NO137152B - Analogifremgangsm}te for fremstilling av kortikotrope oktadekapeptider - Google Patents

Description

Den foreliggende oppfinnelse angår en analogifremgangsmåte for fremstilling av kortikotrope oktadekapeptider representert ved folgende formel: p-alanyl-L-tyrosyl-L-seryl-X-Y-L-histidyl-L-f eny.lalanyl-L-arginyl-L-tryptofyl-glycyl-L-ly syl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-L-ornityl-L-lysyl-L-arginyl-Z, hvori X er en L-metionin-, L-norvalin-, L-norleucin-, L-leucin- eller oc-aminosmorsyrerest;

Y er en L-glutaminsyre- eller L-glutaminrest og Z er en L-arginin, L-argininamid- eller L-argininesterrest; ikke-giftige syreaddis jons-salter eller komplekser derav, og det særegne ved oppfinnelsen er at et beskyttet dekapeptid med formel : R1 -(3-alanyl-L-tyrosyl-L-seryl-X-°f -R2-L-glutamyl-L-histidyl-L-fenylalanyl-L-arginyl-L-tryptofyl-glycin, hvori R^ er en amino-beskyttende gruppe; X har den ovennevnte betydning og R0 er en karboksyl-beskyttende gruppe, omsettes med et beskyttet oktadekapeptid av formel: N -R^-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-NS-R^-L-ornityl-N^-R^-L-lysyl-L-arginyl-Z, hvori R^, R^_ og R^- hver er en amino-beskyttende gruppe og Z har den ovennevnte betydning, ved den aktiverte ester-metode, dicykloheksyl-karbodiimid-metoden, azidmetoden, metoden med blandede anhydrider eller.en kombinasjon derav, og beskyttende grupper fjernes (avblokkeres) fra det dannede beskyttede oktadekapeptid med formel: R^ -|3-alanyl-L-tyrosyl-L-seryl-X-Y -R2-L-glutamyl-L-histidyl-L-fenyl-alanyl-L-arginyl-L-tryptofyl-glycyl-N^-R^-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-NS-R^-L-ornityl-N^-R^-L-lysyl-L-arginyl-Z, hvori R^, X, R^, R^? R^j Rj- og Z har de ovennevnte betydninger ved hydrogenolyse, acidolyse, alkalisk forsepning, hydrazinolyse eller reduksjon med natrium i flytende ammoniakk, og om onsket omdannes det dannede (avblokkerte) oktadekapeptid til syreaddisjonssalter eller komplekser derav på i og for seg kjent måte.

Disse/1-P-alanin,15-ornitin7-oktadekapeptider, som i det folgende er ang-J ti; som / fi- Ala 1 , Orn 1 V%-oktadekapeptider) fremstilt ved den foreliggende oppfinnelse er nyttige som et medikament, fordi de viser markerte kortikotropin-aktiviteter, som f.eks/ adrenal-stimulerende aktivitet, lipotropisk aktivitet eller melanocyt-stimulerende aktivitet, og disse aktiviteter er av lang varighet.

I 1965 ble syntesene for oktadekapeptider, ACTH(1-18)-0H og ACTH(1-18)-NH2, tilsvarende de forste atten aminsyrerestene i kortikotropin (ACTH), rapportert av de samme oppfinnere og med-arbeidere (Biochem.(Tokyo) 58 512 (1965)). Senere ble syntesene for det analoge 1-glycin, dvs. Gly'' - ACTH (1 -1 8) - NIL-, rapportert i Bull. Chem. Soc. Japan <1>+3 196 (1970). Fra disse syntetiske og biologiske studier av kortikotropinpeptider har oppfinnerne funnet at de amino-terminale atten rester utgjor de minimale krav for frembringelse av en hoy adrenal-stimulerende aktivitet. ACTH(1-18)-NH2 og Gly<1->ACTH(1-18)-NH2 ble imidlertid funnet å ha en mindre aktivitet enn det naturlige hormon, særlig når de ble tilfort subkutant eller intravenost. Nylig ble et utmerket kortikotropin-peptid, dvs. fi-Ala 1-ACTH(1-18)-NH2 rapportert av oppfinnerne og al (Bull. Chem. Soc. Japan 1+3 1163 (1970)). Dette peptid har biologiske egenskaper som er vesentlig forbedret i forokning av styrke, på grunn av den avtatte folsomhet overfor virkningen av intracellulær aminopeptidase. Amino-terminal substitusjonen med /3-alanin forbedret stabiliteten av peptidet i vevet, men ikke stabiliteten i blod. I virkeligheten var den analoge virkningen av 1-/3-alanin i blod' mindre varig enn for det naturlige kortikotropin, noe som indikerte at det forste ble hurtigere inaktivert enn det siste ved virkningen av endopeptidase i blod, når det ble tilfort ved intravenos metode. Så Ledes har dét vært onskélig med en ytterligere forbedring ved å tillate kort-kjede-peptidet å komme nærmere det naturlige kortikotropin, ut fra en industriell fremstilling og praktisk anvendelse.

Som et resultat av undersøkelsene av kortikotropinpeptider har

det blitt oppdaget av oppfinnerne at /3-Ala , Orn -y-oktadekapeptider har en forbedret biologisk egenskap.med hensyn til varig-heten av virkningen og at de har samme nivå for adrenal-stimulerende

aktivitet som det naturlige kortikotropin. Det har også blitt oppdaget at slike forbedrede egenskaper skyldes senkning i folsomhet for /(S-Ala 1 , Orn 15_7-oktadekapeptider overfor virkningen av endopeptidase i blod og aminopeptidase i vev.

Kondensasjon for dannelse av peptidbinding kan utfores ved

vanlige metoder, men de mest vanlige benyttede metoder er den aktiverte estermetode, dicykloheksylkarbodiimidmetoden, azidmetoden og den blandede anhydridmetode.

1 15"

I fremstillingen av /J3-Ala , Orn V-°ktadekapeptider er en hver fri funksjonell gruppe som ikke tar del i reaksjonen fortrinnsvis beskyttet, særlig ved slike grupper som kan bli lett fjernet ved hydrogenolyse, acidolyse, alkalisk forsåpning, hydrazinolyse eller natrium i flytende ammoniakk-reduksjon. Karboksylgruppen er fortrinnsvis beskyttet ved forestring, f.eks. med en lavere alkanol.

Aminogruppen er fortrinnsvis beskyttet ved innforing av en gruppe som f.eks. t-butyloksykarbonylgruppe, t-amyloksykarbonylgruppe, o-nitrofenylsulfenylgruppe, 2-(p-difenyl)-isopropyloksykarbonyl-gruppe, benzyloksylarbonylgruppe, p-nitrobenzyloksykarbonylgruppe, tosylgruppe, formylgruppe eller tritylgruppe på en vanlig måte. For beskyttelse av guanidylgruppen av arginin, blir det fortrinnsvis benyttet en nitrogruppe, tosylgruppe eller adamantyloksy-karbonylgruppe, men beskyttelsen av guanidylgruppen er ikke alltid nodvendig.# -karboksylgruppen av glutaminsyre blir fortrinnsvis beskyttet ved slike karboksyl-beskyttende grupper som nevnt ovenfor, ogItf-aminogruppen av ly sin eller ornitin blir fortrinnsvis beskyttet ved slike aminobeskyttende grupper som nevnt ovenfor. Imidazolgruppen av histidin kan bli beskyttet ved tosylgruppen, benzyloksykarbonylgruppe eller benzylgruppe. Videre kan hydroksyl-gruppen av serin eller tyrosin bli beskyttet ved en acetylgruppe, benzylgruppe eller t-butylgruppe, men en slik beskyttelse er ikke alltid nodvendig.

I tillegg til aminosyrerestene ved amino-terminalen og ved stilling 15 kan videre en del andre rester av aminosyresekvensen av kortiko-tropinpeptidét bli erstattet av andre aminosyrer, uten vesentlig å forringe den kortikotropiske aktivitet. Således kan den fjerde aminosyren,- metionin, bli erstattet med norvalin, norleucin,

leucin eller a-aminosmorsyre og/eller den femte aminosyren, glutaminsyre, kan bli erstattet med glutamin.

En sammenkoblingsreaksjon for fremstilling av peptidet (I) blir f.eks. utfort ved å kondensere et beskyttet dekapeptid med formelen: R1-B-alanyl-L-tyrosyl-L-seryl-X-"^ R2-L-glutamyl-L-histidyl-L-fenylalanyl-L-arginyl-L-tryptofyl-glycin, hvori R1 er en amino-beskyttende gruppe; X er L-metioninrest, L-norvalinrest, L-norleucinrest, L-leucinrest eller a-aminosmorsyrere st og R,-, er

en karboksyl-beskyttende gruppe, med et beskyttet oktapeptid av formelen: -R^-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-N6-R^-L«rnityl--R^-L-lysyl-L-arginyl-Z, hvori R^ , R^, og R^ hver er en amino-beskyttende gruppe og Z er L-argininrest, L-argininesterrest eller L-argininamidrest, ved den aktiverte estermetode, dicykloheksylkarbodiimidmetoden, azidmetode, den.blandede anhydridmetode eller en kombinert metode av disse i et inert løsningsmiddel ved en temperatur av - 20°C til 60°C fra 2 timer til 7 dager, og å fjerne de beskyttende grupper fra det dannede beskyttede oktadekapeptid med formelen: R^-B-alanyl-L-tyrosyl-L-seryl-XY'-R2-L-glutamyl-]L-histidyl-L-fenylalanyl-L-arginyl-L-tryptofyl-glycyl-N^-R^-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-Nfi-R^-L-ornityl-N^-R^-L-lysyl-L-arginyl-Z, hvori R-j , X, R2, R^, R^, Rj og Z har den ovenfor angitte betydning, ved hydrogenolyse, acidolyse, alkalisk forsåpning, hydrozinolyse eller reduksjon med natrium i flytende ammoniakk ved en temperatur av omkring -20°C til 60°C fra 30 minutter til 2h timer. De inerte løsningsmidler er dimetylformamid, dimetylsulfoksyd, dioksan, heksametylfosfortriamid, vandige losninger av disse og blandinger av disse.

De foretrukne fremgangsmåter for fremstilling av .^""B-Ala -i, Orn oktadekapeptider er vist i skjemaene I, II, III og IV.

I synte se skjemaene er folgende forkortelser benyttet: /3-Ala=/7-alaninrest, Tyr-L-tyrosinrest, Ser=L-serinrest, Met=L-metioninrest, Glu=glutaminsyrerest, His=L-histidinrest, Phe=L-fenylalanin-rest, Arg=L-argininrest, Trp=L-tryptofanrest, Gly=glycinrest, Lys=L-lyslnrest, Pro=L-prolinrest, Val=L-valinrest, Orn=L-ornitin-rest, Cbo=benzyloksykarbonyl, BOC=t-butyloksykarbonyl, Bzl=benzyl, OBu<*> =t-butoksy, DCC=N,N'-dicykloheksylkarbodiimid, HOSu=N-hydroksysukkinimid, ONP=p-nitrofenoksy.

Som vist i synteseskjemaene omfatter den foretrukne prosess en sammenkobling av tripeptidet inneholdende de forste 3 aminosyres1, dvs. /3-alanyl-L-tyrosyl-L-serin eller tetrapeptidet, dvs. /S-alanyl-L-tyrosyl-L-seryl-L-metionin med heptapeptidet eller heksapeptidet tilsvarende til henholdsvis- stillingen *+-10 eller 5-10, fortrinnsvis ved azidmeto.den, hvoretter det dannede dekapeptid blir kondensert med peptidet som svarer til resten av molekylet (stillinger 11-18) fortrinnsvis ved den aktiverte estermetode.

Selvom den ovenfor nevnte fremgangsmåte er foretrukket for fremstillingen av de foreliggende kortikotropinpeptider er det mulig å substituere de beskyttende grupper, sammenkoblingsmetodene eller avblokkeringsmetodene som benyttet ovenfor, for ekvivalentene eller ekvivalente metoder og å bytte valget av peptidfragmenter og sammenkoblingsrekkefolge.

De beskyttede gruppene som benyttes ved den foreliggende oppfinnelse kan bli fjernet ved hydrogenolyse, alkalisk forsåpning, hydrazinolyse, natrium i flytende ammoniakkreduksjon eller ved behandling med en syre som f.eks. trifluoreddiksyre, maursyre, hydrogenhalogenid (f.eks. hydrogenfluorid, hydrogenbromid, hydrogen-klorid), hydrogenhalogensyre (f.eks. fluorhydrogensyre, bromhydrogensyre, saltsyre) eller en blanding av disse, på en vanlig måte, avhengig av gruppens natur.

^-Ala1, Orn<1>^7-oktadekapeptider fremstilt ved den•foreliggende oppfinnelse kan bli :mset ved kjente metoder, som f.eks. kolonne-kromatografering med ioneutbyttings-harpiks, ioneutbyttings-

cellulose eller metoden med motstromsfordeling.

ffl- Ala , Orn V-oktadekapeptidene i folge oppfinnelsen fremstilles således i form av baser eller farmasøytisk tålbare ikke-giftige syreaddisjonssalter derav, avhengig av de benyttede reaksjons-betingelser. Saltene kan også fremstilles ved å behandle oktadekapeptidene med uorganiske syrer som f.eks. hydrogenhalogensyre (f. eks. f luorhydrogensyre . bromhydrogensyre, saltsyre), hydrogenhalogenid (f.eks. hydrogenfluorid, hydrogenbromid, hydrogen-klorid), svovelsyre eller fosforsyre, eller med organiske syrer som f.eks. eddiksyre, maursyre, propionsyre, glukolsyre, melkesyre, pyrodruesyre, oksalsyre, malonsyre, ravsyre, maleinsyre, fumarsyre, vinsyre, sitronsyre, benzosyre, metansulfonsyre, benzensulfonsyre eller toluensulf onsyxe, på en kjent måte. En ekvimolar- eller overskudds-mengde av syren kan bli benyttet ved slik saltdannelse.

De således fremstilte ^-Ala 1 , Orn 1V5-oktadekapeptider har en hoy kortikotKpisk aktivitet og en utmerket forlengelse av varighet. Halveringstiden i plasma er lenger enn for det naturlige kortikotropin. Detaljerte undersøkelser av de biologiske egenskaper av // 3- kla. Orn V-oktadekapeptider vil bli beskrevet nedenfor ved bruk av /y?-Ala1 , Orn1 V"-ACTH( 1 -1 8)-NH2 som prove-peptid.

Biologisk halveringstid for Z#-Ala<1>, Orn1 V-ACTH( 1-18)-MH2 ble bestemt med in vitro lipotropisk aktivitet /A. Tanaka, B.T. Picker-ing og C.H. Li., Arch. Biochem. Biophys. 99 29^ (1962)7 som e.t parameter. Resultatene er angitt i tabell 1, sammenlignet med det naturlige kortikotropin (sauekortikotropin; c^-ACIH), /?-Ala ACTH(1-18)-NH2 og Gly<1->ACTH(1-18)-NH2..

M erk: a) En peptidprove ble Injisert intravenøst inn i lavere vena cava på rotter og blodprover, som ble samlet fra abdominal aorta ved passende tidsintervaler og surgjort, ble^provd for den in vitro lipotropiske aktivitet, b) En prove ble lost i friskt plasma fra bedovét rotte og blandingen ble deretter inkubert ved 37°C. Prover tatt fra blandingen etter passende tidsintervaler ble provd for den in vitro lipotropiske aktivitet.

De ovenfor angitte data viser klart at halveringstiden for ^3-Ala1, Orn1^7-ACTH(1-18)-NH2 er omtrent den samme som for det naturlige kortikotropin og lenger enn for beslektede peptider, når det blir tilfort ved intravenos injeksjon. Videre er

1 1 ^

halveringstiden for /7?-Ala , Orn <7-ACTH(1-18)-NH"2 meget lenger enn for det naturlige kortikotropin og beslektede oktadekapeptider når det inkuberes med plasma in vitro. Den forlengede varighet av aktivitet for de foreliggende oktadekapeptider skyldes den okede motstand i peptidet overfor virkningen av endopeptidase i blodet.

De adrenal-stimulerende aktiviteter av ffl- Ala , Orn v-oktadeka-

- peptider ble provd i folge.fire forskjellige metoder og de ble sammenlignet med de for det naturlige saue-kortikotropin (°<.S-ACTH). Den in vivo steroidogene aktivitet ved intravenos tilforsel til hypofysestomisert rotte ble provd ved metoden til Lipscomb og Nelson /Endoorinol. 71 13 (1962)/ med en mindre modifikasjon /S.Tanaka og C.H. Li., Endocrinol. Japonica 13 180 (1966)_7. Den in vivo steroidogene aktivitet ble også provd i deksametason-pentobarbital-forhåndsbehandlet mus, £k. Tanaka og N. Nakamura, "Integrative mechanism of neuroendocrine system", Hokkaido University Medical Library Series 1 <1>+9 (1968)_7. I til-.legg ble den steroidogene aktivitet ved intramuskulær tilforsel til hypofysestomisert rotte bestemt, hvor en peptidlosning ble injesert til lårmuskelen og en blodprove bie samlet fra abdominal aorta 30 min. etter injeksjonen. Videre ble den steroidogene aktivitet ved intravenos tilforsel til hypofysestomisert rotte bestemt på en slik måte at et peptidpreparat ble injesert inn i lår-venen og en blodprove ble samlet fra abdominal aorta 30 min. • etter injeksjonen. Under eksperimentene ble "The Hird TJSP Corticotropin Reference Standard" benyttet som standard og produksjonen av 11-hydroksykortikosteroider.(11-0HCS) ble bestemt ved fluorfotometri.sk metode til Peterson /JT. Biol. Chem. 225 25 (195717. For hver provemetode ble flere bestemmelser utfort og de uavhengige oppnådde data ble underkastet statistisk behandling ved hjelp av Sheps og Moore fremgangsmåte /J. Pharmacol. Extl. Therap. 128 99 (196017. Resultatene av disse provene på /^-Ala1 , Orn1 V-ACTH(1-18)-NH2 er gitt i tabell: 2 i sammenligning med det naturlige kortikotropin (<* -ACTH).

Merk: Aktivitetene er uttrykt i USP-onheter/rag, relativt til The Third USP Corticotropin Reference Standard. D-3 adrenal-stimulerende aktiviteter av ^3-Ala ,Orn PJ-ACTH(1-18)-NH2 er omtrent de samme som for det naturlige kortikotropin. Oktadekapeptidet i folge oppfinnelsen viser en hoy lipotropisk aktivitet, som er summert i tabell 3 °g sammenlignet med det naturlige kortikotropin (<* -ACTH).

Merk: Den lipotropiske aktivitet ble b3stemt ved hjelp av den raeto.de som er beskrevet av Tanaka et al /Aren. Biochem. Biophys. 99 29<!>+ (196217 med rotte-epididymal-adiposevev og kanin-perirenal-adiposevev. Okningen i konsentrasjonen av ikke-forestret fett-syre i både medium og vev er parameteret. Aktiviteten uttrykkes som minste effektive dose pr. 50 mg vev.

Prove for den in vitro melanocyt-stimulerende aktivitet av Z#-Ala<1>, Orn<1>V-AGTH(1-18)-NH2 ble utfort i folge metoden til

K. Shizume, A.B. Lerner og T.B. Fitzpatrick /Endocrinol. 5<*>+ 553 095^+17, ved bruk av isolerte hudfragmenter av Rana pipin-frcsker. Den meInocyt-stimulerende aktivitet av det foreliggende oktadekapeptid ble funnet å være 0,7 x 10 10 U/g. Et rent preparat av naturlig oC-metoocyt-stimulerende hormon ble benyttet som en standard.

1 15

2^3-Ala , Orn v-oktadekapeptidene i folge oppfinnelsen kan bli omdannet til det tilsvarende kompleks med et kompleksdannende tungt metall (f.eks. sink, kopper, jern, nikkel, kobolt), en kompleks-dannende polyaminosyre (f.eks. polyglutaminsyre, poly-aspartinsyre, kopolyglutamyltyrosin, kopolyaspartylglutaminsyre) eller med en blanding av disse. Komplekset viser en utmerket lang-virkende egenskap sammenlignet med det vanlige peptid.

Det tunge metallkompleks kan bli fremstilt ved å behandle oktadekapeptidet.med en tung metallforbindelse som f.eks. tungt metallhalogenid (f.eks. sinkklorid, kopperklorid, jernklorid, koboltklorid, nikkelklorid), acetat (f.eks. sinkacetat), sulfat (f.eks. sinksulfat) eller hydroksyd (f.eks. sinkhydroksyd) i et omtrent forhold av 1:0,1 - 100 beregnet som vekt under svak sur betingelse, fortrinnsvis ved p.H 6,5 til 7,0 på en vanlig måte. Blant de tunge metallene er sink mest foretrukket. Polyamino-syrekomplekset kan bli fremstilt ved å behandle oktadekapeptidet med en polyaminosyre i et omtrent forhold av 1:0,1 - 100 beregnet som vekt under svak sur betingelse, fortrinnsvis ved pH 6,5 til 7,0, på en vanlig måte. De benyttede polyaminosyrer er homo-polymerer eller kopolymerer av aminosyrer og de kan være av L-, D- eller DL-konfigurasjon. Eksempler på foretrukkede polyaminosyrer er poly-L-glutaminsyre, poly-D-glutaminsyre, poly-DL-glutaminsyre, poly-L-aspartinsyre, poly-D-aspartinsyre, poly-DL-aspartinsyre, kopoly-L-glutaaryl-L-tyrosin og kopoly-L-aspartyl-L-glutaminsyre. Foretrukket molekylvekt av polyaminosyren er omtrent'1.000 til 100.000, spesielt 2.000 til 6.000. Det er foretrukket å benytte en polyaminosyre som forut bar blitt noytralisert med

et alkalisk middel (f.eks. natriumhydroksyd). Andre passende tilsetningsstoffer, som f.eks. et konserverende (f.eks. benzyl-alkohol, fenol, timerosal), buffer (f.eks. fosfat, karbonat, citrat) eller isotonerende-middel (f.eks. natriumklorid) kan tilsettes til fremstillingen av komplekset.

Det skal bemerkes at de ovenfor beskrevne data bare er gitt som

115

eksempler. Siden de andre få-Ala , Orn v-oktadekapeptider har omtrent de samme egenskaper og fordeler som medikament, som det oven1 f5or beskrevne //?-Ala1 , Orn1 V"-ACTH(1-1 8)-NH9, er ^-Ala1 , Orn V-oktadekapeptider i folge oppfinnelsen meget nyttige og fordelaktige for terapeutiske formål, f.eks. for behandling av akutt eller kronisk artikulær rheumatisme, allergiske lidelser eller adrenarche i mennesker og dyr eller for undersøkelse av adrenokortikin-funksjonen.

Således kan ^3-Ala<1>, Orn<1>^oktadekapeptidene, syreaddisjonssaltene og kompleksene av disse tilfores oralt eller parenteralt i folge kjente metoder, f.eks. som injeksjon, væske, suspensjon, emulsjon eller erosol, eller i blanding med passende bærere, stabiliserings-midler, emulgatorer, konserveringsmidler, buffere, isotoniserende og/eller fuktemidler, med innhold av en terapeutisk effektiv mengde av den aktive bestanddel.

Den effektive dose kan lett bli bestemt av medisinere på basis

av de angitte data. F.eks. er området for en typisk klinisk dose av de foreliggende oktadekapeptider omtrent 0,2 U/kg til 0,8 U/kg for normale voksne personer. Oktadekapeptidet tilfores med fordel i doseform ved injeksjon og tilfoiælen gjentas så ofte som det kreves i samsvar med legens angivelse.

De folgende eksaipler illustrerer oppfinnelsen.

Eksempel 1

(a) Benzyloksykar Ponyl-/ 3- alanyl- L- tyr osin- me tyle ster

Til en losning av benzyloksykarbonyl-/?-alanin (8,9 g) og L-tyrosin-metylester (7,8 g) i acetonitril blir det tilsatt en losning av 'N,<W->dicykloheksylkarbodiimid (8,3 g) i diklormetan ved 0°C. Blandingen blir satt tilside natten over ved 0°C og det utfelte dicykloheksylurea blir fjernet ved filtrering. Filtratet' blir konsentrert under redusert trykk og gir en rest som loses i etylacetat. Losningen blir vasket med 1N saltsyre og 5% natriumhydrogenkarbonat, torket over natriumsulfat og konsentrert under redusert trykk for å gi en sirup-aktig rest, som blir krystallisert fra etylacetat. Rekrystallisering fra samme løsningsmiddel gir det onskede produkt (13,2 g), med smeltepunkt 11^- - 116°C.

6,2 + 0,<1>+° (c=1.C40, metanol).

Analyse beregnet for <C>^<H>^<I>^<O>g: C = 62,99, H = 6,04-, N = 6,93. Funnet: C = 62,9^, H = 6,06, N = 6,85.

(b) Benzyloksykarbonyl-/^- alanyl- L- tyrosinhydrazid

Benzyloksykarbonyl-/?-alanyl-L-tyrosinmetylester (*+,8l g) blir

lost i etanol (50 ml) og hydrazin (2,9 ml) blir tilsatt. Blandingen blir satt tilside ved romtemperatur i 2 til 3 timer ved h°C natten over. Det utfelte krystalline hydrazid samles ved filtrering, vaskes med kald etanol og torkes under redusert trykk for å gi det onskede produkt (^,72 g), som blir behandlet med varm etanol. Smeltepunkt 225 - 228°C, /*7p<6>+ 3,9 + 0,^° (c = 1,032, 50$ eddiksyre).

Analyse beregnet for C^H^N^O^: C = 59,99, H = 6, 0h, N = 13,99. Funnet: C = 60,09, H = 6,16, N = 13,97-(c) Benzyloksykar bonyl-/ ?- alanyl- L- tyr osyl- L- ser in- me tyle ster

Benzyloksykarbonyl-/?-alanyl-L-tyrosin-hydrazid (2,1+0 g) blir

lost i dimetylformamid (7 ml) og til losningen blir det tilsatt 1N saltsyre (15 ml). Losningen blir avkjolt med is og blandet med is-kald 2M natriumnitrit (3,6 ml). Blandingen blir holdt ved 0°C i h min. og det utfelte azid blir ekstrahert med is-kald etylacetat (25 ml x 2). Ekstraktene blir blandet, vasket med is-kald 5% natriumhydrogenkarbonat og torket over natriumsulfat. Den dannede losning blir tilsatt til en losning av L-serin-metylesterhydroklorid (0,93 g) og trietylamin (0,8*+ ml) i 90$ tetrahydrofuran (20 ml) og blandingen blir omrort ved l+°C i 1+8 timer. Gelatin-aktige utfellinger blir samlet ved filtrering, vasket med vann og torket under redusert trykk for å gi det onskede produkt (1,58- g), som blir behandlet med varm etanol. Smeltepunkt 195 - 196°C. ZV§<6> - 2,1 +0,<1>+° (c =1,091 metanol).

Analyse beregnet for C^H^<N>^<O>g<:> C = 59,13, H = 6,00, N = 8,62.' Funnet: C = 59,29, H = 6,08, N = 8,63.

(d) Benzyloksykarbonyl-/ g- alany. l- L- tyrosyl- L- serin- hydrazid

Til en losning av benzyloksykarbonyl-/?-alanyl-L-tyrosyl-L-serin-metylester (1,1+6 g) i dimetylf ormamid (5 ml) blir det tilsatt hydrazid (0,73 nil)' og blandingen blir satt tilside ved i+°C i 2i+ timer og gir det krystalline hydrazid. Etter tilsetning av etanol blir krystallene samlet ved filtrering, vasket med etanol og torket under redusert trykk for- å gi det onskede produkt (1,1+0 g), som blir behandlet med varm etanol for å gi det rene hydrazid (1,32 g), med smeltepunkt 220 - 22<l>+°C (spalting).

fi& ti* <+> 15,7 - 0,5° ^c = 1?0lf2' iseddiksyre).

Analyse beregnet for C^H^<N>^<O>^<:> C = 56,66, H = 6,00, N = 1<>>+,37. Funnet: C = 56,35, H = 6,Q<l>+, W = 1^,57.

(e) t- butyloksykarbonyl- y- benzyl- L- glutamyl-L-histidyl-L-fenylalanyl- L- arginyl- L- tryptofyl- glycin

Til en losning av L-histidyl-L-fenylalanyl-L-arginyl-L-tryptofyl-glycinacetat (1,20 g) (fremstilt i folge metoden beskrevet

i Bull. Chem. Soc. Japan 1+3 196 (1970) i 5Q$ dimetylformamid

(10 ml) blir det tilsatt t-butyloksykarbonyl-T-benzyl-L-glutaminsyre-p-nitrofenylester (1,03 g) og dimetylformamid (25 ml) og blandingen blir satt tilside' ved <1>+°C i 3 dager. Reaks.jonsblanding-en blir dåpevis tilsatt til et blandet løsningsmiddel av etylacetat og eter (1:1 beregnet som volum, 200 ml) og utfellingene blir samlet ved filtrering. Utfellingene blir vasket med etylacetat og eter, og torket under redusert trykk (utbytte 1,86 g). Produktet blir igjen lost i 50$ eddiksyre (ca. 10 ml) og etanol (ca. 100 ml) blir tilsatt. Den utfelte masse blir samlet og lyofilisert fra eddiksyre for å gi det onskede produkt (1,37 g).

{c*J^- - 23,9 <+> 0,6° (c = 1,020 , 50$ eddiksyre).

Analyse beregnet for C ^ jPI,^, N1 ^ 1. CH^COOH. 3R"20:

C = 56,07, H = 6,57, N = 1<!>+,81, CB^CO = 3,79.

Funnet: C = 56,MD, H = 6,22, N = 15A0, CH^CO = 3,25-

(f) t- butyloksykarbonyl- L- metionyl- y- benzyl- L- glutamyl- L-histidyl- L- fenylalanyl- L- arginyl- L- tryptofyl- glycin

t-butyloksykarbonyl-T-benzyl-L-glutamyl-L-histidyl-L-fenylalanyl-L-arginyl-L-tryptofyl-glycin (1,26 g) blir lost i trifluoreddiksyre (6 ml) og losningen blir holdt ved romtemperatur i 30 min. Losningen blir avkjolt i et isbad og eter tilsettes. Det dannede, delvis avblokkerte heksapeptid som utfelles (1,3<*>+ g) blir lost i dimetylformamid (10 ml) og til losningen blir det tilsatt trietylamin (0,<1>+6 ml) og t-butyloksykarbonyl-L-metionin-p-nitro-fenylester (0,7*+ g). Blandingen blir holdt ved <1>+°C i 2h timer og helles over i etylacetat-eter (1 :h beregnet som volum, 250 ml).

Den utskilte utfelling blir samlet vei filtrering, /asket med eter og torket under redusert trykk (utbytte 1,56 g). Utfellingen blir suspendert i etanol (15 ml), varmet og avkjolt. De dannede utfellinger blir samlet ved filtrering, vasket med kald etanol og eter, lyofilisert fra etylacetat for å gi det onskede produkt (1,16 g). fotff- - 18,5 + 0,5° (c = 1,072, dimetylf ormamid).

Analyse beregnet for C^H ^0-, 2S-CH^COOH. 2H20:

C = 5^,23, H = 6,67, N = 1^,18.

Funnet: C = 5^,51, H= 6,16, N= 13,9^.

(g) Benzylok sykarbonyl-/ g- alanyl- L- tyrosyl- L- seryl- L- metionyl- Y-benzyl- L- glutamyl- L- histidyl- L- fenyl alanyl- L- arginyl- L-tryptofyl- glycin

t-butyloksykarbonyl-L-metionyl-^-benzyl-L-glutamyl-L-histidyl-L-fenylalanyl-L-arginyl-L-tryptofyl-glycin (1,09 g) blir under isavkjollng lost i trifluoreddiksyre (o ml) som inneholder en dråpe vann. Reaksjonsblandingen blir satt til side ved romtemperatur i 30 min. og det dannede heptapeptid-trifluoracetat blir utfelt ved tilsats av eter. Utfellingen blir samlet ved filtrering, vasket godt med eter og torket under redusert trykk (utbytte 1,21 g).

En blanding av benzyloksykarbonyl-/?-alanyl-L-tyrosyl-L-serin-hydrazid (0,86 g),1N saltsyre ( hm\) og dimetylformamid (5 ml) blir avkjolt i et isbad, og is-kald 2M natriumnitrit (0,96 ml) blir tilsatt dråpevis. Blandingen blir omrort ved 0°C i h min.

og is-kald dimetylf ormamid (10 ml) blir tilsitt for å lose det utfelte azid. Etter tilsetning av trietylamin (0,56 ml) blir den resulterende losning tilsatt til en losning av heptapeptid-trif luoracetat fremstilt ovenfor og trietylamin (0,^9 ml) i is-kald dimetylformamid (20 ml). Reaksjonsblandingen blir satt til side ved 0°C i 2k timer og eddiksyre (1 ml) blir tilsatt. Losningsmidlet blir fjernet ved inndamping under redusert trykk ved en bad-temperatur av <1>+5°C for å gi en sirup-aktig rest, som

blir tilsatt med etanol (20 ml). Den gelatin-aktige masse som felles ut blir samlet ved filtrering, vasket omhyggelig med etanol, etylacetat og eter og torket under redusert trykk (utbytte 0,88 g). Filtratet og utvaskingene blir blandet og konsentrert under redusert trykk for å gi en rest. Resten blir lost i etylacetat og uloselige utfellinger blir samlet ved filtrering. Utfellingen blir varmet i etanol til kokepunktet, avkjolt og filtrert vekk (0,27 g). Totalt utbytte utgjor 1,15 g. De blandede utfellingene blir renset ved behandling med varm etanol. A7q2 - 18,5 + 0,5° (c = 1,067, dimetylformamid), Rf = 0,75 (silikagel tynn-skikts kromatografering i et losningsmiddel-system av n-butanol-eddiksyre-pyridin-vann = 30:6:20:21+), Rf = 0,83 (papirkromatografering i et løsningsmiddel-system av n-butanol-eddiksyre-vann = ^rl^).

Analyse beregnet for Or^H^N., g01 ^S. 2CH3C00H. 3R"20:

c = 55,70, H = 6,23, N = 13,33.

Funnet: C = 55,71, H = 6,06, N = 13,3^.

(h) N^- benzyloksykarbonyl- N^- t- butyloksykarbonyl- L- lysyl-L- prolyl- L- valyl- glycyl- N^- t- butyloksykarbonyl- L- ornitin-metylestcr

N -benzyloksykarbonyl-N -t-butyloksykarbonyl-L-ornitin-metylester £\ ,20 g, smeltepunkt 69 - 70°C, Z*7p<8> - 10,6 + 0,5° (c = 1,092, metanol]/ blir hydrogenert over palladium-sort katalysator i metanol som inneholder 10$ eddiksyre i 2 timer. Inndamping av losningsmidlet under redusert trykk gir N<*->t-butyloksykarbonyl-L-ornitin-metylesteracetat som en sirup-aktig rest, som blir behandlet med 50$ vandig kaliumkarbonat i diklormetan ved 0°C.

Det organiske lag blir torket over natriumsulfat og inndampes under redusert trykk ved en bade-temperatur av 20°C. Den dannede rest blir lost i diklormetan (10 ml) og til losningen blir det tilsatt N<*->benzyloksykarbonyl-N<£->t-butyloksykarbonyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycin (1,83 g) fremstilt i henhold til metoden beskrevet i Bull. Chem. Soc. Japan 37 1V71 (196M-). Til losningen blir det tilsatt en losning av N,W-dicykloheksylkarbodiimid (0,60 g) 1 diklormetan ved 0°C. Blandingen blir satt tilside ved h°C i 2 dager. Etter fjernelse av dicykloheksylurea ved filtrering blir filtratet konsentrert under redusert trykk for å gi en slrup-aktig rest. Resten blir lost i etylacetat, vasket med is-kald 1N saltsyre og 1M natriumbikarbonat, torket over natriumsulfat og konsentrert under redusert trykk. Den resulterende rest blir igjen lost i etylacetat (30 ml) og blandet med eter (30 ml) for å gi det onskedggpentapeptidmetylester i en ren form. Utbytte 2, <2>h g. A7D - 55,9 + 0,9° (c = 1,062, metanol).

Analyse beregnet for Cl+2<H>67<N>7°12: C = 58,52, H = 7,83, N = 11,37-

Funnet: 0 = 58,52, H = 8,08, N = 11,33.

(i) N* - benzyloksykarbonyl- N£- t- butyloksykarbo nyl- L- lysyl- L-prolyl- L- valyl- glycyl- N^-t-b utyloksykarbonyl- L- ornitin-hydrazid

Den ovenfor fremstilte pentapeptidmetylester (2,2 g) blir lost

i metanol (30 ml) og hydrazin (0,26 ml) blir tilsatt. Reaksjonsblandingen blir satt tilside ved romtemperatur i 3 dager og hydrazidet helles ut ved tilsetning av vann. Utfellingen blir samlet ved filtrering og krystallisert fra metanol-vann for å

gi det onskede hydrazid (2,1 g), smeltepunkt ved 175 - 180°C.

/«7p<5> _ 35,8 + 0,7° (c -- 1,0^0, dimetylf ormamid).

Analyse beregnet for ^ E^ H^ O^ 1 : C = 57,13, H = 7,83, N = 1^,62.

Funnet: C = 57,01, H 7,87, N = 1^,<1>*1.

(j) N^- benzyloksykarbonyl- N^- t- butyloksykarb onyl- L- lysyl- L-prolyl- L- valyl- glycyl- N^- t- butyloksykarbonyl- L- ornityl-N£- t- butyloksykarbonyl- L- lysyl- L- arginyl- L- arginin-ami d- dla ce tat

Til en is-kald losning av det ovenfor fremstilte pentapeptid-hydrazid (0,95 g) i 90$ tetrahydrofuran (10 ml) blir det tilsatt is-kald 1N saltsyra (2,75 ml) og 2M natriumnitrit (0,61 ml). Blandingen blir satt tilside ved 0°C i 5 min. og justert til pH 7,<1>+ - 7,6 ved tilsetning av trietylamin (0,38 ml). Til losningen blir det tilsatt en is-kald losning av N^-t-butyloksykarbonyl-L-lysyl-L-arginyl-L-arginin-amid-triacetat (fremstilt fra 0,92 mmol av N<*->benzyloksykarbonyl-N<£->t-butyloksykarbonyl-L-lysyl-NG<->nitro-L-arginyl-N -nitro-L-arginin-amid ved katalyttisk hydrogenering

i folge metoden beskrevet i Bull. Chem. Soc. Japan 39 882 (1966) og trietylamin (0,<1>+2 ml) i 80% tetrahydrofuran (7,5 ml). Blandingen blir satt tilside ved <i>+°C i 3 dager og konsentrert under redusert trykk. Til den dannede rest blir det tilsatt etylacetat (10 ml) og 1N eddiksyre (10 ml) og blandingen blir godt ristet. Den vandige fase blir ekstrahert tre ganger med etylacetat og

de kombinerte ekstrakter blir konsentrert under redusort trykk til omtrent 10 ml. Konsentratet blir godt ekstrahert med vann-mettet n-butanol. Ekstrakten blir torket over natriumsulfat og konsentrert under redusert trykk. Den dannede rest blir lyofilisert fra eddiksyre for å gi det onskede produkt (0,85 g).

/^D<2> - ^3,1 t 1,5° (c = 0,5^, 50% eddiksyre).

Analyse beregnet for C6lfH Q016N18.2CH3C00H.U-H20:

C = 51,70, H = 8,0+, N = 15,96, CH3C0 = 5,11.

Funnet: C = 51,60, H = 7,72, N = 15,62, CR^CO = + ,30.

(k) /^- Alanyl- L- tyrosylHL- seryl- L- metionyl- L- glytamyl-L-his tidyl-L- f enylalanyl- L- arginyl- L- tryptofyl-glycy 1-L- lysyi- L- prolyl

L- valyl- ?lycyl- L- orni tyl- L- lysyl- L- arg inyl- L- argini narri d

Til en losning av benzyloksykarbonyl-^-alanyl-L-tyrosyl-L-seryl-L-metionyl-y-benzyl-L-glutamyl-L-histidyl-L-fenylalanyl-L-arginyl-L-tryptofyl-glycin (0,1+05 g) i eddiksyre (5 ml) blir det tilsatt

IN saltsyre i eddiksyre (0,5 ml) og blandingen blir oyeblikkelig lyofilisert, etterfulgt av torking over natriumhydroksydperler. Det således fremstilte dekapeptid-hydroklorid blir lost i dimetylformamid ( h ml) sammen.med N-hydroksysukkinimid (0,10+ g) og til denne losning blir det tilsatt en losning av N,N'-dicykloheksyl-karbodiimid (0,186 g) i dimetylformamid (2 ml). Blandingen blir holdt ved h°C natten over. Det utfelte dicykloheksylurea blir fjernet ved filtrering og filtratet blir helt over i et is-kaldt blandet losning smidde 1 av etylacetat (50 ml) og eter (50 ml).

Den dannede utfelling blir filtrert vekk, vasket med etylacetat

og eter, torket under redusert trykk for å gi den dekapeptid-aktive ester (0,+35 g).

N <x -benzyloksykarbonyl-N f-t-butyloksykarbonyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-N^-t-butyloksykarbonyl-L-ornityl-N^-t-butyloksykarbonyl-L-lysyl-L-arginyl-L-argininamid (0,230 g) blir hydrogenert over palladium som katalysator i 90$ metanol inneholdende eddiksyre (0,1 ml) i 3 timer. Etter fjernelse av katalysatoren blir filtratet konsentrert under redusert trykk for å gi en sirupaktig rest, som blir lyofilisert fra eddiksyre og gir 0,262 g av et pulver. Dette produkt blir lost i dimetylformamid (2 ml)

og trietylamin (0,2 ml) blir tilsatt. Til losningen blir det tilsatt en losning av den ovenfor fremstilte dekapeptid-aktive ester (0,+35 g) i dimetylformamid (1,5 ml) og blandingen blir satt tilside ved +°C i +5 timer. Deretter ble reaksjonsblandingen helt over i is-kald etylacetat (100 ml) og den dannede utfelling ble samlet ved filtrering. Utfellingen ble vasket med etylacetat og eter, lyofilisert fra eddiksyre og torket over natriumhydroksyd-perier under redusert trykk for å gi det urene beskyttede oktadekapeptid (0,662 g).

Det beskyttede oktadekapeptid (0,6+6 g) blir behandlet med hydrogenfluorid (ca.. 10 ml) ved 0°C i 60 min. i nærvær av anisol (0,6 ml) og L-metionin (0,12 g). Etter fjernelse av hydrogenfluorid ved inndamping blir resten lost i is-kaldt vann og losningen blir vasket med etylacetat. Losningen blir sendt gjennom en kolonne (1,7 x 15 cm) av Amberlite CG-^00 (acetatform). Kolonnen blir vasket godt med vann og den vandige losning blir samlet opp. Losningen blir konsentrert til et lite volum og lyofilisert. Det urene avblokkerte peptid (0,70^ g) blir underkastet kromatografering i en kolonne (2,7 x 32 cm) av karboksy-metylcellulose (Serva, 0,56 meq/g) ved bruk av en ammonium-acetatbuffer (pH 6,5, 2000 ml) med en lineær konsentrasjons-gradient fra 0,025 - 0,6 M. Fraksjoner av 10 ml blir samlet og absorbsjonen ved 280 mu blir undersokt. Fraksjonene som til-svarer hovedtoppen (proveror nr. 153 - 180) og skulder av denne (proveror nr. 181 - 200) blir samlet hver for seg og hovedmassen av losningsmidlet blir fjernet ved inndamping under redusert trykk ved en bad-temperatur på 50 - 55°C Restene blir lyofilisert til konstante vekter og gir 228 mg (F-I) og 62 mg (F-II) av fargelostblott pulver fra de to fraksjoner respektivt. F-I (228 mg) blir på nytt kromatografert i en karboksylmetylcellulose-kolonne (2,2 x 27 cm) på samme måte som beskrevet ovenfor, og det rensede peptid (195 mg, F-I-1) blir oppnådd fra en enkel topp. En liten skulder av toppen gir F-I-2 (20 mg). F-IE (62 mg) og F-I-2 (20 mg) blir blandet og den kromatografiske renselse blir gjentatt to ganger for å gi en ytterligere mengde av rent peptid (+6 mg). Totalt utbytte av oktadekapeptidet utgjor således 2+1 mg.' - 55,<*>+° (o = 0,5, 0,1 N eddiksyre), UV A^ <N_>HC1

279 W (E^m 2+, + ), X^ llf1 - 288 mu (E]<*>m17,8),

x0,^N-Na0H = 281 ^ (E<1>$m 25)9)? 28g ^ (E1$m 25?0)>

Aminosyreforholdet i syrehydrolysatet: serin 0,83, glutaminsyre 0,96, prolin 1,0+, glycin 2,09, valin 1,00, metionin 1,03, tyrosin 1,03, fenylalanin 0,98, /?-alanin 0,93, ornitin 1,11, lysin 1,95, histidin 0,97, arginin .3,07. Tryptofa/tyrosin-forholdet i det intakte peptid ble bestemt spektrofotometrisk til 1,15.

Eksempel 2

(a) t- buty lok sykar bony 1-/ 2- alanin

/S-alanin (8,91 g) blir lost i 1N natriumhydroksyd (100 ml)

og til denne losning blir det tilsatt natriumhydrogenkarbonat (21,0 g) og dioksan (70 ml). Losningen blir omrort ved 50°C

og en losning av t-butylazidformat (17,2 g) i dioksan (30 ml)

blir tilsatt dråpevis. Losningen blir omrort i +1,5 time ved 50°G og konsentrert under redusert trykk til omtrent 100 ml. Konsentratet blir avkjolt med is og justert til pH 2 ved tilsetning av +N saltsyre (180 ml). Losningen blir ekstrahert med is-kald etylacetat (ca. 100 ml), torket over vannfri natriumsulfat og konsentrert under redusert trykk for å gi en sirupaktig rest. Resten blir rekrystallisert fra etylacetat-petroleumeter for å gi 12,66 g av det onskede produkt, med smeltepunkt 77 til 78°C.

Analyse beregnet for CgH^NO^: C = 50,78, H = 7,99, N = 7,^0. Funnet: C = 50,99, H = 8,06, N = 7,V7.

(b) t- butyloksykarbonyl-/ ff- alanyl- L- tyrosin- metylester L-tyrosin-metylester-hydroklorid (3,^-8 g) blir lost i vann (15 ml). Til losningen blir det tilsatt 50$ kaliumkarbonat (5 ml) under is-avkjoling og blandingen blir satt tilside på et kaldt sted i +0 min. De utskilte krystallene blir samlet ved filtrering, vasket omhyggelig med kaldt vann og torket under redusert trykk for å gi 2,55 g av L-tyrosin-metylester.

På den annen side blir t-butyloksykarbonyl-/?-alanin (1 ,89 g)

lost i vannfri tetrahydrofuran, og losningen blir avkjolt til

-10°C. Til losningen blir det langsomt tilsatt sulæssivt tri-n-butylamin (2,0+ g) og etylklorformat (1,19 g) under omroring. Etter ti min. blir det tilsatt en suspensjon av det ovenfor fremstilte L-tyrosin-metylester (1,95 g) i vannfri tetrahydrofuran (20 ml). Blandingen blir omrort ve.d - 10°C i 30 min. og ved rom-

temperatur i 2,5 timer og losningsmidlet blir fjernet ved inndamping under redusert trykk. Den dannede rest blir lost i etylacetat, vasket suksessivt med 1N saltsyre, vann, 5$ natriumhydrogenkarbonat og vann, og torket over natriumsulfat. Etter fjernelse av losningsmidlet ved inndamping under redusert trykk blir den dannede rest blandet med eter for å felle ut krystaller. Krystallene som skilles ut blir samlet ved filtrering og torket under redusert trykk for å gi et utbytte av 2,99 g av det onskede produkt. Rekrystallisering fra metanol-eter gir krystaller med smeltepunkt 1+1 til 1+2°C.

Æ7^3 + 8,2 + 0,5° (c = 1,020, metanol).

Analyse beregnet for C18<H>26<N>2<0>6: C = 59,00, H = 7,15, N = 7,65. Funnet: C = 59,03, H = 7,12, N = 7,63.

(c) t- butyloksykarbonyl-/ ?- alanyl- L- tyro sin-- hydrazid

t-butyloksykarbonyl-/?-alanyl-L-tyrosin-metylester (2,56 g) blir lost i vannfri etanol (26 ml). Hydrazin-hydrat (1,7 ml) blir tilsatt til losningen og blandingen blir holdt ved romtemperatur i 5 timer og i et kaldt sted natten over. De dannede krystaller blir samlet ved filtrering, vasket med etanol og eter, torket og gir et utbytte av 2,5<*>+ g av det onskede produkt. Rekrystallisering fra varmt vann gir krystaller med smeltepunkt fra 213,5 til 215°C. + 3,6 + 0,6° (c = 0,978, 50$ eddiksyre).

Analyse beregnet for C^H^N^O^: C = 55,72, H = 7,15, N = 15,29-Funnet: G = 55,7^, H = 7,11, N = 15,30.

(d) t- butyloksykarbonyl- vff- alanyl- L- tyrosyl-L-sery l- L- metionin-metylester

t-butyloksykarbonyl-^-alanyl-L-tyrosin-hydrazid (1,10 g) blir lost i kald 1N saltsyre (7,5 ml). Losningen blir holdt ved ca.

- 10°C og kald 2M natriumnitrit (3,6 ml) blir tilsatt. Deretter

blir blindingen satt tilside for h min. og det dannede azid blir ekstrahert med eter, vasket med kald 1N natriumhydrogenkarbonat og torket over vannfri natriumsulfat. Etter fjernelse av losningsmidlet ved inndamping under redusert trykk ved en bad-temperatur av ca. 10°C blir den dannede rest lost i kald acetonitril. Til losningen blir det tilsatt L-seryl-L-metionin-metylester (0,756 g"

(fremstilt i henhold til metoden beskrevet i Bull. Chem. Soc. Japan 39 1171 (1966)), og blandingen blir satt tilside i h8 timer. Etter fjernelse av losningsmidlet ved inndamping under redusert trykk blir resten lost ved tilsetning av etylacetat og en liten mengde vann. Losningen blir vasket suksessivt med kald 1N saltsyre, vann, 5% natriumhydrogenkarbonat og vann, og torket over natriumsulfat. Etter fjernelse av losningsmidlet ved inndamping under redusert trykk blir den dannede gelatin-aktige masse samlet ved filtrering, vasket med kald etylacetat og eter, og torket for å gi det onskede produkt med et utbytte av 1,20^ g. Produktet blir renset ved ny utfelling fra etylacetat, smeltepunkt 121,5 til 123°C. - 13,0 + 0,6° (c = 0,997, metanol).

Rf = 0,53 (silikagel tynn-skikts-kromatografering i et losnings-middelsystem av metanol-eddIksyre = 15:85 beregnet som volum).

Analyse beregnet for C0Æ N,0oS: C = 52,1*1 , H = 6,90, N = 9,58,

Funnet: C = 52» = 6,85, N = 9,65,

y s 5,1+8.

(e) t- butyloksykarbonyl-^- alanyl- L- tyrosyl- L- seryl- L- metionin-hydrazld

t-butyloksykarbonyl"/?-alanyl-L-tyrosyl-L-seryl-L-metionin-metylester (0,969 g) blir lost i dimetylformamid (6 ml). Til losningen blir det tilsatt hydrazinhydrat (0,5 ml) og blandingen blir satt tilside på .et kaldt sted i omtrent +3 timer. Losningen blir blandet med etylacetat og gir en'gelatin-aktig masse, som blir samlet ved filtrering, vasket med kald etylacetat og torket og gir et utbytte av 1,01 g av det onskede produkt. En ny krystal-lisering fra vann gir krystaller med smeltepunkt 186,5 til 188°C.

/S7^<3> - 20,1 <+> 0,5° (c = 1,3^6, 50$ metanol).

Analyse beregnet for C^H^øOgNgS.B^O: C = +9,82, H = 7,02,

N =13,9^, S = 5,32.

Funnet: C = ^9,72, H = 7,05, N = 1^,50, S = 5,15-(f) t- butyloksykarbonyl-/ 2-ala nyl-L- tyrosyl- L- seryl- L- metionyl-T- t- butyl- L- glutamyl- L- histidyl- L- fenylalanyl-L-a rginyl- L-tryptofyl- glycin.

■ t-butyloksykarbonyl-/?-alanyl-L-tyrosyl-L-seryl-L-metionin-hydrazid (0,+52 g) blir lost i 90$ dimetylformamid (V,5 ml) og losningen blir avkjolt i et is-salt bad. Til losningen blir det tilsatt is-kald 1N saltsyre (2,0 ml) og 1M natriumnitrit (0,825 ml) under omroring: Etter ca. + min. blir det tilsatt en is-kald losning (20 ml) mettet med natriumklorid og t-butyloksykarbonyl-tetrapeptidazidet blir ekstrahert med is-kald etylacetat. Ekstrakten blir vasket med is-kald 5$ natriumhydrogenkarbonat

og torket over vannfri natriumsulfat.

7-t-butyl-L-glutamyl-L-histidyl-L-fenylalanyl-L-arginyl-L-tryptofyl-glycinacetat (0,+96 g) (fremstilt i henhold til metoden beskrevet i Bull. Chem. Soc. Japan 38 11+8 (1965)) og trietylamin (0,21 ml) blir lost i dimetylformamid (15 ml). Til denne losning blir det tilsatt en losning av det ovenfor fremstilte azid i etylacetat og etylacetat blir fjernet ved inndamping under redusert trykk ved en bad-temperatur av 10 - 15°0 og gir en klar losning, som blir satt tilside på et kaldt sted natten over. En ytterligere mengde av azidet fremstilt fra tetrapeptidhydrazid (0,226 g),

som nevnt ovenfor, blir tilsatt til losningen og blandingen blir satt tilside natten over på et kaldt sted.

Deretter blir losningen tilsatt dråpevis til is-kald etylacetat (200 ml) under omroring. Den dannede utfelling blir samlet ved filtrering og gir 0,691 g av det urene dekapeptid-derivatet,

som blir utfelt på nytt fra dimetylformamid-metanol (2:5 beregnet som volum) og lyofilisert fra eddiksyre og gir et pulver i et

utbytte av 0,<1>+5'+ g.

En silikagel tynn-skikts-kromatografering av produktet gir en enkel topp med Rf-verdi (0,5<*>+ til 0,57). Produktet har en spesifikk optisk dreining av - 19,^ ± 0,7° (c = 0,882, dimetylformamid).

Analyse beregnet for <CggH>^N^O^S.SHgO: C = 51,57, H = 7,00,

W = m-,15, S = 2,02.

Funnet: C = 51,62, H = 6,66, N = 1^-,06, S = 2,6+.

På lignende måte som beskrevet i eksempel 1 (k) blir t-butyloksykarbonyl-z^-alanyl-L-tyrosyl-L-seryl-L-metionyl-y-t-butyl-L-glutamyl-L-histidyl-L-fenylalanyl-L-arginyl-L-tryptofyl-glycin kondensert med N<£->t-butyloksykarbonyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-W°-t-butyloksykarbonyl-L-ornityl-N-t-butyloksykarbonyl-L-lysyl-L-arginyl-L-argininamid og det dannede beskyttede oktadekapeptid blir behandlet med hydrogenfluorid for å gi det avblokkerte oktadekapeptid. Etter kromatografisk renselse av produktet

/3-alanyl-L-tyrosyl-L-seryl-L-metionyl-L-glutamyl-L-histidyl-L-fenylalanyl-L-arginyl-L-tryptofyl-glycyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-L-ornityl-L-lysyl-L-arginyl-L-argininamid blir dette erholdt i en ren form. Dette produkt var identisk med oktadeka-paptidet fremstilt i eksempel 1 (k) med hensyn til /°i7D , UV, aminosyreforhold og biologiske egenskaper.

Eksempel

Z^-Ala<1>, Orn<1>57-ACTH(1-l8)-ra2-acotat (0,5 mg) blir lost i <1>+0 mM sinkklorid (0,25 ml) ved romtemperatur, og til denne losning blir det tilsatt en losning (0,25 ml) av l+0mM dinatriumhydrogenfosfat inneholdende natriumklorid (+,5 mg). Således oppnås en suspensjon av det onskede kompleks og dette blir justert til pH 7,0 ved tilsetning av 0,1N natriumhydroksyd.

Sk sompel h

/£-Ala<1>, 0rn<1>^7-AGTH(1-l8)-NH2~acetat (0,5 mg) blir lost i destillert vann (0,15 ml). Til losningen blir det tilsatt en losning (0,1 ml) av poly-L-glutaminsyre (0,5 mg ; molekylvekt ca. 1.500 - 2.000) som forut har blitt nøytralisert med 0,1N natriumhydroksyd. Blandingen blir omrort i flere minutter og til denne blir det tilsatt en losning (0,25 ml) av M/30 fosfatbuffer som inneholder natriumklorid (+,5 mg). Det dannede kompleks blir justert til pH 7, 0 ved tilsetning av 0,1N natriumhydroksyd.

Eksempel 5

^3-Ala<1>, Orn<1>?7-ACTH(1-l8)-NH2-acetat (1,0 mg) blir lost i destillert vann (0,2 ml). Til losningen blir det tilsatt under omroring en losning av poly-L-aspartinsyre (2 mg; molekylvekt ca. 3.OOO) som har blitt nøytralisert med 0,1W natriumhydroksyd, (0,3 ml) for bruk, og således dannes en suspensjon av en hvit utfelling. Den onskede suspensjon av komplekset blir fremstilt ved å tilsette til suspensjonen en losning (0,5 ml; pH 6,8) av M/1 5 dinatriumhydrogenfosfat/kaliumdihydrogenfosfat inneholdende natriumklorid (9,0 mg) og å justere pH i suspensjonen til 7,0 med 0,1N natriumhydroksyd.

Eksemp el 6

/3-Ala<1>, Orn1 ?7-AGTH(1-l8)-NH2-acetat (0,5 mg) blir lost i 100 mM sinkklorid (0,15 ml).- På den annen side blir poly-L-glutaminsyre (0,5 mg; molekylvekt ca. 2.000 - 3.000) noytralisert med 0,1N natriumhydroksyd (0,1 ml) og til losningen blir det tilsatt natriumklorid ( h, 5 mg) og M3 mM dinatriumhydrogenfosfat (0,25 ml). Således dannede losninger blir blandet og omrort ved romtemperatur for å danne en suspensjon av det onskede kompleks, og dette blir noytralisert med en passende mengde av 0,1N natriumhydroksyd.

Eksempel 7

/~~B-Ala1, Orn 1 5 _7-ACTH(1 -1 8 )-NH2-acetat (0,5 mg) blir lost i vann (0,1 ml) ved romtemperatur og til dette blir det tilsatt M/15 kaliumdihydrogenfosfat-dinatriumhydrogenfosfat (0,25 ml)

som inneholder + ,5 mg av natriumklorid. Kopoly-L-glutamyl-L-tyrosin (2,0 mg) (molekylvekt 21.850) blir noytralisert ved tilsetning av 0,1N natriumhydroksyd (0,15 ml). Den nøytraliserte losning blir tilsatt til det ovenfor fremstilte peptid og blandingen blir omrort for å danne en suspensjon av det onskede kompleks, og denne blir justert til pH 7,0 med 0,1N natriumhydroksyd.

Eksempel 8

Z~B-Ala1, Orn 1 5_7-ACTH(1 -18)-NH2-acetat (0,5 mg) blir lost i vann.

(0,1 ml) og til denne blir det tilsatt M/15 fosfatbuffer (0,25 ml) som inneholder U-,5 mg av natriumklorid. Kopoly-L-glutamyl-L-tyrosin (7 mg; molekylvekt cl. 21.850) blir noytralisert med 0,1N natriumhydroksyd. Den nøytraliserte losning (0,1 ml) blir tilsatt til losningen av det ovenfor nevnte peptid for å gi en suspensjon som øyeblikkelig blir klar. Til losningen blir det tilsatt timerosal (0,1 mg) i vann (0,05 ml) og den dannede klare losning blir justert til pH 7,0 ved tilsetning av 0,1N natriumhydroksyd.

Claims (1)

1. Analogifremgangsmåte for fremstilling av kortikotrope oktadekapeptider representert ved folgende formel: B-alanyl-L-tyrosyl-L-seryl-X-Y-L-histidyl-L-fenylalanyl-L-arginyl-L-tryptofyl-glycyl-L-ly syl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-L-ornityl-L-ly syl-L-arginyl-Z, hvori X er en L-metionin-, L-norvalin-, L-norleucin-, L-leucin-eller a-aminosmorsyrerest; Y er en L-glutaminsyre- eller L-glutaminrest og Z er en L-arginin-, L-argininamid- eller L-argininesterrest; ikke-giftige syreaddisjonssalter eller komplekser derav, karakterisert ved at et beskyttet dekapeptid med formel: -B-alanyl-L-tyrosyl-L-seryl-X-Y-R2~L-

   glutamyl-L-histidyl-L-fenylalanyl-L-arginyl-L-tryptofyl-glycin, hvori R1 er en amino-beskyttende gruppe; X har den ovennevnte

   betydning og R2 er en karboksyl-beskyttende gruppe, omsettes med et beskyttet oktadekapeptid av formel: W^-R^-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-N^-R^-L-ornityl-N^R^-L-lysyl-L-arginyl-Z, hvori R^, R^ og R^ hver er en amino-beskyttende gruppe og Z har den ovennevnte betydning, ved den aktiverte estermetode, dicyklo-heksylkarbodiimid-metoden, azidmetoden, metoden med blandede anhydrider eller er kombinasjon derav, og beskyttende grupper fjernes (avblokkeres)fra det dannede beskyttede oktadekapeptid med formel: R1-B-alanyl-L-tyrosyl-L-seryl-X-f-R2-L-glutamyl-L-histidyl-L-fenyl-alanyl-L-arginyl-L-tryptofyl-glycyl-N^-R^-L-lysy1-L-prolyl-L-valyl-glycyl-N^-R^-L-ornit<y>l-Nf-R^-L-lysyl-L-arginyl-Z, hvori R1 , X, R2, R^, R^, R^ og Z har de ovennevnte betydninger ved hydrogenolyse, acidolyse, alkalisk for.sepning, hydrazinolyse eller reduksjon med natrium i flytende ammoniakk, og om onsket omdannes det dannede (avblokkerte) oktadekapeptid til syreaddisjonssalter eller komplekser derav på i og for seg kjent måte.