MX2014010318A - Metodo de inmunoanalisis cromatografico mutiplexado para la caracterizacion de inmunocomplejos circulantes. - Google Patents

Abstract

En la presente se reporta un método para analizar/caracterizar los complejos inmunes circulantes (CICs) formados in vivo que comprende una cromatografía por exclusión de tamaño, de una muestra obtenida de un mamífero al cual se le ha administrado el fármaco al menos una vez para determinar el peso/tamaño de los inmunocomplejos, opcionalmente una segunda cromatografía diferente a la SEC, y al menos un inmunoanálisis, por medio de esto el complejo inmune se caracteriza por la correlación del tamaño del complejo inmune y el resultado/lectura del inrnunoanálisis. También se reporta en la presente el uso de un método para determinar una correlación de la farmacocinética alterada, para determinar la pérdida o reducción de eficacia, para determinar la neutralización de las contrapartes naturales del fármaco, para determinar las reacciones inmunes y de hipersensibilidad, que incluyen la enfermedad del suero/reacción de hipersensibilidad tipo III/enfermedad mediada por complejos inmunes.

Description

METODO DE INMU OANALISIS CROMATOGRAFICO MULTIPLEXADO PARA LA CARACTERIZACION DE INMÜNOCOMPLEJOS CIRCULANTES CAMPO DE LA INVENCION En la presente se reporta un método para la detección y caracterización (tamaño y composición) de inmunocomplejos circulantes en matrices biológicas por medio de un método de pasos múltiples que comprende una cromatografía por exclusión de tamaño (SEC, por sus siglas en inglés) y un inmunoanálisis .

ANTECEDENTES DE LA INVENCION La mayoría de las terapias biológicas pueden inducir respuestas inmunes indeseables con posibles consecuencias en seguridad y eficacia por medio de esto estas respuestas varían en la frecuencia y severidad (Buttel, I.C. et al., Biologicals 39 (2011) 100-109; COMMITTEE FOR MEDICINAL PRODUCTS FOR HUMAN USE (CHMP) , EMEA Guías en Immunogenicity Assessment of Biotechnology-derived Therapeutic Proteins, http : //www . emea . europa . eu (2007)).

La formación de anticuerpos anti-fármaco (ADA, por sus siglas en inglés) puede originar farmacocinética alterada, pérdida o reducción de eficacia, neutralización de contrapartes naturales así como también reacciones generales inmunes y de hipersensibilidad, que incluye enfermedad del suero/reacción de hipersensibilidad del tipo Ill/enfermedad Ref. 249678 mediada por el complejo inmune (Buttel, I.C. et al., Biologicals 39 (2011) 100-109; COMMITTEE FOR MEDICINAL PRODUCTS FOR HUMAN USE (CHMP) , EMEA Guías en Immunogenicity Assessment of Biotechnology-derived Therapeutic Proteins, htt : //www. emea . europa . eu (2007) ) .

El síndrome similar a la enfermedad del suero, como resultado de la formación de complejos ADA-D, es un caso adverso bien conocido y se ha reportado una variedad de compuestos biológicos en los estudios preclínicos (Ponce, R. et al., Regul . Toxicol . Pharmacol . 54 (2009) 164-182) y en práctica clínica (COMMITTEE FOR MEDICINAL PRODUCTS FOR HUMAN USE (CHMP) , EMEA Guías en Immunogenicity Assessment of Biotechnology-derived Therapeutic Proteins, http : //www . emea . europa . eu (2007); Dreyfus, D.H. et al., Ann. Allergy Asthma Immunol. 96 (2006) 624-627; Gamarra, R.M., J. Emerg. Med. 30 (2006) 41-44; Goto, S. et al., Int. J. Hematol. 89 (2009) 305-309; Hansel, T.T. et al., Nat . Rev. Drug. Discov. 9 (2010) 325-338; Pilette, C. et al., J. Alergy Clin. Immunol. 120 (2007) 972-973; Tamilvanan, S. et al, J. Drug Target 18 (2010) 489-498) .

Para los fármacos vendidos, las características de las reacciones principales tal como la enfermedad del suero o reacciones alérgicas severas se diagnostican clínicamente. En casos donde los casos adversos después de la administración del mAb implicados, las reacciones se atribuyen a una respuesta del anticuerpo (COMMITTEE FOR MEDICINAL PRODUCTS FOR HUMAN USE (CHMP) , EMEA Guías en Immunogenicity Assessment of Biotechnology-derived Therapeutic Proteins, http://www. emea . europa . eu (2007)). Por supuesto, solo pueden encontrarse datos muy limitados donde la formación de ADAs se investigaron y correlacionado con las señales observadas clínicamente (Goto, S. et al., Int. J. Hematol . 89 (2009) 305-309) .

Dada la gravedad potencial de la inmunogenidad, la EMEA enfatizó la importancia de la confirmación y caracterización de la formación ADA (COMMITTEE FOR MEDICINAL PRODUCTS FOR HUMAN USE (CHMP) , EMEA Guías en Immunogenicity Assessment of Biotechnology-derived Therapeutic Proteins, http ://www, emea . europa . eu (2007) ) .

La evaluación de la inmunogenidad se realiza típicamente utilizando pruebas inmunológicos que se diseñan para detectar ADAs (Mire-Sluis, A.R. et al., J. Immunol . Methods 289 (2004) 1-16; Shankar, G. et al., J. Pharm. Biomed. An l. 48 (2008) 1267-1281; Koren, E. et al., J. Immunol. Methods 333 (2008) 1-9) .

La información de la incidencia de ADA, sin embargo, hasta ahora permite una correlación profunda con resultados clínicos y farmacocinética alterada.

La cantidad y tamaño de los complejos de ADA-fármacos formados es dependiente de varios parámetros, p.ej., relación/concentración ADA y fármaco así como también epítopo y valencia (Abbas, A.K. y Lichtman, A.H., las Enfermedades causadas por las respuestas de inmunidad: Hypersensitivity and Autoummunity, in: Saunders (2003); Murphy, K. et al., Janeway's Immunobiology, in Garland Science, Taylor & Francis Group, LCC (2008) ) .

El tamaño del complejo y la carga es un determinante importante de la claridad del complejo o inducción de los eventos adversos. Típicamente, complejos más grandes se eliminan por el sistema retículo-endotelial , los complejos pequeños generalmente no activan la inflamación, mientras los complejos de tamaño intermedio pueden fijar el complemento y pueden originar daño en el tejido (Abbas, A.K. y Lichtman, A.H., las Enfermedades causadas por las respuestas inmunes: Hipersensibilidad y Autoinmunidad, en: Saunders (2003); Murphy, K. et al., Janeway's Immunology, en Garland Science, Taylor & Francis Group, LLC (2008); Mannik, M . , Serum Sickness and pathophysiology of immune complexes, en: Clinical Immunology: Principies and Practices, Rich R.R. , Fleisher T.A.S.B.D., Shearer W.T., Strober W. (eds.) 1062-1071 (1996); Sicherer, S.H., Leung D.Y.M., Serum Sickness, en: Nelsons textbook of pediatrics, Kliegman R.M. , Behrman R.E., Jenson H.B.J., Stanton B.F. (eds.), Saunders Elsevier, pp. 985-986 (2007) . Además, la carga de los complejos es un factor importante para el depósito de tejido de los complejos (Abbas, A.K. y Lichtman, A.H., Enfermedades Causadas por las respuestas i munes: Hipersensibilidad y Autoinmunidad, en: Saunders (2003); Mannik, M. , Serum Sickness and pathophysiology of immune complexes, en: Clinical Immunology: Principies and Practices, Rich R.R., Fleisher T.A.S.B.D., Shearer W.T., Strober W. (eds.) 1062-1071 (1996)).

Para una evaluación profunda de una respuesta ADA, los complejos ADA- fármacos potencialmente formados deben caracterizarse con relación al tamaño y carga. Además, si existe una contraparte endógena del fármaco, la información de si las ADAs formadas tienen reactividad cruzada con estas moléculas y si las contrapartes endógenas también son parte del complejo es una información valiosa. Además, la caracterización estructural del antígeno/fármaco en los inmunocomplejos proporciona información de la patogénesis.

Coyle et al., reporta la detección y aislamiento de los inmunocomplejos en el fluido cerebroespinal con esclerosis múltiple (Journal of Neuroimmunology 15 (1987) 97-107) . Cromatoenfoque combinado con la técnica ELISA - se reporta un método sensible para el análisis de los inmunocomplejos por Kneba, M . , et al., (J. Immunol . eth. 61 (1983) 233-243). Matousovic, K. , et al., reporta los inmunocomplejos que contienen IgA en la orina de los pacientes con neuropatía IgA (Nephrology Dialysis Transplantation 21 (2006) 2478-2484) . Los inmunocomplejos circulantes en conejos que sobreviven a la infección por virus de la peste bovina se reporta por Rattan, B . , et al. (Acta Vir. 38 (1994) 105-110). En el documento WO 2008/031532 se reporta una prueba de anticuerpo anti-fármaco . Stubenrauch, K. , et al., reporta la evaluación de un inmunoanálisis genérico con la tolerancia del fármaco para detectar los inmunocomplejos en las muestras de suero de los simios cynomolgus (macacos cangrejeros) después de la administración de anticuerpos de humano (J. Pharm. Biomed. Anal. 52 (2010) 249-254). En el documento WO 2011/056590 se reportan pruebas para la detección de fármacos anti-TNF y anticuerpos. Wang Shui Long et al . , reporta el análisis de los anticuerpos anti-f rmacos (ADA) a Adalimumab en el suero de pacientes que utilizan una prueba con cambio de movilidad homogénea (Am. J. Gastroent . 105 (Sup 1, 2010) S444-S445) . En el documento EP 2 354 792 se reporta un método para detectar anticuerpos anti- fármaco. Lambert, P.H., et al., reportan un estudio colaborador WHO para la evaluación de dieciocho métodos para detectar inmunocomplejos en el suero (J. Clin. Lab. Immunol. 1 (1978) 1-15). Se reportan métodos para medir los inmunocomplejos circulantes por Levinson, S.S. et al., (Clin. Immunol. Newsletter 3 (1987) 39-42).

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION Se ha encontrado que con un método para la detección y caracterización (tamaño y composición) de inmunocomplejos circulantes p.ej., complejos que contienen ADAs contra un fármaco dado, en matrices biológicas que comprenden un método de etapas múltiples utilizando cromatografía por exclusión de tamaño (SEC) en combinación al menos con un inmunoanálisis, puede hacerse una correlación a la farmacocinética alterada, pérdida o reducción de eficacia, neutralización de las contrapartes naturales así como también reacciones de inmunidad e hipersensibilidad generalizadas, que incluyen enfermedad del suero/reacción de hipersensibilidad del tipo III/enfermedad mediadas por inmunocomplejos .

Un aspecto como se reportó en la presente es un método para analizar/caracterizar un inmunocomplejo circulante (CIC, por sus siglas en inglés) formado in vivo que comprende a) una cromatografía por exclusión de tamaño de una muestra obtenida de un mamífero al cual se ha administrado un fármaco al menos una vez para determinar el peso/tamaño del inmunocomplej o, b) opcionalmente una segunda cromatografía que no es SEC, c) al menos un inmunoanálisis, y d) opcionalmente un análisis a base de espectrometría de masas, por medio de esto el inmunocomplejo se caracteriza por la correlación del tamaño del inmunocomplejo y el resultado/lectura de la prueba de inmunoanálisis o espectrometría de masas. un aspecto como se reporta en la presente es un método para determinar por análisis para determinar un inmunocomple o de anticuerpo anti-fármaco con complejo que comprende un polipéptido terapéutico (exógeno) y un anticuerpo anti-fármaco endógeno formado in vivo que comprende a) una cromatografía por exclusión de tamaño de una muestra obtenida de un mamífero al cual se ha administrado un fármaco al menos una vez para determinar el peso/tamaño del inmunocomplejo, b) opcionalraente una segunda cromatografía que no es SEC, c) al menos un inmunoanálisis heterogéneo para detectar el anticuerpo anti-fármaco, y d) y opcionalmente un análisis a base de espectrometría de masas, por medio de esto el inmunocomplejo se caracteriza por la correlación del tamaño del inmunocomplejo y el resultado/lectura de la prueba de inmunoanálisis o espectrometría de masas. por medio de esto el polipéptido terapéutico es un polipéptido terapéutico sintético o que no se presenta naturalmente .

En una modalidad de todos los aspectos la muestra es suero o fluido cerebroespinal .

En una modalidad de todos los aspectos el inmunocomplejo es un inmunocomplejo específico para el fármaco.

Un inmunocomplej o para un fármaco específico comprende un fármaco junto con otras moléculas que no son fármacos.

En una modalidad de todos los aspectos el inmunoanálisis se selecciona del grupo que comprende la prueba de detección del anticuerpo anti -fármaco, prueba de detección del anticuerpo neutralizante del fármaco, prueba farmacocinética (prueba de cuantificación del fármaco) , prueba de pictograma del anticuerpo, prueba para determinar la reactividad cruzada-ADA con la contraparte del fármaco endógeno (si el fármaco comprende una parte que también puede presentarse endógenamente en el mamífero) , la prueba de enlace del complemento (capacidad de enlace del complemento o enlace del complemento) , prueba para determinar la contraparte endógena del fármaco comprendida en el inmunocomplej o (si el fármaco comprende una parte que también se presenta endógenamente en el mamífero) .

En una modalidad de todos los aspectos el inmunoanálisis es un inmunoanálisis homogéneo o un inmunoanálisis heterogéneo. En una modalidad el inmunoanálisis es un radioinmunoanálisis (RIA, por sus siglas en inglés) , o un inmunoanálisis enzimático (EIA, ELISA, EMIT) , o un inmunoanálisis de polarización por fluorescencia (FPIA) , o un inmunoanálisis de luminiscencia (LIA) , o un inmunoanálisis inmunoradiométrico (IRMA) , o un inmunoanálisis enzimático por microperlas (MEIA) , o un análisis de fluorescencia por enlace enzimático (ALFA) , o un inmunoanálisis de lecitina-enzima (LEIA) , o un análisis de inmunofluorescencia (IFA) , o un análisis de electroquimioluminiscencia (ECLIA) , o un análisis de electroquimioluminiscencia inmunomagnética (IMECL) , o un análisis quimioluminiscencia por marcas de inmunoenlace (CDIA) , o un análisis de turbidez, o un análisis de inmunoturbidez mejorado por partículas. En una modalidad el inmunoanálisis es un análisis de inmunoadsorción enzimática (ELISA) o un análisis de electroquimioluminiscencia (ECLIA) , o un análisis de marcas por inmunoenlace con electroluminiscencia (CDIA) , o un inmunoanálisis de polarización por fluorescencia (FPIA) , o un análisis de turbidez, o un análisis de imunoturbidez mejorada por partículas .

En una modalidad de todos los aspectos la segunda cromatografía que no es SEC es una cromatografía de intercambio iónico (cromatografía de intercambio catiónico o aniónico) , o una cromatografía de fase inversa, o una cromatografía de interacción hidrofílica (HILIC) , o una cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC) , o una cromatografía de interacción por carga hidrofóbica (HCIC) , o una cromatografía de material con acceso restringido (RAMC) .

En una modalidad de todos los aspectos la cromatografía por exclusión de tamaño es una cromatografía por exclusión de tamaño con la recolección del eluato en fracciones. En una modalidad cada una de las fracciones se analizó en el inmunoanálisis .

En una modalidad de todos los aspectos al menos una de las fracciones de cromatografía por exclusión de tamaño se separó más por medio de una segunda cromatografía diferente a SEC con recolección del eluato en las alícuotas. En una modalidad cada una de las fracciones se analizó en el inmunoanálisis. En una modalidad cada una de las fracciones de la cromatografía por exclusión de tamaño se analizó por medio de la segunda cromatografía diferente a SEC.

En una modalidad de todos aspectos la fracción es una alícuota .

En una modalidad de todos los aspectos el inmunoanálisis es un análisis inmunoabsorbente enzimático.

En una modalidad de todos los aspectos al menos un inmunoanálisis es uno o dos o tres, o cuatro, o cinco o seis inmunoaná1isis .

En una modalidad de todos los aspectos, el inmunoanálisis es un inmunoanálisis por anticuerpo anti-fármaco.

En una modalidad de todos los aspectos uno de los inmunoanálisis es un análisis inmunoabsorbente enzimático.

Un análisis inmunoabsorbente enzimático que forman puentes positivos denota que el anticuerpo anti -fármaco fue parte de un complejo ADA-D. La detección de un anticuerpo anti-fármaco en fracciones de peso molecular más alto, es decir en las primeras fracciones de elución de la cromatografía de exclusión de tamaño, denota que el anticuerpo anti-fármaco fue parte de un complejo con peso molecular más alto.

En una modalidad de todos los aspectos un análisis inmunoabsorbente enzimático es un análisis de complejos para la detección de complejos ADA-D. En una modalidad el análisis de complejos comprende un anticuerpo que captura fármacos específicos y un anticuerpo específico de anti-especies como anticuerpo de detección.

En una modalidad de todos los aspectos uno de los inmunoanálisis es un análisis directo para la detección de anticuerpos anti-fármaco que se unen con el fármaco y/o con la contraparte endógena del fármaco. En una modalidad el análisis directo comprende como molécula de captura el fármaco inmovilizado o contraparte endógena del fármaco y un anticuerpo específico anti-especie como anticuerpo de detección.

El análisis directo emplea la formación de un equilibrio del anticuerpo anti-fármaco que se une con el fármaco y/o la contraparte endógena en un fármaco simple e inmovilizado, después que se ha eliminado el anticuerpo anti-fármaco libre por la cromatografía por exclusión de tamaño.

En una modalidad de todos los aspectos el recubrimiento de la superficie del fármaco es un recubrimiento denso de la superficie del fármaco.

Por muy densa que sea el recubrimiento superficial se efectúa el cambio de equilibrio hacia el enlace con el fármaco enlazado a la superficie (utilizando la avidez del anticuerpo anti-fármaco) .

En una modalidad de todos los aspectos la muestra se incuba en el inmunoanálisis durante un periodo de tiempo desde 16 a 32 horas.

Un aspecto como se reporta en la presente es un método para la separación del fármaco de los complejos ADA-D a fin de incrementar la tolerancia del fármaco de los análisis ADA/inmunoanálisis subsiguiente. De la misma forma los métodos como se reportan en la presente pueden usarse para incrementar la tolerancia al fármaco de los inmunoanálisis.

Un aspecto como se reporta en la presente es un método para la caracterización de complejos anticuerpo- fármaco (ADA-D) anti-fármaco formado in vivo comprende a) una cromatografía por exclusión de tamaño de una muestra obtenida de un mamífero al cual se le ha administrado el fármaco al menos una vez para determinar el peso/tamaño de los complejos de ADA-D, b) al menos un análisis de inmunoabsorbencia enzimática para la detección de anticuerpos anti - fármaco, por medio de esto el complejo inmune se caracteriza porque es - un complejo de bajo peso molecular por un análisis inmunoabsorbente enzimático y un peso entre aproximadamente 150 kDa y alrededor de 400 kDa, - un complejo con peso molecular medio por medio de un análisis inmunoabsorbente y un peso entre aproximadamente 400 kDa y alrededor de 1,500 kDa, o - un complejo de alto peso molecular por medio de un análisis inmunoabsorbente enzimático y un peso entre aproximadamente 1,500 kDa y alrededor de 7,000 kDa.

Un aspecto como se reporta en la presente es el uso de un método como se reporta en la presente para la correlación de características del complejo inmune o farmacocinética alterada .

Un aspecto como se reporta en la presente es el uso de un método como se reporta en la presente para determinar la reducción de eficacia de un fármaco.

Un aspecto como se reporta en la presente es el uso de un método como se reporta en la presente para determinar la neutralización de contrapartes naturales del fármaco.

Un aspecto como se reporta en la presente es el uso de un método como se reporta en la presente para determinar las reacciones inmunes y de hipersensibilidad contra el fármaco.

Un aspecto como se reporta en la presente es el uso de u método como se reporta en la presente para determinar el depósito de glomérulos IgG.

En una modalidad de todos los aspectos la reacción inmune y de hipersensibilidad es una enfermedad del suero/reacción de hipersensibilidad del tipo III/enfermedad mediada por el complejo inmune.

Un aspecto como se reporta en la presente es el uso de un método como se reporta en la presente para determinar la presencia del anticuerpo autoinmune que comprende complejos inmunes .

Un aspecto como se reporta en la presente es el uso de una reivindicación de un método como se reporta en la presente para determinar la presencia del fármaco modificado/en complejo.

En una modalidad de todos los aspectos el fármaco es un anticuerpo de humano o humanizado.

Figura 1 La cinética de un complejo fármaco ADA-D (1 mg fármaco y 1 mg ADA) Figura 2 cinética como se muestra en la Figura 1 con más adición de ADA.

Figura 3 Los diagramas de la SEC reconstituida de ejemplificación y los resultados de ELISA como se obtienen con el método reportado en la presente .

Figura 4 La ampliación de la SEC reconstituida como muestra en la Figura Figura 5 La fuente de concentración del fármaco aplicado en el plasma de cinco monos (dosis = 100 mg/kg, aplicación reportada, aplicada el día 17 del estudio) .

Figura 6 Animales positivos con del depósito de IgG (evaluación semi -cuantitativa) .

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION Definiciones El término "anticuerpo anti-fármaco" denota un anticuerpo, que se dirige contra una región antigénica del fármaco. Esta región antigénica puede ser una secuencia de aminoácido antigénico del fármaco, o glicoestructura del fármaco. En una modalidad el anticuerpo anti-fármaco se dirige contra una modificación secundaria del fármaco que resulta de la producción recombinante del anticuerpo del fármaco en células que no son de humano, tal como, células CHO, células HEK, células BHK. Generalmente anticuerpos antifármaco se dirigen contra una región antigénica de un fármaco que se reconoce por el sistema inmune de un animal al que se administra el fármaco. Este anticuerpo anti-fármaco es un "anticuerpo anti-fármaco específico" . Los fármacos se diseñan para comprender unas cuantas regiones antigénicas posibles. Por ejemplo, los fármacos planeados para el uso en humanos pueden humanizarse previo a la aplicación a un paciente humano a fin de minimizar la generación de una respuesta inmune contra el fármaco. Esta respuesta inmune sería en forma de anticuerpos anti-fármaco que se dirigen contra partes no humanas de un fármaco humanizado (véase p.ej., Y. et al., FASEB J. 9(1995) 43-49).

El término "cromogenes" denota grupos y tintes fluorescentes o luminiscentes.

El término "etiqueta detectable" denota enzimas, grupos o partículas metálicas reactivas por RMN, haptenos, tal como, p.ej., digoxigenina . La etiqueta detectable también puede ser un grupo de reticulación fotoactivo, tal como un grupo azido o azirina. Los quelatos metálicos que pueden detectarse por electroquimioluminiscencia también se prefieren grupos que emiten señales, con particular preferencia que se da a los quelatos de rutenio, p.ej., quelato de rutenio (bispiridilo) 32+ . Se describen los grupos de etiquetado con rutenio adecuados, por ejemplo en los documentos, EP 0 580 979, WO 90/05301, WO 90/11511, y WO 92/14138.

El término "fármaco" denota un polipéptido, tal anticuerpo o una molécula de anticuerpos, que puede administrarse a un individuo para el tratamiento de una enfermedad. Los fármacos (estos polipéptidos terapéuticos o anticuerpos monoclonales terapéuticos) se utilizan ampliamente para el tratamiento de diferentes enfermedades tal como enfermedades oncológicas (p.ej., malignidades hematológicas y sólidas que incluyen linfoma de no-Hodgkin, cáncer de seno, y cáncer colorectal) , enfermedades inmunológicas , enfermedades del sistema nervioso central, enfermedades vasculares, o enfermedades infecciosas. Estos fármacos, se describen, por ejemplo, por Levine, A.P., et al., Journal of the Royal of Medicine 98 (2005) 145-152. Estos fármacos son, por ejemplo, anticuerpos contra CD20, CD22, HLA-DR, CD33, CD52, EGFR, G250, GD3 , HER2 , PSMA, CD56, VEGF, VEGF2, CEA, antígeno Levis Y., receptor IL-6, o receptor IGF-1. También se describen anticuerpos terapéuticos por Groner, B., et al., Corr. Mol. Meth. 4 (2004) 539-547; y Harris, M. Lancet Oncol . 5(2004) 292-302.

El término "mamífero" denota un ser vivo que pertenece a la clase de animales vertebrados. El término mamífero denota en una modalidad primates, gatos, perros, ovejas, ratas, ratones y conejos. En una modalidad el término mamífero denota los miembros de las familias del orden de los primates que comprende titis y callitricidos (familia Callitrichidae) , monos del nuevo mundo (familia Cebidae) , monos del viejo mundo (familia Cercopithecidae) , lémures enanos y lémures ratón (familia Cheirogaleidae) , aye-aye (familia Daubentoniidae) , lemúridos y gálagos (familia Galagonidae) , gibones y monos menores (familia Hylobatidae) , indris, sifakas, y parientes (familia Indridae) , lémures verdaderos (familia Lemuridae) , loris (familia Loridae) , lémur juguetón (familia Megalapidae) , tarseros (familia Tarsiidae) , así como también cruzas de estos. En una modalidad el mamífero se selecciona del grupo que comprenden los miembros de las familias de titis y callitrícidos , monos del viejo mundo, lémures enanos y lémures ratón, gibones y simios menores, lémures verdaderos, así como también cruzas de estos. En esta modalidad específica los parientes más cercanos a la humanidad, se excluyen los grandes simios, especialmente el grupo de chimpancés, chimpancé pigmeo, gorilas y orangutanes.

El término "muestra" denota cualquier cantidad de una sustancia que se ha administrado a un mamífero. Estas sustancias incluyen, pero no se limita a, sangre intacta, suero, o plasma de un mamífero, que son las fuentes más ampliamente utilizadas de la muestra en la rutina preclínica. En una modalidad la muestra es una muestra líquida como saliva, orina, fluido sinovial, sangre intacta, plasma o suero. En una modalidad la muestra es sangre intacta, plasma o suero.

El término "fase sólida" significa una sustancia no fluida, e incluye partículas (que incluye micropartículas y granulos) hechos de materiales como polímeros, metales (partículas paramagnéticas , ferromagnéticos) , vidrio y cerámica; sustancias en gel tal como sílice, alúmina, y geles de polímeros; capilares, que pueden hacerse de polímero, metal, vidrio y/o cerámica; zeolitas y otras sustancias porosas, electrodos; placas de microtítulación; tiras sólidas; y cubetas, tubos u otros recipientes para la muestra en el espectrómetro. Un componente en fase sólida de un análisis se distingue de las superficies sólidas inertes con las cuales el análisis puede estar en contacto en donde una "fase sólida" contiene al menos un radical sobre su superficie, que se planea interactúen con el anticuerpo de captura. Una fase sólida puede ser un componente estacionario, tal como un tubo, tira, cubeta, o placa de microtitulo, o puede ser un componente no estacionario, tal como perlas o micropartículas . Las micropartículas también pueden utilizarse como una fase sólida para los formatos de análisis homogéneo. Puede usarse una variedad de micropartículas que permiten el enlace no covalente o covalente de polipéptidos y otras sustancias. Estas partículas incluyen partículas de polímeros tal como poliestireno y poli (metacrilato de metilo) ; partículas de oro tal como nanoparticulas de oro y coloides de oro; y partículas cerámicas como partículas de sílice, vidrio, y óxido metálico. Véase por ejemplo Martin, C.R., et al., Analytical Chemistry-News & Features, Mayo 1, 1998, 322A-327A, que se incorporan en la presente como referencia.

Método de análisis multiplexado de inmuno complejos Se ha encontrado que con un método para la detección y caracterización (tamaño y composición) de complejos inmunes dirigidos contra un fármaco administrado en una matriz biológica que comprende un método de etapas múltiples utilizando cromatografía por exclusión de tamaño (SEC) en combinación con un inmunoanálisis , puede hacerse una correlación con la farmacocinética alterada, pérdida o reducción de eficacia, neutralización de las contrapartes así como también las reacciones inmunes y de hipersensibilidad, que incluyen enfermedad del suero, reacción de hipersensibilidad del tipo II/enfermedad mediada por complejos inmunes.

De esta forma se reporta en la presente como un aspecto un método para analizar/caracterizar los complejos inmunes circulantes (CICs) formados in vivo que comprende una cromatografía por exclusión de tamaño, de una muestra obtenida de un mamífero al cual se le ha administrado el fármaco al menos una vez para determinar el peso/tamaño de los complejos inmunes, opcionalmente una segunda cromatografía diferente a la SEC, y al menos un inmunoanálisis, por medio de esto el complejo inmune se caracteriza por la correlación del tamaño del complejo inmune y el resultado/lectura del inmunoanálisis.

Además se reporta en la presente como un aspecto un método para la caracterización de los complejos de anticuerpo-fármaco anti-f rmaco (ADA-D) formados in vivo que comprende una cromatografía por exclusión de tamaño de una muestra obtenida de un mamífero al cual se le ha administrado el fármaco al menos una vez para determinar el peso/tamaño de los complejos de ADA-D, y al menos un análisis de inmunoabsorción enzimática para la detección de anticuerpos anti-fármaco, por medio de esto el complejo inmune se caracteriza por ser un complejo con bajo peso molecular por medio de un análisis inmunoabsorbente enzimático positivo y un peso entre aproximadamente 150 kDa y alrededor de 400 kDa, que será un complejo de peso molecular medio por un análisis inmunoabsorbente enzimático positivo y un peso entre aproximadamente 400 kDa y alrededor de 1,500 kDa, que será un complejo de peso molecular alto por un análisis inmunoabsorbente enzimático positivo y un peso entre aproximadamente 1,500 kDa y alrededor de 7,000 kDa.

También se reporta en la presente el uso de un método como se reporta en la presente para determinar una correlación de farmacocinética alterada, para determinar la pérdida o reducción de eficacia, para determinar la neutralización de las contrapartes naturales del fármaco, para determinar las reacciones inmunes y de hipersensibilidad, que incluyen enfermedad del suero/reacción de hipersensibilidad del tipo III/enfermedad mediada por complejos inmunes.

Por ejemplo, después de la administración de un fármaco a un mamífero el sistema inmune del mamífero puede reconocer el fármaco administrado como extraño y producir anticuerpos anti-fármaco a fin de neutralizar la sustancia extraña administrada. Si el fármaco comprende elementos endógenos para el mamífero los anticuerpos anti -fármaco también pueden dirigirse contra este elemento del fármaco y del mismo modo también tener como objetivo la contraparte endógena en el mamífero .

Una respuesta inmune/formación de ADA/activación del complemento contra un fármaco terapéutico administrado puede originar la formación de complejos inmunes. La formación de complejos inmunes (complejos ADA-D) pueden originar propiedades farmacocinéticas alteradas o secuelas clínicas, p.ej., enfermedad del suero como síndromes.

Las propiedades del complejo inmune pueden ser determinantes importantes de los efectos continuos: - tamaño del complejo La formación de complejos de tamaño grande puede originar eliminación mejorada por el sistema RES.

La formación de complejos de tamaño intermedio puede originar la fijación, seguida por la deposición del tejido y "enfermedad del suero" .

La formación de complejos pequeños puede tener efecto "no" profundo.

- Tamaño del complejo Los complejos inmunes catiónicos pueden depositarse/asociarse con células/membranas de tejido (superficie celular aniónica) . polaridad del complejo - Clq -enlace o capacidad de enlace De esta forma, la caracterización del complejo inmune acabado es un prerrequisito para la correlación con efecto in vivo (cambios farmacocinéticos y/o efectos toxicológicos) .

La única información de incidencia del anticuerpo antifármaco (ADA) , sin embargo, no permite una profunda correlación con los resultados clínicos y farmacocinética alterada.

La cantidad y tamaño de los complejos inmunes formados, tal como complejos del anti-fármaco anticuerpo-fármaco (complejos ADA-D) , es dependiente de varios parámetros, p.ej., concentración/relaciones así como también el epítopo y la valencia.

El tamaño del complejo es un determinante importante de la claridad del complejo o inducción de los casos adversos. Típicamente, los complejos más grandes se eliminan por el sistema del retículo endotelial, los complejos pequeños usualmente no provocan inflamación, mientras los complejos de tamaño intermedio pueden fijar el complemento y pueden originar daño tisular.

Para una evaluación profunda de una respuesta inmune, los complejos inmunes formados potencialmente deben caracterizarse con relación al tamaño. Además, es una información valiosa si existe una contraparte endógena del fármaco, p.ej., información de si las ADAs formadas son de reacción cruzada con estas moléculas y si las contrapartes endógenas son también parte del complejo inmune.

La información puede correlacionarse con los resultados tal como la farmacocinética alterada o eventos adversos debido a la formación inmune y puede proporcionar información adicional para explicar las diferencias, p.ej., entre los sujetos positivos del complejo inmune sin algún impacto y los sujetos positivos del complejo inmune con farmacocinética alterada o secuelas clínicas o enfermedad del suero como síndromes solo en algunos sujetos positivos del complejo inmune .

A fin de determinar la formación de complejos inmunes en un mamífero al cual se le ha administrado un fármaco y a fin de caracterizar los complejos inmunes formados se requirió un método de dos pasos .

El método como se reporta en la presente puede usarse para la caracterización de algún complejo inmune, p.ej., complejos ADA-D así como también los complejos autoinmunes (enfermedades autoinmunes, tal como artritis reumatoide, lupus , etc . ) .

Cromatografía por exclusión de tamaño En el primer paso se separaron los complejos inmunes formados con respecto a su tamaño a fin de determinar el número aparente de componentes en el complejo. Esto puede hacerse por cromatografía por exclusión de tamaño (SEC) y fraccionamiento (en una formulación de alícuotas) del eluato.

Asumiendo que un anticuerpo anti -fármaco es de la clase IgG tiene un peso molecular aproximadamente de 150 kDa y que el peso molecular de los intervalos de polipéptidos terapéuticos entre aproximadamente 2.5 kDa (fármaco del polipéptido; polipéptido que consiste de 20 residuos de aminoácidos) y aproximadamente 250 kDa (anticuerpo del fármaco; anticuerpo terapéutico de longitud completa de clase IgG que comprende los polipéptidos adicionales efector fusionados o anticuerpo multiespecífico) un complejo estequiométrico 1:1 de un anticuerpo anti-fármaco y un fármaco tiene al menos un peso molecular alrededor de 150 kDa en caso de un fármaco de polipéptido pequeño y hasta alrededor de 400 kDa en caso de un anticuerpo del fármaco del complejo .

La selección de los tiempos del fraccionamiento define la resolución de la información del tamaño.

La muestra (bio-matriz) que puede ser plasma del suero (p.ej., para la detección del anticuerpo anti-fármaco) o fluido sinovial (tal como enfermedad reumatoide) se fracciona utilizando cromatografía por exclusión del tamaño. La cromatografía por exclusión del tamaño proporciona la primera información: el tamaño del analito (complejo) .

Las fracciones individuales de la cromatografía por exclusión del tamaño pueden analizarse utilizando una cromatografía por exclusión del tamaño tal como la separación IEC para determinar la carga del complejo o cromatografía de fase inversa (RP, por sus siglas en inglés) o separación HILIC para determinar la polaridad del complejo.

También pueden analizarse las fracciones individuales de la cromatografía por exclusión de tamaño por su actividad de enlace complementaria.

También las fracciones individuales de la cromatografía por exclusión del tamaño pueden analizarse utilizando un análisis inmunoabsorbente enzimático (ELISA, por sus siglas en inglés) .

Análisis inmunoabsorbente enzimático El fraccionamiento del eluato con cromatografía por exclusión de tamaño permite multiplexar el análisis SEC como diferentes inmunoanálisis que puede desarrollarse para determinar diferentes complejos, como - ELISA del tipo formación de puentes (análisis por tamizado de ADA clásico) : detección de ADA en fracciones de alto peso molecular incida que la ADA es parte de una fracción de alto peso molecular - análisis del tipo de complejo: detección de los complejos ADA-D utilizando la captura específica del fármaco y la detección anti -especie es un método genérico para mAbs en los estudios preclínicos (véase p.ej., WO 2006/066912, WO 2008/031532 ambos se incorporan en la presente como referencia) - análisis directo del tipo: detección de las ADAs que se unen con el fármaco y/o con la contraparte endógena al utilizar el fármaco inmovilizado y la detección específica anti-especie En una modalidad para cada análisis se evaluó un punto de corte específico por análisis de muestras de dosis previa blanco o idealmente.

Para la definición del punto de corte y para la comparación del resultado semi cuantitativo entre diferentes placas, la señal ELISA debe leerse después de un tiempo definido (en una modalidad monitoreada por el uso de un control positivo en la MTP) .

Se conocen los inmunoanálisis por las personas con experiencia. Los métodos para realizar estos análisis así como también aplicaciones prácticas y procedimientos se resumen en libros de texto. Ejemplos de textos relacionados son Tijssen, P. Preparación del enzima-anticuerpo u otros conjugados enzima-macromolécula (en: "Práctica y teoría de inmunoanálisis enzimático" , Burdon, R.H. y v. Kinppenberg, P.H. (eds) , Elsevier, Ámsterdam (1990) pp. 221-178) y varios volúmenes de "Methods in Enzymology" , Colowick, S.P. and Caplan. N.O. (Eds), Academic Press, que trata con los métodos de detección inmunológico, especialmente los volúmenes 70, 73, 74, 84, 92 y 121) .

Se describen los principios de los diferentes inmunoanálisis, por ejemplo, por Hage, D.S., en Anal. Chem 71 (1991) 294R-304R. Lu, B., et al., en Analyst . 121 (1996) 29R-32R, reportan la inmovilización orientada de anticuerpos para el uso en inmunoanálisis. Se reportan los inmunoanálisis mediados con Avidin-biotin, por ejemplo, por ilchek, M. and Bayer, E.A., Methods Enzymol . 184 (1990) 467-469.

En segundo paso los complejos separados por tamaño se caracterizan con base en su composición, p.ej., se confirma la presencia de los anticuerpos anti-fármaco y específicamente se determinan los anticuerpos anti-fármaco . En una modalidad el segundo paso comprende al menos un análisis inmunoabsorbente enzimático (ELISA) .

En general un ELISA comprende una molécula de captura y una molécula de trazado. La molécula de captura es en general inmovilizada/enlazada con una fase sólida. La molécula de trazado es en general conjugado con una etiqueta detectable, por medio de esto la etiqueta detectable puede ser una etiqueta detectable de forma directa o puede ser una etiqueta detectable de forma indirecta.

Para la determinación de la presencia de un anticuerpo anti -fármaco diferente al método ELISA pueden utilizarse los formatos: - ELISA-intercalado.

En una modalidad el fármaco conjugado con la fase sólida se usa como molécula de captura y se utiliza el fármaco conjugado con una etiqueta detectable como molécula trazadora.

En el método ELISA- intercalado el anticuerpo antifármaco forma un puente entre la molécula de captura y la molécula trazadora debido a su estructura bivalente. Este formato de análisis también puede nombrarse ELISA de puente.

Al usar un método ELISA-formando puente/-intercalado pueden detectarse los anticuerpos anti-fármaco . La detección de una fracción ADA en SEC que cubre un intervalo de masa diferente desde su masa molecular (p.ej., diferente desde aproximadamente 300 kDa para el complejo IgG-IgG) indica que la ADA fue parte de un complejo de mayor peso molecular.

- ELISA-tipo-complejo En una modalidad se utiliza un anticuerpo de fármaco específico como molécula de captura y un anticuerpo específico anti-especie se utiliza el anticuerpo conjugado en una etiqueta detectable como una molécula trazadora.

En una modalidad el fármaco conjugado con una fase sólida se utiliza como molécula de captura y un anticuerpo específico anti-especie se utiliza el anticuerpo conjugado una etiqueta detectable como una molécula trazadora.

En una modalidad un anticuerpo específico anti-especie el anticuerpo conjugado con una fase sólida se utiliza como molécula de captura y se utiliza el fármaco conjugado en una etiqueta detectable como una molécula trazadora.

En una modalidad un anticuerpo específico anti-especie el anticuerpo conjugado a una fase sólida se utiliza como molécula de captura y un anticuerpo específico del fármaco conjugado con una etiqueta detectable se utiliza como molécula trazadora.

En un método ELISA-tipo-complej o pueden detectarse los complejos anticuerpo-fármaco anti-fármaco .

En el análisis de la muestra preclínica puede utilizarse un anticuerpo de captura específico del fármaco y el anticuerpo de detección específico anti-especie.

En el análisis de la muestra clínica puede utilizarse una molécula de captura específica del fármaco, tal como un anticuerpo anti-idiotípico, y un anticuerpo de detección específico anti-especies .

Este análisis proporciona la información si el ADA se enlaza con el fármaco o no. Esto se logra al usar diferentes componentes del complejo ADA-D para la captura del complejo (ya sea por medio de interacción con el fármaco o el anticuerpo anti-fármaco) y para la detección del complejo capturado (ya sea por medio de la interacción específica con el anticuerpo anti-fármaco en caso de interacción con el fármaco en caso que se haya utilizado el anticuerpo anti- fármaco para la captura del complejo) .

Ya que el anticuerpo anti-fármaco es en general un anticuerpo de longitud completa producido por el mamífero al cual se ha administrado el fármaco el anticuerpo anti-fármaco comprende una región específica para el mamífero. Por lo tanto, los anticuerpos específico de especies pueden utilizarse para en enlace específico (captura o detección) del anticuerpo anti-fármaco a diferencia del enlace específico del anticuerpo anti-fármaco que explota la presencia de una región constante específica de especies.

- ELISA tipo directo.

En una modalidad el fármaco conjugado con una fase sólida se utiliza como molécula de captura y se utiliza un anticuerpo específico anti -especie el anticuerpo se conjuga con una etiqueta de detección como una molécula trazadora.

En una modalidad la contraparte endógena del fármaco conjugado con una fase sólido se utiliza como molécula de captura y un anticuerpo específico anti-especie se utiliza el anticuerpo conjugado con una etiqueta detectable como molécula trazadora.

Al usar el método ELISA de tipo directo que comprende la contraparte endógena inmovilizada del fármaco y los anticuerpos anti-especie para la detección de anticuerpos anti-fármaco pueden detectar y especificar si el ADA se enlaza con el fármaco o la contraparte endógena.

Adicionalmente es posible determinar el isotipo del anticuerpo del anticuerpo anti-fármaco al utilizar anticuerpos específicos de especies y del subtipo.

La evaluación de los resultados se hace por una matriz de la señal contra el tamaño.

En una modalidad la muestra se incuba con la molécula capturada y/o la molécula trazadora durante un periodo de tiempo desde 16 horas a 32 horas.

El ELISA de puente es un método para la determinación inmunológica de un complejo inmune de un fármaco (D) y un anticuerpo contra el fármaco (anticuerpo anti-fármaco, ADA) en una muestra de un mamífero que utiliza un inmunoanálisis con puentes con antígeno doble.

El complejo inmune se abrevia además como el complejo ADA-D.

En una modalidad la determinación inmunológica de un complejo ADA-D en una muestra utiliza un inmunoanálisis con puentes con antígeno doble que comprende un anticuerpo de captura y un anticuerpo trazador, se caracteriza en que uno de los anticuerpos es un anticuerpo que se une específicamente con la Ig del mamífero y el otro anticuerpo es un anticuerpo que se une específicamente con el fármaco.

En el transcurso de la determinación se forma un complejo entre el anticuerpo Ig anti -mamífero . El complejo ADA-D, y el anticuerpo anti-fármaco y la cantidad del complejo formado se correlacionan con la concentración del complejo ADA-D, el fármaco y/o el ADA.

En una modalidad puede desarrollarse un análisis directo de la muestra para la detección del complejo ADA-D formado. En un análisis solo se encontraron señales positivas si la muestra contiene tanto los anticuerpos del fármaco como el anti -fármaco .

En una modalidad el análisis de la muestra se desarrolla después de la incubación previa de la muestra con una cantidad predeterminada del anticuerpo del fármaco. En este análisis se encontraron señales positivas si la muestra contiene anticuerpos anti-fármaco independientemente de la presencia/ausencia del fármaco en la muestra.

En una modalidad la conjugación del fármaco con su parte de conjugación se desarrolla por el enlace químico vía un grupo N-terminal y/o e-amino (lisina) , grupos e-amino de diferentes Usinas, grupos funcionales carboxi-, sulfhidrilo-, hidroxilo- y/o fenólicos de la cadena principal de aminoácidos del fármaco y/o grupos alcohólicos del azúcar de la estructura de carbohidrato del fármaco.

En una modalidad el anticuerpo de captura o el fármaco se conjuga con una fase sólida por medio de la adsorción pasiva y por lo tanto se conjuga con la fase sólida al menos en dos sitios diferentes del anticuerpo. La adsorción pasiva es, p.ej., descrita por Butler, J.E., en "Solid Phases in Immunoassay" , página 205-225; Diamandis, E.P. y Christopoulos , T.K. (Editores): Imraunoassays (1996) Academic Press San Diego.

En una modalidad el anticuerpo de captura o el fármaco se inmoviliza por medio de un par de enlace específico. Este par de enlace (primer componente/segundo componente) es, por ejemplo, estreptavidina o avidina/biotina , anticuerpo/antígeno (véase, por ejemplo, Hermanson, G.T., et al., Bioconjugate Techniques, Academic Press, 1996), lectina/polisacárido, esteroide/proteína que enlaza esteroides, hormona/receptor de hormonas, enzima/substrato, IgG/Proteína A y/o G, etc. En una modalidad el anticuerpo de captura o el fármaco se conjuga con la biotina y la inmovilización se desarrolla por medio de la avidina o estreptavidina inmovilizada.

En una modalidad el anticuerpo trazador se conjuga con una etiqueta detectable. En una modalidad el anticuerpo trazador se conjuga vía un par de enlace específico. Este par de enlace (primer componente/segundo componente) es, por ejemplo, estreptavidina o avidina/biotina, anticuerpo/antígeno (véase, por ejemplo, Hermanson, G.T., et al., Bioconjugate Techniques, Academic Press, 1996), lectina/polisacárido, esteroide/proteína que enlaza esteroides, hormona/receptor de hormonas, enzima/substrato, IgG/Proteína A y/o G, etc. En una modalidad el anticuerpo trazador se conjuga vía digoxigenina y un anticuerpo contra digoxigenina con la etiqueta detectable. Alternativamente el anticuerpo trazador se conjuga con una etiqueta electroquimioluminiscente, como el complejo de bispiridilo rutenio.

En una modalidad el método es para la determinación inmunológica de un anticuerpo contra un fármaco (anticuerpo anti-fármaco, ADA) en una muestra de una especie de mono que utiliza un inmunoanálisis con enlace de antígeno doble.

En una modalidad el método es para la determinación inmunológica de una ADA en una muestra de un mamífero utilizando un inmunoanálisis de enlace del antígeno doble que comprende una molécula de captura y una molécula trazadora, se caracteriza en que ya sea la molécula de captura o la molécula trazadora es un anticuerpo que une específicamente con el IgG del mamífero y la otra molécula respetiva es el fármaco .

En una modalidad de la determinación inmunológica de una ADA, la molécula de captura y la molécula trazadora es un anticuerpo IgG anti-mamífero que se une específicamente con el IgG del mamífero del cual se deriva/obtiene la muestra. En una modalidad de la determinación inmunológica de un ADA, la molécula de captura es un anticuerpo IgG anti-mamífero que se enlaza específicamente con el IgG del mamífero del cual se deriva/obtiene la muestra, y la molécula trazadora es el fármaco. En el transcurso de la determinación se forma un complejo entre el fármaco, ADA, y el anticuerpo IgG anti-mamífero y la cantidad del complejo formado se correlaciona con la concentración de ADA. En una modalidad de la determinación inmunológica de una ADA, el anticuerpo IgG anti-mamífero es un anticuerpo monoclonal (mAb de IgG antimamífero) .

Los polipéptidos , tal como los polipéptidos del fármaco o anticuerpos del fármaco, contiene diferentes radicales reactivos, tal como, por ejemplo, grupos amino (lisina, grupos alfa-amino) , grupos tiol (cistinas, cisteína y metionina) , grupos de ácido carboxílico (ácido aspártico, ácido glutámico) y grupos alcohólicos de azúcar. Estas pueden emplearse al acoplarse con una parte de enlace como una superficie, una proteína, un polímero (tal como p.ej., PEG, Celulosa o Poliestirol) , una enzima, o un miembro de un par de enlace (véase p.ej., Aslam M. , and Dent, A., Bioconjugation Mac illan Ref. Ltd. (1999) 50-100) .

Uno de los grupos reactivos comunes de polipéptidos es la e-amina alifática de la lisina de los aminoácidos. En general, todos los polipéptidos cercanos contienen lisina abundante. Las aminas de la lisina son razonablemente buenos nucleófilos por arriba de pH 8.0 (pKa = 9.18) y por lo tanto reaccionan fácil y limpiamente con una variedad de reactivos para formar enlaces estables. Otro grupo reactivo común en polipéptidos es el residuo de tiol de la cistina de los aminoácidos que contienen azufre y su cisteína como producto de reducción (o mitad de cistina) . La cisteína contiene un grupo tiol libre, que es más nucleofílico que las aminas y generalmente el grupo funcional más reactivo en una proteína. Los tioles generalmente son reactivos a pH neutro, y por lo tanto pueden acoplarse con otras moléculas selectivamente en presencia de las aminas. Ya que los grupos sulfihidrilos libres son relativamente reactivos, los polipéptidos con estos grupos frecuentemente existen con estos en su forma oxidada como grupos de bisulfuro, o enlaces de bisulfuro. Además de la cistina y la cisteína, algunos polipéptidos también tienen la metionina del aminoácido, que contiene azufre en el enlace de tioeter. La literatura reporta el uso de varios reactivos de reticulación para la formación de tioles tal como el reactivo de Traut (2 - iminotiolano) , acetato (acetiltio) de succinimidilo (SATA) , o hexanoato de sulfosuccinimidilo 6- [3- (2-piridilbitio) ] (Sulfo-LC-SPDP) para proporcionar medios eficientes para introducir múltiples grupos de sulfhidrilo vía los grupos aminos reactivos. Los ásteres reactivos, particularmente N-hidroxisuccinimida (NHS) , son entre los reactivos más comúnmente utilizados para la modificación de los grupos amina. El pH óptimo para la reacción en un ambiente acuoso es pH 8.0 a 9.0. Los isotiocianatos son reactivos de modificación de aminas y forman enlaces de tiourea con las proteínas. Estos reaccionan con las aminas de los polipéptidos en solución acuosa (opcionalmente a pH 9.0 a 9.5). Los aldehidos reaccionan bajo condiciones acuosas medias con aminas alifáticas y aromáticas, las hidracinas y los hidrazuros para formar un compuesto intermediario (base de Schiff) . Una base de Schiff puede reducirse selectivamente con los agentes reductores medios o fuertes (como el borohidruro de sodio o el cianoborohidruro de sodio) para producir un enlace de alquilamina estable. Otros reactivos que se han utilizado para modificar las aminas son los anhídridos de ácidos. Por ejemplo, al anhídrido de dietilentriaminopentacético (DTPA, por sus siglas en inglés) es un agente quelante bifuncional que contiene dos grupos anhídrido reactivo-amina. Este puede reaccionar con los grupos N-terminal y e -amina de las proteínas para formar enlaces de amida. Los anillos del anhídrido se abren para crear brazos quelantes con metales, multivalentes capaces de enlazar fuertemente con los metales en un complejo de coordinación.

Otro grupo reactivo común en los polipéptidos son ácidos carboxílicos (ácido aspártico, ácido glutámico) . Los polipéptidos contienen grupos de ácido carboxílico en la posición C-terminal y dentro de las cadenas secundarias de ácido aspártico y ácido glutámico. Para la conjugación es el grupo de ácido carboxílico usualmente se convierte en un éster reactivo para el uso de una carbodiimida soluble en agua con un agente nucleofílico tal como una amina, hidrazida o hidracina. El reactivo que contiene amina debe ser básico débil a fin de que reaccione selectivamente con el ácido carboxílico activado en presencia de otras aminas en el polipéptido. La reticulación del polipéptido puede presentarse cuando el pH se eleva por arriba de 8.0.

Puede utilizarse el periodato de sodio para oxidar la parte de alcohol de un azúcar dentro del radical carbohidrato en un aldehido. Cada grupo aldehido puede reaccionar con una amina, hidracida, o hidracina, como se describe por los ácidos carboxílicos .

Los agentes de tiol-reactivos son aquellos que se acoplarán con los grupos tiol en los polipéptidos, que forman productos acoplados de tioéter. Estos reactivos reaccionan rápidamente a pH ligeramente ácido a neutro y por lo tanto pueden reaccionar selectivamente en presencia de grupos amina. Los derivados de haloacetilo, p.ej., yodoacetamidas, forman enlaces de tioéter y son reactivos para la modificación de tiol. La reacción se realiza en los grupos cisteína que están intrínsecamente presentes o que resultan de la reducción de los bisulfuros de cisteína en diferentes posiciones del polipéptido. Otros reactivos útiles son las maleimidas. La reacción de las maleimidas con reactivos de tiol-reactivo es esencialmente el mismo que con las yodoacetamidas . Las maleimidas reaccionan rápidamente con pH ligeramente ácido a neutro.

Las aminas, hidrazidas e hidracinas son aldehidos y agentes de ácido carboxílico reactivo (formación de enlaces de amida, hidrazona o alquilamina) . Las aminas, hidracidas e hidracinas pueden acoplarse con los ácidos carboxílicos de los polipéptidos después de la activación del grupo carboxílico por una carbodiimida soluble en agua. El reactivo que contiene amina debe ser débilmente básico a fin de que reaccione selectivamente con el polipéptido activado con carbodiimida en presencia de las e -aminas altamente básicas de la lisina para formar un enlace de amida estable. En la reacción con los grupos aldehido, que pueden generarse en los polipéptidos por oxidación con peroxidato de los residuos de carbohidrato en el polipéptido, se forma el compuesto intermediario con base Schiff, que puede reducirse en una alquilamina a través de la reducción del compuesto intermediario con cianoborohidruro de sodio (medio y selectivo) o borohidruro de sodio (fuerte) agentes reductores solubles en agua.

En la Fig. 1 la cinética de una formación del complejo de fármaco ADA-D se muestra (1 mg de fármaco y 1 mg de ADA) . Puede verse que con el incremento del tiempo se forman complejos de mayor orden, p.ej., iniciando con un fármaco: complejo-ADA 1:1 por medio de un fármaco : complej o-ADA 1:2 en un fármaco : complej o-ADA 1:3 (puntos en el tiempo 0 min, 50 min, 100 min, 160 min, 200 min) . Por la adición de más ADA la composición de la muestra puede cambiarse más a complejos de mayor peso molecular reduciendo el pico de fármaco de monómero (Figura 2) .

En la Figura 3 los diagramas de SEC reconstituidos de ej emplificación (eje y es OD del método ELISA) y el ELISA origina que se obtenga con el método reportado en la presente mostrado. En la Figura 4 el acercamiento de la SEC reconstituida de la muestra 201 se muestra en donde el eje Y se mantiene constante. Por medio de esto puede verse la diferencia en la composición de la muestra.

Las siguientes abreviaturas se utilizan en la presente: ABTS 2 , 2 ' -azino-di- [sulfonato de 3 -etilbencentiazolina (6)] de di-amonio Ab anticuerpo ADA anticuerpos anti-fármaco Bi Biotina CoA Certificado de análisis Conc . Concentración CPP Plasma blanco almacenado del mono Cynomolgus Dil. Dilución ELISA Análisis inmunoabsorbente enzimático HRP Peroxidasa de rábano tnAb Anticuerpo monoclonal MTP Placa de microtitulación OD Densidad óptica PBS Solución salina tamponada de fosfato rpm Revoluciones por minuto RT Temperatura ambiente (+15 a +25°C) RTU Listo para usar SA Estreptavidina SEC Cromatografía por exclusión de tamaño Se proporcionan los siguientes ejemplos para ayudar a comprender la presente invención, el verdadero alcance del cual se expone en las reivindicaciones anexas. Se entiende que las modificaciones pueden hacerse en los procedimientos expuestos sin alejarse de la perspectiva de la invención.

Ejemplo 1 Análisis de las muestras de un estudio de macaco cangrejero Se analizaron las veintisiete muestras obtenidas del plasma de macacos cangrejeros para la detección de complejos que contienen anticuerpos anti- fármaco (ADA) contra el fármaco administrado. Además, se realizó una evaluación del tamaño del complejo.

Se realizó el análisis utilizando un método de dos pasos que comprende una cromatografía con exclusión de tamaño (SEC) y un análisis inmunoabsorbente enzimático (ELISA) .

Se logró la separación potencial de los complejos dependientes del tamaño por medio de la SEC seguida por el fraccionamiento del efluente de la SEC (fracciones de 1 min) , que permitió multiplexar el análisis de la SEC, ya que cada fracción puede analizarse por diferentes métodos ELISA. La detección de los complejos ADA contra el fármaco administrado y se logró la detección de la presencia de los complejos ADA-D en las fracciones recolectadas por dos métodos ELISA diferentes. Uno se diseñó para detectar los ADA (análisis de ADA) al usar el fármaco biotinilado para captura y un anticuerpo de detección específico de la IgG anti-Cynomolgus, el segundo análisis se diseñó para detectar los complejos de ADA-D, al usar una molécula de captura específica del fármaco y un anticuerpo de detección específico de la IgG anti-Cynomolgus .

Se recolectaron muestras de plasma de Cynomolgus del grupo principal y los animales de grupo de recuperación. Grupo 1: grupo placebo (muestras 01, 02, 03, 04, 05, 06), grupo 2: dosis básica (muestra 07, 08, 09, 10, 11, 12), grupo 3: dosis básica en dos tiempos (13, 14, 15, 16, 17, 18), grupo 4: dosis básica en cuatro tiempos (19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27) .

La selección de los tiempos del fraccionamiento define la resolución de la información del tamaño. El tamaño de la fracción fue de 1 min. Los resultados de ELISA de varias fracciones se combinaron para condensar la información en "fracciones de peso molecular alto, medio y bajo" .

SEC: Se separaron las muestras de plasma de cynomolgus en una columna de SEC de 13 µp? BioSuite 450 con un intervalo de peso molecular desde aproximadamente 20,000 a alrededor de 7,000,000 Da. Para evitar la precipitación indeseable de las proteínas en la parte superior del plasma de Cynomolgus en la columna se mezcló con etanol (comparable con la composición de etanol de la fase móvil) seguido por una centrifugación de 1 min. (Relación de plasma de macaco cangrej ero : etanol (95% en peso) alrededor de 16:1; 1 minutos de centrifugación a 20,800 rpm) . Se inyectaron 20 µ? de la muestra en el sistema de HPLC (Agilent 1100) . Se monitoreó las trazas de UV con una longitud de onda de 280 nm. Se desarrolló la separación isocrática con etanol al 5% en tampón de solución salina amortiguada con fosfato (PBS) como fase móvil (flujo de 0.5 ml/min durante 25 minutos y después de esto 0.75 ml/min., durante 13 minutos y 0.5 ml/min., durante 2 minutos finales).

El efluente de la separación de la SEC se fraccionó para permitir la detección por el método ELISA. En una modalidad se recolectaron veinte fracciones consecutivas con una fracción de tiempo de 1 min, cubriendo el tiempo de elución desde el minuto 9 (volumen vacío) al minuto 21.

El peso molecular calculado que corresponde a la respectiva fracción se da en la siguiente tabla 1.

Tabla 1 Análisis -ADA La detección de ADAs en las fracciones de la SEC con peso molecular más alto (mayores de 150 kDa que es equivalente a la masa de un monómero de IgG/ADA) indica que el ADA es parte de un complejo de mayor peso molecular. La detección de ADA se desarrolló por medio de análisis de la fracción recolectada utilizando el análisis ADA. La caracterización del tamaño del complejo se basa en el tiempo de retención de la SEC. La caracterización de la composición del complejo se logra por análisis de la presencia de los complejos de ADA-D (complejos de ADA-Fármaco) en las respectivas fracciones.

Para la detección de los complejos de ADA y ADA-D, se han establecido dos métodos ELISA secuenciales.

Para la detección de ADA los pozos de una SA-MTP se recubrieron con fármaco biotinilado (D-Bi; c = 1 µ9/??1) después de 1 hora. Después que se ha removido la solución de recubrimiento los pozos se lavaron tres veces con 1 x PBS con 0.05% de Tween 20 se agregó una alícuota de la fracción-SEC y se incubó en la MTP durante toda la noche con agitación. Después de lavar los pozos tres veces con 1 x PBS con 0.05% de Tween 20 se agregó un anticuerpo Fe anti-Cynomolgus digoxigenilado (<Cyno Fo-Dig, c = 0.1 ug/ml) se agrega e incuba durante 1 hora con agitación. Después de lavar los pozos tres veces con 1 x PBS con 0.05% de Tween 20 se agregó un anticuerpo anti-digoxigenina conjugado con fragmentos (poli) Fab de HRP (5 mU) y se incubó durante una hora con agitación. Después de lavar los pozos tres veces con 1 x PBS con 0.05% de Tween 20 se agregó solución ABTS y se monitoreó el desarrollo del color (medición de la longitud de onda 405 nm; longitud de onda de referencia 490 nm) .

Para la detección del complejo ADA-D los pozos de una SA- MTP se recubrió con un anticuerpo anti-fármaco biotinilado (<fármaco>-Bi ; c = 2 ug/ml) durante 1 hora con agitación. Después que se ha removido la solución de recubrimiento los pozos se lavan tres veces con 1 x PBS con 0.05% de Tween 20 se agregó una alícuota de la fracción de SEC y se incubó en la MTP durante una hora con agitación para la detección del complejo. Después que se ha removido la solución se lavaron los pozos tres veces con 1 x PBS con 0.05% de Tween 20 se agregó una solución del anticuerpo Fe anti-Cynomolgus digoxigenilado (<Cyno-Fc>-Dig) (c = 0.1 yg/ml) y se incubó durante 1 hora con agitación. Después que se ha removido la solución se lavaron los pozos tres veces con 1 x PBS con 0.05% de Tween 20 se agregó una solución de fragmentos (poli) Fab de (5 mU) de un conjugado de anticuerpo-HRP anti-digoxigenina y se incubó con agitación. Después de lavar los pozos tres veces con 1 x PBS con 0.05% de Tween 20 se agregó solución ABTS y se monitoreó el desarrollo del color (medición de la longitud de onda 405 nm; longitud de onda de referencia 490 nm) .

Un valor del corte con base en la señal de la OD por arriba del cual una fracción de la SEC resultante se define como positiva para la presencia de ADA (análisis ADA) o complejos ADA-D (análisis ADA-D) se definió con base en el análisis de las muestras de placebo del estudio.

Se muestran los resultados para el análisis ADA y el análisis de ADA-D en la siguiente tabla 2 (se listan los resultados de ELISA como valores de OD del análisis de las fracciones de las muestras de placebo (parte superior: análisis ADA; parte inferior: Análisis ADA-D)).

Tabla 2 Análisis ADA fracción/tiempo de retención [min] (Continuación Tabla 2) Análisis ADA-D fracción/tiempo de retención [min] Con base en esos datos, un valor de corte de la OD = 0.20 se define para el análisis de ADA y de OD > 0.10 para el análisis de ADA-D, que representa aproximadamente el doble significa la señal blanco en las fracciones analizadas.

Para otra evaluación s emi - cuant i tat iva , los valores que se dan en la siguiente tabla 3 se definieron (valores de corte (OD) para el análisis ADA (izquierda) y el análisis ADA-D (derecha) ) .

Tabla 3 Señal [OD] Resultado Debajo 0.20 Negativo 0.20-1.00 Positivo (señal media) Arriba 1.00 Positivo (señal alta) Las veintisiete muestras de plasma de mono Cynomolgus obtenidas del estudio se analizaron para la detección de complejos que contienen anticuerpos antifármaco (ADA) contra el fármaco administrado. Además, se realizó una evaluación de los tamaños de los complejos.

Los resultados de las fracciones 1-3 se combinaron y dieron fracciones con complejos con alto peso molecular, las fracciones 4-6 como fracción del complejo de peso molecular medio y las fracciones 7-8 como la fracción del complejo con peso molecular bajo. La revisión de los resultados de ELISA de los análisis de las fracciones de las muestras de estudio se presentan en la siguiente tabla 4 (izquierda: análisis ADA; derecha: análisis ADA-D; grupo 1 es el grupo placebo grupo 2 dosis básica; grupo 3 dosis básica dos veces; grupo 4 dosis básica cuatro veces) .

Tabla 4 Continuación Tabla 4 negativo/debajo del valor de corte; positivo; altamente positivo Tabla 5 25 Señal [OD] Resultado Negativo Positivo (señal media) Altamente positivo (señal alta) Los resultados detallados de ELISA del análisis de fracciones de las muestras de estudio como se muestra en la Tabla 5 previa se dan en la siguiente tabla 6 (parte superior: análisis ADA; parte inferior: análisis ADA-D; grupo 1 es el grupo placebo; grupo 2 dosis básica; grupo 3 dosis básica dos veces; grupo 4 dosis básica cuatro veces) .

Tabla 6 Análisis ADA (<Cyno Fc>) (Continuación Tabla 6) Análisis ADA (<Cyno Fc>) Análisis ADA-D (Continuación Tabla 7) Análisis ADA-D Los complejos ADA-D pudieron detectarse en dos de todas las muestras (muestra 10, 24) de los animales tratados. Se observaron diferencias entre las muestras con respecto a la intensidad de la señal. Con la excepción de la muestra 19 y la muestra 20, todas las muestras mostraron resultados negativos en las fracciones de peso molecular alto (fracciones 1-3) .

Ejemplo 2 Correlación del análisis SEC-ELISA y la f arretaco cinét ica Se recolectaron cinco muestras de plasma de cynomolgus previo a la dosificación y se analizaron en los siguientes puntos de tiempo, día = 9, 13, 21, 23 (todas las muestras) y el día = 63 (animal 2004, 2005, 3002, 3105) para la detección de complejos que contienen anticuerpos anti-fármaco (ADA) contra el fármaco administrado. Además, se realizó una evaluación de los tamaños del complejo con la farmacoc inét ica observada del fármaco administrado.

Se desarrolló el análisis utilizando un método de dos pasos que comprende una cromatografía por exclusión de tamaño (SEC) cromatografía por exclusión de tamaño y un análisis inmunoabsorbente enzimático (análisis ADA-D y análisis ADA) como se reporta en el Ejemplo 1. Para la correlación con la farmacocinética del fármaco administrado, se utilizaron solo los resultados del análisis ADA-D.

Se recolectaron muestras de plasma de cynomolgus de cinco macacos cangrejeros con una dosificación del fármaco de 100 mg/kg.

Del análisis del plasma puede verse que en los macacos cangrejeros número 2001, 2002 y 2004 se observó una claridad más rápida del suero comparada con los macacos cangrejeros número 2003 y 2005 (véase la Figura 5 ) .

El efluente de la separación de SEC se fraccionó con un tiempo de fraccionamiento de 1 min, cubriendo el tiempo de elución desde el minuto 9 (volumen vacío) al minuto 21. El peso molecular calculado que corresponde a la respectiva fracción se utilizó como se describe en el Ejemplo 1 anterior.

Un valor de corte con base en la señal de la OD arriba del que resulta de la fracción de la SEC se define como positivo para la presencia de ADA (análisis ADA) o complejos ADA-D (análisis ADA-D) se define con base en el análisis de las muestras de dosis previa de los animales en estudio.

Los resultados para el análisis de ADA y el análisis de ADA-D se muestran en la siguiente tabla 8 (resultados ELISA listados como valores OD del análisis de las fracciones de las muestras de placebo (parte superior: Análisis ADA; parte inferior: Análisis ADA-D) ) .

Tabla 8 Análisis-ADA Fracción/tiempo de retención [min] (Cont. Tabla 8 Análisis-ADA-D) Fracción/tiempo de retención [min] Correlaciones de la OD (Continuación Tabla 9) Correlaciones de la OD De la Figura 5 puede verse de la Tabla 9 que la claridad mejorada se observó para el animal 2001, 2002 y 2004. Para estos animales la suma de la OD obtenida (todos los días sin dosis previa y el día 63) las señales del análisis ADA-D son 11.9 (animal 2001), 8.7 (animal 2002) y 10.3 (animal 2004) . Estas señales son claras arriba de las señales de 6.7 (animal 2003) y 5.9 (animal 2004) que no mostró claridad mejorada. De esta forma, el incremento en las cantidades de los complejos ADA-Fármaco indica una claridad más rápida del plasma.

Ejemplo 3 Correlación del análisis SEC-ELISA y los resultados de la posición de los glomerulos de la IgG Para cada análisis (Anál i s i s -ADA y Análisis ADA-D) con t = 21d y t 23d y cada señal del grupo de dosificación (Grupo A y Grupo B) de las fracciones de los bloques del tiempo de retención 9 min., a 12 min., (bloque 1), 12 min., a 15 min., (bloque 2) y 15 min., a 17 min., (bloque 3) se resumen (véase las siguientes Tabla 10 y Tabla 11 para el Anál isis -ADA-D y el Análisis ADA) .

Tabla 10 Análisis-ADA-D Tabla 11 Análisis -ADA Las señales resumidas obtenidas para el punto de tiempo t = 23d se dividieron por la señal obtenida para el punto t = 21d ("cociente 1") para indicar una pérdida o incremento de la señal en el t = 23d se muestran en la Tabla 12 y Tabla 13.

Tabla 12 Cociente 1 (d23/d21) Los valores del "cociente 1" del análisis ADA-D se dividen por los valores del "cociente 1" del análisis ADA para obtener los valores del "cociente 2" . Los altos valores del "cociente 2" en el bloque 1 (p.ej., arriba de 2 o 3) indican depósitos de glomerulos en los animales se muestran en la Tabla 13.

Tabla 13 Cociente 2 (ADA-D/ADA) Además, los valores del "cociente 2" de cada grupos de dosificación y el bloque se probaron estadísticamente por la prueba-F y la prueba-T (alfa 5%) para diferenciar si los valores/media del bloque 1 con el bloque 3 de los grupos son diferentes o no, como se muestra en la Tabla 14.

Tabla 14 Promedio del cociente 2 Los datos del depósito glomerular se valoran como "-" sin depósitos con "(+)" para depósitos glomerulares ligeramente visibles para "+" y "++" para muestras positivas con una diferenciación semi-cuantitativa de los depósitos glomerulares encontrados en los animales, como se muestra en la Tabla 15.

Tabla 15 Depósitos glomerulares Los resultados listados en las tablas anteriores muestran una correlación de los inmunocomplej os separados por la SEC con depósitos glomerulares de los animales. Altos valores en el bloque 1 indican depósitos glomerulares en los animales. Todos los animales del grupo A se valoran como "-" y "(+)" y todos los animales del grupo B se valoran como "+" y "++" . Los valores promedio de estos grupos son diferentes estadísticamente .

Como se muestra en la tabla de "Depósitos de glomerulares", se observó una diferenciación semi-cuantitativa entre el resultado del depósito glomerular de la IgG, con los animales 3003 y 3004 que muestran depósitos más pronunciados .

Como se muestra en las tablas el análisis ADA- fármaco y el análisis-ADA la suma de las señales en el bloque 1 son directamente proporcionales con los resultados de los depósitos glomerulares (véase también la Figura 6) .

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (16)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :

1. Método para determinar un anticuerpo anti- fármaco con formación de complejo circulante que comprende un polipéptido terapéutico (exógeno) y un anticuerpo anti -fármaco endógeno formado in vivo, caracterizado porque comprende a) una cromatografía por exclusión de tamaño de una muestra obtenida de un mamífero al cual se ha administrado un fármaco al menos una vez para determinar el peso/tamaño del inmunocomplejo, b) opcionalmente una segunda cromatografía que no es SEC, c) al menos un inmunoanálisis heterogéneo para detectar el anticuerpo anti-fármaco, y d) opcionalmente un análisis a base de espectrometría de masas, por medio de esto el inmunocomplejo, se caracteriza por la correlación del tamaño del inmunocomplejo y el resultado/lectura de la prueba de inmunoanálisis o espectrometría de masas, por medio de esto el polipéptido terapéutico es un polipéptido terapéutico sintético o que se presente naturalmente.

2. Método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la muestra es suero o fluido cerebroespinal .

3. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, caracterizado porque la cromatografía por exclusión de tamaño es una cromatografía por exclusión de tamaño con la recolección del eluato en fracciones.

4. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque al menos una de las fracciones de la cromatografía por exclusión de tamaño se separa más por la segunda cromatografía diferente a la SEC con la recolección del eluato en fracciones.

5. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, caracterizado porque cada una de las fracciones se analizaron en el inmunoanálisis .

6. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el inmunoanálisis es un inmunoanálisis del anticuerpo antifármaco.

7. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque al menos uno de los inmunoanálisis es un análisis inmunoabsorbente enzimático con formación de puentes.

8. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque al menos un inmunoanálisis es un análisis del complejo para la detección de los complejos ADA-D.

9. Método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque el análisis del complejo comprende un anticuerpo de captura específico del fármaco y un anticuerpo específico anti-especie como anticuerpo de detección.

10. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque al menos uno de los inmunoanálisis es un análisis directo para la detección de los anticuerpos anti- fármaco que se enlazan con el fármaco y/o la contraparte endógena del fármaco.

11. Método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque el análisis directo comprende el fármaco inmovilizado por la molécula de captura o la contraparte endógena del fármaco y un anticuerpo específico anti-especie como el anticuerpo de detección.

12. Uso de un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, para la correlación de las características del complejo inmune con farmacocinética alterada.

13. Uso de un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, para determinar la reducción de la eficacia de un fármaco.

14. Uso de un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, para determinar la neutralización de las contrapartes naturales del fármaco.

15. Uso de un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, para determinar las reacciones inmunes y de hipersensibilidad contra el fármaco.

16. Uso de un método de conformidad con la reivindicación 15, en donde pía reacción inmune y de hipersensibilidad es una enfermedad del suero/reacción de hipersensibilidad tipo III/enfermedad mediada por el inmunocomplej o .