NO131940B - - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører et vaske- og rensemiddel inneholdende et nytt alkaliprotease-enzym.

Ved undersøkelser er det nå funnet at visse mikroorganismer som tilhører slekten Fusarium eller slekten Gibberella frembringer en alkaliprotease som har en meget sterk proteolytisk aktivitet omkring pH 11.

Det er dessuten funnet at nevnte proteaseaktivitet nedbryter forskjellige typer protein i et basisk pH-område selv i nærvær av overflateaktive midler og/eller gelaterende forbindelser, noe som gjør at proteasen kan anvendes i vaskemidler.

Skjønt man allerede har anvendt visse enzymer ved vasking og rensing, så har man ikke alltid oppnådd tilfredsstillende resultater. En av de mulige grunner til dette er at renseopp-løsningen vanligvis har en pH på over 8. En annen årsak er at enzymaktiviteten i visse tilfeller inhiberes av overflateaktive midler og/eller gelaterende midler som finnes i vaskemidlene. Aktiviteten til alle kjente proteaser avledet fra mikroorganismer inhiberes av PCMB(p-klorkvikksølvbenzoat)men dette er ikke tilfelle med den protease som anvendes i foreliggende oppfinnelse.

Det er således funnet at det kan oppnås en virksom alkaliprotease på kommersiell basis, og at denne kan anvendes i vaskemidler og andre rensemidler. I det følgende vil- enzymet

bli betegnet som "alkaliprotease".

Hensikten med foreliggende oppfinnelse er således å tilveiebringe et vafeke- og rensemiddel inneholdende en alkaliprotease som har en sterk aktivitet og er stabile i pH-området fra 10 til 12.

Ifølge foreliggende oppfinnelse er det således, tilveie-bragt en vaske- og rensemiddelblanding inneholdende en overflate-aktiv vaskemiddelforbindelse, byggere og vanlig benyttede vaske-middeladditiver samt et proteolytisk enzym, og denne blanding er kjennetegnet ved at enzymet er fremstilt ved dyrking av en mikroorganisme i et medium inneholdende assimilerbare karbonkilder og nedbrytbare nitrogenkilder under aerobe dyrkningsbetingelser, hvoretter det akkumulerte enzym'(alkaliprotease) utvinnes, idet det som mikroorganisme anvendes Fusarium oxysporum (IFO 5942), Fusarium oxysporum f. lini (IFO 5880), Fusarium oxysporum f. niveum (IFO 4471), Fusarium solani (IFO 5232), Fusarium sp. S-19-5 (IFO 8884), Gibberella fujikuroi (IFO 5268) eller Gibberella saubinetii (IFO 6608), og at enzymet har maksimal aktivitet ved pH 10-12.

Blant de ovenfor angitte mikroorganismer er seks hittil tidligere kjente og tilgjengelige. Fusarium sp. S-19-5 (IFO 8884) er hittil ukjent og er deponert ved ATCC som nr. 20.192.

De IFO-tall som er angitt i parentes er tilveksttallene ved Institute of Fermentation, Osaka, Japan.

A. Fusarium sp. S- 19~ 5

Denne mikroorganisme er en av de mest brukbare stammer for fremstilling av alkaliprotease. Denne stamme ble isolert fra en jordprøve og den har følgende mikrobiologiske karakteristika.

(I) Kulturkarakteristika (24°C), 7 døgn.

1. Maltekstrakt:

Det dannet seg en hvit, utflytende hinne som var rynket på

baksiden,svakt rødaktig pigment i mediet.

2. Maltagar:

God vekst, hvit og utflytende, rikelig med lufthyfer, rynker

på baksiden, svakt rødlig pigment i mediet.

3- Czapeck's oppløsning:

God vekst, det dannet seg en hvit, utflytende hinne som var rynket på baksiden, i alt vesentlig intet pigment i mediet. h. Czapeck's agar: God vekst, hvit og utflytende hinne som var rynket på baksiden,

i alt vesentlig intet pigment.

5- Gelatin:

God vekst, det laget seg en hvit og utflytende hinne med et

svartaktig purpurpigment på baksiden, svak væskedannelse.

6. Potetdekstrose:

God vekst, hvit og utflytende hinne med ujevn og rynket bakside,

hvit til svakt purpur, purpuraktig pigment frigjort i mediet.

(II) Mikroskopiske karakteristika.

På hver. av de ovennevnte media dannet det seg ugrenede, hyaline conidioforer fra lufthyfene, de var fra 10 til 16 u lange.og fra 1,0 til 1,5 U brede. Hyaline conidier dannet seg apicalt på conidioforen og satt sammen i slimaktige klumper, de var svakt ovale til nyreformede, fra en til to-cellede, sjelden tre-cellede, fra 5 til 8 ganger 1 til 2 y. Intet seksuelt stadium utviklet seg. Chlamydosporer var vanligvis fraværende,

noen ganger tilstede.

(III) Fysiologiske karakteristika.

1. Vekstbetingelser:

Hydrogenionekonsentrasjon: Gror fortrinnsvis i alkalisk medium, optimalt mellom pH 8,0 og 9>0. Temperatur: Optimalt ved ca. 2H°C. Vekst opptrer mellom 15 og 28°C, dog bedre omkring 15°C

enn omkring 28°C. Oksygenkrav: aerob.

2. Gelatin: væskedannelse:

Svak.

3- Anvendelse av etylalkohol:

Negativ.

4. - Nedbrytning av pektin:

Meget svak.

5- Nedbrytning av tannin:

Negativ.

6. Nedbrytning av fett og oljer:

Positiv.

7. Anvendelse av karbohydrater:

Anvender maltose, galaktose, melibiose, sukrose, trehalose, fruktose, mannose, raffinose, dekstrin, stivelse, glukose og 'laktose. Har svak anvendelse av inulin, xylose,' arabinose gg cellulose.

Ifølge "Dictionaiy of the Pungi" (G.C. Ainsworth, 5« utgave), indikerer nevnte mikrobielle karakteristika at denne spesielle stamme tilhører slekten Fusarium, familien Tuberculariaceae, ordenen Moniliales, underklassen Deuteromycetes,. klassen Fungi Imperfecti.

Basert på Snyder & Hansens klassifikasjon blir Fusarium delt i seksjon A-j^ og A^ på følgende måte:

A-jj Mikroconidier utvikles, vanligvis en-cellede.

A^'- Ingen mikroconidier utvikles eller kun meget

sjelden, spindel, komma eller nyre-formede, fra en til fler-cellede..

Organismen Fusarium sp. S-19_5 utvikler mikroconidier i meget høy grad og kan inkluderes i Elegans-gruppen i seksjon A^. Elegan.s-gruppen er typifisert ved Fusarium oxysporum og innbefatter 36 arter som-alle er plantepatogener som utvikler rikelig med makroconidier.

Organismen Fusarium sp. S-19_5 utvikler imidlertid bare mikroconidier i de fleste tilfeller, og dannelsen av makroconidier er meget sjelden. Dette karakteristikum indikerer at organismen ikke kan føres til noen av de hittil kjente arter i denne gruppe.

B. Fusarium oxysporum ( IFO 5942)

Stroma er brun-hvit til fiolett, plektenchymatisk, glatt, avlang, eller farget grønn til blå-sort ved frembrudd, og utgjøres av sklerotiske harde legemer med en tykkelse på 0,5~3 mm eller

3-6 mm, delvis rynket, under fuktige betingelser vanligvis dekket av knippestilt, middels høyt luftmycelium som senere danner

sporodochia, mer sjelden pionnoter med tre-septat tein-sigd-formede conidier, buede eller nesten rette, stilket eller svakt stilkformet. Mindre conidier er en eller to-cellede, ovale til nyreformede, rikelig i luftmycelium, men mangler i makroconidienes typiske frukt lag:

0- septat, 5-15 x 2-4y

1- septat, 10-26 x 2-4,5u

3-septat, 19-45 x 2,5~5p

5-septat, 30-60 x 3,5~5y

Klamydosporer er endestilte og innskutte, kuleformede, glatte eller rynkede, en-cellede sjelden to-cellede, i hyfer og donidier, 5~15y i mycelium, noen ganger tykkere, nemlig 10-15v-

C. Fusarium oxysporum f. lini ( IFO 5880)

I naturen forekommer conidier noen ganger i sporodochia med tre-septat, 21-41 x 2,5_4y, krem til rosafarget masse. Ved dyrking på gunstige media dominerer mikroconidier. Enkeltisoler-inger med sporodochial utvikling viser tre- (tre- til fem-) septat makroconidier: tre-septat 21-41 x 2,5-4,5y og fem-septat 33~50 x 3j5_4,5y. Mikroconidier en-cellede, 6-12 x 2-3y, en-septat, 9~23 x 2~3y. Makroconidiene varierer i form fra F. orthoceras til F. oxysporum. Stroma er forskjellig farget, hyalin, brun-hvit, grønn-aktig, rosa .til rød (under alkaliske betingelser fiolett til blå), sklerotisk frembrutt stromata noen ganger tilstede, grønn til mørke blå. Klamydosporer er kule- til pæreformede, glatte eller rynkede, 5-13y» vanligvis en-cellede, endestilte og innskutt, forekommer i stort antall.

D. Fusarium oxysporum f. niveum ( IFO 4471)

Adskiller seg fra typen ved de noe tykkere conidier og den mettede purpur-røde farge (som blir blå i alkali) til den om-fattende stroma. Mycelium er hvitt, karmin, rosa eller purpur. Stroma er noen ganger formet som sklerotisk frembrudd med mørke

blå farge. Sklerotiske legemer er relativt store med en diameter på opptil 3-6 mm og forekommer sjelden, idet de forsvinner i gamle kulturer eller blir fargeløse. Makroconidier er en-cellede^ elliptisk formede eller litt septat, .rette eller buede, rikelig i luftmycelium. Makroconidier befinner seg i sporodochia eller lys oransje-røde pionnoter, tre- til fem-septat, lange, nesten sylindrisk til tein-sigdformde, avsmalende ved endene, endespisser noe inn-

snevret, krok- eller konus-formet, rett avskåret ved basis, konus-formet eller stilkformet: 0- septat, 5-12 x 2-4y 1- septat, 10-24 x 2,5"5y

3-septat, 24-50 x 3~4,7y

5-septat, 40-66 x 3~5y

Klamydosporer typiske, endestilte eller innskutt, kule-eller eggformede, glatte, mindre (5~10y) i conidier, større (7-21 x 6-17y) i mycelium, en- eller to-cellede.

E. Fusarium solani ( IFO 5232)

Conidier spredt i falske hoder, sporodochia■eller pionnoter, i masser er de brun-hvite til sand-gule eller grønne til mørke brune, læraktig eller sklerotisk stromata som er blå- eller grønnflekkede. Større conidier er sterkt vridde og svakt buet, begge ender har avrundet til kjegleformet basis med et knapt merkbart vorteformet legeme beliggende' på skrå i forhold til lengde-aksen, sjelden noe stilkformet, tre- til fem-septat:

0- septat, 11 x 3,8y

1- septat, 20 x 4,3y

3-septat, 19-50 x 3,5"7y

5-septat, 32-68 x 4-7y

Klamydosporer endestilte og innskutt, brune, enkeltvise, kule- til pæreformede, en-cellede, 8 x 8y, to-cellede, 9_l6 x 6-10y; forekommer en sjelden gang i kjedeform eller knuteform med glatte, noen ganger vortebelagte (i tørr tilstand) vegger.

F. - Gibberella fujikuroi ( IFO 5268)

Peritesier vokser i klynger, sammenløpende-kvaster og sammenvoksende, læraktig-hinnelignende, vortet, i lengden bøyelig, foldet, eggformet, noe sammentrukket ved basis, blåaktig, 200-300

x 170-220y, vortet. Asci avlang-lanseformet, øverst tilspisset, sammensnevret ved basis til en kort, tykk stengel, 8-sporet, 50-60

x 10-13y. Sporodier enradet eller delvis toradet, teinformet, buet eller rett, tilnærmet spiss, 3-septat, men nesten ikke sammensnevret, nesten hyaline, 14-18 x 4,5~7y. Conidialt trinn, Fusarium moniliforme.

G. Gibberella saubinetii( IFO 6608)

Peritesier vokser i klynger, sammenløpende-kvaster og sammenvoksende, læraktig-hinnelignende, vortet, i lengden bøyelig,

foldet, eggformet, noe sammentrukket ved basis, blåaktig, 200-

300 x 170-220y. Asci avlang-lanseformet, øverst tilspisset, sammensnevret ved basis til en kort, tykk stengel, 8-sporet,

60-76 x 10-12y. Sporodier enradet eller delvis toradet, teinformet, buet eller rett, noe tilspisset, 3-septat, men nesten ikke sammensnevret, nesten hyaline, 18-24 x 4-5y. Conodialt trinn, Fusarium roseum.

For de to sistnevnte mikroorganismer under F og G skal det nevnes at deres karakteristika er tatt fra Sacc. Sylloge. Fra de prøver som har vært for hånden har man funnet det vanskelig å skille dem fra hverandre.

For å dyrke en alkaliprotease-fremstillende mikroorganisme kan man anvende konvensjonelle dyrkningsmedia og betingelser som i seg selv er kjente.

Mediet kan brukes enten i form av en væske eller et

fast stoff. Dyrkningen kan utføres under stasjonære betingelser, men det er imidlertid mer fordelaktig å anvende rystedyrknings-metoder eller aerobe dyrkningsmetoder.

Sålenge den alkaliprotease-fremstillende mikroorganisme kan vokse på mediet, kan man bruke hvilket som helst. Det kan f.eks. som karbonkilde inneholde forbindelser som glukose, sukrose, dekstrin, stivelse, cellulose, glycerol, sorbitol og lignende,

og som nitrogenkilder forbindelser som pepton, kjøttekstrakt, gjærekstrakt, tørket gjær, soyabønnemel, soyabønneolje, riskli, hvetekli, potet ekstrakt, kasein, gluten, kaseinhydrolysat, maisolje, urea, ammoniumsalter, nitrater og andre organiske eller uorganiske nitrogenholdige forbindelser. Videre kan man f.eks. inkorporere uorganiske salter som fosfater, sulfater og hydroklorider. Under visse omstendigheter for å fremme eller å styrke veksten av mikro-organismen kan man tilsette vitaminer, aminosyrer, nukleinsyrer og tilsvarende forbindelser. Alt avhengig av de metoder og betingelser som anvendes kan man effektivt tilsette naturlige eller syntetiske skumbrytningsmidler, f. eks. soyabønneoljer eller silikon-oljer, for derved å få en øket akkumulasjon av enzymet.

Ved dyrkningen er det foretrukket først å fremstille en mindre forkultur som så brukes for å inokulere hovedkulturmediet.

Dyrkningsbetingelser som inkubasjonstemperatur og tid, mediets pH, lufttilførselshastigheten, etc, vil variere alt etter

de mikroorganismer og medier man anvender.

Det eneste krav som stilles er at betingelsene velges

og reguleres slik at akkumuleringen av alkaliproteasen er maksimal.

1 de fleste tilfeller vil de foretrukne betingelser innbefatte en inkubasjonstemperatur fra 20 til 30°C, en inkubasjonstid fra 2 til 7 døgn, et medium hvis pH er nær 7 samt en gjennomluftningshastighet på fra 0,5 til 1,5 liter pr. minutt pr. liter medium.

Det vil under disse betingelser skje en ganske vesentlig akkumulering av alkaliproteasen i kulturen.

Når man anvender et flytende medium vil mesteparten av enzymet forefinnes i kulturens flytende fase. I dette.tilfelle er det derfor foretrukket først å fjerne mycelet ved filtrering' el-ler sentrifugering, og deretter utvinne og isolere enzymet fra filtratet eller supernatanten.

Når man anvender et fast medium, er det vanligvis foretrukket først å ekstrahere kulturen med vann eller en vandig opp-løsning av et uorganisk salt, og deretter utvinne enzymet fra det resulterende ekstrakt.

Por å utvinne og isolere enzymet fra dyrkningsfiltratet, supernatanten eller ekstraktet,- kan man anvende hvilken som helst av i seg selv kjente og vanlige isolasjons- og renseteknikker.

Disse innbefatter utsaltning av enzymet med et uorganisk salt som f.eks. natriumsulfat, ammoniumsulfat eller natriumklorid, fraksjon-ert utfelling av enzymet ved tilsetning av et egnet hydrofilt organisk oppløsningsmiddel som metanol, etanol eller aceton. I tillegg kan enzymoppløsningen konsentreres under redusert trykk og/eller demineraliseres ved dialyse. Man kan dessuten anvende adsorbsjon og desorbsjon på kalsiumfosfatgel, aluminiumoksyd, bentonit, ioneutbytningsharpikser etc, kromatografi ved å anvende et cellulosederivat, f.eks. dietylaminoetylcellulose, gel-filtrering, utfelling, elektrodialyse, elektroforese og fjerning av urenheter som tunge metallkomplekser.

Den optimale temperatur for aktiviteten til det benyttede enzym ligger et sted mellom ca. 20 og ca. 60°C, og da mer spesielt mellom ca. 40 og ca. 50°C. Dette temperaturområde for aktiviteten er i god overensstemmelse med vanlige vaske- og rensebetingelser. Aktiviteten er videre ikke inhibert av overflateaktive midler og/eller gelaterende forbindelser, som ofte er bestanddeler i vaske-

produkter eller rensemidler.

Alakliproteasen kan anvendes ikke bare som et høyrent preparat, men også som et mer urent enzymprodukt som kan fremstilles i den ønskede renhet alt etter formålet. I vaskeproduktene eller rensemidlene kan man enten anvende det rene eller det mer urene enzym.

Som eksempler på overflateaktive midler i vaskeprodukter kan nevnes forbindelser som anioniske overflateaktive midler av fettsyresalttypen, sulfattypen eller sulfonattypen, såsom naturlig fettsyresåpe (NS), alkylsulfat (DAE), olefinsulfat, n-a-olefinsulfonat (AOS), tetrapropyIbenzensulfonat (ABS) og n-alkyl-benzen-sulfonat (LAS), og ikke-ioniske overflateaktive midler av eter eller estertypen, såsom polyoksyetylenalkyletere, polyoksyetylenalkyl-fenoletere, polyalkoholalkylestere, polyoksyetylenalkylestere, sukkerestere og lignende.

Vaskeproduktene eller rensemidlene inneholder byggere

som tri-polyfosfat, sulfater, karbonater, borater. Videre kan de inneholde karboksymetylcellulose, fluoreserende fargestoffer, parfymer, blekemidler som f.eks. perborater, gelaterende forbindelser, f.eks. (N(CH^COONa)^, hudbeskyttende midler som f.eks. dimetyllaury1-aminoksyd, desinfeksjonsmidler som f.eks. tertiært amin, etc.

Alkaliproteasen blandes med de andre komponentene i produktet, og dette kan være i pulverform, granulær eller flytende form, og når den resulterende blanding er flytende, så kan denne tørkes til et pulverformet eller granulært produkt ved vanlige anordninger, f.eks. ved forstøvningstørkning.

Ettersom man ikke har noe internasjonalt enhetssystem

for denne type enzym, så er det på forhånd vanskelig å fastslå mengden av enzymet i vaskeproduktene eller rensemidlene.

Den benyttede alkaliproteasens aktivitet ble bedømt

ved følgende modifiserte Kunitz metode. (J.Gen. Phsiol. 30, 291» 19^7). 1,0 ml av en 2%'s vandig oppløsning av kasein (Hammar-steins'S) og 0,5 ml 0,1 molar glycin-NaOH-buffer, pH 11,0, ble blandet med 0,5 ml av en enzymbppløsning. 2,0 ml av den resulterende blanding ble inkubert ved 37°C i 20 minutter, hvoretter reaksjonen ble stoppet ved en tilsetning av 3,0 ml av en 5%'s vandig oppløsning av trikloreddiksyre. Blandingen ble hensatt ved 37°C i ytterligere 30 minutter, hvorved unedbrutt kasein ble utfelt. Det utfelte

kasein ble frafiltrert og det resulterende filtrat underkastet en måling for optisk tetthet ved 275 my, fra hvilken verdi mengden av nedbrutt kasein ble beregnet som mengden av tyrosin. En enhet av proteaseaktiviteten (PU) defineres som den mengde enzym som opp-løser en kasein-mengde ekvivalent til 1,0 yg tyrosin pr. minutt under prøvebetingelsene. En enzymprøves spesifikke aktivitet ut-trykkes som PU/mg..

Den mengde av alkaliprotease som skal tilsettes vaskeproduktene bør variere med produkttypen. Hvis man har et vaskemiddel for vasking av klær, så vil den foretrukne mengde vanligvis variere fra 5 til 10.000 enheter pr. gram vaskemiddel-, og rent praktisk fra 10 til 5.000 enheter pr. gram.

Et alkaliprotease-holdig vaskemiddel fremstilt på oven-nenvte måte har en meget sterk rensende virkning overfor protein-holdige flekker som skyldes svette, blod,' supper og melk, og som ellers er meget vanskelige å fjerne med vanlige vaskemidler.

Det enzymholdige vaskemiddel kan anvendes såvel ved

forvasking som i hovedvaskingen.

Under forvaskingen blir klærne vanligvis bløtgjort i en vaskeoppløsning ved romtemperatur i flere timer, mens hovedvaskingen fortrinnsvis utføres ved forhøyet temperatur mellom 40 og 60°C i 1 time eller mer.

I det nedenstående angis eksempler på fremstilling og rensing av det ifølge oppfinnelsen benyttede proteolytiske enzym. Prosentsatsene er beregnet med hensyn til vekten pr. volumbasis.

I eksemplene har vektdeler det samme forhold til volumdeler som gram til milliliter.

A. 500 volumdeler av et flytende medium sammensatt av 5% avfettet soyabønnemel, 5% glukose, 2% natriumdihydrogenfosfat og justert til pH 7, tilsatt en fermenteringstank (hvis kapasitet var 2000 volumdeler), sterilisert, inokulert med Fusarium sp. S-19-5 (IFO 8884) og så inkubert ved 28°C i 5 dager under gjennom-luftning og omrøring for derved å få fremstilt en inokuleringskultur.

Inokuleringskulturen ble tilsatt en fermenteringstank (hvis kapasitet var 50.000 volumdeler) inneholdende 30.000 volumdeler av samme væske som nevnt ovenfor, og hele kulturen ble inkubert ved 25°C i 144 timer med en gjennomluftningshastighet på 45.000 volumdeler luft pr. minutt under en omrøring på 500 omdr./ minutt. Under inkuberingen ble skumdannelse hindret ved at man fra tid til annen tilsatte en. mindre mengde av en soyabønneolje.

Forandring av pH samt proteaseaktiviteten under dyrkningen fremgår av følgende tabell.

B. Den kultur som ble oppnådd som beskrevet under A, ble avkjølt til ca. 5°C og deretter ført gjennom en filterpresse med et filtreringsmiddel, nemlig "Hyflo Super-Cel" hvorved mycelet ble fjernet. De resulterende 20.000 volumdeler av filtratet ble tilsatt 0, 6% mettet ammoniumsulfat og det utsaltede bunnfall ble oppsamlet -ved filtrering med et filter-tilsetningsmiddel. Det resulterende ammoniumsulfat-bunnfall inneholdende filtrerings-midlet ble oppløst i ca. 6000 volumdeler kaldt vann, hvoretter uoppløselige materialer ble fjernet ved filtrering. Filtratet ble så tilsatt en 0'^ S% mettet ammoniumsulf atoppløsning, hvorved enzymet igjen ble utfelt, det ble så-oppsamlet ved sentrifugering, oppløst i 1000 volumdeler kaldt vann, dialysert mot kaldt vann ved hjelp av et fiskeskinns-diafragma i 4 døgn og så lyofilisert til et rått enzympulver. Ved ovennevnte fremgangsmåte fikk man fremstilt 30 vektdeler av det rå enzympulver med en brun farge. Denne prøves spesifikke aktivitet var ca. 980 PU/mg.

C. 30 vektdeler av det rå enzympulver fremstilt under B

ble oppløst i 3000 volumdeler kaldt vann, og uoppløselige materialer ble frafiltrert hvorved man fikk en klar oppløsning. Det klare filtrat ble tilsatt 0, 6% mettet ammoniumsulfatoppløsning, hvorved enzymet ble utfelt, dette ble gjenoppløst i 1500 volumdeler kaldt vann, avfarget med trekull, dialysert mot kaldt vann ved 4-5°C i 4 døgn og så lyofilisert til et pulver. Den ovennevnte fremgangsmåte gir 4,5 vektdeler av et partielt renset enzympulver med en spesifikk aktivitet på 1580 PU/mg.

4,5 vektdeler av enzympulveret ble oppløst i 450 volumdeler 0,01 molar tri-HCl-buf,fer, pH 9,0, ble så dialysert mot 0,001 molar tris-HCl-buffer, pH 9,0, i 3 døgn, ble så satt på en

kolonne av dietylaminoetylcellulose som på forhånd var ekvilibrert med tris-HCl-buffer, og deretter eluert med samme buffer. Ca. 675 volumdeler av den enzymrike fraksjon ble oppsamlet, dialysert mot kaldt vann i 3 døgn og deretter lyofilisert til et pulver. Ovennevnte fremgangsmåte gir 0,35 deler av et renset enzym i pulver-tilstand, og dette har en spesifikk aktivitet på 5400 PU/mg.

0,35 vektdeler åv det rensede enzympulver ble oppløst i 335 volumdeler 0,01 molar tris-HCl-buffer, pH 8,0, blir så kromato-grafert gjennom en kolonne av "Sephadex G-100" som på forhånd var vasket med tris-HCl-buffer. 62 volumdeler av den aktive fraksjon ble oppsamlet, dialysert mot kaldt vann i 3 døgn og lyofilisert, og dette ga 0,15 vektdeler av et høyrent enzympulver. Den spesifikke aktivitet for dette høyrene pulver var 6500 PU/mg.

Denne prøve har følgende enzymatiske karakteristika:

(1) Farge og form:

Hvitt pulver.

(2) Typisk elementæranalyse (%) :

C 46,72, H 6,59, N 15,03-

(3) Sedimentasjonskonstant (S„n ):

-13 •

ca. 3,19 x 10 i;

(4) Molekylvekt (ved Archibald's metode):

2,65 x 10<4> (+5*)

(5) Ultrafiolett absorbsjonsspektrum (se fig. 1):

maksimal absorbsjon ved 275-280 my, E2g0 m^ ^ cm= 7,0.

(6) Infrarødt absorbsjonsspektrum (se fig. 2):

betydelige absorbsjonsbånd i mikron ved 3,38, 6,05, 6,55, 6,88, 7,15, 8,12 og 9,30.

(7) Isoelektrisk punkt (ved papirelektroforese):

ca. pH 11.

(8) Oppløselighet:

oppløselig i vann og vandige mineralsalt-oppløsninger med.en ionestyrke på fra 0,01 til 0,1 y. Uoppløselig i metanol,

etanol, aceton og etyleter.

(9) pH-aktivitet (se fig. 3):

optimal pH ved ca. 11.

(10) Temperaturaktivitet (se fig. 4):

optimal temperatur ved ca. 50°C

(11) pH-stabilitet (se fig. 5):

ingen deaktivering i pH-området fra 5 til 8, 10% deaktivering

ved pH 11,5 (1 times inkubering ved 37°C).

(12) Temperaturstabilitet (se fig. 6):

ingen deaktivering under 55°C, 20% deaktivering ved 65°C og 80% deaktivering ved 70°C (10 minutters inkubering ved pH 5).

Følgende eksempler illustrerer oppfinnelsen.

Eksempel 1.

Virkningen av flere forskjellige overflateaktive milder på den benyttede alkaliproteasen ble undersøkt på følgende måte: Ifølge den.sammensetning som er angitt.i tabell 1 ble det fremstilt fem forskjellige vaskemidler hvor natriumsaltet av n-C1^_1g naturlig fettsyre (NS), natrium n-C^-alkylsulfat (DAS), natrium-n-a-C-L^_1g olefinsulfonat (AOS), natriumtetrapropylbenzensulfonat (ABS) og natrium n-C-L2_alkylbenzensul;f'°nat ble brukt som de overflateaktive midler, og de resulterende vaskemidler ble betegnet som henholdsvis NS-, DAS-, AOS-, ABS- og LAS-vaskemidler. 5 mg av hver av de respektive vaskemidler ble oppløst i 2 ml av en enzymoppløsning fremstilt ved å oppløse 2 mg av det rå enzympulver fremstilt som beskrevet under B i 100 ml av en 0,05 molar tris-HCl-buffer, pH 11,0, og den resulterende oppløsnings enzymaktivitet ble bestemt ifølge den ovenfor angitte metode. Resultatene som er angitt i tabell 2, indikerer at ingen av disse vaskemidler inhiberer enzymaktiviteten.

Enzymholdige vaskemidler ble fremstilt ved å blande 0,05 g av det rå enzympulver fremstilt som beskrevet under B med 100 g av hver av de ovennevnte forskjellige vaskemidler. Disse enzymhoIdige vaskemidlers aktivitet ble sammenlignet med de tilsvarende enzymfrie vaskemidler under de prøvebetingelser som er angitt i tabell 3-

Vaskeaktiviteten ble bedømt ved en rekke uavhengige forsøkspersoner. Fem stykker skittent klede ble prøvet i, hvert-vaskemiddel, og etter vasking, skylling og tørking ble de resulterende vaskede stykker bedømt av fem uavhengige personer ved hjelp av følgende skala.

Skala:

+ 2 : Renheten på stykket vasket med det enzymholdige vaskemiddel betydelig bedre enn for det tilsvarende enzymfrie vaskemiddel.

+1 : Renheten på stykket vasket med det enzymholdige vaskemiddel er noe bedre enn det for det tilsvarende enaymfrie vaskemiddel.

0 : Ingen betydelig forskjell med hensyn til renhet

mellom de to sammenlignede stykker.

De oppnådde resultater er angitt i tabell 4, hvor den relative vaskeeffekt av de enzymholdige vaskemidler i forhold til de tilsvarende enzymfrie vaskemidler er angitt.

Eksempel 2

Som beskrevet under A ovenfor ble flere mikroorganismer fra slektene-Fusarium og Gibberella dyrkr-t i 6 døgn.

Kulturen ble deretter sentrifugert til en supernatant som så ble anvendt som enzymoppløsning. Til 2.000 volumdeler av hver av enzymoppløsningene ble det tilsatt 5 vektdeler av det LAS-vaskemiddel som er beskrevet i eksempel 1, og den resulterende opp-løsnings proteaseaktivitet ble bestenr; ifølge den ovenfor angitte fremgangsmåte. De resultater som er angitt i tabell 5 indikerer at LAS-vaskemildet ikke inhiberer noen av de enzymer som fremstilles av disse alkaliprotease-fremstillende mikroorganismer. Enzymenes maksimale aktiviteter i pH-området er 10,5-11.

Eksempel 3

Et flytende vaskemiddel for kjøkkenbruk ble fremstilt på

følgende måte: 5 volumdeler varmt vann ved.60-65°C ble tilsatt 18 vektdeler natriumtetrapropylbenzensulfonat, 12 vektdeler natrium-n-C-L2~alkylf enoletersulfat, 5 vektdeler lauryldietanolamid og 10

vektdeler natriumxylensulfonat. Etter avkjøling ble oppløsningen tilsatt 0,5 vektdeler av det rå enzympulver fremstilt som beskrevet under B, samt en mindre mengde parfyme, hvorved man fikk et flytende vaskemiddel for kjøkkenbruk. Maksimalt pH-aktivitetsområde er 10,5-11-

Eksempel - 4

En hårsjampo ble fremstilt på følgende måte: I 64 vekt-

deler varmt vann ved 60-65°C ble det oppløst 5 vektdeler acetylert lanolin, 6 vektdeler alkylolamin og 25 vektdeler "Duponol XL".

Etter avkjøling ble oppløsningen tilsatt 0,2 vektdeler av det rå

enzympulver fremstilt som beskrevet under B, samt en mindre mengde parfyme, hvorved man fikk fremstilt en hårsjampo. Maksimalt pU-

aktivitetsområde er 10,5-H-

Claims (1)

1. Vaske- og rensemiddelblanding inneholdende en overflate-

   aktiv vaskemiddelforbindelse, byggere og vanlig benyttede vaske-

   middeladditiver samt et proteolytisk enzym, karakterisert ved at enzymet er fremstilt ved dyrking av en mikroorganisme i et medium inneholdende assimilerbare karbonkilder og nedbrytbare nitrogenkilder under aerobe dyrkningsbetingelser, hvoretter det akkumulerte enzym utvinnes, idet det som mikroorganisme anvendes Fusarium oxysporum (IFO 5942), Fusarium oxysporum f. lini (IFO 5880),

   Fusarium oxysporum f. niveum (IFO 4471), Fusarium solani (IFO 5232), Fusarium sp. S-19-5 (IFO 8884), Gibberella fujikuroi (IFO 5268)

   eller Gibberella saubinetii (IFO 6608) , og at enzymet har maksimal aktivitet ved pH 10-12.