NO147860B - Analogifremgangsmaate for fremstilling av et multivalent antigen-proteinkompleks egnet til blokkering av allergireaksjoner - Google Patents

Description

Metoder til behandling av allergier og allergiske

reaksjoner har hittil innebåret at man til vedkommende individ administrerer et antigen som igangsetter dannelse av antistoffer som konkurrerer med de antistoffer som fremkalles av allergenet, hvorved man demper eller nedsetter allergireaksjonen.

Den måte man hittil vanligvis har gått frem på ved behandling av allergipasienter, involverer fremstilling av en rå ekstrakt av den allergifremkallende substans i en bufret vandig opp-løsning. Pasientene behandles derefter med først ganske små, senere efterhvert stigende doser av den rå ekstrakt over en lang tidsperiode. Ofte er tre eller flere års behandling nødvendig før det konstateres vesentlig varig forbedring. Efterhvert som behandlingen skrider frem økes gradvis den

mengde rå ekstrakt som en pasient mottar. Omfanget av øket dosering og hyppigheten derav avhenger av pasientens individuelle følsomhet og graden av reaksjon på forutgående doseringer.

Injeksjon av den hele rå allergenekstrakt gjennom lang

tid fremkaller dannelse av blokkerende eller konkurrerende antistoffer. Teorien går ut på at de blokkerende antistoffer konkurrerer med allergiantistoff for antigenet og gir beskyttelse til allergipasienten.

Det knytter seg mange og åpenbare ulemper til denne

kostbare og tidskrevende fremgangsmåte for desensibilisering av den allergiske pasient. Meget ofte resulterer administreringen av den rå ekstrakt i en alvorlig allergireaksjon hvis doseringen ikke er blitt omhyggelig overvåket og administrert. Dessuten er prosessen med desensibilisering en lang og tid-krevende og meget ofte kostbar prosess. Dessuten resulterer dannelse av konkurrerende antistoffer i allergipasienten meget ofte i bivirkninger som kan være mer skadelige for pasienten enn den allergiske reaksjon i seg selv.

Av større betydning er det at den metode til desensibilisering som hittil har vært anvendt ved kjent teknikk, ikke har vært helt vellykket. I mange tilfeller resulterer den tidskrevende desensibiliseringsprosedyre ikke i tilstrekkelig grad av beskyttelse for den allergiske pasient, som stadig fortsetter å lide under allergien når han eller hun blir utsatt for det kritiske antigen.

Ifølge foreliggende oppfinnelse tilveiebringes en fremgangsmåte for fremstilling av et kompleks som egner seg til administrering hos en allergipasient og som nøytraliserer eksisterende antistoffer og fullstendig blokkerer dannelse av antistoffer, enten de er konkurrerende eller spesifikke for det allergene antigen.

Slike komplekser som blokkerer den allergiske reaksjon

kan anvendes til behandling av allergiske individer til blokkering av allergireaksjonen. Det omhandlede kompleks kan opparbeides til et injiserbart preparat til administrering til en allergipasient for blokkering av allergireaksjoner.

Oppfinnelsen angår således en fremgangsmåte for fremstilling av et multivalent antigen-protein-kompleks egnet til blokkering av allergireaksjoner, som består av minst ett antigen D fragment fra timotei (engrottehale, Phleum pratense) med den antigene determinantstruktur

hvor

G betegner glukose og

T betegner treonin eller et peptid koblet til nevnte struktur

over et treoninmolekyl,

kovalent bundet over minst én giukosedel til et peptid eller et protein, og fremgangsmåten karakteriseres ved at man aktiverer glukosedelen i antigen D-fragmentet med formel I

ved omsetning med et aktiveringsmiddel, særlig et cyanohalogenid, og omsetter det således dannede mellomprodukt med et peptid eller protein.

Det er nylig blitt isolert og karakterisert forskjellige allergene antigenfragmenter av timoteipolien, se Malley et al, Immunochemistry 1975, vol. 12, side 551—554. Et særlig viktig multivalent allergen som finnes i timoteipolien, er det som er tidligere kjent under betegnelsen antigen B. Den monovalente antigene determinairtstruktur av antigen B som vanligvis betegnes antigen D, er:

hvor G betegner glukose og T betegner treonin eller et peptid bundet til den viste struktur over et treoninmolekyl.

Fragmenter av antigen D som i den kjente teknikk er identidfisert som antigen D^, antigen D2 og antigen D^, er innbyrdes forskjellige i størrelsen av den peptid-"hale"

som er koblet til glukosedelen av den antigene determinant-struktur over treoninmolekylet (se J. Immunology 99, 82 5,

1967; Immunochemistry, 1, 237, 1964, 12, 551, 1975;

WHO Symposium on Allergen Standardization, red. av F.T. Perkins, Geneve, 1974, Develop. biol. standard 29, 29, 1975).

Antigen D. har en molekylvekt på ca. 5000. Antigen D ? har

en molekylvekt på ca. 2 500. Antigen er det fragment hvor det til glukosedelen bundne molekyl er treonin alene. I

noen tilfeller er serin i stedet for treonin forbundet med glukosedelen på grunn av en "feillesning" av den kode som er ansvarlig for addisjonen av spesifikke aminosyrer under proteinsyntesen.

Quercetinfraksjonene av antigenets strukturformel er bundet til glukosedelen via en eterbinding over OH-grupper på de respektive molekyler. Treoninbindingen til glukosedelen er også en eterbinding gjennom en OH-gruppe på cellobiosefraksjonen og OH-gruppen i treonin. På basis av støkiometriske betraktninger antas det at aktiveringen primært opptrer på

det glukosemolekyl som er nabostillet til quercetinmolekylet. Det skal imidlertid fremheves at de beskrevne komplekser

dannes ved en glukoseaktiveringsmekanisme uansect den presise lokalisering av aktiveringen innenfor cellobiosefraksjonen.

Det er ikke kjent presis hvilken OH-gruppe i cellobiosefraksjonen som inneholder bindingsstedet.

Det er klart ut fra den ovenfor viste struktur at molekylet på forskjellige steder ér åpent for kobling med mange forskjellige slags reaktanter. Det kan fremstilles mange multivalente komplekser som man kunne vente ville fremkalle allergiske reaksjoner på grunn av deres struktur. Det har faktisk vist seg at tilknytningen av proteiner eller peptider til molekylet på andre steder enn glukose- eller karbohydrat-delene resulterer i komplekser som fremkaller allergiske reaksjoner.

Det har overraskende vist seg at bindingen av et peptid eller et protein til antigen D-fragmentet over glukosedelen resulterer i et kompleks som ikke medfører allergireaksjoner, men som tvert imot fullstendig nøytraliserer allergi-antistoff og hemmer eller blokkerer dannelse av allergi-antistoffer.

Disse komplekser kan således administreres til en allergipasient for fullstendig hemning av allergireaksjonen uten at det er nødvendig å foreta den ovenfor beskrevne langvarige, tidskrevende og kostbare desensibiliseringsprosess. Da administrering av komplekset helt hemmer dannelse av allergi-antistof fer, hemmes allergireaksjonen selv såvel som ailergi-virkninger som frembringes av dannelse av konkurrerende antistoffer som dannes ved den konvensjonelle desensibiliserings-metode.

Timotei-antigen D-fragmentet kan være kovalent bundet over minst én gJukoseenhet til et hvilket som helst egnet peptid eller protein. Det vil forstås at ethvert peptid eller protein som egner seg til administrering til en allergipasient kan bindes kovalent til antigenfragmentet. De fore-trukne peptider eller proteiner er humant serumalbumin, en d-aminosyrekopolymer av lysin og glutaminsyre (d-GL), og humant IgG.

Som nevnt ovenfor er det vesentlig at peptidet eller proteinet er bundet til glukoseenheten av antigen D-fragmentet. Binding av proteinet eller peptidet til en hvilken som helst annen del av molekylet vil resultere i et kompleks som fremkaller istedenfor å hemme allergireaksjonen. Kovalent binding kan oppnås ved aktivering av antigen D-fragmentet med et cyanogen-halogenid. Denne metode er beskrevet utførlig av Axen et al, Nature, 214, 1302-1304 (1967) og av Cuatrecasas et al, Proe. Nati. Acad. Sei., US, 61, 636-643 (1968). Cyanogenhalogenidet reagerer med hydroksylgruppen i glukose-gruppene til dannelse av cyanatestere. Reaksjonen skjer hurtigst ved en pH mellom 10 og 12. Cyanatet kan reagere videre med ytterligere hydroksylgrupper til dannelse av et imidokarbonat-mellomprodukt. Det cykliske imidokarbonat som dannes som hovedprodukt efter reaksjonen av cyanogenhalogenidet med glukosedelen er sterkt reaktivt med aminer tii dannelse av N-imidokarbonater, isourinstoffer eller N-karbamater. Den nøyaktige karakter av bindingen mellom proteinet og den cyanogenhalogenid-aktiverte glukoseenhet er ukjent. Uansett den eksakte mekanisme er det ved reaksjonen av cyanogenhalogenidet med antigen D-fragmentet dannede mellomprodukt, sterkt reaktivt med peptider og proteiner tii dannelse av komplekser hvor peptidet eller proteinet er kovalent bundet over glukoseenheten til antigen-D-fragmentet.

Cellobiosefraksjonen av antigen D-fragmentet kan også aktiveres til kobling til proteinet eller peptidet på den måte som er beskrevet i Immunol. 20, 1061 (1971) (referert i Chem. Abstr. 75 86669h):

Når karboksylgruppene i antigen D-fragmentet ble aktivert av Woodwards reagenset K, idet quercetin-glukose-glukose-

deJen forble upåvirket, fremkalte det resulterende kompleks med f.eks. humant serumalbumin antigenfremkait histamin-frigiveisesreaksjoner, hvilket viste seg ved direkte hudprøver. Det er således tydelig at kompleksets evner til å hemme allergireaksjoner avhenger av koblingen av peptidet eller proteinet med antigen D-fragmentet over glukosedelen.

Det er klart at antigen D-fragmentet kan bindes til protein- eller peptidmolekyiet på flere forskjellige steder på sistnevnte. Generelt foretrekkes det å binde fra 2,0

til 30 mol, fortrinnsvis 5-20 mol av antigen D-fragmentet til 1 mol protein eller peptid. Molforholdet kan varieres ved at man varierer det molare mengdeforhold mellom reaktantene under fremstillingen.

De foran beskrevne antigen-proteinkomplekser kan

inkorporeres i et hvilket som helst passende medium for administrering til en aiiergipasient.

Kompleksene fremstilt ved fremgangsmåten ifølge opp-

finnelsen er nyttige til behandling av gressfølsomme pasienter for å nedsette deres allergisymptomer. Kompleksene undertrykker dannelse av allergi-antistoffer mot gresspollenantigener

og virker dessuten til å nøytralisere eksisterende antistoffer i pasientens system.

Noen eksempler tjener til nærmere belysning av fremgangs-

måten ifølge oppfinnelsen.

Eksempel

Fremstilling av antigen D- proteinkompleks

90 mg antigen D^ fragment (molekylvekt ~5000) ble anbragt

i et isbad og pH ble regulert til 10,5 med natriumhydroksyd-

oppløsning. I blandingen ble anbragt en motordrevet rører og 2 g CNBr ble tilsatt. pH ble holdt på 10,5 1 0,25 ved

tilsetning av NaOH i de neste 10 minutter. Derefter ble

tilsatt 15 ml 0,1M NaHC03 buffer (pH 9) inneholdende 0,15M NaCl. Derefter ble 45 mg humant serumalbumin (HSA) tilsatt, og

blandingen ble omrørt ved 4°C i 2 4 timer. Blandingen ble

konsentrert under vakuum og ga et produkt med et forhold

mellom antigen D^ og protein på ca. 5:1. Uomsatt antigen D^

ble fjernet ved dialyse.

Komplekser med antigen og D^ fragmenter og andre

protein- eller peptidbærere kan fremstilles på helt samme

måte.

Forsøk 1

Dette forsøk belyser de hemningsegenskaper overfor

allergireaksjoner som de her omhandlede komplekser er i be-

sittelse av.

Histaminavgivelsen fra apelungevev som er passivt sensi-

bilisert med serum fra allergipasienter ble bestemt i overens-stemmelse med den metode som er beskrevet av Malley et al,

J. Immunol. 100, 915 (1968). De sera som ble brukt til å

sensibilisere apelungevevet var fra en pulje av sera fra

20 timoteifølsomme pasienter med en gjennomsnittlig allergi-

147860 8

antistofftiter på 1:750. Apelungevevet ble derefter inkubert i 2 timer ved 37 C med serumet. Før påvirkningen med allergenet ble det sensibiliserte vev inkubert i 10 minutter ved 37°C

med det hemmende middel. Antigenpåvirkningen ble utført ved inkubering med den optimale konsentrasjon av rå pollen-ekstrakt (WST) i 15 minutter ved 37°C.

Resultatene fremgår av tabell 1, hvor

WST angir en vandig ekstrakt av helt timoteipolien dialysert for å fjerne lavmolekylære fragmenter,

D angir timotei-antigen D-fragmenter med en molekylvekt

på ca. 5000,

angir timotei-antigen D-fragmentet med en molekylvekt på ca. 2 500,

D^ angir timotei-antigen D-fragmentet med en molekylvekt

på under 1000 og inneholdende det ovenfor angitte kompleks hvor T betegner treonin,

HSA angir humant serumalbumin,

dGL angir en d-aminosyrekopolymer med giutaminsyre og lysin og med en molekylvekt på ca. 40.000, og

Rhlg betegner rhesus-IgG.

Som det fremgår av resultatene i tabell 1 er de omhandlede komplekser kraftig virkende inhibitorer for allergireaksjoner.

Forsøk 2

Dette forsøk belyser ytterligere kompleksenes allergi-reaksjons -inhiberingsegenskaper.

Den passive overførings-hudreaktivitet av de omhandlede komplekser sammenlignes her med de antigener som er til stede i timoteipolien såvel som komplekser fremstilt ved koblingen av peptidet eller proteinet til antigenfragmenter over andre deler enn glukosedelen.

0,1 mi sera inneholdende allergi-antistoffer (fra en pulje

av sera fra 20 timoteifølsomme pasienter; gjennomsnittlig P-K-titer på 750) ble injisert intradermalt i huden av en ikke-aliergisk forsøksperson. 48 timer senere ble hvert sted, som på forhånd var sensibilisert med sera, påvirket med forskjellige antigener og komplekser. Allergi-antistoffene i de implanterte sera reagerer med allergent antigenmateriale for å fremkalle en lokalisert allergireaksjon. Hvis det antigene materiale ikke fremkaller allergireaksjoner, vil det ikke bli konstatert noen lokalisert reaksjon.

Resultatene fra forskjellige forsøk med de her beskrevne komplekser såvel som med antigenmaterialet i timoteipolien fremgår av tabell 2.

Resultatene i tabell 2 viser at de omhandlede komplekser ikke bevirker allergireaksjoner. Dessuten bemerkes at de komplekser av antigen D-fragmentene som er koblet med proteinet over andre deler enn glukoseenheten, er kraftige fremkallere av allergireaksjoner, hvilket viser at koblingen via glukosedelen i antigen D-fragmentet er kritisk.

Forsøk 3

Dette forsøk belyser de omhandlede kompleksers evne til å undertrykke dannelse av allergi-antistoffer.

Innledende undersøkelser viste at LAF^-mus utviklet god

IgE (allergi-antistoffer) respons mot timoteipolien.

I dyrene ble det injisert intraperitonealt 10 ug WST i

alun, og 3 uker senere mottok de en annen intraperitoneal injeksjon av 10 |xg WST i alun. Titere av IgE efter den opprinnelige immunisering stiger til titere mellom 1/100 til 1/200, målt ved PCA. IgE-titere stiger efter den annen injeksjon av antigen til verdier mellom 1/600 og 1/800, målt ved PCA.

Passiv kutan anafylakse (PCA) måles ved injeksjon av 0,025 ml serumfortynning i siden på en mus eller rotte. 72 timer (mus) eller 3 timer (rotte) senere, påvirkes dyrene av WST i Evans blått farve injisert intravenøst. Innbyrdes reaksjon mellom det sirkulerende antigen og vevets fikserte IgE resulterer i en lokalisert allergireaksjon, og stedet gjøres synlig av utsivning av det blå farvestoffet i det reagerte område. IgE-titeren defineres som den laveste fortynning som gir positiv PCA-reaksjon.

Muse-IgE i disse dyr fremstilles mot den samme antigene determinant som uttrykt på antigen D-fragmentene.

Komplekser fremstilt ifølge oppfinnelsen som ble valgt for forsøksformål var:

Antigen D^-dGL i(D2_dGL) : en ikke-immunogen kopolymer av

d - glutaminsyre og d-lysin (molekylvekt 40.000) med et gjennom-snitt på 2,8 antigen D2-grupper/mol dGL tilknyttet. Koblingen skjedde ved modifisering av en sukkerenhet med CNBr forut for addisjonen til dGL.

Administrering av D2~dGL ad den intraperitoneale vei og

gitt 3 dager før den annen immunisering av WST.

Resultater: Kontrolldyr som fikk fysiologisk saltoppløsning på dag 18 har følgende IgE titer-600; gjennomsnittlig reaksjon hos 18 dyr.

Dyr behandlet med D2~dGL:

Disse data viser at komplekset reduserer IgE-nivået betydelig når det administreres 3 dager før den sekundære

antigeninjeksjon, hvilket viser nøytralisasjon og undertrykkelse av antistoff. Lignende forsøk har vist at administrering opptil 7 dager før den sekundære antigeninjeksjon vil gi i det vesent-lige de samme resultater.

Claims (5)

1. Analogifremgangsmåte for fremstilling av et multivalent antigen-proteinkompleks egnet til blokkering av allergireaksjoner, som består av minst ett timotei-antigen D-fragment med den antigene determinant-struktur

hvor G betegner glukose og T betegner treonin eller peptid bundet til den viste struktur over et treoninmolekyl, kovalent bundet over minst én glukoseenhet til et peptid eller protein, karakterisert ved at man aktiverer glukosedelen i antigen D-fragmentet med formel I ved omsetning med et aktiveringsmiddel, særlig et cyanohalogenid, og omsetter det således dannede mellomprodukt med et peptid eller protein.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det som protein eller peptid anvendes humant serumalbumin, d-aminosyrekopolymer av lysin og glutaminsyre eller humant IgG.

3. Fremgangsmåte ifølge et av kravene 1 og 2, karakterisert ved at Ti den generelle formel I betyr treonin.

4. Fremgangsmåte ifølge et av kravene 1 og 2, karakterisert ved at Ti den generelle formel I betyr et slikt treoninholdig peptid at fragmentets molekylvekt er ca. 5000.

5. Fremgangsmåte ifølge et av kravene 1 og 2, karakterisert ved at Ti den generelle formel I betyr et slikt treoninholdig peptid at fragmentets molekylvekt er ca. 2500.