NL194904C

NL194904C - Mannelijke steriele plant.

Info

Publication number: NL194904C
Application number: NL9401153A
Authority: NL
Inventors: Toyokazu Akamatsu; Tsutomu Kagami; Hiromi Sato; Toshi Shiga
Original assignee: Sakata Seed Corp
Priority date: 1993-07-14
Filing date: 1994-07-12
Publication date: 2003-07-04
Also published as: NL194904B; NL9401153A

Description

1 194904

Mannelijke steriele plant

Deze uitvinding heeft betrekking op een mannelijke steriele plant van het geslacht Brassica omvattende een veelvoud aan cellen met elk een veelvoud aan mitochondriên en een veelvoud aan chloroplasten.

5 Bij mannelijke steriele planten zijn de voortplantingsorganen niet functioneel aanwezig. Met niet functioneel aanwezig zijn wordt bedoeld dat op het moment dat de vrouwelijke geslachtsorganen van een plant rijp zijn, er geen mannelijke functionele geslachtsorganen of stuifmeelkorrels van dezelfde plant aanwezig zijn. Hoe dit bereikt kan worden, wordt hieronder uitgelegd.

Deze planten worden bereid met het doel om het met zichzelf kruisen van tweeslachtige planten te 10 voorkomen. Het niet met zichzelf kunnen kruisen van planten wordt wel in zichzelf onverenigbaarheid genoemd. De onderhavige uitvinding vóórziet in nieuwe soorten van mannelijke steriele planten, speciaal van de familie cruciferae (brassicaceae), met name van het geslacht Brassica.

Het nut van in zichzelf onverenigbare planten moge duidelijk zijn. Deze planten kunnen namelijk veel gerichter gekruist worden met andere raszuivere lijnen zonder dat er zelfbestuiving en dus planten (of zaad) 15 zonder de gewenste gekruiste eigenschappen worden geproduceerd.

Als gevolg van de snelle ontwikkeling van plantbiotechnologie in recente jaren zijn er verscheidene middelen voor het verbeteren van plantvariêteiten ontwikkeld. Bij deze middelen voor het verbeteren van plantvarieteiten neemt een mannelijke steriele voorraad een zeer belangrijke plaats in. Bijvoorbeeld het verzamelen van zaad van een F1 -hybride van een groente die tot de familie van de Cruciferae behoort 20 wordt over het algemeen uitgevoerd door gebruik te maken van een "in zichzelf onverenigbaar” inteeltlijn waarin bevruchting niet normaal wordt uitgevoerd als gevolg van het feit dat stuifmeel niet kiemt, de stuifmeelbuis niet kan uitgroeien in de stamper, de groeisnelheid van de stuifmeelbuis verlaagd of onderbro· ken wordt, enz. ondanks bestuiving, omdat een dergelijke lijn hoewel zij monoklineus is en de reproductieve organen van beide seksen zich gelijktijdig ontwikkelen, onverenigbaar is. Niettemin is het bekend dat er 25 sommige inteeltiijnen zijn waarvan het moeilijk is om de gewenste F1-hybrides op efficiënte wijze te verkrijgen, omdat zij zwak zijn in die "met zichzelf onverenigbaarheid” hoewel zij in hun praktische eigenschappen persé uitstekend zijn. Wanneer de productie van een F1-hybride onder gebruikmaking van een mannelijke steriele voorraad als vrouwelijk ouder gewenst wordt, wordt in dergelijke gevallen geen stuifmeel geproduceerd door gezegde vrouwelijke ouder en kan dientengevolge de efficiënte productie van 30 een F1-hybride als bovenbeschreven worden bereikt

Een mannelijke steriele plant van het geslacht Brassica is bijvoorbeeld bekend uit Ogura, H., Mem. Pac.Agri., Kagoshima Univ., vol. 6 pp. 39-78 (1968).

Als één van de middelen voor het produceren van een mannelijke steriele plant kan de kemsubstitutie-techniek genoemd worden. Bij deze techniek wordt een kern van een reeds gevormde mannelijke steriele 35 plant vervangen door een kern van een gewenste plant

Bij deze kemsubstitutietechniek blijft het mitochondriaal DNA, dat bekend is als een genetische bron van mannelijke steriliteit in het cytoplasma bewaard, waardoor de mannelijke steriliteit persé bewaard blijft.

Naast het mitochondriale DNA blijven ook de chloroplasten van de mannelijke steriele plant behouden. Van een chloroplast is bekend dat deze zijn eigen genen bevat die een belangrijke invloed uitoefenen op de 40 expressie van de kenmerken van een plant. In het geval dat een mannelijke steriele voorraad niet gerelateerd is aan de voorraad die de kern levert, kan er een interactie optreden tussen de hetgeen genoemde chloroplast en de genoemde kern, hetgeen kan leiden tot een onvoordelig fenomeen.

Zo’n onvoordelig fenomeen wordt bijvoorbeeld beschreven in het hierboven genoemde artikel, waarin een kemgesubstitueerd type (Ogura) Brassica cam pestris werd geproduceerd door het Ogura cytoplasma van 45 een Japanse radijs te gebruiken als het cytoplasma dat voorziet in mannelijke steriliteit. De kern werd geleverd door een plant behorende tot de Brassica campestris en werd vertegenwoordigd door een Chinese kool. Deze combinatie leidde tot een plant die bij lage temperaturen aan chlorosis leidt. Daarenboven wordt de groei van necatariên in genoemde plant niet gezien, zodat het moeilijk wordt om een insekt zoals een honingbij of dergelijke aan te trekken die een rol hebben bij het transporteren van stuifmeel. Dientengevolge 50 lijkt het moeilijk om te zeggen dat genoemde plant een gunstige voorraad is om te worden ontwikkeld.

Een ander voorbeeld van een mannelijke steriele plant is bekend uit Pelletier et al., Mol.Gen.Gent., vol. 191, blz. 244-250 (1983). Hierin wordt het gebruik beschreven van een mannelijke steriele voorraad/ somatische hybride die verkregen is door protoplasten van de bovengenoemde Ogura radijs cel te fuseren met protoplasten van een plant behorende tot Brassica napus (koolzaad).

55 In een dergelijke somatische hybride blijft de mannelijke steriliteit van de Ogura radijscel behouden en tegelijkertijd valt een chloroplast afgeleid van de Ogura af en blijft alleen een chloroplast van een plant behorende tot het bovengenoemde genus Brassica behouden. Als een resultaat hiervan, heeft genoemde 194904 2 somatische hybride voordelen doordat de bovengenoemde chlorosis en onbevredigende groei van nectariên onherkenbaar worden.

Niettemin is er een grens, uit technisch oogpunt, aan het soort plant behorende tot het genus Brassica dat toegepast kan worden in bovengenoemde protoplastfusie. Daarom is het op dit moment moeilijk om, 5 hetgeen een kweker wil, een mannelijke steriele somatische hybride vrijelijk te produceren middels de bovengenoemde protoplastfusietechnieken.

Dientengevolge ligt het probleem dat op te lossen is met de onderhavige uitvinding in het voorzien van een mannelijke steriele plant die vrijelijk gebruikt kan worden, zoals een kweker dat wil, voor het produceren van een somatische hybride.

10 De onderhavige uitvinders hebben een intensieve bredere en diepere studie gemaakt om het bovenstaande probleem op te lossen. Als een resultaat daarvan, hebben zij gevonden dat het mogelijk is om een plant te produceren behorende tot het genus Brassica die de genoemde gewenste karakteristieken behoud en die tegelijkertijd de mannelijke steriliteit, bruikbaar voor de productie van een F1-hybride bij het terugkruisen van genoemde somatische hybride met een gewenste plant van het genus Brassica, behoud. 15 Het doel van de onderhavige uitvinding wordt bereikt door een mannelijke steriele plant als in de aanhef vermeld, met het kenmerk, dat deze verder mitochondriaal DNA in elke mitochondrion omvat welk DNA toont: een eerste restrictie fragment lengte polymorfisme (RFLP) als geanalyseerd met BamHI als een restrictie-enzym en atpA als probe die identiek is aan een corresponderende identiek geanalyseerde RFLP van 20 mitochondriaal DNA in Ogura cytoplasma, een tweede RFLP als geanalyseerd met EcoRI als een restrictieenzym en atpA als probe die identiek is aan een corresponderende identiek geanalyseerde RFLP van het Ogura mitochondriaal DNA, een derde RFLP als geanalyseerd met Hindlll als een restrictieenzym en atp6 als probe die identiek is aan een corresponderende identiek geanalyseerde RFLP van het Ogura mitochondriaal DNA, 25 een vierde RFLP als geanalyseerd met BamHI als een restrictieenzym en atPa als probe die identiek is aan een corresponderende identiek geanalyseerde RFLP van mitochondriaal DNA in kool, een vijfde RFLP als geanalyseerd met BamHI als een restrictieenzym en coxl als probe die identiek is aan een corresponderende identiek geanalyseerde RFLP van het Ogura mitochondriaal DNA, en een zesde RFLP als geanalyseerd met EcoRI als een restrictieenzym en coxl als probe die identiek is aan 30 een corresponderende identiek geanalyseerde RFLP van het kool mitochondriaal DNA; en chloroplast DNA in elk chloroplast welke toont: een zevende RFLP als geanalyseerd met EcoRI als een restrictieenzym en cpDNA(a) als probe die identiek is aan een corresponderende identiek geanalyseerde RFLP van het chloroplast DNA in kool, en een achtste RFLP als geanalyseerd met Hindlll als een restrictieenzym en cpDNA(a) als probe die identiek 35 is aan een corresponderende identiek geanalyseerde RFLP van het chloroplast DNA in kool.

Het doel van de onderhavige uitvinding wordt tevens bereikt door een mannelijke steriele plant als in de aanhef vermeld, met het kenmerk, dat deze verder mitochondriaal DNA in elke mitochondrion omvat welk DNA toont: een eerste restrictie fragment lengte polymorfisme (RFLP) als geanalyseerd met BamHI als een restrictie* 40 enzym en atpA als probe omvattende een eerste groot fragment (3.7 kb) van een corresponderende identiek geanalyseerde RFLP van het mitochondriaal DNA in Ogura cytoplasma en een tweede groot fragment (4.1 kbp) van een corresponderende identiek geanalyseerde RFLP van mitochondriaal DNA in kool, een tweede RFLP als geanalyseerd met EcoRI als een restrictieenzym en atpA als probe die identiek Is aan 45 een corresponderende identiek geanalyseerde RFLP van het mitochondriaal DNA van kool, een derde RFLP als geanalyseerd met Hindlll als een restrictieenzym en atpA als probe omvattende een derde groot fragment (6.6 kbp) die verschillend is van zowel een corresponderende identiek geanalyseerde RFLP van Ogura mitochondriaal DNA en een corresponderende identiek geanalyseerd RFLP van het mitochondriaal DNA van kool, 50 een vierde RFLP als geanalyseerd met BamHI als een restrictieenzym en atp6 als probe die identiek is aan een corresponderende identiek geanalyseerde RFLP van mitochondriaal DNA in kool, een vijfde RFLP als geanalyseerd met BamHI als een restrictieenzym en coxl als probe die identiek is aan een corresponderende identiek geanalyseerde RFLP van het Ogura mitochondriaal DNA, en een zesde RFLP als geanalyseerd met EcoRI als een restrictieenzym en coxl als probe die identiek is aan 55 een corresponderende identiek geanalyseerde RFLP van het kool mitochondriaal DNA; en chloroplast DNA in elke chloroplast welke toont.

een zevende RFLP als geanalyseerd met EcoRI als een restrictieenzym en cpDNA(a) als probe die identiek 3 194904 is aan een corresponderende identiek geanalyseerde RFLP van het chloroplast DNA in kool, en een achtste RFLP als geanalyseerd met Hindlll als een restrictieenzym en cpDIMA(a) als probe die identiek is aan een corresponderende identiek geanalyseerde RFLP van het chloroplast DNA in kool.

Het doel van de onderhavige uitvinding wordt ook bereikt door een mannelijke steriele plant als in de 5 aanhef vermeld, met het kenmerk, dat deze verder mitochondriaal DNA in elke mitochondrion omvat welk DNA toont een eerste restrictie fragment lengte polymorfisme (RFLP) als geanalyseerd met BamHI als een restrictieenzym en atpA als probe die identiek is aan een corresponderende identiek geanalyseerde RFLP van mitochondriaal DNA in Ogura cytoplasma, 10 een tweede RFLP als geanalyseerd met EcoRI als een restrictieenzym en atpA als probe die identiek is aan een corresponderende identiek geanalyseerde RFLP van Ogura mitochondriaal DNA, een derde RFLP als geanalyseerd met Hindlll als een restrictieenzym en atpA als probe die identiek is aan een corresponderende identiek geanalyseerde RFLP van het Ogura mitochondriaal DNA; een vierde RFLP als geanalyseerd met BamHI als restrictieenzym en atp6 als probe die identiek is aan een 15 corresponderende identiek geanalyseerde RFLP van Ogura mitochondriaal DNA, een vijfde RFLP als geanalyseerd met BamHI als een restrictieenzym en coxl als probe die identiek is aan een corresponderende identiek geanalyseerde RFLP van het Ogura mitochondriaal DNA, en een zesde RFLP als geanalyseerd met EcoRI als een restrictieenzym en coxl als probe die identiek is aan een corresponderende identiek geanalyseerde RFLP van het Ogura mitochondriaal DNA; 20 en chloroplast DNA in elk chloroplast welke toont: een zevende RFLP als geanalyseerd met EcoRI als een restrictieenzym en cpDNA(a) als probe omvattende een eerste groot fragment (1.95 kpb) die verschillend is van zowel een corresponderende identiek geanalyseerde RFLP van het chloroplast DNA In Ogura cytoplasma en een corresponderende identiek geanalyseerde RFLP van het chloroplast DNA in kool, en 25 een achtste RFLP als geanalyseerd met Hindlll als een restrictieenzym en cpDNA(a) als probe omvattende een tweede groot fragment (1.95 kbp) die verschillend is van zowel corresponderende identiek geanalyseerde RFLP van het chloroplast DNA in Ogura cytoplasma en een corresponderende identiek geanalyseerde RFLP van het chloroplast DNA in kool.

Het voordeel van bovenbeschreven mannelijke steriele plant van het geslacht Brassica is dat een plant 30 verkregen wordt die het mogelijk maakt om een somatische hybride die mannelijke steriliteit bezit, zoals door de kweker gewenst, te produceren.

Een mannelijke steriele plant van het geslacht Brassica zoals beschreven in de conclusies is op volgende globale wijze te verkrijgen: (1) Een methode voor het kweken van een mannelijke steriele plarri, omvattende het terugkruisen van een 35 plant die mannelijke steriliteit bezit verkregen door protoplast fusie technieken gebaseerd op een somatische hybride plantcel die het cytoplasma draagt dat mannelijke steriliteit veroorzaakt alsmede een kern van een plant behorend tot Brassica oleracea of een kern van een hybridedeplant tussen een plant behorend tot Brassica oleracea en een plant behorend tot Brassica campestris met een plant behorend tot Brassica oleracea. Brassica campestris, Brassica napus of Brassica juncea om een mannelijke steriele plant te 40 kweken behorend tot Brassica oleracea, Brassica campestris, Brassica napus of Brassica juncea die het bovenstaande cytoplasma dat mannelijke steriliteit overbrengt draagt tezamen met een hoog zuivere kern van een plant behorend tot gezegde Brassica oleracea, Brassica campestris, Brassica napus of Brassica juncea.

(2) Een werkwijze voor het kweken van mannelijke steriele plant volgens het bovenstaande (1), waarin het 45 cytoplasma dat mannelijke steriliteit overbrengt een cytoplasma is verkregen door het recombineren van het

Ogura cytoplasma.

(3) Een methode voor het zich doen voortplanten van een mannelijke steriele plant, omvattende het terugkruisen van een plant die mannelijke steriliteit verkregen door protoplast fusie technieken gebaseerd op een somatische hybride plantcel die een cytoplasma dat mannelijke steriliteit overdraagt bezit, tezamen met 50 een kern van een plant behoren tot Brassica oleracea of een kern van een hybridepjant tussen een plant behorend tot Brassica oleracea en een plant behorend tot Brassica campestris met een plant behorend tot Brassica oleracea, Brassica campestris, Brassica napus of Brassica juncea om een mannelijke steriele plant te kweken behorend tot Brassica oleracea, Brassica campestris, Brassica napus of Brassica juncea die het bovenstaande cytoplasma dat mannelijke steriliteit overbrengt draagt tezamen met een hoog zuivere kern 55 van een plant behorend tot gezegde Brassica oleracea, Brassica campestris, Brassica napus of Brassica juncea.

(4) Een werkwijze voor het zich doen voortplanten van een mannelijke steriele plant als in het boven- 194904 4 staande (3) beschreven, waarin het cytoplasma dat mannelijke steriliteit overbrengt een cytoplasms is verkregen door het recombineren van het Ogura cytoplasma.

Hieronder volgt een meer gedetailleerdere wijze waarop een mannelijke steriele plant van het geslacht Brassica zoals beschreven in de conclusies is te verkrijgen: 5 A. Productie van een plant die mannelijke steriliteit bezit gebaseerd op een somatisch hybride verkregen door protoplast fusie technieken die een cytoplasma dat mannelijke steriliteit draagt overbrengt alsmede een kern van een plant behorend tot Brassica oleracea of een kern van een hybrideplant tussen een plant behorend tot Brassica oleracea en een plant behorend tot Brassica campestris.

Als voorbeelden van ”een plant behorend tot Brassica oleracea" waaruit een somatische hybridecel kan 10 worden bereid door volledig gebruik te maken van protoplast fusie technieken, worden hier als bijzonder geschikte planten genoemd, een kool, een broccoli, een bloemkool, een decoratieve boerenkool, spruitjes, een koolrabi, spinazie, een kairan (de albograbragroep van Brassica oleracea L), een boerenkool, waaronder ’’Kinkei 210”, een F1 hybridevariëteit en de oude lijn "F’ (welke allebei zijn geproduceerd door SAKATA SEED CORPORATION). Deze cellen van genoemde planten kunnen makkelijk geïsoleerd worden 15 als protoplasten en gefuseerd worden met ander protoplasten.

Als voorbeelden van "een somatische hybrideplant tussen planten behorend tot het genus Brassica” waaruit genoemde somatische hybridecel kan worden bereid door volledig gebruik te maken van protoplast fusie technieken, kunnen worden genoemd een hakuran (kunstmatig gesynthetiseerde Brassica napus), die bekend is als een interspecies hybride van een hybride van een kool en een Chinese kool en dergelijke. Het 20 is bekend dat het van oorsprong mogelijk is om de protoplast fusie technieken volledig toe te passen op hun Chinese kool behorend tot Brassica campestris [Jourdan, P. & E.D. Earle; J. Amer. Hort. Schi., vol. 114, blz. 343-349 (1989)]. Het verdient daarom de voorkeur om een Hakuran te gebruiken als ”een somatische hybrideplant tussen planten behorend tot het genus Brassica” waarop protoplast fusie technieken volledig kunnen worden töegepast volgens de onderhavige kweekmethoden omdat het een overbruggingsplant kan 25 zijn voor het produceren van een mannelijke steriele Chinese kool.

Als voorbeelden van een cytoplasma dat mitochondria draagt die mannelijke steriliteit overbrengen, kunnen worden genoemd het Ogura cytoplasma (afgeleid van een Japanse radijs), het SHIGA-THOMPSON cytoplasma en POLIMA cytoplasma (afgeleid van een koolzaad), het ANAND cytoplasma (afgeleid van een mosterdzaad), het MURALIS cytoplasma (afgeleid van Diplotasis muralis) enz. Onder deze mannelijke 30 steriliteit overbrengende cellen, kan het Ogura cytoplasma genoemd worden als bijzonder voordelig omdat een zogenaamd restoratiegen, dat de fertiliteit van een plant herstelt, zeer zeldzaam tot expressie wordt gebracht zelfs als genoemd cytoplasma wordt overgebracht in een plant van het genus Brassica zodat de mannelijke steriliteit per se stabiel behouden kan blijven. Als protoplast fusietechnieken, hetgeen technieken zijn voor het bereiden van een somatische hybridecel tussen een plantcel behorend tot het bovengenoemde 35 gerius Brassica en een cel die een cytoplasma bezit dat mannelijke steriliteit overbrengt, kunnen gebruikelijke technieken die nu worden toegepast op plantencellen worden geadopteerd [Kao N.K. en M.R.

Michayluk, Planta, vol. 115, blz. 355-367 (1974)].

In het bijzonder, worden protoplasten geïsoleerd door celwanden te verwijderen van plantencellen en de genoemde protoplasten met elkaar gefuseerd. Als voorbeelden van fusiemethode kunnen, in dit geval, 40 worden genoemd de traditionele techniek gebruik makend van polyethyleenglycol als een fusogeen; de elektrofusietechniek omvattende het zich tot een parelketting laten vormen van protoplasten door elektriciteit en hierop direct stroom toe te passen. Wanneer efficiëntie van de fusie in acht genomen wordt, dan kan de later genoemde elektrofusietechniek als de voordelige fusietechniek genoemd worden.

Na het uitvoeren van protoplastfusie, kan genoemde gefuseerde protoplast verder worden geïnduceerd 45 tot een gewenste plant door het kweken van die gefuseerde protoplast volgens een op zich bekende methode. Bijvoorbeeld wordt de gefuseerde protoplast gekweekt in een callus kwekend medium bijvoorbeeld het Yamashita & Shimamoto’s medium [Jpn. J. Breeding; vol. 34, supplement volume no. 2, blz. 30-3 (1984)] om kleine calli te bereiden, waarna gezegde kleine calli op regeneratiemedia worden geplaatst die worden bereid door het toevoegen van planthormonen zoals cytokinine en dergelijke aan verschillende 50 basale media om de kleine calli te kweken en de gewenste planten te induceren.

Overigens, van welke hybridecellen de gefuseerde mitochondriale DNA’s en chloroplast DNA’s afkomstig zijn kan worden bevestigd door genoemde DNA's te extraheren en de enzymrestrictiepatronen daarvan te analyseren met de RFLP methode onder gebruikmaking van een bekende probe, of een vergelijkbare methode.

55 B. Terugkruisen van een somatische hybrideplant voorzien van een mannelijke steriliteit verkregen als eerder Brassica oleracea, Brassica campestris, Brassica napus of Brassica juncea om een mannelijke steriele plant te kweken behorend tot Brassica oleracea, Brassica campestris, Brassica napus of Brassica \ 5 194904 juncea die het bovengenoemde cytoplasms dat mannelijke steriliteit overbrengt draagt alsmede een hoog zuivere kern van een plant behorend tot genoemde Brassica oleracea, Brassica cam pestris, Brassica napus of Brassica juncea.

Gezegde terugkruising wordt uitgevoerd door het direct terug te kruisen van een somatische hybrideplant 5 voorzien van mannelijke steriliteit verkregen als bovengenoemd met een plant behorend tot Brassica oleracea, Brassica campestris, Brassica napus of Brassica juncea waarvan de productie gewenst is. Wanneer het terugkruisen meer frequent wordt herhaald komt de somatische hybrideplant dichter bij de pure lijn van een plant behorend tot het genus Brassica. Met betrekking tot eigenschappen van het cytoplasma gedurende deze periode, wordt opgemerkt dat die van moederplant bewaard blijven. Dat wil 10 zeggen, de bovengenoemde mannelijke steriliteit blijft bewaard zoals hij is in nakomelingen planten ongeacht de frequentie van gezegde terugkruising. In een specifieke procedure voor de terugkruising wordt de ovuiecultuur gezamenlijk geadopteerd gedurende de eerste twee keren en daarna wordt gebruikelijke terugkruising uitgevoerd. Hoewel de frequentie van gezegde terugkruising afhangt van de mate van verwantschap tussen een somatische hybrideplant die mannelijke steriliteit bezit en een plant gehorend tot 15 gezegd genus Brassica waarvan de productie gewenst is en hoe zuiver de mannelijke steriele plant die geproduceerd moet worden bedoeld Is, is dit over het algemeen ten minste 5 keer, bij voorkeur ongeveer 7 keer.

Daarenboven kan de ovule cultuurmethode [Nishi et al.; JpnJ. Breed., vol. 8, blz. 215-222 (1959)] gezamenlijk worden geadopteerd in de bovenstaande terugkruising om efficiënt generaties nakomelingen te 20 verkrijgen. In het geval hybridisatie van een plant tussen planten die niet congeen maar xenogeen zijn, dan heeft de bovenstaande gezamenlijke adoptie de voorkeur.

Overigens is er geen restrictie voor een plant behorend tot Brassica oleracea, Brassica campestris, Brassica napus of Brassica juncea als onderwerp van deze terugkruising voor zover het een plant is behorend tot gezegd genus Brassica. Als specifieke voorbeelden van de plant behorend tot Brassica 25 aleracea, kunnen worden genoemd een kool, een broccoli, een bloemkool, een decoratieve boerenkool, spruitjes, koolrabi, spinazie, een kairan (de albograbragföep van Brassica oleracea L) een boerenkool, enz. Als specifieke voorbeelden van de plant behorend tot Brassica campestris kunnen worden genoemd een Chinese kool, een knol, een chingensai (Brassica rapa L. var. chinenis), een komatsuna (Brassica rapa L. var. pervidis), Nabana (Brassica rapa L. var. amplexicaulis), een Nozawana (Brassica rapa L var. rapa), 30 een geselecteerd nakomelingenschap van (een Chugokusaishin x een kunstmatig gesynthetiseerd koolzaad) enz. Als specifieke voorbeelden van de plant behorend tot Brassica napus kunnen worden genoemd een koolzaad, een kunstmatig gesynthetiseerd koolzaad als een hybridisatie nakomelingenschap van (herfst-gedicht x broccoli), enz. Als specifieke voorbeelden van de plant behorend tot Brassica juncea kunnen worden genoemd een bladmosterd, een gekraagd bladmosterd, een oliebladmosterd, een takana (Brassica 35 juncea Czern en Coss var. ineglifolia Kitamura), een zaasai (Brassica juncea var. bulbifera Mas.), enz. vanwege de eenvoud van terugkruisen verdienen de hieronder vermelde combinatie van planten de voorkeur; een combinatie met als mannelijke steriele somatische hybrideplant als ouderplant kool-radijs-MS-2 en een plant behorend tot Brassica oleracea als onderwerp van terugkruisen, een combinatie waarin genoemde mannelijke steriele somatische hybrideplant Hakuran MS-1 is en een plant ais onderwerp van 40 terugkruising is diegene behorend tot Brassica napus, een combinatie waarin gezegde mannelijke steriele somatische hybrideplant Hakuran MS-2 is en een plant als onderwerp terugkruising is diegene behorend tot Brassica oleracea, en een combinatie waarin gezegde mannelijke steriele somatische hybrideplant Hakuran MS-3 is en een plant als onderwerp van terugkruising is diegene behorend tot Brassica campestris.

Hieronder volgt een korte bespreking van de geciteerde stand van de techniek.

45 Thomas W. Walters en anderen (Protoplast fusion-derived Ogura male sterile cauliflower with cold tolerance, Plant Cell Reports, 1992, vol. 10, 624-628) beschrijven de planten verkregen door protoplasten met Ogura mannelijke steriliteit (Brassica oleracea L. ssp. boytrytis) te fuseren met vruchtbare B. oleracea cytoplasma’s. Hierdoor worden planten verkregen met een spectrum van organel en kern types. Planten met B. oleracea chloroplasten zijn tolerant voor de kou.

50 In de Britse octrooiaanvrage GB 2.211.205 worden Brassica oleracea planten beschreven die mitochondrion van het Ogura CMS (cytoplasmatische mannelijke steriliteit) cytoplasma en chloroplasten van normale vruchtbare Brassica oleracea bevatten. Tevens beschrijft deze aanvrage een werkwijze waarop deze planten verkregen kunnen worden.

De internationale octrooiaanvrage WO 92/05251 (PCT/FR91/00742) beschrijft de sequentie van het 55 Ogura steriliteit DNA. Als dit DNA aanwezig is in het cytoplasma van een van een plant veroorzaakt dit DNA mannelijke steriliteit in de genoemde plant.

Stephan A Yarrow en anderen (The transfer of "polima" cytoplasmic male sterility from oilseed rape 194904 6 (Brassica napus) to broccoli (B. oleracea) by protoplast fusion, Plant Cell Report, 1990, vol. 9, 185-188) beschrijven een protoplastenfusie voor de overdracht van het Polima type cytoplasmatische mannelijke steriliteit van Brassica napus, koolzaad variëteit Polima Karat naar Brassica oleracea, broccoli, variëteit "Green Cornet".

5 S.A.Yarrow en anderen (Transfer of cytoplasmic male sterility systems from canola (Brassica napus) to broccoli and cauliflower (B. oleracea) by protoplast fusion, Abstract Vllth international congress on plant tissue and cell culture, 1990, bladzijde 223, samenvatting A8-77) beschrijven de vorming van de volgende cybrides (cytoplasmatische hybrides):-de overdracht vanhet-OguraCMS chondrioom van een Ogura koolzaadlijn naar broccoli met behoud van het B. oleracea plastoom en de overdracht van het Polima CMS 10 type cytoplasma van een Polima koolzaadlijn naar broccoli en bloemkool.

M.M.C. Tan en anderen (Efficient recovery of cold tolerant and cytoplasmic male sterility somatic cybrids in Brassica oleraceae by cell sorting, Abstracts Vllth international congress on plant tissue and ceil culture, 1990, bladzijde 222, samenvatting A8-72) beschrijven somatische cybriden verkregen door de fusie van röntgen-bestraalde hypocotiel protoplasten van B. oleracea die Ogura mannelijk steriel cytoplasma bevatten 15 met blad mesofiel protoplasten van elite lijnen van broccoli als ontvanger.

P.S Jourdan en anderen (Synthesis of male sterile, triazine-resistent Brassica napus by somatic hybridization between cytoplasmic male sterile B. oleracea and atrazine-resistent B. campestris. Theor.

Appl. Genet., 1989, vol. 78, 445-455) beschrijven een protoplastenfusie tussen blad protoplasten van Brassica oleracea variëteit botrytis die Ogura mannelijk steriel cytoplasma bevatten met hypocotiel 20 protoplasten van B. campestris variëteit oleifera die atrazine resistent cytoplasma bezitten.

Takako Sakai en Jun Imamura (Alteration of mitochondrial geneomes containing atpA genes in the sexual progeny of cybrids between Raphanus sativus cms line and Brassica napus cv. Westar, Theor. Appl. Genet., 1992, vol. 84, 923-929) hebben het lot onderzocht van mitochondriale genomen van cybriden die afgeleid zijn van een protoplast fusie tussen röntgen-bestraalde Raphanus sativus (cms lijn) en 25 iodoecetamide-behandelde Brassica napus cv. Westar.

-----Barsby^n anderen (The transfer-oTeytoplasmic-male sterility-to-winter-type oilseed rape (Brassica napus L.) by protoplast fusion, Plant Science, 1987, vol. 53,243-248) beschrijven de overdracht van "Polima” cytoplasmatische mannelijke steriliteit via protoplastenfusie van lentelijnen naar winterlijnen van koolzaad.

De geregenereerde planten behielden hun wintergedrag en de bestudeerde kenmerken waren stabiel over 30 meerdere generaties.

T. Sakai en J. Imamura (Intergeneric transfer of cytoplasmic male sterility between Raphanus sativus (cms line) eind Brassica napus through cytoplast-protoplast fusion, 1990, Theor. Appl. Genet., vol. 80, 421-427) beschrijven de fusie tussen hypocotiel protoplasten van Raphanus sativus (cms lijn) met protoplasten van Brassica napus.

35 Morgan en Maliga (Rapid chloroplast segregation and recombination of mitochondrial DNA in Brassica cybrids, Mol. Gen. Genet, 1987, vol. 209, 240-246) tonen aan dat na een protoplasten fusie tussen vruchtbare protoplasten die origineel B. napus cytoplasma bevatten en steriele protoplasten die Ogura Raphanus sativus cytoplasma bevatten, de chloroplasten afgeleid waren van de vruchtbare ouder en dat er recombinatie optreedt in het mitochondriaal DNA.

40 Menczel en anderen (Fusion-mediated combination of Ogura-type cytoplasmic male sterility with Brassica napus plastids using X-irradiated CMS protoplasts, Plant Cell Reports, 1987, vol. 6, 98-101) beschrijven een protoplasten fusie tussen protoplasten van een Brassica napus lijn die het Ogura Raphanus sativus mannelijk steriel cytoplasma bevatten met protoplasten van de mannelijk vruchtbare B. napus variëteit Olga.

De Europese octrooiaanvrage 87306693.0 beschrijft een werkwijze voor de fusie van protoplasten 45 afgeleid van haploid Brassica weefsel.

De internationale octrooiaanvrage WO 87/01726 (PCT/GB86/00565) beschrijft een werkwijze voor het verkrijgen van een Brassica protoplast fusie product.

De Japanse octrooiaanvrage 01218530 beschrijft een werkwijze voor de verkrijging van een cytoplasmatische hybride plant die cytoplasmatische mannelijke steriliteit bezit.

50 De Japanse octrooiaanvrage 02603426 beschrijft een werkwijze voor de bereiding van een hybride planten door cytoplasma van Raphanus sativus niger te hybridiseren met protoplasten van Brassica variëteiten.

VOORBEELDEN

55 Hieronder wordt de onderhavige uitvinding in meer detail beschreven via de verwijzing naar voorbeelden. Echter, de technische omvang van de onderhavige uitvinding mag in geen geval restrictief geïnterpreteerd worden vanwege gezegde voorbeelden.

7 194904

Voorbeeld 1 (A) Productie van een mannelijke steriele fusieplant van het genus Brassica 1) Isolatie van protoplasten die cytoplasma’s bezitten die mannelijke steriliteit overbrengen.

5 Een Japanse radijs met mannelijk steriel cytoplasma (Ogura) of een kemgesubstitueerde Chinese kool voorzien van genoemde cytoplasma (Ogura) werden aseptisch bewaard en gekweekt in een kweekfles voor ____ongeveer 1 maand, gevolgd door het snijden van bladeren van de gekweekte planten. De gesneden bladeren werden behandeld met een enzymoplossing die 0,1% Pectylase Y-23, 2% Cellulase Onozuka R-10 en 0,5 M mannitol bevatte bij 28°C gedurende 2 uur. Vervolgens werden de protoplasten gezuiverd en 10 geprepareerd onder gebruikmaking van gezegde enzymoplossing volgens een gebruikelijke methode [Nagata, T. en Takebe, I.; Planta, vol. 99, blz. 12 (1971)].

Met betrekking tot bovenstaande mannelijke steriele kern gesubstitueerde Chinese kool, werden protoplasten UV bestraald gedurende 120 tot 180 sec. onder gebruikmaking van een UV lamp en op een schone tafel na zuivering en daarna onderworpen aan het volgende protoplast fusieproces.

15 Met betrekking tot een Japanse radijs, werden de gezuiverde protoplasten als bovengenoemd direct onderworpen aan protoplastfusie.

2) Bereiding van protoplasten van een plant van genus Brassica waarin de mannelijke steriele kenmerken worden overgebracht.

Een blad was verzameld van een aseptische zaailing van een kool (F1 variëteit ’’Kinshi 201” of de 20 ouderlijn daarvan ”F”), waaruit protoplasten werden geprepareerd volgens de bovenstaande protoplast bereidingsmethode. Volgens een dergelijke bereidingsmethode gezuiverde en geïsoleerde protoplasten werden behandeld door ze onder te dompelen in 7,5 mm acetamide gedurende 15 min., te centrifugeren bij 800 toeren per mln. gedurende 3 min. om protoplasten te oogsten en dan te wassen met een W5 oplossing om de gewenste protoplasten te bereiden.

25 3) Protoplastfusie.

~ De protoplasten van een Japansë radijs met man nel ijk^tëriëlë^ytöplasma’s (Ogura)~vërkregen in bovenstaande 1) en de jodoaceetamide behandelde kool protoplasten verkregen In bovenstaande 2) werden respectievelijk behandeld om een concentratie van 1 x 10® cellen/ml te verkrijgen. Na het mixen van 1 ml porties van de respectievelijke protoplasten, werd 3 ml van een 33%-ige polyethyleenglycol (hierna afgekort 30 tot PEG) oplossing toegevoegd en werd gemengd.

Daarna werd een 0,1 M calciumchloride oplossing aan gezegd mengsel toegevoegd, gevolgd door fusie bij kamertemperatuur. Vervolgens werd het supernatant verwijderd, en de gefuseerde cellen werden gewassen met een CPW oplossing [Freason et al.; Dev. Biol. Vol. 33, blz. 130-137 (1973)] en onderworpen aan kweek.

35 In het geval dat de UV bestraalde protoplasten van de kem gesubstitueerde Chinese kool voorzien van mannelijke steriele cytoplasma’s (Ogura) verkregen in bovenstaande 1) en de koolprotoplasten verkregen in bovenstaande 2) werden gefuseerd, werden beide protoplasten respectievelijk gebracht op een concentratie van 1 x 10® cel/ml op de wijze als boven beschreven, en werden de bovenstaande protoplasten in gelijke hoeveelheden gemixed. De celfusie werd elektrisch uitgevoerd gebruikmakend van een model 301 van BTX, 40 Ine. waarbij 30 v/cm van een alternerende stroom werd toegepast op de gemengde cellen gedurende 30 sec. gevolgd door toepassen van 1400 v/cm van directe stroom op gezegde cellen voor 20 ps.

4) Kweek van een gefuseerde protoplast en regeneratie van een plant

Na de bovenstaande fusiebehandeling onder gebruikmaking van een PEG oplossing of door middel van elektrische pulsen, werd de gefuseerde protoplast gekweekt op callus ondersteunend medium [een 45 gemodificeerd MS medium dat 0,3 m mannitol, 0,5 mg/1 2,4-dichlorofenoxyazijnzuur (hierna afgekort tot 2,4-D), 0,35 mg/1 naftaleenazijnzuur (hierna afgekort tot NAA) en 0,5 mg/1 benzylaminopurine (hierna afgekort tot BAP) bevat, gevolgd door toevoegen van een medium met dezelfde samenstelling behalve dat zijn 0,2 molair mannitol bevat op de tiende dag na het begin van de kweek. Na nog 10 dagen werden de kolonies overgebracht naar een 100 ml flacon waarin een vergelijkbaar samengesteld mannitol vrij medium 50 was gebracht en dan geroteerd voor kweek bij 2 touren per minuut. Na 7 dagen van een dergelijke rotatiekweek, werden calli gegroeid tot 1 tot 2 mm lengte in een subcultuur gebracht op regeneratiemedia [MS media bevattende 1 mg/1 benzyladenine (BA)] om de inductie van onvoorziene knoppen te bevorderen. Op deze wijze verkregen onvoorziene knoppen werden overgebracht naar BAP-vrij MS media. Na wortelschièten werden de plantjes gekweekt door ze te acclimatiseren aan de omgeving buiten volgens een 55 gebruikelijke methode. Na bloeien werden de condities van stuifmeelproductie van de plantjes visueel geëvalueerd om mannelijke steriele individuen te selecteren.

5) Selectie van een mannelijke steriele p]ant.

194904 8

Met betrekking tot de aanwezigheid van mannelijke steriliteit, werden de bloeiende planten in het bovengenoemde 4) één voor één onderzocht.

Als resultaat van de protoplastfusie van een Japanse radijs voorzien van mannelijk steriel cytoplasms (Ogura) met een kool, werd verkregen een mannelijke steriele plant dragende het gemengde kariotype van 5 een kool en een Japanse radijs (hierna gerefereerd als kool MS-1)en een mannelijke steriele plant die het kariotype van alleen een kool droeg (hieronder gerefereerd als kool MS-2), welke beide goed ontwikkelde nectariën bezaten en niet het vergelen van bladkleur vertoonden (chlorosis) bij lage temperaturen.

Zaden van bovengenoemde kool MS-2 zijn gedeponeerd bij het ATCC als "Cabbage Cybrid CMS-2" met het accessienr. ATCC 75488.

10 Als resultaat van de protoplastfusie van een kem gesubstitueerde Chinese kool voorzien van mannelijk steriele cytoplasma’s (Ogura) met een kool, werden hakuran type mannelijke steriele planten, die respectievelijk 32, 44 en 43 chromosomen bezaten die alle goed ontwikkelde nectariën bezaten en niet het vergelen van bladkleur bij lagere temperatuur vertoonden verkregen. Hierna wordt aan deze planten gerefereerd als Hakuran MS-1, Hakuran MS-2 en Hakuran MS-3 respectievelijk.

15 Zaden van de bovengenoemde Hakuran MS-3 zijn gedeponeerd in het ATCC als "Hakuran Cybrid CMS-3" met het-accessienr. ATCC 75489.

(B) Analyses met de PCR techniek en de RFLP techniek.

Gebruikmakend van vier soorten nieuwe mannelijke steriele lijnen als testvariëteiten, te weten een mannelijk 20 steriele variëteit kool MS-2 verkregen door de protoplastfusie van een Japanse radijs voorzien van mannelijke steriel cytoplasma (Ogura) met een kool en mannelijke steriele variëteiten (Hakuran MS-1, Hakuran MS-2 en Hakuran MS-3) verkregen door de protoplastfusie van een kern gesubstitueerde Chinese kool voorzien van mannelijke steriele cytoplasma’s (Ogura)en een kool; een Japanse radijs voorzien van (Ogura) cytoplasma’s als bron van gebruikelijke mannelijke steriele cellen; en een vertiele kool gebruikt voor 25 celfusie (F1 variëteit, Kinshi 201), werden de analyses van mitochondrialen DNA’s en chloroplast ONA’s uitgevoerd volgens de volgende PCR techniek en RFLP techniek.

1) PCR techniek

Uit bladeren op de 40®te tot de 50®*® dag na zaaien werd chloroplast DNA (hierna afgekort tot cpDNA) en mitochondriaal DNA hierna afgekort tot mtDNA) volgens de Kemble (1987) methode geëxtraheerd en 30 onderworpen aan PCR-analyse.

PCR-primers werden zodanig bereid dat specifieke plaatsen op mtDNA’s van een Japanse radijs voorzien van mannelijke steriele cytoplasma’s (Ogura), een gewone mannelijke vertiele Japanse radijs, een mannelijke steriele koolzaad voorzien van S type cytoplasma die reeds beschreven zijn (Thompson, 1972; Shiga, T. en Baba, S., 1973) en een mannelijke steriele koolzaad voorzien van Polima-type cytoplasma’s 35 [Fu, T.D.; Cruciferae News Letter, vol. 6, blz. 6-7 (1981)] zouden kunnen worden geamplificeerd.

Dat wil zeggen dat primers waarvan elk zo was gekozen dat zij de regio beginnend bij het promotordeel 300-bp stroomopwaarts van de transcriptie initiatieplaats van DNA coderend voor ATPase subunit 6 in bovengenoemd mtDNA zou kunnen amplificeren [Kadowaki, K. et al.; Mol. Gen. Gent., vol. 224, blz. 10-16 (1990)] (hierna afgekort tot atp 6) tot aan de helft (-1) of het geheel (-2) van het structurele gen (hierna 40 afgekort tot ORF) werden gesynthetiseerd. De basevolgorde van de respectievelijke primers A tot F zijn A (sequentie nr. 1), B (sequentie nr. 2), C (sequentie nr. 3), D (sequentie nr. 4), E (sequentie nr. 5) en F (sequentie nr. 6). De combinaties en de te amplificeren onderwerpen van deze primers zijn de volgende: A + B:Og-1A + C:Og-2 D+B:P-1D + C:P-2 45 E + B:N-1 E + C:N-2 F+B: R-1F + C: R-2

Overigens, tussen de bovengenoemde primers, werd de verwantschap tussen Og en R (Ogura en een Japanse radijs) ontworpen volgens "Christopher A Makaroff, Ingrid J. Ape en Jeffrey D. Palmer; The Journal of Biological Chemistry, vol. 264, blz. 11706-11713 (1989)".

50 De verwantschap tussen N en P (Napus en Polima) werd ontworpen volgens "Mahipal Singh en Gregory G. Brown, the Plant Cell, vol. 3, blz. 1349-1362 (1991).

De amplificatie werd uitgevoerd door gezegde primers als PCR primers toe te passen en mtDNA’s van de bovengenoemde verschillende mannelijke steriele gefuseerde cellen als templates (sjabloon) te gebruiken en een hittecyclus te herhalen van 94°C (1 min.), 55°C (1 min.) en 72°C (2 min.) voor 30 keer.

55 De verkregen PCR amplificatieproducten werden middels agarose elektroforese geanalyseerd.

Met betrekking tot chloroplast (cp) DNA’s, werd de analyse uitgevoerd gebruikmakend van sondes bereid door het digereren van chloroplast DNA’s van Brassica napus met een restrictie-enzym EcoRI en integratie 9 194904 van de digesten in Blue Script plasmiden.

De resultaten van deze analyses zijn gegeven in tabel 1.

TABEL 1 5 - PCR-analyse in cpDNA’s en mtDNA’s van de verschillende mannelijke steriele gefuseerde cellen

Mannelijke steriele Gebied van amplificatie door PCR plant 10 P-1 Og-1 Og-2 N-1 N-2 R-1 R-2 cp: ++++ ++++ +++ +++ - -

Hakuran MS-1 mt: ++++ ++++ - cp: - - ++++ ++++ +++ ++ -

Hakuran MS-2 mt: + - ++++ ++++ +++ - - 15 cp: ++++ +++ + + - - -

HakuranMS-3 mt: ++++ ++++ - - - - - cp: - - ++++ ++++ + + -

Kool MS-2 mt: + - ++++ ++++ +++ ++ - cp: + - ++++ ++++ ++ - - 20 Kool mt: ++ + ++++ ++++ ++ + - cp: ++++ + -----

Ogura CMS mt: ++++ ++++ - - - - - 25 In tabel 1 wordt met + de mate van aanwezigheid van PCR product aangegeven in die zin dat de kwantiteit van verkregen PCR product groter wordfairhet aantal^lüSjeTtöenWmtrAah-dè~andere“kant betekent -dat geen PCR product werd verkregen. Verder betekent cp dat een chloroplast DNA als template werd gebruikt. De gebieden van amplificatie met verschillende PCR’s zijn weergegeven in tabel 1.

Uit deze resultaten werd het duidelijk dat in het geval van het Hakuran MS-1 cytoplasma een nieuw PCR 30 product kon worden verkregen wanneer het gebied van amplificatie door PCR was vastgelegd voor N-1 en N-2 voor het cpDNA, wanneer vergeleken met het (Ogura) mannelijk steriele cytoplasma zoals dat in de natuur bestaat

Additioneel vormde het Hakuran MS-2 cytoplasma PCR producten met N-1 en N-2 voor zowel het cpDNA en het mtDNA als vergeleken met het (Ogura) mannelijk steriele cytoplasma bestaand in de natuur. 35 Aan de andere kant, vormde het Hakuran MS-3 cytoplasma PCR producten met N-1 en N-2 voor cpDNA alleen, vergeleken met het (Ogura) mannelijk steriele cytoplasma bestaand in de natuur.

En, het kool MS-2 cytoplasma, hetzelfde als voorgenoemde MS-2, vormde PCR producten met N-1 en N-2 voor zowel het cpDNA als het mtDNA.

2) RFLP techniek 40 Uit de mesofylen van de mannelijke steriele kolen MS-1 en MS-2 verkregen door een protoplastfusie en de mannelijke steriele Hakuran MS-1, MS-2 en MS-3 verkregen met de protoplast fusie werden volgens de Kemble (1978) methode mpDNA’s geëxtraheerd en vervolgens gedigesteerd met restrictie enzymen BamHI en Hindlll. Gezegde DNA-fragmenten werden geëlektroforeerd op 1% agarose en vervolgens onderworpen aan Southern hybridisatie volgens het Genius systeem (geproduceerd door Boehringer Mannheim Co.). Als 45 sondes werden DNA fragmenten coderend voor ATPase subunit a in het mtDNA van een rijstplant [Kadowaki, K. et al.; Nucleic Adds Res., vol. 17, no. 5 (1990)] (hierna afgekort tot cox-l) gebruikt.

Ook met betrekking tot het chloroplast DNA, werden cpDNA's geëxtraheerd volgens de bovengenoemde Kemble (1987) methode en gedigereerd met Hindlll en EcoRI. Daarna werd de Southern hybridisatie uitgevoerd gebruikmakend van cpDNA probes (sondes) van het genus Brassica (figuren 2-7).

50 De resultaten van deze RFLP worden in tabel 2 weergegeven.

TABEL 2

Resultaten van RFLP techniek in mtDNA’s en cpDNA’s van mannelijke steriele planten.

55 --

Naam van de lijn atp A atp 6 cox I cpDNA (a) 194904 10 TABEL 2 (vervolg)

Resultaten van RFLP techniek in mtDNA’s en cpDNA's van mannelijke steriele planten.

5 Bam Eco Hind Bam Eco Bam Eco Eco Hind

Kool radijs MS-1 Og Og Og Og * Og Og Cab Cab

Kool radijs MS-2 Og Og Og Cab * Og Cab Cab Cab

Hakuran MS-1 Og Ree Ree Og * Og Og Cab Cab

Hakuran MS-2 Ree Cab Ree Cab * Og Cab Cab Cab 10 Hakuran MS-3 Og Og ND Og * Og Og Ree Ree

In tabel 2 betekent een dat geen polymorfisme kon worden waargenomen, betekent ”a” een chloroplast probe, betekent ”Og” een Ogura type, betekent ”Cab" een kooltype, "ree” een gerecombineerd type en 15 betekent "ND” niet bepaald.

Als resultaat met betrekking tot kool MS-1 (weergegeven in tabel 2 als kool radijs MS-1), werd gevonden dat haar cpDNA was veranderd in dat van het kooltype, als vergeleken met het bestaande mannelijke steriele (Ogura) cytoplasma.

Met betrekking tot kool MS-2 (weergegeven in tabel 2 als kool radijs MS-2), atp 6 en cox I in het mtDNA 20 daarvan waren veranderd in die behorend bij het kooltype en additioneel was het cpDNA eveneens veranderd in dat van het kooltype.

Met betrekking tot Hakuran MS-1 werd gevonden dat een nieuwe band werd gevormd en dat recombina-tie van genen toe te schrijven is aan de protoplastfusie optrad in ATP-A in het mtDNA.

Met betrekking tot Hakuran MS-2 werd een nieuwe band gevormd, toe te schrijven aan recombinatie 25 gevormd in ATP-A in het mtDNA, vergelijkbaar met het Hakuran MS-1.

Met betrekking tot Hakuran MS-3 werd geen verschil gevonden in mtDNA tussen gezegd Hakuran MS-3 en het bestaande mannelijke steriele (Ogura) cytoplasma, vergelijkbaar met de resultaten van de bovengenoemde PCR techniek. In het cpDNA echter werd het duidelijk dat een een nieuwe band werd gevormd en dat dus recombinatie plaatsvond.

30 Als beschreven in bovenstaande 1) en 2), werd het duidelijk dat de combinatie van de PCR techniek met de RFLP techniek gebruikmakend van een mtDNA en een cpDNA in een cytoplasma als indexen het mogelijk maakt om de definitieve indicatie van het verschil van het betrokken mannelijke steriele cytoplasma van de bestaande mannelijke steriele cytoplasma’s en tegelijkertijd classificatie en karakterisatie van individuele cytoplasma's mogelijk maakt.

35

Voorbeeld 2

Productie van de gewenste mannelijke steriele plant volgens terugkruisen.

Onder een somatische hybridecel van het genus Brassica die nieuwe mannelijke steriele cytoplasma's hadden verkregen volgens voorbeeld 1, werd kool MS-2 geacht in staat te zijn om te worden gehybridiseerd 40 met een groep van conspecifieke oogst variëteiten omdat haar karyotype hetzelfde was als dat van Brassica oleracea.

Echter, vergeleken met het normale chromosoom aantal van een plant van de soort oleracea had de gezegde plant een toegenomen chromosoom aantal als gevolg van de protoplastfusie.

Daarom werd de ovule kweekmethode tezamen geadopteerd met het terugkruisen met het doel om 45 efficiënt nakomelingschap te verkrijgen. Dat wil zeggen na gezegde terugkruising werden twee weken oude onvolwassen zaden aseptisch verzameld en vervolgens gekweekt door ze op MS media te plaatsen met een gehalveerde concentratie bevattende 5% glucose en 1 g/l Casamino zuur, zodat nakomelingschap verkregen werd. Door de gezamenlijke adoptie van gezegde ovule kweekmethode, werd kool MS-2 meerdere malen teruggekrulst met pure lijnen van een kool, een broccoli, een bloemkool, een decoratieve 50 boerenkool, een boerenkool, een kairan, spinazie een koolrabie behorend tot de soort oleracia vergelijkbaar met de kool MS-2, maar door moederplantlijn gekweekt werd van het genus Brassica die een hoog zuivere kem van Brassica oleracea droeg met een nieuw mannelijk steriel cytoplasma van kool MS-2.

Overigens, hoewel zo'n plant dichter komt bij de pure lijn variëteiten onderworpen aan de hybridisatie naarmate de frequentie van gezegde terugkruising toeneemt, werd dat concreet bepaald volgens de RAPD 55 methode [Williams, J.G. et al.; Nucleic Acid Res., vol. 18, blz. 6531-6535 (1991)]. Met betrekking tot het kem DNA van het nakomelingschap verkregen met gezegde terugkruising werd het verschil tussen beide getest volgens de RAPD methode gebruikmakend van een commercieel verkrijgbare primer kit geprodu- i i

Claims

11 194904 ceerd door Operon, Ine. (1000 Atlantic Ave., suite 108, Alameda, CA., USA). Als een resultaat daarvan werd gevonden dat het nodig was om gezegde terugkruising ongeveer 7 keer uit te voeren. Op dit moment werd, om te bepalen dat de mannelijke steriliteit bewaard bleef omdat een mannelijk steriel cytoplasma wordt overgedragen van alleen de moederplant, een deel van gezegde planten die kool 5 MS-2 mannelijke steriele cytoplasma’s bezaten geïsoleerd vlak voor de bloei om ook te bevestigen dat zaden van zelf-bevruchting nakomelingschappen niet kon worden verkregen. Wanneer een nieuw mannelijk steriel cytoplasma Hakuran MS-1 als moederplant genomen werd, werden synthetische koolzaadplanten voorzien van kernen van zowel Brassica oleracea als Brassica cam pestris kunstmatig geproduceerd volgens de voorgenoemde ovule kweekmethode en werden die van Brassica 10 campestris gebruikt voor terugkruising. In geval dat hakuran MS-2 als een moederplant genomen werd, werden een broccoli, een bloemkool en een kool behorend tot Brassica oleracea; een Chinese kool, een knol en zatsuna behorend tot Brassica campestris; en een bladmosterd behorend tot Brassica juncea teruggekruist. In het geval dat Hakuran MS-3 als moederplant genomen werd, werden een Chinese kool, zatsuna en kukidachina behorend tot Brassica campestris teruggekruist. In ieder geval werd de ovule 15 kweekmethode gezamenlijk toegepast op de eerste generatie of de eerste tot de tweede generaties om nakomelingschapperi te verkrijgen in de gezegde terugkruising. Met betrekking tot de frequentie van de terugkruising, het verschil in kern DNA tussen elke zuivere lijnvariêteit gebruikt voor gezegde terugkruising en elk nakomelingenschap dat werd verkregen werd getest volgens de RAPD methode, vergelijkbaar als beschreven voor kool MS-2. 20 Hieruit bleek dat in elk geval terugkruising bij voorkeur ongeveer 7 keer moest gebeuren. Additioneel, met betrekking tot mannelijke steriliteit in nakomelingschappen, werd het niet alleen gezien dat er geen stuifmeel werd geproduceerd maar werd ook bevestigd dat zaden van zelf bevruchte nakomelingschappen niet werden verkregen wanneer een deel van de moederplanten werd geïsoleerd. 25 KORTE BESCHRIJVING VAN DE FIGUREN Figuur 1 laat de oorsprong van elke PCR primer (sonde) zien. ‘ ~ Figuur 2 is een elektroforesepatroon (1) die de resultaten van RFLP in mitochondriale DNA’s van mannelijke steriele lijnen verkregen door protoplastfusie laat zien (sonde atp A). Figuur 3 Is een elektroforesepatroon (2) dat de resultaten van RFLP in mitochondriale DNA’s van 30 mannelijke steriele lijnen verkregen door protoplastfusie laat zien (sonde atp 6). Figuur 4 is een elektroforesepatroon dat de resultaten van RFLP in chloroplast DNA’s van mannelijke steriele lijnen verkregen door protoplastfusie laat zien (sonde, EcoRI fragment van een chloroplast DNA). Figuur 5 is een elektroforesepatroon (3) dat de resultaten van RFLP in mitochondriale DNA’s van mannelijke steriele lijnen verkregen door protoplastfusie laat zien [sonde, cox I (+ atp A)]. 35 Figuur 6 is een elektroforesepatroon (4) dat de resultaten van RFLP in mitochondriale DNA’s van mannelijke steriele lijnen verkregen door protoplastfusie laat zien [sonde, cox I (+ atp A)]. Figuur 7 is een elektroforesepatroon (5) dat de resultaten van RFLP in mitochondriale DNA’s van mannelijke steriele lijnen verkregen door protoplastfusie laat zien (sonde, atp A). 40

1. Mannelijke steriele plant van het geslacht Brassica omvattende een veelvoud aan cellen met elk een veelvoud aan mitochondriên en een veelvoud aan chloroplasten met het kenmerk dat deze verder 45 mitochondriaal DNA in elke mitochondrion omvat welk DNA toont een eerste restrictie fragment lengte polymorfisme (RFLP) als geanalyseerd met BamHI als een restrictieenzym en atpA als probe die identiek is aan een corresponderende identiek geanalyseerde RFLP van mitochondriaal DNA in Ogura cytoplasma, een tweède RFLP als geanalyseerd met EcoRI als een restrictieenzym en atpA als probe die identiek is 50 aan een corresponderende identiek geanalyseerde RFLP van het Ogura mitochondriaal DNA, een derde RFLP als geanalyseerd met Hindlll als een restrictieenzym en atp6 als probe die identiek is aan een corresponderende identiek geanalyseerde RFLP van het Ogura mitochondriaal DNA, een vierde RFLP als geanalyseerd met BamHI als een restrictieenzym en atpA als probe die identiek is aan een corresponderende identiek geanalyseerde RFLP van mitochondriaal DNA in kool, 55 een vijfde RFLP als geanalyseerd met BamHI als een restrictieenzym en coxl als probe die identiek is aan een corresponderende identiek geanalyseerde RFLP van het Ogura mitochondriaal DNA, en een zesde RFLP als geanalyseerd met EcoRI als een restrictieenzym en coxl als probe die identiek is 194904 12 aan een corresponderende identiek geanalyseerde RFLP van het kool mitochondriaal DNA; en chloroplast DNA in elk chloroplast welke toont: een zevende RFLP als geanalyseerd met EcoRI als een restrictieenzym en cpDNA(a) als probe die identiek is aan een corresponderende identiek geanalyseerde RFLP van het chloroplast DNA in kool, en 5 een achtste RFLP als geanalyseerd met Hindlll als een restrictieenzym en cpDNA(a) als probe die identiek is aan een corresponderende identiek geanalyseerde RFLP van het chloroplast DNA in kool.

2. Mannelijke steriele plant van het geslacht Brassica omvattende een veelvoud aan cellen met elk een veelvoud aan mitochondriën en een veelvoud aan chloroplasten met het kenmerk dat deze verder mitochondriaal DNA in elke mitochondrion omvat welk DNA toont: 10 een eerste restrictie fragment lengte polymorfisme (RFLP) als geanalyseerd met BamHI als een restrictieenzym en atpA als probe omvattende een eerste groot fragment (3.7 kb) van een corresponderende identiek geanalyseerde RFLP van het mitochondriaal DNA in Ogura cytoplasma en een tweede groot fragment (4.1 kbp) van een corresponderende identiek geanalyseerde RFLP van mitochondriaal DNA in kool, 15 een tweede RFLP als geanalyseerd met EcoRI als een restrictieenzym en atpA als probe die identiek is aan een corresponderende identiek geanalyseerde RFLP van het mitochondriaal DNA van kool, een derde RFLP als geanalyseerd met Hindlll als een restrictieenzym en atpA als probe omvattende een derde groot fragment (6.6 kbp) die verschillend is van zowel een corresponderende identiek geanalyseerde RFLP van Ogura mitochondriaal DNA en een corresponderende identiek geanalyseerd RFLP van 20 het mitochondriaal DNA van kool, een vierde RFLP als geanalyseerd met BamHI als een restrictieenzym en atp6 als probe die identiek is aan een corresponderende identiek geanalyseerde RFLP van mitochondriaal DNA in kool, een vijfde RFLP als geanalyseerd met BamHI als een restrictieenzym en coxl ais probe die identiek is aan een corresponderende identiek geanalyseerde RFLP van het Ogura mitochondriaal DNA, en 25 een zesde RFLP als geanalyseerd met EcoRI als een restrictieenzym en coxl als probe die identiek is -aan een corresponderendeidentiekgeanalyseerdeRFLP vein het kool mitochondriaal DNA; en chloroplast DNA in elke chloroplast welke toont. een zevende RFLP als geanalyseerd met EcoRI als een restrictieenzym en cpDNA(a) als probe die identiek is aan een corresponderende identiek geanalyseerde RFLP van het chloroplast DNA in kool, en 30 een achtste RFLP als geanalyseerd met Hindlll als een restrictieenzym en cpDNA(a) als probe die identiek is aan een corresponderende identiek geanalyseerde RFLP van het chloroplast DNA in kool.

3. Mannelijke steriele plant van het geslacht Brassica omvattende een veelvoud aan cellen met elk een veelvoud aan mitochondriën en een veelvoud aan chloroplasten met het kenmerk dat deze verder mitochondriaal DNA in elke mitochondrion omvat welk DNA toont 35 een eerste restrictie fragment lengte polymorfisme (RFLP) als geanalyseerd met BamHI als een restrictieenzym en atpA als probe die identiek is aan een corresponderende identiek geanalyseerde RFLP van mitochondriaal DNA in Ogura cytoplasma, een tweede RFLP als geanalyseerd met EcoRI als een restrictieenzym en atpA als probe die identiek is aan een corresponderende identiek geanalyseerde RFLP van Ogura mitochondriaal DNA, 40 een derde RFLP als geanalyseerd met Hindlll als een restrictieenzym en atpA als probe die identiek is aan een corresponderende identiek geanalyseerde RFLP van het Ogura mitochondriaal DNA; een vierde RFLP als geanalyseerd met BamHI als restrictieenzym en atp6 als probe die identiek is aan een corresponderende identiek geanalyseerde RFLP van Ogura mitochondriaal DNA, een vijfde RFLP als geanalyseerd met BamHI als een restrictieenzym en coxl als probe die identiek is 45 aan een corresponderende identiek geanalyseerde RFLP van het Ogura mitochondriaal DNA, en een zesde RFLP als geanalyseerd met EcoRI als een restrictieenzym en coxl als probe die identiek is aan een corresponderende identiek geanalyseerde RFLP van het Ogura mitochondriaal DNA; en chloroplast DNA in elk chloroplast welke toont: een zevende RFLP als geanalyseerd met EcoRI als een restrictieenzym en cpDNA(a) als probe 50 omvattende een eerste groot fragment (1.95 kpb) die verschillend is van zowel een corresponderende identiek geanalyseerde RFLP van het chloroplast DNA in Ogura cytoplasma en een corresponderende identiek geanalyseerde RFLP van het chloroplast DNA in kool, en een achtste RFLP als geanalyseerd met Hindi I als een restrictieenzym en cpDNA(a) als probe omvat- 13 194904 tende een tweede groot fragment (1.95 kbp) die verschillend is van zowel corresponderende identiek geanalyseerde RFLP van het chloroplast DNA in Ogura cytoplasma en een corresponderende identiek geanalyseerde RFLP van het chloroplast DNA in kool. Hierbij 7 bladen tekening