MXPA98007723A - Anticuerpos erbb3 - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a anticuerpos que enlazan a la proteína ErbB3 y poseen además una o más de las siguientes propiedades:una capacidad para reducir la formación inducida por heregulina de un complejo de proteína ErbB2-ErbB3 en una célula que expresa ErbB2 y ErbB3;la capacidad para aumentar la afinidad de enlace de heregulina por la proteína ErbB3;y la característica de reducir la activación de ErbB2 inducida por heregulina en una célula que expresa ErbB2 y ErbB3.

Description

ANTICUERPOS ErbB3 ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Campo de la Invención Esta invención se refiere en general a anticuerpos que enlazan al receptor de ErbB3. En particular, se refiere a anticuerpos ErbB3 que, sorprendentemente, aumentan la afinidad de enlace de heregulina (HRG) de la proteína ErbB3 y/o reduce la formación inducida de HRG de un complejo de proteína ErbB2-ErbB3 en una célula que expresa los receptores y/o reduce la activación de ErbB2 inducida por heregulina en tal célula.

Descripción del arte relacionado La transducción de señales que regulan el crecimiento y diferenciación celular se regula en parte por la fosforilación de varias proteínas celulares. Las proteínas tirosina cinasas son enzimas que catalizan este proceso. El receptor de las proteínas tirosina cinasas se cree que dirige el crecimiento celular por vía de la fosforilación de tirosina estimulada por el ligando de los sustratos REF.: 28128 intracelulares. Las proteínas tirosina cinasas receptoras del factor de crecimiento de la subfamilia de la clase I incluyen el receptor del factor de crecimiento epidérmico de 170 kDa (EGFR) codificado por el gen erb Bl. El erb Bl se ha implicado causalmente en el tumor maligno de humano. En particular, la expresión aumentada de este gen se ha observado en carcinomas más agresivos del mama, vejiga, pulmón y estómago.

El segundo miembro de la subfamilia de la clase I, pl85reu, se identificó originalmente como el producto del gen transformado de neuroblastomas de ratas tratadas químicamente. El gen neu (también llamado er£>B2 y HER2) codifica una proteína tirosina cinasa receptora de 185 kDa.

La amplificación y/o sobreexpresión del gen humano HER2 se correlaciona con un pronóstico pobre en cánceres de mama y ovario (Slamon et al . , Science, 235:177-182 (1987); y Slamon et al . , Science, 244:707-712 (1989)). La sobreexpresión de HER2 también se ha correlacionado con otros carcinomas que incluyen carcinomas del estómago, endometrio, glándula salival, pulmón, riñon, colón y vejiga.

Además también se ha descrito un gen relacionado, llamado erjB3 o HER3. Ver Pat. US Nos. 5,183,884 y 5,480,968; Plowman et al . , Proc. Na ti Acad. Sci . USA, 87:4905-4909 (1990); Kraus et al., Proc. Nati Acad. Sci. USA, 86:9193-9197 (1989); EP Pat Appln No 444,961A1; y Kraus et al., Proc. Nati Acad. Sci. USA, 90:2900-2904 (1993) Kraus et al., (1989) descubrieron que niveles elevados marcadamente de er£>B3 mARN se presentan en ciertas líneas celulares de mama de humano indicando que er£>B3, erbBl similar y er£>B2, podrían jugar un papel en algunos tumores malignos de humano. Estas investigaciones demostraron que algunos líneas celulares de tumores de mama de humano exhiben elevación significativa de fosforilación de tirosina de ErbB3 en estado estacionario, indicando además que este receptor podría jugar un papel en tumores malignos en humano. Por lo tanto, los bioensayos de diagnóstico que utilizan anticuerpos los cuales se unen a ErbB3 se describen por Kraus et al., en la Patente US Nos. 5,183,884 y 5,480,968.

El papel de erL>B3 en cáncer se ha explorado por otros investigadores. Se ha encontrado que se sobreexpresado en cánceres de mama (Lemoine et al., Br. J. Cáncer, 66:1116-1121 (1992)), gastrointestinal (Poller et al., J. Pathol., 168:275-280 (1992), Rajkumer et al., J. Pathol., 170:271-278 (1993) y Sanidas et al., J. Cáncer, 54:935-940 (1993)), y pancreático (Lemoine et al., J. Pathol, 168:269-273 (1992), y Friess et al., Clinical Cáncer Research, 1:1413-1420 (1995) ) .

ErbB3 es único entre la familia de receptores de ErbB en la que se posee poca o ninguna actividad tirosina cinasa intrínseca (Guy et al . , Proc. Nati . Acad. Sci . USA 91:8132-8136 (1994) y Kim et al . , J. Biol . Chem. 269:24747-55 (1994)). Cuando ErbB3 se coexpresa con ErbB2, un complejo de señalización activa se forma y los anticuerpos dirigidos contra ErbB2 son capaces de romper este complejo (Sliwkowski et al . , J. Biol . Chem. , 269 (20) : 14661-14665 (1994)). Adicionalmente, la afinidad de ErbB3 para heregulina (HRG) se aumenta a un estado de afinidad más alto cuando se coexpresa con ErbB2. Ver también, Levi et al . , Journal of Neuroscience 15:1329-1340 (1995); Morrissey et al . , Proc. Nati . Acad. Sci . USA 92:1431-1435 (1995); y Lewis et al . , Cáncer Res . , 56:1457-1465 (1996) con respecto al complejo de proteína ErbB2-ErbB3.

Raijkumar et al . , Bri tish Journal Cáncer, 70 (3) :459-465 (1994), desarrollaron un anticuerpo monoclonal contra ErbB3 que tiene un efecto agonístico en el crecimiento independiente de anclaje de la líneas celulares que expresan este receptor.

La subfamilia de clase I de las proteínas tirosina cinasas receptoras del factor de crecimiento se ha extendido más para incluir el receptor HER4/pl80erbB4. Ver Sol. Pat. EP No 599,274; Plowman et al . , Proc. Nati . Acad. Sci . USA, 90:1746-1750 (1993); y Plowman et al . , Nature, 366:473-475 (1993). Plowman et al . , encontraron que la expresión aumentada de HER4 se correlacionada cercanamente con ciertos carcinomas de origen epitelial, incluyendo adenocarcinomas de mama. Por consiguiente, los métodos de diagnóstico para detección de condiciones neoplásticas de humano (especialmente cánceres de mama) que evalúan la expresión HER4 se describen en la Sol Pat EP No. 599,274.

La pregunta de un activador del oncógeno HER2 se ha dirigido hacia el descubrimiento de una familia de polipéptidos de heregulina. Estas proteínas parecen resultar de deslizamiento alternativo de un gen sencillo que se mapeó del brazo corto del cromosoma 8 humano por Lee et al . , Genomi cs, 16:790-791 (1993); y Orr-Urtreger et al . , Proc. Na ti . Acad. Sci . USA, Vol. 90 pp. 1867-1871 (1993).

Holmes et al . , aislaron y clonaron una familia de activadores polipéptidos para el receptor de HER2 que se llama heregulina-a (HRG-a) , heregulina-ßl (HRG-ßl), heregulina-ß2 (HRG-ß2) , similar a heregulina-ß2 (similar a HRG-ß2), y heregulina-ß3(HRG-ß3) . Ver Holmes et al . , Science, 256:1205-1210 (1992); y WO 92/20798. El polipéptido de 45kDa, HRG-a, se purificó del medio acondicionado de la línea celular de cáncer de mama humano MDA-MB-231. Estas investigaciones demostraron la capacidad de los polipéptidos de heregulina purificados para activar la fosforilación de tirosina del receptor HER2 en células de tumor de mama MCF-7. Además, se ilustró la actividad mitogénica de los polipéptidos de heregulina en células SK-BR-3 (que expresan altos niveles del receptor de HER2) . Como otros factores de crecimiento que pertenecen a la familia EGF, los polipéptidos HRG solubles parecen derivarse de un precursor de enlace de la membrana (llamado pro-HRG) el cual se procesa proteolíticamente para liberar la forma soluble de 45kDa. Estos pro-HRGs carecen de un péptido señal N-terminal.

Mientras que las heregulinas son sustancialmente idénticas en los primeros 213 residuos de aminoácido, se clasifican en dos tipos principales, a y ß, basados en dos variantes como de dominios tipo EGF que difieren en sus porciones C-terminales. Sin embargo, estos dominios tipo EGF son idénticos en el espaciamiento de seis residuos de cisteína contenidos en los mismos. Basados en una comparación de la secuencia de aminoácido, Holmes et al . , encontraron que entre la primera y sexta cisteínas en el dominio tipo EGF, los HRGs fueron 45% similares al factor de crecimiento tipo EGF que enlaza a heparina (HB-EGF) , 35% idénticos a anfirregulina (AR) , 32% idénticos a TGF-a, y 27% idénticos a EGF.

El factor de diferenciación neu de 44 kDa (NDF) que es el equivalente de rata del HRG humano, se describió primero por Peles et al . , Cell , 69:205-216 (1992); y Wen et al . , Cell , 69:559-572 (1992). Como los polipéptidos de HRG, NDF tiene un dominio de homología de inmunoglobulina (Ig) seguido por dominio tipo EGF y carece de un péptido señal N-terminal. Subsecuentemente, Wen et al . , Mol . Cell Biol . , 14(3):1909-1919 (1994) llevaron a cabo "clonación exhaustiva" para extender la familia de NDFs. Este trabajo reveló seis pro-NDFs fibroblásticos distintos. Adoptando la nomenclatura de Holmes et al . , los NDFs se clasificaron como polipéptidos a o ß basados en esta secuencia de los dominios tipo EGF. Las isoformas 1 a 4 se caracterizan en la base de la yuxtamembrana estirada variable (entre el dominio tipo EGF y dominio transmembranal) . También, las isoformas a, b y c se describe que tienen dominios citoplásmicos de longitud variable. Estas investigaciones concluyen que las isoformas de NDF diferentes se generan por unión alternativa y distinta función de las funciones específicas del tejido.

Falls et al . , Cell 72:801-815 (1993) describe otro miembro de la familia de heregulina que llaman al polipéptido de actividad que induce al receptor de acetilcolina (ARIA) .

El polipéptido ARIA derivado de pollo estimula la síntesis de los receptores de acetilcolina del músculo. Ver también WO 94/08007. ARIA es una heregulina tipo ß y carece del espaciador completo "glico" (rico en sitios de glicosilación) presentes entre el dominio tipo Ig y el dominio tipo EGF de HRGa, y HRGßl-ß3.

Marchionni e al., Na ture, 362:312-318 (1993) identificó varias proteínas derivadas de bovino que llaman a los factores de crecimiento gliales (GGFs) . Estos GGFs comparten el dominio tipo Ig y dominio tipo EGF con las otras proteínas de heregulina descritas anteriormente, pero también tienen un dominio de unión amino terminal. Los GGFs en general no tienen el espaciador completo "glico" entre el dominio tipo Ig y dominio tipo EGF. Solo uno de los GGFs, GGFII, posee un péptido señal N-terminal.

La expresión de la familia ErbB2 de los receptores y polipéptidos de heregulina en cáncer de mama se revisa en Bacus et al . , Pa thology Pa tterns, 102 (4) (Supp.1) :S13-S24 (1994) .

Ver también, Alimandi et al . , Oncogene, 10:1813-1821 (1995); Beerli et al . , Molecular and Cellular Biology, 15:6496-6505 (1995); Karunagaran et al . , EMBO J, 15:254-264 (1996); Wallasch et al . , EMBO J, 14:4267-4275 (1995); y Zhang et al . , Journal of Biological Chemistry, 271:3884-3890 (1996), en relación a la familia del receptor anterior.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN • Esta invención proporciona anticuerpos que enlazan a la proteína ErbB3 y poseen además una o más de las siguientes propiedades: una capacidad para reducir la formación inducida de heregulina de un complejo de proteína ErbB2-ErbB3 en una célula que expresa ErbB2 y ErbB3. La capacidad para aumentar la afinidad de enlace de heregulina con la proteína ErbB3, y la característica para reducir la activación de ErbB2 inducida por heregulina en una célula que expresa ErbB2 y ErbB3.

La invención también se refiere a un anticuerpo que enlaza a la proteína ErbB3 y reduce el enlace de heregulina a la misma.

Los anticuerpos preferidos son anticuerpos monoclonales que enlazan a un epítope en el dominio extracelular del receptor de ErbB3. En general, los anticuerpos de interés enlazarán al receptor de ErbB3 con una afinidad al menos aproximadamente lOnM, más preferentemente al menos aproximadamente InM, en ciertas modalidades, el anticuerpo se inmoviliza en (p. ej . , covalentemente enlazado a) una fase sólida, p. ej . , por purificación de afinidad del receptor o por pruebas de diagnóstico.

Los anticuerpos de los párrafos anteriores podrían proporcionarse en la forma de una composición que comprende el anticuerpo y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.

La invención también proporciona: una molécula de ácido nucleico aislada que codifica el anticuerpo de los párrafos anteriores que podría contener además un promotor operablemente unido al mismo; un vector de expresión que comprende la molécula de ácido nucleico operablemente unida a las secuencias control reconocidas por una célula huésped transformada con el vector; una línea celular que contiene el ácido nucleico (p. ej . una línea celular de hibridoma); y un proceso para usar una molécula de ácido nucleico que codifica el anticuerpo para efectuar la producción del anticuerpo que comprende cultivar una célula que contiene el ácido nucleico y, opcionalmente, recuperar el anticuerpo del cultivo celular y, preferentemente, el medio de cultivo celular.

La invención también proporciona un método para tratar un mamífero, que comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva del anticuerpo descrito aquí al mamífero, en donde el mamífero tiene un desorden que requiere tratamiento con el anticuerpo.

En un aspecto adicional, la invención proporciona un método para detectar ErbB3 in vi tro o in vivo que comprende poner en contacto el anticuerpo con una célula sospechosa de contener ErbB3 y detectar si se ha presentado el enlace. Por lo tanto, la invención proporciona una prueba para detectar un tumor caracterizada porque la expresión amplificada de ErbB3 comprende los pasos de exponer una célula al anticuerpo expuesto aquí y determinar el grado de enlace del anticuerpo con la célula. En general el anticuerpo para usar en tal prueba estará marcado. La prueba de aquí podría ser en una prueba in vi tro (tal como una prueba ELISA) o una prueba in vivo. Para diagnosticar el tumor in vivo, el anticuerpo se conjuga en general con un isótopo radioactivo y se administra a un mamífero, y el grado de enlace del anticuerpo con los tejidos en el mamífero se observa por búsqueda externa para radioactividad.

Breve Descripción de los Ddib jos La Fig. 1 representa HRG enlazado a células K562 ErbB3 en presencia de varios anticuerpos monoclonales anti-ErbB3. Los anticuerpos anti-ErbB3 purificados se incubaron con una suspensión de células K562 ErbB3 y 125I-HRGßl(17_244) . Después de aproximadamente 18 horas en hielo, se midieron las cuentas enlazadas a la célula. Las cuentas se muestran graficadas como un porcentaje de enlace en ausencia del anticuerpo (control) . El enlace no específico se determinó usando un exceso de HRGßl(177_244) (HRG) sin marcar. Los anticuerpos contra la proteína ErbB2 (2C4) y HSV (5B6) se usaron como controles negativos.

La Fig. 2 muestra el efecto de la concentración del anticuerpo en enlace de HRG. Un experimento dosis respuesta se desarrollo en el anticuerpo 3-8D6 que se encontró que aumenta el enlace de HRG. Las células K562 ErbB3 se incubaron con una concentración fija de 125I-HRG y concentraciones aumentadas del anticuerpo 3-8D6. Los resultados del experimento se muestran graficados como cuentas unidas a la célula contra concentración del anticuerpo.

La Fig. 3 ilustra el enlace de HRG a células K562 ErbB3 en presencia y ausencia del anticuerpo 3-8D6 o un fragmento Fab del mismo. Los experimentos de enlace competitivo del ligando se desarrollaron en ausencia (control) y presencia de 3-8D6 o Fab 100 nM. Los datos se graficaron como enlace/total (B/T) contra HRGßl(177_24) total.

Descripción Detallada de las Modalidades Preferidas I . Definiciones A menos que se indique lo contrario, el término "ErbB3" cuando se usa aquí se refiere a la proteína ErbB3 de mamífero y "er£>B3" se refiere al gen eri.B3 de mamífero. La proteína ErbB3 preferida es la proteína ErbB3 de humano presente en la membrana celular de una célula. El gen er£>B3 de humano se describe en la Patente US 5,480,968 y Plowman et al . , Na ti . Acad. Sci . USA, 87:4905-4909 (1990).

El anticuerpo de interés podría ser uno que no tenga reacción cruzada significativamente con otras proteínas tal como las codificadas por los genes erJBl, erbB2 y/o er¿»B4. En tales modalidades, el grado de enlace del anticuerpo con estas proteínas que no son ErbB3 (p. ej . , enlace superficial celular con el receptor endógeno) será menor del 10% como se determina por análisis de clasificación de células activas a flourescencia (FACS) o radioimunoprecipitación (RÍA) . Sin embargo, algunas veces el anticuerpo podría ser uno que tenga reacción cruzada con el receptor de ErbB4, y, opcionalmente, por ejemplo, no tenga reacción cruzada con el receptor de EGFR y/o ErbB2.

La "heregulina" (HRG) cuando se usa aquí se refiere a un polipéptido que activa el complejo de proteína ErbB2-ErbB3 (p. ej . induce la fosforilación de residuos tirosina en el complejo ErbB2-ErbB3 en el enlace al mismo) . Varios polipéptidos de heregulina abarcados por este término se han expuesto anteriormente. El término incluye fragmentos y/o variantes biológicamente activos de un polipéptido de HRG que se presenta en forma natural, tal como un fragmento de dominio similar a EGF del mismo (p. ej . HRGßl177_244) .

El "complejo de proteína ErbB2-ErbB3" es un oligómero asociado no covalentemente del receptor de ErbB2 y el receptor de ErbB3. Este complejo se forma cuando una célula que expresa ambos de estos receptores se expone a HRG. El complejo para aislarse por inmunoprecipitación y se analiza por SDS-PAGE como se describe en el siguiente Ejemplo.

La expresión "reduce la formación inducida por heregulina de un complejo de proteína ErbB2-ErbB3 en una célula que expresa ErbB2 y ErbB3" se refiere a la capacidad del anticuerpo para reducir significativa estadísticamente el número de complejos de proteína ErbB2-ErbB3 que se forman en una célula que se ha expuesto al anticuerpo y con respecto a HRG a una célula sin tratar (control) . La célula que expresa ErbB2 y ErbB3 puede ser una célula o línea celular que se presenta de forma natural (p. ej . célula Caov3) o puede producirse recombinantemente introduciendo el ácido nucleico que codifica cada una de estas proteínas en una célula huésped. Preferentemente, el anticuerpo reducirá la formación de este complejo en al menos 50%, y más preferentemente al menos 70%, como se determina por medio de densitometría de búsqueda de reflectancia de Western blots del complejo (ver el siguiente Ejemplo) .

El anticuerpo que "reduce la activación de ErbB2 inducida por heregulina en una célula que expresa ErbB2 y ErbB3" es una que reduce significativa estadísticamente la actividad de fosforilación de la tirosina de ErbB2 que se presenta cuando HRG se enlaza a ErbB3 en el complejo de proteína ErbB2-ErbB3 (presente en la superficie de una célula que expresa los dos receptores) con respecto a la célula sin tratar (control) . Esto puede determinarse en base a los niveles de fosfotirosina en el complejo ErbB2-ErbB3 después de la exposición del complejo a HRG y el anticuerpo de interés. La célula que expresa la proteína ErbB2 y ErbB3 puede ser una célula o línea celular que se presenta de forma natural (p. e . célula Caov3) o puede producirse recombinantemente. La activación de ErbB2 puede determinarse por Western blot seguido por prueba con un anticuerpo anti- fosfotirosina como se describe en el siguiente Ejemplo. Alternativamente, la prueba de activación del receptor de • cinasa se describe en WO 95/14930 y Sadick et al . , Analytical 5 Biochemistry, 235:207-214 (1996) puede usarse para cuantificar la activación de ErbB2. Preferentemente, el anticuerpo reducirá la activación de ErbB2 inducida por heregulina en al menos 50%, y más preferentemente al menos 70%, como se determina por densitometría por búsqueda de 10 reflectancia de Western blots (manchado Western) del complejo probado por un • anticuerpo anti-fosfotiros-ina (ver el siguiente Ejemplo) .

El anticuerpo podría ser uno que "aumenta la afinidad de enlace de heregulina por la proteína ErbB3". Esto significa que, en presencia del anticuerpo (p. ej . anticuerpo 100 nM) , 15 la cantidad de HRG que se enlaza a ErbB3 (p. ej . , ErbB3 endógeno presente en una célula o línea celular que se presenta de forma natural o introducido por técnicas recombinantes, ver el siguiente Ejemplo) , con respecto al control (sin anticuerpo), se incrementa de forma 20 significativa estadísticamente. Por ejemplo, la cantidad de HRG que se enlaza a la línea celular transfectada k562 con erJB3 como se describe aquí podría incrementarse en presencia del anticuerpo 100 nM en al menos 10%, preferentemente al menos 50%, y más preferentemente al menos 100% (ver Fig. 1), con respecto al control.

El anticuerpo que reduce el enlace de HRG a la proteína de ErbB3 (p. ej . ErbB3 presente en una célula) es el que interfiere con el sitio de enlace de HRG en la proteína ErbB3 tal que se disminuye de forma significativa estadísticamente la cantidad de heregulina que es permite enlazar a este sitio de la molécula. Ejemplo de tales anticuerpos son los anticuerpos 3-2F9, 3-3E9 y 3-6B9 descritos en el Ejemplo de aquí.

El término "anticuerpo" se usa en el sentido más amplio y cubre específicamente anticuerpos monoclonales intactos, anticuerpos policlonales, (p. ej . anticuerpos biespecíficos) formados de al menos dos anticuerpos intactos, y fragmentos de anticuerpos tan grandes que exhiben la actividad biológica deseada. El anticuerpo podría ser, por ejemplo, un IgM, IgG (p. ej . IgGj, IgG2, IgG3 o IgG4), IgD, IgA o IgE. Sin embargo, el anticuerpo no es preferentemente un anticuerpo IgM.

Los "fragmentos de anticuerpo" comprenden una porción de un anticuerpo intacto, en general el enlace de antígeno o la región variable del anticuerpo intacto. Ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen fragmentos Fab, Fab' , F(ab')2, y Fv; diacuerpos; moléculas de anticuerpo de carga simple; y anticuerpos multiespecíficos formados a partir fragmentos de anticuerpo.

El término "anticuerpo monoclonal" como se usa aquí se refiere a un anticuerpo obtenido a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, p. ej . , los anticuerpos individuales que contiene la población son idénticos excepto por mutaciones posibles que se presentan de forma natural que podrían presentarse en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, que se dirigen contra un sitio antigénico simple. Además, en contraste a las preparaciones de anticuerpo convencional (policlonal) que incluyen típicamente diferentes anticuerpo dirigidos contra diferentes determinantes (epítopes), cada anticuerpo monoclonal se dirige contra un solo determinante en el antígeno. Además de su especificidad, los anticuerpos monoclonales son ventajosos en que se sintetizan por medio del cultivo de hibridoma, sin contaminar por otras inmunoglobulinas. El modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo como se va a obtener a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogénea, y no se va a construir como requiere la producción del anticuerpo por medio de cualquier método particular por ejemplo, los anticuerpo monoclonales que se van a usar de acuerdo con la presente invención podrían hacerse por el método de hibridoma descrito primero por Kohier et al . , Nature, 256:495 (1975), o podrían hacerse por métodos de ADN recombinante (ver, p. ej., Patente U.S. No. 4,816,567). Por ejemplo, los "anticuerpos monoclonales" también podrían aislarse a partir de bibliotecas de anticuerpo de fago usando las técnicas descritas en Clackson et al . , Nature, 352:624-628 (1991) y Marks et al . , J. Mol . Biol . , 222:581-597 (1991).

Los anticuerpos monoclonales incluyen específicamente aquí anticuerpos "quiméricos" (inmunoglobulinas) en los que una porción de la cadena pesada y/o ligera es idéntica con u homologa a las secuencias correspondientes de los anticuerpos derivados de otras especies o que pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpo, así como fragmentos de tales anticuerpos, de tal tamaño que exhiben la actividad biológica deseada (Patente U.S. No. 4,816,567; Morrison et al . , Proc. Nati . Acad. Sci . USA, 81:6851-6855 (1984)).

Las formas "humanizadas" de anticuerpos no humanos (p ej . , murino) son inmunoglobulinas quiméricas, cadenas de inmunoglobulinas o fragmentos de las mismas (tal como Fv, Fab, Fab', F(ab')2 u otras secuencias de anticuerpos que enlazan antígenos) que contienen la secuencia mínima derivada de inmunoglobulina no humana. Para la mayor parte, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en los que los residuos de una región que determina complementariedad (CDR) del receptor se recolocan por residuos de una CDR de una especie no humana (anticuerpo donador) tal como ratón, rata o conejo que tienen la especificidad, afinidad y capacidad deseada. En algunos casos, los residuos de la región estructural Fv (FR) de la inmunoglobulina humana se reemplazan por los residuos no humanos correspondientes. Además, los anticuerpos humanizados podrían contener residuos que no se encuentran en el anticuerpo receptor ni en la CDR importada o secuencias estructurales. Estas modificaciones se hacen para refinar y optimizar mas el funcionamiento del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todos de al menos uno, y típicamente dos, dominios variables, en los que todos o sustancialmente todas las regiones CDR corresponden a las de una inmunoglobulina no humana y todos o sustancialmente todas las regiones FR son las de una secuencia de inmunoglobulina humana. Óptimamente el anticuerpo humanizado también comprenderá al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fc), típicamente de la de una inmunoglobulina. Para detalles adicionales, ver Jones et al . , Na ture, 321:522-525 (1986). El anticuerpo humanizado incluye un anticuerpo Primatized^ en donde la región que enlaza antígeno del anticuerpo se deriva de un anticuerpo producido inmunizando monos macacos con el antígeno de interés.

Los fragmentos de "cadena simple de Fv" o sFv" comprenden los dominios VH y VL del anticuerpo, en donde estos dominios se presentan en una cadena simple de polipéptido. En general, el polipéptido Fv comprende además un polipéptido enlazador entre los dominios VH y VL que permiten al sFv formar la estructura deseada para enlazar el antígeno. Para una revisión de sFv ver Pluckthun en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994).

El término "diacuerpo" se refiere a pequeños fragmentos de anticuerpo con dos sitios de enlace de antígeno, estos fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de cadena ligera (VL) en la misma cadena de polipéptido (VH-VL) . Usando un enlazador que es demasiado corto para permitir el apareo entre los dos dominios en la misma cadena, los dominios se forzan a aparearse con los dominios complementarios de otra cadena y crean dos sitios de enlace de antígeno. Los diacuerpos se describen mas completamente en, por ejemplo, EP 404,097; WO 93/11161; y Hollinger et al . , Proc. Nati . Acad. Sci . USA, 90:6444-6448 (1993).

Un anticuerpo "aislado" es una que se ha identificado y separado y/o recuperado de un componente de su ambiente natural. Los componentes contaminantes de su ambiente natural son materiales que interferirían con el diagnóstico de usos terapéuticos para el anticuerpo, y podrían incluir enzimas, hormonas, y otros solutos proteicos o no proteicos. En modalidades preferidas, el anticuerpo se purificará (I) a mas de 95% en peso del anticuerpo como se determina por el método de Lowry, y mas preferentemente mas de 99% en peso, (2) a un grado suficiente para obtener al menos 15 residuos de la secuencia de aminoácido N-terminal o interno por el uso de un secuenciador de copa giratoria, o (3) para homogeneidad por SDS-PAGE bajo condiciones reducidas o no reducidas usando azul de Coomassie o, preferentemente, tintura de plata. El anticuerpo aislado incluye el anticuerpo in si tu dentro de células recombinantes dado que al menos un componente del ambiente natural del anticuerpo no se presentará. Ordinariamente, sin embargo, el anticuerpo aislado se preparará por al menos un paso de purificación.

Como se usa aquí, el término "epítope que enlaza al receptor silvestre" se refiere a un epítope de la región Fc de una molécula IgG (p. ej . , IgGlf IgG2, IgG3, o IgG4) que es responsable de aumentar la vida media del suero in vivo de la molécula IgG.

"Tratamiento" se refiere al tratamiento terapéutico y medidas profilácticas o preventivas. Los que necesitan tratamiento incluyen aquellos que ya tienen el desorden así • como aquellos a los que se va a evitar el desorden.

"Mamífero" para fines del tratamiento se refiere a cualquier animal clasificado como un mamífero, incluyendo humanos, animales domésticos y de granja, y animales de zoológico, deportivos, o mascotas, tal como perros, caballos, gatos, vacas, etc. Preferentemente, el mamífero es humano. • 10 Un "desorden" es cualquier condición que se beneficiaría del tratamiento con el anticuerpo anti-ErbB3. Esto incluye desórdenes crónicos y agudos o enfermedades que incluyen las condiciones patológicas que predisponen al mamífero al desorden en cuestión. En general, el desorden será uno cuya activación excesiva del complejo de proteína ErbB2-ErbB3 se presenta por medio de heregulina. Ejemplos no limitativos de desórdenes a tratarse se incluyen aquí tumores benignos y malignos; leucemias y tumores malignos linfoideos; desórdenes neuronales, gliales, astrocitales, hipotalámicos y otros glandulares, macrofagales, epiteliales, estromales y blastocoélicos; y desórdenes inflamatorios, angiogénicos e inmunológicos .

Los términos "cáncer" y "canceroso" se refieren a o describen la condición fisiológica en mamíferos que se caracteriza típicamente por crecimiento celular no regulado. Ejemplos de cáncer incluyen pero no se limitan a, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma, y leucemia. Ejemplos mas particulares de tales cánceres incluyen cáncer de células escamosas, cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer gastrointestinal, cáncer pancreático, glioblastoma, cáncer cervical, cáncer de ovarios, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, hepatoma, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer colorrectal, carcinoma endometrial, carcinoma de la glándula salival, cáncer de riñon, cáncer renal, cáncer de próstata, cáncer de vulva, cáncer de la tiroides, carcinoma hepático y varios tipos de cáncer de cabeza y cuello.

El término "agente citotóxico" como se usa aquí se refiere a una sustancia que inhibe o previene la función de las células y/o causa destrucción de las células. El término se destina a incluir isótopos radioactivos (p. ej I, Y, Pr) , agentes quimioterapéuticos, y toxinas tales como toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, o fragmentos de las mismas.

Un "agente quimioterapéutico" es un compuesto, químico útil en el tratamiento de cáncer. Ejemplos de agentes quimioterapéuticos incluyen Adriamicina, 5-Fluorouracilo, Citosina arabinosida ("Ara-C"), Ciclofosfamida, Tiotepa, Busulfan, Citoxin, Taxol, Metotrexato, Cisplatina, Melfalan, Vinblastina, Bleomicina, Etoposida, Ifosfamida, Mitomicina C, Mitoxantrona, Vincreistina, Vinorelbina, Carboplatina, Teniposida, Daunomicina, Carmiomicina, Aminopterina, Dactinomicina, Mitomicinas, Esperamicinas (ver Pat. U.S. No. 4,675,187), Melfalan y otras mostazas relacionadas a nitrógeno.

El término "citosina" es un término genérico para proteínas liberadas por una población celular que actúan en otra célula como mediadores intracelulares. Ejemplos de tales citosinas son linfocinas, monocinas, y hormonas tradicionales de polipéptido. Incluidas entre las citosinas están las hormonas de crecimiento tal como la hormona de crecimiento humano, hormona de crecimiento humano N-metionilo, y hormona de crecimiento bovino; hormona paratiroide; tiroxina; insulina; proinsulina; relaxina; prorrelaxina; hormonas de glicoproteína tal como hormona que estimula el folículo (FSH), hormona que estimula la tiroides (TSH) , y hormona de lutenización (LH) ; factor de crecimiento hepático; factor de crecimiento de fibroblasto; prolactina; lactógeno de placenta; factor a y ß de necrosis de tumor; sustancia que inhibe el mullerian; péptido asociado a la gonadotropina de ratón; activina; factor de crecimiento endotelial vascular; integrina; trombopoietina (TPO) ; factores de crecimiento del nervio tales como NGF-ß; factor de crecimiento de plaqueta; factores de crecimiento transformantes (TGFs)tal como TGF-a y TGF-ß; factor de crecimiento I y II similares a insulina; eritropoietina (EPO); factores osteoinductivos; interferones tal como interferón a, ß, y y; factores estimulantes de colonia (CSFs) tal como macrófago-CSF (M-CSF); granulacito-macrófago-CSF (GM-CSF); y granulocito-CSF (G-CSF); interleucinas (lis) tal como IL-1, IL-la, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12; un factor de necrosis de tumor tal como TNF-a y TNF-ß; y otros factores polipéptidos que incluyen LIF y el estuche de ligando (KL) . Como se usa aquí, el término citosina incluye proteínas de fuentes naturales o de cultivo celular recombinante y equivalentes biológicamente activos de las citosinas de secuencia nativa.

El término "profármaco" como se usa en esta solicitud se refiere a una forma precursora o derivada de una sustancia farmacéuticamente activa que es menos citotóxica a las células tumorales comparado al fármaco original y es capaz de activarse enzimática o convertirse en la forma original más activa. Ver, p. ej . , Wilman, "Produgs in Cáncer Chemotherapy" Biochemical Society Transactions, 14, pp. 375-382, 615th Meeting Belfast (1986) y Stella et al . , "produgs: A Chemical Approach to Targeter Drug Delivery", Directed Drug Delivery, Borchardt et al . , 8ed. ) , pp. 247-267, Humana Press (1985). Los profármacos de esta invención incluyen, pero nó se limitan a, profármacos que contienen fosfato, profármacos que contienen tiofosfato, profármacos que contienen sulfato, profármacos que contienen péptidos, profármacos modificados D-aminoácido, profármacos glicosilados, profármacos que contienen ß-lactama, profármacos que contienen fenoxiacetamida opcionalmente sustituida o profármacos que contienen fenilacetamida opcionalmente sustituida, 5-fluorocitosina y otros profármacos de 5-fluorouridina que pueden convertirse en el fármaco libre citotóxico más activo. Ejemplos de profármacos citotóxicos que pueden derivarse en una forma de profármaco para usar en esta invención incluyen, pero no se limita a, los agentes quimioterapéuticos descritos anteriormente .

La palabra "marca" cuando se usa aquí se refiere a un compuesto o composición detectable que se conjuga directa o indirectamente con anticuerpo. La marca podría detectarse por si misma (p. ej . marcas de radioisótopo o marcas fluorescentes) o, en el caso de una marca enzimática, podría catalizar la alteración química de un sustrato compuesto o composición que es detectable.

Por "fase sólida" se indica una matriz no acuosa a la que puede adherirse el anticuerpo de la presente invención. Ejemplos de fases sólidas abarcadas aquí incluyen las formadas parcialmente o completamente de vidrio (p. ej . , vidrio de poro controlado), polisacáridos (p. ej ¿ , agarosa), poliacrilamidas, poliestireno, alcohol de polivinilo y silicones. En ciertas modalidades, dependiendo del contexto, la fase sólida puede comprender el pozo de una placa de prueba; en otras es una columna de purificación (p. ej . , una columna de cromatografía de afinidad) . Este término también incluye una fase sólida discontinua de partículas discretas, tal como las descritas en la Patente U.S. No. 4,275,149.

Una "liposoma" es una vesícula pequeña compuesta de varios tipos de lípidos, fosfolípidos y/o surfactantes que son útiles para liberar un fármaco (tal como los anticuerpos anti-ErbB3 expuestos aquí y, opcionalmente, un agente quimioterapéutico) a un mamífero. Los componentes del liposoma se arreglan comúnmente en una formación bicapa, similar al arreglo lípido de las membranas biológicas.

Una molécula de ácido nucleico "aislada" es una molécula de ácido nucleico que se identifica y se separa de al menos una molécula de ácido nucleico contaminante con la que está asociada ordinariamente en la fuente natural del ácido nucleico del anticuerpo. Una molécula de ácido nucleico aislada es diferente en la forma o ambiente en el que se encuentra en la naturaleza. Por lo tanto las moléculas de ácido nucleico aisladas se distinguen de la molécula de ácido nucleico ya que existe en las células de forma natural. Sin embargo, una molécula de ácido nucleico aislado incluye una molécula de ácido nucleico contenido en las células que expresan ordinariamente el anticuerpo donde, por ejemplo, la molécula de ácido nucleico está en una localización cromosomal diferente de las de células naturales.

La expresión "secuencias control" se refiere a secuencias de ADN necesarias para la expresión de una secuencia codificante enlazado operablemente en un organismo huésped particular. Las secuencias control que son adecuadas para procariotes, por ejemplo, incluyen un promotor, opcionalmente una secuencia operador, y un sitio de enlace del ribosoma. Las células eucariotas se conocen por utilizar promotores, señales de poliadenilación, y aumentadores.

El ácido nucleico está "enlazado operablemente" cuando está colocado en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, el ADN de una presecuencia o guía secretora se enlaza operablemente al ADN de un polipéptido si se expresa como una preproteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o aumentador se enlaza operablemente a una secuencia codificante si afecta la transcripción de la secuencia; o un sitio de enlace del ribosoma se enlaza operablemente a una secuencia codificante si se posiciona para facilitar la translación. En general, "enlazado operablemente" significa que las secuencias de ADN que están enlazadas son contiguas, y, en caso de una guía secretora, contiguas y en fase de lectura. Sin embargo, los aumentadores no tienen que ser contiguos. El enlace se lleva a cabo por la unión en sitios de restricción convenientes. Si tales sitios no existen, los adaptadores del oligonucleótido sintético se usan de acuerdo con la práctica convencional.

Como se usa aquí, la expresión "célula", "línea celular", y "cultivo celular" se usa indistintamente y todas las designaciones incluyen progenie. Así, las palabras "transformantes" y "células transformadas" incluyen la célula elemental sometida y los cultivos derivados de la misma sin estimar el número de transferencias. También se entiende que toda la progenie no podría ser precisamente idéntica en el contenido de ADN, debido a mutaciones deliberadas o inadvertidas. Se incluye la progenie mutante que tiene la misma función o actividad biológica ya que se cribó de la célula transformada originalmente. Donde se destinan designaciones distintas, será claro en el contexto.

II. Formas para Llevar a cabo la Invención ?. Preparación del Anticuerpo Sigue una descripción como ejemplos de técnicas para la producción de los anticuerpos reivindicados. (i) Anticuerpos policlonales Los anticuerpos policlonales se cultivan generalmente en animales por medio de inyecciones múltiples subcutáneas (sc) o intraperitoneales (ip) del antígeno relevante y un adyuvante. Podría ser útil conjugar el antígeno relevante con una proteína que es inmunogénica en las especies a ser inmunizadas, p. ej . , hemocianina de concha de cerradura, albúmina de suero, tiroglobulina de bovino, o inhibidor de tripsina de soya que usa un agente bifuncional o derivado, por ejemplo, éster de maleimidobenzoilo sulfosuccinimida (conjugación a través de los residuos de cisteína), N-hidroxisuccinimida (mediante los residuos de lisina) , glutaraldehído, anhídrido succínico, S0C12, o R1N=C=NR, donde R y R1 son grupos alquilo diferentes.

Los animales se inmunizan contra el antígeno, conjugados inmunogénicos, o derivados por combinación, p. ej . , 100 µg o 5 µg de la proteína o conjugado (de conejos o ratones, respectivamente) con 3 volúmenes del adyuvante completo de Freund e inyectando la solución intradermalmente en sitios múltiples. Un mes después los animales se levantaron con 1/5 a 1/10 de la cantidad original del péptido o conjugado en el adyuvante completo de Freund mediante inyección subcutánea en sitios múltiples. De siete a 14 días después los animales se sangraron y el suero se prueba para titular con anticuerpo. Los animales se levantan hasta la placa de titulación. Preferentemente, el animal se levanta con el conjugado del mismo antígeno, pero con una proteína diferente y/o un reactivo de enlace cruzado diferente. Los combinados también pueden hacerse en cultivo de células recombinantes como fusiones de proteínas. También, los agentes de agregación tal como alúmina se usan apropiadamente para aumentar la respuesta inmune. (ii) Anticuerpos monoclonales Los anticuerpos monoclonales se obtienen de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, p. ej . , los anticuerpos individuales que contiene la población son idénticos excepto por posibles mutaciones que se presentan de forma natural que podrían presentarse en cantidades menores. Así, el modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo a ya que no es una mezcla de anticuerpos discretos.

Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales podrían hacerse usando el método de hibridoma descrito primero por Kholes et al . , Nature, 256:496 (1975), o podría hacerse por métodos de ADN recombinante (Patente U.S. No. 4,816,567).

En el método de hibridoma, un ratón u otro animal huésped apropiado, tal como un hámster, se inmuniza como se describió anteriormente para sacar linfoci?s que producen o son capaces de producir anticuerpos- que enlazarán específicamente a la proteína usada para la inmunización. Alternativamente, los linfocitos podrían inmunizarse in vi tro . Los linfocitos se fusionan después con células de mieloma usando un agente de fusión adecuado, tal como polietilén glicol, para formar una célula de hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies : Principies and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986)).

Las células de hibridoma así preparadas se siembran y crecen en un medio de cultivo adecuado que contiene preferentemente una o mas sustancias que inhiben el crecimiento o sobrevivencia de las células de mieloma parenteral no fusionadas. Por ejemplo, si las células de mieloma parenteral carecen de la enzima hipoxantina guanina fosforribosil transferasa (HGPRT o HPRT), el medio de cultivo para las hibridomas incluirá típicamente hipoxantina, aminopterina, y timidina (medio HAT), cuyas sustancias evitan el crecimiento de células HGRPT-deficientes.

Las células de mieloma preferidas son aquellas que fusionan eficientemente, el soporte estable para producción de alto nivel del anticuerpo mediante las células seleccionadas que producen el anticuerpo, y son sensibles a un medio tal como medio HAT. Entre estas, las líneas celulares de mieloma preferidas son líneas de murino, tal como las derivadas de tumores de ratón MOPC-21 y MPC-11 disponibles en Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California USA, y células SP-2 o X63-Ag8-653 disponibles en la American Type Culture Collection, Rockville, Maryland USA. Las líneas celulares de mieloma humano y heteromieloma ratón-humano también se han descrito para la producción de anticuerpos monoclonales humanos (Kozbos, J. I munol . , 133:3001 (1984); Brodeur et al . , Monoclonal Antibody Production Techniques and Applica tions, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)).

El medio de cultivo en el que las células de hibridoma están creciendo se prueba para la producción de anticuerpos monoclonales dirigidos contra el antígeno. Preferentemente, la especificidad de enlace de los anticuerpos monoclonales producido por células de hibridoma se determina por inmunoprecipitación o por una prueba de enlace in vi tro, tal como radioinmunoprueba (RÍA) o prueba inmunoabsorbente de enzima enlazada (ELISA) .

La afinidad de enlace del anticuerpo monoclonal puede, por ejemplo, determinarse por el análisis Scatchard de Munson et al . , Anal . Biochem. , 107:220 (1980).

Después de que las células de hibridoma se identificaron que producen anticuerpos de la especificidad, afinidad, y/o actividad deseada, los clones podrían subclonarse limitando los procedimientos de dilución y crecimiento por métodos estándares (Goding, Monoclonal Antibodies : Principies and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986) ) . El medio de cultivo adecuado para este fin incluye, por ejemplo, medio D-MEM o RPMI-1640. Además, las células de hibridoma podrían crecer in vivo como tumores de ascitis en un animal.

Los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones se separan adecuadamente del medio de cultivo, fluido de ascitis, o suero por procedimientos convencionales de purificación de inmunoglobulina tal como, por ejemplo, A-Sefarosa de proteína, cromatografía de hidroxilapatita, electroforesis en gel, diálisis, o cromatografía de afinidad.

El ADN que codifica los anticuerpos monoclonales se aisla' y secuencia fácilmente usando procedimientos convencionales (p. ej . , usando sondas de oligonucleótido que son capaces de enlazarse específicamente a los genes que codifican las cadenas pesadas y ligeras de anticuerpos de murino) . Las células de hibridoma sirven como una fuente preferida de tal ADN. Una vez aislado, el ADN podría colocarse en vectores de expresión, que se transfectan después en células huésped tal como células de E. coli , células COS de simio, células de ovario de hámster Chino (CHO) , o células de mieloma que no producirán por el contrario la proteína de inmunoglobulina, para obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales en las células huésped recombinantes. Los artículos de revisión sobre expresión recombinante en bacterias de ADN que codifica el anticuerpo incluyen Skerra et al . , Curr. Opinión in Immunol . , 5:256-262 (1993) y Plückthun, Immunol . Revs . , 130:151-188 (1992).

En una modalidad adicional, los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo pueden aislarse a partir de una biblioteca de fago de anticuerpo generada usando las técnicas descritas en McCafferty et al . , Na ture, 348:552-554 (1990). Clackson et al . , Na ture, 352:624-628 (1991) y Marks et al . , J. Mol . Biol . , 22:581-597 (1991) describen el aislamiento de anticuerpos de murino y humano, respectivamente, usando bibliotecas de fago. Las publicaciones subsecuentes describen la producción de anticuerpos humanos de alta afinidad (rango nM) por medio de desordenamiento de la cadena (Marks et al . , Bio/Technology, 10:779-783 (1992)), así como infección combinatoria y recombinación in vivo como una estrategia para construir bibliotecas muy grandes de fago (Waterhouse et al . , Nuc. Acids . Res . , 21:2265-2266 (1993)). Así, estas técnicas son técnicas viables a las técnicas tradicionales de hibridoma de anticuerpo para el aislamiento de anticuerpos monoclonales.

El ADN también podría modificarse, por ejemplo, sustituyendo la secuencia que codifica para dominios constantes de cadena ligera y pesada en lugar de las secuencias homologas de murino (Patente U.S. No. 4,816,567; Morrison et al . , Proc. Nati . Acad. Sci . USA, 81:6851 (1984)), o uniendo covalentemente la secuencia que codifica inmunoglobulina toda o parte de la secuencia que codifica para un polipéptido que no es inmunoglobulina.

Típicamente tales polipéptidos que no son inmunoglobulina se sustituyen para los dominios constantes de un anticuerpo, o se sustituyen para los dominios variables de un sitio que combina antígeno que tiene especificidad para un antígeno y otro sitio que combina antígeno que tiene especificidad para un antígeno diferente. (iii) Anti cuerpos humanizados y humanos Los métodos para inmunizar anticuerpos no humanos son bien conocidos en el arte. En general, un anticuerpo humanizado tiene uno o mas residuos aminoácido introducidos en el a partir de una fuente que es no humana. Estos residuos aminoácido no humanos se refieren a menudo como residuos "importados", que se toman típicamente de un dominio variable "importado". La humanización puede desarrollarse esencialmente siguiendo el método de Winter y co-autores (Jones et al . , Na ture, 321:522-525 (1986); Riechmann et al . , Na ture, 331:323-327 (1988); Verhoeyen et al . , Science, 239:1534-1536 (1988)), sustituyendo secuencias de roedor CDRs o CDR para las secuencias correspondientes de un anticuerpo humano. Por lo tanto, tales anticuerpos "humanizados" son anticuerpos quiméricos (Patente U.S. No. 4,816,567) en donde sustancialmente menos de un dominio variable humano intacto se ha sustituido por la secuencia correspondiente a partir de una especie no humana. En la práctica, los anticuerpos humanizados son típicamente anticuerpos humanos en los que algunos residuos de CDR y posiblemente algunos residuos de FR se sustituyen por residuos de sitios análogos en anticuerpos de roedor.

La elección de dominios variables humanos, ligeros y pesados, que se van a usar para hacer los anticuerpos humanizados son muy importantes para reducir la antigenicidad. De acuerdo al método también llamado "mejor arreglo", la secuencia del dominio variable de un anticuerpo de roedor se criba contra la biblioteca completa de las secuencias conocidas del dominio variable de humano. La secuencia humana que es más cercana a la de roedor se acepta después como la estructura humana (FR) para el anticuerpo humanizado (Sims et al . , J. Im unol . , 151:2296 (1993); Chothia et al . , J. Mol . Biol . , 196:901 (1987)). Otro método usa un derivado de estructura particular a partir de la secuencia consenso de todos los anticuerpos humanos de un subgrupo particular de cadenas ligeras o pesadas. La misma estructura podría usarse para varios anticuerpos humanizados diferentes (Cárter et al . , Proc. Na ti . Acad. Sci . USA, 89:4285 (1992); Presta et al . , J. Immunol . , 151:2623 (1993)).

Además es importante que los anticuerpos se humanicen con retención de afinidad alta para el antígeno y otras propiedades biológicas importantes. Para lograr este objetivo, de acuerdo a un método preferido, los anticuerpos humanizados se preparan por un proceso de análisis de las secuencias parentales y varios productos humanizados conceptuales que usan modelos tridimensionales de las secuencias parentales y humanizadas. Los modelos tridimensionales de inmunoglobulina se disponen comúnmente y son familiares para los expertos en el arte. Los programas de computo se disponen de tal forma que ilustran y despliegan probables estructuras conformacionales tridimensionales de secuencias candidatas de inmunoglobulina. La inspección de estas presentaciones permite análisis del papel probable de los residuos en el funcionamiento de la secuencia candidata de inmunoglobulina, p. ej . , el análisis de residuos que influencian la capacidad de la inmunoglobulina candidata para enlazar su antígeno. De esta forma, los residuos FR pueden seleccionarse y combinarse a partir de las secuencias receptoras e importadoras para las características del anticuerpo deseado, tal que se logra afinidad aumentada para el antígeno destino. En general, los residuos CDR se involucran directamente y más sustancialmente para influenciar el enlace del antígeno.

Alternativamente, ahora es posible producir animales transgénicos (p. ej . , ratones) que son capaces, en inmunización, de producir un repertorio completo de anticuerpos humanos en ausencia de producción de inmunoglobulina endógena. Por ejemplo, se ha descrito que la eliminación de homocigoto del gen de la región de unión anticuerpo pesado-cadena (JH) en ratones mutantes quiméricos y línea germ resulta la inhibición completa de la producción de anticuerpo endógeno. La transferencia del arreglo del gen de inmunoglobulina de línea germ humano en tal ratón mutante de línea germ resultará en la producción de anticuerpos humanos al poner aprueba los antígenos. Ver, p. ej . , Jakobovits et al . , Proc. Na ti . Acad. Sci . USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al . , Na ture, 362:255-258 (1993); Bruggermann et al . , Year in Immuno . , 7:33 (1993). Los anticuerpos humanos también pueden derivarse de librerías que representan fagos (Hoogenboom et al . , J. Mol . Biol . , 227:381 (1991); Marks et al . , J. Mol . Biol . , 222:581-597 (1991)). (iv) Fragmentos de anticuerpo Varias técnicas se han desarrollado para la producción de fragmentos de anticuerpo. Tradicionalmente, estos fragmentos se derivaban por vía de digestión proteolítica de anticuerpos intactos (ver, p. ej . , Morimoto et al . , Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992) y Brennan et al . , Science, 229:81 (1985)). Sin embargo, estos fragmentos ahora pueden producirse directamente por medio de células huésped recombinantes. Por ejemplo, los fragmentos de anticuerpo pueden aislarse a partir de las bibliotecas de fago de anticuerpo discutidas antes. Alternativamente, los fragmentos Fab'-SH pueden recuperarse directamente de E. coli y acoplarse químicamente para formar fragmentos F(ab')2 (Cárter et al . , Bio/Technology 10:163-167 (1992)). De acuerdo a otro enfoque, los fragmentos F(ab')2 pueden aislarse directamente a partir del cultivo de células huésped recombinantes. Otras técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpo serán evidentes para los expertos en el arte. (v) Anticuerpos biespecíficos Los anticuerpos biespecíficos son anticuerpos que tienen especificidades de enlace para al menos dos epítopes diferentes. Ejemplo de anticuerpos biespecíficos podrían enlazar a dos epítopes diferentes de la proteína ErbB3. Otros anticuerpos podrían combinar un sitio de enlace ErbB3 con sitios de enlace de EGFR, ErbB2 y/o ErbB4. Alternativamente, un brazo anti-ErbB3 podría combinarse con un brazo que enlaza a una molécula que activa un leucocito tal como una molécula receptora de la célula T (p. ej . , CD2 o CD3), o receptores de Fc para IgG (FcyR), tal como FcyRI (CD64), FcyRII (CD32) y FcyRIII (CD16) para enfocar el mecanismo de defensa celular hacia la célula que expresa ErbB3. Los anticuerpos biespecíficos también podrían usarse para localizar agentes citotóxicos a las células que expresan ErbB3. Estos anticuerpos poseen un brazo que enlaza ErbB3 y un brazo que enlaza al agente citotóxico (p. ej . , saporina, anti-interferón-a, alcaloide vinca, cadena A de ricino, metotrexato o hapteno isótopo radioactivo) . Los anticuerpos biespecíficos pueden prepararse como anticuerpos de longitud completa con fragmentos de anticuerpo (p. ej . anticuerpos específicos F(ab')2).

Los métodos para hacer anticuerpos biespecíficos se conocen en el arte. La producción tradicional de anticuerpos biespecíficos de longitud completa se basa en la coexpresión de dos pares de inmunoglobulina cadena pesada-cadena ligera, donde estas dos cadenas tienen especificidades diferentes (Millstein et al . , Nature, 305:537-539 1983)). Debido a la variedad aleatoria de las cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulina, estos hibridomas (cuadromas) producen una mezcla potencial de 10 moléculas diferentes de anticuerpo, de las cuales solamente una tiene la estructura biespecífica correcta. La purificación de la molécula correcta que usualmente se da por pasos de cromatografía de afinidad, más bien es incomodo, y el rendimiento de producto es bajo. Procedimientos similares se exponen en WO 93/08829, y en Traunecker et al . , EMBO J. , 10:3655-3659 (1991).

De acuerdo a un enfoque diferente, los dominios variables de anticuerpo con las especificidades de enlace deseadas (sitios de combinación anticuerpo-antígeno) se fusionan para secuencias de dominio constante de inmunoglobulina) . La fusión es preferentemente con un dominio constante de inmunoglobulina de cadena pesada, que comprende al menos parte de la unión, regiones CH2 y CH3. Se prefiere tener la primera región constante de cadena pesada (CH1) que contiene el sitio necesario para enlazar la cadena ligera, presente en al menos una de las fusiones. Los ADNs que codifican las fusiones de cadena pesada y, si se desea, la cadena ligera de inmunoglobulina, se insertan en vectores de expresión separados, y se cotransfectan en un organismo huésped adecuado. Esto proporciona gran flexibilidad para ajustar las proporciones mutuas de los tres fragmentos de polipéptido en las modalidades cuando las relaciones desiguales de las tres cadenas de polipéptido se usan en la construcción que proporciona el rendimiento óptimo. Sin embrago, es posible insertar las secuencias que codifican para dos o tres cadenas de polipéptido en un vector de expresión cuando la expresión de al menos dos cadenas de polipéptido en relaciones iguales resultan rendimientos altos o cuando las relaciones son de significancia no particular.

En una modalidad preferida en este enfoque, los anticuerpos biespecíficos se componen de una cadena pesada de inmunoglobulina híbrida con una primera especificidad de enlace en un brazo, y una pareja cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina híbrida (que proporciona una segunda especificidad de enlace) en el otro brazo. Se encontró que esta estructura asimétrica facilita la separación del compuesto biespecífico deseado a partir de combinaciones de cadena de inmunoglobulina no deseado, ya que la presencia de una cadena ligera de inmunoglobulina en solamente una mitad de la molécula biespecífica proporciona una forma fácil de separación. Este enfoque se expone en WO 94/04690. Para detalles adicionales de generación de anticuerpos biespecíficos ver, por ejemplo, Suresh et al . , Methods in Enzymology, 121:210 (1986).

De acuerdo a otro enfoque, la interfase, entre un par de moléculas de anticuerpo puede ser con ingeniería para maximizar el porcentaje de heterodímeros que se recuperan a partir del cultivo de células recombinantes. La interfase preferida comprende al menos una parte del dominio CH3 de un dominio constante de anticuerpo. En este método, una o más cadenas laterales de aminoácidos pequeños de la interfase de la primera molécula de anticuerpo se reemplazan con cadenas laterales mayores (p. ej . tirosina o triptofano). Las "cavidades" compensatorias de tamaño idéntico o similar a las cadenas laterales grandes se crean en la interfase de la segunda molécula del anticuerpo reemplazando cadenas laterales de aminoácidos grandes con más pequeños (p. ej . alanina o treonina) . Esto proporciona un mecanismo para aumentar el rendimiento del heterodímero sobre otros productos finales no deseados tal como homodímeros.

Los anticuerpos biespecíficos incluyen anticuerpos de enlace cruzado o "heteroconjugado" por ejemplo, uno de los anticuerpos en el heteroconjugado puede acoplarse a avidina, los otros a biotina. Tales anticuerpos, por ejemplo, se han propuesto para dirigir células del sistema inmune hacia células no deseadas (Patente US No. 4,676,980), y para tratamiento de infección de VIH (WO 91/00360, WO 92/200373, y EP 03089) . Los anticuerpos heteroconjugados podrían hacerse usando cualquier método conveniente de enlace cruzado. Los agentes adecuados de enlace cruzado se conocen bien en el arte, y se exponen en la Patente US No. 4,676,980, junto con un número de técnicas de enlace cruzado.

Las técnicas para generar anticuerpos biespecíficos a partir de fragmentos de anticuerpo también se han descrito en la literatura. Por ejemplo, los anticuerpos biespecíficos pueden prepararse usando enlace químico. Brennan et al . , Science, 229:81 (1985) describe un procedimiento en donde los anticuerpos intactos se cortan proteolíticamente para generar fragmentos F(ab')2. Estos fragmentos se reducen en presencia de arsenito de sodio agente acomplejante de ditiol para estabilizar ditioles vecinos y evitar formación de disulfuro intermolecular. Los fragmentos Fab' generados se convierten entonces a derivados de tionitrobenzoato (TNB) . Uno de los derivados de Fab'-TNB se reconvierte entonces a Fab' -tiol por la reducción con mercaptoetilamina y se mezcla con una cantidad equimolar del otro derivado de Fab'-TNB para formar el anticuerpo biespecífico. Los anticuerpos biespecíficos producidos pueden usarse como agentes para la inmovilización selectiva de enzimas.

El progreso reciente a facilitado la recuperación directa de fragmentos Fab'-SH a partir de E. coli , que pueden acoplarse químicamente para formar anticuerpos biespecíficos. Shalaby et al . , J. Exp. Med. , 175:217-225 (1992) describe la producción de una molécula de anticuerpo biespecífico inmunizado completamente F(ab')2. Cada fragmento Fab' se secretó separadamente de E. coli y se sometió a acoplamiento químico dirigido in vi tro para formar el anticuerpo biespecífico. El anticuerpo biespecífico así formado permitió enlazar células que sobreexpresan el receptor HER2 y células T humanas normales, así como activar la actividad lítica de linfocitos citotóxicos humanos contra tumores receptores de mama humanos .

También se han descrito varias técnicas para hacer y aislar fragmentos de anticuerpo biespecíficos directamente a partir de cultivo de células recombinantes. Por ejemplo, los anticuerpos biespecíficos se han producido usando zíper de leucina. Kostelny et al . , J. Immunol . , 148 (5) :1547-1553 (1992) . Los péptidos de zíper de leucina de las proteínas Fos y Jun se unieron a las porciones Fab' de dos anticuerpos diferentes por medio de fusión del gen. Los homodímeros de anticuerpo se reducen a la región de unión para formar monómeros y después re-oxidarse para formar los heterodímeros del anticuerpo. Este -método también puede utilizarse para la producción de homodímeros de anticuerpo. La tecnología "diacuerpo" descrita por Hollinger et al . , Proc. Na ti . Acad. Sci . USA, 90:6444-6448 (1993) a proporcionado un mecanismo alterno para hacer fragmentos de anticuerpo biespecífico. Los fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de cadena ligera (VL) por medio de un enlazador que es demasiado corto para permitir el apareamiento entre los dos dominios en la misma cadena. Por lo tanto, los dominios VH y VL de un fragmento se forzan para aparearse con los dominios VL y VH complementarios de otro fragmento formando de este modo dos sitios que enlazan antígeno. También se ha reportado otra estrategia para hacer fragmentos de anticuerpo biespecífico mediante el uso de dímeros de cadena simple Fv (sFv) . Ver Gruber et al . , J. Immunol . , 152:5368 (1994).

Se contemplan anticuerpos con más de dos valencias. Por ejemplo, pueden prepararse anticuerpos triespecíficos. Tutt et al . , J. Immunol . 147:60 (1991). (vi) Cribado para anticuerpos con las propiedades deseadas Se han descrito antes las técnicas para generar anticuerpos. Se seleccionan los anticuerpos que tienen las características descritas aquí.

Para seleccionar anticuerpos que reducen la formación inducida de HRG de la proteína compleja ErbB2-ErbB3, las células que expresan ambos receptores (p. ej . células Caov3) pueden preincubarse con amortiguador (control o anticuerpo, después se tratan con HRG o amortiguador control. Entonces las células se lisan y los lisados crudos pueden centrifugarse para retirar el material insoluble. Los sobrenadantes podrían incubarse con un anticuerpo específico para ErbB2 acoplado covalentemente a su fase sólida. Después del lavado, los inmunoprecipitados podrían separarse por medio de SDS-PAGE. Los Western blots de los geles se prueban entonces con anticuerpo anti-ErbB2. Después de la visualización, las manchas podrían cortarse en tiras y re-probarse con un anticuerpo anti-ErbB2. La densitometría por búsqueda de reflectancia del gel puede realizarse para cuantificar el efecto del anticuerpo en cuestión sobre la formación inducida de HRG del complejo. Pueden seleccionarse los anticuerpos que reducen la formación del complejo ErbB2-ErbB3 relativo al control (células sin tratar) . Ver el siguiente Ejemplo.

Para seleccionar los anticuerpos que reducen la activación de ErbB2 inducida por HRG en una célula que expresa el receptor de ErbB2 y ErbB3, las células pueden preincubarse con amortiguador (control) o anticuerpo, tratarse después con HRG o amortiguador control. Las células se lisan entonces y el lisado crudo puede centrifugarse para retirar el material insoluble. La activación de ErbB2 puede determinarse por medio de Western blot seguido por la prueba con un anticuerpo anti-fosfoteosina como se describe en el siguiente Ejemplo. Por ejemplo, la activación de ErbB2 puede cuantificarse por vía de densitometría de búsqueda de reflectancia de gel. Alternativamente, la prueba de activación del receptor de cinasa se describe en WO 95/14930 , ? 51 y Sadick et al . , Analytical Biochemistry, 235:207-214 (1996) puede usarse para determinar la activación de ErbB2.

El efecto del anticuerpo en enlace de HRG a ErbB3 puede determinarse incubando las células que expresan este receptor 5 (p. ej. células 4E9H3 transfectadas para expresar ErbB3) con HRG radiomarcado (p. ej . el dominio similar a EGF del mismo), en ausencia (control) o presencia del anticuerpo ErbB3, por ejemplo, como se describe en el siguiente Ejemplo. Los anticuerpos que aumentan la afinidad de enlace de HRG para el receptor de ErbB3 pueden seleccionarse para desarrollo adicional. Los anticuerpos que aumentan el enlace de afinidad de HRG para el receptor ErbB3 pueden seleccionarse para desarrollo adicional. Donde el anticuerpo de la elección es uno que bloquea el enlace de HRG para ErbB3, pueden identificarse los anticuerpos que hacen esta prueba.

Para cribar anticuerpos que enlazan al epítope en ErbB3 enlazado por medio de un anticuerpo de interés (p. ej . , aquellos que bloquean el enlace del anticuerpo 3-8B8 a ErbB3), puede desarrollarse una prueba de rutina de bloqueo 20 cruzado tal como la descrita en Antibodies, A Labora tory Manual , Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lañe (1988). (vii) Ingeniería de la función efectora Podría ser deseable modificar el anticuerpo de la invención con respecto a la función efectora, por ejemplo, para aumentar la efectividad del anticuerpo en el tratamiento de cáncer. Por ejemplo, residuos de cisteína podrían introducirse en la región Fc, permitiendo así la formación del enlace disulfuro intercadena en esta región. El anticuerpo homodimérico así generado podría tener capacidad de internalización mejorada y/o aumento de muerte celular por medio del complemento y citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC). Ver Carón et al . , J. Exp. Med. 176:1191-1195 (1992) y Shopes, B. J. Immunol . 148:2918-2922 81992). Los anticuerpos homodiméricos con actividad anti-tumor mejorada también podrían prepararse usando enlazadores cruzados heterobifuncionales como se describe en Wolff et al . , Cáncer Research 53:2560-2565 (1993). Alternativamente, un anticuerpo puede someterse a ingeniería el cual tiene regiones Fc duales y podría de este modo tener lisis del complemento y capacidades ADCC mejorados. Ver Stevenson et al . Anti -Cancer Drug Design 3:219-230 (1989). (viii) Inmunocon jugados La invención también pertenece a los inmunoconjugados que comprenden el anticuerpo descrito aquí conjugado para un agente citotóxico tal como un agente quimioterapéutico, toxina (p. ej . una toxina activa enzimáticamente de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, o fragmentos de la misma), o un isótopo radioactivo (p. ej . , un radioconjugado) .

Los agentes quimioterapéuticos útiles en la generación de tales inmunoconjugados se han descrito con anterioridad. Las toxinas y fragmentos de las mismas activas enzimáticamente que pueden usarse incluyen cadena A de difteria, fragmentos activos no enlazados de la toxina de difteria, cadena A de exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa ) cadena A de ricino, cadena A de abrina, cadena A de modecina, alfa-sarcina, proteínas de Aleuri tes fordii , proteínas de diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII, y PAP-S), inhibidor de mormodica charantia, curcina, crotina, inhibidor de sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina y tricotecenes. Una variedad de radionúcleos están disponibles para la producción de anticuerpos anti-ErbB3 radioconjugados. Los ejemplos incluyen 212Bi , 131I , 131In, 90Y y 186Re .

Los conjugados del anticuerpo y agente citotóxico se hacen usando una variedad de agentes acopladores de proteína bifuncional tal como propionato de N-succinimidil-3- (2-piridilditiol) (SPDP) , iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoésteres (tal como adipi idato HCL de dimetilo), esteres activos (tal como suberato de disuccinimidilo) , aldehidos (tal como glutaraldehído) , compuestos bis-azido (tal como bis(p-azido benzoilo) hexandiamina) , derivados bis-diazonio (tal como bis-(p-diazoniobenzoilo) -etilendiamina) , diisocianatos (tal como 2, 6-diisocianato de tolieno), y compuestos fluorados bis-activos (tal como 1, 5-difluoro-2, 4-dinitrobenceno) . Por ejemplo, una inmunotoxina de ricino puede prepararse como se describe en Vitetta et al . , Science 238:1098 (1987). El ácido 1-isotiocianatobencil-3-metildietileno triaminpentaacético marcado en el carbono 14 (MX-DTPA) es un ejemplo de agente quelante para conjugación del radionucleótido con el anticuerpo. Ver WO 94/11026.

En otra modalidad, el anticuerpo podría conjugarse con un "receptor" (como estreptavidina) para la utilización en tumores prerreceptores en donde el conjugado anticuerpo-receptor se administra al paciente, seguido por la remoción del conjugado sin enlazar de la circulación usando un agente clarificador y después la administración de un "ligando" (p. ej . avidina) que se conjuga con un agente citotóxico (p. ej . un radionúcleo) . (ix) Inmunoliposomas Los anticuerpos anti-ErbB3 expuestos aquí también podrían formularse como inmunoliposomas. Los liposomas que contienen el anticuerpo se preparan mediante los métodos conocidos en el arte, tal como se describe en Epstein et al . , Proc . Na ti . Acad. Sci . USA, 82:3688 (1985); Hwuang et al . , Proc. Na ti . Acad. Sci . USA, 77:4030 (1980); y Pat. U.S. Nos. 4,485,045 y 4,544,545. Los liposomas con tiempo de circulación aumentado se exponen en la Patente U.S. No. 5,013,556.

Los liposomas particularmente útiles pueden generarse por el método de evaporación de fase inversa con una composición de lípido que contiene fosfatidilcolina, colesterol y fosfatidiletanolamina derivada de PEG (PEG-PE) . Los liposomas se extruyen a través de filtros de tamaño de poro definido para obtener liposomas con el diámetro deseado. Los fragmentos Fab' del anticuerpo de la presente invención pueden conjugarse con los liposomas como se describe en Martin et al . J. Biol . Chem . 257:286-288 (1982) por vía de una reacción de a intercambio de disulfuro. Un agente quimioterapéutico (tal como Doxorrubicina) se contiene opcionalmente dentro del liposoma. Ver Gabizon et al . J. Na tional Cáncer Inst . 81(19)1948 (1989). (x) Terapia Profármaco Mediada por Enzima Anticuerpo Dependiente (ADEPT) El anticuerpo de la presente invención también podría usarse en ADEPT conjugando el anticuerpo con una enzima que activa el profármaco la cual convierte un profármaco (p. ej . un agente quimioterapéutico de peptidilo, ver WO 81/01145) a un fármaco activo anti-cáncer. Ver, por ejemplo, WO 88/07378 y Patente U.S. No. 4,975,278.

El componente de la enzima del inmunoconjugado útil para ADEPT incluye una enzima capaz de actuar en un profármaco de tal forma que lo convierte en su forma citotóxica más activa.

Las enzimas que son útiles en el método de esta invención incluyen, pero no se limitan a fosfatasa alcalina útil para convertir los profármacos que contienen fosfato en fármacos libres; la arilsulfatasa útil para convertir los profármacos que contienen sulfato en fármacos libres; citosina desaminasa útil para convertir 5-fluorocitosina no tóxica en el fármaco anti-cáncer, 5-fluorouracilo; proteasas, tal como proteasa de serratia, termolisina, subtilisina, carboxipeptidasas y catepsinas (tal como catepsinas B y L) , que son útiles para convertir los profármacos que contienen péptidos en fármacos libres; D-alanilcarboxipeptidasa, útil para convertir profármacos que contienen sustituyentes D-aminoácido; enzimas que rompen carbohidratos tal como ß-galactosidasa y neuraminidasa útil para convertir profármacos glicosilados en fármacos libres; ß-lactamasa útil para convertir fármacos derivados con ß-lactamas en fármacos libres; y penicilina amidasas, tal como penicilina V amidasa o penicilina G amidasa útil para la conversión de derivados de fármacos en sus nitrógenos aminos con grupos fenoxiacetil o fenilacetil, respectivamente, en fármacos libres. Alternativamente, los anticuerpos con actividad enzimática, también conocidos en el arte como "abzimas", pueden usarse para convertir los profármacos de la invención en fármacos activos libres (ver, p. ej . , Massey, Na ture 328:457-458 (1987)). Los conjugados de anticuerpo-abzima pueden prepararse como se describe aquí para liberar la abzima a una población celular de tumor.

Las enzimas de esta invención pueden unirse covalentemente a los anticuerpos anti-ErbB3 por técnicas bien conocidas en el arte tal como el uso de reactivos de enlace cruzado heterobifuncionales discutidos antes. Alternativamente, las proteínas de fusión que comprenden al menos la región que enlaza el antígeno de una anticuerpo de la invención enlazado a al menos una porción funcionalmente activa de una enzima de la invención puede construirse usando técnicas de ADN recombinante bien conocidas en el arte (ver, p. ej., Neuberger et al . , Nature, 312:604-608 (1984)). (xi) Fusiones de epí tope que enlazan el receptor silvestre del anticuerpo.

En ciertas modalidades de la invención, podría ser deseable usar un fragmento de anticuerpo, mas que un anticuerpo intacto, por ejemplo, para aumentar la penetración del tumor. En este caso, podría ser deseable modificar el fragmento del anticuerpo para aumentar la vida media de su suero. Esto podría lograrse, por ejemplo, mediante la incorporación de un epítope que enlaza el receptor silvestre en el fragmento del anticuerpo (p. ej . por mutación de la región apropiada en el fragmento del anticuerpo o incorporando el epítope en una punta del péptido que se fusiona después al fragmento del anticuerpo en el extremo o a la mitad, p. ej . , .por medio de ADN o síntesis del péptido) .

Un método sistemático para preparar tal variante del anticuerpo que tiene una vida media aumentada in vivo comprende varios pasos. El primero involucra identificar la secuencia y conformación de un epítope que enlaza al receptor silvestre de una región Fc de una molécula IgG. Una vez que este epítope se identifica, la secuencia del anticuerpo de interés se modifica para incluir la secuencia y conformación del epítope de enlace identificado. Después de que se muta la secuencia, la variante del anticuerpo se prueba para ver si tiene una vida media más larga in vivo que la del anticuerpo original. Si la variante del anticuerpo no tiene una vida media más larga in vivo en la prueba, su secuencia se altera más para incluir la secuencia y conformación del epítope de enlace identificado. El anticuerpo alterado se prueba para vida media más larga in vivo, y este proceso se continua hasta que se obtiene una molécula que presenta una vida media más larga in vivo.

El epítope que enlaza al receptor silvestre que se incorpora así al anticuerpo de interés es cualquier epítope adecuado tal como se definió anteriormente, y su naturaleza dependerá, p. ej . , del tipo de anticuerpo que se va a modificar. La transferencia se hace tal que el anticuerpo de interés aún posee las actividades biológicas descritas aquí.

El epítope constituye en general una región en donde uno o más residuos aminoácido de uno o dos ciclos de un dominio Fc se transfieren a una posición análoga del fragmento del anticuerpo. Aún más preferentemente, se transfieren tres o más residuos de uno o dos ciclos del dominio Fc. Aún más preferido el epítope se toma del dominio CH2 de la región Fc (p. ej., de un IgG) y se transfieren a la región CH1, CH3, o VH, o más de un región, del anticuerpo. Alternativamente, el anticuerpo se toma del dominio CH2 de la región Fc y se transfiere a la región CL o región VL, o ambas, del fragmento del anticuerpo.

En una modalidad más preferida, el epítope que enlaza al receptor silvestre comprende la secuencia (5' a 3'): PKNSSMISNTP (SEC ID NO: 1), y además comprende opcionalmente una secuencia seleccionada del grupo que consiste de HQSLGTQ (SEC ID NO: 2), HQNLSDGK (SEC ID NO: 3), HQNISDGK (SEC ID NO: 4), o VISSHLGQ (SEC ID NO: 5), particularmente donde el fragmento del anticuerpo es Fab o F(ab')2. En otra modalidad más preferida el epítope que enlaza al receptor silvestre es un polipéptido que contiene las secuencias (5' a 3'): HQNLSDGK (SEC ID NO: 3), HQNISDGK (SEC ID NO: 4), O VISSHLGQ (SEC ID NO: 5) y la secuencia PKNSSMISNTP (SEC ID NO: 1).

B. Vectores, Células Huésped y Métodos Recombinantes La invención también proporciona ácidos nucleicos aislados que codifican un anticuerpo como se expone aquí vectores y células huésped que contienen el ácido nucleico, y técnicas recombinantes para la producción del anticuerpo.

Para la producción recombinante del anticuerpo, el ácido nucleico codificante se aisla y se inserta en un vector replicable para clonación adicional (amplificación del ADN) o para expresión. El ADN que codifica el anticuerpo monoclonal se aisla y secuencia fácilmente usando procedimientos convencionales (p. ej . , usando sondas de oligonucleótido que son capaces de enlazar específicamente a los genes que codifican las cadenas pesadas y ligeras del anticuerpo) . Muchos vectores están disponibles. Los componentes del vector incluyen en general, pero no se limitan a, uno o más de lo siguiente: una secuencia señal, un origen de replicación, uno o más genes marcadores, un elemento aumentador, un promotor, y una secuencia de terminación de transcripción. (i) Componente secuencia señal El anticuerpo anti-ErbB3 de esta invención podría producirse recombinantemente no solo directamente, pero también como un polipéptido de fusión con un polipéptido heterólogo, que es preferentemente una secuencia señal u otro polipéptido que tiene un sitio de corte específico en el término N de la proteína madura o polipéptido. La secuencia señal heteróloga seleccionada es preferentemente una que se reconoce y procesa (p. ej . , se corta por medio de una señal peptidasa) por la célula huésped. Para células huésped procarióticas que no reconocen ni procesan las secuencias señal nativa del anticuerpo anti-ErbB3, la secuencia señal se sustituye por una secuencia señal procariótica seleccionada, por ejemplo, del grupo de las guías de fosfatasa alcalina, penicilinasa, lpp, o enterotoxina termoestable. Para secreción de levadura la secuencia señal nativa podría sustituirse por, p. ej . , la guía de la invertasa de levadura, la guía del factor a (incluyendo las guías de factor a de Saccharomyces y Kluyveromyces) , o la guía de la fosfatas acida, la guía de glucoamilasa de C. albi cans, o la señal descrita en WO 90/13646. En la expresión de célula de mamífero, están disponibles las secuencias señal de mamífero a si como las guías de secreción viral, por ejemplo, la señal gD del herpes simple.

El ADN de tal región del precursor se liga en el marco de lectura al ADN que codifica el anticuerpo anti-ErbB3. (ii) Componente origen de replicación Los vectores de expresión y clonación contienen una secuencia de ácido nucleico que permite al vector replicarse en una o más células huésped seleccionada. En general, en los vectores de clonación esta secuencia es la que permite al vector replicarse independientemente del ADN cromosomal, e incluye orígenes de replicación o secuencias que se replican autónomamente. Tales secuencias son bien conocidas para una variedad de bacterias, levaduras, y virus. El origen de replicación del plásmido pBR322 es adecuado para la mayoría de las bacterias Gram negativas, el origen del plásmido de 2µ es adecuado para levaduras, y varios orígenes virales (SV40, polioma, adenovirus, VSV o BPV) son útiles para vectores de clonación en células de mamífero. En general, el componente origen de replicación no se necesita para vectores de expresión de mamífero (el origen SV40 podría usarse típicamente debido a que contiene el promotor inicial) . (iii) Componente gen de selección Los vectores de expresión y clonación podrían contener un gen de selección, también denominado marcador selectivo. Los genes de selección típicos codifican proteínas que (a) confieren resistencia a antibióticos u otras toxinas, p. ej . , ampicilina, neomicina, metotrexato, o tetraciclina, (b) deficiencias auxotróficas complementarias, o (c) suplemento de nutrientes críticos no disponibles en el medio complejo, p. ej . , el gen que codifica D-alanina racemasa de Bacilli .

Un ejemplo de un esquema de selección utiliza un fármaco para detener el crecimiento de una célula huésped. Las células que se transforman exitosamente con un gen heterológo producen una proteína que confiere resistencia al fármaco y de esta forma sobrevive el régimen de selección. Ejemplos de tal selección dominante usan los fármacos neomicina, ácido micofenólico e higromicina.

Otro ejemplo de marcadores selectivos adecuados para células de mamíferos son los que permiten la identificación de células competentes para tomar el ácido nucleico del anticuerpo anti-ErbB3, tal como DHFR, timidina cinasa, metalotioneína-I y -II, preferentemente genes de metalotioneína de primates, adenosina desaminasa, ornitina descarboxilasa, etc.

Por ejemplo, las células transformadas con el gen de selección DHFR se identifican primero cultivando todas las transformantes en un medio de cultivo que contiene metotrexato (Mtx) , un antagonista competitivo de DHFR. Una célula huésped apropiada cuando se emplea DHFR tipo silvestre es la línea celular de ovario de hámster Chino (CHO) deficiente en actividad de DHFR.

Alternativamente, las células huésped transformadas (particularmente huésped tipo silvestre que contiene DHFR endógeno) o co-transformadas con secuencias de ADN que codifican el anticuerpo anti-ErbB3, la proteína DHFR tipo silvestre, y otro marcador selectivo tal como aminoglicosida 3 '-fosfotransferasa (APH) puede seleccionarse por medio del crecimiento celular en medio que contiene un agente de selección para el marcador selectivo tal como un antibiótico aminoglicosídico, p. ej.. , canamicina, neomicina, o G418. Ver Patente U.S. No. 4,965,199.

Un gen de selección adecuado para usar en levadura es el gen trpl presente en el plásmido de levadura YRp7 (Stinchcomb et al . , Na ture, 282:39 (1979)). El gen trpl proporciona un marcador de selección para una cepa mutante de levadura que carece de la capacidad para crecer en triptofano, por ejemplo, ATCC No. 4407^6 o PEP4-1. Jones, Genetics, 85:12 (1977). La presencia de la lesión trpl en el genoma de la célula huésped de levadura proporciona entonces un ambiente efectivo para detectar la transformación por crecimiento en ausencia de triptofano. Similarmente, cepas de levadura eu2 deficiente (ATCC 20,622 o 38,626) se complementan con plásmidos conocidos que tienen el gen Leu2.

Además, los vectores derivados del plásmido circular pKDl de 1.6 µm puede usarse para la transformación de levaduras Kluyveromyces . Alternativamente, un sistema de expresión para producción en gran escala de quimocina de ternero se reportó para K. lactis . Van den Berg, Bio/Technology, 8:135 (1990). También se han expuesto vectores de expresión estables multicopias para secreción de albúmina de suero humano recombinante madura por medio de cepas industriales de Kl uyveromyces. Fleer et al . , Bio/Technology, 9:968-975 (1991). (iv) Componente promotor Los vectores de expresión y clonación contienen usualmente un promotor que es reconocido por el organismo huésped y se enlaza operablemente al ácido nucleico del anticuerpo anti-ErbB3. Los promotores adecuados para usar con huéspedes procarióticos incluyen el promotor phoA, sistemas promotores de ß-lactamasa y lactosa, fosfatasa alcalina, un sistema promotor de triptofano (trp), y promotores híbridos tal como el promotor tac. Sin embargo, son adecuados otros promotores bacterianos conocidos. Los promotores para usar en sistemas bacterianos también contendrán una secuencia Shine- Dalgarno (S.D.) Enlazado operablemente al ADN que codifica el anticuerpo anti-ErbB3.

Las secuencias promotoras se conocen de eucariotes. Virtualmente todos los genes eucarióticos tienen una región rica en AT localizada aproximadamente 25 a 30 bases corriente arriba del sitio donde se inicia la transcripción. Otra secuencia se encuentra 70 a 80 bases corriente arriba del inicio de la transcripción de muchos genes es una región CNCAAT donde N podría ser cualquier nucleótido. En el extremo 3' de la mayoría de los genes eucarióticos está una secuencia AATAAA que podría ser la señal para la adición de la cola poli A al extremo 3' de la secuencia codificante. Todas estas secuencias se insertan adecuadamente en vectores de expresión eucarióticos.

Ejemplos de secuencias promotoras adecuadas para usar con levaduras huéspedes incluyen los promotores para 3-fosfoglicerato cinasa u otras enzimas glicolíticas, tal como enolasa, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, hexocinasa, piruvato descarboxilasa, fosfofructocinasa, glucosa-6-fosfato isomerasa, 3-fosfoglicerato mutasa, piruvato cinasa, triosafosfato isomerasa, fosfoglucosa isomerasa, y glucocinasa.

Otros promotores de levadura, que son promotores inducibles que tienen la ventaja adicional de transcripción controlada por condiciones de crecimiento, son las regiones promotoras para alcohol deshidrogenasa 2, isocitocromo C, ácido fosfatasa, enzimas degenerativas asociadas con metabolismo de nitrógeno, metalotioneína, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, y enzimas responsables de la utilización de maltosa y galactosa. Los vectores y promotores adecuados para usar en expresión de levadura se describen mas en EP 73,657. Los aumentadores de levadura también se usan ventajosamente con promotores de levadura.

La transcripción del anticuerpo anti-ErbB3 a partir de los vectores en células huésped de mamíferos se controla, por ejemplo, por promotores obtenidos a partir de genomas de virus tal como virus de polioma, poxvirus de gallina, adenovirus (tal como Adenovirus 2), virus de papiloma de bovino, virus de sarcoma de aves, citomegalovirus, retrovirus a, virus de la hepatitis-B y mas preferentemente Virus 40 de Simio (SV40), a partir de promotores de mamífero heterólogo, p. ej . , el promotor de actina o un promotor de inmunoglobulina, a partir de promotores de choque térmico, se proporcionan tales promotores que son compatibles con los sistemas de célula huésped.

Los promotores iniciales y finales del virus SV40 se obtienen convenientemente como un fragmento de restricción SV40 que también contiene el origen viral de replicación SV40. El promotor inicial del citomegalovirus humano se obtiene convenientemente como un fragmento de restricción HindIII E. Un sistema para expresar ADN en huéspedes mamíferos usando virus de papiloma de bovino como un vector se expone en Patente U.S. No. 4,419,446. Una modificación de este sistema se describe en la Patente U.S. No. 4,601,978. Ver también Reyes et al . , Nature, 297:598-601 (1982) en expresión de cADN de ß-interferón de humano en células de ratón bajo el control de un promotor de timidina cinasa del virus del herpes simple. Alternativamente, el virus de sarcoma rous de longitud terminal repetida puede usarse como promotor. (v) Componente elemento aumentador ó mejorador La transcripción de ADN que codifica el anticuerpo anti-ErbB3 de esta invención por eucariotes superiores se aumenta a menudo insertando una secuencia aumentadora en el vector. Muchas secuencias aumentadoras se conocen ahora de genes de mamíferos (globina, elastasa, albúmina, a-fetoproteína, e insulina) . Típicamente, sin embargo, se usará un aumentador de un virus de célula eucariótica. Ejemplos incluyen el aumentador SV40 en el lado final del origen de replicación (pb 100-270) , el aumentador del promotor inicial de citomegalovirus, el aumentador de polioma en el lado final del origen de replicación, y los aumentadores de adenovirus. Ver también Yaniv, Na ture, 297:17-18 (1982) en elementos aumentadores para la activación de promotores eucarióticos. El aumentador podría empalmarse en el vector en una posición 5' o 3* a la secuencia que codifica el anticuerpo anti-ErbB3, pero se localiza preferentemente en un sitio 5' del promotor. (vi) Componente terminación de la transcripción Los vectores de expresión usados en células huésped eucarióticas (células de levadura, hongo, insecto, planta, animal, humano, o nucleadas de otros organismos multicelulares) también contendrán las secuencias necesarias para la terminación de la transcripción y para estabilizar el mARN. Tales secuencias están comúnmente disponibles en 5' y ocasionalmente 3', regiones sin trasladar de ADNs o cADNs eucarióticos o virales. Estas regiones contienen segmentos de nucleótido transcritos como fragmentos poliadenilados en la porción sin trasladar del mARN que codifica el anticuerpo anti-ErbB3. Un componente de terminación de la transcripción útil es la región de poliadenilación de hormona de crecimiento de bovino. Ver WO 94/11026 y el vector de expresión expuesto aquí. (vii) Selección y transformación de células huésped Las células huésped adecuadas para clonar o expresar el ADN en los vectores de aquí son las células procariotes, levadura, o eucariotes superiores descritas anteriormente. Los procariotes adecuados para este propósito incluyen eubacterias, tal como organismos Gram-negativos o Gram- positivos, por ejemplo, Enterobacterias tal como Escherichia , - p. ej . , E. coli , Enterobacter, Erwinia , Klebsiella , Proteus, Salmonella , p. ej . , Salmonella typhimurium, Serratia , p. ej . , Serra tia marcescans, y Shigella, así como Bacilli tal como B. licheniformis (p. ej . , B. licheniformis 41P expuesto en DD 266,710 publicado el 12 de Abril de 1989) Pseudomonas tal como P. aeruginosa , y Streptomyces. Un huésped de clonación E. coli preferido es E. coli 294 (ATCC 31,446), aunque son adecuadas otras cepas tal como E. coli B, E. coli X1776 (ATCC 31,537), y E. coli W3110 (ATCC 27,325). Estos ejemplos son ilustrativos mas que limitativos.

Además de microbios procarióticos, eucarióticos tal como hongos filamentosos o levaduras son huéspedes de clonación o expresión adecuados para vectores que codifican el anticuerpo anti-ErbB3. Saccharomyces cerevisiae, o levaduras de pan comunes, es la mas comúnmente usada entre microorganismos huésped eucarióticos inferiores. Sin embargo, un número de otros géneros, especies, y cepas están disponibles y son útiles comúnmente aquí, tal como Schizosaccharomyces pombe; los huéspedes Kluyveromyces tal como, p. ej . , K. lactis, K. fragilis (ATCC 12,424), K. b?lgaricus (ATCC 16,045), K. wickeramii (ATCC 24,178), K. wal tii (ATCC 56,500), K. drosophilarum (ATCC 36,906), K. termotolerans y K. marxianus; yarrowia (EP 402,226); Pichia pastoris (EP 183,070); Candida ; Trichoderma reesia (EP 244,234); Neurospora crassa ; Schwanniomyces tal como Scwanniomyces occidental i s; y hongos filamentosos tal como, p. ej . , huéspedes Neurospora , Penicillium, Tolypocladium, y Aspergillus tal como A. nidulans y A, niger.

Células huésped adecuadas para la expresión del anticuerpo anti-ErbB3 glicosilado se derivan de organismos multicelulares. Ejemplos de células de invertebrados incluyen células de plantas e insectos. Se han identificado numerosas cepas de baculovirus y variantes y células huésped de insectos permisivos correspondientes tal como Spodoptera frugiperda (oruga) , Aedes aegypti (mosquito) , Aedes albopictus (mosquito) , Drosophila melanogaster (mosca de la fruta), y Bombix mori . Una variedad de cepas de virus para transfección se disponen patentadas, p. ej . , la variante L-l de Autographa californica NPV y la cepa Bm-5 de Bombix mori NPV, y tales virus podrían usarse como los virus de acuerdo a la presente invención, particularmente por transfección de células de Spodoptera frugiperda .

Los cultivos de células vegetales de algodón, maíz, papa, soya, petunia, tomate, y tabaco también podrían utilizarse como huéspedes.

Sin embargo, el interés ha aumentado en células de vertebrados, y la propagación de células de vertebrados en cultivo (cultivo de tejidos) ha sido un procedimiento de rutina. Ejemplos de líneas celulares huésped de mamíferos útiles son la línea de riñon de mono CVl transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); línea de riñon embrionario de humano (293 o células 293 subclonadas para crecimiento en cultivo en suspensión, Graham et al . , J. Gen Virol . , 36:59 (1977)); células de riñon de hámster bebe (BHK, ATCC CCL 10); células de ovario de hámster Chino/-DHFR (CHO, Urlaub et al . , Proc. Na ti . Acad. Sci . USA, 77:4216 (1980)); células de sertoli de ratón (TM4, Mather, Biol . Reprod. , 23:243-251 (1980)); células de riñon de mono (VERO-76, ATCC CRL-1587); células de carcinoma cervical humano (HELA, ATCC CCL 2); células de riñon canino (MDCK CCL 34); células de hígado de rata búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células de pulmón humano (W138, ATCC CCL 75); células de hígado humano (Hep G2, HB 8065); tumor mamario de ratón (MMT 060562, ATCC CCL51); células TRl (Mather et al . , Annals N. Y. Acad. Sci . , 383:44-68 (1982)); células MRC 5; células FS4; y una línea de hepatoma humano (Hep G2) .

Las células huésped se transforman con los vectores de expresión o clonación descritos anteriormente para producción y cultivo de anticuerpos anti-ErbB3 en medio nutritivo convencional modificado como sea apropiado para inducir los promotores, selección de transformantes, o amplificación de genes que codifican las secuencias deseadas. (viii) Cultivo de células huésped Las células huésped usadas para producir el anticuerpo anti-ErbB3 de esta invención podrían cultivarse en una variedad de medios. Medios comercialmente disponibles tal como FIO de Ham (Sigma), Medio Esencial Mínimo ((MEM), (Sigma), RPMI-1640 (Sigma), Medio de Eagle Modificado de Dulbecco ((DMEM), Sigma) son adecuados para el cultivo de células huésped. Además, cualquiera de los medios descritos en Ham et al . Meth . Enz . , 58:44 (1979), Barnes et al . , Anal . Biochem . , 102:255 (1980), Pat. U.S. Nos. 4,767,704; 4,657,866; 4,927,762; 4,560,655; o 5,122,469; WO 90/03430; WO 87/00195; o Patente U.S. Re. 30,985 podrían usarse como medio de cultivo para las células huésped. Cualquiera de estos medios podría suplementarse como sea necesario con hormonas y/o otros factores de crecimiento (tal como insulina, transferrina, o factor de crecimiento epidérmico) , sales (tal como cloruro de sodio, calcio, magnesio y fosfato), amortiguadores (tal como HEPES), nucleótidos (tal como adenosina y timidina) , antibióticos (tal como el fármaco GENTAMYCIN*) , elementos traza (definidos como compuestos inorgánicos presentes usualmente en concentraciones finales en el rango micromolar) , y glucosa o una fuente equivalente de energía. Cualquier otro suplemento necesario también podría incluirse en concentraciones apropiadas que se conocerían por los expertos en el arte. Las condiciones de cultivo, tal como temperatura, pH, y similares, son las usadas previamente con las células huésped seleccionadas para expresión, y será evidente para el experto en el arte. (ix) Purificación del anticuerpo anti-ErbB3 Cuando se usan técnicas recombinantes, el anticuerpo puede producirse intracelularmente, en el espacio periplásmico, o secretado directamente en el medio. Si el anticuerpo se produce intracelularmente, como un primer paso, los residuos particulados, de células huésped o fragmentos lisados, se remueven, por ejemplo, por centrifugación o ultrafiltración. Cárter et al . , Bio/Technology 10:163-167 (1992) describe un procedimiento para aislar anticuerpos que se secretan al espacio periplásmico de E. coli . Brevemente, la pasta celular se derrite en presencia de acetato de sodio (pH 3.5), EDTA, y fenilmetilsulfonilfluoruro (PMSF) durante aproximadamente 30 min. Los residuos celulares pueden removerse por centrifugación. Donde el anticuerpo se secreta al medio, los sobrenadantes de tales sistemas de expresión en general se concentran primero usando un filtro de concentración de proteína disponible, por ejemplo, un Amicon o una unidad de ultrafiltración Millipore Pellicon. Un inhibidor de proteasa tal como PMSF podría incluirse en cualquiera de las etapas ya mencionadas para inhibir proteólisis y podrían incluirse antibióticos para evitar el crecimiento de contaminantes advenedizos.

La composición preparada de anticuerpo de las células puede purificarse usando, por ejemplo, cromatografía de hidroxilapatita, electroforesis en gel, diálisis, y cromatografía de afinidad, con la cromatografía de afinidad que es la técnica de purificación preferida. La adecuación de la proteína A como un ligando de afinidad depende de las especies e isotipo de cualquier inmunoglobulina de dominio Fc que se presenta en el anticuerpo. La proteína A puede usarse para purificar los anticuerpos que se basan en cadenas pesadas ?l, ?2, o ?4 de humano (Lindmark et al . , J. Immunol . Meth . 62:1-13 (1983)). La proteína G se recomienda para todos los isotipos de ratón y para ?3 humano (Guss et al . , EMBO J. 5:15671575 (1986)). La matriz a la que se une el ligando de afinidad es mas a menudo agarosa, pero se disponen otras matrices. Las matrices mecánicamente estables tal como vidrio de poro controlado o poli (estirendivinil) benceno permiten para velocidades de flujo mas rápidas y tiempos de procesamiento mas cortos que puedan lograrse con agarosa. Donde el anticuerpo comprende un dominio CH3, la resina Bakerbond ABX^ (J. T. Baker, Phillipsburg, NJ) es útil para purificación. Otras técnicas para purificación de proteínas tal como fraccionamiento en una columna de intercambio iónico, precipitación de etanol, HPLC de Fase Inversa, cromatografía en sílice, cromatografía en heparina Sepharose"1* cromatografía en una resina de intercambio de anión o catión (tal como una columna de ácido poliaspártico), cromatoenfoque, SDS-PAGE, y precipitación de sulfato de amonio también están disponibles dependiendo del anticuerpo que se va a recuperar.

Después de cualquier paso de purificación adicional, la mezcla que contiene el anticuerpo de interés y contaminantes podría someterse a cromatografía de interacción hidrofóbica de bajo pH usando un amortiguador de elución a pH entre aproximadamente 2.5-4.5, preferentemente desarrollado a bajas concentraciones de sal (p. ej . sal de aproximadamente 0-0.25 M) .

C. Formulaciones Farmacéuticas Las formulaciones terapéuticas del anticuerpo se preparan del acumulado mezclando el anticuerpo que tiene el grado deseado de pureza con opcional vehículos, excipientes y estabilizadores fisiológicamente aceptables (Remington ' s Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)), en la forma de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. Los vehículos, excipientes, o estabilizadores aceptables son no tóxicos a los receptores en las dosificaciones y concentraciones empleadas, e incluyen amortiguadores tal como fosfato, citrato, y otros ácidos orgánicos; ácidos orgánicos incluyendo ácido ascórbico y metionina; preservativos (tal como cloruro de octadecildimetilbencil amonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio; cloruro de benzotonio; alcohol fenólico, butílico o bencílico; alquil parabenos tal como metil o propil parabén; catecol; resorcinoi; ciclohexanol; 3-pentanol; y m-cresol); polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos) ; proteínas, tal como albúmina de suero, gelatina, o inmunoglobulinas; polímeros hidrofílicos tal como polivinilpirrolidona; aminoácidos tal como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina, o lisina; monosacáridos, disacáridos, y otros carbohidratos incluyendo glucosa, mañosa, o dextrinas; agentes quelantes tal como EDTA; azúcares tal como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; sal que forma cuentas de iones tal como sodio; complejos metálicos (p. ej . complejos Zn-proteína) ; y/o surfactantes no iónicos tal como Tween*, Pluronics1111 o polietilén glicol (PEG) .

La formulación de aquí también podría contener mas de un compuesto activo de ser necesario para la indicación particular que se va a tratar, preferentemente aquellos con actividades complementarias que no se afectan adversamente uno a otro. Por ejemplo, podría ser deseable proporcionar además anticuerpos que enlazan a EGFR, ErbB2, ErbB4, o factor endotelial vascular (VEGF) en la formulación. Alternativamente, o además, la composición podría comprender un agente quimioterapéutico o una citosina. Tales moléculas se presentan adecuadamente en combinación en cantidades que son efectivas para el propósito planeado.

Los ingredientes activos también podrían atraparse en microcápsulas preparadas, por ejemplo, por técnicas de coacervación o por polimerización interfacial, por ejemplo, hidroximetilcelulosa o microcápsulas de gelatina y microcápsulas de poli- (metilmetacrilato) , respectivamente, en sistemas coloidales de liberación del fármaco (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nano-partículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones. Tales técnicas se exponen en Remington r s Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980).

Las formulaciones que se van a usar para administración in vivo deben ser estériles. Esto se realiza fácilmente por filtración a través de membranas de filtración estériles.

Podrían prepararse preparaciones de liberación sostenida. Ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrofóbicos sólidos que contienen el anticuerpo, cuyas matrices están en la forma de artículos moldeados, p. ej . películas o microcápsulas. Ejemplos de matrices de liberación sostenida incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo, poli (2-hidroxietil-metacrilato) , o poli (vinilalcohol) ) , polilacturos (Pat. U.S. No. 3,773,919), copolímeros de ácido L-glutámico y y etil-L-glutamato, acetato de etileno de vinilo no degradable, copolímeros de ácido láctico-ácido glicólico degradables tal como Lupron Depot1™ (microesferas inyectables compuestas de copolímero de ácido láctico-ácido glicólico y acetato de leproluro) , y ácido poli-D- (-) -3-hidroxibutírico. Mientras que polímeros tal como acetato de etileno de vinilo y ácido láctico-ácido glicólico permiten liberar moléculas durante 100 días, ciertos hidrogeles liberan proteínas durante períodos de tiempo mas cortos. Cuando los anticuerpos encapsulados permanecen en cuerpo durante un tiempo grande, podrían desnaturalizarse o agregarse como resultado de la exposición a humedad a 37°C, resultando en una pérdida de actividad biológica y posibles cambios en inmunogenicidad. Estrategias adicionales pueden proyectarse para la estabilización dependiendo del mecanismo involucrado. Por ejemplo, si se descubre que el mecanismo de agregación es la formación de enlace intermolecular S-S mediante intercambio tio-disulfuro, la estabilización podría lograrse modificando los residuos sulfhidrilo, liofilizando en soluciones acidas, controlando el contenido de humedad, usando aditivos apropiados, y desarrollando las composiciones de la matriz de polímero específico.

D. Usos No-terapéuticos del Anticuerpo Los anticuerpos de la invención podrían usarse como agentes de purificación de afinidad. En este proceso, los anticuerpos se inmovilizan en una fase sólida tal como resina Sefadex o papel filtro, usando métodos bien conocidos en el arte. El anticuerpo inmovilizado se pone en contacto con una muestra que contiene la proteína ErbB3 (o fragmento de la misma) que se va a purificar, y posteriormente el soporte se lava con un disolvente adecuado que removerá sustancialmente todo el material en la muestra excepto la proteína ErbB3, que se enlaza al anticuerpo inmovilizado. Finalmente, el soporte se lava con otro disolvente adecuado, tal como amortiguador de glicina, pH 5.0, que liberará la proteína ErbB3 del anticuerpo.

Los anticuerpos anti-ErbB3 también podrían ser útiles en las pruebas de diagnóstico para la proteína ErbB3, p. ej . , detectando su expresión en células específicas, tejidos o suero. Así, los anticuerpos podrían usarse en el diagnóstico de tumores malignos de humano (ver, por ejemplo, Patente US 5,183,884) .

Para aplicaciones de diagnóstico, el anticuerpo se marcará típicamente con un radical detectable. Están disponibles numerosas marcas que pueden agruparse en general en las siguientes categorías: (a) Radioisótopos, tal como 35S, C, 125I, 3H, y 131I. Por ejemplo el anticuerpo puede marcarse con el radioisótopo usando las técnicas descritas en Current Protocols in Immunology, Volúmenes 1 y 2, Coligen et al . , Ed., Wiley-Interscience, New York, Pubs., (1991) y la radioactividad puede medirse usando conteo por cintilación. (b) Están disponibles marcas fluorescentes tal como quelatos de tierras raras (quelatos de europio) o fluoresceína y sus derivados, radamina y sus derivados, dansilo, Lisamina, ficoeritrina y Rojo Texas. Por ejemplo, las marcas fluorescentes pueden conjugarse con el anticuerpo usando la técnica expuesta en Current Protocols in Immunology, supra . La fluorescencia puede cuantificarse usando un fluorímetro. (c) Están disponibles varias marcas enzima-sustrato y Patente U.S. No. 4, 275,149 proporciona una revisión de algunas de estas. La enzima cataliza en general una alteración química del sustrato cromogénico que puede medirse usando varias técnicas. Por ejemplo, la enzima podría catalizar un cambio de color en un sustrato, que puede medirse espectrofotométricamente. Alternativamente, la enzima podría alterar la fluorescencia o quimioluminiscencia del sustrato. Las técnicas para cuantificar un cambio en fluorescencia se describen antes. El sustrato quimioluminiscente llega a excitarse electrónicamente por una reacción química y podría emitir entonces luz que puede medirse (por ejemplo, usando un quimioluminómetro) o donar energía a un aceptor fluorescente. Ejemplos de marcas enzimáticas incluyen luciferasas (p. ej . , luciferasa de luciérnaga y luciferasa de bacterias; Patente U.S. No. 4,737,456), luciferina, 2, 3-dihidronaftalazindionas, malato deshidrogenasa, ureasa, peroxidasa tal como peroxidasa de rábano picante (HRPO), fosfatasa alcalina, ß-galactosidasa, glucoamilasa, lisozima, sacárido oxidasas (p. ej . , glucosa oxidasas, galactosa oxidasa, y glucosa-6-fosfato deshidrogenasa), oxidasas heterocíclicas (tal como uricasa y xantina oxidasa), lactoperoxidasa, microperoxidasa, y similares. Las técnicas para conjugar enzimas con anticuerpos se describen en O'Sullivan et al . , Methods for Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay, en Methods in Enzym. (Ed J. Langone & H. Van Vunakis), Academic press, New York, 73:147-166 (1981).

Ejemplos de combinaciones sustrato-enzima incluyen, por ejemplo: (i) Peroxidasa de rábano picante (HRPO) con hidrógeno peroxidasa como sustrato, en donde la hidrógeno peroxidasa oxida un precursor de tinte (p. ej . ortofenilén diamina (OPD) o clorhidruro de 3, 3' , 5, 5' -tetrametil benzidina (TMB)); (ii) fosfatasa alcalina (AP) con para-Nitrofenil fosfato como sustrato cromogénico; y (iii) ß-D-galactosidasa (ß-D-Gal) con un sustrato cromogénico (p. ej . p-nitrofenil-ß-D-galactosidasa) o el sustrato fluorogénico 4-metilumbeliferil-ß-D-galactosidasa.

Otras combinaciones numerosas enzima-sustrato son disponibles para los expertos en el arte. Para una revisión general de esto, ver Patentes U.S. Nos. 4,275,149 y 4,318,980.

Algunas veces, la marca se conjuga indirectamente con el anticuerpo. El experto en el arte estará enterado de varias técnicas para conseguir esto. Por ejemplo, el anticuerpo puede conjugarse con biotina y cualquiera de las tres categorías amplias de marcas mencionadas antes puede conjugarse con avidina, o vi ce versa . La biotina enlaza selectivamente a avidina y por consiguiente, la marca puede conjugarse con el anticuerpo de esta forma directa. Alternativamente, para lograr la conjugación indirecta de la marca, el anticuerpo se conjuga con un hapteno pequeño (p. ej . dioxina) y uno de los diferentes tipos de marcas mencionadas anteriormente se conjuga con un anticuerpo anti-hapteno (p. ej . anticuerpo anti-dioxina) . Así, puede lograrse la conjugación indirecta de la marca con el anticuerpo.

En otra modalidad de la invención, el anticuerpo anti-ErbB3 no necesita marcarse, y la presencia del mismo puede detectarse usando un anticuerpo marcado que enlaza al anticuerpo anti-ErbB3.

Los anticuerpos de la presente invención podrían emplearse en cualquier método de prueba conocido, tal como pruebas de enlace competitivo, pruebas de colocar entre dos partes directas e indirectas, y pruebas de inmunoprecipitación. Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp. 147-158 (CRC Press, Inc., 1987).

Las pruebas de enlace competitivo se basan en la capacidad de un estándar marcado para competir con el analito de la muestra de prueba para enlazar con una cantidad limitada de anticuerpo. La cantidad de proteína ErbB3 en la muestra de prueba es inversamente proporcional a la cantidad de estándar que se llega a enlazar. Para facilitar la determinación de la cantidad de estándar que se llega a enlazar, los anticuerpos en general se insolubilizan antes o después de la competición, de tal forma que el estándar y analito que se enlazan a los anticuerpos puedan separarse convenientemente del estándar y analito que permanece sin enlazar.

Las pruebas de colocar entre dos partes involucran el uso de dos anticuerpos, cada uno capaz de enlazar a una porción inmunogénica diferente, o epítope, de la proteína que se va a detectar. En una prueba de colocar entre dos partes, el analito de la muestra de prueba se enlaza por medio de un primer anticuerpo que se inmoviliza en un soporte sólido, y posteriormente un segundo anticuerpo se enlaza al analito, formando así un complejo insoluble de tres partes. Ver, p. ej . , Pat US No. 4,376,110. El segundo anticuerpo podría marcarse por si mismo con radical detectable (pruebas directas de colocar entre dos partes) o podría medirse usando un anticuerpo anti-inmunoglobulina que se marca con un radical detectable (prueba indirecta de colocar entre dos partes) . Por ejemplo, un tipo de prueba de colocar entre dos partes es una prueba ELISA, en cuyo caso el radical detectable es una enzima.

Por inmunohistoquímica, la muestra de tumor podría ser fresca o congelada o podría embeberse en parafina y fijarse con un preservativo, por ejemplo, tal como formalina.

Los anticuerpos también podrían usarse para pruebas de diagnóstico in vivo. En general, el anticuerpo se marca con un radionúcleo (tal como ?nIn, "Te, 1C, 131I, 125I, 3H, 32P o 35S) para que el tumor pueda localizarse usando inmunocintiografía.

E. Estuches de Diagnóstico Como un asunto de conveniencia, el anticuerpo de la presente invención puede proporcionarse en un estuche, p. ej . , una combinación de empaque de reactivos en cantidades predeterminadas con instrucciones para desarrollar la prueba de diagnóstico. Donde el anticuerpo se marca con una enzima, el estuche incluirá sustratos y cofactores requeridos por la enzima (p. ej . un sustrato precursor que proporciona el cromóforo o fluoróforo detectable) . Además, podrían incluirse otros aditivos tal como estabilizadores, amortiguadores (p. ej . un amortiguador de bloqueo o amortiguador de lisis) y similares. Las cantidades relativas de varios reactivos podrían variarse ampliamente para proporcionar concentraciones en solución de los reactivos que optimizan sustancialmente la sensibilidad de la prueba. Particularmente, los reactivos podrían proporcionarse como polvos secos, usualmente liofilizados, incluyendo excipientes que en disolución proporcionarán una solución de reactivo que tiene la concentración apropiada.

F. Usos Terapéuticos del Anticuerpo Se contempla que el anticuerpo anti-ErbB3 de la presente invención podría usarse para tratar condiciones en las que se está presentando la activación excesiva del complejo ErbB2-ErbB3, particularmente la activación es mediada por un polipéptido de heregulina. Ejemplo de condiciones de desórdenes que se van a tratar con el anticuerpo ErbB3 incluyen tumores benigno o malignos (p. ej . carcinomas renal, de hígado, de riñon, de vejiga, de mama, gástrico, de ovario, colorrectal, de próstata, pancreático, de pulmón, vulval, tiroide, hepático; sarcomas; glioblastomas; y varios tumores de cabeza y cuello); leucemias y tumores malignos de linfoide; otros desórdenes tal como desórdenes neuronal, glial, astrocital, hipotalémico y otros glandular, macrofagal, epitelial, estromal y blastocoélico; y desórdenes inflamatorio, angiogénico e inmunológico.

Los anticuerpos de la invención se administran a un mamífero, preferentemente un humano, de acuerdo con métodos conocidos, tal como administración intravenosa tal como un bolo o por infusión continua durante un período de tiempo, por administración intramuscular, intraperitoneal, intracerebroespinal, subcutánea, intra-articular, intrasinovial, intratecal, oral, tópica, o rutas de inhalación. La administración intravenosa del anticuerpo es la preferida.

Otros regímenes terapéuticos podrían combinarse con la administración de los anticuerpos anti-ErbB3 de la presente invención. Por ejemplo, el paciente que se va a tratar con los anticuerpos expuestos aquí también podrían recibir terapia de radiación. Alternativamente, o además, un agente quimioterapéutico podría administrarse al paciente. Los horarios de preparación y dosificación para tales agentes quimioterapéuticos podrían usarse de acuerdo a las instrucciones del fabricante o como se determinan empíricamente por el médico experto. Los horarios de preparación y dosificación para tal quimioterapia también se describen en Chemotherapy Service Ed., M.C. Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, MD (1992) . El agente quimioterapéutico podría preceder, o seguir la administración del anticuerpo o podría darse simultáneamente con el mismo.

También podría ser deseable administrar los anticuerpos contra otros antígenos asociados con tumor, tal como anticuerpos que enlazan al EGFR, ErbB2, ErbB4, o factor endotelial vascular (VEGF) . Dos o mas anticuerpos anti-ErbB3 podrían co-administrarse al paciente.

Para la prevención o tratamiento de enfermedad, la dosificación apropiada del anticuerpo dependerá del tipo de enfermedad que se va a tratar, como se definió antes, la severidad y curso de la enfermedad, si el anticuerpo se administra para fines preventivos o terapéuticos, terapia previa, la historia clínica del paciente y respuesta al anticuerpo, y la discreción del médico que atiende. El anticuerpo se administra adecuadamente al paciente en una vez o una serie de tratamientos.

Dependiendo del tipo y severidad de la enfermedad, aproximadamente 1 µg/kg a 15 mg/kg (p. ej . 0.1- 20 mg/kg) de anticuerpo es una dosificación candidata inicial para administración al paciente, ya sea, por ejemplo, por medio de una o mas administraciones separadas, o por infusión continua. Una dosificación típica diaria podría estar en el rango de aproximadamente 1 µg/kg a 100 mg/kg o mas, dependiendo de los factores mencionados antes. Para administraciones repetidas durante varios días o mas, dependiendo de la condición, se tratamiento se mantiene hasta que se presenta una supresión deseada de los síntomas de la enfermedad. Sin embargo, podrían ser útiles otros regímenes de dosificación. El progreso de esta terapia se monitorea fácilmente por técnicas y pruebas convencionales. 6. Artículos de Elaboración En otra modalidad de la invención, se proporciona un artículo de elaboración que contiene materiales útiles para el tratamiento de los desórdenes descritos antes. El artículo de elaboración comprende un recipiente y una marca. Recipientes adecuados incluyen, por ejemplo, botellas, viales, jeringas, y tubos de ensayo. Los recipientes podrían formarse de una variedad de materiales tal como vidrio o plástico. El recipiente mantiene una composición que es efectiva para tratar la condición y podría tener una puerta de acceso estéril (por ejemplo el recipiente podría ser una bolsa de solución intravenosa o vial que tienen un tapón penetrable por una aguja de inyección hipodérmica) . El agente activo en la composición es el anticuerpo anti-ErbB3. La marca en, o asociada con, el recipiente indica que la composición se usa para tratar la condición elegida. El artículo de elaboración podría comprender además un segundo recipiente que contiene un amortiguador farmacéuticamente aceptable, tal como amortiguador salino de fosfato, solución de Ringer y solución de dextrosa. Podría incluir además otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y de uso, incluyendo otros amortiguadores, diluyentes, filtros, agujas, jeringas, y folletos de empaque con instrucciones de uso.

H. Depósito de Materiales La siguiente línea celular de hibridoma se ha depositado con la American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, USA (ATCC) : Designación ATCC No. Fecha de Depósito Bibridoma/Anticuerpo 8B8 HB-1270 Marzo 22, 1996 Este depósito se hizo bajo las condiciones del tratado de Budapest en el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos Para el Fin de Procedimiento y las Regulaciones de Patente bajo el mismo (Tratado de Budapest) . Esto asegura el mantenimiento de un cultivo viable durante 30 años a partir de la fecha de depósito. La línea celular estará disponible en la ATCC bajo los términos del Tratado de Budapest, y sujeto a un acuerdo entre Genentech, Inc. y ATCC, que asegura (a) el acceso al cultivo estará disponible durante la duración de la solicitud de patente a alguien determinado por el Comisionado para autorizar al mismo de acuerdo a 37 CFR §1.14 y 35 USC §122, y (b) que todas las restricciones de disponibilidad al público del cultivo así depositado se retirará irrevocablemente en garantía de la patente.

La asignación de la presente solicitud ha acordado que si el cultivo en depósito podría morir o perderse o destruirse cuando se cultiva bajo condiciones adecuadas, se reemplazará prontamente en notificación con un espécimen viable del mismo cultivo. La disponibilidad de la línea celular depositada no se va a construir como una licencia para practicar la invención en contravención de los derechos concedidos bajo la autoridad de cualquier gobierno de acuerdo con sus leyes de patente.

La especificación escrita ya mencionada se considera que es suficiente para permitir a un experto en el arte practicar la invención. La presente invención no se limita en alcance por el cultivo depositado, dado que la modalidad depositada se destina como una sola ilustración de un aspecto de la invención y cualquier cultivo que sea equivalente funcionalmente está dentro del alcance de esta invención. El depósito del material de aquí no constituye una admisión que la descripción escrita contenida aquí es inadecuada para permitir la práctica de cualquier aspecto de la invención, incluyendo la mejor forma de la misma, ni se construye como limitante del alcance de las reivindicaciones para la ilustración específica que representa. Realmente, varias modificaciones de la invención además de las mostradas y descritas aquí serán evidentes para los expertos en el arte a partir de la descripción ya mencionada y cae dentro del alcance de las reivindicaciones anexadas.

Al respecto de las designaciones en que la patente Europea se solicita, una muestra del microorganismo depositado se hará disponible hasta que la publicación de la mención de concesión de la patente Europea o hasta que la fecha en que la aplicación se ha desechado o retirado o se considera para retirarse, solo por la sucesión de tal muestra a un experto nominado por la persona que pide la muestra (Regla 28(4) EPC) Los siguientes ejemplos se ofrecen a forma de ilustración y no a forma de limitación. Las exposiciones de todas las citaciones en la especificación se incorporan expresamente aquí por referencia.

EJEMPLO PRODUCCIÓN DE ANTICUERPOS ANTI-ErbB3 Este ejemplo describe la producción de anticuerpos que tienen las características descritas aquí.

Materiales y Métodos Líneas celulares. La línea celular de leucemia mieloide humana K562 (que carece del receptor clase I subfamilia proteína tirosina cinasa determinado por Western blot) y línea celular de carcinoma de ovario humano Caov3 se obtuvieron de la American Type Culture Collection (Rockville, MD) . Se cultivaron en medio RPMI 1640 suplementado con 10% de suero de feto de bovino, glutamina 2 mM, 100 U/mL de penicilina, 100 µg/mL de estreptomicina, y HEPES 10 mM ("medio de crecimiento") .

Transfección Estable de Células K562. La línea celular K562 se transfectó y se seleccionaron los clones que expresan ErbB3. Brevemente, er£>B3 cADN se subclonó en el vector de expresión de células de mamífero pcDNA-3 (Invitrogen) y se introdujo en las células K652 por electroporación (1180 mF, 350 V) . Las células transfectadas se cultivaron en medio de crecimiento que contenía 0.8 mg/mL de G418. Los clones resistentes se obtuvieron limitando la dilución y se probaron para la expresión de ErbB3 por Western blot y pruebas de enlace de heregulina (HRG) . El clon 4E9H3 que expresa ErbB3 se usó en los experimentos descritos en este reporte. La estimulación de éster de forbol se encontró que aumenta significativamente la expresión de ErbB3 en las transfectantes K562. Por lo tanto, las células 4E9H3 se colocaron en medio de crecimiento que contenía 10 ng/mL de acetato de forbol-12-miristato (PMA) toda la noche antes de usar en varias pruebas descritas después.

Anticuerpos . Los anticuerpos monoclonales específicos para la proteína ErbB3 se generaron contra un fragmento recombinante del receptor correspondiente al dominio extracelular (ECD) del mismo fusionado en su término amino para el virus del herpes simple tipo 1 (HSV I) glicoproteína D (gD) epítope del anticuerpo monoclonal 5B6. La secuencia que codifica para la secuencia señal de ErbB3 se reemplazó con una secuencia que codifica los aminoácidos 1-53 del polipéptido gD. Los aminoácidos 1-25 codifican la secuencia señal de gD mientras que los aminoácidos 26-53 contienen un epítope para el anticuerpo monoclonal 5B6. Ver WO 95/14776. La construcción resultante, gD.ErB3.ECD, se purificó usando una columna de afinidad de anticuerpos anti-gD. Las inmunizaciones se realizaron como sigue. Ratones hembras Balb/c (Charles River) se inyectaron inicialmente por vía de la base de la pata con 5 µg de gD.ErbB3.ECD en 100 µl de' adyuvante RIBI'sMR (Ribi Immunochem Research, Inc., Hamilton, MT) . Los animales se alzaron 2 veces con 5 µg de gD.ErbB3.ECD en su pata cada dos semanas seguido por una inyección final de 5 µg de gD.ErbB3.ECD. Tres días después de la última inmunización, se removieron los ganglios linfáticos poplíteos y se preparó una suspensión de células simples por fusión de PEG.

Los anticuerpos monoclonales se purificaron y clonaron por ELISA de inmovilización y de solución de fase para reactividad cruzada con ErbB2 y ErbB4. Para ELISA inmovilizada, 1 µg/ml de ErbB2.ECD, gD.ErbB3.ECD o gD.ErbB4.ECD se usó para cubrir una placa de microtitulación de 96 pozos toda la noche. Anti-ErbB3 Mab a 1 µg/ml se adicionó y se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente (RT) , se lavó y por IgG de cabra anti-ratón (gam) se conjugó con HRPO. La ELISA se desarrolló y leyó a 490 nm. Para la ELISA de solución de fase, se usó 1 µg/ml de gam IgG (Fc específico) para cubrir una placa de microtitulación de 96 pozos toda la noche. Anti-ErbB3 Mab a 1 µg/ml se adicionó y se incubó durante 1 hora a RT, se lavó y por ErbB2.ECD, gD.ErbB3.ECD o gD.ErbB4.ECD. Esta reacción se incubó durante 1 hora a RT, se lavó y seguido con HRPO estrepavidina. La ELISA se desarrolló y leyó a 490 nm. En esta prueba, ninguno de los anticuerpos anti-ErbB3 reaccionó cruzado con ErbB2 o ErbB4.

Los fragmentos Fab del anticuerpo 3-8D6 se generaron por digestión de papaína. Los fragmentos IgG y Fc sin digerir se removieron por cromatografía de afinidad de proteína A seguido por cromatografía de filtración en gel. No se detectó IgG en la reserva de Fab por SDS-PAGE y por Western blot probado con un anticuerpo específico Fc.

Pruebas de Enlace HRG. Todos los experimentos se llevaron a cabo usando el dominio similar EGF de la isoforma ßl, p. ej . HGRßl177_244 (Sliwkowski et al . , J. Biol . Chem. 269:14661-5 (1994)). El panel del anticuerpo ErbB3 se cribó para un efecto en enlace de HRG incubando 5.0 x 104 células de 4E9H3 con 125I-HRG 100 pM toda la noche a 0°C, en ausencia (control) o presencia de anticuerpo anti-ErbB3 100 nM. IgGs irrelevantes se usaron como controles negativos. Las células se cosecharon y se lavaron rápidamente con amortiguador de prueba enfriado en hielo (medio RPMI que contiene HEPES 10 mM, pH = 7.2) en un dispositivo de filtración de 96 pozos. (Millipore) . Los filtros se removieron entonces y se contaron.

Para los experimentos dosis-respuesta del anticuerpo, las células 4E9H3 se incubaron con 100 pM 125I-HRG en presencia de concentraciones incrementadas de anticuerpo. Las mediciones de afinidad de HRG se determinaron en ausencia (control) o presencia de fragmento de anticuerpo o Fab 100 nM. Estos experimentos se llevaron a cabo en un formato de inhibición competitiva con cantidades crecientes de HRG no marcado y una concentración fija (35 pM) de 125I-HRG. Para el experimento control (sin anticuerpo) se usaron 1 x 105 células 4E9H3 para cada muestra. Debido a limitaciones en el rango dinámico de la prueba, el número de células 4E9H3 usadas para enlazar en presencia del anticuerpo o Fab se redujo a 2.5 x 104 células por muestra.

Reducción del anticuerpo de fosforilación estimulada por HRG. Las células Caov3, que expresan de forma natural ErbB2 y ErbB3, se preincubaron con el anticuerpo 3-8D6 anti-ErbB3 250 nM, fragmentos Fab de este anticuerpo, o amortiguador (control), durante 60 minutos a temperatura ambiente. El anticuerpo anti-ErbB2, 2C4 (Fendly et al . , Cáncer Res . , 50:1550-1558 (1990)), que se mostró previamente para bloquear la fosforilación estimulada por HRG de ErbB2 se incluyó como un control positivo. Las células se estimularon entonces con HRG a una concentración final de 10 nM durante 8 minutos a temperatura ambiente, o se dejó sin estimular. La reacción se paró removiendo los sobrenadantes y disolviendo las células en amortiguador de muestra SDS. Los lisados se corrieron entonces en SDS-PAGE. Los Western blots de los geles se probaron entonces con anti-fosfotirosina conjugada con peroxidasa de rábano picante (Transduction Labs), y las manchas se visualizaron usando un sustrato quimioluminiscente (Amersham) . Las manchas se buscaron con un densitómetro de búsqueda por reflectancia como se describe en Holmes et al . , Science, 256:1205-1210 (1992).

Reducción del anticuerpo de formación del complejo de proteína ErbB2-ErbB3. Las células Caov3 se pre-incubaron con amortiguador (control), anticuerpo 3-8D6 anti-ErbB3 250 nM, o fragmentos Fab de este anticuerpo, o el anticuerpo anti-ErbB2 (2C4) durante 60 minutos a temperatura ambiente, después se trató con HRG 10 nM o amortiguador control durante 10 minutos. Las células se lisaron en Tris 25 mM, pH = 7.5, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, 1.0% de Tritón X-lOO", 1.0% de CHAPS, 10% v/v de glicerol, que contenía PMSF 0.2 mM, 50 mTU/mL de aprotinina, y leupeptina 10 mM ("amortiguador de lisis"), y los lisados crudos se centrifugaron brevemente para remover el material insoluble. Los sobrenadantes se incubaron con 3E8, un anticuerpo monoclonal específico para ErbB2 (Fendly et al . , Cáncer Res . , 50:1550-1558 (1990)), se acoplaron covalentemente a un soporte insoluble (Affi Prep-lO^, BioRad) . La incubación se llevó a cabo toda la noche a 4°C. Los inmunoprecipitados se lavaron dos veces con amortiguador de lisis enfriado con hielo, se resuspendieron en un volumen mínimo de amortiguador muestra SDS, y se corrieron en SDS-PAGE. Los Western blots de los geles se probaron entonces con un anti-ErbB3 policlonal (Santa Cruz Biotech) . Las manchas se buscaron con un densitómetro de búsqueda por reflectancia como se describe en Holmes et al . , Sicence, 256:1205-1210 (1992). Después de la visualización con el sustrato de quimioluminiscencia ECL, las manchas se cortaron en tiras y se reprobaron con un anti-ErbB2 policlonal (Santa Cruz Biotech) . Una prueba duplicada entramada con anti-ErbB2 mostró que cantidades iguales de ErbB2 se inmunoprecipitaron en cada muestra.

Resultados Un panel de anticuerpos monoclonales dirigidos contra el dominio extracelular de ErbB3 se evaluaron para su capacidad para afectar el enlace de HRG con ErbB3. El cribado inicial se llevó a cabo incubando cada uno de los anticuerpos purificados en una concentración final de 100 nM con células 4E9H3 en presencia de 125I-HRG. Las células 4E9H3 son transfectantes de ErbB3 de la línea celular de leucemia mieloide humana K562. La línea celular K562 no expresa receptores ErbB endógenos o HRG. Por consiguiente, la heregulina que enlaza a células 4E9H3 se presenta exclusivamente por medio de ErbB3. Después de la incubación las muestras se enfriaron en hielo toda la noche, se midieron las cuentas asociadas a células. Como se muestra en la Fig. 1, dos de los anticuerpos monoclonales anti-ErbB3 (2F9 y 3E9) redujeron la cantidad de 125I-HRG enlazado a células 4E9H3 relativas a control (sin anticuerpo) . Sin embargo, hubo varios ligandos enlazados aumentados significativamente. Estos resultados sugirieron que estos anticuerpos anti-ErbB3 eran capaces de aumentar la afinidad para enlazar HRG y/o aumentar la disponibilidad de sitios de enlace HRG. Para caracterizar más la influencia de estos anticuerpos en el enlace HRG a ErbB3, los experimentos dosis-respuesta se realizaron usando el anticuerpo 3-8D6 que aumentó el enlace HRG. Las células 4E9H3 se incubaron con 100 pM de 125I-HRG en presencia de concentraciones crecientes del anticuerpo 3-8D6. Las cuentas asociadas a células se midieron entonces después una noche de incubación en hielo. Los resultados se muestran en la Fig. 2 como gráficas de cuentas asociadas a células contra concentraciones de anticuerpo. Hay una correlación entre el aumento de enlace de HRG y el aumento de la concentración de anticuerpo. El enlace de heregulina alcanzó la saturación entre 10 y 100 nM IgG. El valor EC50 para el anticuerpo 3-8D6 fue 722 pM. No disminuyeron las curvas en la dosis-respuesta a concentraciones altas de anticuerpo se observaron para cualquier anticuerpo.

El análisis Scatchard de enlace de HRG se determinó en presencia de estos anticuerpos y los resultados se muestran en la Tabla 1.

Tabla 1 En ausencia del anticuerpo, un Kd de 1200 pM se midió para enlace de HGR a ErbB3, que es acorde con una medición de afinidad medida previamente de enlace de HRG a ErbB3. El número de sitios de enlace por célula se determinó que es de 36,000. En presencia del anticuerpo, 3-8D6, la constante de enlace medida para el enlace de HRG se incrementa significativamente hasta 210 pM. Sin embargo, el número de sitios de enlace de HRG no aumenta en presencia de 3-8D6.

Para determinar si el aumento en la afinidad de enlace del ligando de ErbB3 era dependiente del anticuerpo que es divalente, los experimentos de enlace de HRG se realizaron en presencia de 100 nM de un fragmento Fab preparado por digestión de papaína del anticuerpo 3-8D6. Los fragmentos Fab usados para estos experimentos se purificaron por cromatografía de afinidad de proteína A y por cromatografía de filtración en gel. Se detectó IgG no intacto en está preparación purificada por SDS-PAGE. Como se muestra en la Fig. 3, el enlace de HRG en presencia del anticuerpo intacto o el Fab resultante es casi idéntico. El análisis Scatchard de estos resultados proporcionan una constante de disociación para el enlace de HRG en presencia de Fab de 280 pM y el número de receptores por célula determinada a partir de este experimento también fue esencialmente el mismo que el del control. Estos resultados son consistentes con los presentados en la Fig. 2, donde las curvas dosis respuesta con los anticuerpos intactos muestran una meseta más que una curva en forma de campana a concentración más alta del anticuerpo, donde podría presentarse el enlace del anticuerpo univalente. Sin teorizar, estos resultados sugieren que la alteración en el enlace de HRG observado en presencia de estos anticuerpos no requiere un anticuerpo divalente.

El efecto del anticuerpo 3-8D6 en una prueba de fosforilación del receptor de tirosina, usando la línea celular de tumor de ovario Caov3 que coexpresa ErbB2 y ErbB3 se examinó después. Las células se estimularon con HRG 10 nM después de una pre-incubación de 60 minutos con el anticuerpo 3-8D6 (a 250 nM) o amortiguador (control) . Los lisados celulares completos se analizaron en una prueba Western blot con anti-fosfotirosina. El tratamiento de HRG no estimuló la fosforilación en células 4E9H3. El tratamiento de células 4E9H3 con el anticuerpo 3-8D6 no indujo fosforilación de ErbB3 por si mismas ni tuvo ningún efecto en fosforilación de tirosina en células Caov3. Un señal de fosforilación de tirosina marcada se detectó en una proteína con un tamaño molecular ~180 kDa después de la estimulación de HRG. El tratamiento de las células Caov3 con 2C4, un anticuerpo específico para ErbB2, permitió bloquear la señal de fosforilación de tirosina mediada por HRG. Cuando las células se trataron con el anticuerpo anti-ErbB3, 3-8D6, antes de la estimulación de HRG, también disminuyó la fosforilación de tirosina. Por medio de densitometría de búsqueda de las manchas de anti-fosfotirosina de los lisados de las células completas, se observó que 3-8D6 inhibe la señal de fosfotirosina en 180-185 kDa a aproximadamente 80% (rango 76-84%) . Está señal es contribuida por los residuos tirosina fosfato en ErbB3 y ErbB2. El tratamiento de células Caov3 con los fragmentos de Fab preparados a partir del anticuerpo 3-8D6, también redujo la fosforilación estimulada de HRG de la banda de 180 kDa relativa al control. Sin embargo, la actividad inhibidora del Fab fue ligeramente menos potente que el anticuerpo intacto.

El aumento mediado por el anticuerpo 3-8D6 en la afinidad receptora de células que expresan ErbB3 solo es análogo al incremento en la afinidad asociada con la coexpresión de ErbB2 con ErbB3. Además, este anticuerpo bloquea la actividad cinasa de ErbB2 estimulada por HRG en células que expresan ambos receptores. Para determinar si el anticuerpo anti-ErbB3 compite directamente con ErbB2 para enlazar a ErbB3, una serie de experimentos de co-inmunoprecipitación se realizaron usando células Caov3. Las células se pre-incubaron con anticuerpo, o amortiguador (control) y después se trataron con HRG 10 nM durante 10 minutos. Los lisados de las células se inmunoprecipitaron entonces con un anticuerpo monoclonal contra ErbB2. Los inmunoprecipitados se analizaron entonces por Western blot para la presencia de ErbB3. Los resultados de estos experimentos indican que ErbB3 estaba presente en el inmunoprecipitado de ErbB2 del lisado celular estimulado por HRG, pero no en el inmunoprecipitado del lisado sin estimular. Estos resultados sugieren que HRG dirige la formación de un complejo ErbB2-ErbB3 en células Caov3. ErbB3 no se detectó en el inmunoprecipitado de la muestra tratada con el anticuerpo monoclonal anti-ErbB2, 2C4. Una disminución significativa en la señal ErbB3 se observó cuando las células se pre-incubaron con el anticuerpo 3-8D6 o su Fab resultante antes de la estimulación de HRG. Estos resultados indican que el anticuerpo 3-8D6 inhiben la formación de un complejo de ErbB2-ErbB3 siguiendo el tratamiento de HRG. La densitometría de búsqueda de los Western blots anti-ErbB3 de los inmunoprecipitados anti-ErbB2 reveló que la señal anti-ErbB3 (que indica el número de complejos ErbB2-ErbB3 presentes) también disminuye por 3-8D6 en aproximadamente 80% (rango 71-90%) . Cuando las manchas duplicadas se probaron con anti-ErbB2, cantidades equivalentes de ErbB2 se presentaron en todas las rutas.

LISTADO DE SECUENCIAS (1) INFORMACIONES GENERALES: (i) SOLICITANTE: Genentech, Inc. (ii) TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Anticuerpos ErbB3 (iii) NUMERO DE SECUENCIAS: 5 (iv) DIRECCIÓN PARA CORRESPONDENCIA: (A) DESTINATARIO: Genentech, Inc. (B) CALLE: 460 Point San bruno Blvd (C) CIUDAD: South , San Francisco (D) ESTADO: California (E) PAÍS: USA (F) CÓDIGO POSTAL (ZIP) : 94080 (v) FORMA DE LECTURA DE COMPUTADORA: (A) TIPO DE MEDIO: 3.5 pulgadas, 1.44 Mb floppy disk (B) COMPUTADORA: IBM PC compatible (C) SISTEMA DE OPERACIÓN: PC-DOS/MS-DOS (D) PAQUETERÍA: WinPatin (Genentech) (vi) DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL: (A) NUMERO DE SOLICITUD: (B) FECHA DE PUBLICACIÓN: (C) CLASIFICACIÓN: (viii) INFORMACIÓN DE ABOGADO/MANDATARIO: (A) NOMBRE: Lee, Wendy M. (B) NÚMERO DE REGISTRO: 40,378 (C) NÚMERO DE REFERENCIA/LISTA: P1003PCT (ix) INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN: (A) TELÉFONO: 415/225-1994 (B) TELEFAX: 415/952-9881 (C) TELEX: 910/371-7168 (2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 1: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 11 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 1 Pro Lys Asn Ser Ser Met lie Ser Asn Thr Pro 1 5 10 11 (2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 2: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 7 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 2: is Gln Ser Leu Gly Thr Gln 1 5 7 (2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 3: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 8 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 3: s Gln Asn Leu Ser Asp Gly Lys 5 8 (2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 4: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 8 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 4: s Gln Asn lie Ser Asp Gly Lys 5 8 (2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 5: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 8 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 5: Val lie Ser Ser His Leu Gly Gln 1 5 8 Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el convencional para la manufactura de los objetos a que la misma se refiere.

Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes.

Claims (21)

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo que enlaza a la proteína ErbB3 y reduce la formación de inducida por heregulina de un complejo de proteína ErbB2-ErbB3 en una célula, caracterizado porque expresa ErbB2 y ErbB3.

2. El anticuerpo de la reivindicación 1, caracterizado porque aumenta la afinidad de enlace de heregulina por la proteína ErbB3.

3. El anticuerpo de la reivindicación 1, caracterizado porque reduce además la activación de ErbB2 inducida por heregulina en la célula.

4. El anticuerpo de la reivindicación 1, caracterizado porque es un anticuerpo monoclonal.

5. El anticuerpo de la reivindicación 1, caracterizado porque es humanizado.

6. El anticuerpo de la reivindicación 1, caracterizado porque es humano.

7. El anticuerpo de la reivindicación 1, caracterizado porque es un fragmento de anticuerpo.

8. El fragmento de anticuerpo de la reivindicación 8, caracterizado porque es un Fab.

9. El anticuerpo de la reivindicación 1, caracterizado porque está marcado.

10. El anticuerpo de la reivindicación 1, caracterizado porque está inmovilizado en una fase sólida.

11. Un anticuerpo, caracterizado porque se enlaza a la proteína ErbB3 y aumenta la afinidad de enlace de heregulina por la proteína ErbB3.

12. Un anticuerpo, caracterizado porque se enlaza a la proteína ErbB3 y reduce la activación de ErbB2 inducida por heregulina en una célula que expresa ErbB2 y ErbB3.

13. Un anticuerpo, caracterizado porque se enlaza a la proteína ErbB3 y reduce el enlace de heregulina al mismo.

14. El anticuerpo de la reivindicación 13, caracterizado porque reduce además la activación de ErbB2 inducida por heregulina en una célula que expresa ErbB2 y ErbB3.

15. El anticuerpo de la reivindicación 1, caracterizado porque se enlaza al epítope enlazado por el anticuerpo 8B8.

16. El anticuerpo de la reivindicación 1, caracterizado porque tiene las regiones que determinan complementariedad del anticuerpo 8B8.

17. Una composición, caracterizada porque comprende el anticuerpo de la reivindicación 1 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

18. Una línea celular, caracterizada porque produce el anticuerpo de la reivindicación 1.

19. La línea celular de la reivindicación - 18, caracterizada porque es una línea celular de hibridoma que produce el anticuerpo 8B8.

20. Un método para determinar la presencia de la proteína ErbB3, caracterizado porque comprende exponer una célula sospechosa de contener la proteína ErbB3 con el anticuerpo de la reivindicación 1 y determinar el enlace de dicho anticuerpo a la célula.

21. Un estuche, caracterizado porque comprende el anticuerpo de la reivindicación 1 e instrucciones para usar el anticuerpo para detectar la proteína ErbB3.