NL1039495C2 - Werkwijze ter vervaardiging van een huidsubstituut op basis van spinnenzijde alsmede draagstructuur vervaardigd onder toepassing van deze werkwijze en draagstructuur met doorgroeiende levende huid. - Google Patents

Description

Titel: Werkwijze ter vervaardiging van een huidsubstituut op basis van spinnenzijde alsmede draagstructuur vervaardigd onder toepassing van deze werkwijze en draagstructuur met doorgroeiende levende huid.

5 Kunstenares en uitvinder Jalila Essaïdi van bovengenoemde nieuwe werkwijze, nieuwe draagstructuur en nieuwe doorgroeiende levende huid is beoefenaar van de opkomende kunststroming "BioArt" waarin levend biologisch materiaal gebruikt wordt als medium om het kunstwerk te realiseren.

10 Uitgangsmateriaal voor dit doel is afkomstig uit de biotechnologie. De uitvinder heeft zich verdiept in het gebruik van spinnenzijde en gewone zijde bij toepassing voor huid. Met huid wordt in deze werkwijze de huid bedoeld in de breedste zin van het woord, zowel organische huid voor toepassingen zoals bijvoorbeeld bij brandwonden en open wonden, maar ook artificiële huid van voorwerpen zoals 15 bijvoorbeeld sokken en auto's.

Studies over de eigenschappen van zijde geven aan dat natuurlijke spinnenzijde een hoge potentie heeft voor warmte geleiding en in biologische toepassingen er een snellere genezing kan optreden, minder littekenweefsel ontstaat, 20 zachtere wondgenezing en stimulatie van het regeneratieproces van huidcellen.

Een toepassingsproject van spinnenzijde leek bijvoorbeeld geschikt als uitvoering voor een kogelwerendvest omdat spinnenzijde vele malen sterker, elastischer en vocht- en temperatuurbestendiger is dan de Kevlarvezel. Ook de 25 toepassing als hechtdraad voor medische doeleinden is bekend. De uitvinder heeft zich nu laten inspireren door deze bekende toepassingen en overwogen dat wanneer spinnenzijde met succes als hechtdraad gebruikt kan worden, dan zal het aannemelijk zijn dat er evenmin een immuunreactie zal optreden indien het nieuw en inventief gecombineerd wordt met weefselkweek. Ook heeft de uitvinder zich laten inspireren 30 en overwogen dat als natuurlijk spinnenzijde een hoge potentie voor warmte geleiding heeft, dan zal het aannemelijk zijn dat een huidsubstituut op basis van textiel of andere twee en drie dimensionale inventief verkregen constructies, vervaardigd van spinnenzijde afkomstig van genetisch gemodificeerde organismen, ook een hoge warmtegeleidende eigenschap zullen hebben.

1 039 49 5 35 2

INLEIDING

Spinnenzijde bestaat uit vezelachtige proteïnes welke worden gesponnen door een verscheidenheid aan spinnen'. Deze hebben een scala aan functies; het 5 beschermen van eieren, het gebruik als dragline, het maken van een net dat een hoge impact kan weerstaan en insecten kan vangen"iv. Spinnenzijde komt voor in vele soorten en maten, bijvoorbeeld een Orb-weaver kan 6 verschillende soorten spinnenzijde produceren met ieder verschillende mechanische eigenschappen.

10 STAND VAN DE TECHNIEK VOOR SPINNENZIJDE

Spinnenzijde is zowel sterker in termen van energie alvorens te breken dan Kevlar, tot wel 5 maal zo sterk, maar is ook elastischer dan Nylonv vi. Het heeft een treksterkte tot wel zes maal zo hoog als de treksterkte van staalvii. Bovendien is 15 spinnenzijde ook stabiel bij een groot temperatuurbereik tot wel 250°C, de warmtegeleiding is bijzonder hoog en het is flexibel en onoplosbaar in vele organische en waterige oplosmiddelen, alsmede zwakke zuren en basenviii ix; desondanks is het wel langzaam bio-afbreekbaarx x'.

20 Een drager voor huidweefselkweek moet bij voorkeur afbreken op een vergelijkbaar tempo als de groei van nieuw weefsel, zodat het nieuwe weefsel kan worden geïntegreerd in het omringende gastheer-weefsel. Dit afbrekings-proces is bij zowel zijde als spinnenzijde een resultaat van proteolysex" Xl" xiv, waarvan proteasen de grootste invloed hebbenx xv XVI. In vivo onderzoek heeft aangetoond dat spinnenzijde al 25 na 14 dagen na implantatie werd afgebrokenXVH, echter dit is erg afhankelijk van de vorm van de drager.

De belangrijkste eigenschap van spinnenzijde voor het gebruik in organische huid-substituten is bio-compatibiliteit. Normale zijde wordt al sinds het einde van de 30 19de eeuw op commerciële schaal gebruikt voor hechtmateriaal en heeft bewezen een effectief biomateriaal te zijn, echter het is niet volledig bio-compatibel. Spinnenzijde (spidroin) in tegenstelling tot normale zijde (fibroin), beschikt niet over de immunogene sericin coating welke in combinatie met fibroin is geïdentificeerd als de bron van deze immunogene reactiesxvl"x,x. Verschillende onderzoeken tonen aan dat 35 wanneer sericin wordt onttrokken uit de normale zijde cel-hechting, proliferatie, levensvatbaarheid, de groei en functie voor een verscheidenheid aan celtypes, toeneemtxx xxi xxii xxiii xxiv xxv xxvi xxvii. Echter wanneer de sericin onttrokken wordt uit de normale zijde resulteert dit in veranderingen van onder andere de mechanische 3 eigenschappen van de zijdexxv,ii, en in hoeverre deze eigenschappen veranderen is afhankelijk van de gebruikte methodexxlx. Het gegeven dat spinnenzijde niet beschikt over deze immunogene sericin coating en dus zonder extra bewerking bio-compatibelxvii is maakt spinnenzijde tot de ideale keuze voor een drager voor huid-5 substituten.

De belangrijkste eigenschap van spinnenzijde voor het gebruik in artificiële huid-substituten is de warmtegeleidende eigenschap van spinnenzijde die warmte beter geleidt dan de meeste materialen, waaronder siliconen, aluminium en zuiver 10 ijzer3"™.

VERSCHILLENDE PRODUCTIE METHODEN VAN SPINNENZIJDE

Om spinnenzijde op natuurlijke wijze te verkrijgen van spinnen dienen deze in 15 grote ruimtes afgezonderd van elkaar intensief verzorgd te worden10™'. Mede hierdoor is het oogsten van grote hoeveelheden van spinnenzijde (voor industriële normen) niet uitvoerbaar en werken er verschillende partijen aan alternatieve strategieën voor de productie van grote hoeveelheden spinnenzijde.

20 Wereldwijd wordt er onderzoek gedaan naar transgenetische modificatie van verschillende organismen, waaronder geiten, bacteriën, alfalfa en zijdewormen3™3*". In deze organismen wordt een gen afkomstig van spinnen ingebracht, verantwoordelijk voor de productie van een spinnenzijde proteïne, met als doel dat deze nieuwe organismen zelf dit spinnenzijde proteïne kunnen produceren.

25

Bij de meeste van deze onderzoeken is het oogsten van grote hoeveelheden spinnenzijde echter nog niet commercieel interessant, vanwege de hoge productie kosten. Recente onderzoek bij zijdewormen biedt hier een veel belovende toekomst; verschillende onderzoeken onder leiding van zowel Hongxiu Wen als Randy Lewis 30 resulteerden in de creatie van een transgene zijderups die spinnenzijde eiwitten produceert, een combinatie van de chemische en fysische eigenschappen van spinnenzijde met de vergemakkelijkte oogst van zijdewormen3*3™'".

De spinnenzijde die door de uitvinder gebruikt werd voor het kogelwerend 35 project is afkomstig van onderzoek ontstaan aan de hand van de NIH Grant welke was toegekend aan Randy Lewis, Don Jarvis en Mac Frasier. Met behulp van deze Grant zijn verschillende soorten transgenetisch gemodificeerde zijdewormen gecreëerd die in 4 hun zijde voornamelijk spinnenzijde produceerden. Ook zijn er wormen gecreëerd waar het originele zijdeproducerend gen uit verwijderd is; een platform-worm die klaar is voor een genetische ingreep met als resultaat tailormade spinnenzijde. Spinnenzijde met de gewenste mechanische eigenschappen, afgestemd op de wensen 5 van de onderzoekers. Zo heeft het bedrijf Biocraft wereldwijde licenties rechten gekregen voor het gebruik / toepassing van deze spinnenzijde.

DRAGERS VOOR TISSUE ENGINEERING OP BASIS VAN SPINNENZIJDE

10 Het gebruik van zijde voor dragers in tissue engineering is een gebied waar op brede schaal onderzoek naar gedaan wordt. De hieronder besproken verschillende vormen van dragers op basis van zijde zouden ook gemaakt kunnen worden op basis van spinnenzijdexxxiv xxxv xxxvi xxxvii.

15 Veranderingen van onder andere mechanische eigenschappen van zijde door het onttrekken van sericinxxvl" zijn niet meer van belang wanneer de zijde wordt opgelost. In deze meest simpele vorm kan zijde verwerkt worden als een film of een coating voor andere materialenxxi xxxviii xxxix xl, in deze vorm kan de zijde ook behandeld worden door middel van zout uitloging om een poreuze drager te creëren*1' xl" X|IM xllv xlv 20 xlv'xlv"X|VI"X|IX en een sponzige of poreuze drager kan ook verkregen worden door vriesdrogen**......, gas foaming11,1 en phase seperationhi'llv. Zijde-oplossingen kunnen ook omgezet worden in vezels met behulp van electrospinningxxxvl lv lv' xxxv'lv" |VI", en getwijnd worden tot draad*llx lx 1x1 lx"lxl" waar dragers mee gemaakt kunnen worden. Ook kan zijde in opgeloste vorm gebruikt worden als basis ingrediënt voor hydrogelslxiv 25 Ixv ixvi ixvü ixviü dje a,s drager kunnen functioneren.

Voor de ontwikkeling van de drager gebruikt voor het kogel werend project is echter geen gebruik gemaakt van een spinnenzijde in opgeloste vorm maar van recombinant spinnenzijde in draadvorm direct afkomstig van een cocon van een 30 genetisch gemanipuleerde zijdeworm. Deze spinnenzijde was verkregen via Randy Lewis in de vorm van een spoel met daarop de afgewikkelde cocon. Om de spinnenzijde machinaal te kunnen verweven moest deze echter verstevigd worden door de zijde van drie spoelen te twijnen tot één draad.

35 Bij het weven van de spinnenzijde tot een drager is rekening gehouden met twee belangrijke eigenschappen van de vorm van de drager voor een optimale vergroeiing met het verkozen huid-model.

5 (a) Het gebruikte huid-model voor het huid-substituut op basis van spinnenzijde dient vanuit de onderkant gevoed te worden en aan de bovenkant blootgesteld te worden aan lucht. Hiervoor worden petri-schaaltjes gebruikt die een 5 inlage hebben met een permeabel membraan waarop het huid-model met de daarin aanwezige drager zich bevind. Mede doordat de ingezaaide cellen vanuit de onderkant gevoed worden dient de drager te beschikken over openingen van 50 a 150 micrometer. Deze openingen mogen niet groter zijn vanwege de afmetingen van de in te zaaien cellen.

10 (b) Het vergroten van de oppervlakte van de drager zorgt ervoor dat meer cellen zich kunnen hechten aan de drager en draagt daarmee bij aan de stevigheid van de uiteindelijke huid.

15 VERSCHILLENDE HUID-MODELLEN

Menselijk gereconstrueerde huidmodellen zijn op verschillende gebieden steeds belangrijker geworden in de afgelopen jaren. Gereconstrueerde epidermis-modellen vervangen al dierproeven voor huidcorrosie en huidirritatie testen. Ze worden gebruikt 20 voor het testen van de cosmeticarichtlijnen en wetgeving. Meer complexe huid modellen worden ingezet als research tools voor de cosmetische en farmaceutische industrie, alsmede voor de academische wereld. Vooral in dit gebied, groeit de diversiteit van de huid modellen en toepassingen snel.

25 HUID-SUBSTITUUT OP BASIS VAN SPINNENZIJDE

Het streven voor het kogelwerend project van de uitvinder was om een huid te maken die zo dicht mogelijk in de buurt komt van de menselijke huid, dit om het werk zeg maar "dichter op de huid te brengen". Mede hierdoor was gekozen voor een full-30 thickness huid-model gebaseerd op menselijke huidcellen die geïsoleerd werden uit huid welke overblijft na cosmetische ingrepen zoals borstverkleiningen, buikwandcorrecties en besnijdenissen.

Omdat de drager gebaseerd op spinnenzijde in het huid-model verwerkt dient 35 te worden zijn de volgende stappen een aanvulling op bestaande protocollen voor huid-modellen.

6 1. De drager gebaseerd op fibers/draad wordt met plasma behandeld om deze steriel te krijgen, dit vanwege overlapping van verschillende fibers. Een drager gebaseerd op films/poreuze scaffolds/sponzen wordt behandeld door verhitting.

2. De drager kan gecoat worden met verschillende moleculen ter verbetering van 5 celhechting en/of andere eigenschappen, zoals basement membrane proteines die van nature aanwezig zijn in de natuurlijke huid.

3. Een fibroblast cultuur, verkregen alvorens het verkozen huid-model ontstaat, wordt met collageen tot een vloeibare gel verwerkt; de verhouding tussen het fibroblast-medium bestaande uit 20% fibroblasten en het collageen is 6:1.

10 4. Dit vloeibaar collageen / fibroblasten mengsel wordt over de drager gegoten en op 37,5 graden bij 5% CO2 weggezet in een C02 incubator voor 2 a 3 dagen.

Dit geheel gelegeerd / vergroeid vormt een dermis waarin de drager geïntegreerd is.

5. Vervolgens wordt op deze dermis een keratinocyten cultuur, verkregen uit het 15 verkozen huid-model, aangebracht.

6. Na 1 a 2 dagen afgesloten in de C02 incubator worden de keratinocyten 14 dagen aan de lucht blootgesteld om te groeien en te differentiëren. Tijdens deze periode dient het medium drie maal per week vervangen te worden.

20 De fibroblasten vormen samen met het collageen en de drager een kunstmatige dermis waarop de keratinocyten groeien. Omdat het gekweekte model aan de lucht wordt blootgesteld, vormt zich na ongeveer twee weken een levensechte huid, voorzien van alle in de echte huid aanwezig huidlagen, versterkt door de spinnenzijde.

25

Door het twijnen van 2 of meer spinnenzijde-draden (een materiaal direct afkomstig van cocons van genetisch gemodificeerde zijdewormen en daarmee vele malen steker dan de alternatieven omdat het geen processen hoeft te doorlopen die invloed hebben op de mechanische eigenschappen van spinnenzijde), ontstaat er een 30 draad die steviger is dan de oorspronkelijke variant.

Door toepassing van de machinaal geweven spinnenzijde-draad (zowel het origineel als de sterkere getwijnde variant voorheen besproken) ontstaat een constructie die steviger en goedkoper is om te produceren omdat het gebruik kan 35 maken van de al eeuwen oude bekende productie uit de zijde-industrie.

7

De hierboven besproken constructie kan toegepast worden als een goedkopere warmtegeleider voor een breed scala aan toepassingen. Afhankelijk of het doel warmtewisseling of warmteafvoer is kan besloten worden om de dichtheid van de verweven constructie aan te passen zodat deze optimaal warmte kan afstaan of 5 opnemen van een medium. Ook kan de verkregen constructie geïsoleerd worden om warmteverlies te minimaliseren.

De hierboven besproken constructie kan ook toegepast worden als een goedkopere drager voor weefselkweek.

10

De hierboven besproken drager vormt door zijn materiaal en weefstructuur een constructie die betere celhechting vertoont voor weefseikweek. Spinnenzijde heeft op zich al de eigenschappen voor een goede celhechting, maar de vergrote oppervlakte verkregen door de weeftechniek en het aanmengen van een celcultuur met collageen 15 in een bepaalde verhouding versterkt deze eigenschappen.

Normale zijde wordt al sinds het einde van de 19de eeuw op commerciële schaal gebruikt voor hechtmateriaal en heeft bewezen een effectief biomateriaal te zijn. Verschillende onderzoeken tonen aan dat in combinatie met zijde met een 20 verminderde mate van sericin de groei en functie voor een verscheidenheid aan celtypes toeneemtxx xx". Door toepassing van de hier boven besproken drager voor weefselkweek ontstaat er nu een constructie die de groei en functie van cellen in verhoogde mate stimuleert en zo een significante invloed heeft op de huidgroei.

25 Een drager voor huidweefselkweek moet bij voorkeur afbreken op een vergelijkbaar tempo als de groei van nieuw weefsel, zodat het nieuwe weefsel kan worden geïntegreerd in het omringende gastheer-weefsel. Dit afbrekings-proces is bij zowel zijde als spinnenzijde een resultaat van proteolysexii xiii xiv, waarvan proteasen de grootste invloed hebbenx xv xvi. In vivo onderzoek heeft aangetoond dat spinnenzijde al 30 na 14 dagen na implantatie werd afgebrokenxv", echter dit is erg afhankelijk van de vorm van de drager. Door toepassing van de hierboven besproken drager voor weefselkweek ontstaat er een constructie met de juiste vorm die op een acceptabel tempo bio-afbreekbaar en geen / in een mindere mate schadelijke stoffen produceert welke immunogene reacties kunnen oproepen.

35

De belangrijkste eigenschap van spinnenzijde voor het gebruik in huid-substituten is bio-compatibiliteit. Spinnenzijde, in tegenstelling tot normale zijde, 8 beschikt niet over de immunogene sericin coating welke is geïdentificeerd als de bron van immunogene reactiesxviii xix. Door toepassing van de hierboven besproken drager voor weefselkweek ontstaat er een constructie die dankzij het gebruik van spinnenzijde een verminderde pathologische immuniteitsrespons teweeg zal brengen.

5

Door toepassing van de hierboven besproken drager voor weefselkweek, waarop via een speciale techniek huidcellen worden aangebracht ontstaat een constructie die een betere hechting vertoont met huid, bio-afbreekbaar en bio-compatibel is, celgroei verbetert en een stevigere huid vormt dan alle alternatieven 10 die tot op heden bestaan. Een stevigere huid met een aantal nieuwe eigenschappen zoals de tolerantie voor harde impacten, zoals door kogels en scherven.

Een normale huid groeit in vitro gemiddeld 5 weken en begint dan af te sterven doordat de productie van stamcellen afneemt / opraakt. Door de combinatie met de 15 hierboven besproken drager is in dit experiment/project de huid na 2 maanden nog steeds blijven doorgroeien. Men weet nog niet wat er precies gebeurd is, slechts blijkt dat de stamcelproductie niet is gestagneerd. Verder onderzoek is nodig. Men speculeert dat er misschien een aminozuur uit de spinnenzijde zorgt voor stimulering van de stamcelproductie waardoor de huid blijft doorgroeien.

20

De uitvinding wordt in de tekening toegelicht aan de hand van enkele illustraties.

In de tekening toont Fig. 1 een machinaal geweven spinnenzijde drager voor 25 een organisch huidsubstituut. De inslag omkapselt de schering dusdanig dat de schering zowel aan de bovenkant als onderkant niet meer zichtbaar is. Hierdoor ontstaat een meer drie dimensionale constructie ten opzichte van traditioneel geweven textiel. De hier afgebeelde variant heeft een hoge weefdichtheid; 30 Fig. 2 toont in vergroting een aanzicht van de spinnenzijde drager van Fig. 1;

Fig. 3 toont de spinnenzijde drager van Fig.1 ingebed in een volgroeid full-thickness huidmodel; 35 Fig. 4 toont het testresultaat van een test bij het Nederlands Forensisch

Instituut met betrekking tot de verhoogde resistentie van het huidsubstituut uit Fig. 3 ten opzichte van de kogelproef.

9

VOORBEELDEN VAN PRAKTISCHE TOEPASSINGEN

Het gebruik van spinnenzijde afkomstig van genetisch gemodificeerde 5 organismen en meer specifiek het gebruik van spinnenzijde-draad en recombinant spinnenzijde-draad afkomstig van genetisch gemodificeerd zijdewormen voor:

A: LIFE SCIENCES

10 1. het vervaardigen van een sterkere huid voor plastische chirurgie: een huidsubstituut op basis van spinnenzijde kan een belangrijke vooruitgang betekenen, in het bijzonder voor mensen met zgn. doorligplekken, oorlogsslachtoffers met grote wonden, brandwonden, etc.; 15 2. het weven van twee dimensionale dragers voor weefselkweek; 3. het weven van complexe drie dimensionale dragers met verschillende structuren en dichtheden afgesteld op een combinatie van verschillende soorten cellen gecombineerd tot 1 drager voor weefselkweek; 4. het gebruik als medium voor drie dimensionale printers voor de 20 productie van dragers voor weefsel kweek; 5. het weven van een drager voor weefselkweek die cel-hechting bevordert; 6. het weven van een drager voor weefselkweek die celgroei stimuleert; 7. het weven van een biocompatibele drager voor weefselkweek met 25 verminderde pathologische immuunrespons; 8. het weven van een bio-afbreekbare drager voor weefselkweek waarvan de snelheid van de degratie (bio-afbreekbaarheid) van de drager afstembaar is op de gewenste situatie; 9. het weven van een drager voor weefselkweek voor stimulatie van 30 stamcel- productie; 10. het vervaardigen van een inwendige liftende BH; 11. het vervaardigen van synthetische ligamenten en pezen; 12. het vervaardigen van zijdespray voor open wonden; 13. het weven tot verband/pleisters/drukverband.

35 10

B: ALGEMEEN GEBRUIK TEXTIEL

14. het weven van sterkere textiele materialen; 15. het weven tot flexibele kabels; 5 16.het weven van een flexibel support voor tape op basis van nanotubes of ander kleefbaar materiaal; 17. het weven voor het gebruik in kleding in ruime zin, zoals in shirts, sweaters, truien, ondergoed, nachtkleding, boven- en onderkleding, lingerie, BH, hemden/slips, blazers/jasjes, jurken/rokken, broeken, 10 stropdassen, sokken, panties, sjaals, hoeden, petten, korsetten, trouwjurken, bretels, baby kleding; 18. het weven voor het gebruik in lichtgewicht sterkere schoenen en laarzen; 19. het weven voor het gebruik in kogelwerende civiele kleding: shirts, 15 jasjes, tops; 20. het weven en combineren met een synthetisch materiaal dat de kogelwerende eigenschappen van de voorheen omschreven huid, gegroeid op de spinnenzijde matrix, kopieert voor het gebruik in kogelwerende vesten; 20 21.het weven tot buitenkant/huid/omhulsel voor auto's, trailers en andere vaar- en voertuigen; 22. het weven voor gebruik in bekleding van stoelen en banken; 23. het weven tot bed textiel, overtrek, onderlaken, kussenslopen, slaapzakken; 25 24.het weven tot gordijnen; 25. het weven voor gebruik in tapijten; 26. het weven voor gebruik in tassen, sieraden, portemonnees, riemen; 27. het weven voor gebruik in paraplu's, parasols; 28. het weven voor gebruik in boekkaften; 30 29.het weven tot spankabels/spanbanden/veiligheidsriemen; 30. het weven voor gebruik in silk top lace pruiken; 31. het weven tot vlaggen.

11 C: SPECIFIEK GEBRUIK VAN EEN OP SPINNENZIJDE GEBASEERD TEXTIEL GEBASEERD OP HET FEIT DAT SPINNENZIJDE WARMTE BETER GELEIDT DAN MENIG ANDER MATERIAAL: 5 32. het weven tot thermisch geleidend textiel; 33. het weven tot huid/omhulsel voor zonneboilers; 34. het weven tot een warmtewisselaar voor zonneboilers; 35. het weven tot heatsinks/warmteafvoer voor elektronica welke dankzij de weefstructuur gemakkelijk warmte kunnen afstaan aan de lucht; 10 36. het weven tot warmteafvoer/warmtewisselaar voor vloeistoffen; 37. het weven tot warmteafvoer/warmtewisselaar voor gassen; 38. het weven tot warmtewisselaar voor elektronica; 39. het weven tot flexibele heatsinks/warmteafvoer voor datacenters/serverparks; 15 40. het weven tot flexibele warmtewisselaar voor grotere toepassingen, tuinbouw, ruimtevaart; 41. het weven tot flexibele warmtewisselaar in de vorm van zonwering; 42. het weven tot flexibele warmtewisselaar / flexibel element voor centrale verwarming.

20 43. het weven tot binnenkantvoering voor handschoenen en schoenen; 44. het weven tot warmtewisselaar voor absorptie koeling zoals absorptiekoelkasten met een warmtebron op basis van: a. zonnewarmte; b. verbrandingswarmte; 25 c. de uitlaat van auto's; d. de motor van auto's; e. de buitenkant/huid/skin van auto's; f. operationele warmte van datacenters/serverparks; 45. het weven tot warmtewisselaar voor airco's op basis van absorptie 30 koeling; 46. het weven tot warmtewisselaar / flexibel element voor vloerverwarming; 47. het weven tot elektronisch verwarmde onder/boven-dekens, kussens, sloffen, stoelzittingen en inlegzooltjes; 35 48. het weven tot thermische gordijnen.

12

D: ALGEMEEN GEBRUIK VAN SPINNENZIJDE PROTEÏNE IN NIET GEWEVEN VORM

49. al de voorgaande gebruiken van spinnenzijde gebaseerd op het feit dat spinnenzijde warmte beter geleidt dan koper (C) maar dan niet in de 5 vorm van een geweven textiel maar als foam, gel of film; 50. al de voorgaande gebruiken van spinnenzijde voor kleding en bekleding volgens B, maar dan niet in de vorm van een geweven textiel maar als een foam, gel of film; 51. al de voorgaande gebruiken van spinnenzijde voor biotechnologische 10 toepassingen volgens A, maar dan niet in de vorm van een geweven textiel maar als een foam, gel of film; 52. het gebruik in haarproducten, shampoo, iotions, gezicht crème, make-up; 53. het gebruik als medium voor 3d printers; 15 54. bio-afbreekbare bekertjes, bestek, medicijn potjes plasticzakken, afsluitingen voor verpakkingsmateriaal; 55. zijdedraad als tandflos.

13 i Vollrath, F. Biology of spider silk. International Journal of Biological

Macromolecules 1999; 24(2-3): 81-88.

ii. Foelix, R.F. Biology of spiders.Cambridge, MA, USA: Harvard University Press; 1992.

5 iii. Vollrath, F. Strength and Structure of spiders' silks. Journal of Biotechnology 2000; 74(2): 67-83.

iv Wang, Y., Kim, H.J., Vunjak-Novakovic, G., Kaplan, D.L. Stem cell-based tissue engineering with silk biomaterials. Biomaterials 2006; 27(36): 6064-82.

10 v Kubik S (2002) High-performance fibers from spider silk. Angew Chem Int Ed

Engl 41(15): 2721-2723.

vi Ko FK, Jovicic J (2004) Modeling of mechanical properties and structural design of spider web. Biomacromolecules 5(3): 780-785.

vii Allmeling, C.; Jokuszies, A.; Reimers, K.; Kali, S. and Vogt P. M. (July- 15 September 2006). "Use of spider silk fibres as an innovative material in a biocompatible artificial nerve conduit". Journal of Cellular and Molecular Medicine 10 (3): 770-777.

viii Lombardi SJ, Kaplan DL (1990) The amino acid composition of major ampullate gland silk (dragline) of nephila davipes (araneae, tetragnathidae).

20 The Journal of Arachnology (USA) 18(3): 297-306.

ix Cunniff PM, Fossey SA, Auerbach MA, Song JW, Kaplan DL, et al. (1994) Mechanical and thermal properties of dragline silk from the spider nephila clavipes. Polymer for Advanced Technologies. (5): pp. 401-410.

x Horan, R.L., Antle, K., Collette, A.L., Wang, Y., Huang, J., Moreau, J.E., 25 Volloch, V., Kaplan, D.L., Altman, G.H. In vitro degradation of silk fibroin.

Biomaterials 2005; 26(17): 3385-3393.

xi Wang Y, Rudym DD, Walsh A, Abrahamsen L, Kim HJ, et al. In vivo degradation of three-dimensional silk fibroin scaffolds. Biomaterials 2008; 29(24-25): 3415-3428.

30 xii Taddei, P., Arai, T., Boschi, A., Monti, P., Tsukada, M., Freddi, G. In vitro study of the proteolytic degradation of Antheraea pernyi silk fibroin. Biomacromolecules 2006; 7(1): 259-267.

xiii Hermanson, K.D.; Huemmerich, D.; Scheibel, T.; Bausch, A.R. Engineered microcapsules fabricated from reconstituted spider silk. Adv. Mater. 2007, 19, 35 1810-1815.

14 xiv Hermanson, K.D.; Harasim, M.B.; Scheibel, T.; Bausch, A.R. Permeability of silk microcapsules made by the interfacial adsorption of protein. Phys. Chem. Chem. Phys. 2007, 9, 6442-6446.

xv Arai, T., Freddi, G., Innocenti, R., Tsukada, M. Biodegradation of bombyx mori 5 silk fibroin fibers and films. Journal of Applied Polymer Science 2004; 91(4): 2383-2390.

xvi Li, M., Ogiso, M., Minoura, N. Enzymatic degradation behavior of porous silk fibroin sheets. Biomaterials 2003; 24(2): 357-365.

xvii Vollrath, F., Barth, P., Basedow, A., Engstrom, W., List, H. Local tolerance to 10 spider silks and protein polymers in vivo. In Vivo 2002; 16(4): 229-234.

xviii Soong, H.K., Kenyon, K.R. Adverse reactions to virgin silk sutures in cataract surgery. Ophthalmology 1984; 91(5): 479-483.

xix Panilaitis, B., Altman, G.H., Chen, J.S., Jin, H.J., Karageorgiou, V., Kaplan, D.L. Macrophage responses to silk. Biomaterials 2003; 24(18): 3079-3085.

15 xx Kuhbier JW, Allmeling C, Reimers K, Hillmer A, Kasper C, et al. (2010)

Interactions between spider silk and cells-NIH/3T3 fibroblasts seeded on miniature weaving frames. PLoS One 5(8): el2032.

xxi Gupta, M.K., Khokhar, S.K., Phillips, D.M., Sowards, L.A., Drummy, L.F., Kadakia, M.P., Naik, R.R. Patterned silk films cast from ionic liquid solubilized 20 fibroin as scaffolds for cell growth. Langmuir 2007; 23(3): 1315-1319.

xxii Minoura N, Aiba S, Gotoh Y, Tsukada M, Imai Y (1995) Attachment and growth of cultured fibroblast cells on silk protein matrices. J Biomed Mater Res 29(10): 1215-1221.

xxiii Roh, D.H., Kang, S.Y., Kim, J.Y., Kwon, Y.B., Hae, Y.K., Lee, K.G., Park, Y.H., 25 Baek, R.M., Heo, C.Y., Choe, J., Lee, J.H. Wound healing effect of silk fibroin/alginateblended sponge in full thickness skin defect of rat. Journal of Materials Science: Materials in Medicine 2006; 17(6): 547-552.

xxiv Servoli, E., Maniglio, D., Motta, A., Predazzer, R., Migliaresi, C. Surface properties of silk fibroin films and their interaction with fibroblasts.

30 Macromolecular Bioscience 2005; 5(12): 1175-1183.

xxv Unger, R.E., Wolf, M., Peters, K., Motta, A., Migliaresi, C., James Kirkpatrick, C. Growth of human cells on a non-woven silk fibroin net: a potential for use in tissue engineering. Biomaterials 2004; 25(6): 1069-1075.

xxvi Jin, H.-J., Chen, J., Karageorgiou, V., Altman, G.H., Kaplan, D.L. Human bone 35 marrow stromal cell responses on electrospun silk fibroin mats. Biomaterials 2004; 25(6): 1039-1047.

15 xxvii Inouye, K., Kurokawa, M., Nishikawa, S., Tsukada, M. Use of Bombyx mori silk fibroin as a substratum for cultivation of animal cells. Journal of Biochemical and Biophysical Methods 1998; 37(3): 159-164.

xxviii Perez-Rigueiro, 3., Elices, M., Llorca, J., Viney, C. Effect of degumming on the 5 tensile properties of silkworm (Bombyx mori) silk fiber. Journal of Applied

Polymer Science 2002; 84(7): 1431-1437.

xxix Jiang, P., Liu, H., Wang, C., Wu, L., Huang, J., Guo, C. Tensile behavior and morphology of differently degummed silkworm (Bombyx mori) cocoon silk fibres. Materials Letters 2006; 60(7): 919-925.

10 xxx Huang, X., Liu, H. Wang, X., New Secrets of Spider Silk: Exceptionally High Thermal Conductivity and Its Abnormal Change under Stretching. Advanced Materials 2012.

xxxi Higgins L (2006) Quantitative shifts in orb-web investment during development in nephila clavipes (araneae, nephilidae). Journal of Arachnology 15 34(2): 374-386.

xxxii Fahnestock SR, Irwin SL (1997) Synthetic spider dragline silk proteins and their production in escherichia coli. Appl Microbiol Biotechnol 47(1): 23-32.

xxxiii Wen H, Lan X, Zhang Y, Zhao T, Wang Y, et al. (2010) Transgenic silkworms (bombyx mori) produce recombinant spider dragline silk in cocoons. Mol Biol 20 Rep 2010; 37(4): 1815-182.

xxxiv Bai, 3., Ma, T., Chu, W., Wang, R., Silva, L., Michal, C., Chiao, J.C., Chiao, M. Regenerated spider silk as a new biomaterial for MEMS. Biomedical Microdevices 2006; 8(4): 317-323.

xxxv Gellynck, K., Verdonk, P., Almqvist, K.F., Van Nimmen, E., Gheysens, T., 25 Mertens, J., Van Langenhove, L., Kiekens, P., Verbruggen, A. Chondrocyte

Growth in Porous Spider Silk 3D-Scaffolds. European Cells and Materials Journal 2005; 10(Suppl. 2): 45.

xxxvi Bini, E., Foo, C.W.P., Huang, J., Karageorgiou, V., Kitchel, B., Kaplan, D.L. RGD-Functionalized Bioengineered Spider Dragline Silk Biomaterial.

30 Biomacromolecules 2006; 7(11): 3139-3145.

xxxvii Rammensee, S., Huemmerich, D., Hermanson, K.D., Scheibel, T., Bausch, A.R. Rheological characterization of hydrogels formed by recombinantly produced spider silk. Applied Physics A: Materials Science and Processing 2006; 82(2): 261-264.

35 xxxviii Sofia, S., McCarthy, M.B., Gronowicz, G., Kaplan, D.L. Functionalized silk-based biomaterials for bone formation. Journal of Biomedical Materials Research 2001; 54(1): 139-148.

16 xxxix Meinel, L, Hofmann, S., Karageorgiou, V., Kirker-Head, C, McCool, J.,

Gronowicz, G., Zichner, L, Langer, R., Vunjak-Novakovic, G., Kaplan, D.L.

The inflammatory responses to silk films in vitro and in vivo. Biomaterials 2005; 26(2): 147-155.

5 xl Jin, H.J., Park, J., Valluzzi, R., Cebe, P., Kaplan, D.L. Biomaterial films of

Bombyx mori silk fibroin with poly(ethylene oxide). Biomacromolecules 2004; 5(3): 711-717.

xli Wang, Y.Z., Blasioli, D.J., Kim, H.J., Kim, H.S., Kaplan, D.L. Cartilage tissue engineering with silk scaffolds and human articular chondrocytes. Biomaterials 10 2006; 27(25): 4434-4442.

xlii Wang, Y.Z., Kim, U.J., Blasioli, D.J., Kim, H.J., Kaplan, D.L. In vitro cartilage tissue engineering with 3D porous aqueous-derived silk scaffolds and mesenchymal stem cells. Biomaterials 2005; 26(34): 7082-7094. xliii Marolt, D., Augst, A., Freed, L.E., Vepari, C., Fajardo, R., Patel, N., Gray, M., 15 Farley, M., Kaplan, D., Vunjak-Novakovic, G. Bone and cartilage tissue constructs grown using human bone marrow stromal cells, silk scaffolds and rotating bioreactors. Biomaterials 2006; 27(36): 6138-6149. xliv Meinel, L., Hofmann, S., Karageorgiou, V., Zichner, L., Langer, R., Kaplan, D., Vunjak-Novakovic, G. Engineering cartilage-1 ike tissue using human 20 mesenchymal stem cells and silk protein scaffolds. Biotechnology and

Bioengineering 2004; 88(3): 379-391.

xlv Hofmann, S., Hagenmuller, H., Koch, A.M., Muller, R., Vunjak-Novakovic, G., Kaplan, D.L., Merkle, H.P., Meinel, L. Control of in vitro tissue-engineered bone-like structures using human mesenchymal stem cells and porous silk 25 scaffolds. Biomaterials 2007; 28(6): 1152-1162.

xlvi Kim, H.J., Kim, U.-J., Vunjak-Novakovic, G., Min, B.-H., Kaplan, D.L.

Influence of macroporous protein scaffolds on bone tissue engineering from bone marrow stem cells. Biomaterials 2005; 26(21): 4442-4452. xlvii Meinel, L., Betz, 0., Fajardo, R., Hofmann, S., Nazarian, A., Cory, E., Hilbe, 30 M., McCool, J., Langer, R., Vunjak-Novakovic, G., Merkle, H.P., Rechenberg, B., Kaplan, D.L., Kirker-Head, C. Silk based biomaterials to heal critical sized femur defects. Bone 2006; 39(4): 922-931. xlviii Kirker-Head, C., Karageorgiou, V., Hofmann, S., Fajardo, R., Betz, 0., Merkle, H.P., Hilbe, M., von Rechenberg, B., McCool, J., Abrahamsen, L., Nazarian, A., 35 Cory, E., Curtis, M., Kaplan, D., Meinel, L. BMP-silk composite matrices heal critically sized femoral defects. Bone 2007; 41(2): 247-255.

17 xlix Karageorgiou, V., Tomkins, M., Fajardo, R., Meinel, L., Snyder, B., Wade, K., Chen, J., Vunjak-Novakovic, G., Kaplan, D.L. Porous silk fibroin 3-D scaffolds for delivery of bone morphogenetic protein-2 in vitro and in vivo. Journal of Biomedical Materials Research Part A 2006; 78A(2): 324-334.

5 I Nazarov, R., Jin, H.J., Kaplan, D.L. Porous 3-D Scaffolds from Regenerated

Silk Fibroin. Biomacromolecules 2004; 5(3): 718-726.

li Li, M., Wu, Z., Zhang, C., Lu, S., Yan, H., Huang, D., Ye, H. Study on porous silk fibroin materials. II. Preparation and characteristics of spongy porous silk fibroin materials. Journal of Applied Polymer Science 2001; 79(12): 2192-10 2199.

lii Matsuzaki, M., Sato, A., Nakazawa, Y., Asakura, T. Preparation of bombyx mori silk fibroin sponge and the characterization. Polymer Preprints, Japan, Yokohama 2294.

liii Aoki, H., Tomita, N., Morita, Y., Hattori, K., Harada, Y., Sonobe, M., Wakitani, 15 S., Tamada, Y. Culture of chondrocytes in fibroin-hydrogel sponge. Bio-

Medical Materials and Engineering 2003; 13(4): 309-316.

liv Morita, Y., Tomita, N., Aoki, H., Wakitani, S., Tamada, Y., Suguro, T., Ikeuchi, K. Visco-elastic properties of cartilage tissue regenerated with fibroin sponge. Bio-Medical Materials and Engineering 2002; 12(3): 291-298.

20 Iv Chen, C., Chuanbao, C., Xilan, M., Yin, T., Hesun, Z. Preparation of non- woven mats from all-aqueous silk fibroin solution with electrospinning method. Polymer 2006; 47(18): 6322-6327.

Ivi Li, C.M., Vepari, C., Jin, H.J., Kim, H.J., Kaplan, D.L. Electrospun silk-BMP-2 scaffolds for bone tissue engineering. Biomaterials 2006; 27(16): 3115-3124. 25 Ivii Jin, H.J., Fridrikh, S.V., Rutledge, G.C., Kaplan, D.L. Electrospinning Bombyx mori Silk with Poly(ethylene oxide). Biomacromolecules 2002; 3(6): 1233-1239.

Iviii Kim, S.H., Nam, Y.S., Lee, T.S., Park, W.H. Silk fibroin nanofiber.

Electrospinning, properties, and structure. Polymer Journal 2003; 35(2): 185-30 190.

lix Altman, G.H., Horan, R.L., Lu, H.H., Moreau, J., Martin, I., Richmond, J.C., Kaplan, D.L. Silk matrix for tissue engineered anterior cruciate ligaments. Biomaterials 2002; 23(20): 4131-4141.

lx Horan, R.L., Collette, A.L., Lee, C., Antle, K., Chen, J., Altman, G.H. Yarn 35 design for functional tissue engineering. Journal of Biomechanics 2006; 39(12): 2232-2240.

18

Ixi Chen, J., Altman, G.H., Karageorgiou, V., Horan, R.L., Collette, A.L., Volloch, V., Colabro, T., Kaplan, D.L. Human bone marrow stromal cell and ligament fibroblast responses on RGD-modified silk fibers. Journal of Biomedical Materials Research Part A 2003; 67A(2): 559-570.

5 Ixii Moreau, J.E., Chen, J., Horan, R.L., Kaplan, D.L., Altman, G.H. Sequential

Growth Factor Application in Bone Marrow Stromal Cell Ligament Engineering. Tissue Engineering 2005; 11(11-12): 1887-1897.

Ixiii Seo, Y.K., Choi, G.M., Kwon, S.Y., Lee, H.S., Park, Y.S., Song, K.Y., Kim, Y.J., Park, J.K. The biocompatibility of silk scaffold for tissue engineered ligaments.

10 Key Engineering Materials 2007; 342-343: 73-76.

Ixiv Fini, M., Motta, A., Torricelli, P., Giavaresi, G., Nicoli Aldini, N., Tschon, M., Giardino, R., Migliaresi, C. The healing of confined critical size cancellous defects in the presence of silk fibroin hydrogel. Biomaterials 2005; 26(17): 3527-3536.

15 Ixv Kim, U.J., Park, J., Li, C., Jin, H.J., Valluzzi, R., Kaplan, D.L. Structure and properties of silk hydrogels. Biomacromolecules 2004; 5(3): 786-792.

Ixvi Gil, E.S., Frankowski, D.J., Hudson, S.M., Spontak, R.J. Silk fibroin membranes from solvent-crystallized silk fibroin/gelatin blends: Effects of blend and solvent composition. Materials Science and Engineering: C 2007; 20 27(3): 426-431.

Ixvii Fang, J.Y., Chen, J.P., Leu, Y.L., Wang, H.Y. Characterization and evaluation of silk protein hydrogels for drug delivery. Chemical and Pharmaceutical Bulletin 2006; 54(2): 156-162.

Ixviii Motta, A., Migliaresi, C., Faccioni, F., Torricelli, P., Fini, M., Giardino, R.

25 Fibroin hydrogels for biomedical applications: Preparation, characterization and in vitro cell culture studies. Journal of Biomaterials Science, Polymer Edition 2004; 15(7): 851-864.

1039495

Claims (4)

1. Werkwijze ter vervaardiging van een huidsubstituut in de breedste zin van het woord op basis van één of meer getwijnde spinnenzijde-draden afkomstig van 5 genetisch gemanipuleerde organismen, in het bijzonder de genetisch gemanipuleerde zijdewormen, welke machinaal geweven worden tot een huidsubstituut dat een (sterk) verhoogde warmtegeleiding heeft en in combinatie met weefselkweek daarbij een (sterk) verminderde pathologische immuniteitsresponse van dat te gebruiken weefsel teweegbrengt. 10

2. Draagstructuur vervaardigd volgens de werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat het huidsubstituut een aanmerkelijk betere hechting heeft met de huid, bio-afbreekbaar en bio-compatibel is, de celgroei stimuleert en een verhoogde weerstand bied tegen harde impacten. 15

3. Draagstructuur volgens conclusie 2, met het kenmerk, dat het huidsubstituut na te zijn vervaardigd onder toepassing van de werkwijze volgens conclusie 1 een opmerkelijke "doorgroei" vertoont.

4. Een complex twee of drie dimensionale constructie vervaardigd volgens werkwijze volgens conclusie 1, dusdanig afgesteld dat de verhoogde warmtegeleiding optimaal benut kan worden voor diens toepassing. 1039495