-Pr), -CH(CH3)2 (/so-Pr), -CH(CH2)2(ciclopropil), -CH2CH2CH2CH3 (n-Bu), -CH(CH3)CH2CH3 (sec-butilo) , CH2CH(CH3)2 (/so-bulil), "C(CH3)3 (ter-butilo), -CH2C(CH3)3(neo-pentilo), ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo, y ciclohexilmetilo son ejemplos no limitantes de grupos alquilo. El término "alcanodiilo" cuando se utiliza sin el modificador "sustituido", se refiere a un grupo alifático saturado divalente, con uno o dos átomos de carbono saturados como el punto(s) de adhesión, una estructura lineal o ramificada ciclo, cíclica o acíclica, sin enlaces dobles o triples carbono-carbono, y sin átomos además de carbono e hidrógeno. Los grupos (metileno), -CH2CH2-, - C H 2 C ( C H 3 ) 2C H 2 - . -CH CH2CH y son ejemplos no limitantes de grupos alcanodiilo. El término "alquilideno" cuando se utiliza sin el modificador "sustituido" se refiere a un grupo divalente =CRR' en el cual R y R' independientemente hidrógeno, alquilo, o R y R' tomados juntos representan un alcanodiilo que tiene al menos dos átomos de carbono. Los ejemplos no limitantes de grupos alquilideno incluyen: = CH2, = CH(CH2CH3), y =C(CH3)2. Cuando cualquiera de estos términos se utiliza con el modificador "sustituido, uno o más átomos de hidrógeno han sido reemplazados independientemente por -OH, -F, -Cl, -Br, -I, -NH2, -N02, "C02H, -C02CH3, -CN, -SH, -OCH3, -OCH2CH3, -C(0)CH3, -N(CH3)2, -C(0)NH2, -OC(0)CH3, o -S(0)2NH2. Los siguientes grupos son ejemplos no limitantes de grupos alquilo sustituidos: -CH2OH, -CH2CI, ~CF3, -CH2CN, -CH2C(0)OH, -CH2C(0)OCH3, -CH2C(0)NH2) -CH2C(0)CH3, -CH2OCH3, -CH2OC(0)CH3, -CH2NH2, -CH2N(CH3)2, y -CH2CH2CI. El término "haloalquilo" es un subconjunto de alquilo sustituido, en donde se han sustituido uno o más hidrógenos con un grupo halo y no están presentes otros átomos además de hidrógeno y halógeno. El grupo -CH2CI es un ejemplo no limitante de un haloalquilo. Un "alcano" se refiere a un compuesto H-R, en donde R es alquilo. El término "fluoroalquilo" es un subconjunto de alquilo, en donde se han sustituido uno o más hidrógenos con un grupo fluoro, y no están presentes otros átomos además de carbono, hidrógeno y fluoro. Los grupos -CH2F, -CF3, y -CH2CF3 son ejemplos no limitantes de grupos fluoroalquilo. Un "alcano" se refiere al compuesto H-R, en donde R es alquilo.
El término "alquenilo" cuando se utiliza sin el modificador "sustituido" se refiere a un grupo alifático insaturado monovalente con un átomo de carbono como el punto de adhesión, una estructura lineal o ramificada, ciclo, cíclica o acíclica, al menos un enlace doble carbono-carbono no aromático, sin enlaces triples carbono-carbono, y sin átomos además de carbono y hidrógeno. Los ejemplos no limitantes de grupos alquenilo incluyen: -CH = CH2(vinil), -CH = CHCH3, CH = CHCH2CH3, -CH2CH = CH2 (alil), -CH2CH = CHCH3, y -CH = CH-C6H5. El término "alquenodülo" cuando se utiliza sin el modificador "sustituido", se refiere a un grupo alifático insaturado divalente, con dos átomos de carbono tal como puntos de adhesión, una estructura lineal o ramificada ciclo, cíclico o acíclico, al menos un enlace doble carbono-carbono no aromático, y sin enlaces triples carbono-carbono y sin átomos además de carbono e hidrógeno. Los grupos, -CH = CH- CH = C(CH3)CH2- -CH = CHCH2- y son ejemplos limitantes de grupos alquenodülo. Cuando estos términos se utilizan con el modificador "sustituido", uno o más átomos de hidrógeno han sido reemplazados independientemente por -OH, -F, -Cl, -Br, -I, -NH2, -N02, -C02H, -C02CH3, -CN, -SH, -OCH3, -OCH2CH3( -C(0)CH3, -N(CH3)2, -C(0)NH2, -OC(0)CH3, o -S(0)2NH2. Los grupos, -CH = CHF, -CH = CHCI y -CH = CHBr, son ejemplos no limitantes de grupos alquenilo sustituido. Un "alqueno" se refiere al compuesto H-R, en donde R es alquenilo.
El término "alquínilo" cuando se utiliza sin el modificador "sustituido", se refiere a un grupo alifático insaturado monovalente con un átomo de carbono como el punto de adhesión, una estructura lineal o ramificada ciclo, cíclica o acíclica, al menos un enlace triple carbono-carbono, y sin átomos además de carbono e hidrógeno. Tal como se utiliza en la presente invención, el término alquinilo no excluye la presencia de uno o más enlaces dobles de carbono-carbono no aromáticos. Los grupos, -C=CH, -C=CCH3, y -CH2C=CCH3, son ejemplos no limitantes de grupos alquinilo. El término "alquinodiilo" cuando se utiliza sin el modificador "sustituido" se refiere a un grupo alifático insaturado divalente, con dos átomos de carbono como puntos de adhesión, una estructura lineal o ramificada ciclo, cíclica o acíclica, al menos un enlace triple carbono-carbono, y sin átomos además de carbono e hidrógeno. Cuando estos términos se utilizan con el modificador "sustituido", uno o más átomos de hidrógeno han sido reemplazados independientemente por -OH, -F, -Cl, -Br, -I, -NH2, -N02, -C02H, -C02CH3, -CN, -SH, -OCH3, -OCH2CH3, -C(0)CH3, -N(CH3)2, -C(0)NH2, -OC(0)CH3, o -S(Q)2NH2. Un "alquino" se refiere al compuesto H-R, en donde R es alquinilo.
El término "arilo", cuando se utiliza sin el modificador "sustituido", se refiere a un grupo aromático insaturado monovalente con un átomo de carbono aromático como el punto de adhesión, formando parte el átomo de carbono de una o más estructuras de anillo aromáticas de seis miembros, en donde los átomos de anillo todos son carbono, y en donde el grupo consiste en no más átomos además de carbono e hidrógeno. Si está presente más de un anillo, los anillos pueden ser fusionados o no fusionados. Tal como se utiliza en la presente invención, el término no excluye la presencia de uno o más grupos alquilo (permitiendo la limitación del número de carbono) adheridos al primer anillo aromático o cualquier anillo aromático adicional presente. Los ejemplos no limitantes de grupos arilo incluyen fenilo (Ph), metilfenilo, (dimetil)fenilo, -C6H4CH2CH3 (etilfenil), naftilo, y el grupo monovalente derivado de bifenilo. El término "arenodiilo" cuando se utiliza sin el modificador "sustituido", se refiere a un grupo aromático divalente, con dos átomos de carbono aromáticos como los puntos de adhesión, formando parte de los átomos de carbono de una o más estructuras lineal aromática de seis miembros en donde los átomos de anillo todos son carbono, y en donde el grupo monovalente consiste en no más átomos que carbono e hidrógeno. Tal como se utiliza en la presente invención, el término no excluye la presencia de uno o más grupos alquilo (permitiendo la limitación de números de carbono) adheridos al primer anillo aromático, o cualquier anillo aromático adicional presente. Si está presente, más de un anillo, los anillos pueden ser fusionados o no fusionados. Los ejemplos no limitantes de grupos arenodiilo incluyen: Cuando estos términos se utilizan con el modificador "sustituido", uno o más átomos de hidrógeno ha sido reemplazado independientemente por -OH, -F, -Cl, -Br, -I, -NH2, -N02, "C02H, -C02CH3, -CN, -SH, -OCH3, -OCH2CH3, -C(0)CH3, -N(CH3)2, -C(0)NH2, -OC(0)CH3, o -S(0)2NH2. Un "areno" se refiere al compuesto H-R, en donde R es arilo.
El término "aralquilo" cuando se utiliza sin el modificador "sustituido" se refiere al grupo monovalente -alcanediil-arilo, en donde los términos alcanediilo y arilo cada uno se utilizan en una forma consistente con las definiciones aquí proporcionadas. Los ejemplos no limitantes de araiquiios son: fenilmetilo (bencilo, Bn) y 2-fenil-etilo. Cuando el término se utiliza con el modificador "sustituido", uno o más átomos de hidrógeno del alcanodiilo y/o arilo ha sido reemplazado independientemente por -OH, -F, -Cl, -Br, -I, -NH2, -N02, -C02H, -C02CH3, -CN, -SH, -OCH3, -0CH2CH3, -C(0)CH3, -N(CH3)2, -C(0)NH2, -OC(0)CH3, o -S(0)2NH2. Los ejemplos no limitantes de araiquiios sustituidos son: (3-clorofenil)-metilo, y 2-cloro-2-fenil-et-1 -ilo.
El término "heteroarilo", cuando se utiliza sin el modificador "sustituido", se refiere a un grupo aromático monovalente con un átomo de carbono o átomo de nitrógeno aromático como el punto de adhesión, formando parte el átomo de carbono o átomo de nitrógeno de una estructura de anillo aromático, en donde al menos uno de los átomos de anillo es nitrógeno, oxígeno o azufre, y en donde el grupo consiste en no átomos además de carbono, hidrógeno, nitrógeno aromático, oxígeno aromático y azufre aromático. Tal como se utiliza en la presente invención, el término no excluye la presencia de uno o más grupos alquilo (permitiendo la limitación de número de carbono) adherido al anillo aromático o cualquier anillo aromático adicional presente. Los ejemplos no limitantes de grupos heteroarilo incluyen furanilo, imidazolilo, indolilo, indazolilo (lm), metilpiridilo, oxazolilo, piridilo, pirrolilo, pirimidilo, pirazinilo, quínolilo, quinazolilo, quinoxalinilo, tienilo, y triazinil. El término "heteroarenodiilo" cuando se utiliza sin el modificador "sustituido", se refiere a un grupo aromático divalente, con dos átomos de carbono aromáticos, dos átomos de carbono de nitrógeno aromáticos o un átomo de carbono aromático y un átomo de nitrógeno aromático como los dos puntos de adhesión, formando parte los átomos de una o más estructura(s) de anillo aromática, en donde al menos uno de los átomos de anillo es nitrógeno, oxígeno o azufre, y en donde el grupo divalente consiste en no átomos además de carbono, hidrógeno, nitrógeno aromático, oxígeno aromático y azufre aromático. Tal como se utiliza en la presente invención, el término no excluye la presencia de uno o más grupos alquilo (permitiendo la limitación de números de carbono) adheridos al grupo aromático o cualquier anillo aromático adicional presente. Si está presente más de un anillo, los anillos pueden ser fusionados o no fusionados. Los ejemplos no limitantes de grupos heteroarenodiilo incluyen: Cuando estos términos se utilizan con el modificador "sustituido", uno o más átomos de hidrógeno han sido reemplazados independientemente por -OH, -F, -Cl, -Br, -I, -NH2, -N02, C02H, -C02CH3, -CN, -SH, -OCH3, -OCH2CH3, -C(0)CH3, -N(CH3)2, -C(0)NH2, -OC(0)CH3, o -S(0)2NH2.
El término "acilo", cuando se utiliza sin el modificador "sustituido" se refiere al grupo -C(0)R, en donde R es un hidrógeno, alquilo, arilo, aralquilo o heteroarilo, tal como se define en los términos anteriormente. Los grupos, -CHO, -C(0)CH3 (acetilo, Ac), -C(0)CH2CH3, -C(0)CH2CH2CH3, -C(0)CH(CH3)2, -C(0)CH(CH2)2, -C(0)C6H5, -C(0)C6H4CH3l -C(0)CH2C6H5, -C(0)(imidazolil), son ejemplos no limitantes de grupos acilo. Un "tioacilo" se define en una forma análoga, excepto que el átomo de oxígeno del grupo -C(0)R ha sido reemplazado con un átomo de azufre, -C(S)R. Cuando cualquiera de estos términos se utilizan con el modificador "sustituido", uno o más átomos de hidrógeno han sido reemplazados independientemente por -OH, -F, -Cl, -Br, -I, -NH2, -N02, -C02H, -C02CH3, -CN, -SH, -OCH3, -OCH2CH3, -C(0)CH3, -N(CH,)2, -C(0)NH2, -OC(0)CH3, o -S(0)2NH2. Los grupos, -C(0)CH2CF3, -C02H (carboxilo), -C02CH3 (metilcarboxil), -C02CH2CH3, -C(0)NH2 (carbamoilo), y -CON(CH3)2, son ejemplos no limitantes de grupos acilo sustituidos.
El término "alcoxi" cuando se utiliza sin el modificador "sustituido" se refiere al grupo -OR, en donde R es un alquilo, tal como se define el término anteriormente. Los ejemplos no limitantes de grupos alcoxi incluyen: -OCH3, -OCH2CH3, -OCH2CH2CH3, -OCH(CH3)2, -OCH(CH2)2, -O-ciclopentilo, y -O-ciclohexilo. Los términos "alqueniloxi", "alquiniloxi", "ariloxi", "aralcoxi", "heteroariloxi", y "aciloxi", cuando se utilizan sin el modificador "sustituido", se refieren a grupos, definidos como -OR, en donde R es alquenilo, alquinilo, arilo, aralquilo, heteroarilo, y acilo, respectivamente. Similarmente, el término "alquiltio" cuando se utiliza sin el modificador "sustituido" se refiere al grupo -SR, en donde R es un alquilo, tal como se definió el término anteriormente. Cuando cualquiera de estos términos se utiliza con el modificador "sustituido", uno o más átomos de hidrógeno han sido reemplazados independientemente por -OH, -F, -Cl, -Br, -I, -NH2, -N02, -C02H, -C02CH3> -CN, -SH, -OCH3, -OCH2CH3, -C(0)CH3, -N(CH3)2, -C(0)NH2, -OC(0)CH3, o -S(0)2NH2. El término "alcohol" corresponde a un alcano, tal como se definió anteriormente, en donde al menos uno de los átomos de hidrógeno ha sido reemplazado por un grupo hidroxi.
El término "alquilamino" cuando se utiliza sin el modificador "sustituido" se refiere al grupo -NHR, en donde R es un alquilo, tal como se definió el término anteriormente. Los ejemplos no limitantes de grupos alquilamino incluyen: -NHCH3 y -NHCH2CH3. El término "dialquilamino", cuando se utiliza sin el modificador "sustituido" se refiere al grupo -NRR', en donde R y R' pueden ser los mismos grupos alquilo o diferentes, o R y R' se pueden tomar juntos para representar un alcanodiilo. Los ejemplos no limitantes de grupos dialquilamino incluyen: -N(CH3)2, -N(CH3)(CH2CH3), y N-pirrolidinilo. Los términos "alcoxiamino", "alquenilamino", "alquiniloamino", "arilamino", "aralquiloamino", "heteroarilamino", y "alquilsulfonilamino" cuando se utiliza sin el modificador "sustituido", se refieren a grupos, tal como se define -NHR, en donde R es alcoxi, alquenilo, alquinilo, arilo, aralquilo, heteroarilo, y alquilsulfonilo, respectivamente. Un ejemplo no limitante de un grupo arilamino es -NHC6H5. El término "amido" (acilamino), cuando se utiliza sin el modificador "sustituido", se refiere al grupo -NHR, en donde R es acilo, tal como se definió el término anteriormente. Un ejemplo no limitante de un grupo amido es -NHC(0)CH3. El término "alquilimino" cuando se utiliza sin el modificador "sustituido" se refiere al grupo divalente = NR, en donde R es un alquilo, tal como se definió el término anteriormente. Cuando cualquiera de estos términos se utiliza con el modificador "sustituido", uno o más átomos de hidrógeno han sido reemplazados independientemente por -OH, -F, -Cl, -Br, -I, -NH2, -N02, "C02H, -C02CH3, -CN, -SH, -OCH3, -OCH2CH3, -C(0)CH3, -N(CH3)2, -C(0)NH2, -OC(0)CH3, o -S(0)2NH2. Los grupos -NHC(0)OCH3 y -NHC(0)NHCH3 son ejemplos no limitantes de grupos amido sustituido.
El término "alquilfosfato" cuando se utiliza sin el modificador "sustituido", se refiere al grupo -OP(0)(OH)(OR), en donde R es un alquilo, tal como se definió el término anteriormente. Los ejemplos no limitantes de grupos alquilfosfato incluyen: -OP(0)(OH)(OMe) y -OP(0)(OH)(OEt). El término "dialquilfosfato" cuando se utiliza sin el modificador "sustituido", se refiere al grupo -OP(0)(OR)(OR'), en donde R y R' puede ser los mismos grupos alquilo o diferentes, o R y R' pueden tomarse juntos para representar un alcanodiilo. Los ejemplos no limitantes de grupos dialquilfosfato incluyen: -OP(0)(O e)2, -OP(0)(OEt)(OMe) y -OP(0)(OEt)2. Cuando cualquiera de estos términos se utilizan con el modificador "sustituido", uno o más átomos de hidrógeno han sido reemplazados independientemente por -OH, -F, -Cl, -Br, -I, - H2, -N02, -C02H, -C02CH3, -CN, -SH, -OCH3, -OCH2CH3, -C(0)CH3, -N(CH3)2, -C(0)NH2, -OC(0)CH3, o -S(0)2NH2.
Los términos "alquilsulfonilo" y "alquilsulfinilo" cuando se utiliza sin el modificador "sustituido" se refiere a los grupos -S(0)2R y -S(0)R, respectivamente, en donde R es un alquilo, tal como se definió el término anteriormente. Los términos "alquenilsulfonilo", "alquinilosulfonilo", " a r ¡ I s u I f o n i I o " , "aralquilosulfonilo", y "heteroarilsulfonilo", se definen en una forma análoga. Cuando cualquiera de estos términos se utiliza con el modificador "sustituido", uno o más átomos de hidrógeno han sido reemplazados independientemente por -OH, -F, -Cl, -Br, -I, -H2, -N02, "C02H, -C02CH3, -CN, -SH, -OCH3, -OCH2CH3, -C(0)CH3, -N(CH3)2, -C(0)NH2, -OC(0)CH3, o -S(0)2NH2.
Tal como se utiliza en la presente invención, un "auxiliar quirálico" se refiere a un grupo quirálico removible que tiene la capacidad de influenciar la estereoselectividad de una reacción. Los expertos en la técnica están familiarizados con dichos compuestos, y muchos de ellos están comercialmente disponibles.
Las "sales farmacéuticamente aceptables" significa sales de compuestos de la presente invención están farmacéuticamente aceptable, tal como se definió anteriormente, y que poseen la actividad farmacológica deseada. Dichas sales incluyen sales de adición de ácido formadas con ácidos inorgánicos tales como ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido fosfórico, y similares, con ácidos orgánicos tal como ácido 1,2-etanodisulfónico, ácido 2-hidroxi etanosulfónico, ácido 2-naftalenosulfónico, ácido 3-fenilpropiónico, 4,4'-metilenobis(ácido 3-hidroxi-2-eno-1 -carboxílico), ácido 4-metilbiciclo[2.2.2]oct-2-eno-1 -carboxílico, ácido acético, alifático mono- y ácidos dicarboxílico, ácido sulfúrico alifático, ácidos sulfúricos aromáticos, ácido bencenosulfónico, ácido benzoico, ácido camforsulfónico, ácido carbónico, ácido cinnamico, ácido cítrico, ácido ciclopentanopropiónico, ácido etanosulfónico, ácido fumárico, ácido glucoheptonico, ácido glucónico, ácido glutámico, ácido, glucólico, ácido heptanoico, ácido hexanoico, ácido hidroxinaftoico, ácido láctico, ácido laurilsulfúrico, ácido maleico, ácido málico, ácido malónico, ácido mandélico, ácido metanosulfónico, ácido mucónico, ácido o-(4-hidroxibenzoil)benzoico, ácido oxálico, ácido p-clorobencenosulfónico, ácidos alcanoico sustituido con fenilo, ácido propiónico, ácido p-toluenesulfónico, ácido pirúvico, ácido salicílico, ácido esteárico, ácido succínico, ácido tartárico, ácido ter-aributilacético, ácido trimetilacético, y similares. Las sales farmacéuticamente aceptables también incluyen sales de adición base que se pueden formar cuando los protones ácidos presentes tienen la capacidad de reaccionar con bases inorgánicas u orgánicas. Las bases inorgánicas aceptables incluyen hidróxido de sodio, carbonato de sodio, hidróxido de potasio, hidróxido de aluminio e hidróxido de calcio. Las bases orgánicas aceptables incluyen etanolamina, dietanolamina, trietanolamina, trometamina, N-metilglucamina y similares. Deberá reconocerse que el anión o catión particular que forma parte de cualquier sal de la presente invención, no es importante siempre que la sal, como una totalidad, sea farmacológicamente aceptable. Los ejemplos adicionales de sales y sus métodos de preparación y uso se presentan en la Publicación de Handbook de Pharmaceutical Salts: Properties, y Use (Manual de Sales Farmacéuticas: Propiedades y Uso) (2002).
Las modificaciones o derivados de los compuestos, agentes, e ingredientes activos descritos a lo largo de la presente especificación, están contemplados como útiles como los métodos y composiciones de la presente invención. Los derivados pueden ser preparados, y las propiedades de los derivados pueden ser ensayadas para sus propiedades deseadas a través de cualquier método conocido en la técnica.
En ciertos aspectos, el término "derivado" se refiere a un compuesto modificado químicamente que aún retiene los efectos deseados del compuesto antes de la modificación química. Los "derivados de isoxazol" por consiguiente se refieren a un compuesto modificado químicamente que aún retiene los efectos deseados del isoxazol de origen antes de su modificación química. Dichos efectos pueden ser incrementados (por ejemplo, ligeramente más efectivos, dos veces más efectivos, etc) o disminuidos (por ejemplo, ligeramente menos efectivos, 2 veces menos efectivos, etc.) en forma relativa al isoxazol de origen, pero aún se considera como un derivado isoxazol. Dichos derivados pueden tener la adición, eliminación o sustitución de una o más porciones químicas en la molécula de origen. Los ejemplos no limitantes de tipos de modificaciones que se pueden elaborar a los compuestos y estructuras aquí descritos incluyen la adición o eliminación de alquilos no sustituidos inferiores tales como metilo, etilo, propilo, o alquilos inferiores sustituidos tales como grupos hidroximetilo o aminometilo; grupos carboxilo y grupos carbonilo; hidroxilos; grupos nitro, amino, amida, y azo; grupos sulfato, sulfonato, sulfono, sulfhidrilo, sulfonilo, sulfoxido, fosfato, fosfono, fosforilo grupos, y sustituyentes de haluro. Las modificaciones adicionales pueden incluir una adición o una eliminación de uno o más átomos de la estructura atómica, por ejemplo, sustitución de un etilo por un propilo; sustitución de un fenilo por un grupo aromático, más grande o más pequeño. Alternativamente, en la estructura cíclico o bicíclico, los heteroátomos tales como N, S, o O pueden ser sustituidos en la estructura en lugar de un átomo de carbono.
Los profármacos y solvatos de los compuestos de la presente invención también se contemplan en la presente invención. El término "profármaco" tal como se utiliza en la presente invención, se entiende como un compuesto el cual, al administrarse a un sujeto, tal como un mamífero, pasa por conversión química mediante procesos metabólicos o químicos para producir un compuesto de cualquiera de las fórmulas aquí mencionadas, o una sal y/o solvato del mismo (Bundgaard, 1991; Bundgaard, 1985). Los solvatos de los compuestos de la presente invención son preferentemente hidratos.
Los ejemplos no limitantes de ácidos inorgánicos que se pueden utilizar para preparar las sales farmacéuticamente aceptables incluyen: ácido clorhídrico, ácido fosfórico, ácido sulfúrico, ácido bromhídrico, ácido yodhídrico, ácido fosforoso y similares. Los ejemplos de ácidos orgánicos que se pueden utilizar para preparar las sales farmacéuticamente aceptables incluyen: ácidos mono- y dicarboxílicos alifáticos, tal como ácido oxálico, ácido carbónico, ácido cítrico, ácido succínico, ácidos alcanoicos sustituidos con heteroátomo de fenilo, ácidos sulfúricos alifáticos y aromáticos y similares. Las sales farmacéuticamente aceptables preparadas a partir de ácidos inorgánicos u orgánicos incluyen por lo tanto clorhídrico, bromhídrico, nitrato, sulfato, pirosulfato, bisulfato, sulfito, bisulfato, fosfato, monohidrogenofosfato, dihidrogenofosfato, metafosfato, pirofosfato, yodihidrato, fluorhidrato, acetato, propionato, formato, oxalato, citrato, lactato, p-toluensulfonato, metanosulfonato, maleato, y similares.
Las sales farmacéuticamente aceptable adecuadas también se pueden formar haciendo reaccionar los agentes de la presente invención con una base orgánica tal como metilamina, etilamina, etanolamina, lisina, ornitina y similares.
Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen las sales formadas entre grupos carboxilato o sulfonato encontrados en algunos de los compuestos de la presente invención y los cationes inorgánicos, tales como sodio, potasio, amonio, o calcio, o cationes orgánicos tales como isopropilamonio, trimetilamonio, tetrametilamonio, y imidazolio.
Deberá reconocerse que el anión o catión particular que forma parte de cualquier la sal de la presente invención no es importante, siempre que la sal, como una totalidad sea farmacológicamente aceptable. Los ejemplos adicionales de sales farmacéuticamente aceptables y sus métodos de preparación y uso presentan en la Publicación de Handbook de Pharmaceutical Salts: Properties, Selection y Use (Manual de Sales Farmacéuticas: Propiedades, Selección y Uso) (2002), la cual está incorporada a la presente invención como referencia.
Tal como se utiliza en la presente invención, el término "grupo cíclico" se refiere a un grupo carbocíclico (por ejemplo, ciclopropilo, ciclohexilo), un grupo heterociclo (por ejemplo, pirrolidinilo), un grupo arilo, o cualquier combinación de los mismos (por ejemplo, grupo bicíclico fusionado).
Tal como se utiliza en la presente invención, el "grupo de protección" se refiere a una porción adherida al grupo funcional para prevenir una reacción no deseada de dicho grupo funcional. Los grupos de protección son conocidos para los expertos en la técnica. Los grupos de protección de ejemplo no limitantes, están dentro de las categorías tales como los grupos de protección hidroxi, grupos de protección amino, grupos de protección sulfhidrilo, grupos de protección y grupos de protección carbonilo. Dichos grupos de protección pueden encontrarse en la Publicación de Greene y Wuts (1999). Los compuestos de la presente invención se contemplan específicamente en donde uno o más grupos funcionales son protegidos por un grupo de protección.
Los compuestos de la presente invención pueden contener uno o más centros asimétricos, y por lo tanto pueden surgir como racematos o mezclas racémicas, enantiómeros simples, mezclas diastereoméricas o diastereómeros individuales. En ciertas modalidades, está presente un diastereómero simple. Todos los posibles estereoisómeros de los compuestos de la presente invención, están contemplados como estando dentro del alcance de la presente invención. Sin embargo, en ciertos aspectos se contemplan diastereómeros particulares. Los centros quirálicos de los compuestos de la presente invención pueden tener la configuración S- o R- tal como se define mediante IUPAC 1974 Recommendations. En ciertos aspectos, ciertos compuestos de la presente invención pueden comprender configuraciones S- o R- en centros de carbono particulares. Por ejemplo, los siguientes compuestos específicos contienen centros asimétricos y por lo tanto son reivindicados como formas de mezcla racémica (+/-), ( + ) y S (-).
Las elecciones de solventes para la preparación sintética de compuestos de la presente invención, son bien conocidas para los expertos en la técnica. Las selecciones de solventes pueden depender, por ejemplo, de cual facilitará la solubilización de todos los reactivos, o por ejemplo, cual facilitará de mejor manera la reacción deseada (particularmente cuando se conoce el mecanismo de acción). Los solventes pueden incluir, por ejemplo, solventes polares y solventes no polares. Las elecciones de solventes incluyen pero no se limitan a, tetrahidrofurano, dimetilformamida, dimetilsulfóxido, dioxano, metanol, etanol, hexano, cloruro de metileno y acetonitrilo. Se puede elegir más de un solvente para cualquier reacción o procedimiento de purificación en particular. También se puede mezclar en adiciones el agua de cualquier elección de solvente. Además, el agua, tal como agua destilada, puede constituir el medio de reacción en lugar de un solvente.
Los expertos en la técnica estarán familiarizados con métodos para purificar compuestos de la presente invención. Un experto en la técnica comprenderá que los compuestos de la presente invención generalmente pueden ser purificados en cualquier paso, incluyendo la purificación de intermediarios así como la purificación de los productos finales. En modalidades particulares, la purificación se lleva a cabo a través de cromatografía de columna de gel de sílice o HPLC.
En virtud de las definiciones anteriores, otros términos químicos utilizados a lo largo de la presente solicitud pueden ser fácilmente comprendidos por los expertos en la técnica. Los términos pueden utilizarse solos o cualquier combinación de los mismos. Las longitudes de cadena preferidas y más preferidas de los grupos radicales, aplican para todas de dichas combinaciones.
C. Diabetes y Deficiencia de Insulina La diabetes melitus, con frecuencia es simplemente referida como diabetes, es un grupo de enfermedades metabólicas en donde la persona tiene alto nivel de azúcar en la sangre, ya sea debido a que el cuerpo no produce suficiente insulina o debido a que las células no responden a la insulina que se produce. Este alto contenido de azúcar en la sangre produce los síntomas clásicos de poliuria (orina frecuente), polidipsia (sed incrementada) y polifagia (hambre incrementada).
Existen tres tipos principales de diabetes: • Diabetes tipo 1: que resulta de la falla que tiene el cuerpo en producir insulina, y requiere que la persona se inyecte insulina. (También referido como diabetes melitus dependiente de insulina, IDDM para diabetes corta y juvenil).
• Diabetes tipo 2: resulta de la resistencia a insulina, una condición en la cual las células fallan en utilizar adecuadamente la insulina, y se combina eventualmente con una deficiencia absoluta de insulina. (Anteriormente referido como diabetes melitus no dependiente de insulina, NIDDM para diabetes corta, y desencadenamiento en adultos).
• Diabetes gestacional: es cuando la mujer embarazada, quien nunca ha tenido diabetes anteriormente, tiene un alto nivel de glucosa en la sangre durante el embarazo. Puede preceder el desarrollo de diabetes melitus tipo 2.
Otra forma de diabetes melitus incluye diabetes congénita, la cual se debe a defectos genéticos de secreción de insulina, diabetes relacionada con fibrosis quística, diabetes por esferoides inducida por altas dosis de glucocorticoides, y diversas formas de diabetes monogénica.
Todas las formas de diabetes han sido tratables desde que la insulina estuvo disponible en 1921, y la diabetes tipo 2 puede ser controlada con medicamento. Tanto el tipo 1 como el tipo 2, son condiciones crónicas que normalmente no se pueden curar.
Se han intentado trasplantes de páncreas con éxito limitado en diabetes tipo 1; la cirugía de bypass gástrico ha tenido éxito en muchos con obesidad mórbida y diabetes tipo 2. La diabetes gestacional normalmente se resuelve después del parto. La diabetes sin tratamiento adecuado puede originar muchas complicaciones. Las complicaciones agudas incluyen hipoglucemia, quetoacidosis diabética o, hiperosmolar no cetótico. Las complicaciones a largo plazo severas incluyen enfermedad cardiovascular, falla renal crónica, daño retinal. El tratamiento adecuado de diabetes por lo tanto es importante, así como el control de presión sanguínea y los factores de estilo de vida tales como dejar de fumar y mantener un peso corporal saludable.
La diabetes es una gran carga de salud, con un costo aproximado de $174 billones de dólares en el 2007. Sólo en los Estados Unidos de América más de 23 millones de personas, ~8% de la población son diabéticos; un 32% adicional de los adultos están en riesgo con prediabetes, ya sea tolerancia a glucosa oral dañada o glucosa en ayuno anormalmente alta (estadísticas NIDDK, ADA). Esto se agrega a una proporción cada vez más grande de la población en adultos en los Estados Unidos de América con metabolismo de glucosa anormal. A nivel mundial, 230 millones de personas son afectados por diabetes, y se espera que el número se duplique en los siguientes 20 años. Actualmente, la diabetes tipo 1 abarca únicamente el -5% del total. Ya que la obesidad se ha vuelto una epidemia, la diabetes tipo 2 se ha incrementado en un rango alarmante. A pesar de estos números desalentadores, las estadísticas también revelan que las intervenciones que mejoran el control glucémico reducen las consecuencias negativas en la salud.
La mayoría de los casos de diabetes melitus están en tres amplias categorías: diabetes tipo 1, tipo 2 y gestacional. Se describen algunos otros tipos. El término diabetes, sin calificación, normalmente se refiere a diabetes melitus. La enfermedad rara, diabetes insipidus, tiene síntomas similares a la diabetes melitus, pero sin las perturbaciones en el metabolismo del azúcar.
El término "diabetes tipo 1" ha reemplazado varios términos anteriores, incluyendo diabetes de generación en la infancia, diabetes juvenil y diabetes melitus dependiente de insulina (IDDM). De igual manera, el término "diabetes tipo 2" ha reemplazado otros varios de los términos anteriores, incluyendo diabetes de generación en adultos, diabetes relacionada con obesidad y diabetes melitus no dependiente de insulina (NIDDM). Además de estos dos tipos, no existe un acuerdo en la nomenclatura estándar. Varias fuentes han definido la "diabetes tipo 3" como: diabetes gestacional, diabetes tipo 1 resistente a insulina (o "diabetes doble"), diabetes tipo 2 que ha progresado en su requerimiento de insulina inyectada, y diabetes autoinmune latente de adultos (o diabetes LADA o "tipo 1.5").
La diabetes melitus tipo 1 está caracterizada por pérdida de células beta que producen insulina de los isletos de Langerhans en el páncreas, lo cual conduce a deficiencia de insulina. Este tipo de diabetes puede ser clasificada además como transmitida por inmunidad o idiopática. La mayor parte de la diabetes tipo 1 es de la naturaleza transmitida por el sistema inmune, en donde la pérdida de células ß es un ataque autoinmune transmitido por la célula T. No existe una medida preventiva conocida contra diabetes tipo 1, lo cual origina aproximadamente el 10% de los casos de diabetes melitus en América del Norte y Europa. Las personas más afectadas son personas saludables y con un peso saludable cuando se desencadena. La sensibilidad y capacidad de respuesta a la insulina es normal, especialmente en las etapas tempranas. La diabetes tipo 1 puede afectar a niños o adultos aunque normalmente se denomina "diabetes juvenil" debido a que representa una mayoría en los casos de diabetes en niños.
La diabetes melitus tipo 2 está caracterizada por resistencia a insulina que puede combinarse con secreción de insulina altamente reducida. La capacidad de respuesta defectuosa de los tejidos corporales a la insulina tiene una formación de posibles causas con obesidad como un factor importante. Los surgimientos de diabetes melitus enlazados a mutaciones de gen simple son conocidos como diabetes de generación en la madurez de los jóvenes o MODY, y se clasifican por separado. La diabetes tipo 2 es el tipo más común.
En la etapa temprana de diabetes tipo 2, la anormalidad predominante es la sensibilidad reducida a insulina. En esta etapa la hiperglucemia puede ser revertida por una variedad de medidas y medicamentos que mejoran la sensibilidad a insulina o reducen la producción de glucosa por parte del hígado.
La diabetes melitus gestacional (GDM) se asemeja a la diabetes tipo 2 en varios aspectos, implicando una combinación de secreción y capacidad de respuesta a insulina relativamente no adecuada. Ocurren aproximadamente del 2 al 5% de todos los embarazos y puede mejorar o desaparecer después del parto. La diabetes gestacional es completamente tratable, pero requiere supervisión médica cuidadosa a lo largo del embarazo. Aproximadamente del 20% al 50% de las mujeres afectadas desarrollan diabetes tipo 2 posteriormente en su vida.
Incluso aunque pueda ser temporal, la diabetes gestacional no tratada puede dañar la salud del feto o la madre. Los riesgos para el bebé incluyen macrosomia (mucho peso al nacer), anormalidades cardíacas y en el sistema nervioso central congénitas, malformaciones de músculo esquelético. La insulina fetal incrementada puede inhibir la producción de tensoactivo fetal y originar síndrome de dificultad respiratoria.
La hiperbilirrubinem ¡a puede resultar por la destrucción de glóbulos rojos. En casos severos, puede ocurrir muerte perinatal, en su mayoría comúnmente como resultado de una deficiente perfusión de la placenta debido al daño vascular. La inducción de labor de parto puede ser indicada con una función de placenta disminuida. Se puede llevar a cabo una cesárea si existe tensión fetal marcada o un riesgo incrementado de lesión asociada con macrosomia, tal como distocia de hombros.
Algunos de los casos de diabetes son originados por receptores de tejido del cuerpo que no responden a insulina (incluso cuando los niveles de insulina son normales, lo cual es lo que la separa de la diabetes tipo 2); esta forma es muy poco común. Las mutaciones genéticas (autosomales y mitocondriales) pueden conducir a defectos en la función de célula beta. La acción de insulina normal también puede haber sido determinada genéticamente en algunos casos. Cualquier enfermedad que origine daño extenso al páncreas puede conducir a diabetes (por ejemplo, pancreatitis crónica o fibrosis quística). Las enfermedades asociadas con secreción excesiva de hormonas antagonistas a insulina puede originar diabetes (lo cual normalmente se resuelve una vez que este exceso hormonal se elimina). Muchos fármacos dañan la secreción de insulina y algunas toxinas dañan las células ß pancreáticas. La entidad de diagnóstico ICD-10 (1992), diabetes melitus relacionada con mala nutrición (MRDM o MMDM, código ICD-10 E12), fue desaprobada por la World Health Organization (Organización Mundial de la Salud), cuando se introdujo una taxonomía actual en 1999.
D. Composiciones Farmacéuticas y Métodos de Tratamiento 1. Composiciones Se considera que, para administración a un receptor, los compuestos y células de la presente invención serán suspendidos en una formulación adecuada para administración a un receptor. Las composiciones acuosas de la presente invención comprenden una cantidad efectiva de un compuesto y/o células dispersas en una formulación y/o medio acuoso farmacéuticamente aceptable. Las frases "farmacéuticamente y/o farmacológicamente aceptable" se refieren a composiciones que no producen una reacción adversa, alérgica y/o de otra forma no dirigida cuando se administran a un animal, y específicamente a humanos, según sea lo adecuado.
Tal como aquí se utiliza, un "transportador farmacéuticamente aceptable" incluye cualquiera solventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y/o antifúngicos, agentes isotónicos y/o de retraso de absorción y similares. El uso de dichos medios o agentes para sustancias farmacéuticamente activas es bien conocido en la técnica. Excepto en la medida en que cualquier medio o agente convencional sea incompatible con el ingrediente activo, se contempla su uso en las composiciones terapéuticas. Los ingredientes activos suplementarios también pueden ser incorporados en las composiciones. Para administración a humanos, las preparaciones deben cumplir con estándares de esterilidad, pirogenicidad , seguridad y/o pureza en general, según lo requiere los estándares de FDA Office of Biologies (Oficina de Biologías de la FDA). 2. Administración Los compuestos y/o células para administración generalmente serán formulados para administración parenteral, por ejemplo, formulados para inyección mediante rutas intravenosas, intramusculares, subcutáneas, intralesionales o incluso intraperitoneales. La preparación de una composición acuosa que contiene células como un componente o ingrediente viable, será bien conocida para los expertos en la técnica a la luz de la presente descripción. En todos los casos, la forma debe ser estéril y debe ser fluida hasta el grado en que haya una fácil capacidad de inyección, y que se mantenga la viabilidad de las células. Se contempla generalmente que la mayor parte del medio de cultivo será eliminado de las células antes de la administración.
El trasplante de isletos está contemplado particularmente como parte de la presente invención. Una vez trasplantados, los isletos comienzan a producir insulina, regulando activamente el nivel de glucosa en la sangre. Los isletos normalmente se infusionan en el hígado del paciente. Si las células no proceden de un donador genéticamente idéntico, el cuerpo del paciente las reconocerá como extrañas y el sistema inmune comenzará a atacarlas como con cualquier rechazo de trasplante. Para evitar esto, se utilizan fármacos inmunosupresores. Los estudios recientes han mostrado que el trasplante de isletos ha progresado hasta el punto en que el 58% de los pacientes en un estudio fueron independientes a insulina un año después de la operación .
La meta del trasplante de isleto es infusionar suficientes isletos para controlar el nivel de glucosa en la sangre, eliminando la necesidad de inyecciones de insulina. Para una persona con complexión promedio (70 kg), un trasplante típico requiere aproximadamente un millón de isletos, aislados de dos páncreas de donadores. Debido al buen control de la glucosa en la sangre, se puede disminuir o prevenir el progreso de las complicaciones asociadas con diabetes, tal como daño a los nervios u ojos, un trasplante exitoso puede reducir el riesgo de estas complicaciones. No obstante un receptor del trasplante necesitará tomar fármacos inmunosupresores que detengan el sistema inmune, para que no rechace los isletos trasplantados.
Los investigadores utilizan una mezcla de enzimas altamente purificadas llamadas colagenasas para aislar los isletos del páncreas de un donador que ya falleció. La solución de colagenasa se inyecta en el ducto pancreático que corre a través de la cabeza, cuerpo y cola del páncreas. Suministrada de esta forma, la solución de enzimas origina la distención del páncreas, que subsecuentemente se corta en pequeños trozos y se transfiere en la llamada cámara de Ricordi, en donde tiene lugar la digestión hasta que los isletos son liberados y eliminados de la solución. Los isletos aislados se separan posteriormente del tejido exócrino y de los residuos en un proceso llamado purificación.
Durante el trasplante, un radiólogo utiliza ultrasonido y radiografía para guiar la colocación de un catéter a través del abdomen superior y en la vena portal del hígado. Los isletos infusionan posteriormente a través del catéter en el hígado. El paciente recibirá un anestésico local. Si un paciente no puede tolerar la anestesia local, el cirujano puede utilizar anestesia general y realizar el trasplante a través de una incisión pequeña. Los posibles riesgos del procedimiento incluyen sangrado o coágulos de sangre.
Toma tiempo que los isletos se adhieran a los nuevos vasos sanguíneos y comiencen a liberar insulina. El doctor ordenará muchas pruebas para revisar los niveles de glucosa en la sangre después del trasplante, y puede ser necesaria la insulina hasta que se logre el control.
En particular, se contempla el protocolo de Edmonton o una variación del mismo. El protocolo de Edmonton es un método para implantar isletos pancreáticos para el tratamiento de diabetes melitus tipo 1. El protocolo implica aislar isletos de un páncreas de donador cadavérico utilizando una mezcla de enzimas llamadas Liberase® (Roche). Cada receptor recibe isletos de uno hasta cuando mucho tres donadores. Los isletos son infusionados en la vena portal del paciente, seguido del uso de dos inmunosupresores, sirolimus y tacrolimus, así como el anticuerpo monoclonal daclizumab, para evitar el ataque por parte del sistema inmune del receptor. Sirolimus y tacrolimus, los dos fármacos principales que evitan que el sistema inmune destruya los isletos trasplantados, pueden ser tomados el resto de la vida.
Dos de las más importantes limitaciones son los medios actualmente no adecuados para evitar el rechazo de isletos, y el suministro limitado de isletos para el trasplante. Los regímenes inmunosupresores actuales tienen la capacidad de evitar la falla del isleto durante de meses hasta años, pero los agentes utilizados en estos tratamientos son costosos y pueden incrementar el riesgo de malignidades específicas e infecciones oportunistas. Además, y un tanto irónico, los agentes más comúnmente utilizados (tipo inhibidores de calcineurina y rapamicina) también son conocidos por dañar la función de isletos y/o acción de insulina normales. Además, igual que todos los medicamentos, los agentes tienen otras toxicidades asociadas, con efectos secundarios tales como úlceras orales, edema periférico, anemia, pérdida de peso, hipertensión, hiperlipidemia, diarrea y fatiga. Posiblemente la mayor preocupación para el paciente y el médico es el efecto peligroso de ciertos agentes inmunosupresores ampliamente empleados en la función renal. Para el paciente con diabetes, la función renal es un factor crucial en determinar el resultado a largo plazo, y los inhibidores de calcineurina (tacrolimus y ciclosporina) son significativamente nefrotóxicos. Por lo tanto, aunque algunos pacientes con trasplante de páncreas toleran bien los agentes inmunosupresores, y para dichos pacientes la nefropatía diabética puede mejorar gradualmente, en otros pacientes el efecto neto (riesgo disminuido debido al control mejorado de glucosa en la sangre, riesgo incrementado por los agentes inmunosupresores) puede empeorar la función renal. De hecho, Ojo et al., ha publicado un análisis que indica que entre pacientes que reciben aloinjertos además de riñón, el 7% a 21% terminan con falla renal como resultado del trasplante y/o inmunosupresión subsecuente.
Igual que todas las terapias de trasplante, el trasplante de isleto también está discapacitado por la recolección limitada del donador. Los números son alarmantes: al menos 1 millón de Americanos tienen diabetes melitus tipo 1, y están disponibles cada año únicamente unos pocos miles de donadores de páncreas. Para superar este problema de inconveniente de los órganos, los investigadores continúan viendo formas de "crecer" isletos - o al menos células con la capacidad de regular fisiológicamente la secreción de insulina - in vitro, aunque actualmente se pueden utilizar únicamente isletos de donadores cadavéricos para restaurar la euglucemia. Para exacerbar en forma adicional el problema (y a diferencia de los trasplantes de riñon, hígado y corazón, en donde únicamente se necesita un donador para cada paciente) la mayor parte de los pacientes de trasplante de isleto requieren isletos de dos o más donadores para lograr la euglucemia. Finalmente, los métodos actuales para el aislamiento de isletos necesitan ser mejorados, ya que únicamente aproximadamente la mitad de los aislamientos intentados producen isletos listos para trasplante. La presente invención proporciona por lo tanto métodos mejorados para tratar y estimular las células ß, incluyendo las que tienen productos de insulina reducidos o han perdido completamente su capacidad. Las composiciones de la presente invención incrementan/reactivan la producción de insulina en estas células, y pueden inducir en forma adicional la proliferación de célula ß. Los tratamientos pueden ocurrir ex vivo después de la recuperación de un cadáver o del paciente que está siendo tratado, o después de trasplante in vivo.
Generalmente, se preparan dispersiones incorporando los compuestos o células en un vehículo estéril que contiene el medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos para mantener la viabilidad celular. Así como los componentes potencialmente adicionales, para efectuar la proliferación, diferenciación o reemplazo/injerto in vivo. Al momento de la formulación, las soluciones serán administradas en una forma compatible con la formulación de dosificación, o en una cantidad que sea terapéuticamente efectiva. Ocurrirá necesariamente cierta variación en la dosificación, dependiendo de la condición del sujeto que esté siendo tratado. Los responsables de la administración, en cualquier caso, determinarán la dosis adecuada para el sujeto individual. 3. Terapias y Procedimientos Adjuntos De acuerdo con la presente invención, se puede probar la conveniencia de combinar los métodos aquí descritos con terapias o procedimientos adjuntos para incrementar el efecto antidiabético general. Dichas terapias y procedimientos se establecen en general más adelante. Un experto en la técnica podrá apreciar la forma más adecuada en la cual se pueden emplear estas terapias y procedimientos.
La presente invención, aunque diseñada para eliminar la necesidad de otras terapias, está contemplada para proporcionar un uso conveniente con suplemento de insulina tradicional, pero en menores niveles, tales como debajo de 90%, debajo de 80%, debajo de 70%, debajo de 60%, debajo de 50%, debajo de 40%, debajo de 30%, debajo de 20%, debajo de 15%, 10 a 15%, debajo de 10%, 5 a 10%, debajo de 5%, 4%, 3%, 2% o 1% de la dosis de insulina diaria normal. La dosis diaria normal para TD1 es de 30 a 60 unidades al día. Dichas terapias deben ser diseñadas específicamente para el paciente individual debido a su situación clínica actual, y se contempla que el sujeto pueda ser "deshabituado" dado de baja or desconectado de terapia de insulina después de comenzar la provisión de isoxazol. A continuación se encuentran lineamientos generales para una "monoterapia" típica utilizando suplemento de insulina mediante inyección, y pueden ser aplicadas aquí, aunque dentro del contexto de las reducciones antes mencionadas en la dosis diaria total.
La insulina puede ser inyectada en los muslos, abdomen, brazos superiores o región de glúteo. En los niños, se prefieren los muslos o el abdomen. Éstas ofrecen un área grande para una rotación de sitio frecuente y son fácilmente accesibles para autoinyección. La insulina inyectada en el abdomen se absorbe rápidamente, aunque no obstante desde el muslo se absorbe en forma más lenta. Por lo tanto, los pacientes no deben cambiar de un área a otra en forma aleatoria. El abdomen debe ser utilizado durante la hora en el día cuando se desea un intervalo corto entre la inyección y el alimento (normalmente previo al desayuno cuando el niño puede estar con prisas para ir a la escuela) y en los muslos cuando el paciente puede esperar 30 minutos después de la inyección para sus alimentos (normalmente antes de la cena). Dentro del área seleccionada la rotación del sitio sistemática puede practicarse de modo que no se administren más de una o dos inyecciones al mes en cualquier punto. Si no se practica el sitio de rotación, se pueden desarrollar grumos de grasa conocidos como lipohipertrofia en los sitios frecuentemente inyectados. Estos grumos son cosméticamente inaceptables, y lo más importante, la absorción de insulina en estas regiones es altamente errática.
Antes de inyectar la insulina, el sitio seleccionado debe ser limpiado con alcohol. La inyección antes de que se evapore el alcohol, puede ser muy dolorosa. La jeringa se sujeta como una pluma en una mano, se pincha la piel entre el dedo pulgar y el índice de la otra mano y se inserta la aguja a través de la piel en un ángulo de 45 a 90° hacia la superficie. El pistón se empuja hacia abajo para inyectar la insulina en el espacio subcutáneo (el espacio entre la piel y el músculo), entonces se espera unos segundos después de la liberación de la piel y antes de extraer la aguja. El sitio de inyección no se debe masajear.
Para el manejo de diabetes día a día, se utiliza una combinación de insulina de acción corta y acción intermedia. Algunos niños en el primer año después de la generación de diabetes pueden permanecer bien controlados con una sola inyección de insulina al día. Sin embargo, la mayor parte de los niños diabéticos requerirán 2, 3 o incuso 4 dosis de insulina al día para un buen control. Un doctor debe decidir que régimen es el más adecuado.
Régimen de una invección: Una sola inyección comprende una mezcla de insulina de acción corta y acción intermedia (mezclada en la misma jeringa) en una proporción de 1:3 o 1:4 que se toma de 20 a 30 minutos antes del desayuno. La dosis de inicio total usual es de 0.5 a 1.0 unidades/kg de peso corporal al día. Este régimen tiene tres desventajas: (1) todos los alimentos deben ser consumidos en momentos fijos; (2) ya que toda la cantidad de insulina se proporciona a la vez, se observa un solo pico grande de acción de insulina durante las horas tempranas y tardías del anochecer, haciéndolo más propenso a hipoglucemia en este momento; (3) ya que la acción de la insulina de acción intermedia raramente dura más allá de 16 a 18 horas, el cuerpo del paciente permanece subinsulinizado durante las horas tempranas de la mañana, período durante el cual normalmente es alto el requerimiento de insulina en el cuerpo.
Régimen de dos inyecciones: Este régimen es el más popular: Se toman dos dosis de insulina - una antes del desayuno (2/3 de la dosis total) y la otra después de la cena (1/3 de la dosis total). Cada una es una combinación de insulina de acción corta y acción intermedia en una proporción de 1:2 o 1:3 para la dosis de la mañana, y de 1:2 o 1:1 para la dosis de la noche. Con este régimen, se rectifican parcialmente las desventajas del régimen de una sola inyección. Es posible cierta flexibilidad para las comidas de la noche. Además, ya que la insulina total del día se divide, no ocurren grandes picos individuales de acción de insulina, reduciendo de esta forma el riesgo de hipoglucemia, y permaneciendo más o menos insulinizado de manera uniforme a lo largo del día. En este régimen, la glucosa en la sangre previa el desayuno es alta, aunque es baja en el nivel de 3 a.m., por lo que la dosis de la noche puede necesitar dividirse para proporcionar insulina de acción corta antes de la cena e insulina de acción intermedia al momento de dormir.
Regímenes de insulina de dosis múltiple: El cuerpo normalmente produce insulina en una forma de bolo basal, es decir, existe una secreción basal constante no relacionada con la ingesta de alimentos y de manera sobreimpuesta en esto, existe una liberación de insulina de bolo en respuesta a cada alimento. Los regímenes de insulina de dosis múltiple fueron considerados para mimetizar este patrón fisiológico de producción de insulina. La insulina de acción corta se toma antes de cada alimento principal (desayuno, comida y cena) para proporcionar "insulina de bolo" y la insulina de acción intermedia se administra una o dos veces al día para "insulina basal". Normalmente, la insulina de bolo comprende el 60% de la dosis total y la insulina basal abarca el 40% restante. Con este régimen se tiene gran flexibilidad. Tanto la programación, como la cantidad de cada alimento puede alterarse según se desee, haciendo alteraciones adecuadas en las dosis de insulina de bolo. Para tomar la mayor ventaja de este régimen, se debe aprender el "control de carbohidrato" y trabajar con la proporción de carbohidrato: insulina - el número de gramos de carbohidrato para el cual el cuerpo necesita una unidad de insulina. 4. Monitoreo de Niveles de Glucosa Cualquier persona que padece de diabetes, estará familiarizada con la necesidad de medir regularmente los niveles de glucosa en la sangre. El nivel de glucosa en la sangre es la cantidad de glucosa, o azúcar, en la sangre. También se refiere como "nivel de glucosa en suero". Normalmente, los niveles de glucosa en la sangre permanecen dentro de límites muy estrechos a lo largo del día (4 a 8 mmol/l), aunque con frecuencia son más altos después de los alimentos y normalmente más bajos en la mañana. Desafortunadamente cuando una persona tiene diabetes, su nivel de glucosa en la sangre algunas veces se mueve fuera de estos límites. Por lo tanto, muchos del reto de los diabéticos es que cuando se padece de diabetes, es importante que el nivel de glucosa esté tan cercano a lo normal como sea posible. La glucosa en la sangre estable reduce significativamente el riesgo de desarrollar complicaciones diabéticas de etapas tardías, que comienzan a aparecer de 10 a 15 años después del diagnóstico con diabetes tipo 1, y con frecuencia en menos de 10 años después del diagnóstico con diabetes tipo 2.
Los niveles de glucosa en la sangre pueden medirse muy simple y rápidamente con un equipo de prueba doméstico del nivel de glucosa en la sangre, que consiste en un aparato de automedición y una tira de prueba. Para revisar el nivel de glucosa en la sangre, se coloca una pequeña cantidad de sangre en la tira de prueba, la cual posteriormente se coloca dentro del aparato. Después de aproximadamente 30 segundos, el aparato muestra el nivel de glucosa en la sangre. La mejor forma de tomar una muestra de sangre es picando el dedo con una lanceta. Los valores ideales son (a) 4 a 7 mmol/l antes de los alimentos, (b) menos de 10 mmol/l una a una y media hora después de los alimentos; y (c) alrededor de 8 mmol/l al momento de dormir.
Las personas que atienden diabetes tipo 1 deben medir su nivel de glucosa en la sangre una vez al día, ya sea en la mañana antes del desayuno o a la hora de dormir. Además, se debe llevar a cabo un perfil de 24 horas un par de veces a la semana (midiendo los niveles de glucosa en la sangre antes de cada alimento y después de ir a la cama). Las personas que tienen diabetes tipo 2 y que están siendo tratadas con insulina también deben seguir este programa. Las personas que tienen diabetes tipo 2 y que están siendo tratadas con tabletas o una dieta especial, deben medir sus niveles de glucosa en la sangre una o dos veces a la semana, ya sea antes de los alimentos o una y media horas después de una comida. También deben llevar a cabo un perfil de 24 horas una o dos veces al mes.
La ventaja principal de medir los niveles de glucosa en la sangre de diabéticos tratados con insulina en la mañana, es que se pueden tomar cantidades de insulina ajustadas, si el nivel de glucosa en la sangre es alto o bajo, reduciendo de esta forma el riesgo de desarrollar complicaciones diabéticas de etapas tardía. Similarmente, el nivel de glucosa en sangre al momento de dormir debe ser de entre 7 y 10 mmol/. Si la glucosa en sangre es muy baja o muy alta al momento de ir a dormir, puede haber la necesidad de ajustar la ingesta de alimentos o la dosis de insulina. La glucosa en sangre también debe ser medida cada vez que el paciente no se siente bien, o piensa que su glucosa en la sangre está muy alta o muy baja. Las personas que tienen diabetes tipo 1 con un alto nivel de glucosa en su sangre (más de 20 mmol/l) además de residuos de azúcar en la orina, deben revisar los cuerpos de cetona en su orina, utilizando una tira de orina. Si están presentes cuerpos de cetona, es una señal de alarma de que ya sea tienen o pueden desarrollar acidosis diabética.
E. Ejemplos Se incluyen los siguientes ejemplos para demostrar ciertas modalidades preferidas de la presente invención. Los expertos en la técnica deberán apreciar que las técnicas descritas en los ejemplos que se encuentran a continuación representan técnicas descubiertas por los inventores para funcionar bien en la práctica de la presente invención, y por lo tanto se puede considerar que constituyen modos preferidos para su práctica. Sin embargo, los expertos en la técnica deben, a la luz de la presente descripción, apreciar que se pueden realizar muchos cambios en las modalidades específicas que se describen y obtener aún un resultado igual o similar sin apartarse de la esencia y alcance de la presente invención.
EJEMPLO 1 - MATERIALES Y MÉTODOS Materiales. Los anticuerpos contra ERK1/2 y pERK1/2 fueron tal como se describen (Lawrence et al., 2008). Los anticuerpos BETA2 (N-19), cMaf (M-153), PDX-1 (-18) y p300 (C-20) fueron de Santa Cruz Biotechnology . Los anticuerpos que reconocen las modificaciones de cromatina, pan-AcH4 K5K8K12K16 (06-866), AcH3K9 (07-352), AcH3K14 (07-353), AcH3K9K14 (07-353), fueron de Upstate/Millipore. Los inhibidores se obtuvieron de las siguientes fuentes: U0126 y FK506-LC Laboratories; PD0325901 -Stemgent; nifedipina y BAPTA-Calbiochem; wortmanina y tricostatina A-Sigma. La molécula pequeña 3.5-disustituida Isx fue descrita previamente y se muestra en la figura 5A (Sadek er al., 2008; Schneider ef al., 2008).
Cultivo celular y tratamiento. Se cultivaron células MIN6 en DMEM (Gibco), que contiene 25 mM de glucosa, 10% de suero de bovino fetal, 10 mM de Hepes pH 7.4, 10.2 mM L-glutamina, 50 mM de piruvato de sodio, 2.5 mM de ß-mercaptoetanol, 100 U/ml de penicilina y 100 de estreptomicina a una temperatura de 37°C en condiciones 10% C02. Se obtuvieron isletos humanos en ICR Basic Science Islet Distribution y en University of Alabama, Birmingham Islet Resource Facility, y se cultivaron en RPMI 1640 con 11 m de glucosa durante hasta 1 año. El medio se cambió dos veces a la semana y los isletos se subcultivaron cuando alcanzaron el 90% de confluencia. Para los tratamientos Isx, las células se incubaron en un medio que contiene ya sea Isx o el volumen equivalente de vehículo DMSO (0.04%). Para medir GSIS, las células se colocaron en bicarbonato de Krebs-Ringer/Hepes que contiene 0.1% de albúmina de suero de bovino y 2 mM de glucosa durante 2 horas, y se estimularon durante 15 minutos con 20 mM de glucosa, una mezcla de amino-ácido 1x (concentraciones como en DMEM), o 50 nM de Exendin-4. U0126 (10 µ?), nifedipina (3 µ?), BAPTA (10 µ?), wortmanina (0.5 µ?) o FK506 (0.1 µ?) se agregaron durante de 1 a 24 horas, según se indicó.
Construcciones de ADN. Se describió anteriormente (Lawrence et al., 2005) la construcción de reportero de promotor-luciferasa de insulina 1 de rata (pGL3-rlns -410, +1). Los vectores de expresión que codifican MafA:myc, PDX-1:myc y BETA2:myc fueron de Michael Germán (UCSF). p300 fue un obsequio de Joseph García (Southwestern). Se generaron mutantes de punta MafA:myc mediante mutagénesis Quik-Change (Agilent Technologies).
Análisis ChIP y Q-PCR. ChIP fue tal como se describió (Lawrence et al., 2008) con las siguientes modificaciones. La cromatina se reticuló con 1% de formaldeh ido y se sonicó con un Bioruptor 200 (Diagenode) en un baño de agua enfriada con hielo. Los anticuerpos inmovilizados en gránulos de proteína-sefarosa fueron utilizados para inmunoprecipitación. Los productos ChIP fueron analizados mediante Q-PCR de tiempo real tal como se describió previamente para análisis PCR de tiempo real (Lawrence et al., 2008) utilizando los siguientes cebadores (5'-CAGACCTAGCACCAGGG-3' (SEQ ID NO: 1) y 5'-GGACTTTGCTGTTTGTCCC-3' (SEQ ID NO: 2) para amplificar el fragmento -157/-50 del promotor de insulina de ratón que comprende los sitios de enlace C1 (MafA), E1 (BETA2) y A1 (PDX-1). Los resultados se expresaron en forma relativa a la entrada y se presentaron como un promedio +/- SEM de al menos dos experimentos independientes por triplicado.
Ensayos HAT y HDAC. Se midieron las actividades de desacetilasa y transferasa de acetilo de histona en 50 pg de proteína nuclear utilizando equipos de ensayo colorimétricos de actividad HAT y HDAC de Biovision Biotech nology de acuerdo con las recomendaciones del fabricante.
Análisis de Expresión de Gen. Se extrajo el ARN total de preparaciones de isleto humano con reactivo TRI de acuerdo con el protocolo del fabricante (Ambion). Se preparó cADN a partir de ARN total a través de una mezcla de transcripción inversa aleatoria imprimada por hexámero y oligo-dT- (iScript Biorad). Se evaluó la expresión de insulina y glucagon relativa al 18S ARN mediante ensayos TaqMan (Applied Biosystems). La expresión relativa de factores pancreáticos fue determinada utilizando la Mezcla Power SYBR Green PCR Master (Applied Bio systems). Las secuencias de cebador para qRT-PCR están en STable 1. Se llevó a cabo PCR a base de sonda SYBR Green y TaqMan utilizando el Sistema de Detección de Secuencia de ADN ABI 7500 con químicas fluorescentes estándar y condiciones de ciclado térmicas especificadas por el fabricante: 50°C durante 2 minutos, 95°C durante 10 minutos durante un ciclo y un adicional de 40 ciclos en 95°C durante 15 seg, y posteriormente 58°C durante 1 minuto.
Ensayos de Gen Reportero de Luciferasa. Se transfectaron células HEK 293 (células 0.15 x 106) por triplicado con la construcción de reportero pGL3-rlns (0.1 Mg/depósito) (Stratagene) y se cotransfectaron con 0.5 pg/depósito de ya sea un vector vacío (pcDNA3.1) o vectores que codifican BETA2:myc, MafA:myc o PDX-1:myc utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Después de 24 horas, las células se estimularon con 20 µ? Isx o DMSO durante otras 24 horas. La actividad de luciferasa se midió utilizando el sistema de reportero de luciferasa dual (Promega) con Renilla Luciferase como un control interno.
Estadísticas. Los experimentos con dos grupos se analizaron para significancia estadística utilizando la prueba t del Estudiante con dos colas disparejas. Las barras de error representan desviación estándar (s.d.), a menos que se indique de otra forma. Los valores de p<0.05 fueron considerados estadísticamente significativos.
EJEMPLO 2 - RESULTADOS Isx incrementa la Secreción de Insulina Inducida por Glucosa e Incrementa la Expresión de Factores Importantes para la Transcripción de Gen de Insulina en Isletos Humanos. Los inventores revisaron el efecto de Isx en la función de células ß dentro de isletos humanos mantenidos en cultivo durante hasta un año. Con base en los efectos de concentración en células cultivadas descritos más adelante y en estudios anteriores en otros tipos de células (Sadek et al., 2008; Schneider et al., 2008), la mayor parte de los estudios emplearon 20 o 40 µ? de Isx. Además de las células ß, los isletos que contienen otros dos tipos de células importantes, las células a y d, que secretan glucagon y somatostatina, así como células y o pp que secretan polipéptido pancreático (Steiner et al., 2010). Estos tipos celulares expresan factores de transcripción tanto compartidos como específicos de la célula que transmiten sus distintas secreciones de hormonas reguladas por nutrientes, y el juego interno entre ellos es importante para la función de isletos. Después de meses en cultivo, los isletos muestran una expresión reducida de factores de transcripción restringidos por célula ß y se vuelven menos capaces de secretar insulina en respuesta a un desafío de glucosa (Buitrago et al., 1975; Hollande et al., 1976).
El tratamiento de isletos humanos que han estado en cultivo durante 6 meses con Isx durante 1 o 2 días indujeron un gran incremento en el mARN de preproinsulina, aunque el mARN de glucagon disminuyó casi un 80% bajo las mismas circunstancias (figura 1A). La insulina secretada durante un período de 24 horas de estos isletos también estuvo marcadamente incrementada (figura 1B). Para determinar la significancia relativa de estos cambios originados por el compuesto, comparando los efectos de Isx en isletos humanos cultivados durante 3 meses en los isletos humanos recientemente obtenidos. El contenido de insulina en los isletos de 3 meses de edad fue incrementado -10 veces mediante Isx, a un valor casi del 75% del contenido de insulina de isletos aislados únicamente 1 semana antes (figura 1C). Además, una exposición de 2 días a Isx incrementó el contenido de insulina de isletos frescos en casi el 25%. Los isletos en cultivo durante 2 meses y tratados con Isx durante 2 días reveló un incremento obvio en Ngn3, BETA2 e inmunomanchado de insulina (figura 1E).
Los inventores revisaron un curso de tiempo de la acción de Isx en una serie de mARNs en isletos mantenidos en cultivo durante un año. El mARN de preproinsulina se incrementó 10 veces en 24 horas y 50 veces o más después de varios días de exposición a Isx (figura 1D). Debido a que Isx también incrementó la capacidad de respuesta de glucosa, los inventores evaluaron sus efectos en la expresión de glucocinasa y Glut2, proteínas esenciales para las características de detección de glucosa de células ß y encontraron que ambos se incrementaron marcadamente, teniendo un pico después de 4 días de exposición. Junto con BETA2, los inventores revisaron la expresión de factores de transcripción asociados con la transcripción de gen de insulina, así como la diferenciación y funciones diferenciadas de las células ß. La mayor parte de las probadas, mostraron temporalmente uno de dos patrones de expresión. Varias incrementaron durante el curso de tiempo o incrementaron hasta alcanzar una meseta; además de la propia insulina, éstas incluyeron BETA2, afA, PDX-1, Pax6, Nkx6.1, Nkx2.2, Foxa2, Hnf6, ???a, ????ß, Hnf4a y Is11 (Wilson et al., 2003; Lyttle et al., 2008; Oliver-Krasinski and Staffers, 2008; Scearce et al., 2002; White et al., 2008) (figura 1D y figura 5B). Otras incrementaron rápidamente y posteriormente disminuyeron con períodos de exposición más largo incluyeron Ngn3 y Pax4. Los incrementos en PDX-1, Hnfs y Isll fueron relativamente pequeños, aunque los incrementos en otros factores fueron generalmente más de 10 veces. Ni PCNA, un indicador de proliferación, ni Oct4, un factor asociado con células madre, mostraron cambios consistentes o sustanciales en la expresión de mARN.
Isx Incrementa la Expresión de BETA2 y la Secreción de Insulina de Células ß IN6. Para revisar los cambios inducidos por Isx en células ß MIN6 aisladas, los inventores mostraron primero que Isx incrementó la expresión de BETA2 y otros factores en su línea de célula ß cultivada. Después de 24 horas de exposición, BETA2 inmunorreactiva incrementó en todas las concentraciones de Isx probadas (figura 2A). La expresión de MafA también incrementó sustancialmente, aunque si acaso existe poco cambio en PDX-1 detectado. Los inventores revisaron posteriormente las actividades de ERK1/2, que son esenciales para la transcripción de gen de insulina estimulada por glucosa. La fosforilación de ERK1/2 incrementada por Isx fue detectable después de 24 horas de exposición. Un curso de tiempo de tratamiento con 20 µ? de Isx indicó un efecto bifásico en ERK1/2 con una activación inicial pequeña en los primeros pocos minutos, seguido de una activación más lenta, más pronunciada y sostenida que comienza alrededor de 2 horas de la exposición de Isx (figura 6). La acetilación de histona H3 y H4, indicadores de inducción de gen, también se incrementó mediante Isx en células ß, tal como se encontró previamente en otros tipos de células tratados con este compuesto (Sadek et al., 2008). Todos estos cambios estuvieron acompañados por un incremento de 4 veces en el mARN de preproinsulina (figura 2B).
Para revisar la secreción de insulina, las células ß MIN6 fueron incubadas en un medio completo con 4.5 mM de glucosa durante 24 horas antes del tratamiento con Isx. La secreción de insulina estimulada por glucosa (GSIS) incrementó casi 4 veces mediante tratamiento Isx (figura 2C), a pesar de un incremento relativamente pequeño en el contenido de insulina (figura 2D). El incremento en GSIS estuvo parcialmente bloqueado por la inhibición de la activación de ERK1/2 utilizando un inhibidor MEK. Los experimentos de seguimiento mostraron que Isx incrementó la estimulación de la secreción de insulina mediante glucosa, aminoácidos y exendin-4 (un agonista de péptido 1 tipo glucagon de acción prolongada), individualmente y en combinación de 2 a 5 veces (figura 2E). Los efectos de otros inhibidores en Isx incrementados por Isx también fueron explorados. El inhibidor de calcineurina FK506, también inhibe ERK1/2 (Lawrence et al., 2005), el inhibidor de Pl 3-cinasa, wortmanina, y nifedipina, un inhibidor de los canales de calcio dependientes de voltaje tipo L, junto con el quelador BAPTA, todos redujeron el incremento en GSIS originado por Isx (figura 5E).
Mecanismos Epigenéticos que Contribuyen a la Acción de Isx. Para explorar los cambios funcionales originados por Isx, utilizamos ensayos de sobreexpresión y reconstitución en células MIN6 y 293 para determinar si las actividades de factores que fueron inducidos, también fueron impactados por el compuesto. Se incrementó la actividad de reportero de gen de insulina en 4 veces o más ya sea mediante BETA2 o MafA en la presencia de Isx (figura 3A, figura 7). En contraste, la actividad de PDX-1 incrementó dos veces o menos mediante Isx. Se originó un enlace de cromatina comparable o mayor de BETA2 y MafA para el promotor de gen de insulina mediante Isx; se inhibió el enlace inducido por Isx bloqueando la activación de ERK1/2 (figuras 3D-E), tal como se muestra previamente para enlace estimulado por glucosa de estos factores (Lawrence et al., 2005). Isx también originó la acetilación de BETA2 más fuertemente que el butirato de sodio de inhibidor HDAC (figura 3C). Aunque BETA2 es un substrato ERK1/2 (Khoo ef al., 2003), no hemos tenido la capacidad de mostrar que MafA es un substrato ERK1/2. Se ha reportado la fosforilación reguladora de MafA en los sitios de serina-prolina a través de otras enzimas (Benkhelifa et al., 2001; Han et al., 2007). En forma consistente con el papel de la modificación de serina, la mutación de serina 65, y hasta menor grado serina 14, limitó la capacidad de Isx para incrementar la actividad de transcripción MafA (figura 3B).
Isx Regula la Acetilación de Histona Incrementando la Actividad de HAT. Mostramos previamente que Isx disminuyó la fosforilación de HDAC5 e incrementó su exportación nuclear, tomando en cuenta posiblemente los cambios en la transcripción de Nkx2.5 (Schneider et al, 2008). Aquí encontramos que, además de un efecto en la acetilación de BETA2, Isx también tuvo un efecto marcado en la acetilación de histonas (figura 4A). Nifedipina, un bloqueador de canal de calcio, en combinación con el agente de quelación BAPTA, disminuyó la acetilación de H3 en las Usinas 9 y 14 inducido mediante Isx, pero tuvo poco efecto en la acetilación de H4. Los inhibidores de la trayectoria MEK/ERK U0126 y PD325901, inhibieron la acetilación inducida por Isx de H4, como el inhibidor de calcineurina FK506, pero tuvo poco efecto en la acetilación H3. En contraste, el inhibidor de quinasa PI-3 wortmanina no tuvo efecto en cualquiera de estas lecturas.
Para determinar las bases para la acetilación de histona incrementada en células ß, se midieron las actividades de HDAC y HAT en extractos nucleares de células MIN6 o HeLa tratadas con vehículo o Isx durante 24 horas (figuras 4B a C). La actividad HDAC en células MIN6 no fue afectada por el compuesto, aunque se inhibió mediante el inhibidor de HDAC tricostatina A (Bieliauskas y Pflum, 2008). Las unidades de actividad fueron similares en extracto nucleares MIN6 y HeLa. Por otra parte, la actividad HAT en extractos nucleares de células MIN6 tratadas con Isx se incrementó ~2 veces mediante Isx. La actividad de HAT en las células tratadas con Isx fue parcialmente dependiente de ERK1/2, tal como se sugiere mediante la sensibilidad inhibidora MEK (figura 4D). Los efectos de Isx en HATs se expresaron en células 293 indicaron que las actividades de p300 y CBP, pero no PCAF o GCN5, fueron incrementadas mediante una combinación de expresión ERK2 y Isx, pero bloqueadas por la expresión de ERK2 de muerte por quinasa (K52R) (figura 8). Para validar la regulación aparente de p300 mediante Isx, se expresó p300 en células MIN6. Isx incrementó la actividad de HAT en los extractos nucleares en y arriba del p300 expresado; U0126 inhibió el incremento inducido por Isx en la actividad de HAT. El reclutamiento de cromatina de p300 para el promotor de insulina al momento del estímulo mediante glucosa se incrementó mediante tratamiento previo de Isx en una forma dependiente de ERK1/2 (figura 4E). Estos descubrimientos son consistes con la conclusión de que Isx estimula la actividad p300 y que los cambios inducidos por Isx en histona y la acetilación del factor de transcripción, son originados al menos en parte por la regulación de p300.
Ensayo de reportero utilizando la actividad de reportero de insulina de rata en MIN6 (líneas de células beta). En la figura 9 se muestran compuestos de isoxazol adicionales (lsx-9 I el mismo que Isx descrito anteriormente). En un primer experimento, se comparó el tratamiento lsx-9 (10 µ?) con el de HA-104-94 (10 µ y 2 µ?). Incluso en 2 µ?, la molécula HA-104-94 tuvo actividad comparable con lsx-9 en 10 µ? (figura 10). Posteriormente, los inventores descubrieron que las concentraciones tan bajas como 0.625 µ? de HA-104-94 pueden activar al doble el reportero de gen de insulina (figura 11).
Expresión de insulina endógena en células MIN6. lsx-9 activa la expresión de gen de insulina endógena óptimamente en una concentración de 20 µ?. En comparación con una molécula pequeña relacionada en 2 µ? y 20 µ?, Isx-OH (HA-104-94) tuvo mayor capacidad de activar el gen de insulina en 2 µ?, similar a lsx-9 en 20 µ (figura 12).
Identificación de nuevos compuestos de isoxazol. Con base en una pantalla de relación de actividad de estructura (SAR), los inventores caracterizaron las propiedades de diversos compuestos relacionados con isoxazol (figura 19). Se seleccionaron dos (LSH-18 y LSH-97) para más análisis detallados debido a que se desempeñaron mejor que la molécula de isoxazol de origen LSH1, de la presente invención, en concentraciones submicromolares en incrementar la función de célula beta y la secreción de insulina. Tal como se muestra en la figura 13, LSH-97 aún es efectiva en 62.5 nM.
Los compuestos 2-ISX incrementan la secreción de insulina en respuesta a glucosa y secretagogos activados por receptor. Es importante reconocer que los derivados de isoxazol aquí descritos no son secretagogos de insulina, debido a que no inducen la secreción de insulina al momento del tratamiento. Más bien, las moléculas Isx incrementan la función de célula beta pancreática. Las células beta tratadas previamente mostraron una secreción de insulina significativamente mayor en respuesta al estímulo con glucosa, aminoácidos (AA) o Exendin-4 (Ex-4) un agonista de receptor GLP1 (figura 14).
El tratamiento previo con 1 µ de LSH-097 incrementa la función de célula beta. Las moléculas Isx tienen la capacidad de inducir cambios epigenéticos (acetilación de histona) que activan la expresión de gen. Las moléculas Isx mejoran probablemente la diferenciación terminal de las células beta, incrementando de esta forma su función. Por ejemplo, la figura 15A muestra la señalización-A después del estímulo mediante aminoácidos (AA), Exendina-4 (Ex-4), glucosa o el agonista GPR40 (receptor 1 de ácido graso) GW9508 con o sin tratamiento previo con 1 µ? de LSH-97 durante 48 horas. La figura 15B muestra la secreción de insulina en células MIN6 tratadas previamente con MIN6 con 1 µ? Isx de LSH-97 durante 48 horas.
El derivado de Isx LSH-097 (y LSH- 8, datos no mostrados) incrementa la función de célula beta y puede ser utilizada para potenciar la secreción de insulina dependiente de glucosa, aunque no induce una secreción sustancial sólo. LSH-097 incrementa la secreción de insulina selectivamente en la presencia de concentraciones estimuladoras de glucosa, aminoácidos y GLP1, (y probablemente otros) pero no mediante los ligandos para GPR40.
Influjo de calcio como un método para medir la función de célula beta. La elevación en el calcio intracelular activa la secreción de insulina regulada en células beta. En células MIN6, la mejoría en la secreción de insulina está acompañada por un estímulo significativo de influjo de calcio intracelular inducido por secretagogos.
Los isoxazoles protegen las células beta pancreáticas de disfunción inducida por ácido graso libre (FFA). LSH-018 y LSH-097 mejoró significativamente la sección de insulina en respuesta a varios secretagogos, excepto GW9508. De hecho, LSH-018 (FIGURAS 17A-B) y LSH-097 (datos no mostrados) redujeron significativamente la señalización de ERK1/2 de quinasa MAP inducida por el agonista GPR40 de receptor de ácido graso libre, sin tener efecto alguno en su efecto de amplificación en la secreción de insulina.
GPR40 y GPR120 son necesarios para la inducción de ácido graso (FFA) de tensión y gluco-lipotoxicidad ER, que es una causa importante de la pérdida de célula beta en diabetes tipo II. FFA puede potenciar la secreción de insulina inducida por glucosa en corto plazo, sin embargo, la exposición a largo plazo a FFA tiene un efecto prejudicial y daña la función de célula beta, reminiscente del progreso de diabetes tipo II. Los inventores hipotetizaron por lo tanto que las moléculas pequeñas de isoxazol pueden prevenir la pérdida de la función de célula beta y la apoptosis durante la agresión lipotóxica.
Efecto de Isx en isletos humanos cultivados. Cuando se ponen en cultivo durante suficiente tiempo, los isletos pancreáticos humanos pierden la expresión de los factores de isletos, lo cual se correlacionará con la pérdida de secreción de insulina inducida por glucosa. Con el objeto de determinar si los nuevos compuestos Isx pueden desempeñarse mejor que el LSH-1 de origen, los isletos humanos cultivados durante 2 meses que fueron tratados con varios compuestos LSH durante 7 días, tienen resultados que pueden ser replicados durante los isletos humanos cultivados. Varias moléculas Isx incrementaron significativamente la síntesis de insulina tal como se mide mediante los niveles de transcripción (figura 18A) y los niveles de proteína (figura 18B) incrementados.
EJEMPLO 3 - DISCUSIÓN Isx incrementó la expresión de factores de transcripción, incluyendo MafA y BETA2, que incrementan la diferenciación de célula ß y la transcripción de gen de insulina que responde a nutrientes de control, dando como resultado un incremento en el mARN de preproinsulina y en el contenido de insulina intracelular. Isx potenció la secreción de insulina inducida por nutrientes y secretagogos hormonales antes del incremento en el contenido de insulina intracelular, lo que indica que también ajusta la eficiencia de la maquinaria de secreción. El resultado final es un incremento sustancial en las características esenciales para la función de célula ß madura, biosíntesis de insulina y liberación en respuesta a estímulo de secreción.
Para crear estos cambios en los isletos envejecidos en cultivo, Isx indujo una falanje de factores que dirigen la diferenciación de célula ß. Estos factores de transcripción tienen funciones, con frecuencia de traslape, en el desarrollo de células ß y varios tienen funciones de traslape también en las células ß maduras (Oliver-Krasinski y Stoffers, 2008). Ngn3 induce la expresión de BETA2 en precursores pancreáticos y suprime la división celular a través de la inducción de un inhibidor de quinasa dependiente de ciclina (Miyatsuka et al, 2011). Ngn3 se eleva en forma temprana en la diferenciación de isletos antes de la distinción entre las células a y ß, y en contraste con algunos otros factores, Ngn3 se vuelve indetectable en el páncreas de adulto (Huang et al, 2000; Schwitzgebel et al, 2000). BETA2 y Ngn3, aunque no funcionalmente redundantes, ambos pueden conducir la diferenciación de isleto, ambos pueden conducir la diferenciación de isleto e inducir la proteína de homeodominio Nkx2.2 (White et al, 2008; Gasa et al, 2008; Gu et al, 2010); Ngn3 también induce Pax4. Nkx2.2 y Pax4 se requieren para el desarrollo de linaje de célula ß (Habener y Staffers, 1998; Smit er al, 2000; Smit et a., 2003; Brun y Gautier, 2008).
Junto con Foxa2 y PDX-1, Nkx2.2 regula directamente la expresión de MafA (Anderson ef al, 2009; Doile y Sussel, 2007; Raum er al, 2006; Lynn et al, 2007). Nkx6.1, también la corriente descendente de Nkx2.2, se requiere para el desarrollo de precursores de célula ß específicamente durante la onda secundaria del desarrollo de células ß (Sander et al, 2000). Nkx6.1 también suprime la expresión de glucagón, tomando en cuenta posiblemente la represión del glucagón Isx. Además de sus roles de desarrollo, Foxa2 también es importante en el metabolismo de glucosa y secreción de insulina, regulando genes que incluyen las subunidades de canal K+ sensibles a ATP, Kir6.2 y Sur-1 (Wang et al, 2002; Lee et al, 2002; Lantz et al, 2004; Gao et al, 2007). La diabetes de generación en la madurez de los jóvenes (MODY) puede originarse por mutaciones en Hnf4a, Hnfla, y ???ß, las cuales también regulan el número de moléculas importantes para la detección de glucosa y otras funciones de célula ß (Eeckhoute et al, 2001; Gupta et al, 2005). Entre los objetivos MafA, se encuentran glucoquinasa, Glut2, el receptorde péptido 1 tipo glucagón, y la convertasa de prohormona (Pcskl) que procesa la proinsulina (Wang et al, 2007). En forma consistente con el control de estos genes mediante MafA, su sobreexpresión originó un cambio hacia la izquierda en la sensibilidad de glucosa de la secreción de insulina (Wang et al, 2007). La inducción de estas proteínas mediante MafA contribuye probablemente a la producción de insulina incrementada y a la capacidad de respuesta de secreción mejorada de células ß y los isletos expuestos a Isx.
Isx estimuló la acetilación de proteínas nucleares, a través de una acción en acetiltransferasas incluyendo p300. p300 tiene un impacto importante en la diferenciación y funciones diferenciadas de células ß, incluyendo transcripción del gen de insulina (Sharma et al, 1999; Qiu et al, 1998). Además de la modificación de histonas, p300 puede acetilar otras proteínas que soportan la función de célula ß, por ejemplo, BETA2 (Qiu ef al, 2004). Los estudios con mutantes sugieren que la acetilación de BETA2 afectan las funciones tanto de enlace como de activación de ADN. Recientemente, las mutaciones en el factor tipo Kruppel KLF11 (MODY 7) revelaron una asociación con diabetes tipo II de generación temprana (Nevé et al, 2005). KLF11 se activa mediante p300 como una gran fracción de otros genes MODY (Fernandez-Zapico ef al, 2009).
Por lo tanto, la activación de p300 es probablemente uno de los mecanismos más significativos de la acción de Isx. Los eventos de señalización regulados por Isx incluyen activación bifásica de ERK1/2 que es temporalmente distinta a la inducida por nutrientes. Los diversos factores de transcripción de gen de insulina sensibles a glucosas son regulados por ERK1/2. Aunque MafA no parece ser un substrato ERK1/2 fisiológico, el enlace de cromatina de MafA junto con BETA2 y PDX-1 es dependiente de ERK1/2 (Lawrence et a., 2005; Lawrence et al, 2008). ERK1/2 también fosforila a p300 y controla su actividad y asociación de cromatina, explicando posiblemente la supresión parcial de la actividad de p300 incrementada por Isx originada por U0126 o la coexpresión del muíante ERK2 de muerte por quinasa (Chen ef al, 2007; Foulds et al, 2004). La pérdida de p300 por el promotor de gen de insulina, está acompañada por la pérdida de estos tres factores esenciales, lo que sugiere que un evento regulado por ERK1/2 es acetilación la cual está considerada para controlar el acceso de los tres factores al promotor próximo.
Se han descrito varias estrategias para generar células beta a partir de células madre, el ducto pancreático y otros tipos de células diferenciadas (Borowiak y Melton, 2009). La mayor parte de éstas, implicaron la expresión heteróloga de grupos de factores de transcripción o grupos escalonados de factores hormonales que indujeron la diferenciación de célula beta (Kobinger et al, 2005; Zhang et al, 2009; D'Amour et al, 2006; Zhou et al, 2008; Kroon et al, 2008). Se identificó una molécula pequeña que indujo los progenitores pancreáticos procedentes de células madre embriónicas (Chen et al, 2009). Los compuestos que incrementaron la proliferación de célula ß también han sido reportados (Wang et al, 2009). La planta alcaloide, conofilina, puede inducir la diferenciación de célula beta de células acinares pancreáticas y tejido pancreático fetal de rata después de 3 a 6 semanas de tratamiento (Kawakami et al, 2010). Además de su curso de acción de tiempo aparentemente más lento, la conofilina incrementa la expresión del mARN PDX-1 hasta un mayor grado que el observado aquí Isx, sugiriendo distintos mecanismos de acción.
En conclusión, Isx está relativamente pocas moléculas individuales identificadas que pueden mejorar dramáticamente la función de célula beta. Los derivados Isx son herramientas nuevas para estudiar la función de célula ß y conduce a fármacos con la capacidad de rescatar la biosíntesis de insulina en isletos humanos inactivos antes del trasplante y posteriormente directamente en pacientes diabéticos. Los compuestos actualmente disponibles probablemente serán útiles en pacientes debido a que requieren concentraciones micromolares para ejercer sus efectos. Sin embargo, son auxiliares valiosos para desarrollar métodos no invasivos para mejorar la función de célula ß.
Varias moléculas pequeñas de isoxazol aquí descritas inducen la expresión de factores relevantes para homeostasis y función de célula beta pancreática. Por consiguiente, estos y otros derivados de isoxazol pueden ser útiles como agentes para la profilaxis o tratamiento de diabetes. El uso de compuestos de isoxazol debe estar asociado con un bajo riesgo de inducción de hipoglucemia, que puede ser una consecuencia negativa asociada con secretagogos de insulina tales como agonistas de receptor y sulfonilureas. Es posible que también puedan tener efectos benéficos en las consecuencias inhibidoras de dietas con alto contenido de ácido graso.
Todos los métodos y aparatos descritos y reivindicados en la presente invención, pueden realizarse y ejecutarse sin experimentación indebida a la luz de la presente descripción. Aunque las composiciones y métodos de la presente invención han sido descritas en términos de modalidades preferidas, los expertos en la técnica podrán apreciar que se pueden aplicar variaciones a los métodos y aparatos y en los pasos o en la secuencia de pasos aquí descritos sin apartarse del concepto, esencia y alcance de la presente invención. Más específicamente, se podrá apreciar que ciertos agentes que están tanto química como fisiológicamente relacionados pueden ser sustituidos por los agentes aquí descritos, pudiéndose lograr al mismo tiempo los mismos resultados o unos similares. Todos de dichos sustituyentes y modificaciones similares apreciados por los expertos en la técnica, se consideran dentro de la esencia, alcance y concepto de la presente invención, tal como se define a través de las reivindicaciones adjuntas.
REFERENCIAS Las siguientes referencias, hasta el grado en el que proporcionen procedimientos de ejemplo u otros detalles suplementarios a los aquí establecidos, están incorporadas específicamente a la presente invención como referencia.
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Claims (71)

REIVINDICACIONES
1. método para inducir la producción y/o secreción de insulina a partir de una célula ß de isleto, en donde el método comprende contactar la célula con un compuesto de la fórmula (I): en donde: R1 es fenilo sustituido o no sustituido, tiofenilo sustituido o no sustituido o un sustituyente de la fórmula (A): en donde: R4, Rs y R6 cada uno son independientemente hidrógeno, hidroxi, halo, ciano, nitro; o alquil (c=io>, a ril{C=i 2)¦ aralquil(C=i5), heteroaril(C=i2), acil(c=io) o una versión sustituida de cualquiera de estos grupos; y G es O, -NH, o S; R2 es: hidrógeno, hidroxi, halo, o nitro; o alquil(C=io), alquenil(Csio), alquinil(C=io), alcoxi(Csio), alqueniloxi(C=io), alquiniloxi(C=io), a ri l(C=i 2) . aralquil(C=i5), acil(C=io), o una versión sustituida de cualquiera de estos grupos; o -C(0)R7, -OC(0)R7, -OC(0)OR7, -C(0)NR8R9, OC(0)NR8R9, -NR8OR9l o -SO3R7; en donde R7 es hidrógeno, alquil(C=io), aril(c=i2), aralquil(C=i5); R8 y R9 cada uno son independientemente hidrógeno, alquilO(csio), arilo(c=i2), aralquilo(C=i5), o tomados juntos son alcanediil(c=6); R3 es -NH-0-alquil(c=io), — NHOH, -OR10 o -NRnR12, en donde, R10 es hidrógeno, alquilo(Csio) sustituido o no sustituido, alquenil(C=io) sustituido o no sustituido, alquin¡lo(C=io) sustituido o no sustituido, arilo <c=i2) sustituido o no sustituido), o aralquilo(c=i5) sustituido o no sustituido); R11 y R12 cada uno son independientemente hidrógeno, alquil(csio) sustituido o no sustituido, alquenil(C=io) sustituido o no sustituido, alquinilo(Csio) sustituido o no sustituido, a ri l(C=i 2 sustituido o no sustituido, o aralquil(C=i5) sustituido o no sustituido; o R11 y R12 se toman juntos para formar alcanediil(C=6), -CH2CH2NHCH2CH2-, o -CH2CH2OCH2CH2-; o R11 y R12 se toman juntos para formar alcanediil(C=6); o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde R^ es un sustituyente de la fórmula (A).
3. El método de acuerdo con la reivindicación 2, en donde G es S.
4. El método de acuerdo con la reivindicación 3, en donde R4, R5 o R6 son hidrógeno.
5. El método de acuerdo con la reivindicación 4, en donde R4, R5 o R6 cada uno son hidrógeno.
6. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 5, en donde R2 es hidrógeno.
7. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 6, en donde R3 es -NRnR12.
8. El método de acuerdo con la reivindicación 7, en donde R12 o R13 son ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo o ciclohexllo.
9. El método de acuerdo con la reivindicación 8, en donde R12 o R13 son ciclopropilo.
10. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el compuesto de formula (I) se define en forma adicional como un compuesto de la fórmula (II): (II) en donde: Rn y R12 ambos son hidrógeno; o R11 es hidrógeno y R12 es alquil(C=io) sustituido o no sustituido, alquenil(c=io) sustituido o no sustituido, alquinilo(C=io) sustituido o no sustituido, o bencilo; o R, , y R 2 tomados juntos son -CH2CH2CH2-, C H 2 C H 2 C H 2C H 2 - -C H 2 C H 2 C H 2C H 2C H 2 - , -CH2CH2NHCH2CH2- o -CH2CH20CH2CH2-¡ R4, R5 y R6 cada uno son independientemente: hidrógeno, halo, hidroxi, ciano, nitro; o alquil(csio). aril{Csi2), aralquil(Csi5), heteroaril(C=i2), acil(C=io) o una versión sustituida de cualquiera de estos grupos; y G es O, NH, o S, o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos.
11. El método de acuerdo con la reivindicación 10, en donde G es S.
12. El método de acuerdo con la reivindicación 11, en donde R4, R5 o R6 son hidrógeno.
13. El método de acuerdo con la reivindicación 12, en donde R4, R5 y R6 cada uno son hidrógeno.
14. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 13, en donde Rn es hidrógeno.
15. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 14, en donde R12 es ciclopropilo o un alcohol alifático (csio) o un poliol alifático (?=??>·
16. El método de acuerdo con la reivindicación 10, en donde el compuesto es: o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos.
17. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 15, en donde la célula se localiza en un animal.
18. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 15, en donde la célula se contacta ex vivo.
19. Un método para tratar diabetes en un sujeto en donde el método comprende administrar al sujeto un compuesto de la fórmula (I): en donde: Ri es fenilo sustituido o no sustituido, tiofenilo sustituido o no sustituido o un sustituyente de la fórmula (A): en donde: R , R5 y Re cada uno son independientemente hidrógeno, hidroxi, halo, ciano, nitro; o alquil (c=io). aril(C=i2), aralquil(C=i5), heteroaril(C=i2), acil (C=10) o una versión sustituida de cualquiera de estos grupos; y G es O, -NH, o S; R2 es: hidrógeno, hidroxi, halo, o nitro; o alquil(csio), alquenil(Csi0), alquinil<Csio)> alcoxi(C=io), alqueniloxi(C=io), alquiniloxi(C=io), aril(C=i 2), aralquil(C=i5), acilO(c= o), o una versión sustituida de cualquiera de estos grupos; o -C(0)R7, -OC(0)R7, -OC(0)OR7, -C(0)NR8R9, 0C(0)NRaR9, -NR8OR9l o -S03R7; en donde R7 es hidrógeno, a Iq u i l C= 1 o> , aril(Csi2). aralquil(C=i5); R8 y Rg cada uno son independientemente hidrógeno, alquil(c=io), aralquil(C=i5), o tomados juntos son alcanediil(Cs6); R3 es -NH-0-alquilo(C=io), --NHOH, -OR10 o — NR R 2, en donde R10 es hidrógeno, alq uil(C=i o) sustituido o no sustituido, alquenil(C=io) sustituido o no sustituido, alquinilo(C=io) sustituido o no sustituido, a ri I (C= 12> sustituido o no sustituido, o aralquil(c=i5) sustituido o no sustituido; R11 y R12 cada uno son independientemente hidrógeno, alquil(C=io)Sust¡tuido o no sustituido, alquenil(C=io) sustituido o no sustituido, alquin¡lo(C=io) sustituido o no sustituido, a ri I (C= 12) sustituido o no sustituido, o aralquil(c=i5); sustituido o no sustituido; o R11 y R12 se toman juntos para formar alcanediil(C=6). -CH2CH2NHCH2CH2-, o -CH2CH2OCH2CH2-; o R11 y R12 se toman juntos para formar alcanediil(C=6); o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
20. El método de acuerdo con la reivindicación 19, en donde R-i es un sustituyente de la fórmula (A).
21. El método de acuerdo con la reivindicación 20, en donde G es S.
22. El método de acuerdo con la reivindicación 21, en donde R4, R5 o R6 son hidrógeno.
23. El método de acuerdo con la reivindicación 22, en donde R , R5 y R6 cada uno son hidrógeno.
24. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 19 a la 23, en donde R2 es hidrógeno.
25. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 19 a la 24, en donde R3 es -NRnR12.
26. El método de acuerdo con la reivindicación 25, en donde R12 o R 3 es ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo o ciclohexilo.
27. El método de acuerdo con la reivindicación 26, en donde R 2 o R13 son ciclopropilo.
28. El método de acuerdo con la reivindicación 19, en donde el compuesto de la fórmula (I) se define en forma adicional como un compuesto de la fórmula (II): en donde: R11 y R12 ambos son hidrógeno; o Rn es hidrógeno y R12 es alquil(C=io) sustituido o sustituido, alquenil(C=io) sustituido o no sustituido, alquinilo( sustituido o no sustituido, o bencilo; o Rn y R12 tomados juntos son --CH2CH2CH2--, C H 2C H 2 C H 2C H 2-- , --C H 2C H 2C H 2C H 2C H 2-- , --CH2CH2NHCH2CH2--o --C H 2C H 2O C H 2 C H 2-- ¡ R , R5 y R6 cada uno son independientemente: hidrógeno, halo, hidroxi, ciano, nitro; o alquil(csio), ar¡l(Csi2), aralquilo(csi5)> heteroar¡l(Csi2), acil(C=io) o una versión sustituida de cualquiera de estos grupos; y G es O, NH, o S, o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos.
29. El método de acuerdo con la reivindicación 28, en donde G es S.
30. El método de acuerdo con la reivindicación 29, en donde R4, R5 o R6 son hidrógeno.
31. El método de acuerdo con la reivindicación 30, en donde R4, R5 y R6 cada uno son hidrógeno.
32. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 19 a la 31, en donde Rn es hidrógeno.
33. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 19 a la 32, en donde R12 es ciclopropilo o un alcohol alifático(C=io) o un poliol alifático <c.;io)
34. El método de acuerdo con la reivindicación 28, en donde el compuesto es: o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
35. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 19 a la 33, en donde la célula se localiza en un animal.
36. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 19 a la 33, en donde la célula se contacta ex vivo.
37. Un método para tratar diabetes en un sujeto, en donde el método comprende (a) contactar una célula ß de isleto ex vivo con un compuesto de la fórmula (I): en donde: R-i es fenilo sustituido o no sustituido, tiofenilo sustituido o no sustituido o un sustituyente de la fórmula (A): en donde: R4, R5 y Re cada uno son independientemente hidrógeno, hidroxi, halo, ciano, nitro; o alquil(Csio), aril(C=i2), aralquilo(C=i5), heteroaril(C=i2), acil(C=io) o una versión sustituida de cualquiera de estos grupos; y G es O, -NH, o S; R2 es. hidrógeno, hidroxi, halo, o nitro; o alquil(c=io), alquenil(Csio), alquinilo(C=io), alcoxi(C=i 0j. alqueniloxi(C=io), a Iq u i n i loxi (C= 1 o , a ri I (C= 12) , aralquilo(C=i5), acil(c=io), o una versión sustituida de cualquiera de estos grupos; o -C(0)R7, -OC(0)R7, -OC(0)OR7, -C(0)NR8R9, OC(0)NR8R9, -NR8OR9, o -S03R7; en donde R7 es hidrógeno, alquil(C=io), aril(C=i2), aralquilo(C=i5); R8 y Rg cada uno son independientemente hidrógeno, alquil(C=io). aralquil(C=i5), o tomados juntos son alcanedi¡l(C=6); R3 es -NH-O-alquil(C=i0),--NHOH, -OR10 o -NR^Ru, en donde R10 es hidrógeno, alquil(C=io) sustituido o no sustituido, alquenil(c=io) sustituido o no sustituido, alquinil(C=io) sustituido o no sustituido, aril(C=i2) sustituido o no sustituido, o aralquilo(c=i5) sustituido o no sustituido; R11 y R12 cada uno son independientemente hidrógeno, alquil(C=io) sustituido o no sustituido, alquenil(C=io) sustituido o no sustituido, alquinilo(C=io) sustituido o no sustituido, aril(c=i2). o aralquilo(c=i2); o R11 y 12 se toman juntos para formar alcanediil(C=6). -CH2CH2NHCH2CH2-, o -CH2CH2OCH2CH2-; o R11 y R12 se toman juntos para formar alcanediil(C=6); o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos; y (b) administrar la célula ß de isleto al sujeto.
38. El método de acuerdo con la reivindicación 37, en donde Ri es un sustituyente de la fórmula (A).
39. El método de acuerdo con la reivindicación 38, en donde G es S.
40. El método de acuerdo con la reivindicación 39, en donde R4, 5 o R6 son hidrógeno.
41. El método de acuerdo con la reivindicación 40, en donde R4, R5 y Re cada uno son hidrógeno.
42. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 37 a la 41, en donde R2 es hidrógeno.
43. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 37 a la 42, en donde R3 es -NR R 2.
44. El método de acuerdo con la reivindicación 43, en donde R12 o R13 son ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo o ciclohexilo.
45. El método de acuerdo con la reivindicación 44, en donde R12 o R13 son ciclopropilo.
46. El método de acuerdo con la reivindicación 37, en donde el compuesto de formula (I) se define en forma adicional como un compuesto de la fórmula (II): R11 y R12 ambos son hidrógeno; o R,, es hidrógeno y R12 es alquil(C=io) sustituido sustituido, alquenil(C=io) sustituido o no sustituido, alquinilo(C=io) sustituido o no sustituido, o bencilo; o R y R12 tomados juntos son --CH2CH2CH2--, C H 2 C H 2 C H 2C H 2 -- , -- C H 2 C H 2 C H 2 C H 2 C H 2 - - , --CH2CH2 HCH2CH2— o --CH2CH2OCH2CH2--; R , R5 y f¾6 cada uno son independientemente: hidrógeno, halo, hidroxi, ciano, nitro; o alquil(c=io), aril(csi2), aralquilo(C=i5), heteroaril(C=i2), acil(csio) o una versión sustituida de cualquiera de estos grupos; y G es O, -NH, o S; o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos.
47. El método de acuerdo con la reivindicación 46, en donde G es S.
48. El método de acuerdo con la reivindicación 47, en donde R4, R5 o R6 son hidrógeno.
49. El método de acuerdo con la reivindicación 48, en donde R4, R5 y R6 cada uno son hidrógeno.
50. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 37 a la 49, en donde Rn es hidrógeno.
51. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 37 a la 50, en donde R12 es ciclopropilo o un alcohol alifático (c=ioj o un poliol alifático (c=io>-
52. El método de acuerdo con la reivindicación 46, en donde el compuesto es: o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos.
53. Un método para reactivar una célula ß de isleto, en donde el método comprende contactar la célula con un compuesto de la fórmula (I): en donde: Ri es fenilo sustituido o no sustituido, tiofenilo sustituido o no sustituido o un sustituyente de la fórmula (A): en donde: R4, R5 y R6 cada uno son independientemente hidrógeno, hidroxi, halo, ciano, nitro; o alquil(C=io), aril(CSi2), aralquil(Csi5), heteroaril(C=i2), acil(C=io), o una versión sustituida de cualquiera de estos grupos; o G es O, -NH, o S; R2 es: hidrógeno, hidroxi, halo, o nitro; o alquil(C=io)> alquenil(Csio), alquinilo(C=io), alcoxi(C=io), alqueniloxi(C=io), alquin¡loxi(c=io), a ri l(C=i 2) , aralquilo(C=i5), acil(C=io), o una versión sustituida de cualquiera de estos grupos; o -C(0)R7, -OC(0)R7, -OC(0)OR7, -C(0)NR8R9, OC(0)NR8R9, -NR8OR9, o -S03R?; en donde R7 es hidrógeno, alquil(C=io), a ri I (C=i 2) » aralquilo(C=i5); Re y R9 cada uno son independientemente hidrógeno, alquil(csio), aril(C=i5), aralquilo (c=i5). o tomados juntos son alcanediil(c=6); R3 es -NH-O-alquil(C=i0),--NHOH, -OR10 o -NR R12l en donde R10 es hidrógeno, alquil(C=io) sustituido o no sustituido, alquen¡l(C=io) sustituido o no sustituido, alquinilo(C=io) sustituido o no sustituido, aril(C=i2) sustituido o no sustituido, o aralquMo(C=i5) sustituido o no sustituido; R11 y R12 cada uno son independientemente hidrógeno, alquil(c=io) sustituido o no sustituido, alquenil(C=io) sustituido o no sustituido, alquinilo(C=io) sustituido o no sustituido, aril(Csi2), o aralquilo<Csi2); o R11 y 12 se toman juntos para formar alcanediil(C=6), --CH2CH2NHCH2CH2--, o -CH2CH2OCH2CH2-; o R11 y R12 se toman juntos para formar alcanediil(C=6); o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos
54. El método de acuerdo con la reivindicación 53, en donde Ri es un sustituyente de la fórmula (A).
55. El método de acuerdo con la reivindicación 54, en donde G es S.
56. El método de acuerdo con la reivindicación 55, en donde R4, R5 o R6 son hidrógeno.
57. El método de acuerdo con la reivindicación 56, en donde R4, R5 y R6 cada uno son hidrógeno.
58. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 53 a la 57, en donde R2 es hidrógeno.
59. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 53 a la 58, en donde R3 es -NR R12.
60. El método de acuerdo con la reivindicación 59, en donde R12 o R12 son ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo o ciclohexilo.
61. El método de acuerdo con la reivindicación 60, en donde R13 o R13 son ciclopropilo.
62. El método de acuerdo con la reivindicación 53, en donde el compuesto de formula (I) se define en forma adicional como un compuesto de la fórmula (II): en donde: R11 y 12 ambos son hidrógeno; o Rn es hidrógeno y R12 es alquil(C=io) sustituido o no sustituido, alquenil(C=io) sustituido o no sustituido, alquinilo(C=io) sustituido o no sustituido, o bencilo; o Rn y R12 tomados juntos son --CH2CH2CH2--, C H 2 C H 2 C H 2 C H 2" , -- C H 2C H 2C H 2 C H 2 C H 2 , --CH2CH2NHCH2CH2--o --C H 2C H 2O C H 2C H 2-- ! R4, R5 y Re cada uno son independientemente: hidrógeno, halo, hidroxi, ciano, nitro; o alquil(C=10), aril(C=i2), aralquil(C<i5). heteroaril(C=i2), acil(C«io> o una versión sustituida de cualquiera de estos grupos; y G es O, NH, o S, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
63. El método de acuerdo con la reivindicación 62, en donde G es S.
64. El método de acuerdo con la reivindicación 63, en donde R4, R5 o R6 son hidrógeno.
65. El método de acuerdo con la reivindicación 64, en donde R , R5 y R6 cada uno son hidrógeno.
66. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 53 a la 65, en donde Rn es hidrógeno.
67. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 53 a la 66, en donde R12 es ciclopropilo o un alcohol alifát¡co(C=io) o un poliol alifático (c=io>-
68. El método de acuerdo con la reivindicación 64, en donde el compuesto es: o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
69. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 53 a la 68, en donde la célula se localiza en un animal.
70. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 53 a la 68, en donde la célula se contacta ex vivo.
71. Un compuesto que tiene la fórmula: Una composición farmacéutica que comprende compuesto que tiene la fórmula: disperso en un amortiguador, transportador, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable.
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