NO146542B - Stabiliserte toerrkulturer av melkesyreproduserende bakterier - Google Patents

Description

Denne oppfinnelse angår stabiliserte, tørrede kulturmediumfaststoffer som utgjør et konsentrat av levedyktige; uskadelige melkesyreproduserende bakterieceller.

Kulturer av melkesyrebakterier til kommersiell fremstilling av ost konserveres vanligvis ved frysning, under anvendelse av flytende nitrogen, av kulturen, som dermed nød-vendigvis må oppbevares og distribueres i frossen tilstand.

En slik kr.yogen konservering er rimelig tilfredsstillende når fabrikanten av kulturen og ostefabrikanten har det nødvendige fryse- og kjøleutstyr. Fryste kulturer av visse melkesyrebakterier anvendes også til kommersiell fremstilling av yoghurt og syrnede melkeprodukter.<v> Til hjemmefremstilling av yoghurt og syrnede melkeprodukter er fryste kulturer ikke tilfredsstillende, hvilket skyldes deres relativt høye pris og problemer forbundet med deres håndtering.

I Europa og USA har det derfor vært kommersiell praksis å distribuere tørrede kulturer av yoghurt- og surmelkproduserende bakterier til hjemmebruk. Med slike tørrede kulturer har der forekommet alvorlige problemer med hensyn til deres lagerholdbarhet. Selv om detaljistene ofte har sørget for å holde de tørrede kulturer under avkjøling, har produktene uønsket liten lagerholdbarhet. Antallet av levedyktige bakterier forminskes kontinuerlig med tiden under oppbevaring i avkjølt tilstand.

Uten oppbevaring under kjølebetingelser desaktiveres de tørrede kulturer hurtig. For å sikre at der vil være tilstrekkelig med levedyktige celler tilstede til å danne yoghurt og syrnede melkeprodukter etter fabrikantens instruksjoner, har det vært nødvendig å levere et 50 - 200% overskudd av cellene. Dette forøker omkostningene og gjør de med produktene følgende bruks-anvisninger unøyaktige.

Lignende problemer gjør seg gjeldende ved fremstilling og distribuering av yoghurt- og surmelkbakterier i form av tabletter for oral inntagelse. De tabletterte,tørre celler kan oppbevares under avkjøling, men selv da skjer det et tap av cellelevedyktigheten med tiden. Når tablettene på emballasjen angis å inneholde en viss minimumsmengde aktive celler pr. tab-lett, må produsenten derfor, for å være på den sikre side, inn-føre et overskudd av celler på det tidspunkt da tablettene fremstilles for å sikre at etiketteringen vil fortsatt være gyldig og nøyaktig mens produktet finnes på lager hos detalj isten.

Inntil foreliggende oppfinnelse var det kjent at kommersielt tørrede kulturer av melkesyreproduserende bakterier ikke har tilstrekkelig stabilitet til at de kan oppbevares ved værelsetemperatur. En tilstrekkelig lagerholdbarhet kunne ikke oppnåes med mindre kulturene ble oppbevart ved kjøletemp-eraturer. Med foreliggende fremgangsmåte muliggjøres for første gang distribuering og detalj forhandling av tørrede yoghurt- og surmelkkulturer til hjemmebruk og av tabletterte yoghurt- og surrnelkbakterier uten at det er nødvendig med noen kjøling.

I henhold til oppfinnelsen tilveiebringes der' således stabiliserte, tørrede kulturmediumfaststoffer som utgjør et konsentrat av levedyktige,uskadelige melkesyreproduserende bakterieceller, hvilke faststoffer er fremstilt ved tørring av en fermentert kultur inneholdende disse celler sammen med andre faststoffer som er tilstede ved avslutningen av inkubasjonen av en kultur av cellene i et vandig næringsholdig medium, hvilket medium er tørret til et fuktighetsinnhold på under 5 vekt%, etter at dets pH-verdi er innstilt på en størrelse som er gunstig for cellenes stabilitet etter tørring. De nye stabiliserte, tørrede kulturmediumstoffer er karakteristiske ved at der er tilstede i faststoffene en synergistisk virkende kombinasjon av stabiliseringspotensiatorer omfattende (a) en ascorbatforbindelse valgt blant L-ascorbinsyre og spiselige, vannoppløselige salter av denne syre, og (b) en andre potensiator valgt blant glutaminsyre, asparaginsyre og spiselige,vannoppløselige salter av disse syrer, hvilke potensiatorer er blitt oppløst i den fermenterte kultur for å oppnå effektiv kontakt med cellene før tørring og i mengder svarende til, på molar basis, 4-20 vektdeler L-ascorbinsyre for ascorbatforbindelsens vedkommende, og for den annen potensiator svarende til 1,5 - 20 vektdeler, fortrinnsvis 3-15 vektdeler, mononatriumglutamat pr. 100 vektdeler av den vannfrie samlede vekt av cellene og de andre fer-menterings f ast stoff er .

Uttrykket "melkesyrebakterier" er her brukt for å betegne den store klasse av uskadelige melkesyreproduserende bakterier. Disse bakterier har generelt en evne til å -fermente-re enkle carbohydrater, f.eks. lactose eller fructose, idet melkesyre er i det minste ett av fermenteringsproduktene, og vanligvis det i størst mengde forekommende. Som eksempler på slike melkesyrebakterier kan nevnes følgende: Streptococcus lactis, Streptococcus cremoris, Streptococcus diacetilactis, Streptococcus thermophilus, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus bifidus, Lactobacillus casei, Lactobacillus lactis, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus thermophilus, Lactobacillus fermentii og Pediococcus cerevisiae.

Foreliggende oppfinnelse er særlig nyttig og frembyr særlige fordeler i forbindelse med fremstillingen av stabiliserte tørrede bakteriekonsentrater av Streptococcus thermophilus, Lactobacillus bulgaricus og Lactobacillus acidophilus, men oppfinnelsen er ikke begrenset til fremstilling av tørrede bakteriekonsentrater av disse tre organismer. Bakteriene Streptococcus termofilus og Lactobacillus bulgaricus betegnes undertiden

"yoghurt-bakteriene" og anvendes i alminnelighet til fremstilling av yoghurt. I visse land anvendes Streptococcus thermophilus og Lactobacillus acidofilus til fremstilling av surmelkprodukter. I USA er en "yoqhurt"-kultur oftest en blanding av Streptococcus thermophilus og Lactobacillus bulgaricus. I forbindelse med foreliggende oppfinnelse anvendes

imidlertid uttrykket "yoghurt-bakterier" generelt og omfatter én eller flere stammer av Lactobacillus bulgaricus, Streptococcus thermophilus eller Lactobacillus acidofilus, eller en kombinasjon av to eller tre av disse arter.

Ved fremstillingen av de stabiliserte, tørrede kulturmediumfaststoffer ifølge foreliggende oppfinnelse dyrkes en ren eller blandet kultur av de ønskede melkesyre-produserende bakterier i et flytende medium som gir tilstrekkelig vekst av

den eller de angjeldende kulturer. Dette medium kan være sammen-satt av protein eller proteinfraksjoner, forskjellige fermenter-bare carbohydrater, vekststimulanter, uorganiske salter, puffere, etc, eller mediet kan være steril søtmelk, skummetmelk, valle eller andre naturlige substrater, eller de kan være kombinasjo-ner derav. Vekstmediet kan oppvarmes eller steriliseres til potensiering av en tilfredsstillende vekst. Etter den ønskede varmebehandling, avkjøling og poding får kulturen lov til å ut-vikle seg under generelt optimale inkuberingsbetingelser med hensyn til tid og temperatur. Avhengig av den eller de organismer som dyrkes, kan inkubasjonstidene være 4-48 timer, og tem-peraturene kan variere fra 15 til 50° C. Det kan også være ønskelig å regulere pH-verdien og mengden av oppløst oxygen.

Når der er oppnådd tilfredsstillende vekst, avkjøles kulturen

i sitt vekstmedium til mellom 0° og 15° C.

Generelt omfatter den metode som anvendes for å oppnå levedyktige celler av melkesyre-produserende bakterier, ikke i seg selv hittil ukjente trinn, men den utføres i overensstemmel-se med kjente metoder for dyrkning av slike bakterier. Når der er oppnådd en tilfredsstillende bakteriepopulasjon i et egnet vekstmedium, kan vekstvæskens pH-verdi være lavere enn den som er ønskelig til fremstilling av et tørret produkt. Slutt-pH-verdien vil typisk ligge i området 4,4 - 5,4. Før tørring av fermenteringsvæsken er det fordelaktig å tilsette et alkalisk reagens, f.eks. natriumhydroxyd, for å heve pH-verdien til et nivå som er gunstigere for bakterienes stabilitet. I alminnelighet er det, som bekjent, ønskelig å regulere pH-verdien oppad mot nøytralitet (pH-verdi 7) , og der foretas regulering til minst pH-verdi 5,8. Der kan anvendes et hvilket som helst i næringsmidler akseptabelt alkali, f.eks. natriumhydroxyd, kaliumhydroxyd, ammoniumhydroxyd og kalsiumhydroxyd. Det foretrekkes å innstille pH-verdien på ca. 6,0 - 6,5. Som spesifikt eksempel kan nevnes at pH-verdien ved tilsetning av natriumhydroxyd kan heves til ca. 6.2. Når der i vekstmediet skal inkorporeres andre tilsetninger, som vil påvirke vekstmediets pH-verdi, f.eks. de ifølge foreliggende oppfinnelse anvendte stabilitetspotensiatorer, kan pH-reguleringen bekvemt utføres til slutt.

Før tørring av cellene i vekstmediet tilsettes en,kombinasjon av potensiatorer. En ascorbatforbindelse er en av de vesentlige medvirkende potensiatorer for å oppnå den forøkede stabilitet. Uttrykket "ascorbatforbindelse" skal her betegnes L-ascorbinsyre (vitamin C) og dens vannoppløselige spiselige salter. Slike "spiselige salter" er de salter som er godkjent til anvendelse i menneskeføde og er av næringsmiddelkvalitet. Ascorbatforbindelsen bør inkorporeres i en mengde som på mol-basis svarer til 4-20 vektdeler L-ascorbinsyre pr. 100 deler tørrstoff i vekstmediet, hvilket vil si tørrvekten av bakteriecellene + tørrvekten av de andre faststoffer som finnes i vekstmediet. På samme basis tilsettes den annen potensiator i en mengde som på molar^basis svarer til 1,5 - 20 (eller fortrinnsvis 3-15) deler mononatriumglutamat pr. 100 deler av det nevnte totale tørrstoffinnhold i fermenteringsmediet. Uttrykke-ne "glutamatforbindelse" og "aspartatforbindelse" skal her betegnes henholdsvis (a) glutaminsyre og dens spiselige vannopp-løselige salter, og (b) asparaginsyre og dens spiselige vannopp-løselige salter. Der foretrekkes en glutamatforbindelse som hensiktsmessig kan tilsettes i form av mononatriumglutamat.

Når vekstmediet tørres ved frysetørring, er det ønskelig å inkorporere et frysebeskyttelsesmiddel. Egnede kjente frysebeskyttelsesmidler er f.eks. inositol, sorbitol, mannitol, glucose, saccharose, maissirup, dimethylsulfoxyd, stivelsesarter og modifiserte stivelsesarter av alle typer, polyvinylpyrro-lidon, maltose eller andre mono- og disaccharider. Tilsetnings-ir.engden kan ligge i om rådet fra 1,0 til 300 g/l av kulturen, avhengig av det angjeldende middels identitet.

Der bør anvendes en mengde som effektivt nedsetter cellebeskadi-gelsen ved frysning til et minimum. Når der anvendes en annen tørremetode, f.eks. varmetørring, anvendes ikke noe frysebeskyttelsesmiddel, og der kan generelt anvendes en hvilken som helst av de forskjellige metoder til tørring av bakterier eller nytti-ge biologiske materialer til et pulver. Som eksempler på disse kan nevnes frysetørring, spraytørring, valse- og/eller vakuum-pannetørring. De foretrukne tørremetoder for utfølelse av oppfinnelsen er frysetørring eller spraytørring.

Sammenligningsforsøk som viser de viktige og uventede

, resultater som oppnås ved foreliggende oppfinnelse, fremgår av nedenstående forsøk A, B, C og D og de tilhørende tabeller.

Forsøk A

To 2000 ml prøver av rekonstituert skummetmelk, (12 % tørrstoff) podes med en aktiv melkesubkultur av Lactobacillus acidofilus i en mengde på 1,0 % og inkuberes i 8 timer ved 4 0°C. Derpå avkjøles begge prøvene til 7° C. Begge prøvers pH-verdi er under 5,0 etter inkubering og avkjøling. 60 minutter før frysetørring innstilles den ene 2000 ml prøve på pH 6,55 med 50 %-ig natriumhydroxydoppløsning, og den annen prøve (kontroll-prøven) får fortsatt ha pH 4,77. Derpå frysetørres begge prøver. De erholdte tørrede pulveres lagerholdbarhet ved 21° C fremgår av nedenstående tabell A. Analysen for å bestemme antallet av levedyktige organismer er utført etter en gjengs platetellemeto-de til bestemmelse av levedyktige organismer under anvendelse av en standard-yoghurtagar som platedyrkningsmedium. Platene inkuberes ved 37° C i 72 timer.

Forsøk B

Betingelsene og metodene er de samme som i forsøk A

med den forskjell at der bare fremstilles én prøve på 2000 ml. Til denne tilsettes 25 g mononatriumglutamat (MSG), og pH-verdien innstilles på 6,55 med 50 %-ig natriumhydroxydoppløsning. Etter en henstandstid på 60 minutter for likevektsinnstilling frysetørres fermenteringsmediet inneholdende Lactobacillus acidofilus-cellene. Lagerholdbarheten bestemmes ved 21° C og der fåes følgende resultater:

Forsøk C

Der anvendes lignende betingelser som beskrevet i forsøk A, men denne gang innstilles begge 200 0 ml prøver på pH 6,00 før frysetørringen. Til den ene 2000 ml prøve tilsettes også 25 g L-ascorbinsyre (som tilblandes før pH-innstillingen). Der anvendes en pH på 6,00 i stedet for 6,55 på grunn av de lavere resulterende fuktighetsinnhold i pulveret. Begge pulvere frysetørres. De erholdte tørrede pulveres lagerholdbar-tiet ved 21° C fremgår av nedenstående tabell C.

Forsøk D

2000 ml Lactobacillus acidofilus-kultur fremstilles som beskrevet under forsøk A med den forskjell at pH-verdien som i forsøk C innstilles på 6,00 med 50 %-ig natriumhydroxyd-

oppløsning etter tilsetning av 25 g L-ascorbinsyre og 25 g mononatriumglutamat (MSG). Prøven frysetørres. Resultatene av lagerholdbarhetsundersøkelsen fremgår av tabell D.

De ovenfor stående forsøksresultater kan lettest sam-menlignes på basis av følgende sammenfattende tabell.

Sammenfattende tabell

(Forsøk A, B, C og D)

Utførelsesformer av foreliggende oppfinnelse, som kan tilpasses til kommersiell drift, er anført i nedenstående eksempler 1 - 4. Det vil forståes at de negative kontroller som betegnes "gammel metode", bare er medtatt av sammenligningsgrunner, mens de behandlinger som betegnes med "ifølge oppfinnelsen" er utførelsesformer for foreliggende oppfinnelse.

Eksempel 1

To 2000 ml prøver av rekonstituert skummetmelk (12 % skummetmelkfaststoff) oppvarmes i 12 minutter ved 116° C. Deretter avkjøles de til 40° C og podes med 1,0 % av en egnet kultur av Lactobacillus bulgaricus inneholdende ca. 1 milliard levedyktige celler pr. ml. De to på denne måte podede prøver inkuberes deretter ved 40° C i 8 timer, hvorpå de avkjøles hurtig i isvann til 5° C. Den ene fermenterte kultur på 2000 ml betegnes "ifølge oppfinnelsen" og får følgende behandling: 40 g ascorbinsyre, 25 g mononatriumglutamat (MSG) og 25 g inositol tilsettes under rstadig omrøring, og derpå innstilles pH på 6,10 med 50 %-ig natriumhydroxydoppløsning. Den annen 2000 ml fermenterte kultur, som betegnes "gammel metode", undergår ikke denne behandling. Den sistnevnte kultur er kontroll. De to kulturer frysetørres deretter på konvensjonell måte, og de erholdte pulvere oppbevares ved 21° C, og passende platetellin-ger for bestemmelse av antallet av levedyktige organismer utfø-res på Hansens yoghurt-agar, dels straks og dels etter 1, 2 og 3 måneders forløp. Resultatene fremgår av nedenstående tabell I:

Eksempel 2

Der anvendes samme metode som beskrevet i eksempel 1 med den forandring at der som forsøksorganisme anvendes Lactobacillus helveticus. Lagerholdbarhetsforsøkene med de erholdte frysetørrede pulvere gir de i nedenstående tabell II anførte resultater:

Eksempel 3

Den i eksempel 1 beskrevne metode anvendes med følgen-de forskjell: Som dyrkningsmedier anvendes to 10 000 ml prøver av rekonstituert skummetmelk (16 % tørrstoff); forsøksorganis-men er Lactobacillus acidofilus; de to erholdte fermenterte kulturer sprøytetørres på et lite sprøytetørringsapparat med en tilførselshastighet for kulturen på 12 - 15 ml/min, en dysehas-tighet på 3,5 kg/cm^ og en utgangstemperatur på 50 - 60° C.

De lagerholdbarhetsresultater som oppnås med disse to typer av sprøytetørrede pulvere, fremgår av nedenstående tabell

III.

Eksempel 4

Den i eksempel 1 beskrevne fremgangsmåte anvendes med følgende forskjell: Som forsøksorganisme anvendes Streptococcus cremoris. Der inkuberes ved 21° C i 16 timer; der tilsettes pr. 2000 ml fermentert kultur 20 g ascorbinsyre, 12,5 g mononatriumglutamat og 12,5 g inositol; pH-verdien innstilles på 6,25 med 50 %-ig natriumhydroxydoppløsning; der anvendes sta-dig en ubehandlet kultur som kontroll; dyrkningsmediene fremstilles som to 2000 ml prøver av rekonstituert skummetmelk (16 % tørrstoff), og der anvendes en gjengs melkeagar (Ellikers) til platetellingsbestemmelsen av antallet av levedyktige organismer. Resultatene fremgår av nedenstående tabell IV.

Eksempel 5

Betingelser og fremgangsmåter er de samme som beskrevet i eksempel 1 med den forskjell at der i stedet for MSG anvendes 23 g natriumaspartat. Resultatene fremgår av nedenstående tabell V.

Som det fremgår av de ovenstående eksempler, foretas der før tørringen inkorporering av begge potensiatorer i dyrk-ningsmediet-og innstilling av pH-verdien. Det er bekvemt å foreta pH-innstillingen sist da tilsetningen av potensiatorene vil medføre en liten endring i pH-verdien. Disse tilsetninger bør oppløses i det flytende: medium for å oppnå effektiv kontakt med cellene før tørringen. En kort ventetid etter tilsetningen av potensiatorene og etter pH-innstillingen er ønskelig. Cellene bør få lov til å innstille seg i likevekt med tilsetningene. Den minimale holdetid er ikke blitt bestemt, men i alminnelighet er det ønskelig å holde cellene i kontakt med de oppløste tilsetninger i 30 - 60 minutter eller lengre. Ved kommersiell drift er en holdetid på 1 - 2 timer blitt anvendt. Det er ikke

nødvendig å ha lengre holdetid. Kulturmediet inneholdende tilsetningene holdes fortrinnsvis ved en temperatur mellom 0° og 15° C, og den anvendte temperatur er en ikke-frysetemperatur ved hvilken cellene er beskyttet mot tap av levedyktighet. Når den kommer-sielle behandling av en flytende kultur for å få et tørt produkt forsinkes, f.eks. over natten, kan holdetiden fortsettes under de angitte kjølebetingelser. I nærvær av tilsetningene og ved oppbevaring ved en ikke-frysetemperatur på under 15° C forblir cellene i kulturmediet levedyktige etter flere døgns oppbevaring. Det er imidlertid ikke noen grunn for å forsinke tørringen, og vanligvis underkastes kulturen frysetørring eller sprøytetørring i løpet av få timer (2-6 timer) etter inkorporeringen av tilsetningene .

Uttrykket "tørret" er her brukt for å betegne produkter som inneholder høyst 5 vekt% fuktighet. Slike produkter fremkommer umiddelbart i form av et fint pulver eller granuler. Vanligvis kan det dannede produkts gjennomsnittlige fuktighetsinnhold ved enten frysetørring eller sprøytetørring nedsettes til minst 2,5 - 3,5 vekt%. Der er ikke noe minimumsfuktighets-innhold for det tørrede produkt, men i praksis er det vanskelig å fremstille produkter som inneholder mindre enn ca. 1 - 2 vekt% vann. Fortrinsvis inneholder de stabiliserte tørrede konsentrater av melkesyreproduserende bakterieceller, som fremstilles ifølge oppfinnelsen, mindre enn 3,5 vekt% vann, f.eks. 2,5 - 3 vekt% fuktighet.

Når det ønskes å fremstille tabletter av de stabiliserte tørrede konsentrater med et høyt antall levedyktige celler, kan det stabiliserte tørrede materiale blandes med en til

tablettering egnet sukkerart, f.eks. lactose eller saccharose, hvilket sukkermateriale fortrinnsvis er

i granulær form som er avpasset etter dens funksjon som tablett-bindemiddel. For eksempel kan 5-10 vektdeler av de stabiliserte tørrede fermenteringsfaststoffer inneholdende cellekonsen-tratet blandes med 90 - 95 deler tabletteringssukkermateriale, og blandingen kan presses til tabletter på vanlige tablette-ringsmaskiner.

Der kan til foreliggende oppfinnelses formål anvendes konvensjonelt frysetørrings- og sprøytetørringsapparatur. I de ovenstående eksempler er frysetørringen utført med en frysetørre-maskin fremstilt av Alloy Products. Inc., Waukesha, Wisconsin, og sprøytetørringen er utført i et Nichols/Niro laboratorie-sprøytetørreutstyr.

Claims (4)

1. Stabiliserte, tørrede kulturmediumfaststoffer som ut-gjør et konsentrat av levedyktige, uskadelige melkesyreproduserende bakterieceller, hvilke faststoffer er fremstilt ved tør-ring av en fermentert kultur inneholdende disse' celler sammen

med andre faststoffer som er tilstede ved avslutningen av inkubasjonen av en kultur av cellene i et vandig, næringsholdig medium, hvilket medium er tørret til et fuktighetsinnhold på under 5 vekt%, etter at dets pH-verdi er innstilt på en størrelse som-er gunstig for cellenes stabilitet etter tørring,karakterisert ved at der er tilstede i faststoffene en synergistisk virkende kombinasjon av stabiliseringspotensiatorer omfattende (a) en ascorbatforbindelse valgt blant L-ascorbinsyre og spiselige,vannoppløselige salter av denne syre, og (b) en andre potensiator valgt blant glutaminsyre, asparaginsyre og spiselige,vannoppløselige salter av disse syrer, hvilke potensiatorer er blitt oppløst i den fermenterte kultur for å oppnå effektiv kontakt med cellene før tørring og i mengder svarende til, på molar basis, 4-20 vektdeler L-ascorbinsyre for ascorbatforbindelsens vedkommende. og for den annen potensiator svarende til 1,5 - 20 vektdeler, fortrinnsvis 3-15 vektdeler, mononatriumglutamat pr. 100 vektdeler av den vannfrie samlede vekt av cellene og de andre fer-menterings f aststof f er .

2. Stabiliserte,tørrede kulturmediumfaststoffer ifølge krav 1, karakterisert ved at den andre potensiator er mononatriumglutamat.

3. Stabiliserte,tørrede kulturmediumfaststoffer ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at bakteriecellene er Streptococcus thermofilus, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus acidofilus eller blandinger derav.

4. Stabiliserte,tørrede kulturmediumfaststoffer ifølge krav 1 - 3r karakterisert ved at den fermenterte kultur har vært underkastet sprøytetørring.