NO150242B - Analogifremgangsmaate for fremstilling av terapeutisk aktive 2-beta-d-ribofuranosyltiazol-4-karboksamid-estere - Google Patents

Description

Bekjempelse av ondartede tumorer i mennesker og dyr

er fortsatt et mål som ikke er nådd. I løpet av de siste tiår har forståelsen av ondartede tumorer gjort betydelige fremskritt, men det er hittil ikke lykkes å bekjempe den ondartede sykdomstilstand.

Vanlig behandling av både mennesker og andre verdifulle dyrearter som er angrepet av ondartede tumorer, omfatter for tiden kirurgisk fjernelse av tumoren, lokal strålebehandling av det angrepne dyr, og kjemoterapi ved administrering av et kjemoterapeutisk middel til dyret. Det forhold at et betydelig antall av pasienter som er angrepet av ondartede tumorer dør, skyldes ikke den primære tumor, men isteden metastaser av den primære tumor til sekundære steder i kroppen. Hvis en primær tumor påvises tidlig, kan den normalt fjernes

ved kirurgi, strålebehandling eller kjemoterapi eller kombinasjoner av disse. Metastase-koloniene av disse primære tumorer er imidlertid meget vanskeligere å påvise og fjerne,

og en lite vellykket behandling av dem er fortsatt et alvorlig medisinsk problem.

Tumorer er normalt klassifisert enten som godartede eller ondartede. En ondartet tumor adskiller seg fra den godartede ved sin evne til å trenge inn i både omgivende vev og kolonisere fjerntliggende steder via metastase. Visse organer er mer utsatt for metastase enn andre. Denne gruppe omfatter lungen, hjernen, leveren, eggstokkene og adrenal-kjertlene. Det er videre antydet at både kirurgi og bestråling av en primær tumor i virkeligheten fremmer metastase.

Fordi den nuværende cancer-behandling ikke er i stand til

å gi noen vellykket behandling av ondartede tumorer og metastase derav, er det klart at det foreligger et behov for ytterligere kjemoterapeutiske midler.

I en artikkel med tittelen Synthesis and Antiviral

Activity of Certain Thiazole C-Nucleosides, J. Med. Chem. 1977, vol. 20, No. 2, 256, har oppfinneren og hans medarbeidere beskrevet syntese av og en viss preliminær in vitro antiviral aktivitet av forbindelsene 2-0-D-ribofuranosyltiazol-4-karboksamid og 2-(2,3,5-tri-O-acetyl-Ø-D-ribofuranosyl)-tiazol-4-karboksamid i et in vitro testsystem under anvendelse av tre typer virus, type 1 herpes simplex virus, type 3 parainfluenza-virus og type 3 rhinovirus. In vitro aktiviteten for forbindelsen 2-0-D-ribofuranosyltiazol-4-karboksamid mot disse tre viruser var bare moderat. Med forbindelsen 2-(2,3,5-tri-O-acetyl-Ø-D-ribofuranosyl)tiazol-4-karboksamid ble bare moderat aktivitet oppnådd med type 1 herpes simplex virus, mens aktiviteten var negativ med type 3 parainfluenza virus og type 13 rhinovirus. Mens en viss marginal in vitro antiviral aktivitet ble funnet slik som det fremgår av det ovenstående, var derimot in vivo antiviral aktivitet for både 2-0-D-ribof uranosyltiazol-4-karboksamid og 2- (2 , 3 ,5-tri-O-acetyl-ø-D-ribofuranosyl)tiazol-4-karboksamid, som bedømt

ved antall døde forsøksdyr, negativ. Ved in vivo undersøkelsene var antall dødsfall for forsøksdyrene for både 2-0-D-ribofuranosyltiazol-4-karboksamid og 2-(2,3,5-tri-O-acetyl-Ø-D-ribofuranosyl)tiazol-4-karboksamid lik eller oversteg antall dødsfall med placebo kontrolldyrene, hvilket viser at begge forbindelsene 2-0-D-ribofuranosyltiazol-4-karboksamid og 2-(2,3,5-tri-O-acetyl-Ø-D-ribofuranosyl)tiazol-4-karboksamid ikke oppviser noen nyttig in vivo antiviral aktivitet.

Med hensyn til den ovennevnte in vitro antivirale under-søkelse av både 2-0-D-ribofuranosyltiazol-4-karboksamid og 2-(2,3,5-tri-O-acetyl-Ø-D-ribofuranosyl)tiazol-4-karboksamid, ble disse forbindelser undersøkt mot virus som den kjente antivirale forbindelse RIBAVIRIN har en positiv antiviral aktivitet mot. På grunnlag av den preliminære marginale in vitro aktivitet av 2-0-D-ribofuranosyltiazol-4-karboksamid mot disse forsøksvirus, ble det antatt at aktivitetsspekteret for 2-ø-D-ribofuranosyltiazol-4-karboksamid ville være lik aktivitetsspekteret for forbindelsen RIBAVIRIN<®>. RIBAVIRIN<®> er kjent for å være et aktivt in vitro antiviralt middel og også in vivo antiviralt, og er dessuten kjent for ikke å oppvise noen vesentlig antitumor-aktivitet. Dessuten er visse derivater av RIBAVIRIN så som dens 5<1->monofosfat, også .kjent for å være inaktivt.som antitumor-forbindeIser. Det var rimelig å anta, ved sammenligning med den preliminære in vitro antivirale aktivitet av 2-D-ribo.furanosyltiazol-4-karboksamid med aktiviteten for RIBAVIRIN", at 2-0-D-ribofuranosyltiazo1-4-karboksamid ville oppvise positiv in vivo antiviral aktivitet og negativ antitumor-aktivitet i likhet med RIBAVIRIN ®. I motsetning til dette hadde forbindelsen 2-0-D-ribofuranosyltiazol-4-karboksamid ingen nyttig in vivo antiviral aktivitet og er uventet funnet å ha en positiv antitumor-aktivitet.

Det er funnet at visse estere av forbindelsen 2-3-D-ribofuranosyltiazol-4-karboksamid innbefattet 2-(5-0-fosforyl-Ø-D-ribofuranosyl)tiazol-4-karboksamid oppviser antitumor-aktiviteter av slik betydning at de er nyttige som antitumor-midler in vivo.

Visse estere av 2-3-D-ribofuranosyltiazol-4-karboksamid

er vist å oppvise betydelig antitumor-aktivitet in vivo. Foreliggende oppfinnelse angår fremstilling av disse forbindelser som kan anvendes til behandling av ondartede tumorer i varmblodige dyr. Antitumor-egenskåpene for 2-/3-D-ribofuranosyltiazol-4-karboksamid-estere utnyttes ved at det til et varmblodig dyr administreres en effektiv mengde av et farmasøytisk preparat inneholdende den aktive forbindelse i en mengde på minst ca. 0,1 vekt%, basert på preparatets totale vekt.

De nye forbindelser som fremstilles ifølge oppfinnelsen, har formelen: hvor R., er lavere alkanoyl eller

og fysiologisk godtagbare salter derav.

Spesielt foretrukne alkanoylgrupper som betydning for , er acetyl, propionyl, butyryl og isobutyryl.

Spesielt viktige som godtagbare salter er alkalimetall- og ammonium- og substituerte ammoniumsalter, så som natrium-, kalium- og ammoniumsalter.

For anvendelse i farmasøytiske preparater anvendes et farmasøytisk bæremiddel av en slik karakter at det tillater administrering av en passende konsentrasjon av de aktive forbindelser fremstilt ifølge oppfinnelsen som oppløsninger eller suspensjoner ved injeksjon til et varmblodig dyr som skal behandles. Avhengig av dyret som har den ondartede tumor, tumortypen og tumorstedet, vil administrering ved injeksjon skje intravenøst, intramuskulært, intracerebralt, subkutant eller intraperitonealt.

Alternativt kan preparatet hensiktsmessig tilberedes

i passende farmasøytiske bæremidler som tillater administrering via andre veier så som oral administrering, oftal administrering, lokal administrering eller administrering med stikkpiller.

Utgangsforbindelsen som anvendes ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, forbindelse 1, 2-0-D-ribofuranosyltioazol-4-karboksamid, fremstilles fortrinnsvis som beskrevet i eksempel 1. En alternativ syntese av denne forbindelse er beskrevet i J. Org. Chem., vol. 41, nr. 26, 1976, 4074.

Visse estere av 2-0-D-ribofuranosyltiazol-4-karboksamid, forbindelse 1, så som 2-(5-0-fosforyl-Ø-D-ribofuranosyl)-tiazol-4-karboksamid, forbindelse 2, fremstilles som beskrevet i eksempel 2. Andre estere, så som monoesteren 2-(5-0-acetyl-Ø-D-ribofuranosyl)tiazol-4-karboksamid, forbindelse 3, kan fremstilles ved syntesen beskrevet i eksempel 3. For andre foretrukne karboksylsyreestere kan eddiksyreanhydrid utskiftes med et passende anhydrid så som propionsyreanhydrid eller smørsyreanhydrid.

Alternativt kan det passende syreklorid anvendes istedenfor syreanhydridet.

Alkanoylgruppene kan velges fra syrer så som eddiksyre, propionsyre, n-smørsyre, isosmørsyre, valeriansyre, kapronsyre, enantinsyre og kaprylsyre. Hvis en fosforylgruppe velges, kan fosforyl-esteren være i form av en fri syre eller som en salt-form. Godtagbare salter av fosfat-delen av fosforylesteren kan velges fra gruppen bestående av alkali- og jordalkalisalter, f.eks. av natrium, kalium, kalsium, magnesium, litium, ammonium og substituert ammonium, trialkylammonium, dialkylammonium, alkyl-ammonium, f.eks. trietylammonium, trimetylammonium, dietyl-ammonium, oktylammonium, cetyltrimetylammonium og cetyl-pyridinium.

Som foretrukne estere fremstilt ifølge oppfinnelsen kan nevnes forbindelsene 2 og 3. Når fosforylestere fremstilles, dannes fosfatgruppene fortrinnsvis som et salt, særlig som et natriumsalt eller et annet alkalimetallsalt eller ammoniumsalt.

Esterformer av forbindelse 1, som vist i eksemplene, er nyttige for å tilføre forbindelsen til det angrepne sted hos en pasient. Selv om vi her ikke skal begrense oss til noen teori, er det mulig at hvis fosforylesteren av forbindelse 1, 5'-fosfatet, anvendes, er det mulig at enzymer som er til stede in vivo spalter fosfatet enzymatisk for å tilføre in situ forbindelse 1. Forbindelse 2, fosforylesteren av forbindelse 1, er som vist i eksemplene, funnet å være et effektivt anti-tumormiddel ved injeksjon i en pasient. På det nuværende tids-punkt er det ikke klart hvorvidt aktiviteten er i form av 5'-fosfatet eller hvorvidt dette spaltes enzymatisk til forbindelse 1. Videre er det mulig at forbindelse 1 kan dannes in situ ved andre enzymatiske reaksjoner til forbindelse 2.

Ved fremstilling av et passende preparat blandes en ønsket ester med formel I med et egnet farmasøytisk bæremiddel som kan være så enkelt som sterilisert vann, eller det kan være et sammensatt bæremiddel som inneholder passende midler for på passende måte å efterligne visse viologiske omgivelser, dvs.

pH- og salt-justert oppløsning som er egnet for intravenøs, intramuskulær eller andre injeksjoner.

Ved valg av et egnet farmasøytisk bæremiddel må man ta hensyn til tumortypen, tumorens lokalisering og helsetilstand og alder hos pasienten. Dessuten må man også ta hensyn til

den kjemiske reaktivitet av esteren. Således vil en karboksyl-syreester fortrinnsvis suspenderes eller oppløses i et passende ikke-surt medium. En fosforylester kan hensiktsmessig anvendes i nærvær av en egnet buffer eller som et salt som nevnt ovenfor.

Fortrinnsvis blandes forbindelsene fremstilt ifølge oppfinnelsen med et passende farmasøytisk bæremiddel slik at forbindelsen fortrinnsvis oppløses i bæremidlet. Alternativt kan man anvende suspensjoner, emulsjoner eller andre former for forbindelsene fremstilt ifølge oppfinnelsen. Det farmasøytiske bæremiddel kan i tillegg til å inneholde et solubiliserende eller suspenderende middel, også inneholde passende fortynnings-midler, buffere, overflateaktive midler og andre lignende midler som typisk anvendes i farmasøytiske bæremidler. Den totale sammensetning av det farmasøytiske bæremiddel vil imidlertid velges slik at det passer med det sted hvor virkningen skal.utøves, konsentrasjonen av den aktive bestanddel og andre parametre i henhold til standard farmasøytisk praksis.

Forbindelsene fremstilt ifølge oppfinnelsen blandes hensiktsmessig med det farmasøytiske bæremiddel slik at de er til stede i en konsentrasjon på minst 0,1 vekt% av det totale preparat. Fortrinnsvis er de til stede i det farmasøytiske bæremiddel i en konsentrasjon på ca. 10 til ca. 90 vekt% av det totale preparat.

Effektive mengder av forbindelsene fremstilt ifølge oppfinnelsen varierer typisk fra ca. 2,5 mg pr. kg total kropps-vekt hos det varmblodige dyr som skal behandles, til ca.

200 mg/kg pr. dag. Det foretrukne område er fra 12,5 mg/kg til ca. 100 mg/kg. Et enda mer foretrukket område er fra ca. 15 mg/kg til ca. 50 mg/kg. Som tilfellet er med de andre

faktorer nevnt ovenfor, er mengden av forbindelsen som anvendes for behandling av et angrepet dyr, avhengig av slike parametere som tumortype, tumorsted, den form forbindelsen administreres i, og pasientens fysikalske størrelse og tilstand. I ethvert til-felle må den anvendte mengde være tilstrekkelig til å tilveie-bringe en terapeutisk effektiv mengde av midlet til pasienten

•i et passende volum, hvilket lett kan fastslås av fagfolk på

grunnlag av det som her er angitt.

I eksempel 4 som er tatt med som en illustrasjon nedenfor, ble et dyr med tumor behandlet en gang daglig med den angitte prøveforbindelse. Avhengig av den kliniske situasjon kan den daglige dose av de andre forbindelser fremstilt ifølge oppfinnelsen administreres på lignende måte, men de daglige doser kan også brytes opp i mindre doser som sammenlagt er lik den daglige dose. Således kan f.eks. en pasient som skal behandles med 50 mg/kg passende behandles 4 ganger daglig med doser på 12,5 mg/kg.

Et preparat som anvendes for å hemme ondartede tumorer i varmblodige dyr, kan hensiktsmessig fremstilles ved at forbindelsene fremstilt ifølge oppfinnelsen settes til et farmakologisk forlikelig oppløsningsmiddel fulgt av sterilisering og innføring i passende ampuller som kan forsegles, i en kjent konsentrasjon. Passende doser av forbindelsen tas derefter fra ampullen og administreres ved injisering i pasienten.

Eksempel 1

2- 0- D- ribofuranosyltiazol- 4- karboksamid, forbindelse 1

(utgangsmateriale)

Det ble anvendt etyl-2-(2,3,5-tri-0-benzoyl-0-D-ribofuranosyl)-tiazol-4-karboksamid som fremstilt i Srivastova et al, J. Med. Chem. 1977, vol. 20, nr. 2, 256. En konsentrert oppløsning

av etyl-2-(2,3,5-tri-O-benzyl-Ø-D-ribofuranosyl)tiazol-4-karboksamid (5,0 g, 8,31 mmol) i metanol (15 ml) ble omrørt med metanolisk ammoniakk (mettet ved 0°C, 100 ml) i et trykkar ved romtemperatur i 2 dager. Oppløsningsmidlet ble avdampes, og residuet ble kromatografert gjennom en kolonne (2,4 x 35 cm) av silikagel (100 g) pakket i etylacetat. Eluering av kolonnen med et oppløsningsmiddelsystem (etylacetat-l-propanol-vann, 4:1:2, volum/volum; topplag) fjernet det hurtigvandrende metyl-benzoat og bnezamid. De langsomtvandrende, UV- og sukker-positive hovedfraksjoner ble oppsamlet, og oppløsningsmidlet ble avdampet i vakuum. Det således oppnådde residuum (sirup)

ble lett omkrystallisert fra etanol-etylacetat for å gi 1,6 g (74%) rent produkt, forbindelse 1: sm.p. 144-145°C,

[a]<25>p- 14,3° (c, 1, DMF); UV Amaks PH 1 237 nm ( 8640);

UV ^maks<PH><11> 238 nm ( 8100);

<1>H NMR (Me2SO-d6) 6 7,5-7,8 [S (br), 2, C0NH2],

"4 NMR (Me2SO-d6-D20) 6 4,99 (d, 1, J = 5 Hz, E±), 8,25 (s, 1, H5). Analyse (C<gH>12N2<0>5<S>) C, H, N, S.

Eksempel 2

2-( 5- 0- fosforyl- ø- D- ribofuranosyl) tiazol- 4- karboksamid ( 2- g- D- ribofuranosyltiazol- 4- karb oksamid- 5'-f osfat),

forbindelse 2

Vann (151 mg, 8,4 mmol) ble satt forsiktig til en opp-løsning (som ble holdt ved 0°C under omrøring) av nydestillert fosforylklorid (2,0 g, 13,2 mmol), pyridin (1,21 g, 14,4 mmol)

og acetonitril (2,3 g, 56,7 mmol). 2-6-D-ribofuranosyltiazol-4-kar boks amid, forbindelse 1 (tørret over P-jO^- og pulverisert,

800 mg, 3,0 mmol), ble satt til oppløsningen, og reaksjonsblandingen ble omrørt kontinuerlig i 4 timer ved 0°C. Reaksjonsblandingen ble hellet i isvann (ca. 50 ml), og pH ble regulert til 2,0 med 2N natriumhydroksyd. Oppløsningen ble satt til en kolonne av aktivt kull (20 g), og kolonnen ble vasket omhyggelig med vann inntil eluatet var saltfritt. Kolonnen ble eluert med en oppløsning av etanol-vann-konsentrert ammoniumhydroksyd (10:10:1) og fraksjonene (25 ml hver) ble oppsamlet.

Fraksjonene som inneholdt rent (TLC, silikagel, acetonitril-

0,1N ammoniumklorid (7:3)) nukleotid, forbindelse 2, ble oppsamlet og inndampet til tørrhet under vakuum. Det vannfrie residuum ble oppløst i vann og ført gjennom en kolonne av Dowex 50W-X8 (20-50 mesh, H+<->form, 15 ml). Kolonnen ble

vasket med vann, og fraksjonen inneholdende nukleotidet ble oppsamlet. Oppløsningen ble konsentrert til et lite volum (5 ml) og ført gjennom en kolonne av Dowex 50W-X8 (20-50 mesh, Na<+->form, 15 ml). Kolonnen ble vasket med vann. Fraksjonen inneholdende nukleotidet ble lyofilisert. Residuet ble utgnidd med etanol, oppsamlet ved filtrering og tørret (P2°5^ for ^ gi 560 mg (47%) av forbindelse 2 som mononatriumdihydrat i krystallinsk form.

Analyse beregnet for CgH^l^OgPSNa-2H20:

C 27,13 H 4,04 N 7,04 P 7,78 S 8,05

Funnet:

C 27,42 H 3,87 N 7,07 P 8,03 S 8,41.

Eksempel 3

2-( 4- 0- acetyl- ff- D- ribofuranosyl)t iazol- 4- karboksamid forbindelse 3

En oppløsning av 2-(2,3-0-isopropyliden-Ø-D-ribofuranosyl)-tiazol-4-karboksamid (1,5 g, 5 mmol) (fremstilt ifølge Fuertes et al, J. Org. Chem., vol. 41, nr. 26, 1976, 4074) i vannfri pyridin (20 ml) ble avkjølt i et is-vannbad og eddiksyreanhydrid (2,5 ml) ble tilsatt langsomt under omrøring. Reaksjonsoppløsningen fikk oppvarmes til romtemperatur, og omrøring ble fortsatt i 15 timer. Oppløsningsmidlet ble avdampet i vakuum, og residuet ble oppløst i etylacetat og vasket med vann. Etylacetatdelen ble inndampet i vakuum, og residuet ble oppløst i 80% eddiksyre (25 ml). Oppløsningen ble oppvarmet på dampbad i 30 minutter, og oppløsningsmidlet ble fjernet i vakuum. Residuet ble oppløst i etylacetat, vasket en gang med vann og tørret over MgSO^. Etylacetatdelen ble inndampet, og råproduktet ble ført gjennom en kolonne av silikagel (100 g, pakket i kloroform) og eluert med 20% (volum/volum) etylacetat i kloroform. De nukleosid-holdige fraksjoner ble samlet og" inndampet for å gi 1,05 g (70%) av forbindelse <3> (Cn,Hn .N_0,S).

11 14 l. o

Som illustrerende eksempel på anvendelsen av forbindelsene fremstilt ifølge oppfinnelsen, er eksempel 4 gitt nedenfor. I dette eksempel illustreres effektiviteten av forbindelsene under anvendelse av standard prøver mot visse ondartede tumorer. Prøvene som ble anvendt i dette eksempel, ble utført av Developmental Therapeutics Program, Division of Cancer Treatment, National Cancer Institute. Forsøkene ble overvåket av denne institusjon under anvendelse av deres standard protokoller og prosedyrer. Alle forsøk var i overensstemmelse med disse protokoller, og alle forsøk ble bedømt i henhold til de kriterier som er definert i disse protokoller. Det følgende representative eksempel illustrerer aktiviteten av forbindelsen fremstilt ifølge oppfinnelsen mot prøve-tumorsystemer fra National Cancer Institute.

I det følgende eksempel betyr forkortelsen IP intra-peritoneal. Middel- og median-overlevelsestid er beregnet ifølge Instruction 14 (revidert 6/78) fra Screening Data Summary, Developmental Therapeutics Program, Division of

Cancer Treatment, National Cancer Institute.

I det nedenstående eksempel ble bæremidlet som ble

anvendt for den aktive bestanddel injisert (uten aktiv bestanddel) i kontrolldyrene i samme mengde som mengden av bæremiddel som ble injisert i dyrene som også fikk den aktive bestanddel, for å eliminere en eventuell virkning av bæremidlet på forsøkene.

Eksempel 4

Forbindelse 2, 2- (5-0-fosforyl-3-D-ribofuranosyl)-tiazol-4-karboksamid vises å være aktiv mot L-1210 lyfmoid leukemi i eksempel 4a og 4b. Dosemengdene av prøveforbindelsen er som angitt i tabell Ia og Ib nedenfor for henholdsvis eksempel 4a og 4b. I disse eksempler ble 36 kontrolldyr anvendt, og 6 forsøksdyr for hver av de dosemengder som er angitt i tabellene Ia og Ib. Saltvann ble anvendt som bæremiddel for prøveforbindelsen. Ingen toksisitet av prøveforbindelsen ble funnet i forsøksdyrene i eksemplene 4a og 4b. Ingen forsøks-dyr overlevde utover dag 10 i eksempel 4a, med en midlere dødsdag på da 8,3, og utover dag 11 i eksempel 4b med en midlere dødsdag på dag 10,1.

For både kontrollgruppene og prøveforbindelse-gruppene,

ble tumorer fremkalt ved IP innpodning av tumorceller på dag 0, fulgt av igangsettelse av prøveforbindelse-behandling på dag 1, hvor forbindelse 2 ble gitt en gang daglig i 5 dager. Forsøks-resultatene er uttrykt som T/C (behandlet/kontroll).

Claims (2)

1. <1-> Analoaif remcrangsmåte for fremstillinq av en terapeutisk aktiv forbindelse med formelen hvor R-. er lavere alkanoyl eller karakterisert ved at forbindelsen 2-3-D-ribofuranosyltiazol-4-karboksamid i nærvær av en base omsettes med et acylanhydrid eller acylklorid svarende til R^, fortrinnsvis et karboksylsyreanhydrid eller fosforsyre-anhydrid eller et karboksylsyreklorid eller fosforsyreklorid.
2. 2. Fremgangsmåte ifølge krav 1 for fremstilling av 2-(5-0-fosforyl-Ø-D-ribofuranosyl)-tiazol-4-karboksamid, karakterisert ved at 2-3-D-ribofuranosyltiazol-4-karboksamid i nærvær av en base omsettes med fosforylklorid i et polart oppløsningsmiddel, reaksjonsblandingen behandles med vann, og produktet isoleres, fortrinnsvis ved avsaltning av reaksjonsblandingen med aktivt kull og eluering av produktet fra kullet.