NO121723B - - Google Patents

Description

Fremgangsmåte ved fremstilling av hydroxocobalamin.

Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte for indu-

striell fremstilling av hydroxocobalamin ut fra cyanocobalamin.

Cyanocobalamin (eller vitamin B 12) som i det organiske

molekyl av kompleks struktur inneholder en cyangruppe CN, er kjent.

En beskrivelse av vitamin B 12 og en fullstendig formel såvel som en

oversikt over dets egenskaper finnes f.eks. i 1960-utgaven av "Merck Index", side 1098.

Der er idag en tendens til i stedet for det ovennevnte cy-

anocobalamin å anvende hydroxocobalamin, som også kalles vitamin B 12b, for de samme farmasøytiske formål. Denne forbindelses formel kan avledes fra formelen for cyanocobalamin ved at cyangruppen erstat-

tes med en hydroxylgruppe OH.

Hydroxocobalamainet,som har basiske egenskaper, kan let-tere gå inn i individenes metabolisme.

Der er hittil kjent forskjellige fremgangsmåter til over-foring av vitamin B 12 til vitamin B 12b. Eksempelvis kan man efter en kjent metode fjerne cyanocobalaminets gruppe CN~ i surt miljb og erstatte den med et annet anion som Cl", og derefter overfore den således erholdte ester til hydroxocobalamin.

Den forste reaksjon gir imidlertid et meget lite utbytte, idet cyanocobalaminet praktisk talt ikke ioniseres, så at fremgangsmåten ikke er av særlig interesse fra industrielt synspunkt.

Efter en annen kjent metode hydrogeneres cyanocobalaminet katalytisk hvorved det overfores til cobalamin, som derefter oxyderes til hydroxocobalamin.

I denne fremgangsmåte er imidlertid utbyttet avhengig av katalysatoren hvis effektivitet kan variere med tiden og for hver ut-forelse av prosessen. Dessuten befinner cobalaminene sig i nærvær av hydrogen i et betydelig tidsrom. Dette er skadelig, hvilket vil bli forklart i det folgende.

En tredje kjent metode omfatter likeledes hydrogenering med påfolgende oxydasjon, hvorved hydrogeneringen utfores i en cyano-cobalaminopplosning med nascerende hydrogen.

Spesielt er der tidligere beskrevet en fremgangsmåte i hvilken en syre omsettes med et toverdig salt som går over til tre-verdig under frigjoring av hydrogen, i nærvær av cyanocobamaminet. Eksempelvis kan man omsette saltsyre med ferroklorid eller svovelsyre med natriumbisulfit. Efter frafiltrering av den dannede utfeldning reoxyderes oppløsningen ved gjennombobling av luft.

Denne fremgangsmåte, som utgjor en forbedring av den foran nevnte fremgangsmåte, oppviser like fullt den mangel at cobalaminene i et betydelig tidsrom holdes i nærvær av hydrogen.

Der er likeledes foreslått å utfore reduksjonen ved tilsetning av et metall (Fe eller Zn) i en sur opplosning av cyanocobalamin. Denne fremgangsmåte er imidlertid uten interesse fra industrielt synspunkt, da de mengder syre og metall som forutsettes anvendt, gir et hydrogentrykk som er utilstrekkelig for oppnåelse av den on-skede hydrogeneringshastighet. Fremgangsmåten er derfor ikke lonnsom. Dessuten forutsetter denne fremgangsmåte omroring av reaktantene, hvad der gjor det vanskelig å oppnå reproduserbare driftsbetingelser.

I henhold til en annen metode utfores hydrogeneringen ved

å lede en blanding av en opplbsning av en syre og cyanocobalamin gjennom en kolonne av granulert sink. Opplosningen som taes ut fra kolonnen, reoxyderes derefter straks ved gjennombobling av luft.

Denne fremgangsmåte medfbrer betydelige fordeler sammen-lignet med den forannevnte fremgangsmåte hvor et toverdig salt anvendes, fordi hydrogeneringen her utfores kontinuerlig, slik at det hyd-rogenerte produkt ikke holdes tilbake i reduserende miljb, hvad der i betydelig grad minsker risikoen for avbygning av cobalaminene.

Selv i denne fremgangsmåte kan imidlertid visse vanskelig-heter oppstå som folge av at hydrogeneringen varierer med den hastig-het med hvilken væsken ledes over sinken, samt med sinkens kornstor-relse og kvalitet. Det er derfor nbdvendig å regulere alle faktorer for hvert enkelt tilfelle.

I alle fremgangsmåter som omfatter innvirkning av en syre på et metall og utvikling av gassformig hydrogen kan rH-verdien av opplosningen som skal hydrogeneres, ansees å være lik null. rH-verdien gir som kjent uttrykk for en opplbsnings oxydo-/reduksjonspoten-sial. Den har verdien null i det tilfelle hvor der foreligger fritt hydrogen av atmosfæretrykk og verdien 41 i det tilfelle hvor der foreligger fritt oxygen av atmosfæretrykk, mens der ved en rH-verdi på 21,5 praktisk talt ikke kan registreres noen aktivitet. rH-verdien gir således et mål på en opplbsnings reduksjons- eller oxydasjonsevne.

I og med at rH-verdien er null ved de kjente fremgangsmåter, kan opplbsningens reduksjonsevne ikke reguleres. Man risikerer således at hydrogeneringen går lengere frem enn bnsket, hvad der kan medfbre ubnskede endringer i cobalaminmolekylet.

Ved foreliggende oppfinnelse avhjelpes ulempene ved de kjente fremgangsmåter, idet den muliggjbr den bnskede omdannelse av cyanocobalamin til hydroxocobalamin under optimale betingelser, spesielt hvad angår reduksjonsevnen av det anvendte hydrogeneringsmiljb. Der skaffes herved en fremgangsmåte for industriell fremstilling av hydroxocobalamin.

I fremgangsmåten ifblge oppfinnelsen reduseres cyanocobalamin i nærvær av et ioniserbart ferrosalt med påfblgende oxydasjon, og det karakteristiske hovedtrekk ved oppfinnelsen er at man danner en vandig opplbsning av cyanocobalaminet og det ioniserbare ferrosalt, hvilken opplbsning har en rH hbyere enn 20,5 og en pH mellom 3 og 5, fortrinnsvis mellom 3,2 og 4,5, gradvis tilsetter en sterk uorganisk base til opplosningen inntil dens rH er blitt lavere enn 20,5 og dens pH hoyere enn 6,2, hvorved cyanocobalåminets CN-grupper utfelles fra opplosningen som ferro-ferrocyanid - og enten skiller utfeldningen fra opplosningen, fortrinnsvis ved en pH-verdi mellom 7,2 og 8, bobler en oxyderende gass gjennom opplosningen, hvorved jern utover det som ble utfeldt som ferro-ferrocyanid, utfelles i form av ferrihydroxyd, og foretar en ny separasjon for å skille ferrihydroxydet fra opplosningen - eller fortsetter tilsetningen av den sterke uorganiske base inntil pH-verdien har nådd en verdi mellom 8,5 og 10, hvorved alle ferroforbindelser inklusive ferro-ferrocyanid utfelles fra opplosningen, skiller de utfeldte forbindelser fra opplosningen og tilsetter den tilbakeblivende opplbsning en sterk uorganisk syre, såsom saltsyre eller svovelsyre, inntil oppløs-ningens pH-verdi er blitt mellom 5,5 og 6 og derefter bobler en oxyderende gass gjennom opplosningen.

Ved denne fremgangsmåte kan ikke bare rH-verdien reguleres efter bnske, hvad der muliggjbr oppnåelse av en regulert ionisering og ikke en partiell hydrogenering, men dertil oppnåes der en fullstendig reaksjon fordi man kan fjerne CN-gruppen efterhvert som den frigjbres, i form av et uopplbselig ferrocyanid.

Av denne grunn forskyves likevekten fullstendig uten at det er nbdvendig å ty til en sterk reduksjonsvirkning som ville kun-ne angripe visse deler av cobalaminenes komplekse molekyl.

Det konstateres dessuten at opplosningen, som opprinnelig var rod, skifter farve fra pH 6,2 - 6,5 og blir brun, samtidig som ferrocyanidet utfelles. Reaksjonen er praktisk talt momentan. Når man efter filtrering bestemmer innholdet av cyanid ved hjelp av de mest fblsomme metoder ved hvilke der kan påvises f.eks. 0,3 -y/liter opplbsning, blir prbven negativ, hvilket viser at der oppnåes kvanti-tativt utbytte som folge av at en av likevektsfaktorene (den ioniser-te cyangruppe som inngår i ferrycyanidet) fjernes ved utfeldning.

Den konstaterte farveendring indikerer overgangen av co-bolt i cyanocobalaminet fra den treverdige til den toverdige til-stand, eller fra den oxyderte form til den reduserte form. Det er videre å merke at den således oppnådde omdannelse svarer til ionisering av hele mengden av cyanocobalaminet.

Som foran angitt innstilles pH-verdien av utgangsopplbsningen inneholdende cyanocobalaminet og.det ioniserbare ferrosalt fortrinnsvis mellom 3,2 og 4,5, mens nøytraliseringen av utgangsopp- losningen med den sterke base utfores inntil en pH-verdi hoyere enn 6,2. Der kan nøytraliseres opp til en pH-verdi på 9 - 9,5 uten at der derved oppstår noen vanskelighet, hvilket muliggjor utfeldning av alt ferro-ferrocyanid.

I henhold til en fordelaktig utfbrelsesform av fremgangsmåten anvendes cyanocobalaminet i form av en vandig opplbsning med en konsentrasjon mellom 2COO og 15000 y/ml, mens det ioniserbare ferrosalt er av ferroklorid eller ferrosulfat som anvendes i en sådan mengde at ferrosaltkonsentrasjonen i den erholdte opplbsning blir mellom 0,025 og 0,20 mol pr. liter. Det skal imidlertid under-strekes at ferrosaltkonsentrasjonen kan variere innenfor et meget stort område uten at dette har noen særlig innflytelse på utbyttet. Det er imidlertid fordelaktig å tilsette minst mulig ferrosalt for å lette den senere rensning.

Den sterke base som anvendes for å heve pH-verdien, er fortrinnsvis en opplbsning av natriumhydroxyd, kaliumhydroxyd, kalk eller bariumhydroxyd. Anvendelse av ammoniakk er ikke å anbefale, fordi denne kan forårsake dannelse av komplekser.

Da der inntrer ionisering med påfblgende utfeldning, er reaksjonen momentan, og det dannede produkt forblir derfor ikke i kontakt med det reduserende miljb i særlig lang tid. Omsetning av ferrosulfatet med bariumhydroxyd muliggjor dannelse av det uoppløse-lige ferrooxyd og det uopplbselige barium sulfat, slik .at der tilslutt fåes en opplbsning bare av hydroxocobalamin og meget små mengder sal-ter. Fjernelsen av jernsaltene ved tilsetning av en sterk base forer dessuten til at i det byeblikk man får et alkalisk miljb med pH-verdi 9,5 - IO, finnes der praktisk talt intet ferrosalt tilbake i opplosningen. Reduksjonsevnen er da praktisk talt redusert til null, og man risikerer ikke at det erholdte produkt bdelegges.

Når man efter utfeldningen av cyanocobalaminets CN-grupper som ferro-ferrocyanid velger det foran forst angitte alternativ ved utfbrelsen av fremgangsmåten i£ige oppfinnelsen, bor man ved gjennomboblingen med den oxyderende gass sbrge for en relativt frem-skreden oxydasjon i opplosningen. En sådan kan oppnåes f.eks. ved å anvende oxygen i stedet for luft.

Denne gjennombobling med oxyderende gass, som jo utgjor

et av trinnene i begge alternativer, forårsaker dannelsen av hydroxo-cobalaminet, hvorved cobalt i cobalaminet går over fra 2-verdig til 3-verdig. Oppløsningens farve slår herved over fra brun til rod.

I begge alternativer skilles det erholdte hydroxycobal-amin fra den for jern befridde opplbsning ved hjelp av i og for sig kjente metoder, som f.eks. kromatografering med påfblgende krystal-lisasjon. Herved erholdes rent hydroxocobalamin.

Analyser av denne opplbsning på cyanid og jern gir nega-tivt resultat, selv ved anvendelse av de mest fblsomme metoder. Dens innhold av hydroxocobalamin kan konstateres ved fotometrisk un-dersøkelse.

Man kan gi fblgende forklaring på fremgangsmåten ifblge oppfinnelsen, uten at man derved vil binde sig til denne forklaring: Reaksjonen mellom ferrokloridet FeC^ og cyanocobalaminet representert ved formelen:

fblgelig er 3-verdig) synes å svare til den fblgende totalreaksjon:

Denne reaksjon kan oppdeles i en rekke elementærreaksjo-ner. I nærvær av soda gir ferrokloridet som tilsettes til utgangs-blandingen, ferrohydroxyd:

Ferrohydroxydet har tendens til å hydrolyseres til ferrihydroxyd, som utfelles dersom pH-verdien overskrider 2,2:

Cyanocobalaminet som således befinner sig i reduserende miljb, går over i cobalaminformen:

Blåsyren reagerer med ferrohydroxyder, hvorved der dannes ferro(ferrocyanidet), som er et meget stabilt kompleks som utfelles fra og med pH 6,2, idet utfeldningen er total henimot pH 7,2 eller hbyere:

Utfeldningen av ferro-(ferrocyanidet) forårsaker således en stadig forskyvning av likevekten av de ovenstående reaksjoner (a) og (b).

Oxydasjonen ved gjennombobling av luft overfores cobalaminene til hydroxocobalamin:

Dersom man ved tilsetning av soda hever pH-verdien til hbyere enn 8,5 under anvendelse av den fbrste utfbrelsesform av fremgangsmåten, utfelles ferrohydroxydet Fe (OH)^som er uopplbselig i dette pH-område.

Ved den annen utfbrelsesform av oppfinnelsen oppnåes denne utfeldning ved at ferrohydroxydet overfores til ferrihydroxyd i henhold til ligningen:

Studiet av oxydasjons-reduksjonspotensialene har forbvrig vist at overgangen av pH-verdien for den erholdte opplbsning (cyanocobalamin + ferrosalt) fra en verdi i området fra 3 til 5 til en verdi hbyere enn 6,2 ved tilsetning av den sterke base ble ledsaget av en overgang av rH-verdien gjennom likevektsverdien på ca. 21,5 nett-opp for pH 6,2, idet rH-verdien svarer til et oxyderende miljb for mindre pH-verdier og et reduserende miljb for hbyere pH-verdier. Således har man ved pH = 4 en rH-verdi på 30,3, mens man ved pH = 8,5

har en rH-verdi på 8,6.

Fblgende eksempler vil ytterligere illustrere oppfinnelsen:

Eksempel 1

48 g cyanocobalamin opplbses i 6 liter vann, hvilket gir en konsentrasjon av ca. 8000 y/ml cyanocobalamin.

Under omrbring tilsettes 64 g krystallinsk forroklorid. Krystallene opplbses straks, og der erholdes en opplbsning av konsentrasjon ca. 0,083 mol/liter. Den således erholdte utgangsopplbsnings pH-verdi er 3,4. Opplosningen forblir rod, og der foregår ingen reaksjon.

Utgangsopplbsningen tilsettes en IN opplbsning av soda under omrbring og under overvåkning av pH-verdien. Sistnevnte oker, og fra og med pH 6,2 endrer opplosningen farve og blir brun (hvilket svarer til overgangen av cobalaminene fra den 3-verdige form til den 2-verdige form), og der foregår utfeldning av ferro-(ferrocyanidet).

Tilsetningen av soda fortsettes inntil der er nådd en pH-verdi på 7,5. Blandingen omrbres i IO minutter under omrbring, hvorefter der tilsettes ytterligere mengder soda inntil en pH-verdi på 8,8 er nådd. Herved utfelles overskuddet av ferrosalter.

Blandingen filtreres, og filtratet tilsettes litt syre (fortrinnsvis saltsyre eller svovelsyre) for å bringe pH-verdien tilbake til området 5,5 - 6.

Derefter utsettes opplosningen for luftning ved at den gjennombobles i 15 minutter av en oxyderende gass såsom luft. Opplosningen blir påny rod. Spektralanalyse gir de karakteristiske kjenne-tegn på hydroxocobalamin. Opplosningen tilsettes 80 % aceton, hvorefter der kromatograferes på aluminiumoxyd og elueres med 50 % aceton. Den erholdte midlere fraksjon krystalliseres ved tilsetning av aceton og holdes i 24 timer ved forminsket temperatur (ca. 5°C).

Der erholdes således 40 g vakre krystaller hvis spektre i surt og basisk miljb svarer til spektrene for rent hydroxocobalamin. Dessuten viser pH-kurven den pufferutflatning som er karakteristisk for hydroxocobalaminets basiske funksjon mellom pH 6,2 og pH 8,4.

Selv de mest fblsomme metoder for påvisning av cyanid og jern gir negative resultater.

Eksempel 2

24 g cyanocobalamin opplbses i 6 liter vann. Der tilsettes 50 g hydratisert ferrosulfat, hvilket gir en sluttkonsentrasjon på ca. 0,025 mol/liter. Oppløsningens pH-verdi er 4,2.

Under.omrbring tilsettes der en opplbsning av IN kaliumcarbonat under overvåkning av pH-verdien. Fra og med pH 6,4- 6,5 for-andrer opplosningen farve, og ferro-(ferrocyanidet) begynner å utfelles.

Tilsetningen av kaliumcarbonat tilsettes inntil pH 8, hvorefter opplosningen omrbres i IO minutter. Derefter fortsettes tilsetningen av kaliumcarbonat inntil pH 8,5 - 9, hvilket fullfbrer utfeldningen av overskytende mengder ferrosalter. Der filtreres, filtratets pH-verdi bringes tilbake til ca. 5,5, og der bobles luft gjennom filtratet i 20 minutter.

Den således behandlede opplbsning kromatograferes derefter på aluminiumoxyd, hvorefter det krystalliseres. Ved fraskillelse av krystallene og tbrring erholdes 19 g hydroxocobalamin.

Eksempel 3

60 g cyanocobalamin opplbses i 6 liter vann, slik at der fåes en konsentrasjon av ca. 10 OOO y/ml.

Der tilsettes under omrbring 50 g krystallinsk ferroklorid som straks opplbses. Konsentrasjonen av den erholdte opplbsning er ca. 0,067 mol/liter, og dens pH-verdi er 3,5. Opplosningen er fortsatt rod..

Under fortsatt omrbring og under overvåkning av pH-verdien tilsettes der en IN opplbsning av natriumcarbonat. pH-verdien ok-er til over 6, og opplosningen skifter farve fra rbdt til brunt. Tilsetningen av natriumcarbonat fortsettes inntil pH 7,9, hvorefter om-rbringen fortsettes IO minutter. Ferrocyanidet utfelles.

Der filtreres for å fraskille ferrocyanidet, og opplosningen oxyderes ved gjennombobling av gassformig oxygen i IO minutter. Ferrooxydet overfores derved til ferrioxyd, som utfelles, og cobalaminene skifter fra valensen 2 til valensen 3, idet der dannes hydr-oxycobalamin. Der filtreres påny for å fraskille de utfeldte ferri-sailter, hvorefter der til den erholdte opplbsning tilsettes aceton og der kromatograferes på aluminiumoxyd som i eksempel 1. Mellom-fraksjonen krystalliseres ved pH 9. Der erholdes således 47 g vakre, rene krystaller av hydroxocoba-lamin.

Eksempel 4

I 60 liter vann opplbses 240 g cyanocobalamin og 600 g ferrosulfat med 7 hydratvann. pH-verdien blir 3,8. Under omrbring tilsettes der langsomt bariumcarbonat under overvåkning av pH-verdien. Ved pH 8 konstateres der en meget pufret sone som svarer til utfeldningen av ferrooxydene.

Efter tilsetning av 700 g bariumcarbonat er pH-verdien 9,9 - IO. Efter filtrering er væskens pH-verdi 9,2.

Der tilsettes svovelsyre inntil pH 5, og blandingen luft-behandles.

Efter kromatografering og krystallisering erholdes 190 g rent hydroxocobalamin.

Eksempel 5

50 g cyanocobalamin opplbses i 6 liter vann sammen med

50 g ferrosulfat FeS04-7 H20.

Under omrbring tilsettes der langsomt kalk, idet bkningen av pH-verdien overvåkes.

Påny konstateres der at der ved pH 8 fåes en meget pufret sone som svarer til utfeldningen av ferrooxydet.

Tilsetningen av kalk fortsettes inntil der er erholdt en pH-verdi på 9,9 - 10. Efter filtrering er pH-verdien av den erholdte væske 9,3.

Der tilsettes svovelsyre inntil pH 5, og blandingen luft-behandles for å oxydere cobalaminene.

Der filtreres påny for å fjerne det utfeldte kalsiumsul-fat, hvorefter der kromatograferes og krystalliseres efter de vanlige metoder.

Der erholdes 46 g hydroxocobalamin.

Fremgangsmåten ifblge oppfinnelsen muliggjor således omdannelse av cyanocobalamin til hydroxocobalamin under oppnåelse av et hbyt utbytte, uten at det er nbdvendig å anvende katalysatorer eller metallpulver og uten gassutvikling. Reaksjonen kan således utfores meget raskt og lett under anvendelse av meget enkelt utstyr. Dessuten er utbyttet pr. tidsenhet hbyt.

Claims (2)

1. Fremgangsmåte ved fremstilling av hydroxocobalamin (vitamin B 12b) ved reduksjon av cyanocobalamin (vitamin B 12) i nærvær av et ioniserbart ferrosalt og påfolgende oxydasjon, karakterisert ved at man danner en vandig opplbsning av cyanocobalaminet og det ioniserbare ferrosalt, hvilken opplbsning har en rH hbyere enn 20,5 og en pH mellom 3 og 5, fortrinnsvis mellom 3,2 og 4,5, gradvis tilsetter en sterk uorganisk base til opplosningen inntil dens rH er blitt lavere enn 20,5 og dens pH hbyere enn 6,2, hvorved cyanocobalaminets CN-grupper utfelles fra opplosningen som ferro-ferrocyanid - og enten skiller utfeldningen fra opplosningen, fortrinnsvis ved en pH-verdi mellom 7,2 og 8, bobler en oxyderende gass gjennom opplosningen, hvorved jern utover det som ble utfeldt som ferro-ferrocyanid, utfelles i form av ferrihydroxyd, og foretar en ny separasjon for å skille ferrihydroxydet fra opplosningen - eller fortsetter tilsetningen av den sterke uorganiske base inntil pH-verdien har nådd en verdi mellom 8,5 og IO, hvorved alle ferroforbindelser inklusive ferro-ferrocyanid utfelles fra opplosningen, skiller de utfeldte forbindelser fra opplosningen og tilsetter den tilbakeblivende opplbsning en sterk uorganisk syre, såsom saltsyre eller svovelsyre, inntil oppløsningens pH-verdi er blitt mellom 5,5 og 6 og derefter bobler en oxyderende gass gjennom opplosningen.

2. Fremgangsmåte ifblge krav 1, karakterisert ved at cyanocobalaminet anvendes i en konsentrasjon av mellom 2000 og 15000 y/ml.