NL8501880A

NL8501880A - Nieuw beta-urogastron-gen, overeenkomstige recombinerende plasmiden, overeenkomstige transformerende produkten, hun bereiding en die van beta-urogastron.

Info

Publication number: NL8501880A
Application number: NL8501880A
Authority: NL
Original assignee: Earth Chemical Co
Priority date: 1984-07-02
Filing date: 1985-06-28
Publication date: 1986-02-03
Also published as: SE8503228L; GB2162851A; GB2162851B; DK291885D0; NL192116B; JP2554459B2; DE3523634A1; IT1210142B; JPS6115691A; CH670654A5; DE3523634C2; NL192116C; FR2566799A1; CA1304023C; AU4411185A; KR860001186A; GB8516591D0; IT8505195A0; KR920009543B1; AU599003B2

Description

_ 2- .4¾ # ^ ψ 853Ο71/vdV/Ar/cd

Korte aanduiding: Nieuw β-urogastron-qen, overeenkomstige recombinant-plas-miden, overeenkomstige transformanten en de bereiding ervan en van p-urogastron.

De onderhavige uitvinding heeft betrekking op een nieuw p-urogastron-gen, overeenkomstige recombinant-plasmiden, overeenkomstige transformanten en de bereiding ervan en van p-urogastron.

5 jjrürogastron is een polypeptide-hormoon, dat gesyntheti seerd wordt in de speekselklieren van mensen, enz. (zie bijvoorbeeld Heitz et al., Gut, Γ9, 408-413 (1978)), en een primaire struktuur met 53 aminozuren in de volgende volgorde bezit (zie H.Gregory et al., Int.J.Peptide Protein Res.,ί), 10 107-118 (1977).

Asn Ser Asp Ser Glu Cys Pro Leu Ser His Asp Gly Tyr Cys Leu His Asp Gly Val Cys Met Tyr II e Glu Ala Leu Asp Lys Tyr Ala Cys Asn Cys Val Val Gly Tyr Ile Gly Glu Arg Cys Gin Tyr 15 Arg Asp Leu Lys Trp Trp Glu Leu Arg.

In de beschrijving worden aminozuren weergegeven door de volgende symbolen.

Asn: asparagine Ser: serine

Asp: asparaginezuur Glu: glutaminezuur 20 Leu: leucine His: histidine

Gly: glycine Tyr: tyrosine

Val: valine Met: methionine lie: isoleucine Ala: alanine

Lys: lysine Gin: glutamine 25 Arg: arginine Trp: tryptofaan

Phe: fenylalanine. Cys: cysteine 5-ürogastron bezit fysiologisc Stóften zoals het onderdrukken van de afscheiding van maagzuur en het bevorderen van celgroei (zie Elder et al.. Gut, 16, 887-893 (1975)) en 30 is derhalve nuttig voor het behandelen van zweren en wonden.

Aangezien p-urogastron in kleine hoeveelheden uitgescheiden wordt in menselijke urine, wordt de verbinding op het ogenblik door extraktie, scheiding en zuivering uit urine bereid. Deze methode heeft echter het bezwaar, dat niet gemakkelijk 35 grote hoeveelheden van de verbinding verkregen kunnen worden, omdat de verbinding een gering bestanddeel van menselijke «r . λ *1 $ y I J O -u «F * -2- urine is.

Anderzijds beschrijft de Europese octrooiaanvrage nr.

0 046 039 een poging om β-urogastron te produceren door een gen-manipulatietechniek onder toepassing van een synthetisch 5 p-urogastron-gen. De bovengenoemde publikatie beschrijft echter het synthetische gen met een specifieke nucleotide-volgorde, doch openbaart niet of er andere genen zijn. die in staat zijn om 13-urogastron volgens een soortgelijke methode te exprimeren en vermeldt evenmin een dergelijk gen met 10 een bijzondere nucleotide-volgorde.

Een groot aantal nucleotide-volgorden kan coderen voor d'e aminozuurvolgorde van jj-urogastron. Niettemin is het moeilijk te vóórspellen welke van dergelijke genen in staat is om p-urogastron te exprimeren door middel van een genmanipula-15 tietechniek, of welk gen het meest geschikt is voor de toepassing van genmanipulatietechnieken. Dientengevolge zijn vele proeven en inventieve inspanningen vereist om de meest geschikte nucleotide-volgorde te bepalen.

Een oogmerk van de onderhavige uitvinding is het ver-20 schaffen van een nieuw β-urogastron-gen, dat totaal verschillend is van het in de bovengenoemde publikatie beschreven gen met betrekking tot de nucleotidevolgorde en in staat is om p-urogastron te exprimeren door middel van genmanipulatietechnieken .

25 Een ander oogmerk van de onderhavige uitvinding is het verschaffen van een gen, dat geschikt is voor de expressie van p-urogastron door genmanipulatietechnieken.

Een ander oogmerk van de onderhavige uitvinding is het verschaffen van nieuwe recombinant-plasmiden en transformanten 30 overeenkomende met het nieuwe p-urogastron-gen.

Nog een ander oogmerk van de onderhavige uitvinding is het verschaffen van een werkwijze, die de produktie van p-urogastron in grote hoeveelheden met een hoge zuiverheid mogelijk maakt met behulp van het nieuwe gen door middel van 35 genmanipulatietechnieken.

Deze en andere oogmerken van de onderhavige uitvinding zullen toegelicht worden in de volgende beschrijving.

Door Aanvraagster zijn vele proeven uitgevoerd en is gevonden, dat een gen I met de volgende nucleotide-volgorde 40 het mogelijk maakt om de oogmerken van de uitvinding te be-D % ü ü t· r λ -3- ί τ" y reiken.

Gen I:

5' AAT A G C GAT TCT GAG TGC CCA CTG

3' TTA TCG CTA AGA CTC ACG GGT GAC

5 TCT CAC GAT GGC TAT TGT CTG CAC

AGA GTG CTA CCG ATA ACA GAC GTG

GAC GGT GTT TGC ATG TAC ATC GAA

CTG CCA CAA ACG TAC ATG TAG CTT

GCT TTG GAT A A A TAC GCG TGT AAC

CGA AAC CTA TTT ATG CGC ACA TTG

10 TGT GTA GTG GGT TAT ATC GGT GAA

ACA CAT CAC CCA ATA TAG CCA CTT

CGC TGT CAA TAC CGT GAT CTG A A A

GCG ACA GTT ATG GCA CTA GAC TTT

TGG TGG GAA TTG CGT 3' ACC ACC CTT AAC GCA 5’ 15

De letters geven de urine- of pyrimidine-basen aan, die de nucleotidevolgorde vormen. De hierin voor basen toegepaste symbolen zijn als volgt: A voor adenine, G voor guanine, C voor cytosine en T voor thymine.

20 Het gen I is volledig nieuw en ligt als zodanig niet voor de hand en wordt verkregen door bepaling van de specifieke nucleotidevolgorde uit een zeer groot aantal mogelijke nucleo-tidevolgorden.

Het gen I heeft de volgende eigenschappen: 25 (1) jb-Urogastron kan zeer voordelig geëxprimeerd worden door genmanipulatietechnieken.

(2) De trinucleotide-codons, die het gen I vormen, zijn alle aanvaardbaar voor gastheercellen, in het bijzonder Escherichia coli (E.coli), dat gemakkelijk met zekerheid verkrijgbaar is, 30 waardoor een hoge mate van expressie gewaarborgd wordt.

(3) Specifieke herkenningsplaatsen van het restrictie-enzvm kunnen in het gen en aan beide zijden ervan gevormd worden, en de plaatsen kunnen naar wens gemanipuleerd worden ter vergemakkelijking van de koppeling met een ander gen en de opname 35 in de plasmidévector.

(4) Voor de bereiding van het gen I kunnen de samenstellende oligonucleotiden crekoppeld worden tot blokken en kunnen de blok- 880 * 1 -4- ken gemakkelijk naar wens tot ondereenheden gekoppeld worden, die in hoofdzaak vrij zijn van ongewenste koppeling.

(5) Bij het exprimeren van £rurogastron als een gefuseerd eiwit zijn middelen beschikbaar, waardoor een niet noodzakelijk 5 gedeelte gemakkelijk verwijderd kan worden ter verkrijging van het gewenste β-urogastron.

Wanneer jy-urogastron feitelijk met behulp van het gen I geëxprimeerd moet worden, kunnen herkenningsplaatsen van het restrictie-enzym aangebracht worden aan de voorzijde en/of de 10 achterzijde van het gen met het oog op de koppeling met de promotor, Shine-Dalgarno-volgorde (hierna aangeduid als "SD-volgorde"), vector, enz. die nodig zijn voor de expressie.

Voorts kan, indien noodzakelijk, een start-codon en/of een stop-codon respektievelijk bovenstrooms en benedenstrooms van 15 het gen aangebracht worden. De herkenningsplaatsen, het start-codon en het stopcodon zijn niet bijzonder beperkt, doch kunnen naar wens gekozen worden.

Hierna wordt een voorbeeld van een gen met een uitgebreide volgorde (hierna aangeduid als "gen II") gegeven, dat een boven-20 strooms van het gen I aangebrachte restrictie-enzym-herkennings-plaats en een startcodon en een benedenstrooms van het gen I aangebrachte stopcodon en restrictie-enzym-herkenningsplaats bevat, waarbij de plaatsen en codons in de vermelde volgorde zijn aangebracht, en het gen II voorts andere restrictie—· enzym-25 herkenningsplaatsen bevat.

Gen II:

Start codon -15 -1, 1_.

5' Iaat tIc g a aIg a t c t g c a t_g| a a t a g c

3' G C TT C T A G| ACG TAC TTA TCG

30 E Ta Bg(S) Mb 10 20 30

gIa T T CT GAG TGC CCA CTG TCT C AC

CTA AGA CTC ACG GGT GAC AGA GTG

Hf 35 40 50

GAT GGC TAT TGT CTG CAC GAC GGT

CTA CCG ATA ACA GAC GTG CTG CCA

§501880 * ..

I w -5- 60 70 80

GTT TGC ATG TAC A T[C_G AlA GCT TTG

CAA A C G TAC ATG T AG C] T T C G AI A A C

Ta Hd 5 90 100

GAT AAA T AlC GCG TGT AAC TGT G T A

C T A T T T A T G C G Cl ACA TTG ACA CAT

Ml(Th) 10 110 120

GIG GGT TAT ATC GGT G A A CGC TGT

CAC CCA AT A TAG CCA CTT GCG ACA

» 130 140 150

CAA TAC CGT [GAT C T G AAA TGG TGG

GTT ATG GCA C T A g] A C TTT ACC ACC

15

S

Stop codon . 160 _ _ 170

GlA A T T G CGT T A A TAG T G A aIg A T C T

CTT A AlC GCA ATT ATC ACT T C T A G] A

20 ·

Bg(S) G[_ 3' C C T AG 5'

Ba 25 De symbolen, die de restrictie-enzymen in de bovenstaande volgorde vertegenwoordigen, hebben de volgende betekenissen: E : EcoRI, Ta: Taql

Bg: BglII, S : Sau3AI

Mb: Mboll, Hf: HinFI

30 Ba: BamHI, Hd: HindlII

Ml: Mlul, Th: Thai

De onderhavige uitvinding is niet beperkt tot het gen I en het gen II doch omvat tevens andere genen, die in hoofdzaak daaraan identiek zijn met betrekking tot de nucleotide-volg-3 5 orde en in staat zijn om ^-urogastron te exprimeren.

8501330 * 4 -5a-

Voor de synthetische bereiding van het gen I of II is het voordelig om het gen I of II verdeeld in de voorste helft en de achterste helft samen te stellen. Het is bijvoorbeeld mogelijk om een onder-5 eenheid te bereiden met de voorste helft van de ongeveer in het midden gedeelde nucleotidevolgorde van het gen I of II en een andere ondereenheid met de achterste helft van de nucleotidevolgorde daarvan, en deze twee ondereenheden van het gen I of II samen te voegen tot het gen I of II. De 10 ondereenheid die de voorste helft van de nucleotide-volgorde van het gen II bezit kan voorts een herkenningsplaats voor een restrictie-enzym aan de achterzijde bevatten, en een andere ondereenheid die de achterste helft van de nucleotide-volgorde van het gen II bezit, kan een herkennings-15 plaats voor een restrictie-enzym aan de voorzijde bevatten en deze ondereenheden worden samengevoegd tot het gen II.

" ) ‘ j 1 8 8 ö

* V

-6-

Meer in het bijzonder ter illustratie kan de eerste on-dereenheid een ondereenheid A met de voorste helft van het gen II en een restrictie-enzvm (BamHI) herkenningsplaats aan de achterzijde ervan en de laatstgenoemde ondereenheid een ondereenheid B met de achterste helft van het gen II met een restrictie-enzym (HindlII) herkenningsplaats aan de voorzijde ervan zijn. Deze ondereenheden zijn hierna weergegeven. Ondereenheid A:

5’ AAT TCG AAG ATC TGC ATG AAT AGC

3' GC TTC TAG ACG TAC TTA TCG

GAI TCT GAG TGC CCA CTG TCT CAC CTA AGA CTC ACG GGT GAC AG A GTG

GAT GGC TAT TGT CTG CAC GAC GGT

CTA CCG ATA ACA GAC GTG CTG CC A

GTT TGC ATG TAC ATC GAA GCT TCG

CA A. ACG TAC ATG TAG CTT CGA AGC

3' CTA G 5’

Ondereenheid B

5' A GCT TTG GAT A A A TAC GCG TGT

3' AAC CTA TTT ATG CGC ACA

A AC TGT GTA GTG GGT TAT ATC GGT

TTG ACA CAT CAC CCA ATA TAG CCA

GAA CGC TGT CAA TAC CGT GAT CTG

CTT GCG ACA GTT ATG GCA CTA GAC

AAA TGG TGG GAA TTG CGT TAA TAG

TTT ACC ACC CTT AAC GCA ATT ATC

TGAAGATCTG 3' ACT TCT AGA CCT AG 5’ P £ ï\ 4 ^ 3 n

« +? U i w J

* \ -7-

De ondereenheden A en B worden bijvoorbeeld op de volgende wijze bereid. Oligonucleotiden met 11, 13 of 15 basen worden bereid (A-l tot A-16 en B-l tot B-16, d.w.z. 32 oligonucleotiden). Vervolgens worden 4 tot 6 van deze oligonucleotiden samenge-5 voegd en tot blokken gekoppeld (blok 1 tot blok 7, d.w.z. 7 blokken). Deze oligonucleotiden en blokken zijn hierna weergegeven .

Blok 1: (A-l) (A-2) (A-3) 5' AATTCGAAGAT CTGCATGAATAGC GATTCTGAGTG 3’ 10 3' GCTTCTAGACGTA CTTATCGCTAA GACTCACGGGTGA 5' (A-16) (A-15) (A-14)

Blok 2.: (A-4) (A-5) (A-6) 5' CCCACTGTCTCAC GATGGCTATTG TCTGCACGACGGT 3' 15 3* CAGAGTGCTAC CGATAACAGACGT GCTGCCACAAA 5’ (A-13) (A-12) (A-ll)

Blok 3: (A-7) (A-S) 5' GTTTGCATGTA CATCGAAGCTTCG 3' U 3' CGTACATGTAGCT TCGAAGCCTAG 5' (A-10) (A-9)

Blok 4: (B-l) (B —2) 25 5' AGCTTTGGATA AATACGCGTGTAACT 3 3' AACCTATTTATGC GCACATTGACACA 5' (B-16) (B-15)

Blok 5: 30 (B-3) (B-4) 5' GTGTAGTGGGT TATATCGGTGAACGC 3’ 3' TCACCCAATATAG CCACTTGCGACAG 5’ (B-14) (B—13)

Blok 6: 35 (B-5) (B-6) 5' TGTCAAXACCG TGATCTGAAATGGTG 3' 3’ TTATGGCACTAGA CTTTACCACCCTT 5' (B-12) (B—11)

Blok 7: (B-7) (B-8) 5* GGAATTGCGTT AATAGTGAAGATCTG 3' 3' AACGCAATTATCA CTTCTAGACCTAG 5' .30 (B-10) (B-9) r J' -8-

Vervolgens worden de blokken 1 t/m 3 samengekoppeld tot 5 de ondereenheid A en worden de blokken 4 t/m 7 samengekoppeld tot de ondereenheid B.

De onderhavige uitvinding zal nader beschreven worden aan de hand van de bijgevoegde tekeningen en foto's.

Fig. 1 toont schematisch de synthese van een oligonucleo-10 tide volgens de vaste fase-methode; fig. 2 toont een werkwijze voor het koppelen van oligonu-cleotiden A-l t/m A-16 tot een ondereenheid A en het opnemen van de ondereenheid in een plasmide pBR322 afkomstig van E.coli ter verkrijging van een recombinant-plasmide püGl; 15 fig. 3 toont een soortgelijke werkwijze voor het bereiden van een recombinant-plasmide pUG2 door opnemen van een ondereenheid B in een plasmide pBP322; fig. 4 toont een werkwijze voor het bereiden van een recombinant-plasmide pUG3 uit pUGl en pUG2; 2Q fig* 5 toont het resultaat verkregen door analyseren van de nucleotidevolgorde van oligonucleotide A-3 door tweedimensionale fraktionering door electroforese en homochromato-grafie; fig. 6 toont een werkwijze voor het bereiden van een re-25 combinant-plasraide pGH37; fig. 7 toont een werkwijze voor het bereiden van een recombinant-plasmide pGH35; fig. 8 toont een werkwijze voor het bereiden van een recombinant-plasmide pEK28? 30 fig. 9 toont werkwijzen voor het bereiden van recombinant- plasmiden pUG102 tot pUG122 en recombinantplasmiden pUG103-E en PÜG117-E; fig. 10 toont werkwijzen voor het bereiden van recombi-nant-plasmiden pBRHQ2 en pBRH03; 35 fig. 11 toont een MboII restrictie-schema van pUG3 met een H-fragment (179 b.p.), dat het onderhavige Q-urogastron-gen bevat; fig. 12 toont een werkwijze voor het bereiden van recom-binant-plasmiden pUG2301 t/m pUH2303; 85 0 1 S3? .

* \ -9- fig. 13 toont een werkwijze voor het bereiden van recom-binant-plasmiden pUG2101 t/m pUG2l05; fig. 14 toont een werkwijze voor het bereiden van re-combinant-plasmiden pOG270l t/m pUG2703; 5 fig. 15 toont een werkwijze voor het bereiden van recom- binant-plasmiden püG1102 en pUG1105; fig. 16 toont een werkwijze voor het bereiden van een recombinant-plasmide püGl004; fig. 17 toont een werkwijze voor het bereiden van een re-10 combinant-plasmide pUG1201; fig. 18 toont een werkwijze voor het bereiden van een recombinant-plasmide pUGl301; en de foto's 1 t/m 5 tonen respektievelijk analytische resultaten van nucleotide-volgorden van recombinant-plasmiden, 15 die bijvoorbeeld verkregen zijn volgens de Maxam-Gilbert-methode.

De procedures voor het opbouwen van het gen II van de onderhavige uitvinding ziin als zodanig bekend. De oligonucleo-tiden voor het opbouwen van het gen II kunnen volgens bekende 20 methoden bereid worden, bijvoorbeeld door de vaste fase-methode, die hierna in het kort beschreven zal worden (zie bijvoorbeeld H. Ito et al./ Nucleic Acids Research, 10, 1755-1769 (1982)).

Wanneer gebruik gemaakt wordt van de vaste fase-methode, wordt het oligonucleotide zoals weergegeven in fig. 1 bereid 25 door achtereenvolgens koppelen van mononucleotiden of dinucleo-tiden met een op polystyreenhars gedragen nucleoside ter verkrijging van een vooraf bepaalde volgorde van nucleotiden.

Het hars voor het ondersteunen van het nucleoside kan bijvoorbeeld bereid worden met behulp van een gedeeltelijk 3Q verknoopt polystyreenhars door N- (chloormethyl) -ftaalimide met het hars te laten reageren, hydrazine met het produkt te laten reageren ter verkrijging van aminomethylgroepen bevattend polystyreenhars en aan de aminogroep ervan een nucleoside met de 51-hydroxylgroep in vrije vorm en de aminogroep beschermd 35 te binden onder toepassing van barnsteenzuur als afstandhouder.

Anderzijds zijn verschillende werkwijzen voor de bereiding van mononucleotiden of dinucleotiden bekend (zie bijvoorbeeld C.Broka et al., Nucleic Acids Research, 8_, 5461-5471 (1980)). Bijvoorbeeld kan een mononucleotide bereid worden door 8501833 r · -10- laten reageren van o-chloorfenylfosfordichloridaat, triazool en een nucleoside,, waarvan de 51-hydroxylgroep beschermd is met een dimethoxytritylgroep (DMTr) in aanwezigheid van tri-ethvlamine, waarna men het verkregen monotriazolide laat 5 reageren met β-cyaanethanol in aanwezigheid van 1-methylimida-zool als katalysator en het reaktieprodukt elueert met chlo-roform-methanol door kolomchromatografie op silicagel. Deze werkwijze levert een volledig beschermd mononucleotide.

Een dinucleotide kan bereid worden door het hierboven lQverkregen volledig beschermde mononucleotide te behandelen met benzeensulfonzuur of een soortgelijk zuur ter verkrijging van het mononucleotide met een vrije 51-hydroxyIgroep, dat men laat reageren met het eerder verkregen monotriazolide, en het reaktieprodukt te elueren met chloroform-methanol door kolom-15chromatografie op silicagel. Deze werkwijze levert een volledig beschermd /^ïicleotide.

De synthese van oligonucleotiden in vaste fase wordt met voordeel uitgevoerd onder toepassing van een DNA-synthese-middel, dat bijvoorbeeld als DNA-synthesemiddel verkrijgbaar 20 is bij Bachem Inc., ü.S.A. Het hierboven verkregen nucleoside-onder.steunende hars wordt in een reaktievat gebracht en met dichloormethaan-isopropanol gewassen, en een oplossing van zinkbromide in dichloormethaan-isopropanol wordt toegevoecd aan het hars om de dimethoxytritylgroep op de 5'-plaats te 25verwijderen. Deze procedure wordt verscheidene malen herhaald tot de kleur van de oplossing verdwijnt. Het hars wordt gewassen met dichloormethaan-isopropanol en vervolgens met een oplossing van triethylammoniumacetaat in dimethylformamide ter 2+ verwijdering van het resterende Zn , en daarna gewassen met 30 tetrahydrofuran en gedurende verscheidene minuten blootgesteld aan een stroom stikstofgas om het te drogen. Afzonderlijk wordt het volledig beschermde dinucleotide of mononucleotide opgelost in pyridine gevolgd door toevoeging van triethvlamine en wordt de verkregen oplossing geschud, waarna men hem ge-35 durende verscheidene uren bij kamertemperatuur laat staan en vervolgens onder verminderde druk indampt. Het verkregen tri-ethylammoniumzout wordt opgelost in pyridine en verscheidene malen met behulp van pyridine azeotropisch ingedampt om het te drogen. Het nucleotidezout wordt opgelost in een oplossing van 40 mesityleensulfonyl-5-nitrotriazool (MSNT, condensatiemiddel) fi 5 *1 1 3 /¾ V ^ V “ » 4 l -11- in pyridine. Men voegt de verkregen oplossing toe aan het gedroogde hars en laat bij kamertemperatuur staan. Men verwijdert het vloeibare gedeelte van het reaktiemengsel en wast het harsgedeelte met pyridine en laat het vervolgens reageren met 5 azijnzuuranhydride onder toepassing van methylaminopyridine als katalysator in tetrahydrofuran-pyridine om de niet omgezette hydroxylgroep te maskeren. Tenslotte wordt het hars met pyridine gewassen om één cyclus van de vaste fase-synthese te voltooien. Door één cyclus wordt de nucleotidevolgorde met 10een of twee ketenlengten verlengd. De bovenstaande procedure wordt herhaald om achtereenvolgens mononucleotiden of dinucleo-tiden met het hars te koppelen tot de gewenste lengte, waardoor een op het hars gedragen volledig beschermd oligonucleotide verkregen kan worden.

15 Aan het verkregen hars wordt een oplossing van tetrame- thylguanidine-2-pyridinealdoximaat in pyridine-water toegevoegd en men laat het mengsel onder verwarming staan. Vervolgens wordt het hars afgefiltreerd en afwisselend met pyridine en ethanol gewassen. De wasvloeistoffen en het filtraat worden 20 samengevoegd en onder verminderde druk geconcentreerd. Het concentraat wordt opgelost in een waterige oplossing van tri-ethylammoniumbicarbonaat (TEAB) gevolgd door wassen met ether.

De waterige oplossing wordt onderworpen aan Sephadex G-50-ko-lomchromatografie onder toepassing van een TEAB-oplossing als 25 elutiemiddel. De frakties worden verzameld en de optische dichtheid van elke fraktie wordt bij 260 nm bepaald. Een fraktie met eerste elutiepiek wordt geconcentreerd. Het concentraat wordt gezuiverd, bijvoorbeeld door snelle vloeistofchromato-grafie, tot een enkele piek wordt verkregen. Het aldus ver-30 kregen oligonucleotide is op de 5'-plaats nog steeds beschermd door een dimethoxytritylgroep, zodat het produkt behandeld wordt met een waterige oplossing van azijnzuur ter verwijdering van de beschermende groep, opnieuw gevolgd door snelle vloeistof chroma togr af ie of dergelijke voor de zuivering tot een 35 enkele piek wordt verkregen.

De gewenste oligonucleotiden worden volgens de bovenbeschreven werkwijze bereid en vervolgens afzonderlijk onderzocht met betrekking tot de nucleotidevolgorde door middel van een tweedimensionale fraktioneringsmethode onder toepassing 8501380 •-Jm __ -12- jï?v' van electroforese en homochromatografie en (of) de Maxam-Gilbert-methode en daarna toegepast voor de bereiding van de blokken en ondereenheden.

De tweedimensionale fraktioneringsmethode voor het be-5 palen van nucleotidevolgorde kan uitgevoerd worden volgens de methode van Wu et al. (E.Jay, R.A.Bambara, R.Padmanabhan en R. Wu, Nucleic Acids Res., 331 (1974))-

Voor de uitvoering van deze methode wordt het oligonucleotide in gevriesdroogde toestand opgelost in gedestilleerd wa- 10 ter tot een concentratie van ongeveer 0,1 fxq/^1. Een gedeelte 32 van deze oplossing wordt behandeld met V- P-ATP en T4 poly- 32 nucleotidekinase om het 5'-uiteinde te merken met P en vervolgens gedeeltelijk gedigereerd met slangengif-fosfordiesterase. Het produkt wordt op een cellulose-acetaatfilm gedruppeld en 15 onderworpen aan electroforese voor de eerste dimensionale ontwikkeling ter scheiding van het produkt aan de hand van het verschil in de basen. De ontwikkelde produkten worden dan overgebracht op een diethylaminoethylcellulose (DEAE cellulose) plaat en onderworpen aan de tweede dimensionale ontwikkeling 20 onder toepassing van een oplossing van gedeeltelijk gehydro-lyseerd RNA, homomengsel genaamd. (Deze procedure wordt homochromatografie genoemd). Aldus wordt het oligonucleotide overeenkomstig de ketenlengte gescheiden. Vervolgens wordt de nucleotidevolgorde van het oligonucleotide vanaf het 5'-einde 25 autoradiografisch bepaald.

Wanneer het moeilijk is om de volgorde door deze methode te bepalen, wordt indien noodzakelijk gebruik gemaakt van de Maxam-Gilbert-methode. (A.M. Maxam and W.Gilbert, Proc.Natl., Acad.Sci., USA, 74, 560 (1977), A.M. Maxam en W. Gilbert, 30 Methods in Enzymol., Vol 65, blz. 499, Academie Press 1980.

Deze methode, die eveneens een chemische ontledingsmetho-de wordt genoemd, maakt gebruik van een voor een bepaalde base specifieke reaktie om het oligonucleotide te splitsen op de plaats van de base, en de door electroforese getoonde banden 35 dienen om de volgorde vanaf het 5‘- of 3'-einde te bepalen.

De voor de base specifieke reakties zijn als volgt. Guanine wordt specifiek gemethyleerd door dimethylsulfaat. Guanine en adenine ondergaan een depurineringsreaktie in de aanwezigheid van een zuur. Thymine en cytosine reageren beide met hydrazine 8501 s e 0 J» κ -13- in een lage zoutconcentratie, doch cytosine reageert alleen met hydrazine in een hoge zoutconcentratie. Na de voltooiïnq van de reakties voor de vier basen laat men elk reaktiemengsel reageren met piperidine om de base, waar de ring geopend is, 5 te vervangen, en de ^-eliminatie van beide fosfaten uit de suiker te katalyseren, en tenslotte wordt de DNA-streng bij deze base gesplitst. De verkregen reaktiemengsels worden respek-tievelijk onderworpen aan elektroforese met polyacrylamide-gel om de nucleotidevolgorde vast te stellen afhankelijk van lOwelke van de reakties elke band produceerde.

Vervolgens worden de oligonucleotiden gekoppeld met behulp van een T4 DNA ligase zoals weergegeven in fig. 2. Voor de juiste koppeling worden de 16 oligonucleotiden A-l t/m A-16 overeenkomende met de ondereenheid A verdeeld in drie stellen, 15d.w.z. het blok 1 met A-l, A-2, A-3, A-14, A-15 en A-16, het blok 2 met A-4, A-5, A-6. A-ll, A-l2 en A-13, en het blok 3 met A-7, A-8, A-9 en A-10 zoals weergegeven in fig. 2 gekoppeld. Door elektroforese worden de blokken 1 t/m 3 met de juiste volgorden verkregen en voorts gekoppeld tot de ondereenheid A.

20 Meer in het biizonder worden sommige van de 5’-einden van de 16 oligonucleotiden A-l t/m A-16 gemerkt met P met behulp van V- P-ATP en polynucleotidekinase en worden de hydroxylgroepen van de resterende 5*-einden gefosforyleerd met ATP. Ter vorming van elk van de drie blokken worden de oligonu-25 cleotiden verenigd en gekoppeld met behulp van DNA ligase, en het produkt wordt onderworpen aan electroforese op polyacryl-amidegel om het gewenste blok te isoleren. De aldus verkregen drie blokken worden gekoppeld met behulp van T4 DNA ligase ter vorming van de ondereenheid A. Hoewel een dimeerstruktuur ge-30 vormd kan worden bij de koppelingsreaktie, wordt deze gemakke-lijk gesplitst met de restrictie-enzymen EcoRI en BamHI ter verkrijging van de ondereenheid A. Vervolgens wordt, zoals weergegeven in fig. 2, een bekende plasmidevector, pBR322, die afkomstig is van E.coli en gemakkelijk verkrijgbaar is, gesplitst 35 met EcoRI en BamHI en wordt de ondereenheid A opgenomen in de vector ter verkrijging van een recombinant-plasmide pUGl.

Dezelfde procedure als hiervoor wordt eveneens toegepast voor de ondereenheid B. Evenals in het geval van de ondereenheid A worden de 16 oligonucleotiden B-l t/m B-16 verdeeld in £i c λ i -> λ ’ & ü Ö C’ (b -14- vier stellen zoals weergegeven in fig. 3 gekoppeld en worden de blokken samengekoppeld ter vorming van ondereenheid B. Het dimeer, indien gevormd, wordt gesplitst met de restrictie-enzvmen HindlII en BamKI ter verkrijging van de ondereenheid B. 5 Een plasmidevector, pBR322, wordt gesplitst met HindlII en BamHI en de ondereenheid B wordt in de vector opgenomen ter verkrijging van een recombinant-plasmide pUG2 zoals weergegeven in fig. 3.

Voorts wordt, zoals weergegeven in fig. 4, pUGl ge-lOsplitst met restrictie-enzymen HindlII en Sail en wordt een met behulp van dezelfde restrictie-enzymen uit pUG2 verwijderd fragment ppgenomen in pUGl ter vorming van een recombinant-plasmide püG3 met een p-urogastron-struktureel gen (gen II) .

pUGl, pUG2 en pÜG3 zijn recombinant-plasmiden, die elk l5pBR322 en de ondereenheid A, die de voorste helft van het jj-urogastron-strukturele gen is, de ondereenheid B, die de achterste helft van het gen is, of het gehele strukturele gen ‘ bevatten. Deze recombinant-plasmiden kunnen in grote hoeveelheden vermenigvuldigd worden door ze in een gastheer op te ne-20men zoals de stam HB101 van E.coli, die bekend en gemakkelijk verkrijgbaar is volgens de calciummethode als transformatiemethode (E.Lederberg and S.Cohen, J.Bacteriol., 119, 1072 (1974)).

Of pUGl, pUG2 en pUG3 aanwezig zijn in de gastheer, 25 zoals de stam HB1Q1 van E.coli, kan door de volgende methoden nagegaan worden. Nadat de plasmiden verzameld zijn door de alkalische extraktiemethode, worden pUGl en pUG2 gecontroleerd op de aanwezigheid van de BglII herkenningsplaats, die niet aanwezig is in de vector pBR322. Op soortgelijke wijze worden 30 püG2 en pUG3 erop gecontroleerd, of ze afgesplitst kunnen worden met Mlul, dat niet aanwezig is in pBR322.

Volgens de alkalische extraktiemethode wordt E.coli, waarin het plasmide is gehuisvest, geincubeerd, waarna de cellen verzameld worden en men er lysozym op laat inwerken om 35 de celwand op te lossen. Een mengsel van natriumhydroxyde en natriumlaurylsulfaat wordt toegepast om de cel te verbreken en het DNA vervolgens te denatureren, dat dan geneutraliseerd wordt met natriumacetaatbuffer. Hierbij blijft het chromosoom-DNA gedenatureerd, doch hij krijgt het plasmide, dat een niet 40 uit chromosomen afkomstig DNA is, de oorspronkelijke dubbele 8501880 -15- streng-vorm. Plasmiden worden verzameld door gebruik te maken van deze eigenschappen. De plasmiden worden voorts onderworpen aan ultracentrifugeren met een dichtheidsgradient met cesium-chloride en ethidiumbromide ter zuivering en vervolgens door 5 een biogel A 5Om kolom geleid om RNA te verwijderen. Zo kunnen plasmiden met een hoqe zuiverheid in een grote hoeveelheid verkregen worden. Op deze wijze kan het jj-urogastron-gen van de uitvinding (gen II) verkregen worden.

Vervolgens zal de methode voor het opnemen van het ^-uro-10 gastron-gen in gastheercellen beschreven worden.

De bij de onderhavige uitvinding toe te passen gastheercellen zijn niet bijzonder beperkt en elk van de bekende cellen is bruikbaar, bijvoorbeeld die van E.coli, Bacillus, Pseudomonas, gisten, enz., waarvan de voorkeur wordt gegeven aan E.coli-cel-15 len.

De wijzen voor het tot expressie brenqen van het p-urogas-tron-gen met behulp van E.coli omvat een systeem voor het di-rekt exprimeren van β-urogastron, en een systeem, waarin het geëxprimeerd wordt als een gefuseerd eiwit met ji-lactamase of 20 een ander eiwit.

Voor de direkte expressie van Q-urogastron-gen is het nodig om bovenstrooms van het §-urogastron-gen een promotor en een SD-volqorde in het recombinant-plasmide op te nemen. Omdat de promotor niet bijzonder beperkt is, zijn gewenste promotoren 25 degene, die in hoge mate van expressie waarborgen, zoals dat de linkse promotor van ^-bacteriofaag is, lac UV5, dat bovenstrooms van ^rgalactosidase-gen van E.coli aanwezig is, •enz. Wanneer λΡ_ toegepast wordt als promotor, is de SD-volg-orde niet bijzonder beperkt, doch het is gewenst om de vier-30 basen-volgorde van AGGA toe te passen. Voorts is het bij toepassing van LAC UV5 als promotor gewenst om de SD-volgorde toe te passen, die bovenstrooms van de LAC UV5 promotor optreedt, of degene, die chemisch gesynthetiseerd is.

Het systeem voor direkte expressie van het jjrurogastron-35 gen zal beschreven worden aan de hand van het geval, waarin λΡ^-SD volgorde-j^-urogastron-gen wordt toegepast. Hoewel λPL een krachtige promotor is (J.Hedgpeth et al., Molecular and General Genetics, 163, 197-203 (1978)) veroorzaakt de volledig qeaktiveerde -promotor lethale uitwerkinqen op de E.coli

Li "1 1 40 gastheercel, zodat het noodzakelijk is om de cel onder een van 8501880 *·» ' ___ -16- *.....· * * elke lethale werking vrije omstandigheid te vermenigvuldigen en daarna de λΡτ te laten werken. Anderzijds is CI857, dat een gen in λ bacteriofaag is, een van de gemuteerde genen van Cl repressor, die inwerkt op de operator voor λΡ^. Bij lage 5 temperaturen (tot ongeveer 30°C) bindt de CI857 repressor zich aan de operator, waardoor de aktiviteit van APT als promotor volledig geremd wordt, en dientengevolge de vermenigvuldiging van E.coli mogelijk gemaakt wordt. Dientengevolge laat men de gastheercellen zich in deze toestand vermenigvuldigen en brengt 10 ze daarna op een hoge temperatuur (niet lager dan 37°C), waardoor het ?\P in staat gesteld wordt om te werken. Voorts zijn de plasmidevectoren, zoals pSClOl, dat bekend en gemakkelijk verkrijgbaar is, met een streng replicatiemechanisme, en degene zoals pBR322 met een gematigd replicatiemechanisme, niet onver-15 enigbaar met elkaar, doch kunnen ze tezamen in dezelfde E.coli-cel bestaan.

Dientengevolge is het geschikt om een recombinant-plasmide pGH37 op te bouwen, waarin een Cl857-gen opgenomen is in een tetracvcline-resistente plasmidevector pSClOl (met lac UV5-20 promotor bovenstrooms ervan aangebracht voor de efficiënte expressie van CI857) zoals weergegeven in fig. 6, en het recombinant-plasmide op te nemen in E.coli (stam HB101) ter verkrijging van een transformant ter toepassing als gast heer voor de vector voor de expressie van β-urogastron onder 25 leiding van de λΡτ promotor.

ij

Volgens de onderhavige uitvinding wordt het λρ -SD-volg-

II

orde-^-urogastron-gen bijvoorbeeld opgenomen in pBR322 ter verkrijging van een Pj-urogastron exprimerende vector, die toegepast wordt voor de transformatie van de stam ECI-2, waardoor 30 een zogenaamd twee-plasmidesysteem wordt verkregen, waarin twee bruikbare plasmiden coëxisteren in een E.coli-cel.

Met dit systeem bindt de door pGH37 gecodeerde CI857 repressor zich aan de operator voor de ^P^-promotor op het tweede plasmide, wanneer de cel bijvoorbeeld bij 30°C wordt gekweekt, 35 waardoor de vermenigvuldiging van de cel wordt mogelijk gemaakt. Nadat de cel in deze toestand volledig vermenigvuldigd is. wordt de temperatuur bijvoorbeeld tot 40°c verhoogd, waarop de CI857 repressor van de operator gescheiden wordt, waardoor de aktiviteit van de PL~promotor voor de expressie van p-urogastron 40 wordt mogelijk gemaakt.

3501380 * * -17-

Hoewel een soortgelijk ontwerp toegepast werd voor de expressie van fibroblast-interferon, SV-40 Small t-antigeen, enz. wordt in deze gevallen een Λ-lysogeen toegepast als gastheer, waarin het DNA van K-bacteriofaag met een CI857 gen op-5 genomen wordt in het gastheer-chromosoom (R.Derynck et al, Nature, 287, 193-197 (1980), C. Derom et al, Gene, 17_, 45-54 (1982), K. Küpper et al, Nature, 289, 555-559 (1981)).

*

Met het systeem van de onderhavige uitvinding wordt het CI857 gen echter opgenomen in een verschillend plasmide, dat 10 resistent is voor tetracycline. Dientengevolge heeft het onderhavige systeem de voordelen, dat het niet waarschijnlijk is dat het in het gastheer-chromosoom opgenomen Λ-bacteriofaag tot vermenigvuldiging zal worden gebracht en de stam gemakkelijk gecontroleerd kan worden. Vanzelfsprekend wordt het twee-15 plasmidesysteem voor de eerste maal toegepast voor systemen voor de expressie van j^-urogastron.

Volgens een ander systeem wordt een gedeelte van een ander eiwit-gen zoals p-lactamase-qen gekoppeld aan het p-uro-gastron-gen om het β-urogastron-gen als een gefuseerd eiwit 20 te exprimeren. Deze methode heeft het voordeel, dat het gefuseerde eiwit minder ontvankelijk is voor ontleding door het protease in het E.coli en dientengevolge bescherminq voor het p-urogastron levert. Een ander voordeel is, dat het gefuseerde eiwit migreert naar en zich ophoopt in het periplasma in de 25 cel van E.coli (S.J.Chan et al, Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 78, 5401-5405 (1981)), plaatselijk aanwezig is, en dientengevolge gemakkelijk af te scheiden en te zuiveren is.

Meer in het bijzonder wordt een gen-codering voor twee basische aminozuren, die een splitsingsplaats kunnen leveren 30 voor de verwijdering van j^-urogastron uit het gefuseerde eiwit door splitsing met een enzym, opgenomen in het jj-lactamase-gen op een geschikte restrictie-enzym-splitsingsplaats, en wordt een p-urogastron-gen gekoppeld aan het p-lactamase-gen.

Bij voorkeur is de volgorde van de twee basische amino-35 zuren -Lys-Arg- of Arg-Lys-. Voorbeelden van enzymen voor het herkennen van de aminozuurvolgorde ter afsplitsing van J^-uro-gastron uit het gefuseerde eiwit zijn kallikreïne, trypsine, enz. Voorbeelden van restrictie-ënzymen voor het afsplitsen van het ^-lactamase-gen zijn XmnI, Hindi, Seal, Pvul, PstI, Bgll, 40 BanI, enz.

8501S80 -18-

Het aldus bereide J^j-lactamase-prurogastron recombinant-plasmide kan een gefuseerd eiwit exprimeren in E-coli voor de produktie. Het verkregen gefuseerde eiwit wordt behandeld met kallikreine of dergelijke, waardoor ^-urogastron verkregen 5 kan worden.

Het expressiesysteem kan gecontroleerd worden door direk-te analyse van de nucleotidevolgorde van het gen volgens de Maxam-Gilbert-methode, door vaststellen van de opname van het gen en de richting ervan door de mini-bereidings- of ontwerp-lOmethode (H.C. Birnboim et al.. Nucleic Acids Research, Ί_, 1513-1523 (1979)), of door radio-immunologische bepaling van p-urogastron.

De aldus verkregen transformant van de onderhavige uitvinding wordt volgens de gebruikelijke methode gekweekt, waar-15 door jïrurogastron met een hoge zuiverheid in een grote hoeveelheid verkregen kan worden.

De onderhavige uitvinding zal nu nader beschreven worden aan de hand van het volgende voorbeeld, waartoe de uitvinding op generlei wijze beperkt is.

20 Voorbeeld.

1) Bereiding van het nucieoside-dragende hars.

Verschillende nucieoside-dragende harsen werden bereid volgens de volgende methode.

Een hoeveelheid van 1 gew% verknoopt polystyreenhars 25^^111 (produkt van BIO.RAD Laboratories, U.S.A., 200 tot 400 mesh) werd gemengd met 2,41 g N-(chloormethyl)-ftadimide, 0,22 ml trifluormethaansulfonzuur en 50 ml dichloormethaan door 2 uur roeren bij kamertemperatuur. Na voltooiing van de reaktie werd het hars afgefiltreerd, achtereenvolgens met dichloorme-30thaan, ethanol en methanol gewassen, onder verminderde druk gedroogd en vervolgens gedurende 1 nacht door verwarming onder terugvloeikoeling gekookt met 50 ml van een 5 gew%'s hydrazine-oplossing in ethanol. Het hars werd afgefiltreerd, achtereenvolgens met ethanol, dichloormethaan en methanol gewassen en 35 vervolgens onder verminderde druk gedroogd. Men liet het mengsel van aldus verkregen aminomethylgroepen bevattend polystyreenhars (2,5 g), 0,75 mmol monobarnsteenzure ester van 5'- o-dimethoxytritylnucleoside, 1,23 mmol dicyclohexylcarbodiimide en 1 mmol dimethylaminopyridine 1 nacht bij kamertemperatuur 40 staan onder toevoeging van 30 ml dichloormethaan. Het hars 3591330

* V

-19- werd afgefiltreerd/ achtereenvolgens met dichloormethaan, methanol en pyridine gewassen en vervolgens ondergedompeld in pyridine-azijnzuuranhydride (volumeverhouding 90:10), waarna men het 30 minuten bij kamertemperatuur liet staan. Het ver-5 kregen nucleoside-dragende hars werd afgefiltreerd, gewassen met pyridine en dichloormethaan en onder verminderde druk gedroogd ter toepassing bij de synthesereaktie in vaste fase.

2) Synthese van dinucleotide.

Bij wijze van voorbeeld zal de synthese van een volledig 10 beschermd dinucleotide met de basevolgorde van TA beschreven worden. Adenosine (13,14 g) met de 5'-hydroxylgroep beschermd met een dimethoxytrityl (DMTr) groep en de aminogroep beschermd met een benzoylgroep, en 6,34 g triazool werden opgelost in wa-tervrije dioxan. Onder koelen met ijs werd 8,35 ml triethylamine 15 aan de oplossing toegevoegd, waarna gedurende 10 minuten druppelsgewijs 6.86 g o-chloorfenylfosfordichloridaat aan het mengsel werd toegevoegd, en het verkregen mengsel werd 2,5 uur bij kamertemperatuur geroerd.

Het gevormde triethylamine-hydrochloride werd afgefil-20 treerd, het filtraat werd geconcentreerd tot ongeveer 2/3 van het volume en 3,6 g J^-cyaanethanol en 4,8 g 1-methylimidazol werden met het concentraat gemengd door 3 uur roeren bij kamertemperatuur. Het reaktiemengsel werd onder verminderde'druk geconcentreerd. Het residu werd opgelost in ethylacetaat, driemaal 25 gewassen met een 0,1 M waterige oplossing van dibasisch natrium-fosfaat en tweemaal met water en vervolgens onder verminderde druk geconcentreerd, waardoor 19,96 g ruw produkt werd verkregen. Het produkt werd gezuiverd door chromatografie op een silicagelkolom onder toepassing van chloroform-methanol (volume-30 verhouding 98:2) als elutiemiddel. De zuivering werd herhaald ter verkrijging van 15,12 g volledig beschermd adenosine-mono-nucleotide.

Het aldus verkregen adenosine-mononucleotide (7,81 g) werd toegevoegd aan een 2 gewS's oplossing van benzeensulfon-35 zuur in chloroform-methanol (volumeverhouding 70:30) en het mengsel werd 20 minuten onder koelen met ijs geroerd en vervolgens geneutraliseerd met een waterige oplossing van natrium-waterst'of-carbonaat. De afgescheiden chloroformlaag werd met water gewassen en onder verminderde druk geconcentreerd, waar-40 door 7,11 g ruw produkt werd verkregen. Het produkt werd on- 8-501380 > 4 -20- derworpen aan kolomchromatografie op silicagel en geëlueerd met chloroform-methanol (volumeverhouding 97:3) ter verkrijging van 4,31 g adenosine-mononucleotide met een vrije 5'-hydroxylgroep.

5 Thymidine (1,64 g) met de 5'-hydroxylgroep beschermd met een dimethoxytritylgroep en 0,95 q triazool werden opgelost in 21 ml watervrije dioxan, aan de oplossing werd 1,25 ml triethyl-amine toegevoegd en aan het mengsel werd gedurende 5 minuten onder roeren en koelen met ijs druppelsgewijs 0,69 ml o-chloor-10 fenylfosfordichloridaat toegevoegd. Het mengsel werd daarna 1 uur bij kamertemperatuur geroerd. Het bij de reaktie verkregen triethylaminehydrochloride werd afgefiltreerd en het filtraat werd 10 minuten geroerd met 1,1 ml van een waterige pyridine-oplossing (1 M). Aan de oplossing werd een dioxanoplossing 15 (10 ml) van 1,17 g van het op de bovenbeschreven wijze bereide adenosine-mononucleotide met de vrije 5'-hydroxylgroep en 0,72 ml 1-methylimidazool toegevoegd, en het mengsel werd 3 uur bij kamertemperatuur geroerd. Het verkregen reaktiemengsel werd onder verminderde druk geconcentreerd, het residu werd 20 opgelost in ethylacetaat en de oplossing werd gewassen met een waterige oplossing van dibasisch natriumfosfaat (0,1M) en vervolgens met water en onder verminderde druk geconcentreerd, waardoor 2,39 g ruw produkt werd verkregen. Het produkt werd onderworpen aan kolomchromatografie op silicagel en geëlueerd 25 met chloroform-methanol (volumeverhouding 98:2) ter verkrijging van 2,39 g volledig beschermd dinucleotide TA.

Op dezelfde wijze werden verschillende nucleotriden bereid.

3) Synthese van oligonucleotide.

De synthese in vaste fase van het oligonucleotide A-l, 3Qd.w.z. undecanucleotide AATTCGAAGAT zal beschreven worden.

Een hars (40 mg) met het daarop aangebrachte en volgens de bovenstaande methode 1) bereide nucleoside T werd in een reaktievat gebracht, driemaal met dichloormethaan-isopropanol (volumeverhouding 85:15) gewassen en vervolgens behandeld met 35 een oplossing van zinkbromide (1M) in dichloormethaan-isopropanol om de dimethoxytritylgroep op de 5'-plaats te verwijderen. Deze procedure werd verscheidene malen herhaald tot de kleur van de oplossing verdwenen was. Het hars werd gewassen met di-chloormethaan, vervolgens gewassen met een oplossing van trie- 3 £? fi 1 1 9 Λ v i O i * »; -21- * * thylammoniumacetaat (0.5Μ) in dimethylformamide ter verwijdering 2+ van de resterende Zn , voorts gewassen met tetrahydrofuran en gedroogd door verscheidene minuten stikstofgas door het re-aktievat te leiden.

5 Het volledig beschermde en op de eerder beschreven wijze 2) bereide dinucleotide GA (50 mg) werd opgelost in 1 ml pyridine, geschud met 1 ml triethylamine en gedurende verscheidene uren bij kamertemperatuur met rust gelaten. De oplossing werd vervolgens onder verminderde druk ingedampt. Het residu werd IQverscheidene malen azeotropisch ingedampt met pyridine om het nucleotide om te zetten in een triethvlammoniumzout. Het zout werd opgelost in 0,3 ml van een 0,3 M oplossing van mesityleen-sulfonyl-5-nitrotriazool in pyridine. De oplossing werd toegevoegd aan het gedroogde hars, waarna men 60 minuten bij kamer-15 temperatuur liet reageren. Het vloeibare gedeelte werd uit het reaktiemengsel afgefiltreerd en het vaste gedeelte werd met pyridine gewassen, waarna men het 5 minuten liet staan in het mengsel van 0,2 ml azijnzuuranhydride en 0,8 ml van een 0,1 M oplossing van dimethvlaminopyridine in tetrahydrofuran-2Q pyridine om de niet omgezette hydroxylqroep te maskeren. Tenslotte werd het hars gewassen met pyridine, waardoor een cyclus van de vaste fase-synthese voltooid werd. Een cyclus verlengt de nucleotideketen met twee basen. Dezelfde procedure werd herhaald om achtereenvolgens de dinucleotidei AA, CG, TT en AA 25 door condensatie met het verkregen nucleotide te koppelen, waardoor het volledig beschermde undecanucleotide AATTCGAAGAT gedragen door het hars werd bereid.

Men liet het verkregen hars (20 mg) 1 uur bij 40°C staan met 0,6 ml van een 0,5 M oplossing van tetramethvlguanidine-30 2-pyridinealdoximaat in pyridine-water (volumeverhouding 90:10). Het hars werd vervolgens door een met katoen gevulde pasteur-pipet geleid en daardoor afgefiltreerd. Het hars werd afwisselend met pyridine en ethanol gewassen. De wasvloeistoffen en het filtraat werden bijeengevoegd en onder verminderde druk 35 bij 40°C geconcentreerd. Het residu werd opgelost in 2 ml van een waterige oplossing van triethylammoniumbicarbonaat (TEAB, 10 mmol). De oplossing werd driemaal met ether gewassen. De waterige fase werd overgebracht naar een Sephadex G-50 kolom (2 x 100 cm) en geëlueerd met 10 mM TEAB-oplossing. De frak- 8501880 * , jl -22- ties werden gecontroleerd op de absorptie bij 260 nm. De frak-tie met de eerste eluaatpiek werd geconcentreerd. Het residu werd onderworpen aan snelle vloeistofchromatografie (pomp: model 6000A, detector: model 440, produkten van Waters 5 Associates, U.S.A.) ter verkrijging van een gezuiverde fraktie met een enkele piek. De voor de snelle vloeistofchromatografie toegepaste kolom was ^ArBondapak C1g (produkt van Waters Associates, U.S.A.) , en een 0,1 M oplossing van triethylammo-niumacetaat in waterige acetonitril werd toegepast als elutie-10 middel voor gradient-elutie (5 —* 40 vol%) . Het aldus gezuiverde undecanucleotide was nog steeds op de 5'-plaats beschermd met de dimethoxytritylgroep, zodat de verbinding gedurende 15 minuten behandeld werd met een 80 vol%*s waterige azijnzuuroplossing om de dimethoxytritylgroep te verwijderen en vervolgens op-15 nieuw door snelle vloeistofchromatografie werd gezuiverd tot een enkele piek werd verkregen. Hiertoe werd gebruik gemaakt van dezelfde kolom als in het voorafgaande, en werd een 0-1M oplossing van triethylammoniumacetaat in waterige acetonitril toegepast voor de gradient-elutie (5 —* 25 vol%).

20 Op dezelfde wijze als in het voorafgaande werden oligo- nucleotiden A-2 t/m A-16 en B-l t/m B-16 gesynthetiseerd.

Tabel 1 toont de opbrengst van elk oligonucleotide bepaald met behulp van 20 mg van het van de vaste fase-synthese verkregen hars, door het oligonucleotide van het hars te 25 scheiden, gevolgd door verwijdering van de beschermende groep en zuivering.

De opbrengst werd berekend uit de bepaling van de absorptie van het uiteindelijke gezuiverde produkt bij 260 nm en de som van de absorptiewaarden voor de nucleotide-basen.

Ss:]? 39 0 -23-Tabel 1, A-l, 8C^g A-2, 120ug A-3, 90μδ A-4, 50μδ 5 a-5, 14C^g A-6, 70ug A-7, 80μ§ A-8, 9<teg A-9, 100μg A-10, 90μg A-ll, 110μg A-X2, 40μg A-13, 50ng A-14, 40μδ A-15, 60μg A-16, 150μg B-l, 60μg B-2, X00μg B-3, 50μg B-4, 90μg 10 B-5, 100μg B-6, 90μδ B-7, 130ug B-8, 100μg B-9, llOug B-10, 100μδ B-ll 110μg B-12, llOug B-13. 130μκ B-14, 60ug B-15, 70ug B-16, 50μg _ 15 4) Controle van de volgorde van de oligonucleotidebasen.

De volgorde werd gecontroleerd volgens de eerder genoemde tweedimensionale fraktionering door electroforese en homochroma-20 tografie van Wu et al.

Gevonden werd, dat elk van de oligonucleotiden A-l t/m A-16 en B-l t/m B-16 de gewenste nucleotidevolgorde bezaten.

Fig. 5 toont het d oor analyse van het oligonucleotide A-3 verkregen resultaat, waarbij gevonden werd, dat A-3 gezien van-25 af het 5'-einde de volgorde GATTCTGAGTG bezat.

De nucleotidevolgorde van elk oligonucleotide werd eveneens gecontroleerd volgens de eerder genoemde Maxam-Gilbert-methode.

Vastgesteld werd. dat de oligonucleotiden A-l t/m A-16 30 en B-l t/m B-16 elk de gewenste nucleotidevolgorde bezaten.

5) Opbouw van oligonucleotideblokken en ondereenheden.

De blokken en ondereenheden werden op de in fig. 2 toegelichte en hierna nader beschreven wijze bereid.

Eerst werd ongeveer 5 jAg van elk van de oligonucleotiden 35 A-l, A-2, A-3, A-14, A-15 en A-16 opgelost in gedestilleerd water (50 jJU.) ter verkrijging van een oplossing met een concentratie van ongeveer 0,1 jAg/pl. De zes soorten van waterige oplossingen werden elk in een hoeveelheid van 10 pl (1 pg berekend als DNA) afzonderlijk in zes Eppendorf-buizen gebracht.

40 Een gemengde oplossinq (6 pl) met 250 mM tris-HCl (pH 7,6), 50 mM magnesiumchloride, 10 mM spermine en 50 mM DTT werd in 85 Q1880 -24- elke buis gebracht, gevolgd door toevoeging van 0,5 pi wateri-ge y- P-ATP-oplossing (produkt van Amersham International Ltd., Engeland), 0,5 fü T4 polynucleotidekinase (produkt van Takara Shuzo Co.,Ltd., Japan) en 13 pl gedestilleerd water, ter ver-5 krijging van 30 ji1 mengsel. Men liet het mengsel 30 minuten bij 37°C reageren en vervolgens nog 30 minuten verder reageren onder toevoeging van 1 jXl waterige 30 mM ATP oplossing. De reaktie werd beëindigd door 2 minuten op 100°C te verhitten.

Het reaktiemengsel werd snel met ijs gekoeld. De oligonucleo-10 tiden A-l, A-2, A-3, A-14, A-15 en A-16 met hun aldus gefosfori-leerde 5’-plaatsen werden elk in een hoeveelheid van 10 til in êên enkele Eppendorf-buis van 1,5 ml gebracht. In de buis werd 40^1 van een waterige 250 mM tris-HCl oplossing (pH 7,6), 40yql 50 mM magnesiumchloride en 35 Hl gedestilleerd water ge-15 bracht ter verkrijging van een totale hoeveelheid van 175 gl.

Het mengsel werd 2 minuten op 90°C verhit en vervolgens geleidelijk tot kamertemperatuur afgekoeld. Onder toevoeging van 10 yu-l waterige 200 mM DTT-oplossing, 10 juJL waterige 20 mM ATP oplossing en 5 yul (100 eenheden) DNA ligase (produkt van 20 Nippon GEne Co., Ltd., Japan) liet men het mengsel 1 nacht bij 4°C reageren, waardoor het blok 1 van gekoppelde oligonucle-otiden A-l, A-2, A-3, A-14, A-15 en A-16 werd bereid.

De blokken 2 en 3 werden op soortgelijke wijze gevormd door koppeling van A-4, A-5, A-6, A-ll, A-12 en A-13 en door 25 koppeling van A-7, A-8, A-9 en A-10.

Ethanol werd in een tweemaal zo grote volumehoeveelheid toegevoegd aan het reaktiemengsel van de aldus bereide blokken en men liet het mengsel 30 minuten bij -80°C staan om DNA neer te slaan, gevolgd door electroforese op een 12,5 gew%'s polv-30 acrylamidegel en autoradiografie. Dit leidde tot banden op de plaatsen van 72 b.p. (basenpaar) en 36 b,p. voor het blok 1, een band op de plaats van 36 b.p. voor het blok 2 en banden op de plaatsen van 48 b.p. en 24 b.p. voor het blok 3. Vervolgens werd elke band uitgesneden en werd een mengsel van 10 mM 35 tris-HCl (pH 7,6) en 10 mM EDTA in waterige oplossing (tris-EDTA) eraan toegevoegd. Men liet het mengsel vervolgens 1 nacht bij kamertemperatuur staan ter extraktie. Het verkregen mengsel werd gecentrifugeerd, de bovenstaande vloeistof werd afgescheiden en de bovenstaande vloeistof werd grondig geschud met 8501380

1 -V

-25- raet tris-EDTA verzadigde fenol en vervolgens gecentrifugeerd om de onderste laag te verwijderen. Dezelfde procedure werd tweemaal herhaald met met tris-EDTA verzadigde fenol. Tenslotte werd de bovenste laag door een met Sephadex G-50 gepakte kolom 5 met een diameter van 1 cm en een lengte van 20 cm geleid om de fenol en acrylamide te verwijderen. Het eluaat werd vervolgens geconcentreerd tot 200 yu.1, waarna men het 30 minuten bij -80°C liet staan met een tweemaal zo grote volumehoeveelheid ethanol om DNA neer te slaan.

10 De drie verkregen blokken werden gecombineerd. Aan het mengsel werd 50 mM tris-HCl (pH 7,6) , 10 mM magnesiumchloride, 20 mM DTT, 1 mM ATP en 5^ul (100 eenheden) T4 DNA ligase toegevoegd. Men liet het verkregen mengsel 1 nacht bij 4°C staan voor de koppeling. Aan het mengsel werd tweemaal het volume 15 aan ethanol toegevoegd en men liet het mengsel 30 minuten bij -80°C staan om DNA neer te slaan, gevolgd door electroforese op 8 gew%'s polyacrylamidegel en autoradiografie, waardoor banden bij 96 b.p. en 192 b.p. werden getoond. Elke band werd uitgesneden en tris-EDTA werd eraan toegevoegd, en men liet het 20 mengsel 1 nacht bij kamertemperatuur staan ter extraktie. Het mengsel werd gecentrifugeerd om de bovenstaande vloeistof af te scheiden, de bovenstaande vloeistof werd grondig geschud met met tris-EDTA verzadigde fenol, en de onderste laag werd weggegooid. Deze procedure werd tweemaal herhaald met verdere 25 toevoeging van met tris-EDTA verzadigde fenol. De bovenste laag werd door een Sephadex G-50 kolom geleid, het eluaat werd geconcentreerd en aan het concentraat werd tweemaal het volume aan ethanol toegevoegd, gevolgd door 30 minuten laten staan bij -80°C om DNA neer te slaan. Het verkregen produkt werd ge-30 splitst met EcoRI en BamHI ter verkrijging van de ondereenheid A.

Dezelfde procedure als in het voorafgaande werd herhaald zoals getoond in fig. 3 om oligonucleotiden B-l, B-2, B-15 en B-16 te koppelen tot het blok 4, oligonucleotiden B-3, B-4, 35 B-13 en B-15 te koppelen tot het blok 5, oligonucleotiden B-5, B-6, B-ll en B-12 te koppelen tot het blok 6 en oligonucleotiden B-7, B-8, B-9 en B-10 te koppelen tot het blok 7. De blokken overeenkomende met 26 b.p. en 52 b.p. werden verzameld en op soortgelijke wijze gekoppeld ter vorming van produkten met 40104 b.p. en 208 b.p., die gesplitst werden met HindïII en BamHI.

p S .0 t ,Q μ o -26-

Aldus werd de ondereenheid B verkregen.

6) doneren van ondereenheden en analyse van recombinant-plasmiden.

Onder verwijzing naar fig. 2 werd pBR322 gesplitst met 5 EcoRI en BamHI en werden fosfaatgroepen met alkalisch fosfa-tase (produkt van Takara Shuzo Co. .Ltd.,Japan) verwijderd van de 5'-einden, om de oorspronkelijke toestand niet te herstellen. Vervolgens liet men het aldus gesplitste en gedefosforv-leerde pBR322 en de ondereenheid A 1 nacht bii 4°C in een meng-lOsel van 50 mM tris-HCl (pH 7,6), 10 mM magnesiumchloride, 20 mM DTT en 1 mM ATP met toevoeging van 5^1 DNA ligase staan, waardoor ze gekoppeld werden. Aan het reaktiemengsel werd tweemaal het volume aan ethanol toegevoegd en men liet het mengsel 30 minuten bij -80°C staan ter precipitatie. Het mengsel werd 15 vervolgens gecentrifugeerd, het neerslag werd gedroogd en opgelost in 100^41 gedestilleerd water, waardoor een plasmide pUGl werd verkregen, waarin de ondereenheid A opgenomen was in pBR322.

De E.coli stam HB101 werd getransformeerd met het plasmide 20 püGl volgens (Je calcium-methode.

De als gastheer dienende stam HB101 werd bij 37°C gekweekt in 50 ml LB kweekmedium (1 gew% bactotrypton, 0,5 gew% gist-extrakt en 0,5 gew% natriumchloride) . Wanneer de absorptie bij 610 nm 0,25 bereikte, werd een hoeveelheid van 40 ml van de 25 kweekvloeistof overgebracht in een centrifugebuis en 10 minuten bij 4°C met 6000 rpm gecentrifugeerd. De bovenstaande vloeistof werd weggeworpen, het neerslag werd gesuspendeerd in 20 ml met ijs gekoelde 0,1 M magnesiumchlorideoplossing, de suspensie werd opnieuw onder dezelfde omstandigheden gecentri-30 fugeerd en de bovenstaande vloeistof werd weggeworpen.

Het neerslag werd gesuspendeerd in 20 ml van een met ijs gekoelde oplossing van 0,1M calciumchloride en 0,05M magnesiumchloride en 1 uur met ijs gekoeld. De suspensie werd gecentrifugeerd, de bovenstaande vloeistof werd verwijderd en het neer-35 slag werd gesuspendeerd in 2 ml van een met ijs gekoelde oplossing van 0,1M calciumchloride en 0,05M magnesiumchloride. Aan een hoeveelheid van 200^111 van de suspensie werd 10 /Jl waterige oplossing van püGl toegevoegd en het menasel werd 1 uur met ijs gekoeld en vervolgens 30 seconden in een waterbad op 43,5°C

8501330 -27- verwarmd. Vervolgens werd 2,8 ml LB kweekmedium aan het mengsel toegevoegd, gevolgd door 1 uur incubatie bij 37°C. De kweek werd vervolgens uitgespreid over een LB plaat met 50/üg/ml am-picilline in een hoeveelheid van 200 /4l/schaal en 1 nacht 5 bij 37°C geincubeerd. De groeiende kolonies werden gecontroleerd door verdere transplantatie op een LB plaat met 50 /*-g/ml ampicil- - r line en eveneens op een LB plaat met 20 g/ml tetracycline en werden 1 nacht bij 37°C geincubeerd. Alleen de ampicilline -resistente kolonies werden afgescheiden ter verkrijging van een 10 getransformeerde cel.

Plasmiden werden uit de cel verzameld op kleine schaal door middel van de alkalische extraktiemethode en gecontroleerd op de aanwezigheid van een BG1II splitsingsplaats. Een van de cellen met het plasmide met een BglII splitsingsplaats werd 15 op grote schaal gekweekt om op soortgelijke wijze gezuiverd plasmide pÜGl met behulp van de alkalische extraktiemethode te verkrijgen.

De nucleotidevolgorde van de in het Verkregen pÜGl opgenomen ondereenheid A werd aan beide strengen geanalyseerd 20 met behulp van de eerder genoemde Maxam-Gilbert-methode.

De foto's 1 en 2 tonen de resultaten van de analyse.

De banen 1 t/m 4 zijn het resultaat van de electroforese voor het EcoRI - Sail fragment en de banen 5 t/m 8 voor het BamHI-Pstl fragment. De banen 1 en 5 tonen de reaktieprodukten voor 25 guanine, de banen 2 en 6 de reaktieprodukten voor guanine + adenine, de banen 3 en 7 tonen de reaktieprodukten voor thymine + cytosine en de banen 4 en 8 tonen de reaktieprodukten voor cytosine. Foto 2 toont de met behulp van dezelfde monsters verkregen resultaten, waarin een gebied van het gedeelte met 30 een hoger molecuulgewicht (overeenkomende met het bovenste gedeelte van foto 1) is vergroot. Aldus werd de nucleotidevolgorde van de ondereenheid A vastgesteld.

Onder verwijzing naar fig. 3 werd het plasmide pBR322 gesplitst met HindlII en BamHI en werd het grotere fragment 35 met behulp van electroforese geïsoleerd en aan de ondereenheid B gekoppeld. Aldus werd een plasmide pUG2 verkregen, waarin ondereenheid B op soortgelijke wijze als in het geval van pÜGl opgenomen was in pBR322. Onder toepassing van het verkreqen plasmide pUG2 werd de stam HB101 getransformeerd en werden uit- 8501880 -28- sluitend de ampicilline-resistente kolonies geselekteerd. Plas-miden werden uit de kolonies verzameld en vervolgens gecontroleerd op de aanwezigheid van een BglII splitsingsplaats en een Mlul splitsingsplaats, De cellen met het plasmide met beide 5 plaatsen werden geselekteerd. Eén van de geselekteerde cellen werd op grote schaal gekweekt ter verkrijging van gezuiverd plasmide pUG2. De nucleotidevolgorde van de ondereenheid B in pUG2 werd aan beide strengen geanalyseerd met behulp van de Maxam-Gilbert-methode.

10 Foto 3 toont de resultaten van de analyse, De banen 1 t/m 4 tonen het door het HindlII-SalI fragment verkregen resultaat. De banen 5 t/m 8 tonen het met hetzelfde monster verkregen resultaat, waarin een gebied van het gedeelte met hoger molecuulgewicht (overeenkomende met het bovenste gedeelte van 15banen 1 t/m 4} op vergrote schaal is getoond. Elke baan toont hetzelfde overeenkomende reaktieprodukt als op foto 1. Aldus werd de nucleotidevolgorde van de ondereenheid B vastgesteld.

Vervolgens werd onder verwijzing naar fiq. 4 püGl gesplitst met HindlII en Sail en werd een groter fragment afgescheiden 20met behulp van een biogelkolom van 1,5 m. pUG2 werd gesplitst met HindlII en Sail, gevolgd door elektroforese ter verkrijging van een kleiner fragment. De twee fragmenten werden gecombineerd en behandeld met T4 DNA ligase voor de koppeling, waardoor het plasmide pUG3 werd verkregen, waarin de ondereen-25heden A plus B, d.w.z. 0-urogastron-gen, opgenomen was in pBR322.

De E.coli stam HB101 werd met behulp van het plasmide pUG3 getransformeerd. De transformant is gedeponeerd volgens het verdrag van Budapest met betrekking tot internationale erkenning van depöts onder het nummer FERM BP 543 bij het Fermentation 30Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry, Japan.

In het bovenstaande geval werden eveneens de cellen, die uitsluitend ampicilline-resistentplasmide pUG3 met een Mlul splitsingsplaats huisvesten, geselekteerd-Eën van de geselek-35teerde cellen werd op grote schaal gekweekt ter verkrijging van gezuiverd plasmide pUG3. De nucleotidevolgorde van het 5~uro-gastron-gen in püG3 werd aan beide strengen geanalyseerd met behulp van de Maxam-Gilbert-methode.

Foto 4 toont de resultaten van de analyse. De banen 1 40t/m 4 tonen het met het BamHI-PstI fragment verkregen resul- 353 1 8 3 0 ' ** * .* -29- taat. De banen 5 t/m 8 tonen het met hetzelfde monster verkregen resultaat, waarin een gebied van het gedeelte met hoger molecuulgewicht (overeenkomende met het bovengedeelte van de banen 1 t/m 4) op grote schaal getoond is. De reaktieprodukten 5 van de banen zijn dezelfde als de overeenkomstige produkten op foto 1. De analyse bevestigde de nucleotidevolgorde van het ^-urogastron-gen.

7) Expressievector met \pL-promotor.

De λP_-promotor, de linkse promotor van λ-bacteriofaag, lOwerd toegepast voor het exprimeren van 0-urogastron, zoals hierna nader beschreven zal worden.

Eerst zal de bereiding van een stam ECI-2 afgeleid van E.coli-stam HB101 beschreven worden. ECI-2 diende als gastheer voor"X-P expressieplasmiden. Vervolgens zal het doneren van 15 een DNA fragment metAP^ promotor vanuit het DNA van A-CI857Sy, dat een mutant van A-bacteriofaag is, en de opbouw van expres-sieplasmiden uit het gedoneerde DNA beschreven worden. Voorts zal de expressie van ly-urogastron-gen in de ECI-2 gastheerstam door de ΛΡ^-promotor beschreven worden.

20 7-1)Opbouw van de stam ECI-2.

De stam ECI-2 is E.coli HB101, dat een plasmide pGH37 voor de expressie van CI857-gen huisvest.

pGH37 werd volgens de in fig. 6 getoonde werkwijze bereid. Eerst werd DNA van ACI857Sy gesplitst met BglII. Vervol-25 gens werden de samenhangende uiteinden op de splitsingsplaats gedigereerd met behulp van SI nuclease. Men liet 1 /tig met BglII gesplitst DNA van Xci857S^ 30 minuten bij 20°C reageren met 200 eenheden SI nuclease in 100/Ml van een waterige oplossing (pH 4,5), die 200 mM natriumchloride, 30 mM natriumace-30taat en 5 mM zinksulfaat bevatte. De aldus verkregen DNA fragmenten met stompe uiteinden werden onderworpen aan een elek-troforese met 1,0 gew% agarosegel om daaruit een fragment met 2385 b.p. met het gehele CI857 structurele gen te isoleren. Het fragment werd opgenomen op de PvuII splitsingsplaats van 35 plasmiden pGLIOl ter vorming van een plasmide pGH36, dat het CI857-gen exprimeert onder leiding van een promotor, lac UV5. Vervolgens wordt pGH36 gesplitst met twee restrictie-enzymen, EcoRI en PstI, ter verkrijging van een fragment met 1193 b.p., dat opgenomen werd in een plasmide pSClOl tussen de EcoRI en 8501880 -30-

Pstl splitsingsplaatsen ter vorming van een plasmide pGH37.

Vervolgens werd de stam HB101 van E.coli getransformeerd met pGH37 volgens de eerder genoemde calcium-methode. Een van de verkregen stammen werd ECI-2 genoemd. De stam ECI-2 is 5 volgens het verdrag van Budapest met betrekking tot internationale erkenning van depóts onder nummer FERM BP 542 gedeponeerd bij het Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry, Japan. Deze stam is resistent voor tetracycline, lQexprimeert het CI857 gen en maakt een gelijktijdige aanwezigheid, door transformatie, van andere plasmiden mogelijk, die bijvoorbeeld afgeleid zijn uit pBR322. Dientengevolge werd de stam ECI-2 vervolgens als gastheer voor AP^expressieplasmiden toegepast.

15 7-2) doneren van λP^-promotor en bereiding van expressieplas-miden-

Zoals toegelicht in fig. 7 werd eerst pGH35 gevormd. DNA van Cl857Sy werd gesplitst met EcoRI en Sail ter verkrijging van een fragment met 5925 b.p., dat de λPL~promotor en het 20 CI857 gen alsmede >PR-promotor bevat. Het fragment werd opgenomen in het plasmide pBR322 tussen de EcoRI en Sail splitsingsplaatsen ter vorming van een plasmide pGH25.

Vervolgens werd pGH25 gesplitst met BamHI en gekoppeld aan op soortgelijke wijze met BamHI gesplitst pBR322 ter ver-25 krijging van pGH34.

Vervolgens werd pGH34 gesplitst met Aval en BglII en daarna behandeld met SI nuclease ter vorming van een fragment met een stomp uiteinde van ongeveer 4500 b.p. Het fragment werd tot een ring gevormd met T4 DNA ligase ter vorming van een plas-30 mide pGH35.

Vervolgens werd zoals weergegeven in fig. 8 pEK28 opgebouwd. Synthetische oligonucleotiden C-l-1 en C-l-2 als adaptor, die een SD-volgorde en de hierna vermelde nucleotide-volgorde bevatten, werden gekoppeld aan het fragment, dat ver-35 kregen was door splitsing van pGH35 met Hpal. De combinatie werd voorts gekoppeld aan het met BamHI gesplitste plasmide pMC1403 ter verkrijging van plasmide pEG2. Het pËG2 bezit twee ampicilline-resistente genen en exprimeert van pMC1403 afgeleid Ppgalactosidase-gen onder leiding van ΛΡ -promotor

II

8501380 A t -31- onder toepassing van een startcodon alsmede de SD-volgorde in de adaptor.

De fragmenten C-l-1 en C-l-2 bezitten de volgende nucle-otide-volgorde.

5 SD-volgorde Start-codon.

C-l-1: 5' A G G A A C a|G A T C T A T G 3* C-l-2:3'T C C T T G T C T A g|a TACCTAG 5'

Bglll

De methode van Miller werd toegepast om de expressie van lOÜrgalactosidase in de gastheer ECI-2 van het plasmide pEG2 vast te stellen (Miller, J. (1972) "Experiments in Molecular Genetics" New York, Cold Spring Harbor Laboratory pp352-355.

Deze methode is gebaseerd op de reaktie van ζ-galactosidase met een synthetisch substraat ONPG (o-nitrofenylgalactoside) 15om een gele verbinding o-nitrofenol vrij te maken. De methode van Miller zal nader beschreven worden. Een hoeveelheid van 0,1 ml van een kweek van een bacteriesoort, waarvan de absorptie gemeten is bij 610 nm, wordt gemengd met 1,9 ml van een proef-buffer (0,1 M natriumfosfaat, pH 7,0, 1 mM magnesiumsulfaat en 200,1 M $-mercapto~ethanol) en 15 seconden krachtig geschud met 0,1 ml tolueen om de permeabiliteit van de bacteriesoort te verhogen. De tolueen wordt daarna afgedampt door middel van een aanzuiger. Met toevoeging van 0,2 ml ONPG oplossing (oplossing van 400 mg ONPG in 100 ml proefbuffer) wordt het mengsel bij 2530°C geincubeerd tot zich een gele kleur ontwikkelt, waarna 0,5 ml 1 M natriumcarbonaat toegevoegd wordt om de enzymreak-tie te stoppen. De absorptie van het reaktiemengsel wordt bij 420 nm en 550 nm gemeten.

De aktiviteit van 5-galactosidase wordt gedefinieerd 30 door de eenheden in 1 ml van de kweekvloeistof volgens de onderstaande vergelijking, waarbij de absorptie bij 610 nm berekend is als 1,0.

Aktiviteit van 6- OD._n - 1,75 x OD_ςη galactosidase-® - x 1000 35[eenheden) t x v x ODg10 t : incubatietijd (minuten) v : aan het reaktiesysteem toeqevoegde hoeveelheid monster (0,1 ml) ODg20: al3SOrPtie bij 610 nm van het monster.

40 Bij uitvoering van de bovenstaande methode werd het vol- 3531880 -32- gende resultaat verkregen. Wanneer de pEG2 herbergende stam ECI-2 bij 30°C werd geincubeerd, bedroeg de β-galactosidase-aktiviteit 98 eenheden. Wanneer de kweek echter verder gedurende 1 uur bij 42°C werd geincubeerd, werd de ΛΡ--promotor 5 geaktiveerd met als resultaat een β-galactosidase-aktiviteit van 9637 eenheden. Dit bevestigt, dat de volgorde van de λΡ -

L

promotor tot β-galactosidase de gewenste volgorde is.

Hoewel pEG2 twee BglII splitsingsplaatsen bezit, is slechts de onmiddellijk na de SD-volgorde van t)-galactosidase 10aanwezige BglII plaats noodzakelijk, terwijl de andere plaats ongewenst is. Dientengevolge werd het plasmide met BamHI gesplitst en opnieuw gekoppeld ter verwijdering van een fragment met ongeveer 770 b.p. Aldus werd de opbouw van pEK28, dat een expressieplasmide met toepassing van λΡτ-promotor is, voltooid.

ij 15 7-3) Expressie van gefuseerd gen van de voorste helft van β-urogastron en ^-galactosidase.

Fig. 9 toont schematisch de reeks van de hierna beschreven procedures.

Een plasmide pUGlOl werd op de volgende wijze opgebouwd.

2Q Dit plasmide is een gefuseerd gen van de voorste helft van β-urogastron en een β-galactosidase. Meer in het bijzonder werd pUGl, dat de voorste helft van ty*urogastron-gen bevat, en pMC14Q3 met een Vgalactosidase-gen gesplitst met BamHI en vervolgens gekoppeld ter vorming van pUGlOl. Met dit plasmide zijn 25 de voorste helft van het β-urogastron-gen en het 5-galactosidase-gen in hetzelfde frame gekoppeld. Dientengevolge exprimeert het plasmide de aminozuurvolgorde van de twee als een gefuseerd eiwit.

Voor de expressie met dit plasmide onder leiding van de 30 λ P^-promotor, werden pUGlOl en pEK28 elk gesplitst met BglII.

De splitsing met BglII levert.een DNA-fragment met uitstekende 51 -einden in de vorm van l· ’ *^Ctac^ * Wanneer men liet DNA-fragment echter laat reageren met een groot fragment van E.coli DNA polymerase I (Klenow fragment) in aanwezigheid van 35 de vier soorten deox—ribonucleotide-trifosfaten dGTP, dATP, dTTP en dCTP, wordt een stomp uiteinde verkregen door opvullen met de overeenkomstige nucleotiden, die het uiteinde /...AGATC] \. . . TCTAG/ vormen. Wanneer alleen dGTP wordt toegevoegd als nucleotide-bestanddeel, wordt het uiteinde ’*TCTA(^ verkregen tengevolge Λ ;· , p I Λψ * » -33- van de beëindiging van de reaktie. Vervolgens, wanneer Sl-nucle-ase wordt toegepast voor het digereren van de resterende enkele streng, wordt een stomp uiteinde in de vorm van ( ver kregen. Op soortgelijke wijze wordt, wanneer dGTF en dATP toe- 5 gevoegd worden bij de Klenow-reaktie, gevolgd door digereren ? aga\ met Sl-nuclease, l'TCT/ ver^re?en· Wanneer de Klenow-reaktie uitoevoerd wordt door toevoecinc van dGTP, dATP en cLTTP, ge- (AGATi TCTAJverkre9en·

Voorts wordt, wanneer alleen het digereren met Sl-nuclease 10 wordt uitaevoerd zonder uitvoering van de Klenow-reaktie, / A\ (*'’ verkregen. Wanneer derhalve het DNA fragment met het uit- \ ···* / / a \ einde I' * *Tctag) on<^erworPen wordt aan de Klenow-reaktie met gebruik' van verschillende nucleotiden en/of aan de Sl-nuclease -reaktie, worden vijf soorten stompe uiteinden verkregen, die 15 van elkaar verschillen door de lengte van een basenpaar.

De Klenow-reaktie en Sl-nuclease-reaktie werden onder de volgende omstandigheden uitgevoerd. x Klenow-reaktie:

Men liet 1 yt>g DNA als substraat reageren met 1 mM van elk 20 desoxyribonucleotidetrifosfaat gedurende 30 minuten bij 12°C in aanwezigheid van 1 eenheid van het enzym (Klenow-fragment) en 1 mM ATP in 50 /cl van een reaktiemedium, dat 40 mM kalium-fosfaatbuffer (pH 7,4) , 1 mM p-mercapto-ethanol en 10 mM magne-siumchloride bevat.

25 x Sl-nuclease-reaktie:

Men liet 1 ydg DNA als substraat en 200 eenheden van het enzym gedurende 30 minuten bij 20°C reageren in 100 ^ql van een reaktiemedium, dat 200 mM natriumchloride, 30 mM natriumacetaat en 5 mM zinksulfaat bevat (pH 4,5).

30 pEK28 en pUGlOl werden elk gesplitst met BglII en ver volgens onderworpen aan verschillende combinaties van de Klenow-reaktie en de Sl-nuclease-reaktie, waardoor fraqmenten met vijf soorten stompe uiteinden verkregen werden. Bij combinatie van de twee typen van deze fragmenten werden 21 combinaties 35 verkregen, die van elkaar verschilde in het aantal en de volgorde van de nucleotiden tussen de SD-volgorde en het startco-don van het gefuseerde eiwit, zoals vermeld in tabel 2.

In de praktijk werden de aldus verkregen DNA-fragmenten gesplitst met Sail ter isolatie van fragmenten, die het gen 4Q bevatten, dat codeert voor gefuseerd eiwit van de voorste 8501380 v . ï ________________.

-34- jP)-urogastrenhelft en jg-galactosidase uit pUGlOl, en fragmenten met "X-P^-promotor uit pEK28. Deze fragmenten werden gekoppeld door T4 DNA ligase in de in tabel 2 vermelde combinaties.

Dientengevolge werden de recombinant-plasmiden in tabel 5 3 verkregen. De β-galactosidase-aktiviteit van de geëxprimeerde gefuseerde eiwitten werd gemeten volgens methode van Miller. Tabel 3 toont, dat alle geëxprimeerde plasmiden een betrekkelijk hoog niveau van p-galactosidase-aktiviteit bezitten. In het bijzonder p”G103, pUG104 en pUG117 bereikten opmerkelijke re-lOsultaten.

Tabel 2.

Nucleotide-volgorde bovenstrooms van het start-codon (ATG)_ __ATCTGC-_GATCTGC_ -ACA -ACAATCTGC- -ACAGATCTGC- 15 (pUG105) (pUG106) -ACAG - -ACAGGATCTGC- volgorde bene- _(pgG110) denstrooos van _ACAGA -ACAGAATCTGC- -ACAGAGATCTGC- SD-volgorde 20 CAGGA} (PÜG113) (pUGll4) -ACAGAT -ACAGATATCTGC- -ACAGATGATCTGC- (püG117) (pUGH8) -ACAGATC -ACAGATCATCTGC- -ACAGATCGATCTGC- 25 (PÜG121) (pUG122) t _Nucleotide-volgorde bovenstrooms van het start-codon (ATG) TGC- CTGC- TCTGC- -ACA -ACATGC- -ACACTGC- -ACATCTGC- 30 (pUG102) (pUG103) (püGl04)

Nucleotide- ~ -ACAG -ACAGTGC- -ACAGCTGC- -ACAGTCTGC- beneden- (püG107) (püG108) (pUG109) strooms van; cn-tj-ni,__T-ACAGA -ACAGATGC- -ACAGACTGC- de SgS)* tfOSlll) (gOCl»)_ 35 -ACAGAT -ACAGATTGC- - -ACAGATTCTGC- (dUG115) (pUG116) -ACAGATC - -ACAGATCCTGC--ACAGATCTCTGC- Λ ' (PUG119) (püGl20) -,·*>-! * , O pi «*- ··.» - J 5 w *» * -35-Tabel 3.

Aantal nucleotiden tussen de SD-volg- orde en het start- Recombinantplasmide j^-Galactosidase codon (eenheden) 5 6 PÜG102 1674 7 pUG103 2533 7 püGl07 2260 8 pUGl04 2802 8 DÜG108 1835 10 9 PÜG105 1018 9 püG109 1942 10 pUGl06 973 11 pUGllO 1764 11 püGH3 1950 15 11 pUGll9 1862 12 püGH4 946 12 pUGl17 2332 12 pUG120 1374 13 PÜG118 2041 20 13 püG121 1678 14 PÜG122 1814

Vervolgens werd een vector voor de expressie van fj-urogas-tron bereid uit pUG103 of pUG117. Het plasmide (pUG103 of 25PÜG117) werd gesplitst met HindlII en PvuII ter verkrijging van een fragment van 1/2 kb, dat het gebied van λρ -promotor tot li de voorste helft van ji-urogastron-gen bevatte. Voorts werd pUG2 gesplitst met EcoRI, aangevuld met een Klenow-fragment en gesplitst met HindlII ter verkrijging van een fragment van 4,1 kb. 30 De twee fragmenten werden gekoppeld met T4 DNA ligase, en de stam ECI-2 van E-coli werd getransformeerd volgens de eerder genoemde calcium-methode ter verkrijging van een recombinant, die het plasmide PÜG103-E of pUG117-E bevat voor de expressie van de combinatie van de voorste helft en de achterste helft 35van het Prurogastron-gen, d.w.z. het gehele Ppurogastron-gen, onder leiding van λPT-promotor.

8) Vector voor de expressie van gefuseerd eiwit.

Een Pj-lactamase-gen op het plasmide pBR322 en een 9-uro-gastron-gen werden gekoppeld voor het exprimeren van 13-urogas- 8501880 , * -36- tron als gefuseerd eiwit, zoals hierna beschreven zal worden.

8-1) Donor van 3^-lactamase-gen.

pBRH02 wordt verkregen door splitsen van pBR322 met Aval en PvuII, gevolgd door de Klenow-reaktie en koppeling door 5 T. DNA ligase. Dit plasmide bezit genen voor axnpicilline-resis-

^ R R

tentie (Ap ) en tetracycline-resistentie (Tc ) als markeringen.

pBRH03 wordt verkregen door splitsen van pBR325 met Aval en

HindlII, gevolgd door de Klenow-reaktie en koppeling en bevat

R R

Ap en chloorampfenicol-resistentie (Cm ) als markeringen. Fig.

1010 toont deze plasmiden.

8-2) Donor van Ppurogastron-gen.

Op de reeds beschreven wijze bereid pUG3 werd gesplitst met MboII ter verkrijging van 13 soorten DNA-fragmenten, die A t/m M genoemd werden in de volgorde van afmeting zoals weer-15gegeven in fig. 11. Van deze DNA-fragmenten werd gevonden, dat het H-fragment bestond uit 179 b.p. beginnend met een voor asparaginecoderend nucleotide aan het N-uiteinde van 5-urogas-tron en eindigend met 16 basen benedenstrooms van het stopcodon, waarbij het fragment het gehele strukturele gen van §-urogastron 2Qbevat. Om het Η-fragment te isoleren werden de fragmenten onderworpen aan electroforese met 6 gew%'s polyacrylamidegel en werd het fragment gezuiverd.

8-3) Adaptor.

Als adapteren werden de in tabel 4 vermelde oligonucleo-25tiden op de reeds eerder beschreven wijze bereid. Deze adaptoren werden zo ontworpen, dat ze coderen voor het basische aminozuur-paar van Lys-Arg of Arg-Lys voor het enzymatisch afsplitsen van jjj-urogastron uit het geëxprimeerde gefuseerde eiwit.

8^0*3 ga

V V > -.V M V

-37-

Tabel 4.

Adaptor 5 ' einde - 3 ' einde

D-l-3 CCGTAAG

D-l-4 TTACGG

D-2-1 CGTAAG

D-2-2 TTAGG

D-3-2 TTACGGAT

D-4-2 TTACGTGCA

E-l CGCTAAACGG

E-2 CGTTTAGCG

E“3 GACAAACGG

E-4 CGTTTGTC

E-5 CGTTTAGCGAT

E-6 CGTTTGTCTGCA

E-7 CGGCTAAACGG

E-8 CGTTTAGCCG

E-9 CAAACGG

E-10_CGTTTG_ fΛ -i i 'i 8 a Λ * -38- 8-4) Systeem voor de expressie van gefuseerd eiwit van p-lactamase en β-urogastron verbonden door Lys-Arg.

Een vector voor de expressie van lact amase-fr-urogas tron -gefuseerd eiwit werd zodanig bereid, dat een herkenningsvolg-5 orde voor restrictie-enzym gevormd zou worden in het gebied, dat een adaptor bevat.

8-4-a) Opbouw van pUG2301 t/m pUG2303.

De in fig. 12 weergegeven werkwijze werd uitgevoerd.

Het plasmide pBRH02 werd gedurende 3 uur bij 37°C volle-10 dig qesplitst met XmnI. Vervolgens werden 3/Ug van de vector, ongeveer 0,1 /a.g β-urogastronfragment van 179 b.p. en ongeveer l/Hg van zowel E-l als E-2 (met niet-gefosforyleerd 5'-uiteinde) als adaptor in een enkele trap gedurende 15 uur bij 12°C gekoppeld ter verkrijging van plasmiden als expressievector. De stam 15 HB101 werd getransformeerd met behulp van de plasmiden volgens de calcium-methode.

Van de verkregen 499 Tc kolonies waren 168 kolonies

C

(33,7%) Ap . Deze kolonies werden door mini-bereiding gecontroleerd op de afmeting van het plasmide DNA. Dertien plasmiden 20 waren ongeveer 200 b.p. groter dan de vector en werden verondersteld een daarin opgenomen p-urogastron-gen te bevatten. Alle plasmiden met een Mlul-plaats werden gesplitst met Hinfl en gecontroleerd op de oriëntatie van de opname van het Pj-urogastrongen door middel van elektroforese met 1,5 gew%'s agarose-gel.

25 Drie van de gecontroleerde plasmiden gaven fragmenten van ongeveer 1050 b.p. en ongeveer 800 b.p. Dit toonde, dat het β-uro-gastron-gen opgenomen was met dezelfde oriëntatie als p-lactamase. Deze drie plasmiden werden pUG2301 t/m pUG2303 genoemd.

8-4-b) Opbouw van pUG2101 t/m püG2l05.

30 De in fig. 13 weergegeven werkwijze werd uitgevoerd.

Het plasmide pBR322 werd toegepast als plasmidevector met een enkele Pvul plaats in het jj-lactamase-gen. Volgens de in 8-4-a) beschreven werkwijze werd een expressievector gevormd onder toepassing van E-l en E-5 als adaptor.

35 Wanneer de verkregen 1626 Tc -kolonies gecontroleerd wer-

C

den op Ap-gevoeligheid, waren 31 kolonies (1,9%) Ap . Een mini-bereiding werd uitgevoerd voor de 22 Tc en Ap kolonies en de plasmiden werden gecontroleerd op de opname van ^“urogastron-gen door splitsing van Mlul. Gevonden werd, dat twintig plasmiden S591830 *· κ -39- een Mlul plaats bezaten. De oriëntatie werd gecontroleerd door splitsen met Hinfl of BamHI. Gevonden werd, dat de plasmiden PÜG2101 t/m püG2105 een daarin opgenomen 0-urogastron-gen met dezelfde oriëntatie als het Q-lactamase-gen bevatten.

5 8-4-c) Opbouw van pUG2701 t/m pUG2703.

Expressieplasmiden werden gevormd volgens dezelfde methode als 8-4-a) onder toepassing van pBR322 als vector en E-7 en E-8 als adaptor, zoals weergegeven in fig. 14.

T>

Van de verkregen 217 Tc kolonies waren 106 kolonies c 10(48.8%) Ap . Een minibereiding werd uitgevoerd voor 25 van deze kolonies. Acht van de plasmiden waren ongeveer 200 b.p. groter dan de vector en bleken een daarin opgenomen p-urogastron-gen te bevatten, zodat deze acht plasmiden gesplitst werden met BamHI en gecontroleerd werden op de oriëntatie van het gen. Gevonden 15werd, dat drie plasmiden het £rurogastron-gen met dezelfde oriëntatie als prlactamase bevatten en deze werden pUG2701 t/m 2703 genoemd.

Het volgens de bovenstaande methode 8-4-a) verkregen plas-mide pUG2301 levert een gefuseerd eiwit van een gedeelte van 20lactamase en ppurogastron. De voorspelde aminozuurvolgorde en de overeenkomstige nucleotide-volgorde zijn hierna vermeld.

Λ "= Λ :> ,·Ί * Μ Λ λ 1 i , ι* : » V - V ’· * -40-

Met Ser lie Gin His Phe Arg Val

ATG AGT ATT CAA CAT TTC CGT GTC

Ala Leu I Ie Pro Phe Phe Ala A1 a

GCC CTT ATT CCC TTT TTT GCG GCA

Phe Cys Leu Pro Val Phe A la His

TTT TGC CTT CCT GTT TTT GCT CAC

Pro Glu Thr Leu Val Lys Val Lys

CCA GAA ACG CTG GTG AAA GTA AAA

Asp Ala Glu Asp Gin Leu Giy A la

GAT GCT GAA GAT CAG TTG GGT GCA

Arg Val GJy Tyr I Ie Glu Leu Asp

CGA GTG GGT TAC ATC GAA CTG GAT

Leu Asn Ser Giy Lys I Ie Leu Glu

CTC AAC AGC GGT AAG ATC CTT GAG

Ser Phe Arg Pro Glu Glu Arg A la

AGT TTT CGC CCC GAA GAA CGC GCT

Lys Arg Asn Ser Asp Ser Glu Cys

AAA CGG AAT AGC GAT TCT GAG TGC

Pro Leu Ser His Asp Gly Tyr Cys

CCA CTG TCT CAC GAT GGC TAT TGT

Leu His Asp Gly Val Cys Met Tyr

CTG CAC GAC GGT GTT TGC ATG TAC

850 1 8 S ü

*· V

-41- I Ie Glu Ala Leu Asp Lys Tyr Ala

ATC GAA GCT TTG GAT AAA TAC GCG

Cys Asn Cys Val Val Gly Tyr lie

TGT AAC TGT GTA GTG GGT TAT ATC

Gyl Glu Arg Cys Gin Tyr Arg Asp

GGT GAA CGC TGT CAA TAC CGT GAT

Leu Lys Trp Trp Glu Leu Arg (stop)

CTG AAA TGG TGG GAA TTG CGT TAA

V

TAGTGAAGATCTGGATCCGTTTAGCGTTTTCCA AT GATGAGCACTTTTAAAGTT CTGCTATGTGGC

GCGGTATTATCCCGTGTT GACGCCGGGCAAGAG

CAACTCGGTCGCCGCATAC

Op soortgelijke wijze vormt het volgens de methode 8-4—b) verkregen plasmide pUG2101 een gefuseerd eiwit met de volgende primaire struktuur.

Met Ser I Ie Gin His Phe Arg Val

ATG AGT ATT CAA CAT TTC CGT GTC

A la Leu I Ie Pro Phe Phe A i a Ala

GCC CTT ATT CCC TTT TTT GCG GCA

Phe Cys Leu Pro Val Phe A Ia His

TTT TGC CTT CCT GTT TTT GCT CAC

8501380 , " * V' -42-

Pro GIu Thr Leu Val Lys Val Lys

CCA GAA ACG CTG GTG AAA GT A AAA

Asp Ala GIu Asp Gin Leu Gly Ala

GAT GCT GAA GAT CAG TTG GGT GCA

Arg Val Gly Tyr lie GIu Leu Asp

CGA GTG GGT TAC ATC GAA CTG GAT

Leu Asn Ser Gly Lys lie Leu GIu

CTC AAC AGC GGT AAG ATC CTT GAG

Ser Phe Arg Pro GIu GIu Arg Phe

AGT TTT CGC CCC GAA GAA CGT TTT

Pro Met Met Ser Thr Phe Lys Val

CCA ATG ATG AGC ACT TTT AAA GTT

Leu Leu Cys Gly Ala Val Leu Ser

CTG CT A TGT GGC GCG GT A TTA TCC

Arg Val Asp Ala Gly Gin GIu Gin

CGT GTT GAC GCC GGG CAA GAG CAA

Leu Gly Arg Arg lie His Tyr Ser

CTC GGT CGC CGC ATA CAC TAT TCT

Gin Asn Asp lie Val GIu Tyr Ser

CAG AAT GAC TTG GTT GAG TAC TCA

Pro Val Thr GIu Lys His Leu Thr

CCA GTC ACA GAA AAG CAT CTT ACG

• $ ” Λ 4 0 ^ r, * * -43-

Asp Gly Met Thr Val Arg Glu Leu GAT GGC ATG ACA GTA AGA GAA TTA

Cys Ser Ala Ala lie Thr Met Ser

TGC AGT GCT GCC ATA ACC ATG AGT

Asp Asn Thr Ala Ala Asn Leu Leu

GAT AAC ACT GCG GCC AAC TT A CTT

Leu Thr Thr lie Ala Lys Arg Asn

CTG ACA ACG ATC GCT AAA CGG AAT

Si

Ser Asp Ser Glu Cys Pro Leu Ser

AGC GAT TCT GAG TGC CCA CTG TCT

His Asp Gly Tyr Cys Leu His Asp

CAC GAT GGC TAT TGT CTG CAC GAC

Gly Val Cys Met Tyr lie Glu Ala

GGT GTT TGC ATG TAC ATC GAA GCT

Leu Asp Lys Tyr Ala Cys Asn Cys

TTG GAT AAA TAC GCG TGT AAC TGT

Val Val Gly Tyr lie Gly Glu Arg

GTA GTG GGT TAT ATC GGT GAA CGC

Cys Gin Tyr Arg Asp Leu Lys T rp

TGT CAA TAC CGT GAT CTG AAA TGG

Trp Glu Leu Arg (stop)

TGG GAA TTG CGT TAA TAGTGAAGATC

fi λ Λ --------— -44-

T GGATCCGTTTAGCGATCGGAGGACCGAAGfi AGCTAACCGCTTTTTT GCACA

Op soortgelijke wijze vormt het volgens de methode 8-4-c) verkregen plasmide pUG2701 een gefuseerd eiwit met de volgende primaire struktuur.

Met Ser I Ie Gin His Phe Arg Val

ATG AGT ATT CAA CAT TTC CGT GTC

Ala Leu I Ie Pro Phe Phe Ala Ala

GCC CTT ATT CCC TTT TTT GCG GCA

Phe Cys Leu Pro Val Phe A la H is

TTT TGC CTT CCT GTT TTT GCT CAC

Pro Glu Thr Leu Val Lys Val Lys

CCA GAA ACG CTG GTG AAA GTA AAA

Asp Ala Glu Asp Gin Leu Gly A la

GAT GCT GAA GAT CAG TTG GGT GCA

Arg Val Gly Tyr I Ie Glu Leu Asp

CGA GTG GGT TAC ATC GAA CTG GAT

Leu Asn Ser Gly Lys I Ie Leu Glu

CTC AAC AGC GGT AAG ATC CTT GAG

Ser Phe Arg Pro Glu Glu Arg Phe

AGT TTT CGC CCC GAA GAA CGT TTT

•&\ ό λ .; % w ,ί» λ · 4 ·* ' * * -45-

PrO Met Met Ser Thr Phe Lys Val

CCA ATG ATG AGC ACT TTT AAA GTT

Leu Leu Cys Gly Ala Val Leu Ser

CTG CTA TGT GGC GCG GTA TTA TCC

Arg Val Asp Ala Gly Gin Glu Gin

CGT GTT GAC GCC GGG CAA GAG CAA

Leu Gly Arg Arg lie His Tyr Ser

CTC GGT CGC CGC ATA CAC TAT TCT

Gin Asn Asp lie Val Glu Ser Ala

CAG AAT GAC TTG GTT GAG TCG GCT

Lys Arg Asn Ser Asp Ser Glu Cys

AAA CGG AAT AGC GAT TCT GAG TGC

Pro Leu Ser His Asp Gly Tyr Cys

CCA CTG TCT CAC GAT GGC TAT TGT

Leu His Asp Gly Val Cys Met Tyr

CTG CAC GAC GGT GTT TGC ATG TAC

lie Glu Ala Leu Asp Lys Tyr Ala

ATC GAA GCT TTG GAT AAA TAC GCG

Cys Asn Cys Val Val Gly Tyr lie

TGT AAC TGT GTA GTG GGT TAT ATC

Gly Glu Arg Cys Gin Tyr Arg Asp

GGT GAA CGC TGT CAA TAC CGT GAT

8591880 5 -46-

Leu Lys T rp Trp GIu Leu Arg (stop)

CTG AAA TGG TGG GAA TTG CGT TAA

TAGTGAAGATCTGGATCCGJITAGCCGACTCAC

r

CAGT CACAGAAAAGCATCTTACGGAT

10

De voor de gefuseerde eiwitten coderende nucleotide-volgorden in de plasxniden pUG2101, DÜG2301 en püG270l werden geanalyseerd volgens de Maxam—Gilbert—methode.

^5 Foto 5 toont de resultaten van de analyse. In foto 5 tonen de banen 1 t/m 4 het met het MluI-Pstl-fragment (224 b.p.) van püG2101 verkregen resultaat, tonen de banen 5 t/m 8 het met het MluI-EcoRI-fragment (721 b.p.) van pUG2l01 verkregen resultaat, tonen de banen 9 t/m 12 het met het MluI-BamHI-frag-20 ment (452 b.p.) van pUG2301 verkregen resultaat, de banen 13 t/m 16 het met het MluI-Pstl-fragment (335 b.p.) van pUG2701 verkregen resultaat en de banen 17 t/m 20 het met het Mlul-EcoRI-fragment (610 b.p.) van pUG2701 verkregen resultaat. De banen 1, 5, 9, 13 en 17 tonen de reaktieprodukten voor guanide, 25 de banen 2, 6, 10, 14 en 18 de reaktieprodukten voor guanine plus adenine, de banen 3, 7, 11, 15 en 19 de reaktieprodukten voor thymine plus cytosine en de banen 4, 8, 12, 16 en 20 de reaktieprodukten voor cytosine. Het met gemarkeerde gedeelte is een adaptor.

30 8-5) Systeem voor de expressie van gefuseerd eiwit van ^lactamase en i^-urogastron verbonden door Arg-Lys.

8-5-a) Bereiding van DUG1102 en püG1105.

ï3-Urogastron-gen werd opgenomen in het Pjrlactamase-gen van PBR322 op de enige Pvul-restrictie-plaats ter verkrijging 35 van vectoren voor de expressie van gefuseerd eiwit van fy-lac-tamase en Ppurogastron, zoals weergegeven in fig. 15.

Het plasmide pBR322 werd gedurende 3 uur bij 37°C gesplitst met Pvul. Sommige van de plasmiden werden gecontroleerd door elektroforese met 1 gew% agarosegel om te bevestigen, dat 40 ze volledig gesplitst zijn. De adaptoren D-l-3 en D-3-2 wer- 3501380 * -w -47- den gedurende 15 uur bij 12°C aan het fragment gekoppeld en het gekoppelde produkt werd vervolgens onderworpen aan electro-forese met 1 gew%’s agarose-gel om een DNA-fragment te isoleren. Vervolgens werden het g-urogastronfragment en de vector 5 gemengd met een molaire verhouding van ongeveer 5:1 en gedurende 15 uur bij 12°C gekoppeld. Na de koppeling werd de stam HB101 met het verkregen plasmide getransformeerd en werden de

R

kolonies gekozen met betrekking tot Tc .

R

Een en zeventig Tc getransformeerde kolonies werden 10 verkregen en vervolgens gecontroleerd op hun Ap-gevoeligheid.

σ

Plasmide DNA werd bereid uit 20 Ap -kolonies (28,2%) en vervolgens gecontroleerd op de aanwezigheid van Mlul-restrictie-plaats ter bevestiging van de opname van fj-urogastron-gen. Gevonden werd, dat vijf van de 20 plasmiden de Mlul plaats 15 van ft-urogastron-gen bevatten. Het DNA werd gesplitst met Hinfl en vervolgens onderworpen aan electroforese met 1,5 gew%1s agarosegel om de oriëntatie van de opname te controleren. Gevonden werd, dat twee van de plasmiden, n.1. pUG1102 en PÜG1105 het gen in de juiste oriëntatie bevatten.

20 8-5-b) Bereiding van PÜG1004, pUG1201 en pUGl301.

De procedure 8-5-a) werd herhaald onder toepassing van PstI, Hindi en XmnI inplaats van Puvl ter verkrijging van respektievelijk pUG1004, pUG1201 en pUGl301 zoals weergegeven in de figuren 16, 17 en 18.

25 9) Bevestiging van de expressie van 5-urogastron.

De aldus opgebouwde expressieplasmiden werden toegepast voor het transformeren van E.coli, HB101 of ECI-2, en de cellen werden gekweekt volgens de onderstaande methode, gevolgd door extraktie en radio-immunologisch onderzoek ter bevesti-30 ging van de expressie.

9-1) Kweek van recombinant-micro-organismen met fjrurogastron-gen en extraktie van eiwitten.

9-1-a) Expressiesysteem onder toepassing van P_-promotor.

De stam ECI-2 met het expressieplasmide pUG103-E en de-35 zelfde stam met het expressieplasmide pUG117-E werden elk bij 25°C gekweekt in twee kolven, die elk 1 liter LB kweekmedium bevatten. Wanneer de kweek in een van de kolven een absorptie van 0,3 bij 660 nm vertoonde, werd de kweek 1 uur bij 42°C onderworpen aan warmte-inductie. De kweek in de andere kolf CRI) 1

Q J è O Q

-48- werd voortdurend bij 25°C geincubeerd tot de absorptie 0,4 bedroeg. De cellen in elke kolf werden verzameld, gewassen met PBS-buffer (137 mM natriumchloride, 2,7 mM kaliumchloride, 8,1 mM dibasisch natriumfosfaat en 1,5 mM monobasisch natrium- 5 fosfaat (pH 7,0)), vervolgens opnieuw gesuspendeerd in PBS- buffer in 3 vol% van de hoeveelheid van de oorspronkelijke kweek en vernietigd (gedurende 30 seconden bij 100 W, driemaal) 0 door een sonicator (model 5202, produkt van Ohtake Works Co., Ltd.,Japan) onder koelen met ijs. De door ultracentrifugeren 10 (1 uur bij 40.000 g) van de celresten gescheiden bovenstaande vloeistof werdgedialiseerdtegen 0,01N waterige azijnzuuroplos-sing en het dialysaat werd gevriesdroogd en vervolgens onderworpen aan radio-immunologisch onderzoek (hierna aangeduid als "RIA") .

15 9-1-b) Systeem voor de expressie van gefuseerd eiwit.

De E-coli-stam HB101 met plasmiden pUG1004, 1301, 2101, 2303 of 2703 werd vooraf geincubeerd bij 37°c in een kweek-medium, dat 50yxg/ml tetracycline bevat, vervolgens verdund tot een volumeverhouding van 1:100 met hetzelfde medium en 20 gekweekt tot de absorptie bij 660 nm 0,4 bedroeg. De cellen werden verzameld, gewassen met PBS-buffer, vervolgens opnieuw gesuspendeerd in PBS-buffer in 3 vol% van de hoeveelheid van de oorspronkelijke kweek en onderworpen aan sonische trillingen (bij 100 W gedurende 30 seconden, driemaal) met behulp van 25 dezelfde sonicator als eerder vermeld onder koelen met ijs. De door ultracentrifugeren (1 uur bij 40.000 g) van de celresten qescheiden bovenstaande vloeistof werd gedialiseerdtegen 0,0IN waterige az'ijnzuuroplossing, gevriesdroogd en vervolgens onderworpen aan RIA.

30 Ter bevestiging van de ophoping van gefuseerd eiwit in het periplasma werd de periplasma-fraktie bereid volgens S.J. Chan et al. (Chan, S.J. et al., Proc.Natl.Acad.Sci., U.S.A., 78, 5401-5405 (1981)). Een gedeelte van de kweek werd verdund tot een volumever houding van 1:100 met vers E kweekmedium 35 (1 liter waterige oplossing van 10 g dibasisch kaliumfosfaat, 3.5 g natriumammoniumwaterstoffosfaat, 0,2 g magnesiumsulfaat-heptahydraat, 2 g citroenzuur, 2 g glucose, 0,23 g L-proline, 39.5 mg L-leucine, 16,85 mg thiamine en 20 mg tetracycline-hydrochloride) en vervolgens bij 37°C gekweekt tot de absorptie 40 bij 660 nm 0,4 bedroeg. De cellen werden verzameld (6000 r.p.m., 8391880 % -49- 10 min.) en tweemaal gewassen met een mengsel van 10 mM tris-HC1 (pH 8,0) en 30 mM natriumchloride. De cellen (1 g) werden opnieuw gesuspendeerd in 80 ml 20 gew%'s saccharose-30 mM tris-HCl (pH 8,0), waarna EDTA aan de suspensie werd toegevoegd 5 in een concentratie van 1 mM. Het mengsel werd 10 minuten bij 180 r.p.m. (24°C) geschud met een roterend schudapparaat en vervolgens gecentrifugeerd (13.000 g, 10 minuten) om de cellen te verzamelen, die opnieuw gesuspendeerd werden in 80 ml gedestilleerd water. De suspensie werd onder af en toe roeren ge-10durende 10 minuten in ijs gehouden en vervolgens gecentrifugeerd (13000 g, 10 minuten). De bovenstaande vloeistof werd verzameld als periplasma-fraktie (0-Sup). Het bezinksel werd gesuspendeerd in een mengsel van 10 mM tris-HCl (pH 8,0) en 30 mM natriumchloride en behandeld met dezelfde sonicator als 15 in het voorafgaande ter verkrijging van een cytoplasma-fraktie (0-Ppt). Deze monsters werden onderworpen aan RIA.

9-2) Radio-immunologische proef.

9-2-a) Tot stand brengen van het RIA-systeem.

Konijnen werden geïmmuniseerd met gezuiverd menselijk 20 5-urogastron als antigeen ter verkrijging van antiserum. Het Pj-urogastron (300 ^Ug) werd opgelost in 0,2 ml gedestilleerd water, aan de oplossing werd 1,5 ml 50%'s polyvinylpyrrolidon-oplossing toegevoegd en het mengsel werd 2 uur bij kamertemperatuur geroerd. Volledig Freund's adjuvans (2,0 ml) werd aan 25 het mengsel toegevoegd ter verkrijging van een emulsie, die subcutaan geinjekteerd werd in het borstgedeelte van drie konijnen. Na viermaal elke 2 weken herhalen van de immunisatie werd voorts 50 yUg van het antigeen intraveneus geinjekteerd, het gehele bloed 3 dagen daarna verzameld en het serum afge-30 scheiden.

Vervolgens werden de volgende RIA omstandigheden bepaald met het oog op de titratiekromme voor de bepaling van de ver-dunningsgraad van het antiserum voor de proef, de incubatietijd voor het optimaliseren van de proefomstandigheden, de 35 methode voor het scheiden van het gebonden radio-aktief gemerkte antigeen (gebonden) van het vrije radio-aktief gemerkte antigeen (vrij), enz.

De toegepaste verdunningsoplossing was een fosfaatbuf-fer (10 mM. pH 7,4), die 0,5 gew% runderserumalbumine (BSA), f» P* ft β ft r* f\

5? D U i 8 8 U

-50- 140 mM natriumchloride en 25 mM dinatrium-EDTA bevatte. De verdunningsoplossing (400 jUl), 100 μ 1 van het monster of standaard menselijk β-urogastron en 100 μΐ antimenselijk {^-urogas-tron-serum werden gemenqd. Nadat het mengsel 24 uur bij 4°C 5 was geincubeerd werd 100van een 125j -gemerkt menselijk jb-urogastron-oplossing (ongeveer 5000 cpm) aan het mengsel toegevoegd. Nadat het mengsel verder 48 uur bij 4°C was gein- ψ cubeerd, werden 100 /Al van een tweede antilichaam (anti-ko-nijnen γ-globuline geitenserum) (20-voudige verdunning met 10 PBS-buffer), 100 yUl normaal konijnenserum (200-voudige verdunning met PBS-buffer) en 900 μΐ 10 mM PBS-buffer met 5 gew% poly ethyleenglycol aan het verkregen mengsel toegevoegd, waarna het nog 3 uur bij 4°C werd geincubeerd. De kweek werd 30 minuten bij 3000 r.p.m. gecentrifugeerd, de bovenstaande 15 vloeistof werd afgescheiden en het neerslag werd geteld. Het gehalte aan immunoreaktieve stof als menselijk β-urogastron in het monster werd bepaald uit de met behulp van standaard menselijk p-urogastron verkregen standaardkromme.

9-2-b) Bevestiging van β-urogastron-produktiviteit van het re-20 combinant-micro-organisme.

Tabel 5 toont het resultaat van RIA voor het expres-siesysteem met toepassing van λP^-promotor.

Tabel 5.

Expressie- Warmteinductie Geproduceerde hoeveelheid 25 plasmide ^-urogastron (ng/1 van de ___kweek)_ PUG103-E ja 450.2 PÜG103-E nee 3,2 PÜG117-E ja 388,4 30 püG117-E nee 3,2

Controle (pBR322) nee niet waarneembaar

Tabel 6 toont het resultaat van RIA voor gefuseerde eiwit-expressiesystemen.

8501880 * * -51-

Tabel 6.

Expressieplasmide Geproduceerde hoeveelheid Qrurogastron _y*g/l van de kweek)___ PÜG1004 729.6 PÜG1301 650,7 5 püG2101 31,3 PÜG2301 125,2 PÜG2701 119,2

Tabel 7 toont de lokalisatie van het geëxprimeerde gefuseerde eiwit.

10 Tabel 7.

Expressieplasmide Geproduceerde hoeveelheid Φ-urogastron _fclg/1 van de kweek)_

Periplasma —fraktie Cytoplasma-fraktie _ (0-Sup)_(0-Ppt)_ PÜG1004 326,0 4,0 15 PÜG1301 347,4 2,8 PÜG2101 79,9 10,2 PÜG2301 118,8 4,1 PÜG2701 65,7 3,6

De tabellen 5 en 6 tonen, dat het λ-Ρ -promotorsvsteem L· · * 20 voor direkte expressie van p-urogastron en het systeem voor expressie van de verbinding als een gefuseerd eiwit beiden J^-urogastron-immunoreaktiviteit in E.coli exprimeerden. Tabel 7 toont, dat in het geval van gefuseerd eiwit, de geëxprimeerde Ji-urogastron-immunoreaktiviteit vrijwel gelokaliseerd is 25 in het periplasma.

- Conclusies -

Λ Τ' S' A J·» A A

Ö3y ! Ö8 U

Claims

1. Een nieuw ^-urogastron-gen met de volgende nucleotide-volgorde: r 5’ AAT AGC GAT TCT GAG TGC CCA CTG 3' TTA TGG CTA AGA CTC ACG GGT GAG TCT CAC GAT GGC TAT TGT CTG CAC AGA GTG CTA CCG ATA ACA GAC GTG GAC GGT GTT TGC ATG TAC AT C GAA CTG CCA CAA ACG TAC ATG TAG CTT 10 GCT TTG GAT A A A TAC GCG TGT AAC CGA AAC CTA TTT ATG CGC ACA TTG TGT GTA GTG GGT TAT ATC GGT GAA ACA CAT CAC CCA ATA TAG CCA CTT ,5 CGC TGT CAA TAC CGT GAT CTG A A A GCG ACA GTT ATG GCA CTA GAC TTT TGG TGG GAA TTG CGT 3’ ACC ACC CTT AAC GCA 5r 20

2. Een ondereenheid van het in conclusie 1 gedefinieerde gen, die de voorste helft van de in conclusie 1 gedefinieerde en ongeveer in het middelste gedeelte ervan gedeelde nu-cleotide-volgorde bezit.

3. Een ondereenheid van het in conclusie 1 gedefinieer de gen, die de achterste helft van de in conclusie 1 gedefinieerde en ongeveer in het middelste gedeelte ervan gedeelde nucleotidevolgorde bezit.

4. Een gen zoals gedefinieerd in conclusie 1, dat een 30 herkenningsplaats voor restrictie-enzym bevestigd aan de voorzijde en/of de achterzijde van het gen bevat.

5 AAC CTA TTT ATG CGC ACA * λ c TGT GTA GTG GGT TAT ATC GGT TTG ACA CAT CAC CCA ATA TAG CCA GAA CGC TGT CAA TAC CGT GAT GTG 25 ctT GCG ACA GTT ATG GCA CTA GAC a a A TGG TGG GAA TTG CGT TH J A G TIT ACC ACC CTT AAC GCA ATT ATC tgaagatctg y ACT TCT AGA CCT AG 5 30

5. Een gen zoals gedefinieerd in conclusie 4, dat een herkenningsplaats voor restrictie-enzym en een startcodon aan de bovenstroomse zijde van het gen en/of een stopcodon en een 35 herkenningsplaats voor restrictie-enzym aan de benedenstroomse £ Λ * ~ £ f\ * . . -53- zijde van het gen bevat, waarbij de codons en de herkennings-plaatsen in de aangegeven volgorde zijn opgesteld.

6. Een gen zoals gedefinieerd in conclusie 5, dat de volgende nucleotide-volgorde bezit: 5 -15 -1, 1 5' AAT TCG AAG ATC TGC ATG AAT AGC 3' GC TTC TAG ACG TAC TTA TCG 10 20 30

7. Een ondereenheid van het in conclusie 6 gedefinieerde gen, die de voorste helft van de in conclusie 6 gedefinieerde en ongeveer in het middelste gedeelte ervan gedeelde nucleotide-volgorde bezit, waarbij de ondereenheid voorts een 35 herkenningsplaats voor restrictie-enzym aan de achterzijde ervan bevat.

8. Een ondereenheid zoals gedefinieerd in conclusie 7 met de volgende nucleotidevolgorde: 8501880 f , , * -54- 5' A A T TCG A A G ATC TGC ATG A A T AGC 3* GC TTC TAG ACG TAC TTA TCG GAT TCT GAG TGC CCA CTG TCT CAC CTA AGA CTC ACG GGT GAC AGA GTG GAT GGC TAT TGT CTG CAC GAC GGT C T A CCG ATA ACA GAC GTG CTG CCA GTT TGC ATG TAC ATC GAA GCT TCG CAA ACG TAC ATG TAG CTT C G A AGC 10 3' C T A G 5’

9. Een ondereenheid van het in conclusie 6 gedefinieerde gen, die de achterste helft van de in conclusie 6 gedefinieerde en ongeveer in het middelste gedeelte ervan gedeelde nucleotide-volgorde bezit, waarbij de ondereenheid voorts een 15 herkenningsplaats voor restrictie-enzym aan de voorzijde ervan bevat.

10. Een ondereenheid zoals gedefinieerd in conclusie 9, met de volgende nucleotide-volgorde: 20 5' A GCT TTG GAT A A A TAC GCG TGT

10 GAT TCT GAG TGC CCA CTG TCT CAC CTA AGA CTC ACG GGT GAC AGA GTG 40 50 •GAT GGC TAT TGT CTG CAC GAC GGT CTA CCG ATA ACA GAC GTG CTG CCA 1C 60 70 80 GTT TGC ATG TAC ATC GAA GCT TTG CAA ACG TAC ATG TAG CTT CGA AAC 90 100 GAT A A A TAC GCG TGT AAC TGT GTA CTA TTT ATG CGC ACA TTG ACA CAT 20 110 120 GTG GGT TAT ATC GGT GAA CGC TGT CAC CCA ATA TAG CCA CTT GCG ACA 130 140 150 CAA TAC CGT GAT CTG A A A TGG TGG GTT ATG GCA CTA GAC TTT ACC ACC 25 160 170 GAA TTG CGT T AA TAG TGA AGA TCT CTT AAC GCA ATT ATC ACT TCT AGA G 3’ C C T A G 5’ 30

11. Een recombinant-plasmide met het in conclusie 6 gedefinieerde gen.

12. Een werkwijze voor de bereiding van het recombinant-25 plasmide zoals gedefinieerd in conclusie 11, met het kenmerk, dat men de in conclusie 8 gedefinieerde ondereenheid en de in conclusie 10 gedefinieerde ondereenheid opneemt op een geschikte opnameplaats van een geschikte plasmidevector. 3501330 t -55-

13. Een recombinant-plasnu.de/ dat een plasmidevector met daarin opgenoraen het in conclusie 6 gedefinieerde β-uro-gastron-gen bevat, waarbij in de plasmidevector voorts aan de bovenstroomse zijde van het |$-urogastron-gen een promotor voor 5 de regelinq van de expressie van het gen en een met de promotor verbonden SD-volgorde zijn opgenomen.

14. Een recombinant-plasmide, dat een plasmidevector met de volgorde van de vierde en volgende paren basen van het in conclusie 6 gedefinieerde β-urogastron-gen bevat, waarbij 10 in de plasmidevector de combinatie van een promotor, een SD-volgorde en een ander gen aan de bovenstroomse zijde van het £nurogastron-gen is opgenomen.

15. Een recombinant-plasmide zoals gedefinieerd in conclusie 12, waarin hét andere gen een β-lactamase-gen is.

16. Een recombinant-plasmide zoals gedefinieerd in conclusie 13 of 14, waarin de promotor J\P_ of lac UV5 is. Ij

17. Een recombinant-plasmide zoals gedefinieerd in conclusie 13 of 14, waarin de plasmidevector pBR322 is.

18. Een transformant, die een gastheercel met een re- 20 combinant-plasmide bevat, dat in staat is om het in conclusie 1 gedefinieerde ^-urogastron-gen te exprimeren.

19. Een transformant zoals gedefinieerd in conclusie 18, waarin het recombinant-plasmide het in conclusie 13 gedefinieerde recombinant-plasmide is.

20. Een transformant zoals gedefinieerd in conclusie 18, waarin het recombinant-plasmide het in conclusie 14 gedefinieerde recombinant-plasmide is.

21. Een transformant zoals gedefinieerd in conclusie 18, waarin de gastheercel E-coli is.

22. Een transformant zoals gedefinieerd in conclusie 18, waarin de gastheercel getransformeerd is met een recombi-nant-plasmide met een Tc -gen en een CI857-gen.

23. Een werkwijze voor de vorming van een transformant, met het kenmerk, dat men eeri gastheercel transformeert met een 35 recombinant-plasmide, dat in staat is om het in conclusie 1 gedefinieerde ^-urogastron-gen te exprimeren. 8501880 -56-

24. Een werkwijze voor de vorming van ^-urogastron, met het kenmerk, dat men de in conclusie 18 gedefinieerde transformant kweekt en het geëxprimeeerde prurogastron verzamelt. ^ ** ƒ» -¾ y * v iS .