NL1016887C2 - Werkwijze en inrichting voor het detecteren en identificeren van bio-aÙrosoldeeltjes in de lucht. - Google Patents

Description

Titel: Werkwijze en inrichting voor het detecteren en identificeren van bio-aërosoldeeltjes in de lucht.

De onderhavige uitvinding heeft betrekking op een werkwijze en een inrichting voor het detecteren en identificeren van bio-aërosoldeeltjes in de lucht.

Een dergelijke werkwijze en een daarbij gebruikte proefopstelling 5 is bekend uit een artikel van M.A. Stowers c.s.; Application of matrix- assisted laser desorption/iononization to on-line aerosol time-of-flight mass spectrometry, Rapid Commun. Mass Spectrom. 14, 829-833 (2000). In dit artikel wordt aangegeven dat er twee opties zijn voor "quasi-real-time bio-aërosol detectie", te weten een werkwijze waarbij gebruik wordt gemaakt 10 van de intrinsieke fluorescentie van bio-moleculen en werkwijzen waarbij massa spectrometrie wordt toegepast op ionen die zijn gegenereerd door laserdesorptie. Omdat bio-aërosoldeeltjes slechts een klein gedeelte van het totale gehalte aan aërosoldeeltjes in de lucht vormt, kunnen de bekende "single partiele" fluorescentie detectors wel gebruikt worden om aan te 15 geven of de aërosoldeeltjes van biologische origine of niet-biologische origine zijn; zij zijn echter niet ingericht voor het identificeren van bio-aërosoldeeltjes. In genoemd artikel wordt daarom een identificatie-experiment beschreven, waarbij wordt uitgegaan van bio-aërosoldeeltjes in een vloeistof, die wordt verneveld, waarna de nevel wordt aangezogen in een 20 ATOFMS (aerosol time-of-flight mass spectrometer). Hierin wordt op basis van MALDI (matrix-assisted laser desorption/ionization) een aërosoldeeltjes identificatie uitgevoerd. Alhoewel voor dit experiment eerst een aërosol geprepareerd is, is het doel van het in dit artikel aangegeven onderzoek toch gericht op een op real time basis uitgevoerde identificatie. Op de beschreven 25 manier kan dit echter niet bevredigend worden gerealiseerd omdat zich in de lucht voor het grootste deel niet-bio-aërosoldeeltjes bevinden. De gebruikte ATOFMS detectie- en identificatie apparatuur is daardoor relatief 1 5 Π 4 P p o “Jm 2 ongevoelig voor bio-aërosoldeeltjes. Gezien het feit dat een snelle detectie en identificatie van bio-aërosoldeeltjes onder bepaalde omstandigheden absoluut noodzakelijk is, bijvoorbeeld onder omstandigheden van biologische oorlogsvoering, is het doel van de onderhavige uitvinding gericht 5 op het in genoemd artikel gestelde doel, te weten een snelle, on-line bio-aërosoldeeltjes detectie en identificatie.

Een snelle, on-line aërosoldeeltjes detectie en identificatie, niet betreffende bio-aërosoldeeltjes detectie en identificatie, is overigens reeds bekend uit de internationale octrooiaanvrage W096/31900. Een deeltjes 10 bevattende luchtstroom wordt daarbij door een ATOFMS-systeem geleid. Een snelle detectie en identificatie van specifiek bio-aërosoldeeltjes is op deze wijze niet mogelijk, omdat deze deeltjes, zoals hiervoor reeds vermeldt, nu eenmaal relatief weinig in de lucht aanwezig zijn en juist deze deeltjes, zodra zij in de lucht worden verspreid, moeten worden geconstateerd en 15 geïdentificeerd.

Om de hiervoor genoemde problemen op te lossen, worden bij de werkwijze overeenkomstig de uitvinding in een ATOFMS de bio-aërosoldeeltjes in een deeltjesstroom geselecteerd met behulp van fluorescentietechnieken, waarna achtereenvolgens de geselecteerde bio-20 aërosoldeeltjes worden geïoniseerd, de gevormde ionen worden gedetecteerd en de bio-aërosoldeeltjes geïdentificeerd. Voor de selectie van bio-aërosoldeeltjes wordt gebruik gemaakt van de op zich bekende eigenschap dat de aanwezigheid van specifieke stoffen, zoals bijvoorbeeld aminozuren, bij bestraling met een geschikte golflengte aanleiding geeft tot een 25 karakteristieke fluorescentie. Zo geeft de bestraling van tryptofaan door UV-laserlicht van 266 nm een brede fluorescentie in het golflengtegebied van 300 tot 400 nm. Ook de fluorescentie spectra van stoffen, zoals tyrosine, NADH of riboflavine komen daarbij in aanmerking (zie: Feil c.s.; Concentration, size, and excitation power effects and microparticles 30 containing tryptophan and bacteria, SPIE, vol. 3533, p. 52-62). In het 3 algemeen vertonen anorganische en de meeste organische stoffen deze karakteristiek niet. Om van deze eigenschap gebruik te maken bij de werkwijze overeenkomstig de uitvinding, vindt de selectie van bio-aërosoldeeltjes plaats met behulp van door een eerste laserapparaat 5 opgewekte laserstraling van een golflengte die bij specifieke stoffen in bio-aërosoldeeltjes een fluorescentie teweegbrengt, waarna met behulp van een detector voor het vaststellen van de fluorescentiestraling de bio-aërosoldeeltjes worden geselecteerd en een tweede laserapparaat wordt getriggerd voor het uitzenden van licht van een golflengte die de ionisatie 10 van de slechts door de fluorescentiedetector geselecteerde bio-aërosoldeeltjes teweegbrengt. Voor het eerste laserapparaat wordt bijvoorkeur een continulaserapparaat (cw-laserapparaat) gebruikt, terwijl voor het tweede laserapparaat een pulslaserapparaat wordt toegepast, waarbij de pulsen worden getriggerd door de fluorescentiedetector.

15 Het is efficient om bij het selecteren van bio-aërosoldeeltjes tevens gebruik te maken van de grootte, dat wil zeggen de aërodynamische grootte, van de aërosoldeeltjes. De grootte van bacteriën en virussen ligt in hoofdzaak in het gebied kleiner dan 20 pm. Omdat de aërosoldeeltjes met een gegeven snelheid de centrale ruimte van de ATOFMS binnentreden, 20 kan de grootte van de opeenvolgende aërosoldeeltjes worden bepaald uit de tijdsduur van een door een aërosoldeeltje afgelegde bekende weg. Door de laserbundel van het eerste laserapparaat te richten op twee achter elkaar gelegen spots met een bekende onderlinge afstand, kan uit het door een aërosoldeeltje verstrooide en gedetecteerde licht genoemde tijdsduur en 25 daarmee de grootte van het aërosoldeeltje worden bepaald. De afstand tussen de spots dient dan wel kleiner te zijn dan de onderlinge afstand van de opeenvolgende aërosoldeeltjes. Bijvoorbeeld, bij een afstand tussen de spots van 2,5 mm en een snelheid van de aërosoldeeltjes van ongeveer 400 m/s, is de tijdsduur tussen twee metingen ongeveer 6,25 ps. Om de gewenste 30 eenduidigheid tussen metingen op de genoemde spots te verkrijgen, is 4 volgens een verder facet van de uitvinding het eerste laserapparaat een twee-kleuren continu laserapparaat, dat werkzaam is op golflengten van 266 en 532 nm. De golflengte van het op de eerste spot gerichte licht is 532 nm en die van het op de tweede spot gerichte licht is 266. Deze laatste 5 golflengte is tevens zodanig dat bio-aërosolendeeltjes daarbij fluorescentie vertonen.

Het tweede laserapparaat is bijvoorbeeld een excimeerlaserapparaat, dat werkzaam is op een golflengte van 308 nm en na een juiste triggering zorg draagt voor de ionisatie van alleen de bio-aërosoldeeltjes. Hiertoe 10 worden de pulsen van dit laserapparaat, zoals reeds vermeld, getriggerd door de fluorescentiedetector. Het gebruik van een UV-excimeerlaser brengt met zich mee dat om de hier beschreven werkwijze te kunnen uitvoeren op basis van MALDI de aërosoldeeltjes dienen te worden voorzien van een matrix. Volgens een verder facet van de uitvinding worden dan ook tijdens 15 of direct vóór het inzuigen in de ATOFMS de aërosoldeeltjes door verdamping/condensatie of sublimatie/condensatie voorzien van een dergelijke matrix. Zou een IR (infrarood) laserapparaat worden gebruikt, dan is dit niet noodzakelijk.

De werkwijze en de inrichting overeenkomstig de uitvinding zal nu 20 aan de hand van een uitvoeringsvoorbeeld nader worden toegelicht onder verwijzing naar de bijgaande tekening. Hierin toont:

Fig. 1 een inrichting waarin de werkwijze voor het vaststellen en identificeren van bio-aërosoldeeltjes in de lucht overeenkomstig de uitvinding kan worden toegepast; en 25 Fig. 2 op schematische wijze een deel van de weg die een deeltjesstroom doorloopt in de gebruikte ATOFMS met daarin aangegeven de locaties waar deeltjes worden onderworpen aan de desbetreffende laserstraling.

5 j

De in fig. 1 weergegeven ATOFMS 1 is in dwarsdoorsnede, dat wil zeggen loodrecht op de aërosoldeeltjesstroom afgebeeld. De aërosoldeeltjesstroom verloopt hierin in hoofdzaak volgens de lijn 2.

Aërosoldeeltjes worden vanuit de lucht aangezogen in de ATOFMS en in het 5 ingangsgedeelte van dit apparaat onder verhoogde temperatuur voorzien van een coating, afkomstig van een gemakkelijk sublimerende stof. Het is bekend om hiervoor bijvoorbeeld picolinezuur of sinapinezuur te gebruiken.

De aërosoldeeltjes worden vervolgens gebundeld met behulp van een aërodynamisch lenzenstelsel, een convergerende nozzle en skimmers. In fig.

10 2 is schematisch aangegeven hoe de aërosoldeeltjesstroom vanaf de nozzle 3 van genoemd ingangsgedeelte via een uitgangsopening 4 van 300 pm en skimmeropeningen 5 en 6 van respectievelijk 400 en 300 pm in de centrale ruimte 7 van de ATOFMS worden gebracht. Deze ruimte wordt door de aërosoldeeltjes één voor één, achter elkaar op een zekere onderlinge afstand 15 doorlopen. De snelheid waarmee de aërosoldeeltjes de centrale ruimte van de ATOFMS inkomen, bedraagt daarbij in het onderhavige voorbeeld ongeveer 400m/s. De druk in de desbetreffende te doorlopen ruimten bedraagt daarbij achtereenvolgens 1 bar, respectievelijk 1, ÏO3 en ÏO6 mbar.

In de centrale ruimte 7 wordt de aërosoldeeltjesstroom eerst onderworpen 20 aan bestraling door een eerste laserapparaat 8. In fig. 1 is dit een DPSS (Diode Pumped Solid State) laser, dit is een bepaald type twee-kleuren continulaser. Dit laserapparaat 8 stuurt zowel een bundel licht met een golflengte van 532 nm naar de ruimte 7 en wel ter plaatse van de spot 9, als licht met een golflengte van 266 nm ter plaatse van de spot 10 (zie fig. 2).

25 Het licht van beide golflengten wordt daarbij afgebogen door dichroïsche spiegels 11 en 12. De breedte van de spot 9 in de richting van de lijn 2 bedraagt ongeveer 50 pm, de diameter van deze spot in het vlak loodrecht daarop ongeveer 150 pm. De tijd dat een aërosoldeeltje wordt belicht, is dan ongeveer 125 ns. De breedte van de spot 10 in de richting van de lijn 2 i 6 bedraagt ongeveer 500 pm, de diameter van deze spot in een vlak loodrecht daarop weer ongeveer 150 pm. De aërosoldeeltjes die op de spot 9 worden belicht verstrooien het licht, terwijl de aërosoldeeltjes op de spot 10 zowel licht verstrooien als fluorescentiestraling emitteren voor zover een 5 aërosoldeeltje van biologische oorsprong is. Het door de aërosoldeeltjes verstrooide licht wordt gedetecteerd door de detectoren 13 en 14. Deze detectoren zijn daartoe voorzien van een fotomultiplicatorbuis. De detector 13 detecteert rechtstreeks het licht dat vanaf de spot 9 wordt verstrooid. De detector 14 detecteert via een halfdoorlatende spiegel 15 het vanaf de spot 10 10 verstrooide licht, terwijl de fluorescentiestraling door deze spiegel wordt doorgelaten en toegevoerd aan een fluorescentiedetector 16. Omdat de spiegel 15 altijd wel een kleine fractie van de verstrooide 266 nm straling doorlaat, omvat de fluorescentiedetector 16 aan de ingang een bandfilter 17, dat deze golflengte verder wegfiltert, doch de in het gebied van 300 tot 500 15 nm gelegen fluorescentiestraling doorlaat. De breedte van de spot 10 in de richting van de lijn 2 is relatief groot. Gedurende de eerste 125 ns, overeenkomend met de breedte van de spot 9, wordt in de detector 14 het strooilicht van een aërosoldeeltje vastgesteld, zodat op grond van de opeenvolgende waarnemingen van het strooilicht van de spots 9 en 10 de 20 grootte van het desbetreffende aërosoldeeltje kan worden bepaald.

Gedurende de volgende 125 ns wordt de fluorescentiedetector 16 door de detector 14 vrijgegeven om na te gaan of het desbetreffende aërosoldeeltje ook inderdaad van biologische oorsprong is. De resterende tijd dat het aërosoldeeltje op de spot 10 wordt bestraald, geeft de gelegenheid de 25 betrouwbaarheid van de fluorescentiemeting te vergroten. De fluorescentiedetector 16 omvat buiten de diverse spiegels 18, 19 en 20 een diffractierooster 21 en een CCD-beeldopnemer 22. Bij het registreren van de fluorescentiestraling worden vervolgens met behulp van een camera-besturingseenheid 23 stuursignalen afgegeven aan een triggerschakeling 30 24. Aan deze triggerschakeling 24 worden tevens uitgangssignalen van de i n ; · · ’ 7 beide detectoren 13 en 14 toegevoerd. In de triggerschakeling 24 wordt vastgesteld dat een aërosoldeeltje van biologische oorsprong is met een specifieke grootte, waarop vervolgens een triggersignaal wordt afgegeven aan de excimeerlaser 25. Met andere woorden, zodra een aërosoldeeltje van 5 een zekere grootte is herkend als zijnde van biologische oorsprong, wordt het excimeerlaserapparaat getriggerd. Dat wil zeggen dat dan door het excimeerlaser apparaat een laserpuls wordt afgegeven, welke op de spot 26 de ionisatie van het desbetreffende bio-aërosoldeeltje bewerkstelligt. Om er zeker van te zijn dat de bio-aërosoldeeltjes inderdaad worden geïoniseerd, 10 is deze spot relatief groot: in de richting van de lijn 2 ongeveer 300pm en in het vlak loodrecht daarop ongeveer 500 pm. De afstand tussen de spots 10 en 26 is afgestemd op de snelheid van de aërosoldeeltjes en de tijd nodig om het triggersignaal te genereren. De excimeerlaserpuls wordt via de genoemde dichroïsche spiegels 11, 12 naar de centrale ruimte 7 in de 15 ATOFMS geleid. De geïoniseerde bio-aërosoldeeltjes wordt vervolgens op de gebruikelijke manier met behulp van electroden 27 versneld en afgebogen en via lenzen 28 en een afbuigorgaan 29 geleid naar de iondetector 30. Het resultaat van de aldus uitgevoerde massaspectrometrie wordt weergegeven op een display 31.

20 De uitvinding is niet beperkt tot het hier aan de hand van de tekening beschreven uitvoeringsvoorbeeld, doch omvat allerlei modificaties hierop, uiteraard voor zover deze vallen binnen de beschermingsomvang van de hiernavolgende conclusies. Zo kunnen andere typen laserapparaten worden gebruikt en is het, wanneer de groottebepaling als extra hulpmiddel 25 voor het identificeren van aërosoldeeltjes als zijnde van biologische oorsprong niet nodig wordt geacht, niet noodzakelijk een twee-kleurenlaserapparaat te gebruiken. Eveneens kan in plaats van een fluorescentiedetector 16 met diffractierooster en CCD-beeldopnemer elk ander bekend type worden toegepast,· diffractierooster en CCD- f O I v J- ;Λ· i vjs 8 beeldopnemer kunnen vervangen worden door bijvoorbeeld een "gated PMT" met banddoorlaatfilters. De spotafmetingen zijn slechts bij wijze van voorbeeld gegeven; zij kunnen uiteraard anders worden gekozen, evenals de overige in beschrijving genoemde parameters. Omdat licht naar alle kanten 5 door de aërosolen wordt verstrooid, respectievelijk geëmitteerd, kunnen meerdere detectoren aanwezig zijn. Strikt genomen, is het niet absoluut noodzakelijk de detectoren 13 en 14 te gebruiken. Voldoende is de fluorescentiedetector voor het herkennen van een aërosoldeeltje als zijnde van biologische oorsprong en voor het triggeren van de excimeerlaser. De 10 betrouwbaarheid van een dergelijke uitvoering zal echter voor de praktijk onvoldoende zijn.

Claims (7)

1. 1. Werkwijze voor het vaststellen en identificeren van bio-aërosoldeeltjes in de lucht, waarbij in een ATOFMS (aerosol time-of-flight mass spectrometer) de bio-aërosoldeeltjes in een deeltjesstroom worden geselecteerd met behulp van fluorescentietechnieken en slechts de 5 geselecteerde bio-aërosoldeeltjes worden geïoniseerd, waarna achtereenvolgens de gevormde ionen worden gedetecteerd en de bio-aërosoldeeltjes geïdentificeerd

2. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat de selectie van bio-aërosoldeeltjes plaatsvindt met behulp van door een eerste 10 laserapparaat opgewekte laserstraling van een golflengte die bij specifieke stoffen in bio-aërosoldeeltjes een fluorescentie teweegbrengt, waarna met behulp van een fluorescentiedetector de bio-aërosoldeeltjes worden geselecteerd en een tweede laserapparaat wordt getriggerd voor het uitzenden van licht van een golflengte die de ionisatie van de slechts door de 15 fluorescentiedetector geselecteerde bio-aërosoldeeltjes teweegbrengt.

3. Werkwijze volgens conclusie 1 of 2, met het kenmerk, dat tijdens of direct vóór het inzuigen in de ATOFMS de aërosoldeeltjes door verdamping/condensatie of sublimatie/condensatie worden voorzien van een matrix, waarna de geselecteerde bio-aërosoldeeltjes op basis van MALDI 20 (matrix-assisted laser desorption/ionization) worden geïoniseerd, waarna achtereenvolgens de ionen worden gedetecteerd en de bio-aërosoldeeltjes geïdentificeerd.

4. Inrichting voor toepassing van de werkwijze volgens een van de voorgaande conclusies onder gebruikmaking van een ATOFMS, met het 25 kenmerk, dat een eerste laserapparaat aanwezig is voor het uitzenden van licht van een golflengte die bij specifieke stoffen in bio-aërosolen een fluorescentie teweegbrengt en een bijbehorende fluorescentiedetector voor het vaststellen van de fluorescentiestraling, alsmede een door deze detector getriggerd tweede laserapparaat voor het uitzenden van licht van een golflengte die de ionisatie van de door de fluorescentiedetector geselecteerde bio-aërosolen teweegbrengt.

5. Inrichting volgens conclusie 4, met het kenmerk, dat het eerste laserapparaat een continulaserapparaat is en het tweede laserapparaat een pulslaserapparaat.

6. Inrichting volgens conclusie 4 of 5, met het kenmerk, dat het eerste laserapparaat een twee-kleuren continu laserapparaat is, werkzaam op 10 golflengten van 266 en 532 nm.

7. Inrichting volgens een van de conclusies 4-6, met het kenmerk, dat het tweede laserapparaat een excimeerlaserapparaat is, werkzaam op een golflengte van 308 nm.