NL8201321A

NL8201321A - Werkwijze voor de behandeling van metastase en de groei van tumorcellen.

Info

Publication number: NL8201321A
Application number: NL8201321A
Authority: NL
Original assignee: Bayer Ag
Priority date: 1981-04-07
Filing date: 1982-03-30
Publication date: 1982-11-01
Also published as: JPS57179163A; ES511209A0; BE892772A; AU551063B2; ES8404994A1; IL65423A; FR2502954B1; ZA822335B; IT1150790B; IT8220621A1; ES521457A0; IT8220621A0; EP0062319A1; GR75460B; PH18651A; AU8235382A; CA1265451A; ES8404995A1; IL65423A0; NZ200234A

Description

% , * t AANVRAAGSTER NOEMT ALS UITVINDERS: 1. Dr. Wolf-Dieter Busse, 2. Dr. Kenneth V. Honn, 3. Dr. Elke Möller, 4. Dr. Friedel Seuter

Werkwijze voor de behandeling van metastase en de groei van tumorcellen

Het primaire doel van een behandeling van kanker is de behandeling en volledige uitroeiing van de primaire tumor. Gelijktijdig met deze behandeling is de verhindering van de metastasering noodzakelijk, afzettingen van primaire tumorcellen en het daaropvolgende indringen in 5 het lymfesysteem of de bloedvaten ter overbrenging gedefinieerd kan worden. Een dergelijke uitbreiding kan door het aanhechten aan de endo-theelwanden en het daaropvolgend doordringen ervan, het zich neerzetten van secundaire tumoren in de perivasculaire weefsels en tenslotte verbreiding van de tumorcellen naar verwijderde plaatsen toe plaatshebben.

10 Hoewel over de klinische manifestaties van het metastase proces veel bekend is, weet men slechts weinig over de aan de metastase deelnemende biochemische, immunologische, genetische en hormonale mechanismen. In deze zin kan de metastase als een afzonderlijk verschijnsel beschouwd worden, die op een opeenvolging van gecompliceerde processen berust.

15 Vanwege de betekenis van zowel de behandeling van de groei van de primaire tumor alsook het voorkomen van de metastase hebben de onderzoekers van kanker omvangrijke onderzoekingen uitgevoerd om de met tu-morgroei en metastase verbonden wisselwerkingen op te helderen.

Een van de biologische eigenschappen, die tumorcellen schijnen te 20 bezitten, is het vermogen met de bloedplaatjes van de gastheer in wisselwerking te treden en zich daaraan te hechten en daardoor het vermogen van de tumor te versterken zich in het microvaatsysteem vast te zetten en aan het vasculaire endotheel te hechten. Als een andere mogelijkheid werd voorgesteld, dat de tumorcellen na het vastzetten ervan 25 de vorming van de deze cellen omgevende, als bescherming werkende plaatjes-tromben te kunnen oplossen. Opdat een succesvolle metastase kan plaatsvinden, moeten de metastasecellen eerst zich aan het vasculaire endotheel vastzetten en aldaar hechten en intravasculair blijven.· ^ ------" " tot het in het omgevende weefselJhinnendrlngt.

___3D- Vanwege de overeenkomsten tussen het aan het vastzetten en aanhechten van de tumorcellen aan het endotheel deelnemende proces en de vorming van niet-tumor-tromben hebben vele onderzoekers ertoe besloten, 8201321 » * ♦ 2 dat plaatsjes op een of andere wijze daarbij een rol spelen. Vanwege deze deelname werden met de plaatjes talrijke onderzoekingen uitgevoerd om de werking van een therapie door middel van anticoagulantia op de metastase te bepalen. De hierna geciteerde onderzoekingen omvatten de 5 toediening van anticoagulerende verbindingen, die krachtige remmers voor een plaatsaggregatie zijn. De resultaten spreken elkaar tot dusverre tegen.

Van heparine werd bericht, dat het de metastase zowel vermindert alsook verhoogt, in het bijzonder in de longen [zie Cell Biol.Inti.Rep. 10 _2, (1963) 81-86 en Arch. Surg. 91, (1965) 625-629]. Aspirine gaf gemengde resultaten [zie Eur.J.Cancer J3, (1972) 347-352 en Intl.J.Cancer 11, (1973) 704-718]. Voor Warfarin werd aangetoond, dat het aanzienlijke antimetastatische werkingen na intraveneuze injectie van tumorcellen en in spontaan metastaserende tumoren teweeg brengt [zie Cancer 35, 15 (1975) 5-14 en Cancer Res. ^37, (1971) 272-277]. Aangetoond werd^ dat een door intraveneuze toediening van B-16a-me!anoom-cellen teweeg gebrachte metastase door toediening van het anticoagulatiemiddel prosta-cycline verhinderd kan worden [zie Cell Biol. 87, (180) 649].

Een overzicht over de toepassing van anticoagulantia voor de tu-20 mor-therapie is te vinden bij M.B. Donati c.s., Malignancy and the Hemostatic System, bladzijden 103-120, Saven Press, 1981.

Het vermoeden werd geuit, dat het gebruik van de therapie door middel van anticoagulantia ten dele daarom minder dan tevreden stellend verlopen is, omdat het te toegepaste anticoagulatiemiddelen aan speci-25 ficiteit ontbreekt en omdat enkele van de middelen óp de tumorcellen zelfwerkingen teweeg brengen, die in totaal de gewenste werking op de bloedplaatjes en daarmee op de metastase kunnen opheffen.

Volgens de onderhavige uitvinding is de in het Amerikaanse oc-trooischrift 4.053.621 geopenbaarde en als therapeutisch werkzaam anti-30 trombotisch middel geoctrooieerde verbinding 3-methyl—>l-[2-(2-naftyl-oxy)-ethyl]-2-pyrazolin-5-on een krachtig antimetastatisch middel met begeleidende antineoplastische werkzaamheid gebleken.

De onderhavige uitvinding is op een therapeutische methode ter vermindering van de metastase en de neoplastische groei bij zoogdieren 35 gericht. Deze methode omvat de toediening van een therapeutisch werkzame hoeveelheid 3-methyl-l-[2-(2-naftyloxy)-ethyl]-2-pyrazolin-5-on aan de zoogdieren.

Zoals in het Amerikaanse octrooischrift 4.053.621 werd beschreven kan de bij de onderhavige uitvinding toegepaste methylpyrazolonverbin-40 ding (voorgesteld door formule 1) langs verschillende wegen bereid wor- 8201321 * $ 3 den, zoals hierna wordt toegelicht. Volgens de reactievergelijking met fig. 1 wordt 2-(2-naftyloxy),-ethylhydrazine met een aceetazijnzuurderi-vaat omgetzet; volgens de reactievergelijkijig met fig. 2 wordt 3-me-thylpyrazolinon-(3) met een 2-(2-naftyloxy)-ethyl-derivaat omgezet; 5 volgens de reactievergelijkinv met fig. 3 wordt 2-(2-naftyloxy)-ethyl-hydrazine met een tetrolzuur-derivaat omgezet.

Tot de toepasbare verdunningsmiddelen behoren alle inerte organische oplosmiddelen, eventueel met water verdund, bijvoorbeeld koolwaterstoffen zoals benzeen en tolueen, halogeenkoolwatetstoffen zoals di-10 chloormethaan, alcoholen, zoals methanol en ethanol en organische basen zoals pyridine en picoline.

Basische of zure condensatiemiddelen kunnen worden toegepast en de reactietemperatuur kan tussen 10°C nen 200°C gevarieerd worden. De verbinding kan op eenvoudige wijze door middel van gebruikelijke methoden 15 door hertkristalliseren uit een geschikt oplosmiddel gezuiverd worden.

In de onderhavige beschrijving betekent de uitdrukking "farmaceutisch onbezwaarlijk verdunningsmiddel of dragermateriaal" een niet-toxische stof, die na het mengen met de werkzame stof of met de werkzame stoffen deze in een voor de toediening geschikte vorm levert. De be-20 tekenis sluit bij voorkeur water en gebruikelijke bij de chemische synthese toegepaste organische oplosmiddelen met laag molecuulgewicht uit, behalve bij het aanwezig zijn van andere farmaceutisch vereiste bestanddelen zoals zouten in de juiste hoeveelheden, om een isotoon preparaat te bereiden, buffers, oppervlakactieve middelen, kleurstoffen en 25 smaakstoffen en conserveermiddelen. Voorbeelden van geschikte vaste en vloeibare verdunningsmiddelen en dragermaterialen zijn de volgende: water bevattende buffers, die door toevoeging van glucose of zouten isotoon gemaakt kunnen worden; niet-toxische organische oplosmiddelen zoals paraffine, plantaardige oliën, alcoholen, glycolen; gemalen natuur-30 lijke vesteenten (bijvoorbeeld kaollen, aluminiumoxide, talk of krijt); synthetische steenpoeders (bijvoorbeeld sterk dispers kiezelzuur of silicaten); en suiker.

De orale toediening kan onder toepassing van vaste en vloeibare verdunningsvormen zoals poeders, tabletten, dragees, capsules, granu-35 laat, suspensies, oplossingen en dergelijke worden uitgevoerd. Waar aangewezen kunnen de doseringseenheden voor de orale toediening gemier ocapsuleerd worden, om de afgifte te vertragen of over een langere tijd te verlangzamen, zoals bijvoorbeeld door het bekleden of inbedden van deeltjesvormig materiaal in polymeren, wassen of dergelijke.

40 De parenterale toediening kan onder toepassing van vloeibare dose- 8201321 t » 4 ringsvormen, zoals steriele oplossingen en suspensies plaatshebben die voor de subcutane, intramusculaire of intraveneuze injectie bestemd zijn. Deze worden door suspenderen of oplossen van een afgemeten hoeveelheid van de verbinding in een voor injectie geschikt, niet-toxisch 5 vloeibaar versnijdingsmiddel, zoals een water bevattend of olie bevattend milieu en sterilisatie van de suspensie of oplossing bereid. Stabilisatoren, conserveermiddelen en emulgatoren kunnen eveneens toegevoegd worden.

In het algemeen bedraagt de op het lichaamsgewicht betrokken dage-10 lijkse dosering voor de parenterale toediening 0,01 tot 50 mg/kg, bij voorkeur 0,1 tot 10 mg/kg en voor de orale toediening 0,1 tot 500 mg/kg.

Voor de bepaling van de antimetastatische en antineoplastische eigenschappen van 3-methyl-l-[2-(2-naftyloxy)-ethyl]-2-pyrazolin-5-on 15 werd de volgende methode toegepast. Het proefschema bedient zich van twee niet met elkaar in betrekking staande typen van muizen-tumoren (een melanoom een carcinoom), om zoveel mogelijk de mogelijkheid uit te schakelen, dat de verkregen resultaten "uniek" met betrekking tot het enige tumortype zijn. Deze beide tumoren worden als routine voor prin-20 cipiële onderzoekingen over het mechanisme van de metastase en de antineoplastische werking toegepast.

A. Het in vivo verkrijgen van de tumor-lijnen.

Subcutaan, amelanotisch B-16 -melanoom (B-16a) en Lewis-longen-carcinoom (3LL) werden van de Division of Cancer Treatment, (NCI), 25 Animal and Human Tumor Bank, Mason Research Institute, Worcester,

Massachusetts, USA, verkregen. Beide tumortypen werden na het verkrijgen aan vier passages onderworpen. Een passage omvatte het implanteren van een tumorblok van 2 x 2 mm in het rechter okselholte-gebied (onder toepassing van een Trokarnaald van 0,33 mm * nr. 13) van mannelijke, 30 syngeneïsche gastheermuizen [(C57BL/6J; Jackson Laboratory-stamj. De gastheermuizen wogen tussen 17 en 22 g (zij waren ongeveer 28 dagen oud) en werden met betrekking tot de duur van de lichtinwerking, het dieet, de temperatuur enz. onder identieke omstandigheden gehouden.

De getransplanteerde tumoren kregen de gelegenheid in aansluiting 35 aan de implantatie in de syngeneïsche gastheermuizen ongeveer 14 dagen lang te groeien.

B. Isolatie en suspensie van tumorcellen.

Tumorcellen werden daarna door aseptische afname van de gastheermuizen verkregen en onder toepassing van een volgende vertering met 40 collagenase gedispergeerd, zoals hierna beschreven. De afgenomen tumo- 8201321 «- 4 5 ren werden in dobbelstenen (4x4 mm) verdeeld en het in dobbelstenen gebrachte weefsel werd over 6 tot 8 steriele Erlenmeyerkolven van poly-carbonaat verdeeld (ongeveer 500 mg/kolf). Een hoeveelheid van 10 ml van een "tumordispersieoplossing" (TDS) werd aan elk van de kolven toe-5 gevoegd.

De TDS werd door het met elkaar mengen van de samenstelling A en de samenstelling B bereid, die hierna beschreven worden.

Samenstelling A (betrokken op 1 1) 10 9,5 g/1 steriel Eagle's "Minimum Essential Medium" (MEM) (in de handel te verkrijgen bij Gibco, Grand Island, New York), 10 ml/1 niet-essentiële aminozuren (Gibco), 10 ml/1 natriumpyruvaat, 0,35 g/1 natriumwaterstofcarbonaat (15 ramol), 15 5,9 g/1 HEPES (25 mmol) a 4-(2-hydroxxyethyl)-1-piperazine- ethaan-sulfonzuur (een organische buffer; in de handel verkrijgbaar bij Sigma Chemical, St. Louis, Missouri), 150 eenh./ml penicilline, 100 ug/ml neomycine-sulfaat.

20 De antibiotica werd toegevoegd om er zeker van te zijn dat geen bacteriële verontreiniging plaats vond.

Samenstelling B is een droog mengsel, dat collagenase met weinig clostripalne en andere proteolytische activiteit bevat; desoxyribonu-clease (DNase), om het van de beschadigde celkernen vrijgemaakte des-25 oxyribonucleoproteïne op te lossen; lima-bonen- of soja-bonen-trypsi-ne-remmers, om elke tryptische restwerking uit te sluiten; menselijk serumalbumine, om niet-specifieke protease-activiteit uit te schakelen en peroxy- alsmede hydroperoxy-vetzuren te absorberen, die door beschadigde membranen worden vrijgemaakt.

30 Samenstelling B

Gewicht/ml van samenstelling A

Collagenase (Worthington Type III) 1 mg DNase I (Sigma Chemical) 50 yg 35 Sojabonen-trypsineremmer (Worthington) 100 yg

Menselijk serumalbumine 10 yg (vetzuurvrij; Sigma Chemical)

Samenstelling B werd afgewogen en in een kolf gebracht en daarna werden 100 ml van de samenstelling A toegevoegd.

40 Het dobbelsteenweefsel in de TDS werd daarna onder lucht in een 8201321

* V

6 stofwisselingsschudinrichting volgens Duhnoff (90 wentelingen/min.) ge-dispergeerd (30 min. bij 37°C). De bovenstaande lagen werden door een zijgdoek in steriele centrifuge-buisj es met ronde bodem van 50 ml uit polycarbonaat verzameld en 10 min. (25°C) met 900 omwentelingen/min.

5 (100 g) in een Sorvall SS-34 -Rotor gecentrifugeerd. Na het centrifu geren werden de bovenstaande fracties verwijderd. Het verkregen cellulaire materiaal (korrels) werd tweemaal met MEM-oplossing gewassen, opnieuw in MEM gesuspendeerd en op 4°G gehouden.

Aan het achterblijvende dobbelsteenweefsel werd een hoeveelheid 10 van 10 ml TDS toegevoegd en het weefsel werd in een stofwisselingsschudinrichting gelncubeerd, zoals hiervoor beschreven, behalve dat de tijdsduur 60 min. bedroeg. Het centrifugeren werd herhaald en de opnieuw gesuspendeerde cellen werden verenigd.

De levensvatbaarheid van de cellen werd volgens de vitale kleur-15 stofuitsluitingsmethode (vital dye exclusion method) [vgl. Exptl. Cell Res. 13, (1957) 341-347] bepaald. Het aantal cellen (cell count) werd in een Hamocytometer bepaald. De stroombare celverontreinigingen, bijvoorbeeld macrofagen, rode bloedlichaampjes, enz. werden door visueel onderzoek onder de microscoop bepaald. De tenslotte verkregen celsus-20 pensie bestond voor meer dan 99 % uit monodisperse cellen met ongeveer 25 % verontreiniging door stroombare gastheercellen. Gebruikelijke opbrengsten van 3,0 g van een B-16a- of 3LL-tumor lagen tussen 9 .

10® en 1,3 . 10^ levensbare tumorcellen.

De celsuspensies van de eindtrap werden daarna ter definitieve af-25 scheiding van de tumorcellen aan een centrifugale·elutriëring onderworpen. Bij de centrifugale elutriëring werden de cellen in het inwendige van een scheidingskamer aan de inwerking van twee tegengestelde krachten onderworpen, namelijk een door een roterende rotor opgewekt centrifugaal veld en een tegenstroom van vloeistof in de tegengestelde 30 ( centripetale) richting. Een in een milieu gesuspendeerd monster wordt in de scheidingskamer gebracht. Elke cel is er toe geneigd naar een zone te gaan waarin de sedimentatiesnelheid ervan precies door de doorstroomsnelheid van de vloeistof door de scheidingskamer heen wordt genivelleerd. De geometrie van de kamer brengt een gradiënt van de stro-35 mingssnelheden van het ene einde naar het andere toe stand; cellen met een ruim traject verschillende sedimentatiesnelheden kunnen in suspensie gehouden worden. Door verhoging van de stromingssnelheid van de elutriëringsvloeistof (scheidingsmedium) in trappen of door verlaging van de rotosnelheid kunnen opeenvolgende populaties met relatief homo-40 gene celgrootten uit de kamer gewassen worden. Elke populatie bevat 8201321

#·· !M

7 cellen, die groter of dichter (dat wil zeggen sneller sedimenterend) zijn dan die van de. voorafgaande fractie.

De centrifugale elutriëring werd door suspensie van de tumorcellen in een "tumor-hersuspensie-oplossing" (TRS) uitgevoerd, die de volgende 5 samenstelling betrokken op 1 liter bezat.

9,5 g/1 steriel Eagle’s "Minimum Essential Medium" (MEM)(Gibco), 10 ml/1 niet-essentiële aminozuren (Gibco), 10 ml/1 natriumpyrüvaat, 0,35 ml/1 natriumwaterstofcarbonaat (15 mmol), 10 5,9 g/1 HEPES (25 mmol) (Sigma Chemical), 150 eenh./ml penicilline, 100 pg/ml neomycine-sulfaat.

De suspensie werd onder toepassing van een Beekman-JE-6 -Elutriator-Rotor geëlutrieerd, die in een Beekman J-2-21 -centrifuge 15 met 2000/min. bij 25°C werd toegepast.

Een scheidingsmedium uit "Hank’s Balanced Salt Solution" werd onder gebruik van een Cole Palmer Master Flex-pomp met een pompkop nr.

7014 door het systeem gepompt. De pompregellngskast werd door middel van een potentiometer met 10 omwentelingen gecentrifugeerd [zie Anal.

20 Biochem. 98, (1979) 112-115]. De doorstroomsnelheid werd met behulp van een stromingsmeter met dubbele kogel volgens Brooks gemeten.

De ingestelde zoutoplossing volgens Hank werd door het gereedmaken van 900 ml oplossing van de hierna volgende samenstelling en mengen met CaCl2«2 H2O, zoals daarna beschreven, bereid.

25 80 g NaCl 4 g KC1 0,98 g MgS04 30 0,48 g Na2HP04 0,60 g KH2P04 1,85 g CaCl2*2 ^0 werden tot 100 ml oplossing aangevuld en deze werd met de hiervoor aangegeven 900 ml gemengd.

35 Ongeveer 1 x 10^ cellen werden door een Y-passtuk in het toe- voersysteem in de mengkamer geïnjecteerd. Na verloop van 15 minuten voor de instelling van het evenwicht werden de celresten met een stromingssnelheid van 9 x 10 ml/min. geëlueerd. De tumorcellen werden in 6 fracties van elk 50 ml met stromingssnelheden van ongeveer 12 tot 18 40 ml/min. geëlueerd. De fracties 2 tot 5, die de tumorcellen bevatten, 8201321 <· 8 werden verenigd, opnieuw gecentrifugeerd (100 g) en in 1 tot 2 ml van de hiervoor beschreven TRS opnieuw gesuspendeerd. In het algemeen werden tussen 70 en 75 % van de in de mengkamer geïnjecteerde cellen teruggewonnen.

5 C. Werking van 3-methyl-l-[2-(2-naftyloxy)-ethyl]-2-pyrazolin-5-on op de groei en de metastase van tumorcellen De op deze wijze verkregen B-16a-melanoom- en Lewis-longcarci-noom-cellen werden, zoals hierna beschreven, voor het onderzoek van de antimetastatische en antineoplastische werkzaamheid van de methylpyra-10 zolon-verbinding toegepast.

(1) Metastase

Zoals reeds hiervoor werd vastgesteld, is de metastase een afzonderlijk verschijnsel, dat door een reek gecompliceerde processen wordt voorgesteld. Tegenwoordig vinden twee "model"-systemen voor het onder-15 zoek van de in vivo metastase een brede toepassing. Het eerste model-systeem omvat de subcutane injectie van de tumorcellen in het dier. De subcutane injectie van de tumorcellen en aansluitende ontwikkeling van een primaire tumor, gevolgd door spontane metastase, wordt als "volle" metastase beschoud. Een ander, model-systeem omvat de injectie van de 20 tumorcellen door de staartvene. In het licht van de gecompliceerdheid van de metastase.geldt de staartvenen-injectie als kunstmatig en slechts partieel model-systeem, omdat het alleen de processen gedurende het laatste deel van de metastase weergeeft. Het staartvenen-model-sy-steem geldt echter ook als buitengewoon gunstig met het oog op een 25 standaardisering van de proefomstandigheden [zie "Methods in Cancer Research", hoofdstuk VII, Academic Press. Ine., 1978].

Als controle-dieren werden (onbehandelde) C57Bl/6J-muizen volgens de volgende werkwijze op volle metastase onderzocht. Celsuspensies van de B-16a- en 3LL-carcinoomcellen, die zoals hiervoor onder A en B be-30 schreven verkregen waren, werden subcutaan in het rechter okselholtege-bied van de mannelijke C57Bl/6J-muizen geïnjecteerd (0,66 mm * nr. 26-naald; 0,2 ml). Verschillende hoeveelheden van de celsuspensies werden in het traject van 1 x 10^ tot 1 x 10^ cellen geïnjecteerd. Proeven over de partiële metastase werden op een zodanige wijze uitgevoerd, dat 35 tumorcellen via de staartvene in de (onbehandelde) controle muizen geïnjecteerd werden. De dieren werden onder identieke omstandigheden van temperatuur, inwerkingsduur van licht, voeding enz. gehouden. Na een waarnemingsperiode van 17 tot 30 dagen werden de voor de volle metastase en voor de partiële metastase gebruikte dieren gedood en werden de 40 longen, lever, nieren, milt en hersenweefsel verwijderd.

8201321 9

Het verwijderde weefsel werd In een oplossing volgens Bouin gefixeerd* Het aantal van de metastatische knoopjes in elk orgaan werd met behulp van een stereo-zoom-microscoop volgens Bausch en Lomb bepaald. Het onderzoek van de controle muizen op metastatische knoopjes gaf bij 5 100 % van de dieren positieve resultaten met betrekking tot metastati sche longtumoren; de incubatietijd voor het tot stand brengen van dergelijke metaetasen bedroeg voor de 3LL-tumorcellen 17 tot 21 dagen en voor de B-16a-tumorcellen 23 tot 30 dagen. In lever, nieren, milt of hersenweefsel werden geen zichtbare knoopjes waargenomen.

10 (2) Antineoplastische werkzaamheid

De antineoplastische werkzaamheid werd in vitro door meting van de DNS-synthese zowel van B-16a- als ook van Lewis-longcarclnoom-cellen door een methode gemeten, die aan de thymidine-opname ten grondslag ligt. Cellen, die ter voorbereiding van de celdeling DNS synthetiseren, 15 zijn door hun vermogen, thymidine op te nemen, gekenmerkt. Derhalve is de cel-proliferatie met de DNS-synthese verbonden. Wanneer de hoeveelheid van het door de tumorcellen gesynthetiseerde DNS verminderd wordt, dan is dat een aanwijzing ervoor, dat de celdeling en daarmee de tumor-groei geremd wordt.

20 De antineoplastische werkzaamheid werd bovendien door direkte me ting van de groei van de tumorcellen in vitro in weefselculturen bepaald. Deze methode bedient zich van het "plating" of openten van een bekend aantal tumorcellen op een groeimilieu en de bepaling van de werking van de aanwezigheid van de te onderzoeken verbinding op de proli-25 feratie van de tumorcellen. Tenslotte werd de antineoplastische activiteit in vivo op een wijze bepaald, dat bij de muizen subcutaan tumorcellen geïnjecteerd werden en het optreden van de groei van tumorcellen alsmede het gewicht van de groeiende tumorcellen in onbehandelde con-trole-dieren en in met de pyrazolon-verbinding behandelde dieren be-30 paald werden.

De werking van 3-methyl-l-[2-(2-naftyloxy)-ethyl]-2-pyrazolin-5-on op de door staartvenen-injectie van tumorcellen teweeg gebrachte meta-stase resp. op de volle metastase op grond van de subcutabne injectie van tumorcellen wordt in de voorbeelden I en II getoond.

35 Voorbeeld I

3 mg 3-methyl-l-[2-(2-naftyloxy)-ethyl]-2-pyrazolin-5-on werden in / 0,6 ml absolute ethanol gesuspendeerd. Het gesuspendeerde pyrazolon werd door instellen van de pH op 9,5 met NaOH opgelost. De uiteindelijke concentratie van het pyrazolon werd door verdunnen van de oplossing 40 met een normaal keukenzoutoplossing (0,9 % NaCl) ingesteld.

8201321 « ίο

Syn^eneïsche C57B1/6J gastheermuizen ontvingen gedurende een tijdsperiode van 3 dagen een injectie op dagelijkse basis van 0,02 en 0,08 mg/muis van de methylpyrazool-5-on-verbinding (subcutaan).

Op de vierde dag werden de voorbehandelde muizen (en de controle 5 muizen) elk met een zoals hiervoor beschreven gereed gemaakte suspensie van 5 x 10^ B-16a-tumorcellen via de staartvene geïnjecteerd. De controle muizen en de behandelde muizen werden onder identieke omstandigheden van temperatuur, inwerkingsduur van licht, voeding enz. gehouden. De muizen werden 14 dagen na de injectie in de staartvenen gedood 10 en hun longweefsel werd onderzocht. De werking van het injecteren van de pyrazolonverbinding in de muizen dén uur voor de injectie van de B-16a~tumorcellen werd eveneens onderzocht.

Zoals uit de in tabel A samengestelde gegevens blijkt, is de toediening van de pyrazolonverbinding op een zodanige wijze werkzaam, dat 15 daardoor het aantal van de longtumorkoloniën, dat wil zeggen de meta-stase, op drastische wijze verminderd wordt, en wel zowel op het niveau van 0,08 mg als op dat van 0,02 mg.

Vermoed werd, dat de onderhavige pyrazolonverbinding de vrijmaking van prostacycline stimuleert [zie The Lancet, bladzijden 518-520 (10 20 maart 1979)]. Aangenomen wordt, dat de antitrombotische werking van het prostacycline door een verhoging van de spiegel van het cyclische adenosine-3',5'-fosforzuur (cAMP) in de plaatjes tot stand wordt gebracht. Het is eveneens bekend, dat als fosfodiësterase-remmers bekende verbindingen de splitsing van cAMP vertragen. Dienovereenkomstig zou te 25 verwachten zijn, dat fosfodiësterase-remmers, doordat zij de splitsing van cAMP vertragen, de antitrombotische werking van een antitrombotisch middel, dat door dit mechanisme werkt, bekrachtigen. Omdat plaatjes eveneens aan het mechanisme van de metastase kunnen deelnemen, werd de werking van een goed bekende fosfodiësterase-remmer, van het theofyli-30 ne, op een potentieel synergisme met de pyrazolonverbinding onderzocht .

Hoewel de resultaten er op wijzen, dat de antimetastastische werking door theofyline versterkt kan zijn, werd vanwege de met de proef gepaard gaande standaardfout een synergisme niet met zekerheid aange-35 toond.

8201321 11 * β :d> a) τΊ ό β Μ Ο (U Η 0) Ο __ .μ ,ϋ m icn Ο I £ι ·> * a) i^mps-'^oocojo ο < <η ή cn in 3+1+1 +! +1 +1 +1 4) u bo I cn ΐ'' ό bo *» * * ü c τ-( σ\ cm m <n Ά 5 o oo—i vo cn Ό

C Η -H

<U

> u

M

Cd «d

4J

CD

3

•H

s > 0) CD g

Cd O

IJ I

ï 7 «t L J.

w £ 2 2 Η β s - o *2

<u 2 S

3 cd ™ Μ Λ 6 >*8 5* o. <? 1 i

- CM O

0 1 2 <11 3 ^ H ? g g £ g 3 5 3 ? ? ΰ 3 5 ? ? f ΐ 8 5 i i ►; -S 5

Cj Η Γ-) Μ γΗ Η *h si O o 0 0 3-1 CL N N τΗ N ö 1 cd cd £*> ai O aj CM W O U W ^ rj I ►. >» *H· ft _ ^ rmmt CL» O CÖ CU 0 d)

* Λ A f A l I

t i λ s i. s I

4J iH rM 1 at 3 JJ

1 >·> >> « ft ® u g —. J3 ^ Ό dt

IJ μ 1 JJ CJ 0} iH

6 <1)<U —) <U Ο Ό Ή 0 cd 11 _L ‘ V u 3

ft 5 ft ft j? ft Ο Ο O

£3 8 8 1ΙΜ>Ι

cd a) η h 8 'T' m — H

ö u >* >» i ft 2 C· 4-1 J, fa Z <44 co a cj a)

Co cd Λ « e g> ·« 1 o c a oo ö o JH ,

CM Ö I I Ο I > Ό M

‘-‘«β CM CM * CM Cd — 9

I _j w w Ο ^ M

Λ ο I I I -y ^ > IS CM CM + CM ö m -

Jj 1-11-1¾ >—' *h m 35

'TL (U i I bo bO I · M

ft 5 Λ -h 3. 3- -c CVOT-jrH

WO II I at *H _ φ q HHOOrHHHH'g

f M jC-CC^e^rd OiCibOO

- 1 1 ξ 0 * 8 " ·. -3 s

Si g1 f f i i P ο I o « >o -H cn cn Η H cn r-icno-o fi t is s I I s :,:1 wcdöo cd W CM 00 0 O 00 w—< JS 30 o <U O o Η I 0 o «J3 J3 » · · · * >3 p5 (β ao Ο Η Η O cd 3 Ü 3 8201321 12

Voorbeeld II

De werking van de toediening van de pyrazolon-verbinding gedurende een langere tijdsperiode op bet aantal van de metastatische longkolo-niën van het B-16a en bet Lewis-longcarcinoom werd zoals hierna be-5 schreven bepaald» 3 mg 3-methyl-l-[2-(2-naftyloxy)-ethyl]-2-pyrazolin-5-on werden in 0,6 ml ethanol opgelost en de oplossing werd met geconcentreerde natriumhydroxide op een pH van 9,5 ingesteld.

Bij syngeneïsche C57BL/6J gastheermuizen werd een suspensie van 10 1,8 x 105 B-16a-cellen subcutaan geïnjecteerd, welke suspensie zo als hiervoor beschreven werd bereid. Bij een andere reeks syngeneïsche C57BL/6J gastheermuizen werd een suspensie van 1 x 10^ Lewis-longcar-cinoom-cellen, verkregen zoals hiervoor beschreven, subcutaan geïnjecteerd. Vanaf de dag na de injectie van de tumorcellen ontvingen de mui-15 zen 28 dagen lang een subcutane injectie van een dagelijkse eenheidsdo-sering van hetzij 0,01 hetzij 0,08 mg van de pyrazolonverbinding. De controle muizen en de behandelde muizen werden onder identieke omstandigheden van temperatuur, inwerkinvsduur van licht, voeding, enz. gehouden». De muizen, die de injectie van de B-16a“tumorcellen ontvangen 20 hadden, werden 25 dagen na de injectie van de tumorcellen gedood; de muizen, waarbij de Lewis-longcarcinoom-cellen geïnjecteerd waren, werden 21 dagen na de injectie van de tumorcellen gedood.

De bij het onderzoek van het longweefsel verkregen experimentele gegevens zijn in tabel B samengevat.

25 8201321 “ * 13 υ 3 ^ S0 «Μ £ Ή 0 "Ί ^ s φ ^ r1 Ο Η <Ν ^ Η Η -< Γ» 5 jl ^ μ-' 0 Ü ο ,_ Ό I Μ <1-

H Μ 0 « A

0) Ο Ο Ό . · . σ 0 S ιΗ . I I I ι ® 31+11 I ι +1 Ü 4-1 C0 _ 0) b0 ·Η βΟ •fH ö {? Λ —Γ β Ο (U <r Ο Η |J (J <0 0 &ο 3 Λ 0 C ^ h !0 ι-Η ^-ν ✓v

Η ^ CM «Μ Μ CM

0J 0 «Μ ι-ι *Η CO Ο 3 ^ ''ι >* ΤΞϊ Λ Η 0 'β' 1-* Ι"« ® 4J Ο ιΗ w ^ ^ 0J ^ Η Ü Λ „ — α} ι φ -η ιί O' οο ® π Li fl ·» * · * * * 0 OIMOOOO a pa fi Λ , . w s 3 VO +| +| +1 +] +1 w ë ω V -h r-. m -h -a· +1 CÖ G P5 Λ * * * * im jj Q -*3“ i*H CN CO ^ I* 0+1-^

2 M

co J2 4 ε ^ 0 n* ft 0 o π 60

§ O

Ml H

*3 Ί f f f ? ,3 _Q H 1111 *2

HO ? ? T T H

N 0 0 0 Ö « λ ή ’’Ί üj y

Ll jQ H rH H iH 0 SL e ο ο ο ο h ft Ο Μ S « g S .

1 O 3 0 0 0 M ·

<n 0 * £ £. £ 4JM

-¾ SS&S: . s S. S A A A A 5!'

s M 111! Φ 0 O. O

t) hQ I—t I"I *"“* *™“· Φ Ψ O <U

<üö rH iH iH rH ti t{ - T?

Λ η P .0 P .0 00:0W

b.1 4JJJWJJ 1-)-1-)1-(0)

Mm 0000 33060 a 5 till «η in o >,0 60600¾

£ ^ 8 Ο § O 33M<N

00 ΗΗΗιΗ 222A

00 >v >·> 6b t* 2S§° 4J+J+J4J 4J+J3 CM 0 H'W'Wiy 3 3 « 0 ^ a 0000 2 2 Λ, ^ ΙΟ 0 O 0 0 ^^0

cm o iii* 2 2 S

Urt CM CM CM CM MMO0

1 crt w v-/ v-/ CO CO

‘ j till e cs *rf y 10 CM CM CM CM _5 _S ti m j g i__i i—i i—i i—i r-l H 0 Ü bL B lilt i-H 1+ W -£ j* r* 4 i-H ι—< φ CJ CO J3

So 1111 ο Ο Φ CO

ft IISI ^^aiS

^¾¾¾ 1-1 Η ·τ7 30M S|!^^ >0H cncn^cn eosöp bo 0 0 H 60 60 ω ω —ι ι—ι <s p ο ι ό o a a a a + 0 3 n * —

,Mv0 0 -U CM ^ M

U-Hp 30000 ....

Ait m ο λ * λ λ ···· l^pqfS UOOOO Φ,ΛΟΤΟ 8201321 14

Zoals de in tabel B samengevatte proefwaarden laten zien, wordt het aantal van de metastatische longkoloniën, zowel van het B-16a~ melanoom alsook van het 3LL-carcinoom door de toediening van de pyrazo-lonverbinding drastisch verminderd.

5 Met het oog op de B-16a-melanoomrmetastase leek een doseringsni- veau van 0,01 mg bijna net zo werkzaam te zijn als een dosèringsniveau van 0,08 mg.

Zoals reeds hiervoor geschetst wordt de subcutane injectie van tumorcellen en daaropvolgende ontwikkeling van een primaire tumor, ge-10 volgd door spontane metastase, als "volle" metastase beschouwd. Omdat de werkwijze van voorbeeld II deze volle metastase betrof, was het aantal van de in de controle dieren aanwezige longtumorkoloniën kleiner dan dat bij de controle dieren van voorbeeld I, waarbij de metastase op grond van de injectie van de tumorcellen in de staartvene ontwikkeld 15 was. Zowel de gegevens in voorbeeld I, alsook de gegevens in voorbeeld II laten echter zien, dat de pyrazolonverbinding een sterke antimeta-stasen-werkzaamheid bezit.

De antineoplastische werkzaamheid van de pyrazolonverbinding werd door meting van thymidine-opname als maat voor de DNS-synthese be-20 paald.

Voorbeeld III

B-16a~ en Lewis-longcarcinoom-ce11en werden zoals hiervoor beschreven verkregen. De gedispergeerde cellen werden in steriele Erlenmeyer-kolven van 25 ml uit kunststof tot een concentratie van 1 x 25 10^ cellen/ml in MEM verdund. Met tritium gemerkt Thymidine (½) met een specifieke activiteit van 1,85 x ÏO”^ tot 2,96 x 10“® s~Vmmol (50-80 Ci/mmol) werd met 7,4 x 10“^ s~V®l (2 yCi/ml) aan elke ml van de celsuspensie toegevoegd.

Aan een reeks kolven, die de B-16a~ en Lewis-longcarcinoom-cel-30 len bevatten, werd de pyrazolonverbinding in hoevelheden van 0,1, 1,0, 10 en 25 yg/ml van het totale volume toegevoegd. De kolven werden vervolgens tezamen met controle kolven van de tumorcellen, die geen pyrazolonverbinding bevatten, bij 37°C in een stofwisselings-schudinrich-ting volgens Dubnoff (90 wentelingen/min.) geïncubeerd.

35 Met tijdsintervallen van 4 h en 18 h werden 4 gelijke hoeveelheden tot 1 ml met een pipet afgenomen en in conische polypropeenbuisjes van 1,5 ml gebracht. De cellen werden door 8 minuten roteren in een mini centrifuge volgens Brinkman (10.000 g) tot korrels gecentrifugeerd. De bovenstaande fractie werd verwijderd en in een reservoir voor radio-40 actief afval afgevoerd. Een hoeveelheid van 1,0 ml koud trichloorazijn- 8201321 T *2 15 zuur (6 gew./vol.%) werd aan elk buisje toegevoegd on de aanwezige proteïnen neer te slaan, met inbegrip van DNS en RNS. De buisj es werden met een kap gesloten en rondgedraaid, om zoals hiervoor beschreven de cellen door centrifugeren uit elkaar te breken. De verkregen korrels 5 bevatten de in zuur onoplosbare fractie met het DNS. De bovenstaande laag, die de in zuur oplosbare bestanddelen bevat, werd verwijderd. De binnenzijde van elk buisje werd met een watte-prop-staafje afgeveegd om de overmaat in zuur oplosbare radio-activiteit te verwijderen. De korrels werden door toevoeging van 50 pl van een middel dat zorgt voor het 10 oplossen van weefsel, in de handel verkrijgbaar bij Amersham Corporation, Del., Arlington Heights, Illinois, onder de handelsnaam NCS, in elk buisje opgelost. De buisjes werden met kappen afgesloten en bij ongeveer 50eC ongeveer 2 uren lang of tot de korrels opgelost waren, ge-ïncubeerd.

15 De toppen van de buisjes, die de opgeloste korrels bevatten, wer den afgesneden en de inhoud werd in scintillatie-ampullen overgebracht.

3 ml van een scintillatie-telvloeistof met xyleen in de verhouding 2 : 1 gemengd werden in elke scintillatie-ampul gebracht. Elke ampul werd afgesloten en geslingerd en de hoeveelheid van het door DNS-synthese 20 opgenomen radio-actief gemerkte thymidine werd bepaald. De telwaarden per minuut werden met behulp van een Searle-PDS-computer onder gebruik van de analyse voor de correctie van de teruggang (quench-correction analysis) gecorrigeerd en als procentueel aandeel van de controle-waar— de aangegeven.

25 De verkregen proefresultaten zijn in fig.Λ voorgesteld. Bij elke pyrazolon-concentratle is de hoeveelheid van het gesynthetiseerde DNS op het niveau van 100 % voor het controle-monster betrokken. Zoals fig.

4 laat zien, bewerkstelligt de pyrazolonverbinding een van de concentratie afhankelijke afname van de DNS-synthese, zoals deze door middel 30 van de %-thymidine-opname werd bepaald. Deze afname van de DNS-synthese laat zien, dat de pyrazolonverbinding een antineoplastische werkzaamheid bezit.

Het aantonen van de inbouw van het thymidine in het DNS werd uitgevoerd, zoals dit in Biochem. and Biophysical Research Communications, 35 87, Nr, 3, bladzijden 795-801 (1979), beschreven werd.

Een ander bewijs voor de antineoplastische werkzaamheid van de pyrazolonverbinding werd door direkte meting van de proliferatie van de tumorcellen in weefselculturen aangevoerd.

Voorbeeld IV

40 B-16a“melanoom-cellen, die zoals hiervoor beschreven verkregen 8201321 i * ié 16 waren, werden in Petrischalen van 60 mm met roosters (gridded) met een dichtheid van 3 x 10^ cellen per plaat overgeënt. De cellen werden in een milieu uit MEM, basisch zoutoplossing volgens Hank en 10 % foetaal kalfsserum, in de handel verkrijgbaar bij Microbiological Associates, 5 Walkersville, Maryland, gekweekt.

Na een incubatie van 24 uren bij 37°C werden de celtellingen door visueel tellen in een omkeer-microscoop uitgevoerd. Het milieu werd verwisseld en door het hiervoor aangeduide milieu en pyrazolon in een concentratietraj eet, dat van 0,1 tot 25 pg/ml rijkt, vervangen. De con-10 trole-groepen bevatten slechts een uitwisseling van het milieu. Daarna werd het pyrazzolon bevattende milieu elke tweede dag vervangen. Na 8 dagen werden celtellingen, zoals hiervoor beschreven, uitgevoerd en de levensvatbaarheid van de cellen werd volgens de hiervoor genoemde vitale kleurstof uitsluitmethode (vital dye exclusive method) bepaald.

15 De verkregen proefresultaten zijn in fig. 5 voorgesteld.

De gegevens zijn voorgesteld als gemiddelde waarden van het aantal cellen + standaardfout uit parallelproeven met zes platen. Het getal boven elke dwarsstreep geeft de levensvatbaarheid van de cellen, betrokken op een 100-procents levensvatbaarheid van de cellen aan. De ge— 20 geus laten zien, dat de pyrazolonverbinding de proloferatie van de tumorcellen over hetzelfde doseringstraject remde, waarover de verbinding ook de DNS-synthese remde.

De index van de levensvatbaarheid, die in het traject tussen 96 + 0,9 en 94+0,4 lag, laat herkennen, dat de antineoplastische wer-25 king van de pyrazolonverbinding niet op cytotoxiciteit van de verbinding berust.

Voor de meting van de antineoplastische werkingen van de pyrazolonverbinding werd een andere proef in vivo uitgevoerd.

Voorbeeld V

30 3 mg 3-methyl-l~[2-(2-naftyloxy)-ethyl]-2-pyrazolin-5-on werden in 0,6 ml ethanol opgelost en de oplossing werd met geconcentreerd natriumhydroxide op een pH van 9,5 ingesteld.

Bij syngeneische C57BL/6J gastheermuizen werden 1 x 10^ Lewis— longcarcinoom-cellen (0,2 ml) subcutaan in het okselholtegebied geïn-35 jecteerd. Na een tijdsinterval van 24 uren werd de pyrazolonverbinding 21 dagen lang dagelijks toegediend. De werking van de toediening van theofylline tezamen met de pyrazolonverbinding werd eveneens onderzocht. Gedurende het tijdsinterval werden de muizen onder identieke omstandigheden van temperatuur, inwerkingsduur van licht, voeding enz.

40 gehouden. De muizen werden 22 dagen na de injectie van de tumorcellen 8201321 17 gedood en door middel van een totale necropsie op de aanwezigheid van subcutane tumoren onderzocht. Aanwezige tumoren werden verwijderd en op een analyse-balans gewogen.

De verkregen proefresultaten zijn in tabel C samengevat.

8201321 18 “bo os Ό r·* cm >n jjï cn <1· cm —i ^ A A A Λ «* ο ο ο ο ο to Λ +| +1 +| +1 +1 ι

•Ο ϋ G

•Η Ή 00 <Γ σ> Ό 00 >-Η 3 ,Ο S σ\ t'' <f ^ 1Λ ΟΊ Ή Λ) * A A * * * .ι ϋ on ο ο ο ο a) •S ° & £ a) Η ω α) Ό Η „ _ ·

3 4J9«gcnmooooini>.OO

Η CONfM on γμ η 3 3 0) 3 3 3 wo* ** 3 3 ο

JS 2 (U

<3 Η Γ-s cm cm cm CM cm CM t-| ft MnJCMf-Hi-ti-··^^\ rH 3

ft O 3 ^ ^ ''ί — ~ H

iömcosc^cncMO 3 ai 9 4 M 00 Η H «3 _ jj Ό

Ü <U

3 3 3 H

3 ο ο λ U> I 1 <u m m in ω μ I ι οι <3 3 3 3

U ·Η Ή H

Ο Η Η Ο a ο ο £ § Ν Μ Η μ 3 3 3 3 3 3 3 >> fj1 ^ irt Cu 3* Ο Ό

1 I H

Q. CM CM 3 3 Ο 113 3 —> rö 3 0 3 Η Η 3 Ο >* £> S 3 ' HI rfS -3 Η -Η 3 ΙΓ) 3 3 3 rfJl 3 3d « « ^ * 3 3 Ο Ο Ο I 1 Η 3 Η Η III θ' Ο 8 Μ η m m m >> Pm ο 111 X X cm λ · Ν 33« 0 0-1¾¾ 3 Η Η Η Η Η Ο 3 3

3 Η Η Η >% >» ^ "Η J

>, Ο Ο Ο 33 £ 0) ft, ΝΝΝ <3 <3 3 3

ι 333 333Ö0U

CM 3 33 333^3 I >. S3 >ι I 1 3 S ΤΡ .—. CUftiCU CM es 3 · 3 3 Η 111 "w v-»· U 3 Η JH- >; CM CM CM I I .a 3 «3 3 S III CM CM 3 3 60 3 pi, „ _ u_i u-i CO ft 3

3 HHH I I _ H 3 H

I f>S >s >i >3· h 3 h S

Λ £ £ £ I I <U 3 _ * >, 333 Η H 13 3 3 Mitt 333 . >·. P 3 H « S III 35 £ 33^0- H s·^ /~\ /~\ 3315,.

>> t*. ps >i 33 Mf H 3

3 8 1 3 CM g H

3 0 O 0 113

3 HHH on cl H 3 H

3 ps Ps HO"3 1 333 60 &0 3 bO O 3

CM 333 8 S V g „ J

\s 333 I <3 3 3

I 333 -1 CM 31 HO

CM III O O J H U

CM CM CM * « 00 3 3 H

I © O 1033 3 III 3 -a 3 3 I' CM CM CM + + 3-33¾ H 3 i—* >—i *·“* 3 3 S 3 3 >, 8 I I I 3 3 3 +1 CD O 3 £ o 33H 3 3 3 3 3 r3 3

4J0 I I 13HH333S

33 HHHHHH p> ft CO H

β H >ipii>iHHHra3 Γ Ü ,3^^bi>.>iebogw on 3 33 3,3,3,3 3+5,^ 3 3 3 3 CU ft 3* >3 η Ή

ft U bO I 6 8 0 0 0 33HH

§ bO 3 I Γ f 3 3 3 HJ3HH

p, ft H on CO on ,3 .3 ,3 33

? Ο H 3 HHE-i'ACbObO

bn H 3 H bO bo bO 0333

ft I T) 0 £ S g bO bO bO > Q Q

•H CQ 3 3 3* 3* 3*

^ Ή 3 3 H CM CO

3&,3 3000000 33 3 0 * ι «minui · ·· J2PP3 ü O O O CM CM CM 3,00 8201321 19

Zoals de proefresultaten in tabel C laten zien, werden zowel de frequentie van het optreden alsook het gewicht van de Lewis-longearci-nooin-tuniofen door de subcutane toediening van de pyrazolonverbinding verminderd; dit laat de antineoplastische werkzaamheid zien en beves-5 tigt de in vitro-gegevens van de voorbeelden III en IV. Theophylline versterkte blijkbaar de werking van de pyrazonlonverbinding, mogelijkerwijze door vergroting van de hoeveelheid van het cAMP.

8201321

Claims

1. Therapeutische werkwijze ter vermindering van de metastase en de neoplastische groei bij zoogdieren, met het kenmerk, dat een therapeutisch werkzame hoeveelheid 3-methyl-l-[2-(2-naf tyloxy)-ethyl]-2-py- 5 razolin-5-on of een van de farmaceutisch onbezwaarlijke zouten ervan wordt toegediend.

2. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat men de toediening oraal uitvoert.

3. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat men de toe-10 diening parenteraal uitvoert. l-H-l- 1-+++H- 8201321