NO134886B - - Google Patents

Description

Fremgangsmåte ved fremstilling av griseofulvin.

Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte ved fremstilling av det antibiotiske stoff griseofulvin.

Griseofulvin er et viktig antibiotisk

stoff med fungicid virkning og fremstilles ved dyrkning av forskjellige arter av slekten Penicillium. I engelsk patentskrift nr. 784 618 er beskrevet metoder til utførelse av slik dyrkning under submerse aerobe betingelser og disse betingelser er bedre

egnet til fremstilling i industriell målestokk enn den tidligere beskrevne overflatekul-tur-teknikk. Som angitt i nevnte engelske patentskrift er forskjellige faktorer viktige ved den submerse dyrkning av griseofulvin-produserende organismer når man skal oppnå rimelig utbytte. Den viktigste av disse betingelser er konsentrasjonen av

nitrogen i dyrkningsmediet. Det angis også at konsentrasjonen av kullhydrater er viktig og at denne bør være noe høyere enn hva der kunne ventes.

Det er nu funnet at det er mulig å oppnå forbedrede utbytter ved submers aerob dyrkning av griseofulvin-produserende organismer ved å regulere dyrkningsmediets pH-verdi under fermentasjonen. I utførte forsøk er det således funnet at dyrkningsmediets pH-verdi forandres ettersom fermentasjonen skrider frem og at pH-verdien til enhver tid under dyrkningen er avhengig av flere faktorer deriblant mediets natur, den hastighet med hvilken det luftes og typen samt størrelsen av de anvendte dyrkningskar. Det er særlig funnet at dyrkningsmediets pH-verdi er spesielt følsom overfor kullhydratkonsentrasjonen i ethvert øyeblikk og at således tilsetning av kullhydrat i ethvert øyeblikk under fermentasjonen raskt følges av et fall i dyrkningsmediets pH-verdi. Denne observasjon har gjort det mulig å regulere pH-verdien i et griseofulvin-produserende dyrkningsmedium ved den enkle forholdsregel å tilsette et kullhydrat fra tid til annen for å frembringe et fall i pH-verdien etter øn-ske. Slike tilsatte kullhydrater tjener også som kilde for kullstoff og energi til organismen. Videre forskning har vist at der for hvilke som helst bestemte dyrkningsbetingelser finnes det som kan betegnes en «ideell» kurve som dyrkningsmediets pH-verdi bør følge når pH-verdien avsettes mot tiden. Når pH-verdien følger en sådan «ideell» kurve får man betydelig høyere utbytte enn når man utfører dyrkningen under vanlige betingelser, altså uten kon-troll av pH-verdien.

Der vil forståes at uttrykket en «ideell» kurve for pH-verdien betegner kurver fastlagt ved forsøk og som pH-verdien bør følge for oppnåelse av optimale resultater under bestemte betingelser. Det vil også forståes at det i praksis er vanskelig, om ikke umulig, å gjennomføre en fermentasjon nøyaktig i overensstemmelse med slike kurver. Hvis imidlertid dyrkningen utføres slik at den kurve pH-verdien følger har en form som ligger nærmere den «ideelle:; kurves form enn en dyrkning som er utført uten regulering av pH-verdien, får man forbedrede resultater. Uttrykket «regulert pH-kurve» brueks altså her for å betegne en kurve for pH-verdien som ligger nærmere den ideelle kurve for pH-verdien enn denne kurve i en fermentasjon som utføres uten regulering av pH-verdien.

Den foreliggende fremgangsmåte ved fremstilling av griseofulvin ved submers aerob dyrkning av en griseofulvinproduse-rende organisme i et egnet næringssubstrat utmerker seg ved at dyrkningen i en innledende periode foretas i et næringssubstrat med lite eller intet innhold av kullhydrat, hvorved der frembringes en stigning i substratets pH-verdi, og at der deretter skjer gjentatt eller kontinuerlig til-førsel av kullhydrat under den resterende dyrkningsperiode for å dekke mikroorganismens kullstoff- og energiforbruk og for å motvirke en ytterligere stigning av pH-verdien over den for dyrkningsresultatet optimale pH-verdi.

Fortrinnsvis holdes dyrkningsmediets pH-verdi mellom 6,6 og 7,6 under den vesentlige del av fermentasjonsperioden og særlig foretrekkes det å holde pH-verdien mellom 6,8 og 7,2. Det er i alminnelighet fordelaktig at kurven for pH-verdien til-nærmelsesvis har form som en rett linje under en vesentlig del av fermentasj ener-etter at begynnelsesstadiet er overstått, i alminnelighet etter ca. 20 timer. Fortrinnsvis har mediet når fermentasjonen innle-des, en pH-verdi som ligger noe under den ønskede, regulerte pH-verdi og inneholder lite kullhydrater eller er fritt for kullhydrater. pH-verdien stiger da raskt ettersom fermentasjonen skrider frem. Kort før pH-verdien når den ønskede, regulerte pH-verdi, tilsettes det en porsjon nærende kullhydrat. Virkningen av denne tilsetning er altså at stigningen i pH-verdien forsinkes eller stopper. Når man observerer en til-bøyelighet til å overstige den ønskede verdi, kan man regulere tilsetningen slik at pH-verdien minskes. I alminnelighet foretrekkes det å utføre fermentasjonen slik at den ønskede, regulerte pH-verdi oppnåes tem-melig raskt, fortrinnsvis innen 24 timer etter fermentasjonens begynnelse.

Ettersom kullhydratet forbrukes av organismen, vil pH-verdien begynne å stige og der tilsettes da en ytterligere mengde kullhydrat. De nøyaktige tidspunkter for tilsetningen av kullhydratet og de mengder som skal tilsettes, kan bare bedømmes ved å observere forholdene med hensyn til pH-verdien på basis av erfaringer. Man bør således tilsette så meget kullhydrat når pH-verdien er tilbøyelig til å bevege seg bort fra den ideelle kurve at en slik tilbøyelig-het hindres, så at en virkelig avvikelse ikke inntrer. Tilsetning av for store mengder vil imidlertid forårsake at pH-verdien faller

til en verdi under den ideelle kurves verdi.

Tilsetningen av kullhydrat gjentas derpå således som det er nødvendig etter pH-verdiens forhold. I alminnelighet er tem-melig hyppige tilsetninger av kullhydrat nødvendig og den mengde som tilsettes hver gang kan variere. Den ideelle kurve for pH-verdien må, som angitt ovenfor, bestemmes for ethvert sett av betingelser ved å utføre prøve-fermentasjoner i et antall som er tilstrekkelig til å fastsette den ideelle kurves stilling og form.

Det er mulig å tilsette kullhydratet med en kontinuerlig på forhånd bestemt hastighet, men dette krever at tilsetnings-hastigheten er nøyaktig den som er nød-vndig for å holde pH-verdien på den valgte verdi. I praksis er dette ofte vanskelig å utføre på en tilfredsstillende måte. Følge-lig er tilsetning av adskilte porsjoner av kullhydrat fra tid til annen således at pH-verdien korrigeres etter behov den fore-trukne utførelsesform for fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen.

I det følgende beskrives nærmere de forskjellige faktorer i fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen.

I denne fremgangsmåte kan mange griseofulvin-produserende arter av slekten Penicillium anvendes. Deriblant er særlig følgende: Penicillium patulum CMI 28,808 Bainier Coll-Thom (4640—454). NCTC

(1722) 1932— NRRL 994, ATCC 9260.

Penicillium urticae Bain, (Rg 8g)

(P. griseofulvum) C.B.S. Baarn. Penicillium nigricans (Bain) (Zaleski).

C.B.S. Baarn.

Penicillium janczewskii Zal. C.M.I. 29. 100. (Fra jordbund i Lakenheath War-ren, Suffolk 1947 — J. H. Warcup B25). Penicillium albidum Sopp. C.M.I. 40.219.

Penicillium raciborskii Zal. C.M.I. 40.568.

Penicillium melinii Thom. C.M.I. 40.216.

Det er imidlertid funnet at de beste resultater oppnåes med Penicillium patulum Bainier Thom (C.M.I. 39.809; NRRL 989 som P. urticae Bain (A) — G. Smith, 1949). Som ået vil være kjent i teknikken på området kan produksjonsevnen for en hvilken som helst art organisme ofte for-bedres ved mutasjoner og oppfinnelsen om-fatter anvendelse av stammer som er er-holdt ved mutasjoner. Metoder til å under-kaste griseofulvin-produserende organismer mutasjoner for frembringelse av stammer med øket produksjonsevne er beskrevet i f. eks. engelsk patentskrift nr. 788 118.

Fortrinnsvis føres organismene inn i dyrkningsmediet som et vegetativt podemateriale, idet der fortrinnsvis anvendes omkring 10 pst. av podematerialet. Slike podematerialer kan f. eks. utvikles fra sporer ved hjelp av et vegetativt fordyrknings-stadium, f. eks. således som beskrevet i engelsk patentskrift nr. 784 618. Om ønskes kan imidlertid selve dyrkningsmediet podes direkte med sporer av vedkommende organisme.

Det anvendte medium inneholder i det vesentlige en kilde for nitrogen samt vekst-fremmende stoffer som kan være av synte-tisk type, dvs. sammensatt av nærende, enkle aminosyrer og/eller enkle nitrogen-forbindelser. Fortrinnsvis anvendes imidlertid som nitrogenkilde stoffer av typen komplekse, organiske materialer som mais-støpvæske, forskjellige nitrogenholdige melkeprodukter som mysepulver, kjerne-melk osv., bomullsfrømel, havremel, «dis-tillers solubles» eller soyabønnemel. Av disse foretrekkes maisstøpvæske. Den mengde assimilerbart nitrogen som tilføres mediet tilsvarer fortrinnsvis fra 0,04 pst. til 0,3 pst. N, særlig fra 0,075 til 0,25 pst. N.

Dyrkningsmediene inneholder videre næringssalter deriblant fosfater, hensikts-messig som kaliumdihydrogenfosfat og fortrinnsvis i mengdeforhold fra 0,4 til 0,8 pst. Det er også ønskelig å ha til stede en kilde for kloridioner, som f. eks. natriumklorid eller kaliumklorid, fortrinnsvis i en konsentrasjon på minst 0,1 pst. og mindre enn 0,3 pst. Tilstedeværelsen av kalk eller kalk-sten i mediet f. eks. i en konsentrasjon fra 0,4 til 0,8 pst. er funnet å være fordelaktig og virker blant annet som puffer for mediet.

Fortrinnsvis sammensettes mediet slik at det inneholder lite eller intet kullhydrat (andre enn dem som er en naturlig be-standdel i kilden for nitrogen) før fermentasjonens begynnelse for å oppnå en rask stigning av pH-verdien til det ønskede nivå. Når kullhydrater er tilstede i det opprin-nelige dyrkningsmedium, kan de tilstede-værende kullhydrater være hvilke som helst som er assimilerbare av organismen, f. eks. stivelse, laktose, glukose osv.

Det kullhydrat som tilsettes fra tid til annen under fermentasjonen for å kon-trollere pH-verdien på den her angitte måte, kan likeledes være et hvilket som helst kullhydrat som er assimilerbart av organismen, men det er en fordel ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen at billige kullhydrater som glukose, stivelse, dekstri-ner, stivelse-hydrolysater, sukrose, xylose, blandinger av disse stoffer og melasse fra sukkerrør er mere effektive i denne fremgangsmåte enn ved anvendelse i konvensjonelle fermentasjonsprosesser, dvs. pro-sesser hvor hele mengden kullhydrater tilsettes mediet ved fermentasjonens begynnelse. Således oppnås i konvensjonelle fer-mentas] oner de beste resultater ved anvendelse av laktose som kullhydrat, mens de resultater som oppnås i foreliggende fremgangsmåte under anvendelse av f. eks. glukose er like gode om ikke bedre enn de resultater som oppnåes med laktose.

Fortrinnsvis tilsettes kullhydratene i form av vandige oppløsninger som også kan inneholde andre næringsstoffer som det kan være ønskelig å tilsette under fermentasjonens forløp, som f. eks. anorganiske salter, skumningshindrende midler osv.

Omrøringshastigheten og luftningshastigheten for dyrkningsmediet bestemmes best ved forhåndsforsøk og er i noen grad avhengige av hverandre. Disse betingelser påvirkes dessuten av fermentasjonskarets form så vel som av naturen av mediets bestanddeler. Det er imidlertid å merke at i alminnelighet er dyrkningsmediets pH-verdi desto høyere jo sterkere fordeling av luft i mediet er.

Således er det f. eks. funnet at ved anvendelse av et dyrkningsmedium med vo-lum 1816 liter og en omrøringshastighet på 160—165 omdreninger pr. minutt oppnåes en pasende luftning ved å lede 2264 liter luft gjennom mediet pr. minutt. I alminnelighet er det fordelaktig å innlede fermentasjonen ved lave luftningshastigheter og øke hastigheten gradvis ettersom fermentasjonen skrider frem.

Som skumningshindrende midler for å forhindre overdreven skumning av dyrkningsmediet kan der f. eks. brukes midler av mineraloljetypen.

Griseofulvinet kan utvinnes fra dyrkningsmediet på en hvilken som helst hen-siktsmessig måte, f. eks. således som beskrevet i engelsk patentskrift nr. 784 618.

I det følgende beskrives for illustre-rende formål og som eksempel en utførel-sesform for fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen under henvisning til vedføyede tegning, som er en grafisk fremstilling i hvilken dyrkningsmediets pH-verdi er av-satt med tiden i sammenligning med en «ideell» pH-kurve fastlagt på samme måte for de anvendte betingelser. På denne grafiske fremstilling vises også mengden og hyppigheten av kullhydrat-tilsetningene og den hastighet med hvilken konsentrasjonen av antibiotisk middel øker. I dette eksempel ble der anvendt 1816 liter av følgende medium:

Faste stoffer i maisstøpvæske

Dette mediums pH-verdi var 5,50. Mediet ble sterilisert i 15 minutter ved 121° C, hvorpå det ble podet med 10 pst. av et vegetativt podemateriale.

Man ledet luft gjennom mediet med en hastighet på 707 liter pr. minutt i de første 5 timer, 1415 liter pr. minutt i de påføl-gende 5—10 timer og deretter med en hastighet på 2264 liter pr. minutt.

På vedføyede tegning representerer kurven merket Aden «ideelle» kurve for pH-verdien. Denne ble fastlagt på basis av et stort antall forsøksdyrkninger og representerer de betingelser for pH-verdien som gir de optimale resultater under de ovenfor angitte dyrkningsbetingelser og i det fermentasjonskar som ble anvendt. Kurve B representerer den virkelige pH-verdi som ble målt i mediet under fermentasjonen. Kurve C viser mengden av tilsatt glukose i liter pr. time, mens kurve D viser konsentrasjonen av antibiotisk stoff i mg. pr. liter.

Som det vil sees, ble fermentasjonen påbegynt uten nærvær av kullhydrat i dyrkningsmediet. I den niende time etter dyrkningens begynnelse påbegynte man en halvkontinuerlig tilsetning av glukose (som besto av en vandig oppløsning av hydroly-sert stivelse i en konsentrasjon på 500 g pr. liter) med en hastighet av 0,75 liter pr. time. Tilsetningene ble utført i adskilte porsjoner på 100—300 ml hvert 2, 4 eller 8

minutt. Som det vil sees, fortsatte pH-verdien å stige raskt og da den i det vesentlige rette del av den ideelle kurve for

pH-verdien var nådd (pH-verdi 6,8) ble glukosetilsetningen øket til 5,0 liter pr. time. Etter den 20. time ble kurven for den virkelige pH-verdi i hovedsaken horisontal ved en gjennomsnittlig pH-verdi på 6,8. En sammenligning mellom kurvene B og C under fermentasjonens forløp viser hvor-dan enhver tilbøyelighet til stigning av pH-verdien forhindres ved en øket tilsetning av glukose. På den annen side forhindres enhver ønsket minskning av pH-verdien ved å minske tilsetningen av glukose. Det vil sees at i det foreliggende forsøk nådde den virkelige kurve for pH-verdien den ønskede i det vesentlige konstante verdi på 6,8 noe tidligere enn det anses ønskelig ut fra den ideelle kurve for pH-verdien, nemlig etter omtrentlig 19 timer. Som det sees av den grafiske fremstilling, nådde konsentrasjonen av antibiotisk stoff en verdi på 5800 mg pr. liter etter ca. 220 timer.

Under anvendelse av samme betingelser med hensyn til dyrkningsmedium og fermentasjonskar ble der utført ytterligere fermentasjoner og resultatene av disse er oppført i nedenstående tabell. Den i det vesentlige rette del av kurven for pH-verdien ble holdt i forsjellige stillinger, således som angitt, og resultatene sammenlig-net med resultatene av en konvensjonell fermentasjon i hvilken der ble brukt laktose som det nærende kullhydrat og hele mengden av dette kullhydrat ble tilsatt ved fermentasjonens begynnelse. De erholdte resultater var følgende:

I forsøk nr. 3 var luftningshastigheten

etter 10 timer bare 1132 1 pr. min. mens den

i de øvrige forsøk var 2264 1 pr. min. I for-søk nr. 3 falt pH-verdien til 6,8 etter 240

timer og luftningshastigheten ble da øket

til 264 1 pr. min.

Claims (4)

1. Fremgangsmåte ved fremstilling av

griseofulvin ved dyrkning av en griseoful-vinproduserende mikroorganisme i et egnet næringssubstrat under submerse, aerobe betingelser, karakterisert ved at dyrkningen i en innledende periode foretas i et næringssubstrat med lite eller intet innhold av kullhydrat, hvorved der frembringes en stigning i substratets pH-verdi, og at der deretter skjer gjentatt eller kontinuerlig tilførsel av kullhydrat under den resterende dyrkningsperiode for å dekke mikroorganismens kullstoff og energifor- bruk og for å motvirke en ytterligere stig ning av pH-verdien over den for dyrkningsresultatet optimale pH-verdi.

2. Fremgangsmåte ifølge påstand 1, karakterisert ved at pH-verdien ved tilsetningen av kullhydratet holdes mellom 6,6 og 7,6, fortrinsvis mellom 6,8 og 7,2.

3. Fremgangsmåte ifølge påstand 1 eller 2, karakterisert ved at tilsetningen av kullhydrat påbegynnes omtrent 20 timer etter at fermentasjonen er påbegynt.

4. Fremgangsmåte ifølge hvilken som helst av de foregående påstander, karakterisert ved at der som kullhydrat anvendes glukose, laktose, stivelse, dekstrin, stivelsehydrolysat, sukrose, xylose eller melasse fra sukkerrør.