MX2014007799A - Peptidos y metodos para usarlos. - Google Patents

Abstract

Los inventores describen péptidos y sus usos para el tratamiento de enfermedades autoinmunes, inflamatorias y metabólicas.

Description

PÉPTIDOS Y MÉTODOS PARA USARLOS CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente descripción presenta péptidos aislados y/o sintetizados. Específicamente, la presente invención es una clase de fragmentos de péptido aislados y/o sintetizados, y análogos sintéticos en base a los fragmentos de péptido. Los péptidos pueden tener efectos preventivos y terapéuticos en la enfermedad humana y se pueden utilizar en el tratamiento de la enfermedad humana.

ANTECEDENTES Los inhibidores de serina proteasa (Serpins) representan una familia grande (>1000) de inhibidores de proteasa, presentes en todas las ramas de la vida e involucrados en una multitud de procesos fisiológicos. En mamíferos, tales como humanos, los Serpins son importantes para la homeostasis y aunque existe un cierto nivel de promiscuidad, cada Serpin tiene una serina proteasa (s) cognada. Por ejemplo, alfa-l-antitripsina (AAT) y alfa-1-antiquimotripsina (ACT) inhiben las proteasas inflamatorias tal como elastasa, mientras que la antitrombina inhibe la trombina y desempeña una función en la coagulación.

Un número de mutaciones AAT específicas se manifiestan en la enfermedad humana, incluyendo COPD, trombosis y Serpinopatías (cirrosis y demencia) . Actualmente, un número pequeño de formulaciones AAT derivadas del suero humano son aprobadas por la FDA para el tratamiento de COPD. En este procedimiento terapéutico, AAT funciona como un inhibidor de proteasa similar al AAT endógena.

AAT es el Serpin arquitipico y comparte la estructura terciaria con otros Serpins. Los Serpins tienen un bucle expuesto de ~20 aminoácidos (aa) , llamado el bucle central reactivo (RCL) , que sirve como cebo para las proteasas cognadas. Una vez que la proteasa enlaza el RCL, este llega ser atrapado, parcialmente desplegado y destinado para la degradación. La segmentación del RCL en su sitio Pl-Pl' impulsa el proceso de inactivación de proteasa y da por resultado la liberación de un péptido C-terminal pequeño a partir de la molécula Serpin.

BREVE DESCRIPCIÓN Los inventores han encontrado inesperadamente que muchos de los péptidos C-terminales de la molécula Serpin y variantes y derivados de los mismos funcionan como potentes agentes anti-inflamatorios . Por consiguiente, los inventores proporcionan composiciones de péptido, composiciones farmacéuticas que comprenden los péptidos Serpin C-terminales y métodos para utilizar los péptidos para tratar condiciones inflamatorias y auto-inmunes que incluyen diabetes tipo II, lupus y enfermedad de injerto contra hospedero, uveitis, eczema y psoriasis, fibrosis cistica, artritis reumatoide (RA) , síndrome de radiación aguda y pacientes quemados, enfermedad de intestino inflamatorio (IBD) y diabetes tipo I de nuevo inicio.

La invención se basa en el descubrimiento de los inventores de que un péptido corto, SP16 (SEQ ID NO: 1) derivado de alfa-l-antitripsina humana muestra propiedades anti-inflamatorias e inmunomoduladoras similares a la proteína parental mucho más grande, alfa-l-antitripsina . Sin desear que sea limitado por una teoría, SP16 se presenta que es un interruptor maestro de péptido de primera clase para el tratamiento de enfermedades auto-inmunes, inflamatorias y metabólicas .

Específicamente, los inventores han mostrado la función del péptido SP16 que consiste de una secuencia de aminoácidos VKFNKPFVFLMIEQNTK (SEQ ID NO: 1) en modelos animales bien establecidos para por lo menos la diabetes tipo II, artritis reumatoide y endotoxemia letal.

Por consiguiente, los inventores proporcionan una composición que comprende un péptido aislado que comprende, que consiste esencialmente de, o que consiste de la secuencia de aminoácidos X1-Z1-F-N-K-P-F-X2-Z2-X3-Z3-Q (SEQ ID NO: 2) , en donde XI es V o L; X2 es V, L o ; X3 es M, l o V; Zl es cualquier aminoácido; Z2 es una secuencia de cualquiera de dos aminoácidos; y Z3 es una secuencia de cualquiera de cinco aminoácidos, y en donde el péptido aislado consiste de 37 o menos aminoácidos.

El péptido puede ser modificado para prolongar la vida en anaquel y/o biodisponibilidad utilizando uno o más enlaces de péptido no naturales o aminoácidos o al unir a los grupos funcionales de péptido tal como, por ejemplo, polietilenglicol (PEG) .

La composición además puede comprender un portador, tal como un portador farmacéuticamente aceptable.

Los péptidos de la invención se pueden utilizar para reducir los niveles de TNF-oc en el suero en individuos humanos quienes tienen niveles de TNF-ct patológicamente incrementados. De esta manera la invención proporciona un método o uso para reducir los niveles de TNF-a en un humano en necesidad del mismo que comprende administrar al individuo humano el péptido de la invención en un portador farmacéuticamente aceptable. En ciertas modalidades, el péptido aislado da por resultado una disminución del 50% o 75% en los niveles de TNF-a en el suero cuando se administra en una cantidad efectiva a un sujeto humano comparado con los niveles antes de la administración del polipéptido aislado. En otras modalidades, el péptido aislado además comprende por lo menos otra proteína. La combinación de las por lo menos dos proteínas puede ser referida como una proteína de fusión. La otra proteína se puede seleccionar de una etiqueta de epítopo y un extendedor de vida media. El péptido puede comprender tanto una etiqueta de epítopo y como un extendedor de vida media.

Los inventores también proporcionan una composición que comprende un péptido aislado que consiste esencialmente de o que consiste de la secuencia de aminoácidos Xl-Zl-F-N-X2-P-F-X3-Z2-X4-Z3-X5 (SEQ ID NO: 3), en donde XI es V o L; X2 es K o R; X3 es V, L o M; X4 es M, l o V; X5 es K o Q; Zl es cualquier aminoácido; Z2 es una secuencia de cualquiera de dos aminoácidos ; Z3 es una secuencia de cualquiera de cinco aminoácidos; y en donde el péptido aislado causa una disminución de 75% en los niveles de TNF-a en el suero cuando se administra en una cantidad efectiva a un sujeto humano comparado con la cantidad de niveles TNF-a antes de la administración del péptido.

En ciertas modalidades, el péptido aislado comprende la secuencia de aminoácidos X1-Z1-F-N-X2-P-F-X3-Z2-X4-Z3-X5 (SEQ ID NO: 3), en donde XI, X2, X3, X4, X5, Zl, Z2, y Z3 se definen como en lo anterior y en donde el péptido consiste de, a lo más, 35, 22 o 21 residuos de aminoácido.

En ciertos aspectos, los péptidos de cualquiera de las modalidades descritas en la presente y por toda la especificación, también comprenden por lo menos otra proteina. La combinación de estas por lo menos dos proteínas puede ser referidas como una proteína de fusión. Específicamente la otra proteína puede ser seleccionada de una etiqueta de epítopo y un extendedor de vida media. En algunos aspectos de todas las modalidades de la invención, el péptido aislado puede comprender tanto una etiqueta de epítopo como un extendedor de vida media.

La descripción también proporciona un péptido aislado que consiste esencialmente de o que consiste de la secuencia de aminoácidos RFNRPFLR (SEQ ID NO: 4) y RFNKPFLR (SEQ ID NO: 5) . En ciertas modalidades, el péptido aislado causa una disminución de 50% o 75% en los niveles de TNF-a en el suero comparado con la cantidad de los niveles de TNF-a antes de la administración del péptido cuando se administra en una cantidad efectiva a un sujeto humano.

En otros aspectos de todas las modalidades de la invención, el péptido aislado se enlaza a otra proteína. La combinación de estas proteínas puede ser referida como una proteina de fusión. Específicamente, la otra proteína se puede seleccionar de una etiqueta de epítopo y un extendedor de vida media.

En algunos aspectos de todas las modalidades de la invención, el péptido aislado consiste de, a lo más, 100, 35, 22, 21 o 9 aminoácidos adicionales.

En otras modalidades, el péptido aislado consiste esencialmente de, o consiste de la secuencia de aminoácidos de Z1-RFNRPFLR-Z2 (SEQ ID NO: 6) y Z1-RFNKPFLR-Z2 (SEQ ID NO: 7), en donde Zl y Z2 son independientemente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 6, 7, 8, 9, 10 o entre 1 y 3, entre 1 y 5, entre 1 y 6, entre 1 y 7, entre 1 y 8, entre 1 y 9, o entre 1 y 10 aminoácidos básicos .

En algunas modalidades, el péptido aislado consiste esencialmente de o consiste de la secuencia de aminoácidos de RRRFNRPFLRRR (SEQ ID NO: 8) y RRRFNKPFLRRR (SEQ ID NO: 9) .

La descripción también proporciona una composición que comprende un péptido aislado que consiste esencialmente de o que consiste de la secuencia de aminoácidos de FNRPFL (SEQ ID NO: 10) y FNKPFL (SEQ ID NO: 11).

La descripción también proporciona una composición que comprende un péptido aislado o sintetizado que consiste esencialmente de o que consiste de cualquiera o una combinación de los siguientes péptidos: SP40; SP43; SP46; y SP49 como se expone en la Tabla B, y su uso en métodos para tratar inflamación, artritis reumatoide, COPD, fibrosis cistica, mejoramiento de control glucémico en sujetos diabéticos y prevención y tratamiento de endotoxemia, por ejemplo, en víctimas quemadas y sujetos expuestos a la radiación aguda.

En una modalidad, la descripción también proporciona un método para disminuir el TNF-a en el suero comparado con la cantidad de niveles de TNF-a antes de la administración del péptido a un sujeto que comprende administrar al sujeto una cantidad efectiva de cualquiera de los péptidos aislados como se definió en lo anterior para disminuir los niveles de TNF-a en el suero por al menos 50%. En una modalidad, los niveles de TNF-a en el suero se disminuyen por 75% comparado con la cantidad de niveles de TNF-ct antes de la administración del péptido. En otras modalidades, el sujeto es un mamífero. En algunos aspectos de todas las modalidades de la invención, el mamífero es un humano .

En algunas modalidades, la descripción proporciona métodos para mejorar el control glucémico o reducir la hiperglucemia en un sujeto en necesidad del mismo que comprende administrar al sujeto con hiperglucemia cualquiera de los péptidos descritos en la presente en un portador farmacéuticamente aceptable.

En algunos aspectos de todas las modalidades de la invención, el humano se ha diagnosticado con diabetes tipo II, diabetes tipo I de nuevo inicio, artritis reumatoide, COPD, fibrosis cistica, uveitis, eczema, psoriasis, lupus, enfermedad de injerto contra hospedero, enfermedad de intestino inflamatorio (IBD) , o endotoxemia después de la exposición a la radiación aguda o quemadura antes de la administración del péptido.

En algunos aspectos, el sujeto no se ha sometido al tratamiento previo con alfa antitripsina, tal como el tratamiento de alfa-l-antitripsina antes del tratamiento con los péptidos de la invención.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 es una tabla que muestra las secuencias y homología de los péptidos C-terminales Serpin (SEQ ID NOs : 18-24, respectivamente, en orden de aparición).

La Figura 2 es una tabla que muestra los péptidos derivados de truncamientos (SEQ ID NO: 25-32, 1, 33-34, 1, 33, 38-51, 10 y 8, respectivamente, en orden de aparición).

La Figura 3 es una gráfica de barras que muestra los niveles de TNF-ot en la sangre de ratones inyectados con 0.5, 0.1, 0.02 o 0.004 mg de varios péptidos (SP1-SP18 de izquierda a derecha en el eje x) . Cada péptido se administró en cuatro concentraciones diferentes. Las cuatro barras para cada uno de los péptidos de izquierda a derecha representan las concentraciones de más alta (0.5 mg) a la más baja (0.004 mg) .

La Figura 4 es una gráfica de barras que muestra los niveles de TNF-a en la sangre de ratones inyectados con 0.004 mg de varios péptidos.

La Figura 5 es una gráfica lineal que muestra los registros de pata acumulativos para la simulación tratada, tratada con dexametasona y péptido (SEQ ID NO: 1, también referido como SP16) en un modelo de rata de artritis inducida por anticuerpo de colágeno (CAIA) .

La Figura 6 es una gráfica lineal que muestra los registros de pata acumulativos para la simulación tratada, tratada con dexametasona y péptido (SEQ ID NO: 1, también referido como SP16) en un modelo de rata de artritis inducida por anticuerpo de colágeno (CAIA) .

La Figura 7 es una gráfica que resume la supervivencia durante un estudio de endotoxemia letal en ratones. Los animales se inyectaron con 0.6 mg/kg de SP16 (SEQ ID NO: 1) como es indicado: 2 horas antes, en tiempo de y/o 0.5 horas después de la inducción de Sepsis. La Sepsis se indujo mediante la inyección de 15 mg/kg de LPS en T=0. La supervivencia se inspeccionó en los puntos de tiempo indicados. La supervivencia en 72 horas fue 60% en el grupo que recibió SP16 en T=-2, 0 y 0.5 horas.

Las Figuras 8A-8F muestran gráficas que resumen los datos de un estudio en el modelo T2D db/db. Ratones db/db de cinco semanas de edad se asignaron a grupos de 10 animales, una IP inyectada con 0.6 mg/kg de SP16 (bisemanalmente) , 15 mg/kg de Rosiglitazona (bisemanalmente) o control de vehículo durante 5 semanas. Los niveles de HbAlc (Figura 8A) y C-péptidos (Figura 8B) se determinaron al final del estudio. Durante la última semana del estudio, una prueba de tolerancia de glucosa se administró (Figura 8C) . La glucosa en la sangre no en ayunas se midió dos veces a la semana por todo el estudio y fue significativamente disminuida en los grupos SP16 (SEQ ID NO: 1) y Rosiglitazona. Los valores representan promedios, con los errores estándares indicados. (*) indica P<0.05 y (**) p<0.01, comparado con el grupo Simulado mediante una prueba T. La Figura 8D resume el grado de hiperplasia de isleta en el estudio db/db como es estimado mediante morfometría. Las Figuras 8E y 8F resumen los niveles de CRP y TGF-beta en el modelo de ratón db/db de diabetes tipo II. Los niveles de CRP en el suero disminuidos son consistentes con el tratamiento de péptido que promueve un perfil de citoquina inflamatoria. Ratones db/db diabéticos de ocho semanas de edad se asignaron a los grupos de 8. El grupo recibió Solución Salina (Simulado) o 0.6 mg/kg de SP16 bisemanalmente durante 12 semanas. Los niveles de CRP y TGF-beta en el cuerpo acumulados se determinaron para cada grupo. (*) indica p<0.05 y (**) p<0.01 comparado con el grupo de control de vehículo.

La Figura 9 es una gráfica que resume los datos de un estudio en el modelo de artritis reumatoide CAIA de ratón. La gráfica muestra registros de hinchamiento acumulativos para todas las patas en el pico de la enfermedad (Día 7) para los grupos de 5 animales. Los ratones de Balb/c se inyectaron IV con un cóctel de anticuerpos de colágeno (MD BioSciences) en el Día 0 y se inyectaron IP con LPS en el Día 3. Los Animales de Control Normales no recibieron inyecciones y sirvieron como el control de línea de base libre de enfermedad. La inyección de SP16 diaria proporcionó protección equivalente a la Dexametasona.

La Figura 10 muestra los niveles de TNF-alfa en ratones estimulados con "LPS. En la Figura 10A los ratones se trataron con el péptido SP16 escaneado en alanina. La Dexametasona sirvió como control positivo del "tratamiento efectivo" y los péptidos SP16, SP40, SP43, SP46 y SP49 todos reducen los niveles de TNF-alfa más que la Dexametasona. En base a esta clasificación de alanina, y sin desear que sea limitado por una teoría, representa que los aminoácidos C- y N-terminales contribuyen al efecto anti-inflamatorio del péptido SP16. Comparar con la Figura 4 que muestra una gráfica que resume los niveles de TNF-alfa en el suero en un modelo de inflamación de ratón, estimulación de LPS, tratado con diferentes péptidos derivados de Serpin humano. Los grupos de 3 animales se inyectaron con 0.2 mg/kg de péptido y se sometieron a la estimulación con LPS. Los niveles de TNF-alfa en el suero se determinaron mediante ELISA. Varios péptidos proporcionaron el mismo nivel de protección como 1 mg/kg de Dexametasona .

La Figura 11 muestra que SP16 es un agonista de TLR2. La gráfica que resume datos representativos de los ensayos con una linea de células indicadora de TLR-2 diseñado (HEK-Blue™ mTLR2, Invivogen) . Las células se incubaron con las concentraciones indicadas de péptido durante 24 horas. En la activación de TLR2, las células secretan fosfatasa alcalina que puede ser ensayada. El ensayo se hizo por triplicado y se grafican los promedios con desviaciones estándares. SP16 exhibió propiedades de ligando TLR-2, induciendo la señalización de TLR-2 en una manera dependiente de dosis. El péptido de control revuelto SP34 no mostró inducción de TLR2. *p <0.05, comparado con el control revuelto (SP34) .

La Figura 12 muestra el análisis de relación de actividad estructural SP16. La gráfica que resume los datos de un experimento donde una linea de célula indicadora de TLR-2 diseñado (HEK-Blue™ mTLR2, Invivogen) se utilizó para probar el impacto de sustituir residuos de aminoácidos del péptido SP16 con alanina ("exploración de t alanina") . Las células se incubaron con 20 µg/ml de los péptidos indicados durante 24 horas. En la activación de TLR2, las células secretan fosfatasa alcalina que puede ser ensayada. El ensayo se hizo por triplicado y los promedios son graficados. Las secuencias de péptidos se muestran en la siguiente figura. *p <0.05, comparado con el control revuelto (SP34).

La Figura 13 muestra el análisis de relación de actividad estructural para SP16. La tabla que muestra las secuencias de aminoácidos (SEQ ID NOS 1, 18, 12-17, 52-56 y 51, respectivamente, en orden de aparición) de los péptidos que se probaron utilizando una linea de células indicadoras de TLR-2 (Ver los datos en la figura previa) . El lado derecho de la tabla resume el impacto de los péptidos en la señalización de TLR-2 (* indica bajo, ***** indica alto, N/A no tiene impacto en la señalización) . Los datos sugieren que los primeros tres residuos contribuyen a inducir la señalización de TLR-2n. Si los residuos 1-3 son sustituidos con alaninas (SP37), el péptido imitante no tiene impacto en TLR2. Sin embargo, cuando se sustituye individualmente (SP52-SP54), los péptidos retienen la habilidad para estimular TLR-2. De manera sorprendente, la sustitución del residuo de fenilalanina en la posición 3 con un residuo de alanina más pequeño aumenta la habilidad para estimular la señalización de TLR-2 comparado con SP16.

La Figura 14 muestra una representación esquemática de las diferentes fases de la diabetes tipo II.

La Figura 15 muestra una gráfica que resume los datos de un experimento con sinoviocitos humanos primarios. Las células se incubaron con 10 µ? de los péptidos indicados, así como 0, 5, 10 o 30 ng/ml ILlb, durante 48 horas. En la estimulación con ILlb, las células secretan la metaloproteasa MMP1, que está involucrada en la descomposición del cartílago en la artritis. El ensayo se hizo por triplicado y los promedios con desviaciones estándares son graficados. SP16 disminuyó la secreción de MMP1 comparado con los péptidos de control revueltos, en 20 ng/ml de ILlb. (*) indica p<0.05 comparado con el control de péptido revuelto.

DESCRIPCIÓN DETALLADA La presente descripción describe péptidos aislados utilizados y útiles en el campo de tratamiento y prevención de enfermedad. Específicamente, la presente invención proporciona péptidos aislados y/o sintetizados, y análogos sintéticos en base a estos péptidos, con efectos preventivos y terapéuticos en la enfermedad humana. Por ejemplo, los péptidos se pueden utilizar para tratar o prevenir la inflamación, destrucción de tejido auto-inmune, por ejemplo, en lupus y enfermedad de injerto contra hospedero, artritis reumatoide, fibrosis cística, eczema, psoriasis y para tratar la diabetes tipo II y tipo I, por ejemplo para estimular la expansión de la masa de célula beta en un individuo con diabetes, para tratar la enfermedad de intestino inflamatorio así como tratar o prevenir la endotoxemia después de la exposición a la radiación aguda y en pacientes quemados.

Los péptidos descritos en la presente se definen específicamente como péptidos C-terminales aislados o sintetizados cortos en base a Serpins y variantes y derivados de los mismos con propiedades anti-inflamatorias sorprendentemente efectivas y con tamaño mucho más útil para las aplicaciones terapéuticas comparadas con las proteínas Serpin nativas. Los péptidos aislados se muestran en las Figuras 1-2. La Figura 1 muestra las secuencias de aminoácidos de los fragmentos C-terminales de una variedad de Serpins. Cada péptido se marca con una SEQ ID NO: en la columna 2, inmediatamente a la izquierda del péptido. La Figura 2 muestra los truncamientos de los fragmentos C-terminales mostrados en la Figura 1, así como variantes y derivados de los mismos. Nuevamente, cada péptido se marca con una SEQ ID NO: en la columna 2, inmediatamente enseguida al péptido.

Los inventores han descubierto que SP16 (SEQ ID NO: 1) que se deriva de alfa-antitripsina humana exhibe propiedades anti-inflamatorias e inmunomoduladoras similares a aquellas de la proteína parental, alfa-l-antitripsina . SP16 se presenta que es un interruptor maestro de péptido de primera clase para el tratamiento de enfermedades auto-inmunes, inflamatorias y metabólicas. Sin desear que sea enlazado por una teoría, los péptidos de la invención pueden proporcionar un buen perfil de seguridad, en base al buen perfil de seguridad de la proteína parental, alfa-1-antitripsina . Sin embargo, los péptidos de la invención son mucho más fáciles y de esta manera menos costosos de producir ya que son mucho más pequeños que la proteína parental.

Los inventores han descubierto que los péptidos C-terminales que resultan de una segmentación de la molécula Serpin por una de sus serina proteasas cognadas tienen función biológica intrínseca que es distinta de aquella de la función del inhibidor de proteasa de la molécula Serpin completa, parental. Por ejemplo, Los péptidos C-terminales de AAT, antiquimotripsina y Kallistatina tienen grados variantes de efectos anti-inflamatorios . En base a la investigación de los inventores, ellos suponen que estos péptidos antiinflamatorios y/o inmunomoduladores , son un subproducto del ciclo de vida de una molécula Serpin, que representa un tipo de un "interruptor maestro" inmunológico e inflamatorio (homeostático) .

Por otra parte, los datos de los inventores de líneas de células diseñadas muestran que SP16 activa la ruta de señalización de TLR-2, pero no la señalización de TLR-4. Esto es interesante debido a que otro péptido de inmunomodulación, DiaPep277, que no comparte similitud de secuencia con SP16, tiene un perfil de activación de TLR similar. Sin desear que sea limitado por una teoría, en base a estas observaciones, los inventores sugieren que SP16 actúa a través del receptor TLR2, y posiblemente el receptor de célula T, para inducir la secreción de citoquina a un perfil de citoquina anti-inflamatoria Th2 (IL-4 e IL-10). En enfermedades auto-inmunes, SP16 se predice que induce la expansión de poblaciones de células T reguladoras y de esta manera desplazan la respuesta inflamatoria hacia una respuesta reguladora.

. Los inventores por lo tanto proporcionan moléculas anti-inflamatorias novedosas de los péptidos C-terminales de moléculas Serpin, y maneras novedosas para desarrollar moléculas anti-inflamatorias adicionales al modificar los fragmentos C-terminales de Serpins.

Las funciones previamente conocidas de los Serpins se relacionan con la inhibición de la función de las enzimas serina proteasa. Unos pocos Serpins inhiben otros tipos de proteínas, y varios no tienen una función inhibidora.

Los Serpins son una familia grande (>1000) de Inhibidores de Serina Proteasa que son estructuralmente similares pero con funcionalmente diversos. Están involucrados en una multitud de procesos fisiológicos y son críticos para la homeostasis en mamíferos. Las mutaciones genéticas en Serpins individuales se manifiestan en diferentes enfermedades humanas, incluyendo COPD, trombosis y enfisema .

Cada Serpin con una función inhibidora es responsable para bloquear la actividad de una o más proteínas. Los Serpins enlazan a sus proteínas objetivo para prevenirlas de completar cualquiera de las reacciones adicionales. En el enlace a un objetivo, ocurre un cambio irreversible en la estructura de una proteína Serpin. Ciertas células reconocen cuando un Serpin se enlaza a su objetivo y evacúan estas proteínas adjuntas de la corriente sanguínea.

La alfa-l-antitripsina (AAT) es el Serpin prototípico. PROLASTIN® (Talecris), ZEMAIRA® (Aventis Behring) y ARALAS ® (Baxter) son formulaciones de AAT derivadas de suero humano aprobadas por la FDA para el tratamiento de COPD. AAT está actualmente en experimentos clínicos para el tratamiento de la diabetes tipo I de nuevo inicio, enfermedad de injerto contra hospedero y fibrosis cística .

Los investigadores han identificado por lo menos 37 genes Serpin diferentes en humanos. En base en la investigación de los inventores, ellos proponen que los fragmentos C-terminales aislados y sintetizados de las proteínas Serpins proporcionan una fuente novedosa de moléculas anti-inflamatorias . De esta manera, los inventores proponen que los fragmentos C-terminales de por lo menos los Serpins listados en la Tabla A son útiles como moléculas anti-inflamatorias .

Los inventores además realizaron una clasificación de alanina que mostró que los péptidos SP16 modificados, aislados o sintetizados mostrados en la Tabla B enseguida son particularmente efectivos en reducir los niveles de TNF-alfa en un modelo de ratón para inflamación. Específicamente, los inventores descubrieron que en estos fragmentos particulares, los tres aminoácidos más N-terminales y los dos aminoácidos más C-terminales se presentan que desempeñan una función en las propiedades anti-inflamatorias de los péptidos como reemplazo de estos que se presentó que reduce la capacidad de los péptidos para reducir los niveles de TNF-alfa en un modelo de ratón estimulado con LPS de sepsis (Figura 10) . Por consiguiente, en algunos aspectos de todas las modalidades de la invención, los péptidos se seleccionan de las secuencias de péptido SP40, SP43, SP46 y SP49 de las cuales se expone en la Tabla B.

La Tabla B muestra los péptidos nombrados SP16; SP40; SP43; SP46; y SP49 que proporcionaron particularmente buen efecto anti-inflamatorio cuando se administran a un modelo de ratón de sepsis (Ver la Figura 10) .

Tabla B Secuencias de Aminoácidos del Péptido SP16 V K F N K P F V F L M I E Q N T K (SEQ ID NO: 1) SP37 A A A N K P F V F L M I E Q N T K (SEQ ID NO: 12) SP40 V K F A A A F V F L M I E Q N T K (SEQ ID NO: 13) SP43 V K F N K P A A A L M I E Q N T K (SEQ ID NO: 14) SP46 V K F N K P F V F A A A E Q N T K (SEQ ID NO: 15) SP49 V K F N K P F V F L M I A A A T K (SEQ ID NO: 16) SP51 V K F N K P F V F L M I E Q A A A (SEQ ID NO: 17) De acuerdo con algunas modalidades y aspectos de la invención, cualquiera de los péptidos aislados que consisten de o que consisten esencialmente de las secuencias expuestas en SEQ ID NOs : 8, 10, 19-34 y 38-49 se pueden utilizar para reducir la inflamación. Cualquiera de los péptidos que consisten de o que consisten esencialmente de las secuencias expuestas en SEC ID NOs: 8, 10, 19-34 y 38-49 también se pueden utilizar para reducir TNF-oc en un sujeto. En ciertas modalidades, la cantidad de TNF- en el suero se reduce por hasta 50% o más o 75% o más comparado con la cantidad de la misma en el suero antes de la administración del péptido.

La Tabla C enseguida presenta péptidos ejemplares adicionales que se utilizaron para reducir los niveles de TNF-alfa en ratones sometidos a una estimulación con LPS. Ver también la Figura 10B. También los péptidos con capacidad para reducir los niveles de TNF-alfa como es mostrado en la Figura 10B se contemplan para las composiciones, composiciones farmacéuticas y métodos de uso y tratamiento de condiciones inflamatorias en la presente invención.

Tabla C (SEQ ID NOS 18-32, 1, y 33-34, respectivamente, en orden de aparición) SP1 AAT Humano C36 SIPPE VK FNKPFVFL I EQNT KSPLF G KVVNPTQK Humano SP2 KALLISTATIN (39) SAQTN RH I L R F N RP F L V V I F S T S T Q S V L F L G K V V D PT K P Humana Antiquimotripsina (40) SALVETRT I VR FNRPFLMI I VPTDT QNI FFMS KVTNPKQA SP4 Serp¡na3M de Rata(C38) SGRPPM I VW FNRPFLIAVSHTHG QTILFMA KVIN PVGA SP5 Serpina 3K de Rata (C38) KSLPQTIP LLN FNRPFMLVITDDNGQSVFFMGKVTNPM SP6 Híbrido 1 de Humano SAQVET IVR FNRPFL VI 1 VSTNTQ SP7 Híbrido 1 de Humano-Rata SI PPQ IVWFNRPFL IAI SHTHTQ SP8 AAT de Humano C36 SIPPE VKFNKPFVFLM IEQNTK Humano SP9 KALLISTATINA (C39) SAQTN RH ILRFNRPFLV VI FSTSTQ Humana SP10 Antíquímotrípsina (40) SALVETRT I VR FNRPFLM 11 VPTCTQ SP11 Serpina 3K de Rata (C38) KSLPQTIPL LN FNRPFMLVITDDNGQ SP12 AAT Humana C36 Humana IPPEVKFNKPFV FLMIEQNTK SP13 KALLISTATINA (C39) NRHILRFNRPFLV VIFSTSTQ Humana SP14 Antiquimotripsina (40) TRTIVRFNRPFLM I IVPTDTQ SP15 Serpina 3K de Rata (C38) TIPLLNFNRPFMLVITDDNGQ SP16 Secuencia de núcleos C36, VKFNKPFVF LMIEQNTK larga SP17 Secuencia de núcleos C36, VKFNKPFVFLM corta SP18 AAT C36 humana SIPPE VKAA'AAAAFLMI EQNTK SP1 (SEQ ID NO: 18); SP2 (SEQ ID NO: 19); SP3(SEQ ID NO: 20) ; SP4 (SEQ ID NO: 21); SP5 (SEQ ID NO: 22); SP6 (SEQ ID NO: 23) ; SP7 (SEQ ID NO: 24); SP8 (SEQ ID NO: 25); SP9 (SEQ ID NO: 26); SP10 (SEQ ID NO: 27); SPll (SEQ ID NO: 28); SP12 (SEQ ID NO: 29); SP13 (SEQ ID NO: 30); SP14 (SEQ ID NO: 31); SP15 (SEQ ID NO: 32); SP16 (SEQ ID NO: 1); SP17 (SEQ ID NO: 33); SP18 (SEQ ID NO: 34).

La frase "que consiste esencialmente de" se propone en la presente para definir el alcance de los péptidos a los aminoácidos de material especificado, y únicamente incluyen aminoácidos adicionales o cambios que no afectan materialmente las características básicas y novedosas de la invención reclamada, específicamente, la capacidad anti-inflamatoria de los péptidos aislados o sintetizados cortos. La definición específicamente excluye los péptidos que tiene una secuencia de una proteína Serpin completa, y la definición también específicamente excluye secuencias de péptido que son iguales a o más largas que 37 aminoácidos de cualquier proteína Serpin de ocurre naturalmente.

Sin desear que sea limitado por una teoría, los inventores también han identificado los aminoácidos importantes que proporcionan el núcleo, y las modificaciones posibles, para los péptidos anti-inflamatorios como son fabricados en la presente. Por lo tanto, los péptidos aislados abarcados por las fórmulas expuestas enseguida también se proporcionan y se pueden utilizar para reducir la inflamación .

La AAT humana, antiquimotripsina y kalistatina se han conocido que contiene elementos con propiedades anti- inflamatorias. Sin embargo, estos elementos no se han identificado previamente. Los inventores ahora han establecido una nueva familia de péptido derivado de Serpin humano con potente efecto anti-inflamatorio utilizando, por ejemplo, un modelo de endotoxemia de ratón (endotoxemia inducida por LPS) . En base a la eficacia de los péptidos en el modelo de inflamación de ratón, el tamaño de péptido y el perfil de seguridad de la proteina parental, los péptidos a base de AAT, los péptidos, tal como SP16 y los fragmentos y derivados de los mismos proporcionan una molécula novedosa y mejorada para tratar la inflamación en humanos.

La Fórmula I proporciona una composición que comprende un péptido que comprende, que consiste esencialmente de o que consiste de la secuencia de aminoácidos X1-Z1-F-N-R-P-F-X2-Z2-X3-Z3-Q (SEQ ID NO: 35) y X1-Z1-F-N-K-P-F-X2-Z2-X3-Z3 (SEQ ID NO: 2) en donde XI es V o L; X2 es V, L o M; X3 es M, l o V; Zl es cualquier aminoácido; Z2 es una secuencia de cualquiera de dos aminoácidos; y Z3 es una secuencia de cualquiera de cinco aminoácidos, en donde el péptido comprende 37 o menos aminoácidos .

En ciertos aspectos de todas las modalidades, el péptido aislado causa una disminución de 50% o 75% en los niveles de TNF-cc en el suero comparado con el nivel en el suero como es medido antes de la administración del péptido aislado, cuando se administra en una cantidad efectiva a un sujeto humano. En algunos aspectos de todas las modalidades de la invención, el péptido además comprende una proteina de fusión. La proteina de fusión se puede seleccionar de una etiqueta de epitopo y un extendedor de vida media o una combinación de los mismos.

En ciertos aspectos de todas las modalidades, el péptido aislado causa mejoramiento en el control glucémico en sujetos diabéticos, como es medido utilizando, por ejemplo, una prueba A1C, prueba de glucosa en el plasma en ayunas (FPG) y/o la prueba de tolerancia de glucosa oral (OGTT) . Los individuos pre-diabéticos típicamente registran en o arriba de 5.7% o abajo de 6.5% en la prueba A1C, mientras que los diabéticos registran arriba de 6.5% en esta prueba. Los individuos pre-diabéticos también típicamente registran en o arriba de 100 mg/dl o abajo de 126 mg/dl utilizando la prueba FPG mientras que los diabéticos registran arriba de 126 mg/dl. Los individuos pre-diabéticos típicamente registran en o arriba de 140 o abajo de 200 mg/dl utilizando la prueba OGTT mientras que los individuos diabéticos registran arriba de 200 mg/dl.

La Fórmula II proporciona una composición que comprende un péptido aislado que comprende, que consiste esencialmente de o que consiste de la secuencia de aminoácidos X1-Z1-F-N-X2-P-F-X3-Z2-X4-Z3-X5 (SEQ ID NO: 3), en donde XI es V o L; X2 es K o R; X3 es V, L o M; X4 es M, l o V; X5 es K o Q; Zl es cualquier aminoácido; Z2 es una secuencia de cualquiera de dos aminoácidos ; Z3 es una secuencia de cualquiera de cinco aminoácidos; y en donde el péptido aislado causa una disminución de 75% en los niveles de TNF-a en el suero comparado con los niveles en el suero antes de la administración del péptido aislado cuando se administra en una cantidad efectiva a un sujeto humano.

En ciertas modalidades, el péptido que comprende la secuencia de aminoácidos de X1-Z1-F-N-X2-P-F-X3-Z2-X4-Z3-X5 (SEQ ID NO: 3) como se definió en lo anterior, incluye, a lo más, 35, 22 o 21 residuos de aminoácido. En ciertos aspectos de todas las modalidades de la invención, el péptido además comprende una proteina de fusión. Específicamente la proteina de fusión se puede seleccionar de una etiqueta de epitopo y un extendedor de vida media o una combinación de los mismos .

En algunos aspectos de todos los métodos y usos de la invención, el péptido es SP16.

Por lo tanto, la invención también proporciona un péptido aislado que consiste de o que consiste esencialmente de la secuencia de aminoácidos RFNRPFLR (SEQ ID NO: 4) y RFNKPFLR (SEQ ID NO: 5), que también se puede utilizar para el tratamiento de inflamación. En ciertas modalidades, el péptido causa una disminución de 50% o 75% en los niveles de TNF-cc en el suero comparado con los niveles de TNF-a en el suero antes de la administración del péptido aislado cuando se administra en una cantidad efectiva a un sujeto humano. En algunos aspectos de todas las modalidades de la invención, el péptido aislado además comprende una proteina de fusión. Específicamente, la proteína de fusión se puede seleccionar de una etiqueta de epitopo y un extendedor de vida media. En otras modalidades, el péptido aislado comprende, a lo más, 100, 35, 22, 21, 16 o 9 aminoácidos. En otras modalidades, el péptido aislado comprende la secuencia de aminoácidos de Z1-RFNRPFLR-Z2 (SEQ ID NO: 6) y Zl-RFNKPFLR-Z2 (SEQ ID NO: 7) en donde Zl y Z2 son independientemente entre 1, 2, 3, 4, 5, 6, 6, 7, 8, 9, 10 o entre 1 y 3, entre 1 y 5, entre 1 y 6, entre 1 y 7, entre 1 y 8, entre 1 y 9 o entre 1 y 10 aminoácidos básicos.

En algunos aspectos de todas las modalidades de la invención, el péptido aislado consiste esencialmente de o consiste de la secuencia de aminoácidos de RRRFNRPFLRRR (SEQ ID NO: 8) y RRRFNKPFLRRR (SEQ ID NO: 9) . La descripción también proporciona una composición que comprende un péptido que consiste esencialmente de o que consiste de la secuencia de aminoácidos de FNRPFL (SEQ ID NO: 10) y FNKPFL (SEQ ID NO: 11) · En ciertas modalidades el péptido aislado comprende 5 o más aminoácidos secuenciales de la secuencia de aminoácidos de FLMIEQNTK (SEQ ID NO: 36) . Estos péptidos se pueden utilizar para reducir la inflamación o reducir el subnivel de TNF-ct en un sujeto. En ciertas modalidades, la cantidad del nivel de TNF-a en el suero se reduce comparada con cantidad de TNF- en el suero antes de la administración del péptido aislado. En ciertas modalidades, el control glucémico se mejora como se mide utilizando las pruebas tal como la prueba A1C, la prueba de glucosa en el plasma en ayunas (FPG) y la prueba de tolerancia de glucosa oral (OGTT) . También, tanto el nivel de TNF- como el control glucémico se puede utilizar cuando se mide el mejoramiento en individuo diabético.

En algunos aspectos, el método de tratamiento de inflamación además comprende el análisis de los niveles en el suero de TNF-oc antes de la administración del péptido aislado y después de la administración del péptido aislado. Si el nivel en el suero de TNF-a se disminuye menor que 30%, la etapa de administración se puede repetir con la misma dosis o con una dosis más grande del péptido, comparada con la primera dosis.

Los fragmentos de cualquiera de los péptidos descritos en lo anterior pueden variar en tamaño. Por ejemplo, estos fragmentos pueden ser 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 o 37, aminoácidos en longitud.

Los péptidos descritos en lo anterior generalmente se utilizan para reducir la inflamación. Los péptidos 'ejercen efectos anti-inflamatorios e inmunomodulación, y adicionalmente, directamente o indirectamente estimulan la regeneración de célula beta. En ciertas modalidades, estos péptidos reducen la inflamación al reducir la actividad o expresión de TNF-cc. La actividad de TNF-a se puede reducir por 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 99 o 100%. La expresión de TNF-a se puede reducir 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 99 o 100%. Cuando se administra terapéuticamente, la composición de péptido típicamente además comprende una solución o portador farmacéuticamente aceptable.

Los péptidos descritos en lo anterior también se pueden utilizar para tratar, prevenir o mejorar los síntomas de varias patologías. Estas patologías incluyen inflamación, destrucción de tejido auto-inmune e hiperglucemia . Los péptidos descritos en lo anterior también se pueden utilizar para estimular la expansión de masa de célula beta en un individuo con diabetes, tratamiento de fibrosis cística, y en el tratamiento o prevención de endotoxemia después de la exposición a la radiación aguda y en pacientes quemados.

Por consiguiente, la descripción además proporciona métodos para tratar la inflamación que comprenden la etapa de administrar cualquiera de los péptidos descritos en la presente o una combinación de los mismos a un sujeto en necesidad del tratamiento de inflamación. En algunos aspectos, el sujeto no se ha tratado con alfa-antitripsina antes del tratamiento. En algunos aspectos, el método comprende una etapa de ensayar si el individuo tiene niveles de TNF-oc en el suero incrementados y si el sujeto tiene niveles de TNF-oc en el suero incrementados, luego administrar el péptido al sujeto y si no es así, entonces no administrar el péptido al sujeto.

La descripción también permite métodos para prevenir el desarrollo de inflamación que comprende la etapa de administrar cualquiera de los péptidos o una combinación de los mismos a un sujeto en necesidad de prevención de inflamación. En algunos aspectos, el sujeto no se ha tratado con alfa-antitripsina antes del tratamiento. En algunos aspectos, el método comprende una etapa de ensayar si el individuo tiene niveles de TNF-a en el suero incrementados y si el sujeto tiene niveles de TNF-a en el suero incrementados entonces administrar el péptido al sujeto, y si no es asi, entonces no administrar el péptido al sujeto.

La descripción también permite métodos para prevenir la destrucción de tejido auto-inmune, que comprenden la etapa de administrar cualquiera de los péptidos o una combinación de los mismos a un sujeto en necesidad de prevención de la destrucción de tejido auto-inmune. En algunos aspectos, el sujeto no se ha tratado con alfa-antitripsina antes del tratamiento. En algunos aspectos, el método comprende una etapa de ensayar si el individuo tiene niveles de TNF-a en el suero incrementados y si el sujeto tiene niveles de TNF-a en el suero incrementados entonces administrar el péptido al sujeto, y si no es asi, entonces no administrar el péptido al sujeto.

La descripción también permite métodos para mejorar el control glucémico en individuos que tienen diabetes que comprenden la etapa de administrar a cualquiera de los péptidos o una combinación de los mismos a un sujeto en necesidad de prevención de la destrucción de tejido auto-inmune. En algunos aspectos, el sujeto no se ha tratado con alfa-antitripsina antes del tratamiento. En algunos aspectos, el método comprende una etapa de ensayar si el individuo tiene control glucémico mejorado mediante, por ejemplo, la prueba A1C, la prueba de glucosa en el plasma en ayunas y/o la prueba de tolerancia de glucosa oral o cualquier otra prueba conocida para medir el funcionamiento del control glucémico.

En una modalidad, la descripción proporciona el uso de cualquiera o una combinación de los péptidos aislados o sintetizados para el tratamiento de inflamación, y la inflamación en donde se incrementa el nivel de TNF- .

En ciertos aspectos de todas las modalidades, la inflamación se relaciona a la diabetes tipo 1 o 2, artritis reumatoide o COPD.

La invención también proporciona métodos para el tratamiento y prevención de fibrosis cistica y endotoxemia después de la exposición a la radiación aguda y en pacientes quemados utilizando cualquiera o una combinación de los péptidos de la invención.

Por conveniencia, ciertos términos empleados en la solicitud completa (incluyendo la especificación, ejemplos y reivindicaciones adjuntas) se definen por toda la especificación. A menos que se defina de otra manera, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente tienen el mismo significado como es comúnmente entendido por uno de habilidad ordinaria en la técnica a la cual esta invención pertenece.

El término "tipo silvestre" se refiere a la secuencia de polinucleótido que ocurre naturalmente que codifica una proteina, o una porción de la misma o secuencia de proteina, o porción de la misma, respectivamente, como normalmente existe in vivo.

El término "mutante" se refiere a cualquier cambio en el material genético de un organismo, en particular un cambio (es decir, supresión, sustitución, adición o alteración) en una secuencia de polinucleótido de tipo silvestre o cualquier cambio en una secuencia de proteina de tipo silvestre. Aunque frecuentemente se asume que un cambio en el material genético da por resultado un cambio de la función de la proteina, el término - "mutante" se refiere a un cambio en la secuencia de una proteina de tipo silvestre sin considerar si ese cambio altera la función de la proteina (por ejemplo, incrementa, disminuye, imparte una nueva función) , o si ese cambio no tiene efecto sobre la función de la proteína (por ejemplo, la mutación o variación es silenciosa) . El término mutación se utiliza intercambiablemente la presente con el polimorfismo en esta solicitud.

Los términos "polipéptido" y "proteína" se utilizan intercambiablemente para referirse a un polímero aislado de residuos de aminoácido, y no están limitados a una longitud mínima a menos que se defina de otra manera. Los péptidos, oligopéptidos, dímeros, multimeros y los similares, también están compuestos de aminoácidos linealmente arreglados, enlazados por enlaces de peptídico, y si se producen biológicamente y se aislan del ambiente natural, producidos utilizando tecnología recombinante, o producidos sintéticamente de manera típica utilizando aminoácidos que ocurren naturalmente.

En algunos aspectos, el polipéptido o proteína es un "polipéptido modificado" que comprende aminoácidos que no ocurre naturalmente. En algunos aspectos, los polipéptidos comprenden una combinación de aminoácidos que ocurren naturalmente y que no ocurren naturalmente, y en algunas modalidades, los péptidos comprenden únicamente aminoácidos que no ocurren naturalmente.

En algunos aspectos de todas las modalidades de la invención, los péptidos o péptidos modificados además comprenden modificaciones co-traduccionales y pos-traduccionales (segmentación de péptido C-terminal) tal como por ejemplo, formación de enlace de disulfuro, glicosilación, acetilación, fosforilación, segmentación proteolítica (por ejemplo, segmentación por furinas o metaloproteasas) y los similares al grado que tales modificaciones no afectan las propiedades anti-inflamatorias de los péptidos aislados o su capacidad para mejorar el control glucémico.

En algunos aspectos de la invención, el polipéptido es alterado. El término "polipéptido alterado" se refiere a un péptido que incluye alteraciones, tales como supresiones, adiciones y sustituciones (generalmente de naturaleza conservativa como seria conocido a una persona en la técnica, tales como alaninas) a la secuencia nativa, mientras que la proteina mantenga la actividad deseada, es decir, la actividad anti-inflamatoria de capacidad para mejorar el control glucémico o reducir la hiperglucemia . Estas modificaciones pueden ser deliberadas, como a través de la mutagénesis dirigida al sitio, o puede ser accidental, tal como a través de mutaciones de hospederos artificiales, tales como bacterias, levaduras o células mamíferas genéticamente diseñadas, que producen las proteínas, o errores debido a la amplificación de PCR u otro métodos de DNA recombinantes. Los polipéptidos o proteínas están compuestos de aminoácidos linealmente arreglados enlazados por enlaces de péptido, pero en contraste a los péptidos, tienen una conformación bien definida. Las proteínas, como es opuesto a los péptidos, generalmente consisten de cadenas de 50 o más aminoácidos.

El término "péptido" como se utiliza en la presente típicamente se refiere a una secuencia de aminoácidos hecha de una sola cadena de aminoácidos unidos por enlaces de péptido. Generalmente, los péptidos contienen por lo menos dos residuos de aminoácido y son menores que aproximadamente 50 aminoácidos en longitud, a menos que se defina de otra manera .

"Péptido modificado" puede incluir la incorporación de aminoácidos no naturales en los péptidos de la invención, incluyendo aminoácidos no nativos sintéticos, aminoácidos sustituidos o uno o más D-aminoácidos en los péptidos (u otros componentes de la composición, con excepción para las secuencias de reconocimiento de proteasa) es deseable en ciertas situaciones. Los péptidos que contienen D-aminoácido exhiben estabilidad incrementada in vitro o in vivo comparado con formas que contienen L-aminoácido . De esta manera, la construcción de péptidos que incorporan D-aminoácidos puede ser particularmente útil cuando se desea o se requiere mayor estabilidad in vivo o intracelular . Más específicamente, los D-péptidos son resistentes a peptidasas endógenas y proteasas, para de esta manera proporcionar mejor suministro trans-epitelial y oral y transdérmico de los fármacos enlazados y conjugados, biodisponibilidad mejorada de los complejos permanentes de membrana (ver en seguida para discusión adicional) y tiempos de vida intravasculares e intersticiales prolongados cuando son deseables tales propiedades. El uso de péptidos D-isómero también pueden aumentar el suministro transdérmico y trans-epitelial oral de los fármacos enlazados u otras moléculas de carga.

Adicionalmente, los D-péptidos no pueden ser procesados eficientemente por la representación restringida del complejo de histocompatibilidad mayor clase II a las células T ayudantes, y por lo tanto son menos probables que induzcan respuestas inmunes humorales en el organismo completo. Los conjugados de péptido por lo tanto pueden ser construidos utilizando, por ejemplo, formas de D-isómero de secuencias de péptido penetrantes de células, las formas de L-isómero de sitios de segmentación y formas de D-isómeros de péptidos terapéuticos. Por lo tanto, en algunas modalidades los péptidos como es descrito comprenden L y D-aminoácidos, en donde se incluyen no más de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 D-aminoácidos. En ciertos aspectos, el péptido comprende más de 10 D-aminoácidos, y en ciertos aspectos todos los aminoácidos de los péptidos son D-aminoácidos.

En todavía un aspecto adicional, los péptidos o fragmentos o derivados de los mismos pueden ser "péptidos retro-inverso". Un "péptido retro-inverso" se refiere a un péptido con una reversión de la dirección del enlace de péptido en por lo menos una posición, es decir, una reversión del amino- y carboxi-terminal con respecto a la cadena lateral del aminoácido. De esta manera, un análogo retro-inverso ha revertido las terminales y revertido la dirección de los enlaces de péptido mientras que aproximadamente mantiene la topología de las cadenas laterales como en la secuencia de péptido nativo. El péptido retro-inverso puede contener L-aminoácidos o D-aminoácidos, o una mezcla de L-aminoácidos y D-aminoácidos, hasta todos los aminoácidos que son el D-isómero. Los análogos de péptido retro-inverso parciales son polipéptidos en los cuales únicamente parte de la secuencia es revertida y reemplazada con residuos de aminoácido enantioméricos . Puesto que la porción retro-invertida de cada análogo tiene en amino y carboxilo terminales revertidos, los residuos de aminoácido que flanquean la porción retro-invertida se reemplazan por diarainometanos y malonatos gemínales a-sustituidos análogos de cadena lateral, respectivamente. Las formas retro-inversa de péptidos penetrantes de célula se han encontrado que trabajan tan eficientemente en la translocalización a través de una membrana como las formas naturales. La síntesis de análogos de péptido retro-inverso se describen en Bonelli, F. y colaboradores, Int J Pept Protein Res. 24(6):553-6 (1984); Verdini, A and Viscomi, G. C, J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1:697-701 (1985); y la Patente de los Estados Unidos No. 6,261,569, que se incorporan en la presente en su totalidad por referencia. Los procesos para la síntesis en fase sólida de los análogos de péptidos retro-inverso parciales se han descrito (EP 97994-B) que también se incorpora en la presente en su totalidad por referencia.

Los términos "homología", "identidad" y "similitud" se refieren al grado de similitud de la secuencia entre dos péptidos o entre dos moléculas de ácido nucleico óptimamente alineadas. La homología y la identidad cada una se puede determinar al comparar una posición en cada secuencia que se pueda alinear para propósitos de comparación. Por ejemplo, está se basa en la utilización de un software de homología estándar en la posición de error, tal como BLAST, la versión 2.2.14. Cuando una posición equivalente en las secuencias comparadas se ocupa por la misma base o aminoácido, entonces las moléculas son idénticas en esa posición; cuando el sitio equivalente ocupado por residuos de aminoácidos similares (por ejemplo, similar en naturaleza estérica y/o electrónica tales como, por ejemplo sustituciones de aminoácido conservativa) , entonces las moléculas pueden ser referidas como homologas (similares) en esa posición. La expresión como un porcentaje de homología/similitud o identidad se refiere a una función del número de aminoácidos similares o idénticos en las posiciones compartidas por las secuencias comparadas, respectivamente. Una secuencia que es "no relacionadas" o "no homologas" comparte menor que 40% de identidad, aunque de preferencia menor que 25% de identidad con las secuencias como es descrito en la presente.

Como se utiliza en la presente, el término "identidad de secuencia" significa que dos secuencias de polinucleótido o aminoácidos son idénticas (es decir, en una base de nucleótido por nucleótido o residuo por residuo) sobre la ventana de comparación. El término "porcentaje de identidad de secuencia" se calcula al comparar dos secuencias óptimamente alineadas sobre la ventana de comparación, al determinar el número de posiciones en las cuales la base de ácido nucleico idéntica (por ejemplo, A, T. C, G. U. o I) o residuo ocurre en ambas secuencias para producir el número de posiciones igualadas, al dividir el número de posiciones igualadas entre el número total de posiciones en la ventana de comparación (es decir, el tamaño de ventana) , y al multiplicar el resultado por 100 para producir el porcentaje de identidad secuencial.

El término "identidad sustancial" como se utiliza en la presente denota una característica de una secuencia de polinucleótido de aminoácidos, en donde el polinucleó ido o aminoácido comprende una secuencia que tiene por lo menos 85% de identidad de secuencia, de preferencia por lo menos 90% a 95% de identidad de secuencia, más usualmente por lo menos 99% de identidad de secuencia como es comparado con una secuencia de referencia sobre una ventana de comparación de por lo menos 18 posiciones de nucleótido (6 aminoácidos), frecuentemente sobre una ventana de por lo menos 24-48 posiciones de nucleótido (8-16 aminoácidos), en donde el porcentaje de identidad de secuencia se calcula al comparar la secuencia de referencia con la secuencia que puede incluir supresiones o adiciones con el 20 por ciento total o menor de secuencia de referencia sobre la ventana de comparación. La secuencia de referencia puede ser un subcon unto de una secuencia más grande. El término "similitud", cuando se utiliza para describir un polipéptido, se determina al comparar la secuencia de aminoácidos y los sustitutos de aminoácidos conservados de un polipéptido con la secuencia de un segundo polipéptido.

Como se utiliza en la presente, los términos "homólogo" u "homólogos" se utilizan intercambiablemente, y cuando se utilizan para describir un polinucleótido o un polipéptido, indica que dos polinucleótidos o polipéptidos , o secuencias designadas de los mismos, cuando se alinean o se comparan óptimamente, por ejemplo utilizando BLAST, versión 2.2.14 con los parámetros de error para una alineación (ver en la presente) son idénticos, con inserciones o supresiones de nucleótido apropiadas o inserciones o supresiones de aminoácido, en por lo menos 70% de los nucleótidos, usualmente de aproximadamente 75% a 99%, y más de preferencia por lo menos aproximadamente 98 a 99% de los nucleótidos. El término "homólogo" u "homólogos" como se utiliza en la presente también se refiere a la homología con respecto a la estructura y/o función. Con respecto a la homología de secuencia, las secuencias son homologas si son por lo menos 50%, por lo menos 60, por lo menos 70%, por lo menos 80%, por lo menos 90%, por lo menos 95% idénticas, o por lo menos 97% idénticas o por lo menos 99% idénticas. La determinación de los homólogos de los genes o péptidos de la presente invención se pueden averiguar fácilmente por la persona experta.

El término "sustancialmente homólogo" se refiere a secuencias que son por lo menos 90%, por lo menos 95% idénticas, por lo menos 96% idénticas, por lo menos 97% idénticas, por lo menos 98% idénticas o por lo menos 99% idénticas . Las secuencias homologas pueden ser el mismo gen funcional en diferentes especies. La determinación de homólogos de los genes o péptidos de la presente invención, se pueden averiguar fácilmente por la persona experta.

Para comparación de secuencia, típicamente una secuencia actúa como una secuencia de referencia, a la cual se comparan las secuencias de prueba. Cuando se utiliza un algoritmo de comparación de secuencia, las secuencias de prueba y de referencia se introducen en una computadora, se designan las coordenadas de subsecuencia, si es necesario, y se designan los parámetros del programa de algoritmo de secuencia. El algoritmo de comparación de secuencia luego calcula el por ciento de identidad de secuencia para la secuencia (s) de prueba con relación a la secuencia de referencia, en base a los parámetros del programa designados.

La alineación óptima de las secuencias para la comparación se puede conducir, por ejemplo, mediante el algoritmo de homología local de Smith y Waterman (Adv. Appl. Math. 2:482 (1981), que es incorporada por referencia en la presente), mediante el algoritmo de alineación de homología de Needleman y unsch (J. Mol. Biol. 48:443-53 (1970), que se incorpora por referencia en la presente) , mediante la búsqueda para método de similitud de Pearson y Lipman (Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85:2444-48 (1988), que se incorpora en la presente por referencia) , mediante implementaciones computarizadas de estos algoritmos (por ejemplo, GAP, BESTFIT, FASTA y FASTA en el Paquete de Software de Genética de Wisconsin, Grupo de Computadora Genética, 575 Science Dr., Madison, Wis), o mediante la inspección visual. (Ver generalmente Ausubel y colaboradores, (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, 4th ed., John Wiley and Sons, New York (1999) ) .

Un ejemplo de un algoritmo útil es PILEUP. PILEUP crea una alineación de secuencia múltiple a partir de un grupo de secuencias relacionadas utilizando alineaciones emparejadas, progresivas para mostrar el por ciento de identidad de secuencia. Este también gráfica un árbol o dendograma que muestra las relaciones de agrupación utilizadas para crear la alineación. PILEUP utiliza una simplificación del método de alineación progresivo de Feng y Doolittle (J. Mol. Evol. 25:351-60 (1987), que se incorpora en la presente por referencia) . El método utilizado es similar al método descrito por Higgins y Sharp (Comput. Appl. Biosci. 5:151-53 (1989), que se incorpora en la presente por referencia) . El programa puede alinear hasta 300 secuencias, cada una de una longitud máxima de 5,000 nucleótidos o aminoácidos. El procedimiento de alineación múltiple comienza con la alineación emparejada de las dos secuencias más similares, produciendo una agrupación de dos secuencias alineadas. Esta agrupación luego se alinea a la siguiente secuencia más alineada o agrupación de secuencias alineadas. Dos agrupaciones de secuencias se alinean mediante una extensión simple de la alineación emparejada de dos secuencias individuales. La alineación final se logra mediante una serie de alineaciones emparejadas, progresivas. El programa se corre al designar secuencias especificas y sus coordenadas de aminoácido o nucleótido para regiones de comparación de secuencia y al designar los parámetros del programa. Por ejemplo, una secuencia de referencia se puede comparar con otras secuencias de prueba para determinar el por ciento de relación de identidad de secuencia utilizando los siguientes parámetros: ponderación de espacio de error (3.00), ponderación de longitud de espacio de error (0.10) y espacios de extremo ponderados.

Otro ejemplo de un algoritmo que es adecuado para determinar el por ciento de la identidad de secuencia y similitud de secuencia es el algoritmo BLAST, que es descrito por Altschul y colaboradores, (J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990), que se incorpora en la presente por referencia). (Ver también Zhang y colaboradores, Nucleic Acid Res. 26:3986-90 (1998); Altschul y colaboradores, Nucleic Acid Res. 25:3389-402 (1997) , que se incorporan en la presente por referencia) . El software para realizar los análisis BLAST es públicamente disponible a través del sitio de la red de Internet del Centro Nacional para Información de Biotecnológica . Este algoritmo involucra primero identificar pares de secuencia de alto registro (HSPs) al identificar palabras cortas de longitud W en la secuencia interrogante, que ya sea que igualan o satisfacen algún registro T de umbral de valor positivo cuando se alinea con una palabra de la misma secuencia en una secuencia de bases de datos. T es referido como el umbral de registro de palabra vecino (Altschul y colaboradores, (1990), supra) . Estos aciertos de palabra vecinos iniciales como semillas para iniciar las búsquedas para encontrar HSPs más largos que los contienen. Los aciertos de palabra luego se extienden en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia para que el registro de alineación acumulativo se pueda incrementar. La extensión de los aciertos de palabra en cada dirección es interrumpido cuando: el registro de alineación acumulativo falla por la cantidad X de su valor logrado máximo; el registro acumulativo va a cero o abajo, debido a la acumulación de una o más de alineaciones de residuo de registro negativo; o se alcanza el final de cualquier secuencia. Los parámetros del algoritmo BLAST W, T y X determinan la sensibilidad y velocidad de la alineación. El programa BLAST utiliza como errores una longitud de palabra (W) de 11, la matriz de registro BLOSUM62 (ver Henikoff and Henikoff, Proc. Nati. Acad. Sci USA 89:10915-9 (1992), que se incorpora en la presente por referencia) alineación (B) de 50, expectativa (E) de 10, M=5, N=-4 y una comparación de ambas hebras.

Además de calcular el por ciento de identidad de secuencia, el algoritmo BLAST también realiza un análisis estadístico de la similitud entre dos secuencias (ver por ejemplo, Karlin and Altschul, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90:5873-77 (1993), que se incorpora en la presente por referencia) . Una medición de similitud proporcionada por el algoritmo BLAST es la probabilidad de sumas más pequeñas (P(N)), que proporciona una indicación de la probabilidad mediante la cual una igualación entre dos secuencias de nucleótidos o de aminoácidos ocurriría por oportunidad. Por ejemplo, una secuencia de aminoácidos se considera similar a una secuencia de aminoácidos de referencia si la probabilidad de sumas más pequeñas en una comparación del aminoácido de prueba al aminoácido de referencia es menor que aproximadamente 0.1, más típicamente menor que aproximadamente 0.01, y mucho más típicamente menor que aproximadamente 0.001.

El término "variante" como se utiliza en la presente se refiere a un péptido o ácido nucleico que difiere del polipéptido o ácido nucleico por una o más supresiones, adiciones, sustituciones de aminoácido o ácido nucleico o modificaciones de cadena lateral, pero retiene una o más funciones específicas o actividades biológicas de la molécula que ocurre naturalmente. Las sustituciones de aminoácido incluyen alteraciones en las cuales un aminoácido se reemplaza con un residuo de aminoácido que ocurre naturalmente diferente o no convencional. Tales sustituciones se pueden clasificar como "conservativas", caso en el cual un residuo de aminoácido contenido de un polipéptido se reemplaza con otro aminoácido que ocurre naturalmente de carácter similar ya sea en relación a la polaridad, funcionalidad de cadena lateral o tamaño. Tales sustituciones conservativas son bien conocidas en la técnica. Las sustituciones abarcadas por la presente invención también pueden ser "no conservativa", en las cuales un residuo de aminoácido que está presente en un péptido se sustituye con un aminoácido que tiene diferentes propiedades, tal como un aminoácido que ocurre naturalmente de un grupo diferente (por ejemplo, la sustitución de un aminoácido cargado o hidrofóbico con alanina), o alternativamente, en el cual un aminoácido que ocurre naturalmente se sustituye con un aminoácido no convencional. En algunas modalidades, las sustituciones de aminoácidos son conservativas. También abarcado dentro del término variante cuando se utiliza con referencia a un polinucleótido o polipéptido, se refiere a un polinucleótido o polipéptido que puede variar en la estructura primaria, secundaria o terciaria, como es comparada con un polinucleótido o polipéptido de referencia, respectivamente (por ejemplo, como es comparado con un polinucleótido o polipéptido de tipo silvestre) .

Las variantes también pueden ser sintéticas, recombinantes, o polinucleótidos químicamente modificados o polipéptidos aislados o generados utilizando métodos bien conocidos en la técnica. Las variantes pueden incluir cambios de aminoácido conservativos o no conservativos, como es descrito enseguida. Los cambios de polinucleótidos pueden dar por resultado sustituciones, adiciones, supresiones, fusiones y truncamientos de aminoácido en el polipéptido codificado por la secuencia de referencia. Las variantes también pueden incluir inserciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos, incluyendo inserciones y sustituciones de aminoácidos y otras moléculas) que normalmente no ocurren en la secuencia de péptido que es la base de la variante, por ejemplo pero no limitada a la inserción de ornitina que no ocurre normalmente en proteínas humanas. El término "sustitución conservativa", cuando se describe un polipéptido, se refiere a un cambio en la composición de aminoácidos del polipéptido que no altera sustancialmente la actividad del polipéptido. Por ejemplo, una sustitución conservativa se refiere a la sustitución de un residuo de aminoácido por un residuo de aminoácido diferente que tiene propiedades químicas similares. Las sustituciones de aminoácido conservativas incluyen el reemplazo de una leucina con una isoleucina o valina, un aspartato con un glutamato, o una treonina con una serina.

Las "sustituciones de aminoácido conservativas" resultan del reemplazo de un aminoácido con otro que tiene propiedades estructurales y/o químicas similares, tal como el reemplazo de una leucina con una isoleucina o valina, un aspartato con un glutamato, o una treonina con una serina. De esta manera, una "sustitución conservativa" de una secuencia de aminoácidos particular, se refiere a la sustitución de estos aminoácidos que no son críticos para la actividad del polipéptido o la sustitución de aminoácidos con otros aminoácidos que tienen propiedades similares (por ejemplo, acídicas, básicas, positivamente o negativamente cargados, polares o no polares, etc.) tal que la sustitución de aún aminoácidos críticos no reduce la actividad del péptido, (es decir, la habilidad del péptido para penetrar la barrera hematoencefálica (BBB) ) . Las tablas de sustitución conservativa que proporcionan aminoácidos funcionalmente similares son bien conocidas en la técnica. Por ejemplo, los siguientes seis grupos cada uno contiene aminoácidos que son subsustituciones conservativas entre si: 1) Alanina (A), Serina (S) , Treonina (T) ; 2) ácido Aspártico (D) , ácido Glutámico (E) ; 3) Asparagina (N) , Glutamina (Q) ; 4) Arginina (R) , Lisina (K) ; 5) Isoleucina (I), Leucina (L) , Metionina (M) , Valina (V) ; y 6) Fenilalanina (F) , Tirosina (Y), Triptófano (W) . (Ver también Creighton, Proteins, W.H. Freeman and Company (1984), incorporado por referencia en su totalidad) . En algunas modalidades, las sustituciones, supresiones o adiciones individuales que alteran, o adicionan o suprimen un solo aminoácido o un pequeño porcentaje de aminoácidos también pueden ser considerados "sustituciones conservativas" si el cambio no reduce la actividad del péptido. Las inserciones o supresiones están típicamente en el intervalo de aproximadamente 1 a 5 aminoácidos. La elección de los aminoácidos conservativos se puede seleccionar en base a la ubicación del aminoácido que es sustituido en el péptido, por ejemplo, si el aminoácido está en el exterior del péptido y expuesto a solventes, o en el interior y no expuesto a solventes .

En modalidades alternativas, se puede seleccionar el aminoácido que sustituirá un aminoácido existente en base a la ubicación del aminoácido existente, es decir, su exposición a solventes (es decir, si el aminoácido se expone a solventes o está presente en la superficie exterior del péptido' o polipéptido como es comparado con los aminoácidos internamente localizados no expuestos a solventes) . La sustitución de sales sustituciones de aminoácido conservativas son bien conocidas en la técnica, por ejemplo como es descrito en Dordo y colaboradores, J. Mol Biol, 1999, 217, 721-739 y Taylor y colaboradores, J. Theor. Biol. 119(1986); 205-218 and S. French and B. Robson, J. Mol. Evol. 19(1983)171. Por consiguiente, se pueden seleccionar sustituciones de aminoácidos conservativas adecuadas para aminoácidos en el exterior de una proteína o péptido (es decir aminoácidos expuestos a un solvente) , por ejemplo, pero no limitados a, las siguientes sustituciones pueden ser utilizadas: sustitución de Y con F, T con S o K, P con A, E con D o Q, N con D o G, R con K, G con N o A, T con S o K, D con N o E, I con L o V, F con Y, S con T o A, R con K, G con N o A, K con R, A con S, K o P.

En modalidades alternativas, también se pueden seleccionar sustituciones de aminoácido conservativas abarcadas de manera adecuada para aminoácidos en el interior de una proteína o péptido, por ejemplo, se pueden usar sustituciones conservativas adecuadas para aminoácidos que está en el interior de una proteína o péptido (es decir, los aminoácidos no son expuestos a un solvente), por ejemplo pero no limitado, se puede usar las siguientes sustituciones conservativas: donde Y es sustituido con F, T con A o S, I con L o V, W con Y, M con L, N con D, G con A, T con A o S, D con N, I con L o V, F con Y o L, S con A o T y A con S, G, T o V. En algunas modalidades, las sustituciones de aminoácido no conservativas también son abarcadas dentro del término de variantes .

El término "derivado" como se utiliza en la presente se refiere a péptidos que se han modificado químicamente, por ejemplo pero no limitado a mediante técnicas tal como ubiquitinación, etiquetación, pegilación (derivatización con polietilenglicol ) , lipidación, glicosilación o adición de otras moléculas. Una molécula también un "derivado" de otra molécula cuando contiene porciones químicas adicionales no es normalmente una parte de la molécula. Tales pociones pueden mejorar la solubilidad de la molécula, absorción, vida media biológica, etc. Las porciones alternativamente pueden disminuir la toxicidad de la molécula, eliminar o atenuar cualquier efecto secundario indeseable de la molécula, etc. Las porciones capaces de mediar tales efectos se describen en Remington' s Pharmaceutical Sciences, 18th edition, A.R. Gennaro, Ed., MackPubl . , Easton, PA (1990), incorporada en la presente por referencia, en su totalidad.

De esta manera, en ciertos aspectos de todas las modalidades de la invención, los péptidos de la invención comprenden derivados de péptido, tales como péptidos pegilados .

El término "funcional" cuando se utiliza en conjunción con "derivado" o "variante" se refiere a un péptido de la invención que posee una actividad biológica (ya sea funcional o estructural) que es sustancialmente similar a una actividad biológica de la entidad o molécula que es un derivado funcional o variante funcional del mismo, es decir, actividad anti-inflamatoria en el contexto de los péptidos descritos en la presente. El término derivado funcional se propone para incluir los fragmentos, análogos o derivados químicos de una molécula.

El término "inserciones" o "supresiones" están típicamente en el intervalo de aproximadamente 1 a 5 aminoácidos. La variación permitida puede ser experimentalmente determinada al producir el péptido sintéticamente mientras que sistemáticamente se hacen inserciones, supresiones o sustituciones de nucleótidos en la secuencia utilizando técnicas de DNA recombinantes .

El término "sustitución" cuando se refiere a un péptido, se refiere a un cambio en un aminoácido para una entidad diferente, por ejemplo otro aminoácido o porción de aminoácido. Las sustituciones pueden ser conservativas o sustituciones no conservativas.

Un "análogo" de una molécula tal como un péptido se refiere a una molécula similar en función a ya sea la molécula completa o a un fragmento de la misma. El término "análogo" también se propone para incluir especies alélicas y variantes inducidas. Los análogos típicamente difieren de los péptidos que ocurren naturalmente en unas o unas cuantas posiciones, frecuentemente en virtud de las sustituciones conservativas. Los análogos típicamente exhiben por lo menos 80 o 90% de identidad de secuencia con los péptidos naturales. Algunos análogos también incluyen aminoácidos no naturales o modificaciones de aminoácidos N o C terminales. Ejemplos de aminoácidos no naturales son, por ejemplo pero no limitados a; aminoácidos disustituidos, N-alquil aminoácidos, ácido láctico, 4-hidroxiprolina, ?-carboxiglutamato, e-?,?,?-trimetillisina, e-?-acetillisina, O-fosfoserina, N-acetilserina, N-formilmetionina, 3-metilhistidina , 5-hidroxilisina, s-?-metilarginina . Los fragmentos y análogos se pueden clasificar para la eficacia profiláctica o terapéutica en modelos de animal transgénico como es descrito enseguida.

Por "covalentemente enlazado" se propone unido ya sea directamente o indirectamente (por ejemplo, a través de un enlazador) mediante un enlace químico covalente. En algunos aspectos de todas las modalidades de la invención, los péptidos de fusión son covalentemente enlazados.

El término "proteína de fusión" como se utiliza en la presente se refiere a una proteína recombinante de dos o más proteínas. Las proteínas de fusión se pueden producir, por ejemplo, mediante una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína que es unida al ácido nucleico que codifica otra proteína tal que constituyen una sola estructura de lectura abierta que se puede traducir en las células en un solo polipéptido que alberga todas las proteínas propuestas. El orden de arreglo de las proteínas puede variar. Las proteínas de fusión pueden incluir una etiqueta de epítopo o un extendedor de vida media. Las etiquetas de epítopo incluyen biotina, etiqueta FLAG, c-myc, hemaglutinina, His6 (SEQ ID NO: 37), digoxigenina, FITC, Cy3, Cy5, proteína fluorescente verde, etiquetas de epítopo V5, GST, ß-galactosidasa, AUl, AU5 y avidina. Los extendedores de vida media incluyen el dominio Fe y albúmina de suero.

Los términos "sujeto" y "individuo" y "paciente" se utilizan intercambiablemente en la presente, y se refieren a un animal, por ejemplo un animal humano o no humano (por ejemplo, un mamífero) , a quien se proporciona el tratamiento, incluyendo el tratamiento profiláctico, con una composición farmacéutica como es descrita en la presente. El término "sujeto" como se utiliza en la presente se refiere a animales humanos y no humanos. El término "animales no humanos" incluye todos los vertebrados, por ejemplo, mamíferos, tales como primates no humanos, (particularmente primates superiores), oveja, perros, roedores (por ejemplo, ratón o rata) , conejillo de indias, cabras, cerdos, gatos, conejos, vacas y no mamíferos tales como pollos, anfibios, reptiles, etc. En una modalidad, el sujeto es humano. En otra modalidad, el sujeto es un animal experimental o sustituto de animal como un modelo de enfermedad. Los mamíferos no humanos incluyen mamíferos tales como primates no humanos, (particularmente primates superiores) , oveja, perros, roedores (por ejemplo ratón o rata), conejillos de indias, cabras, cerdos, gatos, conejos y vacas. En algunos aspectos, el animal no humano es un animal de compañía tal como perro o gato .

"Tratamiento" de una enfermedad o condición en un sujeto o "tratamiento" de un paciente que tiene una enfermedad o condición se refiere a someter al individuo a un tratamiento farmacéutico, por ejemplo, la administración de un fármaco, tal que se disminuye o se estabiliza por lo menos un síntoma de la enfermedad o condición. Típicamente, cuando el péptido se administra terapéuticamente como un tratamiento, este se administra a un sujeto quien se presenta con uno o más síntomas de inflamación.

El término "prevención" se utiliza en relación a la prevención de síntomas o retardo del desarrollo de síntomas durante el tiempo del estado asintomático. Típicamente, cuando el péptido se administra preventivamente, este se administra a un sujeto quien no presenta síntomas inminentes de inflamación. Ticamente, el sujeto está en riesgo de desarrollar inflamación, tal como diabetes o COPD, debido a la historia familiar, resultados de laboratorio, prueba genética o estilo de vida. En algunos aspectos, la "prevención" se relaciona a la administración de los péptidos a víctimas quemadas o gentes que se han sometido a la exposición de radiación aguda antes de que esto desarrolle endotoxemia debido a que estos sujetos están en riesgo de desarrollar endotoxemia como un resultado del daño al tejido causado por una quemadura o radiación.

Por "enlaza específicamente" o "enlace específico" se propone un compuesto o anticuerpo que reconoce y enlaza un polipéptido deseado que sustancialmente no reconoce y enlaza otras moléculas en una muestra, por ejemplo, una muestra biológica, que naturalmente incluye un polipéptido de la invención. El enlace específico se puede caracterizar por una constante de disociación de por lo menos aproximadamente 1x10-6 M o más pequeña. En otras modalidades, la constante de disociación es por lo menos aproximadamente 1x10-7 M, 1x10-8 M o 1x10-9 M. Métodos para determinar si dos moléculas específicamente enlazan son bien conocidas en la técnica e incluyen, por ejemplo, la diálisis de equilibrio, resonancia de plasmón superficial y los similares.

Por "aislado" se propone que el polipéptido se ha separado de cualquier ambiente natural, tal como un fluido corporal, por ejemplo, sangre, y separado de los componentes que acompañan naturalmente el péptido.

Por aislado y "sustancialmente puro" se propone un polipéptido que se ha separado y purificado en por lo menos algún grado de los componentes que naturalmente lo acompañan. Típicamente, un polipéptido es sustancialmente puro cuando es por lo menos aproximadamente 60%, o por lo menos aproximadamente 70%, por lo menos aproximadamente 80%, por lo menos aproximadamente 90%, por lo menos aproximadamente 95%, o aún por lo menos aproximadamente 99% en peso, libre de las proteínas y moléculas orgánicas que ocurren naturalmente con las cuales se asocia naturalmente. Por ejemplo, un polipéptido sustancialmente puro se puede obtener mediante la extracción de una fuente natural, mediante la expresión de un ácido nucleico recombinante en una célula que normalmente no expresa esa proteína, o por síntesis química.

Por una "disminución" o "inhibición" utilizada en el contexto del nivel de, por ejemplo los niveles de TNF-alfa se refiere a la reducción de la cantidad de proteína en la muestra biológica, tal como sangre o muestra de tejido, una célula, un extracto de células o un sobrenadante de células. Por ejemplo, tal disminución puede ser debido a la estabilidad de RNA reducida, transcripción o traducción, degradación de la proteina incrementada o interferencia de RNA. De preferencia, esta disminución es por lo menos aproximadamente 5%, por lo menos aproximadamente 10%, por lo menos aproximadamente 25%, por lo menos aproximadamente 50%, por lo menos aproximadamente 75%, por lo menos-aproximadamente 80% o aún por lo menos aproximadamente 90% comparado con un valor de referencia.

El término "valor de referencia" en el contexto de las reivindicaciones y la solicitud se refieren típicamente a un nivel de TNF-alfa anormalmente alto encontrado en un individuo afectado con o que sufre de inflamación. El valor de referencia es típicamente la cantidad de TNF-alfa en el individuo antes de la administración del péptido de la invención. En algunos aspectos de todas las modalidades concernientes al control glucérnico, el término "valor de referencia" se refiere a los valores numéricos utilizados en la medición del control glucérnico en un sujeto. Hay un número de pruebas que se pueden utilizar para determinar si, por ejemplo, un sujeto humano es afectado con pre-diabetes . Tales pruebas incluyen, por ejemplo, la prueba A1C, la prueba de glucosa en el plasma en ayunas (FPG) y la prueba de tolerancia de glucosa oral (OGTT) . Ejemplos de valores de referencia utilizando estos métodos se muestran enseguida: los individuos pre-diabéticos típicamente registran en o arriba de 5.7% o abajo de 6.5% en la prueba A1C, mientras que los diabéticos registran arriba de 6.5% en esta prueba. Los individuos pre-diabético también típicamente registran en o arriba de 100 mg/dl o abajo de 126 mg/dl utilizando la prueba FPG mientras que los diabéticos registran arriba de 126 mg/dl. Los individuos pre-diabéticos típicamente registran en o arriba de 140 o abajo de 200 mg/dl utilizando la prueba OGTT mientras que los individuos diabéticos registran arriba de 200 mg/dl. De esta manera, con referencia a un valor de referencia normoglucémico, se puede utilizar los siguientes números de corte cuando la medición se realiza utilizando las pruebas mencionadas en lo anterior: prueba A1C - bajo 5.7%; prueba FPG bajo 100 mg/dl; y OGTT bajo 140 mg/dl.

Por un "incremento" en la expresión o actividad de un gen o proteína se propone un cambio positivo en el nivel de proteína o ácido nucleico o actividad en una célula, un extracto de célula, o un sobrenadante de célula. Por ejemplo, tal incremento puede ser debido a la estabilidad de RNA incrementada, transcripción o traducción, o degradación de la proteína disminuida. De preferencia, este incremento es por lo menos 5%, por lo menos aproximadamente 10%, por lo menos aproximadamente 25%, por lo menos aproximadamente 50%, por lo menos aproximadamente 75%, por lo menos aproximadamente 80%, por lo menos aproximadamente 100%, por lo menos aproximadamente 200% o aun aproximadamente 500% o más arriba del nivel de expresión o actividad bajo las condiciones de control .

El término "recombinante" como se utiliza en la presente para describir una molécula de ácido nucleico, significa un polinucleótido de origen genómico, cDNA, viral, semisintético y/o sintético, que, en virtud de su origen o manipulación, no está asociado con toda una porción del polinucleótido con el cual se asocia en la naturaleza. El término recombinante como se utiliza con respecto a una proteina o polipéptido, significa un polipéptido producido por lo expresión de un polinucleótido recombinante. El término recombinante como se utiliza con respecto a una célula hospedara significa una célula hospedera en la cual se ha introducido un polinucleótido recombinante. Recombinante también se utiliza en la presente para referirse a, con referencia al material (por ejemplo, una célula, un ácido nucleico, una proteina o un vector) que el material se ha modificado por la introducción de un material heterologo (por ejemplo, una célula, un ácido nucleico, una proteina o un vector) .

El término "vectores" se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al cual se ha enlazado; un plásmido es una especie del género abarcado por la "vector". El término "vector" típicamente se refiere a una secuencia de ácido nucleico que contiene un origen de replicación y otras entidades necesarias para la replicación y/o mantenimiento de una célula hospedera. Los vectores capaces de dirigir la expresión de genes y/o la secuencia de ácido nucleico a los cuales se enlazan operativamente son referidos en la presente como "vectores de expresión". En general, los vectores de expresión de utilidad están frecuentemente en la forma de "plásmidos" que se refieren a bucles de DNA de doble hebra circulares que, en su forma de vector no se enlazan al cromosoma, y típicamente comprenden entidades para la expresión estable o transiente o el DNA codificado. Otros vectores de expresión se pueden utilizar en los métodos como es descrito en la presente, por ejemplo, pero no limitado a, plásmidos, episomas, cromosomas artificiales bacterianos, cromosomas artificiales de levadura, bacteriófagos o vectores virales, y tales vectores pueden integrarse en el genoma del hospedero o replicarse autónomamente en la célula particular. Un vector puede ser un vector de DNA o RNA. Otras formas de vectores de expresión conocidos por aquellos expertos en la técnica que sirven para las funciones equivalentes también se pueden utilizar, por ejemplo vectores extracromosómicos auto-replicantes o vectores que se integran en un genoma del hospedero. Los vectores preferidos son aquellos capaces de la replicación autónoma y/o expresión de ácidos nucleicos a los cuales se enlazan. Los vectores capaces de dirigir la expresión de genes a los cuales se enlazan operativamente se referidos en la presente como "vectores de expresión".

El término "vectores virales" se refiere al uso de virus, o vectores asociados con virus como portadores de un constructo de ácido nucleico en una célula. Los constructos se pueden integrar y empacar en genomas virales defectuosos, no replicantes similares a Adenovirus, virus Adeno-asociado (AAV) , o virus de Herpes simple (HSV) u otros, incluyendo vectores letroviales y lentiviales, para la infección o transducción en células. El vector puede o no puede ser incorporado en el genoma de la célula. Los constructos pueden incluir secuencias virales para la transfección, si es deseado. Alternativamente, el constructo se puede incorporar en vectores capaces de la replicación episomal, por ejemplo vectores EPV y EBV.

Los artículos "un" y "uno" se utilizan en la presente para referirse a uno o a más de uno (es decir, por lo menos uno) del objeto gramatical del articulo. A manera de ejemplo, "un elemento" significa un elemento o más de un elemento. Diferente a los ejemplos de operación, o donde es indicado de otra manera, todos los números que expresan en cantidades de ingredientes o condiciones de reacción utilizados en la presente deben ser entendidos como modificados en todos los casos por el término "aproximadamente". El término "aproximadamente" cuando se utiliza en conexión con porcentajes puede significar +1%. La presente invención además se explica en detalle por los siguientes ejemplos, pero el alcance de la invención no debe ser limitado a los mismos.

Se debe entender que esta invención no está limitada a la metodología particular, protocolos y reactivos, etc., descritos en la presente y ya que tales pueden variar. La terminología utilizada en la presente es para el propósito de describir modalidades particulares únicamente, y no se propone para limitar el alcance de la presente invención, que se define solamente por las reivindicaciones. Otras características y ventajas de la invención serán evidentes a partir de la siguiente Descripción Detallada, los dibujos y las reivindicaciones.

Métodos de tratamiento de la invención Un aspecto de la presente invención se relaciona al uso de péptidos descritos en la presente y mutantes, variantes, análogos o derivados de los mismos. Específicamente, estos métodos se relacionan a la administración de cualquiera de los péptidos como es descrito en la presente o sus modificaciones farmacéuticamente aceptables en un portador farmacéuticamente aceptable a un sujeto, por ejemplo, un mamífero en necesidad del mismo, por ejemplo, un humano, es decir, un sujeto que tiene inflamación o destrucción de tejido auto-inmune o un . individuo con hiperglicemia o control glucémico deteriorado, tal como un individuo con diabetes tipo 2, y en la necesidad de proteger y/o estimular la expansión de la masa de células beta, o un individuo diagnosticado con fibrosis cistica, o un individuo en alto riesgo de desarrollar endotoxemia como un resultado de quemadura o exposición a la radiación aguda. También, los inventores proporcionan el tratamiento de lupus y la enfermedad de injerto contra hospedero, uveitis, eczema, psoriasis, IBD y diabetes tipo I de nuevo inicio.

Las descripciones clínicas de estas enfermedades son bien conocidas. En algunos aspectos el humano primero se diagnostica por tener uno o más síntomas de la enfermedad antes de la administración de uno o más de los péptidos de la invención. En algunas modalidades, el humano no se ha administrado previamente con AAT como un tratamiento para los síntomas.

Por ejemplo, los inventores han establecido en modelos de ratón preclínicos establecidos para enfermedades humanas incluyendo diabetes tipo II (db/db) , artritis reumatoide (CAIA) y endotoxemia letal que, por ejemplo, el péptido SP16 significativamente mejora los síntomas.

Los inventores también han proporcionado evidencia que, por ejemplo, el péptido SP16 se puede administrar de manera segura utilizando estudios de seguridad preclínicos bien establecidos. Por ejemplo, los inventores también han mostrado utilizando el ensayo FastPatch que, por ejemplo, el péptido SP16 no impacta la actividad de hERG y los inventores también no fueron capaces de identificar cualquiera de los aciertos en el estudio de inmunomodulación del receptor humano (GenSEP Explorer) para el péptido SP16.

Los ratones db/db llevan un receptor de leptina defectuoso que deteriora su habilidad para regular el apetito y el metabolismo. Los animales llegan a ser obesos en 3-4 semanas de edad, e inicialmente muestran resistencia a la insulina que es seguido por hiperglucemia en aproximadamente 4-8 semanas de edad. La hiperglucemia severa está en paralelo por el agotamiento de las células b que producen insulina de las isletas pancreáticas y mueren en 10 meses de edad.

El modelo de animales db/db de las diferentes fases de la Diabetes Tipo II en humanos (Figura 14). Los inventores han mostrado que los péptidos de la invención proporcionan beneficios en etapas tempranas y tardías de la enfermedad. Por ejemplo, los inventores han mostrado que SP 16 mejora el control glucémico en el modelo db/db.

La glucosa en la sangre y los niveles de HbAlc mostraron que el tratamiento con SP16 reduce la hiperglucemia y mejora el control glucémico. En este estudio, ratones db/db pre-diabéticos de cinco semanas de edad se asignaron a grupos de 10. Los grupos recibieron Solución Salina (control de Vehículo), 0.6 mg/kg de SP16 dos veces a la semana o 25 mg/kg de Rosiglitazona dos veces a la semana. Los niveles de glucosa en la sangre no en ayunas se determinaron dos veces a la semana utilizando un glucómetro. Los niveles de HbAlc se determinaron utilizando el monitor "AlcNow" . Los valores representan promedios para cada grupo. (**) indica p<0.01 y (*) indica p<0.05 comparado con el Grupo de Control de Vehículo (prueba T) . Ver, la Figura 8A. También es conocido que el valor de normalización objetivo para pacientes de diabetes humanos también es verdadero para ratones normales, estableciendo de esta manera los resultados del modelo de ratón directamente relevante a la diabetes tipo II humana.

Las Figuras 8B y 8D ejemplifican unas gráficas que resumen los niveles de C-péptido del suero (8B) y la hiperplasia de isleta (8D) en el modelo de ratón db/db de diabetes tipo II. Los niveles de C-péptido en el suero incrementados son consistentes con la función de célula ß mejorada en los grupos tratados. Los ratones db/db pre-diabéticos de cinco semanas de edad se asignaron a grupos de 10. Los grupos recibieron Solución Salina (Simulado), 0.6 mg/kg de SP16 o 25 mg/kg de Rosiglitazona dos veces a la semana. Los niveles de C-péptido en el suero acumulado se determinaron para cada grupo. (*) indica p<0.05 y (**) p<0.01 comparado con el control de Vehículo.

Los inventores también mostraron que el SP16 disminuyó los niveles de CRP en el suero cuando se comparó con un control de vehículo (Figura 8E) . Los niveles de CRP disminuidos son consistentes con la inflamación reducida en el grupo de ratones tratados con SP16. De manera similar, los niveles de TGF-beta incrementados en ratones tratados con SP16 son consistentes con el tratamiento de péptido que promueve un perfil de citoquina anti-inflamatoria (Figura 8F) . Los inventores asignaron ratones db/db diabéticos de ocho semanas de edad a 8 grupos. Los grupos recibieron Solución Salina (Simulados) o 0.6 mg/kg de SP16 bisemanalmente durante 12 semanas. Los niveles de CRP y TGF-beta en el suero acumulados se determinaron para cada grupo. (*) indica p<0.05 y (**) p<0.01 comparado con el grupo control de Vehículo.

El modelo CAIA preclínico de artritis reumatoide es un estudio corto donde la artritis se induce en ratones de Balb/c. En el Día 0, los animales se inyectan intravenosamente con un cóctel de anticuerpo de colágeno (MD BioSciences) que inicia la destrucción auto-inmune del colágeno en sus articulaciones. En el Día 3, se utiliza una inyección intra-peritoneal de LPS para exacerbar la reacción auto-inmune y la inflamación. La lectura de este modelo es el hinchamiento de la pata y la estimación histológica de la erosión de la articulación. La enfermedad típicamente inicia después de 7-10 días.

Los inventores demostraron que SP16 muestra eficacia en el modelo de ratón CAIA preclínico.

Específicamente, los inventores midieron los registros de hinchamiento acumulativos para todas las patas en el pico de la enfermedad (Día 7) para grupos de 5 animales. Los ratones de Balb/c se inyectados IV con un cóctel de anticuerpo de colágeno (MD BioSciences) en el Día 0 y se inyectaron IP con LPS en el Día 3. Los animales de Control Normales no recibieron inyecciones y sirvieron como el control de línea de base libre de enfermedad. La inyección de SP16 diaria de 12 µg/día proporcionó protección equivalente a la Dexametasona y las inyecciones 12 µg una vez cada 3 días redujeron la inflamación por casi 50% comparado con el tratamiento con el vehículo de control. Ver por ejemplo, la Figura 9.

Los inventores también mostraron que el SP16 disminuye la secreción de metaloproteinasa de matriz-1 (MMP-1) en un ensayo a base de células que se asemeja en los resultados del modelo CAIA in vivo para artritis reumatoide. Las células se incubaron con 10 µ? de los péptidos indicados, así como 0, 5, 10 o 30 ng/ml de ? ?ß, durante 48 horas. En la estimulación con ILi , las células secretan la metaloproteasa MMP1, que está involucrada en la descomposición de la matriz extracelular en la artritis. El ensayo se hizo por triplicado y los promedios con desviaciones estándares se grafican. SP16 disminuyó la secreción de MMP-1 comparado con los péptidos de control revueltos, en 20 ng/ml de ILip. (*) indica p<0.05 comparado con el control de péptido revuelto. Ver, por ejemplo, la Figura 15.

Los inventores utilizaron el modelo de endotoxemia letal como un predictor para la protección contra sepsis durante el síndrome de radiación aguda. El lipopolisacárido (LPS) es una endotoxina purificada de las bacterias gram negativas. En animales, LPS induce una fuerte respuesta inmune como es evidenciado por los niveles de citoquina en el suero pro-inflamatorios incrementados y la letalidad en altas dosis En el Síndrome de Radiación Aguda, las bacterias gram negativas que salen del sistema GI contribuyen a un síndrome de la respuesta inflamatoria sistémico y letalidad. En el modelo de animal el péptido se administró en tiempo T=-2 horas, T=0 horas o T=0.5 horas. LPS se inyectó en T=0 horas. Los inventores mostraron que SP16 incrementa la supervivencia en la endotoxemia letal para de esta manera permitir extrapolar que el péptido podría proporcionar tratamiento en víctimas quemadas humanas o en el síndrome de radiación aguda humana. Grupos de 10 animales se inyectaron como es indicado, 2 horas antes, en el tiempo de, y/o 0.5 horas después de la inducción de la endotoxemia letal. La endotoxemia se indujo por inyección de 15 mg/kg de LPS. La supervivencia se inspeccionó en puntos de tiempo 4, 8, 24, 28, 32, 48, 52, 55 y 72 horas (Figura 7) .

Por lo tanto, en un aspecto los inventores proporcionan métodos para el tratamiento de diabetes tipo II, artritis reumatoide y endotoxemia causada por quemaduras y/o radiación que comprende la administración a un sujeto humano en necesidad del mismo una composición que comprende por lo menos uno de los péptidos de la invención. En algunos aspectos, el péptido comprende SP16.

Los inventores han mostrado que los péptidos de la invención, por ejemplo, SP16 son agonistas del receptor similar a tol-2. Por consiguiente, sin desear que sea limitado por una teoría, los péptidos, tal como SP16, actúan como un fármaco anti-inflamatorio al promover un perfil de citoquina ant i-inflamatoria . También, sin dese'ar que sea limitado por una teoría, los péptidos, tales como SP16, también pueden actuar como moduladores inmunes al inducir la expansión de células reguladoras T tolerogénicas y protectoras (T-regs) . Además, sin desear que sea limitado por una teoría, los péptidos, tal como SP16, también pueden regular hacia abajo las respuestas auto-inmunes sin inducir supresión inmunológica general para de esta manera proporcionar un tratamiento superior para enfermedades auto-inmunes comparado con la mayoría de los tratamientos actualmente disponibles que generalmente suprimen el sistema inmune exponiendo a los individuos tratados a un riesgo de infecciones mientras que son tratados con los inmunosupresores generales.

Como los péptidos se derivan de AAT, y en vista de los resultados de los inventores en modelos in vivo e in vitro, es razonable esperar la mayoría de los efectos terapéuticos de AAT que apliquen también a los péptidos de la invención, tal como SP16. Específicamente, AAT se ha mostrado que modula la proliferación de células T y la activación de NF-kappa-B; deteriora la interacción de célula objetivo NK, inhibe la activación de serina proteasas de la señalización de EGFR/TLR-4 de célula epitelial; es involucrado en la expresión génica inducida por TNF-alfa y la apoptosis o células endoteliales; previene la hemolisis de los glóbulos rojos al disminuir en E. coli, la circulación del conteo de células eosinófilas; inhibe la quimiotaxis de neutrófilo, señalización de NADHP oxidasa y ANCA; inhibe la liberación de monocitos y citoquina de macrófago y la regulación de expresión CD14, e inhibe la liberación de histamina de mastocitos; y modula la proliferación de célula B y la producción de citoquinas.

Por lo tanto, en algunas modalidades, los inventores proporcionan métodos para modular la proliferación de célula T y la activación de NF-kappa-B; deteriorando la interacción de célula objetivo NK; inhibiendo la activación de serina proteasas de la señalización de EGFR/TLR-4 de célula epitelial; modulando la expresión génica inducida por TNF-alfa y la apoptosis o células endoteliales; previniendo la hemolisis de glóbulos rojos por E. coli, disminuyendo el conteo de células de eosinófilo circulantes; inhibiendo la quimiotaxis de neutrófilo, la señalización de NADHP oxidasa y ANCA; inhibiendo la liberación de monocito y citoquina de macrófago y la regulación de la expresión CD14, e inhibiendo la liberación de histamina de mastocitos; y modulando la proliferación de célula B y la producción de citoquina que comprende la etapa de administrar a un sujeto humano una composición que comprende por lo menos uno de los péptidos de la invención. En algunos aspectos, el péptido es SP16, que puede comprender una o más modificaciones típicamente realizadas para aumentar la biodisponibilidad del péptido y/o la vida en anaquel, tal como pegilación y los similares.

Realizar un ensayo de optimización de péptido utilizando una exploración de alanina con el ensayo de TLR-2. Los datos se obtuvieron utilizando un experimento con una línea de células indicadora de TLR-2 diseñado (HEK-BLUE™ mTLR2, Invivogen) . Las células se incubaron con el 20 µg/ml de los péptidos indicados durante 24 horas. En la activación de TLR2, las células secretan fosfatasa alcalina que puede ser ensayada. El ensayo se hizo por triplicado y se grafican los promedios. Los péptido SP34 es un control de péptido revuelto (Amarillo) y PAM (Pam3CSK4; Rojo) es un control positivo. Ver, por ejemplo, la Figura 12.

La siguiente tabla proporciona los resultados de un ensayo para el perfil farmacocinético de SP16.

En la realización del ensayo, tres ratas normales se inyectaron intravenosamente con 5 mg/kg de SP16 y la concentración de plasma de SP16 establecida en 8 puntos de tiempo después de la inyección. Para cada punto de tiempo, los niveles de SP16 se determinaron mediante LC/MS/MS y los valores se utilizaron para calcular la Cmax (2.5 µg/ml) y Tl/2 (1.9 horas). El ensayo se ejecutó mediante Apredica, Boston, MA. Por consiguiente, los inventores determinaron que SP16 tiene una vida media de 1.9 horas en ratas nórmales.

El perfil de seguridad SP16 también incluyó los datos hERG. El ensayo FastPatch de hERG mostró que SP16 no inhibe hERG en dosis de hasta 25 µ?. Estos datos predicen que SP16 no tendrá problemas de seguridad cardiaca en humanos. El estudio se ejecutó mediante Apredica, Boston, MA.

Conc de prueba Valor IC50 Cliente ID (µ?) (µ?) Comentario SP16 0.0008-25 ninguna inhibición dependiente de la concentración observada Quinidina 0.01-10 l.¡ control positivo Además, los inventores también realizaron un perfil utilizando la inmunomodulación de receptor humano. El panel GenSEP Explorer contiene 111 objetivos de ensayo in vitro cuidadosamente seleccionados para estimar las actividades biológicas del fármaco/quimicas . Las categorías de ensayo incluyen GPCRs, Canales de Ion Confinado por Voltaje, Canales de Ion Confinado por Ligando, transportadores Neurotransmisores, Receptores Nucleares y Esteroides así como un conjunto diverso de objetivos bioquímicos que incluyen Fosfodiesterasas , Quinasas y otras enzimas relevantes. El estudio se ejecutó mediante Caliper LifeSciences y los resultados se resumen en la tabla siguiente. Se presenta que SP16 no tiene efecto en 111 receptores humanos, indicando que SP16 tiene un excelente perfil de seguridad humano.

En vista del perfil de seguridad de SP16, los inventores pueden extrapolar razonablemente que los otros fragmentos de péptido proporcionados en la presente también serian seguros para la administración a un humano.

En una modalidad, los métodos del tratamiento descritos en la presente, además comprenden la selección o diagnosis de un sujeto que tiene cualquiera de las condiciones descritas en lo anterior, por ejemplo, uno que surge de la inflamación antes de la administración de un péptido como es descrito en la presente o un mutante, variante, análogo o derivado del mismo, para de esta manera tratar la condición o disfunción, tal como inflamación. Tal selección se realiza por el profesional experto mediante un número de métodos disponibles, por ejemplo, la estimación de síntomas que se describen en la presente. Por ejemplo, se puede estimar la cantidad de TNF-alfa en el sujeto para determinar la cantidad de inflamación presente en el sujeto. En el caso de diabetes, se puede medir el control glucémico utilizando niveles de glucosa en la sangre bien definidos. En algunos aspectos de todas las modalidades de la invención, los péptidos se pueden administrar a individuos con etapa pre-diabética para prevenir el desarrollo de diabetes tipo 2. Hay un número de pruebas que se pueden utilizar para determinar si, por ejemplo, un sujeto humano es afectado con pre-diabetes . Tales pruebas incluyen, por ejemplo, la prueba AlC, la prueba de glucosa en el plasma en ayunas (FPG) y la prueba de tolerancia de glucosa oral (OGTT) . Los individuos pre-diabéticos típicamente registran en o arriba de 5.7% o abajo de 6.5% en la prueba A1C, mientras que los diabéticos registran arriba de 6.5% en esta prueba. Los individuos pre-diabéticos también típicamente registran en o arriba de 100 mg/dl o abajo de 126 mg/dl utilizando la prueba OGTT mientras que los diabéticos registran arriba de 126 mg/dl. Los individuos pre-diabéticos típicamente registran en o arriba de 140 a abajo de 200 mg/dl utilizando la prueba OGTT mientras que los individuos diabéticos registran arriba de 200 mg/dl. De esta manera, un método para prevenir la diabetes de acuerdo con la presente invención puede comprender la administración del péptido a un individuo quien primero se ha diagnosticado como pre-diabético, por ejemplo, utilizando cualquiera de los métodos descritos en lo anterior. En algunos aspectos, el método comprende la identificación de diabetes tipo 2 en el sujeto y luego la administración del péptido sintético de la invención al sujeto.

En algunos aspectos de todas las modalidades, se puede usar proteína C-reactiva como un marcador para la inflamación o eficacia del tratamiento. La proteína C-reactiva (CRP) se utiliza para detectar la inflamación si hay una alta sospecha de lesión del tejido o infección en alguna parte del cuerpo. CRP sirve como un marcador general para la infección e inflamación y se puede utilizar para evaluar a un individuo para una condición inflamatoria aguda o crónica. Una alta o incrementada cantidad de CRP en la sangre sugiere la presencia de inflamación. En individuos que se sospechan de tener una infección bacteriana seria, un alto CRP sugiere la presencia de uno. En gentes con condiciones inflamatorias crónicas, altos niveles de CRP sugieren una extensión o que el tratamiento no ha sido efectivo. La concentración normal en el suero humano saludable es usualmente menor que 10 mg/L, ligeramente incrementarse con el enve ecimiento. Los niveles más altos se encuentran en mujeres embarazadas tardías, inflamación leve e infecciones virales (10-40 mg/L), inflamación activa, infección bacteriana (40-200 mg/L), varias infecciones bacterianas y quemaduras (>200 mg/L) . En algunos aspectos el término "valor de referencia" se refiere a las mediciones de CRP cuando el CRP se utiliza como una prueba de diagnóstico para la inflamación .

En algunos aspectos, el sujeto puede llevar una mutación génica diagnosticada, tal cuando el sujeto se diagnostica por tener fibrosis cística (CF) . CF es una enfermedad recesiva, autosomal causada por mutaciones en el gen para el regulador de conductancia de transmembrana de fibrosis cistica de proteína (CFTR) . En algunos aspectos, la invención proporciona un método para primero identificar un CF que causa mutación en el sujeto y luego administrar el péptido sintético de la invención en el sujeto. Actualmente 1913 mutaciones se han reportado a la base de datos de CF públicamente disponible mantenida por el Centro de Fibrosis Cistica en el Hospital para Niños Enfermos en Toronto, Canadá. Frecuentemente, la prueba se utiliza para analizar las mutaciones mucho más comunes tal como AF508. La historia parental y de origen étnico puede proporcionar discernimientos a las clases de mutaciones que se puede clasificar para un niño afectado. La diagnosis de CF también puede incluir la detección de la piel de sabor salado, pobre crecimiento y pobre ganancia de peso a pesar de una ingesta de alimento normal, acumulación de moco adherente, grueso, infecciones del pecho frecuentes y tos o brevedad de respiración. Los seres masculinos pueden ser infértiles debido a la ausencia congénita del vas deferens. Los síntomas frecuentemente aparecen en la infancia y en la niñez, tal como la obstrucción intestinal debido al ileus meconium en bebés recién nacidos. A medida que los niños se desarrollan, ellos deben ejercitarse para liberar el moco en los alvéolos. Las células epiteliales ciliadas en el paciente tienen una proteína mutada que conduce a la producción de moco anormalmente viscoso.

En algunos aspectos, el sujeto es diagnosticado con quemaduras y de esta manera en alto riesgo de desarrollar endotoxemia relacionada con quemadura, y subsecuentemente, los péptidos de la invención se pueden administrar al sujeto para prevenir el desarrollo de endotoxemia . En algunos aspectos, la víctima quemada no tiene y no se ha tratado para condiciones inflamatorias, diabetes, COPD o CF. En algunos aspectos, el sujeto se ha expuesto a la radiación y tiene lesión por radiación aguda, y subsecuentemente, los péptidos de la presente invención se pueden administrar al sujeto para prevenir el desarrollo de endotoxemia. En algunos aspectos, los sujetos tienen signos o síntomas de endotoxemia y los péptidos de la invención se pueden administrar a tal sujeto también. Después de exposición a la radiación deslizante, si la dosis es suficientemente alta, las bacterias gram negativas salen del sistema gastrointestinal y pueden causar endotoxemia (Sepsis). Los inventores han mostrado que los péptidos mejoran la supervivencia durante la endotoxemia letal inducida en un modelo de ratón. De esta manera, en base a estos resultados los inventores pueden concluir que los péptidos también se pueden utilizar en humanos y están en riesgo de una condición similar, específicamente endotoxemia o sepsis como un resultado de quemaduras o la exposición aguda a la radiación.

El tratamiento exitoso o efectivo es evidenciado por el mejoramiento de uno o más síntomas de la condición o disfunción como es discutido en la presente. La administración de un péptido como es descrito en la presente o un rautante, variante, análogo o derivado del mismo en un sujeto en necesidad del mismo se espera que prevenga o retarde el desarrollo de las condiciones y disfunciones físicas descritas en la presente (por ejemplo, aquellas que surgen de la inflamación o destrucción de tejido auto-inmune o a una condición mejorada por la estimulación de la expansión de la masa de célula beta en un individuo con diabetes) . El término "prevención" se utiliza para referirse a una situación en donde un sujeto todavía no tiene la condición específica que es prevenida, lo que significa que no ha manifestado en cualquier forma apreciable. La prevención abarca la prevención o retardo del inicio y/o severidad de un síntoma, (incluyendo donde el objeto ya tiene uno o más síntomas de otra condición) . La prevención se realiza generalmente en un sujeto quien está en riesgo para el desarrollo de una condición o disfunción física. Tales sujetos se dice que están en necesidad de prevención. Por ejemplo, la reducción de los niveles de TNF-alfa comparado con los niveles antes de la administración de los péptidos de la invención, será evidencia del tratamiento exitoso. El mejoramiento en el control glucémico es otra manera de mostrar que el tratamiento ha tenido un efecto. También, si la prueba A1C, la prueba de glucosa en el plasma en ayunas (FPG) y la prueba de tolerancia de glucosa oral (OGTT) muestran que la prueba pre-diabética resulta permanente en niveles de prueba pre-diabéticos, se puede concluir que la prevención de la diabetes en el sujeto pre-diabético ha sido exitosa. También, si una victima quemada o sujeto expuesto a lesión por radiación aguda no desarrolla endotoxemia o los signos y síntomas de endotoxemia son leves la administración del péptido se puede considerar como que tiene un efecto en la prevención.

En una modalidad, los métodos de prevención descritos en la presente, además comprenden la selección de tal sujeto en riesgo para una condición, por ejemplo, aquellos que surgen de la inflamación o destrucción de tejido auto-inmune o una condición mejorada por la estimulación de la expansión de la masa de célula beta en un individuo con diabetes, o un sujeto que tiene quemaduras severas o ha sufrido lesión por radiación aguda y de esta manera susceptible para la endotoxemia, o un sujeto que es fumador y de esta manera susceptible para COPD, o una disfunción física como es descrita en la presente, antes de la administración de un péptido o un mutante, variante, análogo o derivado del mismo, en el sujeto, para de esta manera prevenir la condición o disfunción. Tal selección se realiza por el profesional experto mediante un número de métodos disponibles. Por ejemplo, la estimación de factores de riesgo o diagnóstico o el tratamiento o la terapia conocida que causa la condición o disfunción. Los sujetos que tienen una enfermedad o lesión o una historia familiar relevante que es conocida que contribuye a la condición generalmente se consideran que están en riesgo incrementado.

Como se utiliza en la presente, los términos "tratar" o "tratamiento" o "tratando" se refiere a mediciones del tratamiento terapéuticas, en donde el objetivo es prevenir o retardar el desarrollo de la enfermedad, tal como al reducir por lo menos un efecto o síntoma de una condición, enfermedad o trastorno asociado con la inflamación. El tratamiento es generalmente "efectivo" si uno o más síntomas se mejoran o los marcadores clínicos, tales como los niveles de TNF-alfa, CRP, glucosa en la sangre y/o HbAlc, están dentro de los valores normales o más cercanos de los valores de referencia normales que los valores anormales que reflejan inflamación o pobre control glucémico, dependiendo de la condición, como ese término se define en la presente. Alternativamente, el tratamiento es "efectivo" si la progresión de una enfermedad se retarda, la exhibición de un síntoma o un marcador para una enfermedad se reduce. Es decir, "tratamiento" incluye el mejoramiento de síntomas o marcadores, el retardo del progreso o el retardo del empeoramiento de por lo menos un síntoma que sería esperado en ausencia de tratamiento. Los resultados benéficos o clínicos deseados incluyen, pero no están limitados a, alivio de uno o más síntomas, disminución del grado de enfermedad, estado estabilizado (es decir, no empeoramiento) de la enfermedad, retardo de la progresión de la enfermedad, mejoramiento o paliativo del estado de enfermedad. "Tratamiento" también puede significar la prolongación de la supervivencia como es comparado con la supervivencia esperada si no se recibe tratamiento. Aquellos en necesidad de tratamiento incluyen pacientes con uno o más síntomas de inflamación, tales como síntomas asociados con artritis reumatoide, COPD o diabetes, incluyendo diabetes Tipo 1 y Tipo 2. En algunos aspectos de todas las modalidades de la invención, el sujeto en necesidad de tratamiento tiene fibrosis cística o se ha sometido a quemaduras o radiación aguda y de esta manera está en alto riesgo de desarrollar endotoxemia .

Los niveles de TNF-alfa se pueden estimar, por ejemplo, utilizando cualquier número de equipos de ELISA comercial fácilmente disponibles. La prueba A1C, FPG y OGTT comúnmente se utilizan para el control glucémico en la diagnosis y el manejo de diabetes y pre-diabetes.

En algunos aspectos, la invención se relaciona a métodos para prevenir la inflamación al administrar los péptidos como es descrito a un individuo que todavía no presenta los síntomas de inflamación. Por ejemplo, los péptidos se pueden administrar a un individuo en alto riesgo de desarrollar diabetes o diagnosticados con pre-diabetes, una condición definida por los niveles incrementados de azúcar en la sangre, pero los niveles que todavía no se consideran diabéticos, pero que todavía no tienen diabetes para ayudar a retardar el desarrollo o prevenir el desarrollo de diabetes de la etapa pre-diabética .

Antes de que las personas desarrollen diabetes tipo 2, ellas casi siempre tienen "pre-diabetes" - niveles de glucosa en la sangre que son más altos que los normales pero todavía no bastante altos para ser diagnosticados como diabetes. La investigación reciente ha mostrado que algún daño a largo plazo al cuerpo, especialmente el corazón y el sistema circulatorio, puede ya estar ocurriendo durante la prediabetes. Hay un número de pruebas que se pueden utilizar para determinar si, por ejemplo, un sujeto humano que es afectado con prediabetes. Tales pruebas incluyen, por ejemplo, la prueba A1C, prueba de glucosa en el plasma en ayunas (FPG) y la prueba de tolerancia de glucosa oral (OGTT) . Los individuos pre-diabéticos típicamente registran en o arriba de 5.7% o abajo de 6.5% en la prueba A1C, mientras que los diabéticos registran arriba de 6.5% en esta prueba. Los individuos pre-diabéticos también típicamente registran en o arriba de 100 mg/dl o abajo de 126 mg/dl utilizando la prueba FPG mientras que los diabéticos registran arriba de 126 mg/dl. Los individuos pre-diabéticos típicamente registran en o arriba de 140 o abajo de 200 mg/dl utilizando la prueba OGTT mientras que los individuos diabéticos registran arriba de 200 mg/dl . De esta manera, un método para prevenir una diabetes de acuerdo con la presente invención puede comprender la administración del péptido a un individuo que se ha diagnosticado como pre-diabético, por ejemplo, utilizando cualquiera de los métodos descritos en lo anterior .

El término "cantidad efectiva" como se utiliza en la presente se refiere a la cantidad de una composición farmacéutica que comprende uno o más péptidos como se describe en la presente o un mutante, variante, análogo o derivado del mismo, para disminuir por lo menos uno o más síntomas de la enfermedad o trastorno, y se relaciona a una cantidad suficiente de composición farmacológica para proporcionar el efecto deseado. La frase "cantidad terapéuticamente efectiva" como se utiliza en la presente significa una cantidad suficiente de la composición para tratar un trastorno, en una relación del beneficio/riesgo razonable aplicable a cualquier tratamiento médico. El término "cantidad terapéuticamente efectiva" por lo. tanto se refiere a una cantidad de la composición como se describe en la presente que es suficiente para efectuar una reducción terapéuticamente o profilácticamente en un síntoma o marcador clínico asociado con niveles incrementados de inflamación o hiperglucemia cuando se administra a un sujeto típico quien tiene anemia, anemia de inflamación o diabetes tipo I.

Típicamente la reducción de más de 20% de un marcador de enfermedad, tal como un marcador inflamatorio, por ejemplo, TNF-alfa, es indicativa del tratamiento efectivo. En algunos casos, la reducción de más de 50% o más de 75% de la cantidad de niveles de TNF-alfa en el individuo antes de la administración de los péptidos de la invención es indicativa de tratamiento efectivo.

Una reducción terapéuticamente o profilácticamente significativa en un síntoma es, por ejemplo por lo menos aproximadamente 10%, por lo menos aproximadamente 20%, por lo menos aproximadamente 30%, por lo menos aproximadamente 40%, por lo menos aproximadamente 50%, por lo menos aproximadamente 60%, por lo menos aproximadamente 70%, por lo menos aproximadamente 80%, por lo menos aproximadamente 90%, por lo menos aproximadamente 100%, por lo menos aproximadamente 125%, por lo menos aproximadamente 150% o más en un parámetro medido como es comparado con un control o sujeto no tratado o el estado del sujeto antes de la administración del péptido. Los parámetros medidos o medibles incluyen marcadores de enfermedad clínicamente detectables, por ejemplo, niveles elevados o deprimidos de un marcador biológico, tal como TNF-alfa, así como parámetros relacionados con una escala clínicamente aceptada de síntomas o marcadores para la inflamación. Será entendido, sin embargo, que la utilización diaria total de las composiciones y formulaciones como se describe en la presente será decidida por el médico asistente dentro del alcance del buen juicio médico. La cantidad exacta requerida variará dependiendo de factores tal como el tipo de enfermedad que es tratado, género, edad y peso del sujeto.

Con referencia al tratamiento de un sujeto con inflamación, la destrucción de tejido auto-inmune o diabetes tipo I, el término "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a la cantidad que es segura y suficiente para retardar el desarrollo de uno o más síntomas y dar por resultado la disminución en la cantidad de un marcador inflamatorio, por ejemplo, concentraciones de TNF-a o CRP, o el mejoramiento de los niveles de glucosa en la sangre en pacientes comparados con la cantidad del marcador inflamatorio o los niveles de glucosa en la sangre antes de la administración del péptido. La cantidad de esta manera puede mejorar o causar una disminución en por lo menos un síntoma de inflamación, destrucción de tejido auto-inmune o diabetes tipo I o retardar el curso de progresión de enfermedad, tal como la estabilización de niveles de glucosa en la sangre. La cantidad efectiva para el tratamiento de una enfermedad depende del tipo de diabetes, la especie que es tratada, la edad y condición general del sujeto, el modo de administración y asi sucesivamente. De esta manera, no es posible especificar la "cantidad efectiva" exacta. Sin embargo, para cualquier caso dado, una "cantidad efectiva" apropiada se puede determinar por uno de habilidad ordinaria en la técnica utilizando únicamente la experimentación de rutina. La eficacia del tratamiento se puede estimar por un profesional ordinariamente experto, por ejemplo, la eficacia se puede estimar en modelos de animales conocidos de inflamación (por ejemplo en modelo LPS) , destrucción de tejido auto-inmune (por ejemplo en modelo CAIA) o diabetes (por ejemplo en modelo de ratón db/db) . Cuando se utiliza un modelo de animal experimental, la eficacia del tratamiento es evidenciada cuando una reducción en un síntoma de inflamación, destrucción de tejido auto-inmune o hiperglucemia se muestra contra los animales no tratados.

Como se utiliza en la presente, los términos "administración" e "introducción" se utilizan intercambiablemente en la presente y se refieren a la colocación de los agentes terapéuticos tal como uno o más péptidos como es descrito en la presente o un mutante, variante, análogo o derivado del mismo en un sujeto mediante un método o ruta que da por resultado el suministro de tal agente (s) en un sitio deseado. Los compuestos se pueden administrar mediante cualquier ruta apropiada que da por resultado un tratamiento efectivo en el sujeto.

El uno o más péptidos como es descrito en la presente o un mutante, variante, análogo o derivado de los mismos se puede administrar mediante cualquier ruta conocida en la técnica o descritas en la presentes, por ejemplo, oral, parenteral (por ejemplo, intravenosamente o intramuscularmente) , intraperitoneal, rectal, cutánea, nasal, vaginal, inhalante, piel (parche) u ocular. El uno o más péptidos como es descrito en la presente o un mutante, variante, análogo o derivado del mismo se puede administrar en cualquier dosis o régimen de dosificación. También se puede utilizar bombas, similares a las utilizadas para la administración de insulina.

Dosificación Con respecto a los métodos terapéuticos de la invención, no se propone que la administración del uno o más péptidos como es descrito en la presente o un mutante, variante, análogo o derivado de los mismos sea limitado a un modo particular de administración, dosificación o frecuencia de dosificación; la presente invención contempla todos los modos de administración, incluyendo intramuscular, intravenosa, intraperitoneal, intravesicular, intraarticular, intralesional, subcutánea, o cualquier otra ruta suficiente para proporcionar una dosis adecuada para tratar el trastorno relacionado con la inflamación. La sustancia terapéutica se puede administrar a un paciente en una sola dosis o en múltiples dosis. Cuando se administran múltiples dosis, las dosis pueden ser separadas entre si mediante, por ejemplo, como una hora, tres horas, seis horas, ocho horas, un día, dos días, una semana, dos semanas o un mes. Por ejemplo, la sustancia terapéutica se puede administrar para, por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 15, 20 o más semanas. Se va entender que, para cualquier sujeto particular, los regímenes de dosificación específicos deben de ser ajustados a través del tiempo de acuerdo con la necesidad individual y el buen juicio profesional de la persona que administra o supervisa la administración de las composiciones. Por ejemplo, la dosificación de la sustancia terapéutica se puede incrementar si la dosis menor no proporciona actividad terapéutica suficiente .

Mientras que el médico asistente finalmente decidirá la cantidad apropiada en el régimen de dosificación, las cantidades terapéuticamente efectivas del uno o más péptidos como es descrito en la presente o un mutante, variante, análogo o derivado del mismo se puede proporcionar en una dosis de 0.0001, 0.01, 0.01, 0.1, 1, 5, 10, 25, 50, 100, 500 o 1.000 mg/kg o µg/k;g. Las dosis efectivas se pueden extrapolar de curvas de dosis-respuestas derivadas de los bioensayos o sistemas de prueba de modelo in vitro o animal.

Las dosificaciones para un paciente o sujeto partícula se pueden determinar por uno de habilidad ordinaria en la técnica utilizando consideraciones convencionales (por ejemplo, por medio de un protocolo apropiado, convencional farmacológicos). Un médico, por ejemplo, puede prescribir una dosis relativamente baja primero, subsecuentemente incrementando la dosis hasta que se obtiene una respuesta apropiada. La dosis administrada a un paciente es suficiente para efectuar una respuesta terapéutica benéfica en el paciente a través del tiempo o, por ejemplo, para reducir los síntomas, u otra actividad apropiada, dependiendo de la aplicación. La dosis se determina por la eficacia de la formulación particular, y la actividad, estabilidad o vida media en el suero del uno o más péptidos como es descrito en la presente o un mutante, variante, análogo o derivado del mismo y la condición del paciente, así como el peso corporal o el área de superficie del paciente que es tratado. El tamaño de la dosis también se determina por la existencia, naturaleza y grado de cualquiera de los efectos secundarios adversos que acompañan la administración de un vector particular, formulación o los similares en un sujeto particular. Las composiciones terapéuticas que comprende uno o más péptidos como es descrito en la presente o un mutante, variante, análogo o derivado del mismo opcionalmente se prueban en una o más modelos de enfermedad in vitro y/o in vivo apropiados, tales como modelos de inflamación o diabetes, para confirmar la eficacia, metabolismo del tejido, y para estimar dosificaciones, de acuerdo con métodos bien conocidos en la técnica. En particular, las dosificaciones inicialmente pueden determinar mediante actividad, estabilidad u otras mediciones adecuadas de tratamiento contra no tratamiento (por ejemplo, comparación de células o modelos de animal tratados contra no tratados) , en un ensayo relevante. Las formulaciones se administran en una velocidad determinada por el LD50 de la formulación relevante, y/o la observación de cualquiera de los efectos secundarios de uno o más péptidos como es descrito en la presente o un mutante, variante, análogo o derivado del mismo. La administración se puede realizar por medio de una sola o dosis divididas.

En la determinación de la cantidad efectiva de uno o más péptidos como es descrito en la presente o un mutante, variante, análogo o derivado del mismo que es administrado en el tratamiento o profilaxis de la enfermedad el médico evalúa los niveles en el plasma circulante, toxicidad de formulación y progresión de la enfermedad.

La eficacia y toxicidad del compuesto se pueden determinar mediante procedimientos farmacéuticos estándares en cultivos de células o modelos experimentales, por ejemplo, ED50 (la dosis es efectiva en 50% de la población) y LD50 (la dosis es letal a 50% de la población) . La relación de dosis a los efectos tóxicos al terapéutico es el índice terapéutico, y se puede expresar como la relación LD50/ED50. Las composiciones farmacéuticas que exhiben índices terapéuticos grandes son preferidas.

Estos compuestos se pueden administrar a humanos y otros animales para terapia mediante cualquier ruta adecuada de administración que trabaja para péptidos pequeños, incluyendo oralmente, nasalmente, como mediante, por ejemplo, un rocío, rectalmente, intravaginalmente, parenteralmente, intracisternalmente y tópicamente, como mediante polvos, ungüentos o gotas, incluyendo bucalmente y sublingualmente .

Los niveles de dosificación reales de los ingredientes activos en las composiciones farmacéuticas de esta invención se pueden variar para obtener una cantidad del ingrediente activo que es efectiva para lograr la respuesta terapéutica deseada para un sujeto particular, composición y modo de administración, sin ser tóxico al sujeto.

El nivel de dosificación seleccionado dependerá de una variedad de factores que incluyen la actividad del compuesto particular de la presente invención empleado, o el éster, sal o amida del mismo, la ruta de administración, el tiempo de administración, la velocidad de excreción del compuesto particular que es empleado, la duración del tratamiento, otros fármacos, compuestos y/o materiales utilizados en combinación con el compuesto particular empleado, la edad, sexo, peso, condición, salud general e historia médica previa del paciente que es tratado, y factores similares bien conocidos en las técnicas médicas. Formulación de composiciones farmacéuticas - "portadores farmacéuticamente aceptables" La administración de uno o más péptidos como es descrito en la presente o un mutante, variante, análogo o derivado de los mismos puede ser mediante cualquier medio adecuado que da por resultado una concentración de la proteina que trata el trastorno. El compuesto puede ser contenido en cualquier cantidad apropiada en cualquier sustancia portadora adecuada, y está generalmente presente en una cantidad de 1-95% en peso del peso total de la composición. La composición se puede proporcionar en una forma de dosificación que es adecuada para la ruta oral, parenteral (por ejemplo, intravenosamente o intramuscularmente) , intraperitoneal, rectal, cutánea, nasal, vaginal, inhalante, piel (parche) o administración ocular. De esta manera, la composición puede estar en la forma de, por ejemplo, tabletas, cápsulas, pildoras, polvos, granulados, suspensiones, emulsiones, soluciones, geles que incluyen hidrogeles, pastas, ungüentos, cremas, emplastos, apositos, dispositivos de suministro osmóticos, supositorios, enemas, inyectables, implantes, roclos o aerosoles. Las composiciones farmacéuticas se pueden formular de acuerdo con la práctica farmacéutica convencional (ver, por ejemplo, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th edition, 2000, ed A.R. Gennaro, Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, and Encyclopedia of Pharmaceutical Technology, eds . J. Swarbrick and J.C. Boylan, 1988-1999, arcel Dekker, Nueva York, incorpora en la presente por referencia en su totalidad) .

Las composiciones farmacéuticas de acuerdo con la invención se pueden formular para liberar el compuesto activo inmediatamente en la administración o en cualquier tiempo predeterminado o periodo de tiempo después de la administración. Estos últimos tipos de composiciones son generalmente conocidas como formulaciones de liberación controlada, que incluyen (i) formulaciones que crean concentraciones sustancialmente constantes del agente (s) de la invención dentro del cuerpo durante un periodo prolongado de tiempo; (ii) formulaciones que después de un tiempo transcurrido predeterminado crean concentraciones sustancialmente constantes del agente (s) de la invención dentro del cuerpo durante un periodo prolongado de tiempo; (iii) formulaciones que sostienen la acción del agente (s) durante un periodo de tiempo predeterminado al mantener un nivel efectivo, relativamente constante del agente (s) en el cuerpo con minimización concomitante de efectos secundarios indeseables asociados con fluctuaciones en el nivel del plasma del agente (s) (patrón cinético similar a diente de sierra) ; (iv) formulaciones que localizan la acción del agente (s), por ejemplo, colocación espacial de una composición de liberación controlada adyacente a o en el tejido u órgano enfermo; (v) formulaciones que logran la conveniencia de dosificación, por ejemplo, la administración de la composición una vez por semana o una vez cada dos semanas; y (vi) formulaciones que dirigen la acción del agente (s) al utilizar portadores o derivados químicos para suministrar la sustancia terapéutica a un tipo de célula objetivo particular. La administración de la proteína en la forma de una formulación de liberación controlada es especialmente preferida para compuestos que tienen una ventana de absorción reducida en el tracto gastrointestinal o una vida media biológica relativamente corta.

Cualquiera de un número de estrategias se pueden ejercer con el fin de obtener la liberación controlada en la cual la velocidad de liberación sobrepasa la velocidad del metabolismo del compuesto en cuestión. En un ejemplo, la liberación controlada se obtiene mediante la selección apropiada de varios parámetros de formulación e ingredientes, incluyendo, por ejemplo, varios tipos de composiciones y recubrimientos de liberación controlada. De esta manera, la proteína se formula con excipientes apropiados en una composición farmacéutica que, en la administración, libera la proteína de una manera controlada. Ejemplos que incluyen composiciones de tableta o de cápsula y una sola o múltiple unidad, soluciones de aceite, suspensiones, emulsiones, microcápsulas , complejos moleculares, microesferas , nanopartículas , parches y liposomas.

Como se utiliza en la presente, las frases "administración parenteral" y "parenteralmente administrado" como se utiliza en la presente significa modo de administración deferentes de la administración enteral y tópica, usualmente mediante inyección, e incluye, sin limitación, la administración intravenosa, intramuscular, intraarterial, intratecal, intraventricular, intracapsular, intraorbital, intracardiaca, intradérmica, intraperitoneal, transtraqueal, subcutánea, subcuticular, intraarticular, subcapsular, subaracnoidea, intraespinal, intracerebroespinal e inyección e infusión intraexterna . Las frases "administración sistémica", "sistémicamente administrado", "administración periférica" y "periféricamente administrado" como se utiliza en la presente significa la administración de composiciones terapéuticas diferentemente de manera directa en un tumor tal que entra al sistema del animal y, de esta manera, se somete al metabolismo y otros procesos similares.

La frase "farmacéuticamente aceptable" se emplea en la presente para referirse a aquellos compuestos, materiales, composiciones y/o formas de dosificación que son, dentro del alcance del buen juicio médico, adecuadas para el uso en contacto con los tejidos de seres humanos y animales sin toxicidad excesiva, irritación, respuesta alérgica, u otro problema o complicación, relacionado con una relación de beneficio/riesgo razonable. La frase "portador farmacéuticamente aceptable" como se utiliza en la presente significa un material, composición o vehículo farmacéuticamente aceptable, tal como un rellenador líquido o sólido, diluyente, excipiente, solvente o material encapsulante, involucrado en el mantenimiento de la actividad de o llevar o transportar los presentes agentes de un órgano, o porción del cuerpo, a otro órgano, o porción del cuerpo. Además de ser "farmacéuticamente aceptable" como este término se define en la presente, cada portador también debe ser "aceptable" en el sentido de ser compatible con los otros ingredientes de la formulación. La formulación farmacéutica que comprende el uno o más péptidos como es descrito en la presente o un imitante, variante, análogo o derivado de los mismos en combinación con uno o más ingredientes farmacéuticamente aceptables. El portador puede estar en la forma de un sólido, semi-sólido o diluyente líquido, crema o una cápsula. Estas preparaciones farmacéuticas son un objetivo adicional de la invención. Usualmente general, la cantidad de compuestos activos está entre 0.1-95% en peso de la preparación, de preferencia entre 0.2-20% en peso en preparaciones para uso parenteral y de preferencia entre 1 y 50% en peso en preparaciones para administración oral. Para el uso clínico de los métodos de la presente invención, la composición de suministro dirigida de la invención se formula en composiciones farmacéuticas o formulaciones farmacéuticas para administración parenteral, por ejemplo, administración intravenosa; mucosal, por ejemplo, intranasal; enteral, por ejemplo, oral; tópica, por ejemplo, transdérmica; ocular, por ejemplo, por la via de la escarificación corneal u otro modo de administración. La composición farmacéutica contiene un compuesto de la invención en combinación con uno o más ingredientes farmacéuticamente aceptables. El portador puede estar en la forma de un sólido, semi-sólido o diluyente liquido, crema o una cápsula.

El término "portadores farmacéuticamente aceptables" se propone para incluir todos los solventes, diluyentes, u otro vehículo líquido, dispersión o auxiliares de suspensión, agentes activos en la superficie, agentes isotónicos, agentes espesantes o emulsificantes, conservadores, aglutinantes sólidos, lubricantes y los similares, como es adecuado para la forma de dosificación particular deseada. Típicamente, tales compuestos se llevan o se transportan de un órgano, o porción del cuerpo, a otro órgano, o porción del cuerpo. Cada portador debe ser "aceptable" en el sentido de ser compatible con los otros ingredientes de la formulación y no perjudiciales al paciente. Algunos ejemplos de materiales que pueden servir como portadores farmacéuticamente aceptables incluyen: azúcares, tales como lactosa, glucosa y sacarosa; almidones, tales como almidón de maíz y almidón de papa; celulosa, y sus derivados funcionales, tal como carboximetil celulosa de sodio, etil celulosa y acetato de celulosa; tragacanto en polvo; malta; gelatina; talco; excipientes, tal como manteca de cacao y ceras para supositorios; aceites, tal como aceite de cacahuete, aceite de semilla de algodón, aceite de cártamo, aceite de ajonjolí, aceite de olivo, aceite de maíz y aceite de soja; glicoles, tal como propilenglicol; polioles, tales como glicerina, sorbitol, manitol y polietilenglicol ; ésteres, tal como oleato de etilo y laurato de etilo; agar; agentes amortiguadores, tales como hidróxido de magnesio e hidróxido de aluminio; ácido algínico; agua libre de pirógeno; solución salina isotónica; solución de Ringer; alcohol etílico; soluciones amortiguadoras de fosfato; y otras sustancias compatibles no tóxicas empleadas en formulaciones farmacéuticas.

El término "composición farmacéutica" se utiliza en la presente para referirse a composiciones o formulaciones que usualmente comprenden un excipiente, tal como un portador farmacéuticamente aceptable que es convencional en la técnica y que es adecuado para la administración a mamíferos, y de preferencia humanos o células humanas. Tales composiciones se pueden formular específicamente para la administración por medio de una o más de un número de rutas, incluyendo pero no limitado a, oral, ocular, parenteral, intravenosa, intraarterial, subcutánea, intranasal, sublingual, intraespinal, intracerebroventricular y los similares. Además, las composiciones para administración tópica (por ejemplo, mucosa oral, mucosa respiratoria) y/o administración oral pueden formar soluciones, suspensiones, tabletas, pildoras, cápsulas, formulaciones de liberación sostenida, enjuagues orales o polvos, como es conocido en la técnica como se describen en la presente. Las composiciones también pueden incluir estabilizadores y conservadores. Para ejemplos de portadores, estabilizadores y adyuvantes ver University of the Sciences in Philadelphia (2005) Remington: The Science and Practice of Pharmacy with Facts and Comparusons, 21st Ed.

En ciertas modalidades, los compuestos de la presente invención pueden contener uno o más grupos funcionales acidicos y, de esta manera, son capaces de formar sales farmacéuticamente aceptables con bases farmacéuticamente aceptables. El término "sales, ésteres, amidas y profármacos farmacéuticamente aceptables" como se utiliza en la presente, se refiere a aquellas sales de carboxilato, sales de adición de aminoácidos, ésteres, amidas y profármacos de los compuestos de la presente invención que son, dentro del buen juicio médico, adecuados para el uso en contacto con los tejidos de los pacientes sin toxicidad indebida, irritación, respuesta alérgica y los similares, relacionados con una relación de beneficio/riesgo razonable, y efectivos para su uso propuesto de los compuestos de la invención. El término "sales" se refiere a las sales de adición de ácido no tóxicas, de ácido inorgánico y orgánico de los compuestos de la presente invención. Estas sales se pueden preparar in situ durante el aislamiento y purificación final de los compuestos o al hacer reaccionar por separado el compuesto purificado en su forma de base libre con un ácido orgánico o inorgánico adecuado y al aislar la sal de esta manera formada. Éstos pueden incluir cationes en base a los metales alcalinos y alcalinotérreos tales como sodio, litio, potasio, calcio, magnesio y los similares, asi como cationes de amonio, amonio cuaternario y de amina no tóxicos que incluyen, pero no limitados a amonio, tetrametilamonio, tetraetil amonio, metil amina, dimetil amina, trimetilamina, trietilamina, etilamina y los similares (ver, por ejemplo, Berge S.M., y colaboradores. (1977) J. Pharm. Sci. 66.1, que es incorporado en la presente por referencia) .

El término "ásteres farmacéuticamente aceptables" se refiere a los productos esterificados relativamente no tóxicos de los compuestos de la presente invención. Estos ésteres se pueden preparar in situ durante el aislamiento y purificación final de los compuestos, o al hacer reaccionar por separado el compuesto purificado en su forma de ácido libre o hidroxilo con un agente de esterificación adecuado. Los ácidos carboxilicos se pueden convertir en ésteres por medio de tratamiento con un alcohol en presencia de un catalizador. El término además se propone para incluir grupos de hidrocarburo inferiores capaces de ser solvatados bajo condiciones fisiológicas, por ejemplo, ésteres alquilicos, ásteres metílicos, etílicos y propílicos.

Como se utiliza en la presente, "sales o profármacos farmacéuticamente aceptables" son sales o profármacos que son, dentro del alcance del buen juicio médico, adecuados para el uso en el contacto con los tejidos del sujeto sin toxicidad indebida, irritación, respuesta alérgica y los similares, proporcionado con una relación de beneficio/riesgo razonable y efectivo para su uso propuesto.

El término "profármaco" se refiere a compuestos que se transforman rápidamente in vivo para producir el uno o más péptidos funcionalmente activos como es descrito en la presente o un mutante, variante, análogo o derivados de los mismos. Una discusión completa se proporciona en T. Higachi and V. Stella, "Pro-drugs as Novel Delivery Systems", Vol. 14 of the A.C.S. Symposium Series, and in Bioreversible Carriers in: Drug Design, ed. Edward B. Roche, American Pharmaceutical Association y Pergamon Press, 1987, ambas de las cuales se incorporan en la presente por referencia. Como se utiliza en la presente, un profármaco es un compuesto que, en la administración in vivo, se metaboliza de otra manera se convierte a la forma biológicamente, farmacéuticamente o terapéuticamente activa del compuesto. Un profármaco del uno o más péptidos como es descrito en la presente o un mutante, variante, análogo o derivado del mismo se pueden diseñar para alterar la estabilidad metabólica o las características de transporte del uno o más péptidos como es descrito en la presente o un mutante, variante, análogo o derivado del mismo, para enmascarar los efectos secundarios o toxicidad, para mejorar el sabor de un compuesto o para alterar otras características o propiedades de un compuesto. En virtud del conocimiento de los procesos farmacodinámicos y el metabolismo de fármacos in vivo, una vez que una forma farmacéuticamente activa del uno o más péptidos como es descrito en la presente o un mutante, variante, análogo o derivado del mismo, aquellos de habilidad en la técnica farmacéutica generalmente pueden diseñar profármacos de los compuestos (ver, por ejemplo, Nogrady (1985) Medicinal Chemistry A Biochemical Approach Oxfors University Press, N. Y. páginas 388-392) . Los procedimientos convencionales para la selección y preparación de profármacos adecuados se describen, por ejemplo, en "Design of Prodrugs", ed. H. Bundgaard, Elsevier, 1985. Ejemplos adecuados de profármacos incluyen ésteres metílicos, etílicos y de glicerol del ácido correspondiente .

Composiciones parenterales La composición farmacéutica se puede administrar parenteralmente mediante inyección, infusión o implantación (subcutánea, intravenosa, intramuscular, intraperitoneal o los similares) en formas de dosificación, formulaciones, o por medio del dispositivo o implantes de suministro adecuados que contienen portadores y adyuvantes farmacéuticamente aceptables, no tóxicos, convencionales. La formulación y preparación de tales composiciones son bien conocidas para aquellos expertos en la técnica de formulación farmacéutica.

Las composiciones para uso parenteral se pueden proporcionar en formas de dosificación unitarias (por ejemplo, en ampolletas de una sola dosis) o en frasquitos que contienen varias dosis en las cuales que se puede adicionar un conservador adecuado (ver enseguida) . La composición puede estar en la forma de una solución, una suspensión, una emulsión, un dispositivo de infusión, o un dispositivo de suministro para implantación, o se pueden presentar como un polvo seco para ser reconstituido con agua u otro vehículo adecuado antes del uso. Aparte del agente (s) activo, la composición puede incluir portadores y/o excipientes parenteralmente aceptables, adecuados. El agente (s) activo se puede incorporar en microesferas, microcápsulas, nanopartículas, liposomas o los similares para liberación controlada. Además, la composición puede incluir agentes de suspensión, solubilizantes, estabilizantes, agentes ajustadores del pH, agentes ajustadores de tonicidad, y/o agentes dispersantes.

Como es indicado en lo anterior, las composiciones farmacéuticas de acuerdo con la invención pueden estar en una forma adecuada para inyección estéril. Para preparar tal composición, el agente (s) activo adecuado se disuelve o se suspende en un vehículo liquido parenteralmente aceptable. Entre los vehículos y solventes aceptables que se pueden emplear está en el agua, agua ajustada a un pH adecuado mediante la adición de una cantidad apropiada de ácido clorhídrico, hidróxido de sodio o una solución amortiguadora adecuada, 1, 3-butanodiol, solución de Ringer, solución de dextrosa y solución de cloruro de sodio isotónica. La formulación acuosa también puede contener uno o más conservadores (por ejemplo, p-hidroxibenzoato de metilo, etilo o n-propilo) , en casos donde uno de los compuestos es sólo escasamente o ligeramente soluble en agua, se puede adicionar un agente aumentador de disolución o solubilizante, o el solvente puede incluir 10-60% p/p de propilenglicol o los similares.

Los agentes humectantes, emulsificantes y lubricantes, tales como lauril sulfato de sodio y estearato de magnesio, así como agentes colorantes, agentes de liberación, agentes de recubrimiento, agentes de endulzamiento, saborizantes y perfumantes, conservadores y antioxidantes también se pueden presentar en las composiciones. i 13 Ejemplos de antioxidantes farmacéuticamente aceptables incluyen: antioxidantes solubles en agua, tal como ácido ascórbico, clorhidrato de cisteína, bisulfato de sodio, metabisulfato de sodio, sulfito de sodio y los similares; antioxidantes solubles en aceite, tal como palmitato de ascorbilo, hidroxianisol butilado (BHA) , hidroxitolueno butilado (BHT) , lecitina, galato de propilo, alfa-tocoferol, y los similares; agentes quelantes de metal, tal como ácido cítrico, ácido etilendiamina tetraacético (EDTA) , sorbitol, ácido tartárico, ácido fosfórico y los similares.

Las formulaciones de la presente invención incluyen aquellas adecuadas para la administración intravenosa, oral, nasal, tópica, transdérmica, bucal, sublingual, rectal, vaginal y/o parenteral. Las formulaciones se pueden presentar de manera conveniente en forma de dosificación unitaria y se pueden preparar cualquiera de los métodos bien conocidos en la técnica de farmacia. La cantidad de ingrediente activo que se puede combinar con un material portador para producir una sola forma de dosificación generalmente será aquella cantidad del compuesto que produce un efecto terapéutico.

Métodos para preparar estas formulaciones o composiciones incluyen la etapa de llevar en asociación un compuesto de la presente invención con el portador y. opcionalmente, uno o más ingredientes adicionales . En general, las formulaciones se preparan al llevar de manera uniforme e íntimamente en asociación un compuesto de la presente invención con portadores líquidos, o portadores sólidos finamente divididos, o ambos y luego, si es necesario, conforma el producto.

Las formulaciones de la invención adecuadas para administración oral pueden estar en la fórmula de cápsulas, saquitos, pildoras, tabletas, pastillas (utilizando una base de sabor, usualmente sacarosa o acacia o tragacanto) , polvos, gránulos o como una suspensión o una suspensión en un líquido acuoso o no acuoso, o como una emulsión de líquido de aceite-en-agua o de agua en aceite, o como un elixir o jarabe, o como pastillas (utilizando una base inerte, tal como gelatina y glicerina, o sacarosa y acacia) y/o como enjuagues bucales y los similares, cada uno que contiene una cantidad predeterminada de un compuesto de la presente invención como un ingrediente activo. Un compuesto de la presente invención también se puede administrar como un bolo, electuario o pasta .

Las composiciones farmacéuticas de esta invención adecuadas para administración parenteral comprenden uno o más péptidos como es descrito en la presente o un mutante, variante, análogo o derivado de los mismos en combinación con uno o más soluciones acuosas o no acuosas isotónicas, estériles, farmacéuticamente aceptables, dispersiones, suspensiones o emulsiones, o polvos estériles que se pueden reconstituir en soluciones o dispersiones inyectables justo antes del uso, que pueden contener antioxidantes, soluciones reguladoras, bacteriostatos, solutos que vuelven la formulación isotónica con la sangre del recibidor propuesto o agentes de suspensión o espesantes.

Los ejemplos de portadores acuosos y no acuosos adecuados que se pueden emplear en las composiciones farmacéuticas que comprenden uno o más péptidos como es descrito en la presente o un mutante, variante, análogo o derivado de los mismos incluyen agua, etanol, polioles (tal como glicerol, propilenglicol , polietilenglicol y los similares) , y mezclas adecuadas de los mismos, aceites vegetales, tales como aceite de olivo y ésteres orgánicos inyectables, tal como oleato de etilo. La fluidez apropiada se puede mantener, por ejemplo, mediante el uso de materiales de recubrimiento, tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersiones, o mediante el uso de surfactantes .

Estas composiciones también pueden contener adyuvantes tales como conservadores, agentes humectantes, agentes emulsificantes y agentes dispersantes. La prevención de la acción de microorganismos se puede asegurar mediante la inclusión de varios agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabeno, clorobutanol , ácido sórbico de fenol y los similares. También puede ser deseable incluir agentes isotónicos, tales como azúcares, cloruro de sodio y los similares en las composiciones. Además, la absorción prolongada de la forma farmacéutica inyectable se puede originar mediante la inclusión de agentes que retardan la absorción tal como monoestearato de aluminio y gelatina.

En algunos casos, con el fin de prolongar el efecto de un fármaco, es deseable retardar la absorción del fármaco a partir de la inyección subcutánea o intramuscular. Esto se puede realizar mediante el uso de una suspensión líquida de material cristalino o amorfo que tiene pobre solubilidad en el agua. La velocidad de absorción del fármaco luego depende de su velocidad de solución que, a su vez, puede depender del tamaño del cristal y la forma cristalina. Alternativamente, la absorción retardada de una forma de fármaco parenteralmente administrada se realiza al disolver o al suspender el fármaco en un vehículo de aceite.

Las formas de depósito inyectables se hacen al formar matrices microencapsuladas de los presentes compuestos en polímeros biodegradables tales como polilactida-poliglicolida . Dependiendo de la relación del fármaco a polímero, y la naturaleza del polímero particular empleado, se puede controlar la velocidad de liberación del fármaco. Ejemplos de otros polímeros biodegradables incluyen poli (ortoésteres) y poli (anhídridos) . Las formulaciones inyectables de depósito también se preparan al atrapar el fármaco, tal como uno o más péptidos como es descrito en la presente o un mutante, variante, análogo o derivado del mismo en liposomas o microemulsiones que son compatibles con el tejido corporal.

Sin considerar la ruta de administración seleccionada, los compuestos de la presente invención, que se pueden utilizar en una forma hidratada adecuada y/o composiciones farmacéuticas de la presente invención, se formulan en formas de dosificación farmacéuticamente aceptables por métodos convencionales conocidos para aquellos de habilidad ordinaria en la técnica.

Composiciones parenterales de liberación controlada Las composiciones parenterales de liberación controlada pueden estar en forma de suspensiones acuosas, microesferas, microcápsulas, microesferas magnéticas, soluciones de aceite, suspensiones de aceite o emulsiones. La composición también se puede incorporar en portadores biocompatibles, liposomas, nanoparticulas, implantes o dispositivos de infusión.

Los materiales para el uso en la preparación de microesferas y/o microcápsulas son, por ejemplo, polímeros biodegradables/bioerosionables tales como poligalácea poli- (cianoacrilato de isobutilo) , poli (2-hidroxietil-L-glutamnina) , poli (ácido láctico), ácido poliglicólico y mezclas de los mismos. Los portadores biocompatibles que se pueden utilizar cuando se formula una formulación parenteral de liberación controlada son carbohidratos (por ejemplo, dextranos) , proteínas (por ejemplo, albúmina) , lipoproteínas, o anticuerpos. Los materiales para el uso en implantes pueden ser no biodegradables (por ejemplo, polidimetil siloxano) o biodegradables (por ejemplo, poli (caprolactona) , poli (ácido láctico), poli (ácido glicólico) o poli (orto-ésteres) ) o combinaciones de los mismos.

Formas de dosificación sólidas para uso oral Las formulaciones para uso oral incluyen tabletas que contienen el ingrediente (s ) activo en una mezcla con excipientes farmacéuticamente aceptables no tóxicos, y tales formulaciones son conocidas para la persona experta (por ejemplo, Patente de los Estados Unidos Nos. 5,817,307; 5,824,300; 5,830,456; 5,846,526; 5,882,640; 5,910,304; 6,036,949; 6,036,949; y 6,372,218 incorporados en la presente por referencia) . Estos excipientes pueden ser, por ejemplo, diluyentes inertes o rellenadores (por ejemplo, sacarosa, sorbitol, azúcar, manitol, celulosa microcristalina, almidones que incluyen almidón de papa, carbonato de calcio, cloruro de sodio, lactosa, fosfato de calcio, sulfato de calcio o fosfato de sodio) ; agentes de granulación y desintegración (por ejemplo, derivados de celulosa que incluyen celulosa microcristalina, almidones incluyendo almidón de papa, croscarmelosa de sodio, alginatos o ácido algínico) ; agentes aglutinantes (por ejemplo, sacarosa, glucosa, sorbitol, acacia, ácido algínico, alginato de sodio, gelatina, almidón, almidón pregelatinizado, celulosa microcristalina, silicato de aluminio de magnesio, carboximetilcelulosa sódica, metilcelulosa, hidroxipropil metilcelulosa, etilcelulosa, polivinilpirrolidona, o polietilenglicol) ; y agentes lubricantes, deslizantes y anti-adhesivos (por ejemplo, estearato de magnesio, estearato de zinc, ácido esteárico, sílices, aceites vegetales hidrogenados o talco) . Otros excipientes farmacéuticamente aceptables pueden ser colorantes, agentes saborizantes, plastificantes, humectantes, agentes amortiguadores y los similares .

Las tabletas pueden ser no recubiertas o se pueden recubrir por técnicas conocidas, opcionalmente para retrasar la desintegración y absorción en el tracto gastrointestinal y de esta manera proporcionar una acción sostenida durante un período más largo. El recubrimiento puede se puede adaptar para liberar la proteína en un patrón predeterminado (por ejemplo, para lograr una formulación de liberación controlada) o se puede adaptar para no liberar el agente (s) hasta después del pasaje del estómago (recubrimiento entérico) . El recubrimiento puede ser un recubrimiento de azúcar, un recubrimiento de película (por ejemplo, en base a hidroxipropil metilcelulosa, metilcelulosa, metil hidroxietilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, carboximetilcelulosa, copolimeros de acrilato, polietilenglicoles y/o polivinilpirrolidona ) , o un recubrimiento entérico (por ejemplo, en base al copolimero de ácido metacrilico, ftalato de acetato de celulosa, ftalato de hidroxipropil metilcelulosa, succinato de acetato de hidroxipropil metilcelulosa, ftalato de acetato de polivinilo, laca, y/o etilcelulosa) . Además, se puede emplear un material de retardo de tiempo tal como, por ejemplo, monoestearato de glicerilo o diestearato de glicerilo.

Las composiciones de tabletas sólidas pueden incluir un recubrimiento adaptado para proteger a la composición de los cambios químicos indeseados, (por ejemplo, degradación química antes de la liberación de las sustancias activas) . El recubrimiento se puede aplicar en la forma de dosificación sólida de una manera similar a aquella descrita en Encyclopedia of Pharmaceutical Technology, supra.

Las composiciones de la invención se pueden mezclar conjuntamente en la tableta, o se pueden particionar. En un ejemplo, el primer agente es contenido en el interior de la tableta, y un segundo agente está en el exterior, tal que una porción sustancial del segundo agente es liberado antes de la liberación del primer agente.

Las formulaciones para uso oral también se pueden presentar como tabletas masticables, o como cápsulas de gelatina dura en sonde el ingrediente activo se mezcla con un diluyente sólido inerte (por ejemplo, almidón de papa, lactosa, celulosa microcristalina, carbonato de calcio, fosfato de calcio o caolín) o como cápsulas de gelatina blanda en donde el ingrediente activo se mezcla con agua o un medio de aceite, por ejemplo, aceite de cacahuete, parafina líquida o aceite de olivo. Los polvos y granulados se pueden preparar utilizando los ingredientes mencionados en lo anterior bajo tabletas o cápsulas de una manera convencional usando, por ejemplo, un mezclador, un aparato de lecho fluido o equipos de secado por rocío.

En las formas de dosificación sólidas de la invención para la administración oral (cápsulas, tabletas, pildoras, grageas, polvos, gránulos y los similares), el ingrediente activo se mezcla con uno o más portadores farmacéuticamente aceptables, tal como citrato de sodio o fosfato dicalcio, y/o cualquiera de los siguientes: rellenadores o extendedores, tales como almidones, lactosa, sacarosa, glucosa, manitol, y/o ácido silícico; aglutinantes, tales como, por ejemplo, carboximetilcelulosa, alginatos, gelatina, polivinil pirrolidona, sacarosa y/o acacia; humectantes, tal como glicerol; agentes desintegrantes, tal como agar-agar, carbonato de calcio, almidón de papa o de tapioca, ácido algínico, ciertos silicatos y carbonato de sodio; agentes retardantes de solución, tal como parafina; aceleradores de absorción, tales como compuestos de amonio cuaternarios; agentes humectantes, tales, por ejemplo, alcohol cetílico y monoestearato de glicerol; absorbentes, tal como caolín y arcilla de bentonita; lubricantes, tal un talco, estearato de calcio, estearato de magnesio, polietilenglicoles sólidos, lauril sulfato de sodio y mezclas de los mismos; y agentes colorantes. En el caso de cápsulas, tabletas y pildoras, las composiciones farmacéuticas también pueden comprender agentes amortiguadores. Las composiciones sólidas de un tipo similar también se pueden utilizar como rellenadores en cápsulas de gelatina de relleno blando y duro utilizando tales excipientes como lactosa o azúcares de leche, así como polietilenglicoles de alto peso molecular y los similares.

Una tableta se puede hacer mediante compresión o moldeo, opcionalmente con uno o más ingredientes adicionales. Las tabletas comprimidas se pueden preparar utilizando aglutinante (por ejemplo, gelatina o hidroxipropilmetil celulosa) , lubricante, diluyente inerte, conservador, desintegrante (por ejemplo, almidón de glicolato de sodio o carboximetilcelulosa de sodio reticulada) , agente activo en la superficie o dispersante. Las tabletas moldeadas se pueden hacer al moldear en una máquina adecuada una mezcla del compuesto en polvo humedecido con un diluyente líguido inerte.

Las tabletas, y otras formas de dosificación sólidas de las composiciones farmacéuticas de la presente invención, tales como grageas, cápsulas, pildoras y gránulos, opcionalmente se pueden marcar o preparar con recubrimientos y cubiertas, tales como recubrimientos entéricos y otros recubrimientos bien conocidos en la técnica de formulación farmacéutica. También se pueden formular para proporcionar liberación lenta o controlada del ingrediente activo en la misma utilizando, por ejemplo, hidroxipropilmetil celulosa en proporciones variantes para proporcionar el perfil de liberación deseado, otras matrices de polímero, liposomas y/o microesferas . Ellas se pueden esterilizar mediante, por ejemplo, filtración a través de un filtro de retenedor de bacterias, o al incorporar agentes esterilizantes en la forma de composiciones sólidas estériles que se pueden disolver en agua estéril, o algún otro medio inyectable estéril inmediatamente antes del uso. Estas composiciones también pueden contener opcionalmente agentes opacificantes y se pueden hacer de una composición que liberan el ingrediente ( s) activo solamente, o preferencialmente, en una cierta porción del tracto gastrointestinal, opcionalmente, de una manera retardada. Ejemplos de composiciones de incrustación que se pueden utilizar incluyen sustancias poliméricas y ceras. El ingrediente activo también puede estar en forma micro-encapsulada, si es apropiado, con uno o más de los excipientes descritos en lo anterior. En un aspecto, una solución de resolvina y/o protectina o precursor o análogo del mismo se puede administrar como gotas para los ojos para la neovascularización ocular o gotas para oído para tratar la otitis.

Las formas de dosificación liquidas para administración oral de los compuestos de la invención incluyen emulsiones, microemulsiones , soluciones, suspensiones, jarabes y elixires farmacéuticamente aceptables.

Además del ingrediente activo, las formas de dosificación liquidas pueden contener diluyentes inertes comúnmente utilizados en la técnica, tal como, por ejemplo, agua u otros solventes, agentes solubilizantes y emulsificadores, tal como alcohol etílico, alcohol isopropílico, carbonato de etilo, acetato de etilo, alcohol bencílico, benzoato de bencilo, propilenglicol , 1,3-butilenglicol, aceites (en particular, aceite de semilla de algodón, de nuez molida, maíz, germen, olivo, ricino y ajonjolí), glicerol, alcohol tetrahidrofurílico, polietilenglicoles y ésteres de ácidos graso de sorbitan, y mezclas de los mismos. Además de los diluyentes inertes, las composiciones orales también pueden incluir adyuvantes tales como agentes humectantes, agentes emulsionantes y de suspensión, agentes de endulzamiento, saborizantes, colorantes, perfumantes y conservadores.

Las suspensiones, además de los compuestos activos, pueden contener agentes de suspensión como, por ejemplo, alcoholes isoestearílieos etoxilados, polioxietilen sorbitol y ésteres de sorbitan, celulosa microcristalina, metahidróxido de aluminio, bentonita, agar-agar y tragacanto, y mezclas de los mismos.

Las formas de dosificación para la administración tópica o transdérmica de uno o más péptidos como es descrito en la presente o un mutante, variante, análogo o derivado de los mismos incluyen polvos, roclos, ungüentos, pastas, cremas, lociones, geles, soluciones, parches e inhalantes. El compuesto activo se puede mezclar bajo condiciones estériles con un portador farmacéuticamente aceptable, y con cualquiera de los conservadores, amortiguador o propelentes como puedan ser requeridos.

Los ungüentos, pastas, cremas y geles pueden contener, además de un compuesto activo de esta invención, excipientes, tales como grasas de animales y vegetales, aceites, ceras, parafinas, almidón, tragacanto, derivados de celulosa, polietilenglicoles , siliconas, bentonitas, ácido silícico, talco y óxido de zinc o mezclas de los mismos. Los polvos y rocíos pueden contener, además de un compuesto de esta invención, excipientes tales como lactosa, talco, ácido silícico, hidróxido de aluminio, silicatos de calcio y polvo de poliamida, o mezclas de estas sustancias. Los rocíos adicionalmente pueden contener propelentes usuales, tales como clorofluorohidrocarbonos e hidrocarbonos no sustituidos volátiles, tales como butano y propano.

Los parches transdérmicos tienen la ventaja agregada de proporcionar suministro controlado de los compuestos (resolvinas y/o protectinas y/o precursores o análogos de los mismos) de la presente invención al cuerpo. Tales formas de dosificación se pueden hacer al disolver o dispersar el compuesto en el medio apropiado. Los aumentadores de absorción también se pueden utilizar para incrementar el flujo del compuesto a través de la piel. La velocidad de tal flujo se puede controlar ya sea al proporcionar una membrana de control de velocidad o al dispersar el compuesto activo en una matriz de polímero o gel. En otro aspecto, los polímeros biodegradables absorbibles pueden proporcionar agente de polipéptido extendidos, frecuentemente localizados liberados. Los beneficios potenciales de una liberación de vida media o extendida incrementada para un agente terapéutico son claros. Un beneficio potencial de la liberación localizada es la habilidad para lograr dosificaciones o concentraciones localizadas mucho más altas, por duraciones de tiempo más grandes, con relación a la administración sistémica más amplia, con el potencial de evitar efectos secundarios indeseables posibles que pueden ocurrir con la administración sistémica .

La matriz polimérica bioabsorbible adecuada para el suministro de uno o más péptidos como es descrito en la presente o un mutante, variante, análogo o derivado de los mismos se puede seleccionar de una variedad de polímeros bioabsorbibles sintéticos, que se describen extensivamente en la literatura. Tales polímeros biocompatibles, bioabsorbibles sintéticos, que pueden liberar proteínas a través de varias semanas o meses pueden incluir, por ejemplo, poli-a-hidroxi ácidos (por ejemplo, polilactidas , poliglicólidas y sus copolímeros) , polianhídridos , poliortoésteres, copolímeros de bloque segmentado de polietilenglicol y polibutilen tereftalato ( Polyacti e™) , polímeros derivados de tirosina o poli (éster-amidas) . Los polímeros bioabsorbibles adecuados para ser utilizados en la fabricación de materiales de suministro de fármacos o implantes se discuten, por ejemplo en las Patentes de los Estados Unidos Nos. 4,968,317, 5,618,563, entre otras, y en "Biomedical Polymers", editado por S.W. Shalaby, Cari Hanser Verlag, Munich, Vienna, New York, 1994, y en muchas referencias citadas en las publicaciones anteriores. El polímero bioabsorbible particular, que debe ser seleccionado dependerá del paciente particular que está siendo tratando.

Terapia génica Una o más péptidos como es descrito en la presente o un mutante, variante, análogo o derivado de los mismos se puede utilizar de manera efectiva en el tratamiento mediante la terapia génica. Ver, generalmente, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos No. 5, 399,346, que se incorpora en la presente por referencia. El principio general es introducir el polinucleótido en una célula objetivo en un paciente.

La entrada en la célula se facilita mediante técnicas adecuadas conocidas en el arte tal como la proporción del polinucleótido en la forma de un vector adecuado, o encapsulación del polinucleótido en un liposoma.

Un modo deseado de terapia génica es proporcionar el polinucleótido de tal manera tal que se replicará dentro de la célula, aumentando y prolongando el efecto deseado. De esta manera, el polinucleótido se enlaza operablemente a un promotor adecuado, tal como el promotor natural del gen correspondiente, un promotor heterólogo que está intrínsecamente activo en las células del hígado, neuronales, del hueso, músculo, piel, articulación o cartílago, o un promotor heterólogo que se puede inducir mediante un agente adecuado .

Los vectores de expresión compatibles con células eucarióticas, de preferencia aquellas compatibles con células de vertebrado, se pueden utilizar para producir constructos recombinantes para la expresión de uno o más péptidos como es descrito en la presente o un mutante, variante, análogo o derivados de los mismos, que incluye proteínas de fusión con uno o más péptidos como es descrito en la presente o un mutante, variante, análogo o derivado de los mismos. Los vectores de expresión de células eucariotas son bien conocidos en la técnica y son disponibles de varias fuentes comerciales. Típicamente, tales vectores se proporcionan para contener sitios de restricción convenientes para la inserción del segmento de DNA deseado. Estos vectores pueden ser vectores virales tales como adenovirus, virus adeno-asociados, virus pox tal como un ortopox (vaccinia y vaccinia atenuada) abipox, lentivirus, virus de la leucemia moloney murino, etc. Alternativamente, se pueden utilizar vectores de expresión de plásmidos.

Los sistemas de vectores virales que se pueden utilizar en la presente invención incluyen, pero no están limitados a, (a) vectores de adenovirus; (b) vectores de retrovirus; (c) vectores de virus adeno-asociado; (d) vectores del virus de herpes simple; (e) vectores de SV 40; (f) vectores de virus de polioma; (g) vectores de virus de papiloma; (h) vectores de picornavirus, (i) vectores de virus pox tal como un ortopox, por ejemplo, vectores de virus vaccinia o avipox, por ejemplo, canari pox o fowl pox; y (j) un adenovirus dependiente ayudante o sin intestino. En una modalidad preferida, el vector es un adenovirus. Los virus defectuosos de replicación también pueden ser ventajosos.

El vector puede o no puede ser incorporado en el genoma de las células. Los constructos pueden incluir secuencias virales para la transíección, si es deseado. Alternativamente, el constructo se puede incorporar en vectores capaces de la replicación episomal, por ejemplo, vectores EPV y EBV.

Por "operablemente enlazado" se propone que una molécula de ácido nucleico y una o más secuencias reguladoras (por ejemplo, un promotor) se conectan de tal manera para permitir la expresión y/o secreción del producto (por ejemplo, una proteina) de la molécula de ácido nucleico cuando las moléculas apropiadas (por ejemplo, proteínas de activador transcripcional) se enlazan en las secuencias reguladoras. Establecido de otra manera, el término "operativamente enlazado" como se utiliza en la presente se refiere a la relación funcional de las secuencias de ácidos nucleico con secuencias reguladoras de nucleótidos, tales como promotores, aumentadores, sitios de detención transcripcional y traduccional y otras secuencias de señal. Por ejemplo, el enlace operativo de secuencias de ácido nucleico, típicamente DNA, a una secuencia reguladora o la región de promotor se refiere a la relación física y funcional entre el DNA y la secuencia reguladora o promotor tal que la transcripción de tal DNA se inicia a partir de la secuencia reguladora o promotor, mediante una RNA polimerasa que específicamente reconoce, enlaza y transcribe el DNA. Con el fin de optimizar la expresión y/o transcripción in vitro, puede ser necesario modificar la secuencia reguladora para la expresión del ácido nucleico o DNA en el tipo de célula para la cual se expresa. La deseabilidad de, o necesidad de, tal modificación puede ser empíricamente determinada. Un polinucleótido relativamente enlazado que va a ser expresado típicamente incluye una señal de inicio apropiada (por ejemplo, ATG) y mantiene la estructura de lectura correcta para permitir la expresión de la secuencia de polinucleótido bajo el control de la secuencia de control de expresión, y la producción del polipéptido deseado codificado por la secuencia de polinucleótido.

Como se utiliza en la presente, los términos "promotor" o "región de promotor" o "elemento de promotor" se han definido en la presente, se refiere a un segmento de una secuencia de ácido nucleico, típicamente pero no limitada a DNA o RNA o análogos de la misma, que controla la transcripción de la secuencia de ácido nucleico que es operativamente enlazada. La región de promotor incluye secuencias específicas que son suficientes para el reconocimiento de RNA polimerasa, enlace iniciación de transcripción. Esta porción de la región de promotor es referida como el promotor. Además, la región de promotor incluye secuencias que modulan este reconocimiento, enlace y actividad de iniciación de transcripción del RNA polimerasa . Estas secuencias pueden ser acción ds o pueden ser responsivas a factores de acción trans. Los promotores, dependiendo de la naturaleza de la regulación pueden ser constitutivos o regulados.

El término "secuencias reguladoras" se utiliza intercambiablemente con "elementos reguladores" en la presente se refiere al elemento de un segmento de ácido nucleico, pero no limitado a DNA o RNA o análogos del mismo, que modula la transcripción de la secuencia de ácido nucleico a la cual se enlaza operativamente, y de esta manera actúa como moduladores transcripcionales. Las secuencias reguladoras modulan la expresión de gen y/o secuencia de ácido nucleico a la cual se enlazan operativamente. La secuencia reguladora frecuentemente comprende "elementos reguladores" que son secuencias de ácido nucleico que son dominios de enlaces de transcripción y son reconocidos por los dominios de enlace de ácido nucleico de las proteínas transcripcionales y/o factores de transcripción, represores o aumentadores , etc. Las secuencias reguladoras típicas incluyen, pero no están limitada a, promotores transcripcionales, promotores inducibles y elementos transcripcionales, una secuencia de operación opcional para controlar la transcripción, una secuencia que codifica los sitios de enlace ribosomal de mRNA adecuados, y secuencias para controlar la terminación de transcripción y/o traducción. Incluido en el término "elementos reguladores" son secuencias de ácido nucleico tales como señales de iniciación, aumentadores y promotores, que inducen o controlan la transcripción de secuencias de codificación de proteínas con las cuales se enlazan operativamente. En algunos ejemplos, la transcripción de un gen recombinante está bajo el control de una secuencia de promotor (u otra secuencia reguladora transcripcional ) que controla la expresión del gen recombinante en un tipo de célula en la cual se propone la expresión. También se va a entender que el gen recombinante puede estar bajo el control de la secuencia reguladora transcripcionales que son las mismas o que son diferentes de aquellas secuencias que controlan la transcripción de la forma que ocurre naturalmente de una proteina. En algunos casos, la secuencia de promotor se reconoce por la maquinaria sintética de la célula, o maquinaria sintética introducida, requerida para iniciar la transcripción de un gen especifico.

Las secuencias reguladoras pueden ser una secuencia reguladora única o múltiples secuencias reguladoras, o secuencias reguladoras modificadas o fragmentos de las mismas. Las secuencias reguladoras modificadas son secuencias reguladoras donde la secuencia de ácido nucleico se ha cambiado o modificado por algún medio, por ejemplo, pero no limitado a, mutación, metilación etc.

Las secuencias reguladoras útiles en los métodos como es descrito en la presente son elementos de promotor que son suficientes para promover la expresión de gen dependiente de promotor controlable para especifica de tipo de célula, especifica de tejido o inducible por señales o agentes externos (por ejemplo, aumentadores o represores) ; tales elementos se pueden ubicar en las regiones 5' o 3' del gen nativo, o dentro de un intrón.

Como se utiliza en la presente, el término "promotor especifico de tejido" significa una secuencia de ácido nucleico que sirve como un promotor, es decir, regula la expresión de la secuencia de ácido nucleico seleccionada operablemente enlazada al promotor, y que selectivamente afecta la expresión de la seleccionada de ácido nucleico seleccionada en células especificas de un tejido.

En algunas modalidades, puede ser ventajoso dirigir la expresión de uno o más péptidos como es descrito en la presente o un muíante, variante, análogo o derivado de los mismos en una manera especifica de tejido de célula. La expresión especifica de músculo se puede lograr, por ejemplo, utilizando el promotor MKC de músculo esquelético (como es descrito en la Solicitud de Patente de los Estados Unidos WO2007/100722, que se incorpora en la presente por referencia) u otros promotores específicos de músculo, tal como la cadena pesada de a-misiona, cadena ligera-2 de misiona (que es específica para el músculo esquelético (Shani y colaboradores, Nature, 314;283-86, 1985), la región de control de gen de hormona de liberación gonadotrófica que es activa en el hipotálamo (Masón y colaboradores, Science, 234; 1372-1378, 1986), y el promotor de músculo liso SM22a, que todos son comúnmente conocidos en la técnica.

El término "promotor constitutivamente activo" se refiere a un promotor de un gen que se expresa en todos los tiempos dentro de una célula dada. Los promotores ejemplares para el uso en células mamíferos que incluyen citomegalovirus (CMV) y para el uso en células procarióticas incluyen los promotores T7 y T3 de bacteriófago y los similares. El término "promotor inducible" se refiere a un promotor de un gen que se puede expresar en respuesta a una señal dada, por ejemplo la adición o reducción de un agente. Ejemplos no limitantes de un promotor inducible son promotores "tet-on" y "tet-off", o promotores que son regulados en un tipo de tejido específico.

En una modalidad específica, los vectores virales que contienen secuencias de ácido nucleico que codifican el uno o más péptidos como es descrito en la presente o un mutante, variante, análogo o derivado de los mismos son utilizados. Por ejemplo, se puede utilizar un vector retroviral (ver iller y colaboradores, Meth. Enzymol 217:581-599 (1993)). Estos vectores retrovirales contienen los componentes necesarios para el empacado correcto del genoma viral y la integración en el DNA de la célula hospedera. Más detalle acerca de vectores retrovirales se pueden encontrar ' en Boesen y colaboradores, Biotherapy 6:291-302 (1994), que describe el uso de un vector retroviral para suministrar el gen MDRL a las células madre hematopoyéticas con el fin de hacer a las células madre más resistentes a la quimioterapia. Otras referencias que ilustran el uso de vectores retrovirales en la terapia génica son: Clowes y colaboradores, J. Clin. Invest. 93:644-651 (1994); Kiem y colaboradores, Blood 83:1467-1473 (1994); Salmons y Gunzberg, Human Gene Therapy 4:129-141 (1993); y Grossman y Wilson, Curr. Opin. in Genetics y Devel. 3:110-114 (1993) .

La producción de un vector retroviral recombinante que lleva un gen de interés típicamente se logra en dos etapas. Primero, la secuencia que codifica uno o más péptidos como es descrito en la presente o un mutante, variante, análogo o derivado del mismo se pueden insertar en un vector retroviral que contiene las secuencias necesarias para la expresión eficiente de los reguladores metabólicos (incluyendo los elementos de promotor y/o de aumentador que puede se pueden proporcionar por las repeticiones terminales largas virales (LTRs) o mediante un promotor/aumentador interno y las señales de empalme relevantes) , secuencias requeridas para el empacada eficiente del RNA viral en viriones infecciosas (por ejemplo, una señal de empacado (Psi), un sitio de enlace del cebador tRNA (-PBS) , una secuencia reguladora 3' requerida para la transcripción inversa (+PBS) ) y un LTRs viral) . Las LTRs contienen secuencias requeridas para la asociación del RNA genómico viral, las funciones de transcriptasa inversa e integrasa, y secuencias involucradas en dirigir la expresión del RNA genómico que es empacado en partículas virales.

Después de la construcción del vector viral retroviral recombinante, el DNA vector se introduce en una línea de células de empacado. Las líneas de células de empacado proporcionan proteínas virales requeridas en trans para el empacado de RNA genómico viral en partículas virales que tienen el intervalo deseado (por ejemplo, el núcleo codificado viral (gag) , la polimerasa (pol) y proteínas de envoltura (env) ) . El intervalo de hospedero se controla, en parte, por el tipo del producto génico de envoltura expresado sobre la superficie de la partícula viral. Las líneas de células de empacado pueden expresar productos de gen de envoltura ecotróficos, amfotrópicos o xenotrópicos . Alternativamente, la línea de células de empacado puede carecer de secuencias que codifican una proteína de envoltura viral (env) . En este caso, la línea de célula de empacado puede empacar el genoma viral en partículas que carecen de una proteína asociada con la membrana (por ejemplo, una proteína env) . Para producir partículas virales que contienen una proteína asociada con la membrana que permite la entrada del virus en una célula, la línea de células de empacado que contiene las secuencias retrovirales se puede transfectar con secuencias que codifican una proteína asociada a la membrana (por ejemplo, la proteína G del virus de estomatitis vesicular (VSV) ) . La célula empacada transfectada luego puede producir partículas virales que contienen la proteína asociada con la membrana mediante la línea de células empacadas transfectada; estas partículas virales que contienen RNA genómico viral derivado de un virus encapsidado por las proteínas de envoltura de otro virus se dice que son partículas de virus seudotipadas .

Los adenovirus son otros vectores virales que se pueden utilizar en la terapia génica. Los adenovirus son vehículos especialmente atractivos para suministrar genes a los epitelios respiratorios. Los adenovirus naturalmente infectan los epitelios respiratorios donde causan una leve enfermedad. Otros objetivos para los sistemas de suministro a base de adenovirus son el hígado, el sistema nervioso central, las células endoteliales y el músculo. Los adenovirus tienen la ventaja de que son capaces de infectar células no divisorias. Kozarsky y Wilson, Current Opinión in Genetics y Development 3:499-503 (1993) presenta una revisión de la terapia génica a base de adenovirus. Bout y colaboradores, Human Gene Therapy 5:3-10 (1994) demostraron el uso de vectores de adenovirus que transfieren genes a los epitelios respiratorios de monos rhesus. Otro vector viral preferido es un virus pox tal como virus de vaccínea, por ejemplo, una de vaccínea atenuada tal como el Virus Modificado Ankara ( VA) o NYVAC, una avipox tal como el fowl pox o canari pox. Otros casos del uso de adenovirus en la terapia génica se pueden encontrar en Rosenfeld y colaboradores, Science 252:431-434 (1991); Rosenfeld y colaboradores, Cell 68:143-155 (1992); Mastrangeli y colaboradores, J. Clin. Invest. 91:225-234 (1993); PCT Publication W094/12649; y Wang, y colaboradores, Gene Therapy 2:775-783 (1995) . En otra modalidad, se utilizan vectores lentivirales , tales como los vectores a base de VIH descritos en la Patente de los Estado Unidos No. 6,143,520; 5,665,557; y 5,981,276, que se incorporan en la presente por referencia. El uso de vectores de virus Adeno-asociados (AAV) también es contemplado (Walsh y colaboradores, Proc Soc. Exp. Biol. Med. 204:289-300 (1993); y la Patente de los Estados Unidos No. 5,436,146, que se incorporan en la presente por referencia) .

Otro procedimiento a la terapia génica involucra la transferencia de un gen a células en cultivo de tejido mediante tales métodos como electroporación, lipofección, transfección mediada con fosfato de calcio o infección viral, üsualmente, el método de transferencia incluye la transferencia de un marcador selecciónatele a las células. Las células luego se colocan bajo selección para aislar esas células que han captado y están expresando el gen transferido. Esas células luego se suministran a un paciente.

La patente de los Estados Unidos No. 5,676,954 (que es incorporada en la presente por referencia) reportan en la inyección de material genético, la formación de complejo con portadores de liposomas catiónicos, en ratones. Las Patentes de los Estados Unidos Nos. 4,897,355, 4,946,787, 5,049,386, 5,459,127, 5,589,466, 5,693,622, 5,580,859, 5,703,055, y la publicación internacional No. WO 94/9469 (que se incorporan en la presente por referencia) proporcionan lipidos catiónicos para el uso en la transfección de DNA en células y mamíferos. Las Patentes de los Estados Unidos Nos. 5,589,466, 5,693,622, 5,580,859, 5,703,055 y la publicación internacional No. WO 94/9469 (que se incorpora en la presente por referencia) proporcionan métodos para suministrar complejos de DNA-lípido catiónico a mamíferos. Tales complejos de lipidos catiónicos o nanopartículas también se pueden utilizar para suministrar proteína.

Un gen o secuencia de ácido nucleico se pueden introducir en una célula objetivo mediante cualquier método adecuado. Por ejemplo, uno o más péptidos como es descrito en la presente o un mutante, variante, análogo o derivado de los mismos los constructos se pueden introducir en una célula mediante transfección (por ejemplo, transfección mediada con fosfato de calcio o DEAE-dextrano) , lipofección, electroporacion, microinyección (por ejemplo, mediante la inyección directa de DNA desnudo) , biolistica, infección con un vector viral que contiene un transgen relacionado con el músculo, fusión de células, transferencia génica mediada por cromosomas, transferencia génica mediada por microcélula, transferencia nuclear y los similares. Un ácido nucleico que codifica uno o más péptidos como es descrito en la presente o un mutante, variante, análogo o derivado del mismo se puede introducir en las células mediante electroporacion (ver, por ejemplo, Wong y Neumann, Biochem. Biophys. Res. Commun. 107:584-87 (1982) and biolistecs (e.g. a gene gun; Johnston y Tang, Methods Cell Biol. 43 Pt A:353-65 (1994); Fynan y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. USA. 90:11478-82 (1993) ) .

En ciertas modalidades, un gen o secuencia de ácido nucleico que codifica uno o más péptidos como es descrito en la presente o un mutante, variante, análogo o derivado de los mismos se puede¦ introducir en las células objetivo mediante transfección o lipofección. Los agentes adecuados para transfección o lipofección incluyen, por ejemplo, fosfato de calcio, DEAE dextrano, lipofectina, lipfectamine, DIMRIE C, Superfect y Effectin (Qiagen) , unifectin, maxifectin, DOTMA, DOGS (Transfectam; dioctadecilamidoglicilespermina) , DOPE (1, 2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina) , DOTAP (1,2-dioleoil-3-trimetilamonio propano) DDAB (bromuro de dimetil dioctadecilamonio) , DHDEAB (bromuro de N, N-di-n-hexadecil-N, -dihidroxietil amonio), HDEAB (bromuro de N-n-hexadecil-N, -dihidroxietilamonio) , polibreno, poli (etilenimina) (PEI), y los similares. (Ver, por ejemplo, Banerjee y colaboradores, ed. Chem. 42:4292-99 (1999); Godbey y colaboradores, Gene Ther 6:1380-1388 (1999); Kichler y colaboradores, Gene Ther 5:855-60 (1998); Birchaa y colaboradores, J. Pharm 183:195-207 (1999) , incorporadas en la presente por referencia en sus totalidades) .

Métodos conocidos en la técnica para el suministro terapéutico de agentes tales como proteínas y/o ácidos nucleicos se pueden utilizar para el suministro de un polipéptido o ácido nucleico que codifica uno o más péptidos como es descrito en la presente o un mutante, variante, análogo o derivado de los mismos, por ejemplo, transfección celular, terapia génica, administración directa con un vehículo de suministro o portador farmacéuticamente aceptable, suministro indirecto al proporcionar células recombinantes que comprenden un ácido nucleico que codifica un polipéptido de fusión de dirección de la invención.

Varios sistemas de suministro son conocidos y se pueden utilizar para administrar directamente polipéptidos terapéuticos tal como el uno o más péptidos como es descrito en la presente o un mutante, variante, análogo o derivado de los mismos y/o un ácido nucleico que codifica uno o más péptidos como es descrito en la presente o un mutante, variante, análogo o derivado de los mismos, por ejemplo, encapsulación en liposomas, microparticulas, microcápsulas, células recombinantes capaces de expresar el compuesto, y endocitosis mediado por receptor (ver, por ejemplo, Wu y u, 1987, J. Biol. Chem. 262:4429-4432). Métodos de introducción pueden ser entérales o parenterales e incluyen, pero no están limitados intradérmico, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutánea, pulmonar, intranasal, intraocular, epidural y rutas orales. Los agentes se pueden administrar mediante cualquier ruta conveniente, por ejemplo mediante infusión o inyección de bolo, mediante absorción a través de revestimientos epiteliales o mucocutáneos (por ejemplo, mucosa oral, mucosa rectal e intestinal, etc.) y se pueden administrar junto con otros agentes biológicamente activos. La administración puede ser sistémica o local.

En una modalidad especifica, puede ser deseable administrar las composiciones farmacéuticas de la invención localmente al área en necesidad de tratamiento; esto se puede lograr, por ejemplo, y no a manera de limitación, mediante infusión local durante la cirugía, aplicación tópica, por ejemplo, mediante inyección, por medio de un catéter, o por medio de un implante, el implante que es de un material poroso, no poroso o gelatinoso, incluyendo membranas, tales como membranas sialásticas, fibras o sustitutos de piel comerciales .

En otra modalidad, el agente activo se puede suministrar en una vesícula, en particular un liposoma (ver Langer (1990) Science 249:1527-1533). En todavía otra modalidad, el agente activo se puede suministrar en un sistema de liberación controlado. En una modalidad, se puede utilizar una bomba (ver Langer (1990) supra) . En otra modalidad, se pueden utilizar materiales poliméricos (ver Howard y colaboradores (1989) J. Neurosurg 71:105).

De esta manera, una amplia variedad de vectores de transferencia génica/terapia génica y constructos son conocidos en la técnica. Estos vectores se adaptan fácilmente para el uso en los métodos de la presente invención. Mediante la manipulación apropiada utilizando técnicas de DNA/biología molecular recombinantes para insertar un polipéptido operativamente enlazado que codifica el segmento de ácido nucleico en el vector de expresión/suministro seleccionado, muchos vectores equivalentes para la práctica de los métodos descritos en la presente pueden ser generados.

Otras modalidades A partir de la descripción anterior, será evidente que variaciones y modificaciones se pueden hacer a la invención descrita en la presente para adoptar varias utilizaciones y condiciones. Tales modalidades también están dentro del alcance de las siguientes reivindicaciones.

La descripción también contempla un articulo de manufactura que es un recipiente etiquetado para proporcionar uno o más péptidos como es descrito en la presente o un mutante, variante, análogo o derivado de los mismos. Un articulo de manufactura comprende material de empaquetamiento y un agente farmacéutico del uno o más péptidos como es descrito en la presente o un mutante, variante, análogo o derivado de los mismos, contenido dentro del material de empaquetamiento .

El agente farmacéutico en un articulo de manufactura es cualquiera de las composiciones de la presente invención adecuadas para proporcionar el uno o más péptidos como es descrito en la presente o un mutante, variante, análogo o derivado del mismo y formular una forma farmacéuticamente aceptable como es descrito en la presente de acuerdo con las indicaciones descritas. De esta manera, la composición puede comprender el uno o más péptidos como es descrito en la presente o un mutante, variante, análogo o derivado del mismo o una molécula de DNA que es capaz de expresar tal péptido.

El artículo de manufactura contiene una cantidad de agente farmacéutico suficiente para el uso en el tratamiento de una condición indicada en la presente, ya sea en dosificaciones unitarias o múltiples. El material de empaquetamiento comprende una etiqueta que indica el uso del agente farmacéutico contenido en el mismo.

La etiqueta además puede incluir instrucciones para el uso e información relacionada como pueda ser requerido para la comercialización. El material de empaquetamiento puede incluir recipiente (s) para el almacenamiento del agente farmacéutico .

Como se utiliza en la presente, el término material de empaquetamiento se refiere a un material tal como vidrio, plástico, papel, lámina delgada y similar capaz de contener dentro del fijado de un agente farmacéutico. De esta manera, por ejemplo, el material de empaquetamiento puede ser plástico o frasquitos de vidrio, envolturas laminadas y los recipientes similares utilizados para contener una composición farmacéutica que incluye el agente farmacéutico.

En las modalidades preferidas, el material de empaquetamiento incluye una etiqueta que es una expresión tangible que describe los contenidos del artículo de manufactura y el uso del agente farmacéutico contenido en el mismo .

EJEMPLOS Ejemplo 1. Prueba del potencial anti-inflamatorio en un modelo de sepsis de ratón.

La habilidad de los fármacos de péptido se probó para su potencial para la reducción de citoquinas inflamatorias después del tratamiento con lipopolisacárido bacteriano purificado (LPS)-un componente mayor de la pared celular bacteriana de las bacterias Gram negativas. Un modelo de inflamación se utilizó en donde los ratones se inyectaron con LPS, que indujo una respuesta inmune transiente y un surgimiento de citoquinas inflamatorias en el suero. La respuesta inmune alcanza el máximo después de 90 minutos y desciende después de 24 horas. El nivel de marcadores inflamatorios en el suero claves se comparó entre los ratones tratados y no tratados con LPS 90 minutos después de la inyección.

Los inventores diseñaron 18 péptidos diferentes en base a la secuencia hAAT (Acceso # AAB59371) y han sintetizado estos utilizando la química FMOC convencional. Para estimar el potencial anti-inflamatorio y terapéutico in vivo, los péptidos se probaron en un modelo de estimulación con lipopolisacárido de ratón (LPS) con los niveles de TNFa en suero como lectura. Utilizando dexametasona como referencia, grupos de 3 animales se inyectaron con IP con 0.2 mg/kg de péptido 2 horas antes de una estimulación con LPS, y los niveles de TNFa en el suero determinado 30 min después de la estimulación con LPS, mediante ELISA. El péptido de mejor desempeño reducido los niveles de TNFa en el suero equivalentes a aquellos logrados con 1 mg/kg de dexametasona . Enseguida, se sintetizaron versiones acortadas de este péptido, se probaron en el modelo de estimulación con LPS de ratón y un péptido de 17 aminoácidos, SP16, emergió como un candidato de desarrollo principal para la caracterización adicional. Enseguida, SP16 se probó en un modelo de endotoxemia letal, el modelo de endotoxemia después de la exposición a la radiación aguda, donde las bacterias Gram negativas salen del sistema gastro-intestinal que puede causar endotoxemia letal. En este experimento, el tratamiento con péptido mejoró la supervivencia (Figura 7) . El in vitro, SP16 disminuye la activación de NFKB inducido por LPS en células THPl, consistente con el efecto anti-inflamatorio in vivo .

Los ratones se inyectaron con 0.5, 0.1, 0.02 y 0.004 mg de cada péptido. Los ratones también se trataron con dexametasona como control positivo y el vehículo como un control negativo. Dos horas después cada ratón se inyectó con LPS. Se tomaron muestras 90 minutos después de la inyección de LPS.

Los resultados se muestran en las Figuras 3 y 4. La Figura 3 muestra los niveles de TNF-a de la sangre en ratones inyectados con cada cantidad de cada péptido. La Figura 4 muestra únicamente los resultados para ratones inyectados con 0.004 mg de cada péptido.

Los resultados muestran que los péptidos descritos en la presente son efectivos en disminuir los niveles de TNF-OÍ y de esta manera son efectivos en reducir la inflamación en sujetos mamíferos.

Ejemplo 2: Péptidos clasificados en alanina en el modelo de ratón de sepsis Para evaluar el efecto de diferentes aminoácidos en el péptido SP16 para el efecto de inmunomodulación, los inventores crearon una clasificación de alanina. Los diferentes péptidos en la clasificación de alanina se muestran en la Tabla B. La Figura 10 muestra que ambos de los péptidos sustituidos con alanina N- y C-terrainalmente, donde los 3 aminoácidos más terminales se han reemplazados con alanina, pierden la mayoría de su capacidad para reducir Los niveles de TNF-alfa. Los péptidos en donde la sustitución ocurrió dentro de los aminoácidos 4-14 de SP16, se presentan que mantienen y más bien mejoran su capacidad para reducir los niveles de TNF-alfa comparado con el control de dexametasona . El modelo de ratón de LPS es un modelo establecido para sepsis en humanos y de esta manera los inventores concluye que los péptidos en donde los aminoácidos 1-3 y 15-17 están presentes, se pueden utilizar de manera efectiva en humanos para tratar o prevenir la sepsis en condiciones, tales como quemaduras o radiación aguda, que exponen a los humanos a un alto riesgo de desarrollar endotoxemia .

Ejemplo 3. Prueba del potencial anti-inflamatorio en un modelo de artritis inducido por anticuerpo de colágeno (CAIA) de la artritis reumatoide.

La habilidad de los fármacos de péptido se probó para su potencial para reducir la inflamación y el edema de pata en un modelo de artritis de ratón: el modelo CAIA. Los ratones Balb/c se inyectaron con un cóctel de anticuerpos de colágeno en el Dia 0 y recibieron un refuerzo de LPS en el Día 3. Después del refuerzo de LPS, el hinchamiento de la pata se registró para cada pata. Para los resultados mostrados en la Figura 5, los animales se dosificaron con 0.2 mg/kg del péptido expuesto en SEC ID N0:1 (también referido como SP16) , diariamente. En la Figura 6, los ratones de Balb/c se inyectaron intravenosamente con un cóctel de anticuerpos de colágeno (MD BioSciences) en el Dia 0 y se inyectaron intraperitonealmente con LPS en el Dia 3. El hinchamiento de la pata se determinó en los días 0, 3, 4, 5, 6 y 7, y la gráfica muestra los registros acumulativos para todas las patas de cada grupo experimental de 5 animales. El control no tratado no recibió el cóctel CAIA o LPS. El grupo simulado recibió tanto el cóctel de anticuerpos como el refuerzo de LPS. La dexametasona se administró diariamente en 1 mg/kg. El péptido expuesto en la SEQ ID N0:1 en agua y se administró intraperitonealmente, en 0.6 mg/kg diariamente, o una dosis en un tiempo de 0.6 mg/kg en el día 3.

La Figura 9 muestra la eficacia de SP16 en el modelo de ratón CAIA preclínico de RA. La gráfica resume los datos de un estudio en el modelo CAIA RA de ratón. La gráfica muestra los registros de hinchamiento acumulativos para todas las patas en el pico de la enfermedad (Día 7) para grupos de 5 animales. Los ratones de Balb/c se inyectaron intravenosamente con un cóctel de anticuerpo de colágeno (MD Biosciences) en el Día 0 y se inyectaron intraperitonealmente con LPS en el Día 3. Los animales de control normales no recibieron inyecciones y sirvieron como el control de línea de base libre de enfermedad. Los inventores muestran que la inyección de SP16 diaria proporcionó protección equivalente a Dexametasona .

Como se muestra en las Figuras 5, 6 y 9 el péptido: VKFNKPFVFLMIEQNTK (SEQ ID NO: 1) es un agente antiinflamatorio y/o inmuno-modulador efectivo en el modelo de sepsis.

Ejemplo 4: SP16 mejora el control glucémico en la diabetes tipo II del modelo db/db Favorecido por la sepsis y los datos de RA, los inventores plantearon como hipótesis si SP16 protegería los ratones db/db, un modelo de diabetes tipo II (T2D ) , de la pérdida de célula ß inducida por gluco- y lipotoxicidad y reduce la resistencia a la insulina (25, 39) . Para probar esta hipótesis, se diseñó un estudio y se ejecutó en animales db/db. Los inventores iniciaron un estudio en el modelo db/db de T2DM debido a que es más fácil de manejar (debido a la sincronización y el inicio sincronizado de la diabetes explícita) y de esta manera más efectivo en costo que un estudio en ratones NOD.

En el modelo db/db, el tratamiento con SP16 dio por resultado los niveles de glucosa en la sangre no en ayunas y HbAlc disminuidos, niveles de C-péptido incrementados y tolerancia a la glucosa mejorada (Figura 8) . La tolerancia a la glucosa en la sangre no en ayunas y la tolerancia a la glucosa se mejoraron sobre el grupo de control de vehículo, aunque el grupo de rosiglitazona mostró mejores valores que el grupo SP16. Con untamente, estos datos muestran que el tratamiento con SP16 mejoró el control glucémico en un modelo de diabetes tipo II no establecido.

Estos datos, junto con los resultados de Sepsis y RA, muestran que SP16 posee las propiedades antiinflamatorias e inmuno-moduladoras de la proteína parental hAAT, para de esta manera proporcionar una manera de tratamiento mucho más efectiva en costo ya que el tamaño del fragmento de péptido recientemente descubierto es significativamente más pequeño que aquel de Hatt.

Ejemplo 5: El Péptido SP16 es un Agonista del Receptor Similar a Toll-2 El receptor similar a Toll 2 (TLR-2) desempeña una función en el sistema inmune y es un miembro de la familia de receptores similares a Toll (TLR) que desempeña una función fundamental en el reconocimiento de patógenos y la activación de la inmunidad innata. El gen TLR-2 se expresa más abundantemente en leucocitos de sangre periférica, y se ha mostrado que media la respuesta del hospedero a las bacterias Gram-positivas y levadura por la via de la estimulación de NF-kappaB.

Los datos de los inventores de las lineas de células diseñadas muestran que SP16 activa la ruta de señalización de TLR-2, pero no la señalización de TLR-4. Esto es interesante debido a que otro péptido inmuno modulador, DiaPep277, que no comparte similitud de secuencia con SP16, tiene un perfil de activación de TLR similar. Sin desear que sea limitado por una teoría, en base a estas observaciones, los inventores sugieren que SP16 actúa a través de un receptor TLR2, y posiblemente el receptor de células T, para inducir la secreción de citoquina a un perfil de citoquina anti-inflamatoria Th2 (IL-4 e IL-10) . En enfermedades autoinmunes, SP16 se predice que induce la expansión de las poblaciones de células T reguladoras y de esta manera desplaza la respuesta inflamatoria hacia una respuesta reguladora.

Específicamente, la Figura 11 muestra que SP16 es un agonista de TLR2. La gráfica que resume los datos de un experimento con una línea de células indicadora de TLR-2 diseñada (HEK-BLUE™ mTLR2, Invivogen) . Las células se incubaron con las concentraciones indicadas del péptido durante 24 horas. En la activación de TLR2, las células secretan fosfatasa alcalina que puede ser ensayada. El ensayo se hice por triplicado y se grafican los promedios con desviaciones estándares. SP16 exhibió propiedades de ligando de TLR-2, que induce la señalización de TLR-2 de una manera dependiente de dosis. El péptido de control revuelto o mezclado (SP34) no mostró inducción de TLR2. *p<0.05, comparado con el control revuelto (SP34) .

La Figura 12 muestra el análisis de relación de actividad de estructura para SP16. La gráfica que resume los datos de un experimento donde una línea de células indicadoras de TLR-2 diseñada (HEK-Blue™ mTLR2 , Invivogen) se utilizó para probar el impacto de la sustitución de residuos de aminoácido del péptido SP16 con alanina ("escaneo de alanina") . Las células se incubaron con 20 g/ml de los péptidos indicados durante 24 horas. En la activación de TLR2, las células secretan fosfatasa alcalina que puede ser ensayada. El ensayo se hizo por triplicado y se grafican los promedios. Las secuencias de péptidos se muestran en la siguiente figura *p<0.05, comparado con el control revuelto (SP34) .

La Figura 13 muestra el análisis de relación de actividad de estructura de SP16. La tabla que muestra las secuencias de aminoácidos de péptidos se probaron utilizando una linea de células indicadoras de TLR-2 (ver los datos en la Figura 12). El lado derecho de la tabla resume el impacto de los péptidos en la señalización de TLR-2 (* indica bajo, ***** indica alto, N/A no tuvo impacto en la señalización) .

Los datos sugieren que los primeros tres residuos contribuyen a inducir la señalización de TLR-2. Si los residuos 1-3 son sustituidos con alaninas (SP37), el péptido mutante no tiene impacto sobre TLR2. Sin embargo, cuando se sustituyen individualmente (SP52-SP54), los péptidos retienen la habilidad para estimular TLR-2. De manera sorprendente, la sustitución del residuo de fenil alanina en la posición 3 con un residuo de alanina más pequeño aumenta la habilidad para estimular la señalización de TLR-2 comparado con SP16.

Claims (36)

REIVINDICACIONES

1. Una composición, caracterizada porque comprende un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la fórmula: X1-Z1-F-N-K-P-F-X2-Z2-X3-Z3-Q (SEQ ID NO: 2) en donde XI es V o L; X2 es V, L o M; X3 es M, l o V; Zl es cualquier aminoácido; Z2 es una secuencia de cualquiera de dos aminoácidos; y Z3 es una secuencia de cualquiera de cinco aminoácidos, y donde el péptido comprende 37 o menos aminoácidos.

2. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el péptido además comprende por lo menos un segundo péptido o proteina.

3. La composición de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque el por lo menos un segundo péptido o proteina es una etiqueta de epitopo o un extendedor de vida media o ambos.

4. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, caracterizada porque el péptido comprende uno o más D-aminoácidos .

5. La composición de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada porque la composición además comprende un portador farmacéuticamente aceptable.

6. La composición de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque el péptido comprende una secuencia de aminoácidos VKFNKPFVFLMIEQNTK (SEQ ID NO: 1) .

7. Una composición, caracterizada porque comprende un péptido que consiste esencialmente de la secuencia de aminoácidos X1-Z1-F-N-X2-P-F-X3-Z2-X4-Z3-X5 (SEQ ID NO: 3), en donde XI es V o L; X2 es K o R; X3 es V, L o M; X4 es H, l o V; X5 es K o Q; Zl es cualquier aminoácido; Z2 es una secuencia de cualquiera de dos aminoácidos ; Z3 es una secuencia de cualquiera de cinco aminoácidos; y en donde el péptido causa un 75% de disminución en los niveles de TNF-a en el suero cuando se administra en una cantidad efectiva a un sujeto humano.

8. La composición de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada porque el péptido consiste de 35 residuos de aminoácido o menos.

9. La composición de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada porque el péptido consiste de 22 residuos de aminoácido o menos.

10. La composición de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada porque el péptido consiste de 21 residuos de aminoácido o menos.

11. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 7-10, caracterizada porque además comprende por lo menos una segunda proteina o péptido.

12. La composición de conformidad con la reivindicación 11, caracterizada porque la por lo menos una segunda proteina o péptido se une al péptido como un péptido de fusión.

13. La composición de conformidad con la reivindicación 11, caracterizada porque el por lo menos un segundo péptido o proteina comprende una etiqueta de epitopo o un extendedor de vida media o ambos .

14. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 7-13, caracterizada porque el péptido comprende uno o más D-aminoácidos .

15. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 7-14, caracterizada porque la composición además comprende un portador farmacéuticamente aceptable .

16. Una composición, caracterizada porque comprende un péptido que consiste esencialmente de la secuencia de aminoácidos RFNRPFLR (SEQ ID NO: 4) .

17. Una composición, caracterizada porque comprende un péptido que consiste esencialmente de la secuencia de aminoácidos de RRRFNRPFLRRR (SEQ ID NO: 8).

18. Una composición, caracterizada porque comprende un péptido que consiste esencialmente de la secuencia de aminoácidos de VKFNKPFVFLMIEQNTK (SEQ ID NO: 1) .

19. Una composición, caracterizada porque comprende un péptido que consiste esencialmente de la secuencia de aminoácidos de FNRPFL (SEQ ID NO: 10) .

20. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 16-19, caracterizada porque el péptido además comprende por lo menos un segundo péptido o proteina.

21. La composición de conformidad con la reivindicación 20, caracterizada por el por lo menos un segundo péptido o proteina es una etiqueta de epitopo o un extendedor de vida media o ambos.

22. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 16-21, caracterizada porque por lo menos uno de los aminoácidos es un D-aminoácido .

23. Un método para disminuir los niveles de TNF-en el suero en un sujeto, caracterizado porque comprende administrar al sujeto la composición de cualquiera de las reivindicaciones 1-22.

24. El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque el sujeto se administra con la composición en una cantidad que da por resultado por lo menos 50% de reducción de los niveles de TNF-a comparado con los niveles de TNF-a en el sujeto antes de administrar el péptido .

25. El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque la reducción de los niveles de TNF-a es por lo menos 75%.

26. El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque el sujeto es un mamífero.

27. El método de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque el mamífero es un humano.

28. Un método para mejorar el control glucémico en un sujeto que tiene hiperglucemia, caracterizado porque comprende administrar al sujeto que tiene hiperglucemia la composición de cualquiera de las reivindicaciones 1-22.

29. Un método para reducir un riesgo de endotoxemia en un sujeto expuesto a quemaduras o radiación, caracterizado porque comprende administrar al sujeto la composición de cualquiera de las reivindicaciones 1-22.

30. Un método para tratar fibrosis cística en un sujeto, caracterizado porque comprende administrar al sujeto la composición de cualquiera de las reivindicaciones 1-22.

31. Un método para tratar una condición inflamatoria en un sujeto humano seleccionada de diabetes tipo II, lupus, enfermedad de injerto contra hospedero, uveitis, eczema, psoriasis, fibrosis quistica, artritis reumatoide, síndrome de radiación aguda, pacientes quemados, enfermedad de intestino inflamatorio y diabetes tipo I de nuevo inicio, caracterizado porque comprende administrar al sujeto humano la composición de cualquiera de las reivindicaciones 1-22, o una combinación de las mismas en un portador farmacéuticamente aceptable.

32. Uso de cualquiera de los compuestos de las reivindicaciones 1-22 o cualquier combinación de los mismos, caracterizado porque es para el tratamiento de diabetes tipo II, lupus, enfermedad de injerto contra hospedero, uveitis, eczema, psoriasis, fibrosis cística, artritis reumatoide, síndrome de radiación aguda, pacientes quemados, enfermedad de intestino inflamatorio y diabetes tipo I de nuevo inicio.

33. Uso de cualquiera de los compuestos de las reivindicaciones 1-22 o cualquier combinación de los mismos, caracterizado porque es para mejorar el control glucémico en un sujeto que tiene hiperglucemia .

34. Uso de cualquiera de los compuestos de las reivindicaciones 1-22 o cualquier combinación de los mismos, caracterizado porque es para reducir un riesgo de endotoxemia en un sujeto expuesto a quemaduras o radiación.

35. Uso de cualquiera de los compuestos de las reivindicaciones 1-22 o cualquier combinación de los mismos, caracterizado porque es para tratar fibrosis cistica en un sujeto.

36. Uso de. cualquiera de los compuestos de las reivindicaciones 1-22 o cualquier combinación de los mismos, caracterizado porque es para reducir los niveles de TNF-alfa en un sujeto.