NO117128B - - Google Patents

Description

Fremgangsmåte til fremstilling av antivirus-virksom 5-nitro-2'-deoksyuridin.

Foreliggende oppfinnelse vedrorer en fremgangsmåte til fremstilling av antivirus-virksom $-hitro-2'-deoksyuridin med formelen:

Den antivirus-virksomme forbindelse 5-nitro-2'-doksyuridin, som har en meget hoy aktivitet, har i mange henseender en meget hoyere aktivitet enn tidligere kjente antivirus-virksomme midler med lignende struktur, f.eks. 5_jod-2 '-deoksyuridin.

Ifolge foreliggende oppfinnelse blir en vandig-oppløsning inneholdende 5-nitrouracil og tymidin i forholdet 10:1 til 1:10 in-kubert ved 30° - 4-0°C i 2-5 timer ved en pH på mellom ca. 6 og 7 i nærvær av den enzymatiske aktivitet frembragt ved fermentering av Lactobacillus leichmannii.

Til dette formål prepareres forst enzymet ved hjelp av en mikrobiologisk metode, ved å fermentere en mikroorganisme i et kul-turmedium inneholdende en assimilerbar karbonkilde, en assimilerbar nitrogenkilde og mineralsalter i slike mengder som er vanlige for fermenteringsprosesser, og denne mikroorganisme danner nevnte en-

zym i lopet av fermenteringen. Idet det er tilsiktet at enhver slik mikroorganisme kan anvendes, forutsatt at det gir et rimelig utbytte av enzymet, er det blitt funnet at en særlig egnet organisme er Lactobacillus leichmannii ATCC 7830-Fermenteringen kan utfores som vanlig, f.eks. ved å inkubere mikroorganismen ved en temperatur mellom 30° og 4-0°C i et tidsrom som varierer fra 6 til 24 timer. Ved slutten av fermenteringen isoleres mikro-organismens celler, f.eks. ved sentrifugering og knuses deretter for å frigjore enzymet i cellene. En ultrasonisk desintegrator er praktisk for dette formål og virker på en buffersuspensjon av cellene. Enzymet opploses og kan lagres ved lave temperaturer etter at overflodig cellemateriale er fjernet.

For den enzymatiske reaksjon inkuberes 5-nitrouracil med enzymet i nærvær av thymidin. I lopet av denne inkubering overfores halvparten av thymidinets deoksyribose til 5-nitrouracil, slik at 5-nitro-2'-deoksyuridin dannes. Inkuberingen foregår ved temperaturer mellom ca. 30° og 40°C, fortrinnsvis 37°C, i 2-5 timer i en bufferopplosning, med pH mellom ca. 6 og 7, hvilken opplosning inne-holder thymidin og 5-nitrouracil i varierende gjensidige forhold,

som kan være mellom 10 - 1 og 1 - 10 og inneholde et- passende volum av det urensede enzym, fremstilt som beskrevet ovenfor. Ved inku-beringens slutt kan produktet 5-nitro-2'-deoksyuridin isoleres ved hjelp av en rekke prosesser, men fortrinnsvis ved kromatografi. Idet det henvises til eksemplene, som gir .en bedre forklaring av frem-gangsmåtene brukt ved isoleringen, kan det nevnes at vann er et godt opplosningsmiddel, spesielt i dette tilfelle hvis kromatografi an-

vendes. Det fremstilte produkts egenskaper er oppgitt i eksempel 1.

oppdelt i 100 ml porsjoner fordelt på 500 ml Erlenmeyer-kolber inn-podes med kulturen L..Leichmannii dyrket på et microinoculum medium og inkuberes ved 37°C i 10 timer med vekselvis risting. Cellene fra . sentrifugeringen vaskes med M/15 fosfatbuffer (pH 6.5) og etter nok en sentrifugering med moderat hastighet (5000 g) blir de resuspendert i 20 ml av nevnte fosfatbuffer. Denne suspensjon utsettes for ultrasonisk desintegrasjon, og det resulterende fint oppdelte cellemateriale sentrifugeres ved 10 000 g i 10 minutter. Det ovre lag representerer det urensede enzym og lagres i frossen tilstand ved

-40°C

Til den enzymatiske reaksjon brukes en opplosning bestående

av thymidin (0.5 g), 0.1 g 5-nitrouracil og 50 ml av det'urensede enzym, og dette fortynnes til 500 ml med M/15-fosfatbuffer (pH 6.5). Oppløsningen inkuberes ved yj°Q i 3 timer, varmes på et vannbad for

å koagulere proteiner og sentrifugeres. Det ovre lag inndampes til torrhet under forminsket trykk. Resten ekstraheres med 10 x 10 ml varm etanol og de kombinerte ekstrakter inndampes til torrhet under forminsket trykk. Resten gjenopploses i en minimum-mengde vann. Denne opplosning kromatograferes på en 4 x 30 cm kolonne med Dowex-, format, som er avbalansert med 0.1 M ammoniumformat innstilt på pH 6.0. Bufferen eluerer forst thymidin tett etterfulgt av thymin. pH forandres deretter til 3*5 og under disse betingelser elueres 5-nitro-2'-deoksyuridin. Opplosningen inndampes til torrhet ved 40°C under forminsket trykk og inndampes deretter to ganger til med absolutt etanol. Etter dette ekstraheres bunnfallet med 5 x 30 ml etanol, de kombinerte ekstraktene inndampes ved 40°C under forminsket trykk og gir en farvelos olje som stivner etter en stund. Det stiv-nede produkt opploses i 20 ml etanol og inndampes til et lite volum,

som ved å stå gir 5-nitro-2'-deoksyuridin.

Ultrafiolette spektra.

Rf-verdien i oppstigende tynnsjiktkromatografi i etanol-ammoniumacetat 7' 3 (pH 7-5) er 0«55«Rf-yerdien i nedstigende papir-kromatografi i NagHPO^-opplésning mettet med isoamylalkohol er 0.82.

Eksempel 2

To liter av et medium med folgende sammensetning

oppdelt i 100 ml porsjoner fordelt på $ 00 ml Erlenmeyer-kolber inn-

podes med kulturen L. Leichmannii dyrket på microinoculum medium (Difco) og inkuberes ved 37°C i 12 timer. Cellene oppnådd ved sentrifugering med en hastighet på $ 000 g vaskes med M/30 fosfatbuffer (pH 6.5), og etter nok en sentrifugering med samme hastighet blir de resuspendert i en tilstrekkelig mengde av nevnte' fosfatbuffer, .slik at det dannes en suspensjon med en tetthet på 6.5% lystransmisjon

(Klett). Denne suspensjon utsettes for ultrasonisk desintegrasjon og det resulterende fint oppdelte cellemateriale sentrifugeres ved 10 000 g i 10 minutter. Det ovre lag representerer det urensede enzym og lagres i frossen tilstand ved -40°C.

Til den enzymatiske reaksjon benyttes en opplosning med 5-nitrouracil (1 g) som tilsettes 0.2 g thymidin og 80 ml urenset enzym, og det hele fortynnes til l60 ml med O.25 M acetatbuffer pH $. 8. Oppløsningen inkuberes ved 37°C i 150 minutter. Etter denne inkubering bunnfelles proteinene ved tilsetning av tre volum etanol og sentrifugeres av ved moderat hastighet. Det ovre lag konsentreres til 25 ml under forminsket trykk, filtreres og overfores på en 4 x 30 cm kolonne med Dowex 1-format, som er likevektstilt med 0.1 M ammonium-format innstilt på pH 6.0. Kromatografisk analyse gir forst thymidin etterfulgt av thymin. pH forandres deretter til 3-5°g under disse betingelser elueres 5-nitr°-2 '-deoksyuridin. Fraksjonene samles opp og konsentreres til ca. 50 ml ved 40° C under forminsket trykk. Denne opplosning ekstraheres 16 ganger med n-butanol mettet med vann. Butanolekstraktet inndampes til torrhet under forminsket trykk ved 45°C. Resten loses opp i 25 ml absolutt etanol.

Denne opplosning konsentreres sakte under forminsket trykk til et lite volum. Ved avkjoling i is utkrystalliseres '-deoksyuridin, og dette ga et utbytte på 110 mg rent produkt.

Det ble foretatt en sammenligning mellom antivirusaktiviteten in vitro til 5-nitr,o-2'-deoksyuridin og andre deoksynitrosider. Re-sultatene er oppsummert i folgende tabell.

In vitro- aktiviteten til 5- nitro- 2'- deoksyuridin og andre deoksynitrosider.

5-nitro-2'-deoksyuridin er også aktivt overfor sauekoppervirus med samme konsentrasjon som vaccinia.

Konsentrasjonene nevnt ovenfor indikerer nivåene ved hvilke det oppnås en fullstendig hemning; av cytopatisk effekt hos vedkomm-ende virus.

Med.hensyn til terapi benyttet på mennesker kan 5-nitro-2'-deoksyuridin administreres topikalt i form av salver eller.oppløs-ninger. Alternativt kan stoffet gis oralt, eller parenteralt.

Claims (1)

1. Fremgangsmåte til fremstilling av antivirus-virksom 5_nitro-2'-deoksyuridin med formelen: n

   karakterisert , v e d at en vandig -opplosning inneholdende 5-nitrouracil og tymidin i forholdet 10:1 til 1:10 inkuberes ved 30° - 4-0°C i 2-5 timer ved en pH på mellom ca. 6 og 7 i nærvær av den enzymatiske aktivitet frembragt ved fermentering av Lactobacillus leichmannii.