NO155100B

NO155100B - Analogifremgangsmaate ved fremstilling av nye angiotensin-ii antagoniserende octapeptidestere inneholdende en aminosyreestergruppe i 8-stilling.

Info

Publication number: NO155100B
Application number: NO810150A
Authority: NO
Inventors: Olga Nyeki; Lajos Kisfaludy; Egon Karpati; Laszlo Szporny
Original assignee: Richter Gedeon Vegyeszet
Priority date: 1980-01-18
Filing date: 1981-01-16
Publication date: 1986-11-03
Also published as: PL229244A1; DD156968A5; FI72732C; CS217987B2; FI810122L; HU181009B; AU541526B2; NO155100C; IL61923A; PL126240B1; PH16791A; CA1156222A; DE3170906D1; US4388304A; YU9281A; NO810150L; ATE13740T1; AU6627781A; FI72732B; EP0034259B1

Description

Foreliggende oppfinnelse angår en analogifremgangsmåte for fremstilling av terapeutisk aktive octapeptidestere av generell formel I

X - Arg - Val - Tyr - Ile - His - Pro - Y - OA (I)

hvori

X betegner en acylgruppe av en a-N-methylaminoalkansyre med 1-4 C-atomer, i særdeleshet sarcosylgruppen, eller av en alifatisk carboxylsyre med 1-4 C-atomer inneholdende i a-stilling en aminooxy- eller hydroxylgruppe,

Y betegner resten av aminosyrene isoleucin, alanin og eventuelt methylsubstituert threonin,

A betegner en alkylgruppe med 1-5 carbonatomer, såvel som syreaddisjonssalter og farmasøytisk anvendbare komplekser av disse peptidestere.

Den første angiotensin-II-analog som viste seg å være en spesifikk konkurrerende inhibitor til angiotensin-

II både under in vivo og in vitro betingelser, ble beskrevet

i 1970 [vgl.: G.R. Marshal og medarb., Proe. Nat. Acad. Sei, USA, 67, 1624 (1970), P.A. Khairallah og medarb., J.Med.

Chem. 13, 181 (1970)] .

Denne erkjennelse ga støtet til et omfattende forskingsarbeide med henblikk på en produksjon av angiotensin-ll-analoger med antagoniserende virkning som ville kunne anvendes for diagnose av visse uremi-avhengige hypertensjoner, og eventuelt også ved behandling av slike tilstander

[Sar ■I , Ala Q]-angiotensin-II, en av de mange analoger med antagoniserende effekt fremstilt hittil, er allerede kommet på markedet under varemerket "Saralasin" [D. T. Pals og medarb.: Circ. Res. 29, 673 (1971)]. Kliniske tester utført med denne forbindelse viste at forbindelsen er anvendbar for diagnose av hypertensjoner av forskjellig opprinnel-

se [G. Bonner og medarb.: Dtsch. Med. Wschr. 104, 422 (1979)] såvel som ved behandling av slike betingelser [J. L. Marx: Science 194, 821 (1976)]. Mer nylig ble det også funnet at forbindelser med angiotensin-II-antagonisterende effekt kan anvendes ved behandling av hjerteinsuffisiens forårsaket av renovasculær hypertensjon [H. Gavras og medarb.: JAMA 238,

880 (1977)].

Undersøkelser over sammenhengen mellom strukturen og den biologiske virkning av de hittil fremstilte angiotensin-II-analoger har ført til nyttig informasjon når det gjelder klarlegging av den agoniserendeog antagoniserende virkning. Hovedmålet ved senere tids forsøksarbeide er å produsere antagonistiske substanser med.forlengede biologiske halogeneringstider, som er fri for visse uønskede bivirkninger slik som agonistiske begynnelsesvirkninger.

Det er nå funnet at man kan fremstille virksomme konkurrerende inhibitorer til angiotensin-II når fenylalanin i angiotensin-II-molekylets 8-stilling erstattes med en alifatisk aminosyre, og en N-methyl-aminosyre eller en a-hydroxy- hhv. a-aminooxycarboxylsyre innbygges i molekylets 1-stilling og er molekylets endecarboxylgruppe, forestres med en alkylgruppe med 1-5 carbonatomer. De derved erholdte konkurrerende angiotensin-II-inhibitorer nedsetter i betydelig grad hypertension fremkalt av angiotensin-II

og kan utøve denne virkning også ved subcutan administrering.

Analogifremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er således kjennetegnet ved at man fra et beskyttet octapeptidesterderivat av generell formel II

hvori

B er én gruppe som er fjernbar ved acidolyse eller katalytisk hydrogenolyse, i særdeleshet en benzyloxycarbonyl-eller tertiær butyloxycarbonylgruppe,

C er en egnet beskyttelsesgruppe for temporær beskyttelse av guanidinogruppen av Arg-delen, i særdeleshet en nitro- eller tosylgruppe,

D er en egnet beskyttelsesgruppe for temporær beskyttelse av den aromatiske hydroxylgruppe av Tyr-delen, i særdeleshet en benzylgruppe eller en substituert benzylgruppe,

E er en egnet beskyttelsesgruppe for temporær beskyttelse av imidazolgruppen av His-delen, spesielt en dinitrofenylgruppe, og

A, X og Y er de i generell formel I angitte betydninger, selektivt trinnvis eller i et enkelttrinn fjerner beskyttelsesgruppene, og om ønsket at de erholdte forbindelser av generell formel I overføres i deres addisjonssaltér eller i et farmasøytisk anvendbart kompieksderivat.

Octapeptidderivatet av generell formel II som kan anvendes som utgangsmateriale ved den beskrevne fremgangsmåte, kan fremstilles ved en hvilken som helst metode kjenti peptidkjemlen, for eksempel som beskrevet i ungarsk patent-skrift 168 431, ved acylering av den tilsvarende aminosyre-ester med pentafluorfenylesteren av aminosyre henholdsvis peptider, hvor den N-terminale aminogruppe er beskyttet. For beskyttelse av de sidefunksjonelle grupper skal det anvendes slike beskyttelsesgrupper som er stabile under betingelsene anvendt ved acidolysen for fjerning av N-beskyttelsesgruppen etter acyleringen.

Ifølge en fordelaktig utførelsesform av denne

metode bygges de beskyttede octapeptidderivater av generell formel II trinnvis fra de enkelte aminosyrer. Man kan også gå frem ved at et allerede fremstilt, tilsvarende beskyttet delpeptid acyleres med et annet, eventuelt allerede fremstilt delpeptid. Denne fremgangsmåte kan eksempelvis med

fordel anvendes for fremstilling av peptider inneholdende en a-aminooxysyregruppe i 1-stilling. For temporær beskyttelse av aminogruppene av de enkelte aminosyrer henholsvis amino-syrederivater skal i begge frengangsmåter anvendes slike beskyttelsesgrupper som lett kan fjernes ved asidolyse, i særdeleshet er den tertiære butoxycarbonylgruppe egnet for slike formål.

Etter endt syntese av den beskyttede octapeptidester av generell formel II avspaltes beskyttelsesgruppene fra denne beskyttede octanpeptidester. Derved går man hensiktsmessig frem ved at man først avspalter dinitrofenyl-beskyttelsesgruppen for His ved thiolyse, og hensiktsmessig ved behandling med 2-mercaptoethanol, mens de øvrige til-stedeværende beskyttelsesgrupper hensiktsmessig kan fjernes i ett trinn, og således ved acidolyse, hensiktsmessig med hydrogenfluorid, eller ved katalytisk hydrogenolyse, f.eks. under anvendelse av palladium-aktiv carbon som katalysator.

Når man skal fremstille forbindelser av generell formel I hvori X er en alifatisk acylgruppe inneholdende en a-aminooxygruppe, kan beskyttelsesgruppene i den tilsvarende beskyttede octatidester av generell formel II bare fjernes ved acidolyse, eksempelvis ved behandling av den beskyttede octapeptidester hvorfra dinitrofenylgruppen er fjernet, med hydrogenfluorid, da en katalytisk hydrering samtidig ville føre til en avspaltning av aminogruppen i a-aminooxyacylgruppen i X-stilling, og således en overføring til den tilsvarende a-hydroxyacylrest. Derimot kan forbindelser av generell formel I inneholdende en alifatisk a-hydroxyacylrest fremstilles fra de tilsvarende beskyttede octapeptidestere av generell formel I men som i X-stilling inneholder en a-aminooxyacylrest, hvorved beskyttelsesgruppen kan fjernes ved katalytisk hydrering under samtidig avspaltning av aminogruppen fra X.

De nye forbindelser av generell formel I kan renses etter kjente metoder, f.eks. ved ionebytterkromatografi på carboxymethylcellulose. Produktene fremstilles hensiktsmessig i form av lyofiliserte pulvere, som er meget godt egnet for fremstilling av forskjellige legemidler.

Den antagonistiske virkning av produktet ble under-søkt på narkotiserte hannkatter. Ved undersøkelsen ble hals-vagusnerven på begge sider gjennomskåret og etter blokkering av ganglion ble dyrene behandlet med "hypertensin" ved infusjon med en hastighet på 0,5 yg/kg/min. Etter at det for-høyede blodtrykk hadde stabilisert seg, ble de forbindelser som skulle testes, administrert enten intravenøst eller sub-cutant i fysiologisk saltvannoppløsning eller i løsning inneholdende en bærer. Blodtrykksfallet ble målt i mmHg, og nedsettelsesgraden ble uttrykt i prosent i forhold til verdien før behandling. Den statistiske bestemmelse ble utført på basis av blodtrykksforskjellene, ved Student's "t" testen. Som virkningsvarighet ble betraktet den periode som forløp inntil observasjonen av den siste, fremdeles signifikante

(p = 5 %) blodtrykksforskjell. De erholdte forsøksresulta-ter er oppført i etterfølgende tabell. Som sammenlignings-forbindelse ved disse forsøk ble anvendt det kjente'og som angiotensin-II-antagonistiske midler innen terapien allerede anvendte "Saralasin" (Sar -i ,Ala Q)-Angiotensin-II. De erholdte resultater med Saralasin under de samme betingelser er angitt i tabellen.

Fra data angitt i tabellen fremgår det. at

de nye forbindelser av generell formel I har betydelig blodtrykksenkende virkning, hvilket er et tegn på at lad-ningen av den C-terminale carboxylgruppe ikke er noen nød-vendig betingelse for denne virkning. Graden av denne virkning er også betydelig ved subcutan administrering av disse forbindelser, og med løsninger inneholdende bærere ble det i flere tilfeller nådd virkningsvarighet på flere timer.

De fremstilte nye peptider av generell formel I

kan om ønsket etter kjente metoder overføres i terapeutisk anvendbare syreaddisjonssalter henholdsvis komplekser. Blant terapeutisk anvendbare komplekser skal forstås slike forbindelser av peptidet som ved tilsetning av visse organiske eller uorganiske forbindelser til peptidet fører til en forlenget virkning av det aktive virkestoff. Som eksempel på egnede organiske forbindelser for dette formål kan nevnes gelatin, carboxymethylcellulose, alginsyreester, polyfloretin-fosfater, aminosyre-polymerer og -copolymerer, og som uorganiske forbindelser kan eksempelvis anvendes hydroxyder henholdsvis tungtløselige salter, f.eks. fosfater av visse metaller, i særdeleshet zink.

De nye peptider, såvel som deres syreaddisjonssalter og komplekser kan anvendes innen terapien i form av konvensjonelle farmasøytiske preparater. Disse preparater inneholder de nye forbindelser ifølge oppfinnelsen i blanding med en organisk eller uorganisk bærer som er anvendbar for parenteral eller enteral administrering. Disse preparater kan fremstilles i form av faste lyofilisater hvilke som bærere inneholder faste materialer som er farmasøytisk anvendbare og som ikke reagerer med peptidet, f.eks. carbohydrater, og envidere konsentrerte eller fortynnede suspensjoner og emulsjoner som også kan inneholde forskjellige konserverings-midler og stabiliseringsmidler. De farmasøytiske preparater anvendes for å diagnostisere og differensiere hypertensjoner av forskjellig opprinnelse, og kan anvendes innen terapien til å undertrykke hypertensjoner av renal opprinnelse, behandling av hypertensive kriser og ved behandling av sekundær hjertesvikt.

De farmasøytiske preparater; foreligger fortrinnsvis i form av injeksjonsløsninger inneholdende 1-10 mg aktiv bestanddel. Den daglige dose av de nye forbindelser utgjør for voksne pasienter 1 - 10 mg. Denne mengde admi-nistreres fortrinnsvis én gang daglig i form av en intra-venøs, subcutan eller intramuskulær injeksjon, eller som en langsom intravenøs infusjon.

Oppfinnelsen belyses i de etterfølgende eksempler. De forkortelser som anvendes i eksemplene tilsvarer den som generelt anvendes i litteraturen [vgl. J. Biol. Chem. 24 7, 977 (1972)]. Ytterligere er følgende forkortelser anvendt: HOAA = Hydroxyeddiksyre, OAla = a-aminooxy-propionsyre,

OGly = Aminooxy-eddikysre, Pfp = Pentafluorfenyl.

Ved fremstilling av forbindelsene ble fordampningen alltid utført på en rotavapor-apparatur av Buchi-typen. For bestemmelse av smeltepunktene ble det anvendt et apparat ifølge dr. Tottoli (Buchi). Tynnsjiktskromatogrammene ble fremstilt på silicagelplater "Kieselgel Gnach Stahl" (Merck). For utvikling av kromatogrammene ble følgende løsningsmiddel-blandinger anvendt:

(1) : Ethylacetat: .(pyridin: eddiksyre: vann=20: 6:11) = 98:2

(2) : Ethylacetat:(pyridin:eddiksyre:vann=20:6:11) = 95:5 (3) : Ethylacetat:(pyridin:eddiksyre:vann=20:6:11) = 90:10 (4) : Ethylacetat:(pyridin:eddiksyre:vann=20:6:11) = 80:20 (5) : Ethylacetat:(pyridin:eddiksyre:vann=20:6:11) = 70:30 (6) : Ethylacetat:(pyridin:eddiksyre:vann=20:6:11) = 60:40

(7) : n-butanol:eddiksyre:vann =4:1:5

(8) : n-butanol:eddiksyre:pyridin:vann = 30:6:20:24

(9) : n-butanol:ethylacetat:eddiksyre:vann = 1:1:1:1

(10) : Ethylacetat:(pyridin:eddiksyre:vann = 20:6:11) = 75:25

Utviklingen av flekkene ble foretatt med ninhydrin,

henholdsvis med klortolidin/kaliumjodid.

Den følgende generelle metode ble anvendt for å

rense sluttproduktene:

0,5 g av det fri peptid ble løst i 4 ml 0,01 molar ammoniumacetatoppløsning, og løsningen ble helt over en kolonne på 0,5 liter carboxymethylcellulose (CMC-52) ekvili-brert på forhånd med samme bufferoppløsning. En gradient- blanding på 1,5 liter av 0,01 molar ammoniumacetatløsning og 1,5 liter av en 0,4 ammoniumacetatløsning ble anvendt som elueringsmiddel. Elueringsmidlet ble ført gjennom kolonnen med en hastighet på 2 5 ml/time, og avløpet ble oppsamlet i fraksjoner hver på 10 ml. Sammensetningen av avløpet som forlater kolonnen ble overvåket kontinuerlig med en LKB Uvocord-II-apparatur, og hovedfraksjonen ble separert på basis av den erholdte kurve og deretter lyofilisert in en Leybold-Hereus lyofiliseringsapparatur. Om nødvendig ble produktet underkastet gjentagende ganger kromatografi ved anvendelse av gradiert eluering på nytt.

Fremstillingen av de nye angiotensin-II-analoger er illustrert i de etterfølgende eksempler.

Eksempel 1

Fremstilling av ( Sarcosin 1 , Isoleucin- methylester 8)-angiotensin- II

Trinn 1

Boc-ArgYN02) -Val-Tyr (Bzl)-Ile-His (Dnp) -Pro-Ile-OMe

1,36 g (7,5 mmol) Ile-OMe.HCl ble løst i 30 ml kloroform og tilsatt 1,05 ml triethylamin og 1,90 g (5 mmol) Boc-Pro-OPfp. Blandingen fikk stå ved konstant pH-verdi i 3 0 minutter, ble deretter utrystet med vann, 10 %-ig vandig sitronsyreløsning og igjen med vann, tørket med vannfritt natriumsulfat og inndampet til tørrhet. Det som residuum erholdte beskyttede dipeptid, Rj<1>^ = 0,8, ble umiddelbart løst i 5 ml 8 n saltsyreløsning i dioxan, og etter 15 minutters henstand ble løsningen tilsatt 20 ml vannfri ether og inndampet. Det som residuum erholdte fri dipeptid-hydroklorid, (5) = 0,46, ble umiddelbart løst i 30 ml kloroform, pH-verdien på løsningen ble innstilt på 8 med triethylamin, og det ble tilsatt 4,36 g (7,5 mmol) Boc-His(Dnp)-OPfp. Blandingen fikk stå 1 time, ble deretter tilsatt 0,83 ml N,N-dimethylamino-ethylamin, fikk stå i 10 minutter og ble deretter utristet med en 10 %-ig sitronsyreløsning mettet med natriumklorid, n-saltsyreløsning, 5 %-ig vandig natrium-hydrogencarbonatløsning og vann i den angitte rekkefølge, ble tørket med vannfritt natriumsulfat og inndampet til tørrhet. (2)

Det.som residuum erholdte beskyttede tripeptid, R^ = 0,45, ble uten isolering løst i lo. ml8n saltsyreløsning, løsnin-gen fikk stå i 15 minutter og under tilsetning av vannfritt ether ble det fri tripeptid-hydroklorid utfelt, filtrert fra

(5)

og vasket. Dette fri tripeptid-hydroklorid, Rf =0,30,

ble umiddelbart løst i 15 ml dimethylformamid. pH-verdien på løsningen ble innstilt på 8 med triethylamin, og det ble tilsatt 2,4 g (6 mmol) Boc-Ile-OPfp. Løsningen fikk stå ved konstant pH-verdi i 30 minutter, hvorpå løsningsmidlet ble fordampet, residuet ble løst i ethylacetat og løsningen ble utristet med 10 %-ig vandig sitronsyreløsning, n-saltsyre-løsning og til slutt med vann, tørket med vannfritt natrium-sulf at og inndampet. Residuet ble triturert med en 1:9-blanding av ether og n-hexan og filtrert. Det således

(?)

erholdte beskyttede tetrapeptid, R^ = 0,31, ble løst i 7 ml 8 n saltsyreløsning i dioxan, løsningen fikk stå i 15 minutter og deretter ble produktet utfelt med vannfritt ether og filtrert. Det således erholdte fri tetrapeptid-hydroklorid,

(5)

R^ = 0,38, ble løst i en blanding av 20 ml kloroform og

10 ml dimethylformamid, pH-verdien på løsningen ble innstilt på 8 med triethylamin, og 2,96 g (5,5 mmol) Boc-Tyr(Bzl)-

OPfp ble tilsatt. Løsningen fikk stå i 15 minutter ved konstant holdt pH-verdi, og deretter ble løsningsmidlet fordampet. Residuet ble løst i ethylacetat, løsningen ble tilsatt 0,22 ml N,N-dimethylamino-ethylamin, fikk stå i 10 minutter og ble deretter utristet med 10 %-ig vandig sitronsyreløsning, n-saltsyreløsning og til sist med vann, ble tørket med vannfritt natriumsulfat og inndampet. Residuet ble triturert med vannfri ether og filtrert. Det erholdte beskyttede pepta-(2)

peptid, R£ = 0,52, ble løst i 10 ml 8 n saltsyreløsning i dioxan, og etter 15 minutter ble produktet under tilsetning av vannfri ether utfelt, filtrert fra og vasket med ether.

Det således erholdte fri pentapeptid-hydroklorid, R^^ = 0,8, ble umiddelbart løst i 20 ml dimethylformamid, pH-verdien på løsningen ble innstilt på 8 med triethylamin, og 2,3 g (6 mmol) Boc-Val-OPfp ble tilsatt. Den erholdte løsning fikk stå i 1 time ved konstant holdt pH-verdi, og derpå ble løsningsmidlet fordampet, residuet ble løst i kloroform, løsningen ble utristet med 10 %-ig vandig sitronsyreløsning, med n-saltsyréløsning og til sist med vann, tørket med vannfritt natriumsulfat og inndampet. Residuet ble triturert med vannfri ether og avfiltrert. Det erholdte beskyttede

(2)

hexapeptid, R^ = 0,43, ble umiddelbart løst i 8 n saltsyre-løsning i dioxan, løsingen fikk stå i 15 minutter og derpå ble produktet utfelt under tilsetning av vannfri ether, filtrert fra og vasket. Det erholdte fri hexapeptid-hydroklorid ble umiddelbart løst i 15 ml dimethylformamid, pH-verdien på løsningen ble innstilt på 8 med triethylamin,

og det ble tilsatt 2,6 g (6 mmol) Boc-Arg(NG^)-OPfp. Løs-ningen fikk stå i 3 0 minutter ved konstant holdt pH-verdi, ble tilsatt 45 ml kloroform og blandingen ble utristet med n-saltsyreløsning og med vann, ble tørket med vannfritt natriumsulfat og inndampet. Residuet ble triturert med ethylacetat og filtrert. Det ble således erhåldt 3,3 g beskyttet heptapeptid,Boc-Arg(NO,)-Val-Tyr(Bzl)-Ile-His(Dnp)-(3)

Pro-Ile-OMe, R^ =0,37, (denne mengde svarer til 51 % av det på Boc-Pro-OPfp beregnede teoretiske utbytte, hvilket gir et gjennomsnittlig trinnvis utbytte på 90 %).

Trinn 2

Z-Sar-Arg(NO2)-Val-Tyr(Bzl)-Ile-His(Dnp)-Pro-Ile-OMe

3,3 g (2,5 mmol) Boc-Arg(N02)-Val-Tyr(Bzl)-Ile-His (Dnp)-Pro-Ile-OMe ble løst i 15 ml 8 n saltsyreløsning i dioxan, løsningen fikk stå i 20 minutter ved romtemperatur, ble deretter tilsatt vannfri ether og det utfelte produkt' ble filtrert og vasket med ether. Det erholdte fri heptapeptid-(5)

hydroklorid, R^ = 0,7), ble umiddelbart løst i 15 ml dimethylformamid, pH-verdien på løsningen ble innstilt på 8 med triethylamin, og 2,4 g (6 mmol) Z-Sar-OPfp ble tilsatt. Løsningen fikk stå i 30 minutter ved konstant holdt pH-verdi, ble deretter tilsatt 4 5 ml kloroform, utrystet med n-salt-syreløsning og derpå med vann, tørket med vannfritt natrium-sulf at og inndampet. Residuet ble triturert med ethanol og filtrert. Det ble således erholdt 3,17 g beskyttet oktapeptid Z-Sar-Arg(N02)-Val-Tyr(Bzl)-Ile-His(Dnp)-Pro-Ile-OMe (89 %

av teoretisk), sm.p. 197 - 209° C, R^<4*>= 0,82. ;Trinn 3 ;Fjerning av beskyttelsesgruppene ;2,59 g (1,83 mmol) Z-Sar-Arg(N02)-Val-Tyr(Bzl)-Ile-His(Dnp)-Pro-Ile-OMe ble løst i 5 ml dimethylformamid og tilsatt 4,6 ml 2-mercaptoethanol. Blandingen ble omrørt i 1,5 timer, deretter ble produktet utfelt med vannfritt ether og filtrert. Det ble erholdt 2,0 g beskyttet octapeptid, ;(4) ;R£ = 0,42, som imidlertid ikke lenger inneholder noen dinitrofenylgruppe (87 % teoretisk utbytte). Dette produkt ble løst i 40 ml av en 5:1:1 blanding av methanol, eddiksyre og vann, løsningen ble tilsatt 1,0 g 10 %-ig palladium- ;aktiv carbonkatalysator og under kraftig omrøring i 20 minutter ble hydrogengass innledet gjennom løsningen. Etter endt reaksjon ble katalysatoren fjernet ved filtrering,.vasket med den samme løsningsmiddelblanding og filtratet forenet med vaskevæsken ble inndampet til tørrhet. Residuet ble tilsatt vandig ethanol, igjen inndampet til tørrhet og denne opera-sjon ble gjentatt ennå en gang. Til slutt ble residuet triturert med vannfri ether, filtrert og tørket. Det således erholdte 1,56 g fri octapeptid-methylester (98 % av teoretisk utbytte). Dette urene produkt ble renset etter den tidligere beskrevne rensemetode. ;Det erholdte (Sarcosin 1 , Isoleucin-methylester 8)-Angiotensin-II utviste følgende karakteristiske egenskaper: R^<7>) = 0,19; R^<8>) = 0,59; R^<9>) = 0,38; EQlu(pH = 1,9): 1,00Aminosyre-analyse: Pro 1,0 7 (1), Val 1,1 (1), Tyr 0,8 (1), His 1,03 (1), Arg 1,0 (1), Ile 1,87 (2), Sar 1,0 (1). ;Eksempel 2 ;( Hydroxyacetyl 1 , Isoleucin- methylester 8)- Angiotensin- II ;Trinn 1: ;Z-OGly-Arg(N02)-Val-Tyr-(Bzl)-Ile-His(Dnp)-Pro-Ile-OMe ;1,5 g (0,8 mmol) Boc-Arg(N02)-Val-Tyr(Bzl)-Ile-His (Dnp) -Pro-Ile-OMe (fremstilt ifølge eksempel 1 trinn 1) ;ble løst i 6 ml 8 n saltsyreløsning i dioxan, løsningen fikk stå i 20 minutter ved romtemperatur og deretter ble produktet utfelt under tilsetning av vannfri ether og filtrert. Det erholdte fri heptapeptid-hydroklorid, R^<5>^ = 0,7) ble umiddelbart løst i 10 ml dimethylformamid, pH-verdien på løsningen ;ble innstilt på 8 med triethylamin, og det ble1tilsatt 0,46 g (1,17 mmol) Z-OGly-OPfp. Blandingen fikk stå i 30 minutter, ble deretter tilsatt 30 ml kloroform, ble utrystet med 10 %-ig vandig sitronsyreløsning, n saltsyreløsning og til sist med vann, ble tørket over vannfritt natriumsulfat og inndampet. Residuet ble triturert med ether og filtrert. Det ble således erholdt 1,05 g beskytet octapeptid Z-OGly-Arg(N02)-Val-Tyr (Bzl)-Ile-His(Dnp)-Pro-Ile-OMe (93 % av teoretisk); ;sm.p. 140 - 145° C, R^<3>) = 0,24. ;Trinn 2 ;Fjerning av beskyttelsesgruppene ;1,05 g (0,74 mmol) Z-OGly-Arg(N02)-Val-Tyr(Bzl)-Ile-His(Dnp)-Pro-Ile-OMe ble løst i 5 ml dimethylformamid og tilsatt 2,3 ml 2-mercaptoethanol. Blandingen fikk stå ved romtemperatur i 1,5 time, og produktet ble deretter utfelt under tilsetning av vannfri ether og vasket med ether. Det ble således erholdt 0,85 g beskyttet octapeptid, men som ikke inneholdt noen dinitrofenylgruppe (85 % teoretisk), R^ (4)= 0,40). 0,75 g (0,6 mmol) av dette produkt ble løst i 20 ml ;av en 5:1:1 blanding av methanol, eddiksyre og vann, løsningen ble tilsatt 0,8 g 10 %-ig palladium-aktivt carbon-katalysator, og under kraftig omrøring ble hydrogengass innledet i blandingen i 18 timer. Etter endt reaksjon ble katalysatoren filtrert, vasket med den samme løsningsmiddelblanding og vaskevæsken ble forenet med filtratet og inndampet til tørrhet. Residuet ble inndampet flere ganger til tørrhet med vandig ethanol, ble deretter triturert med vannfri ether, filtrert og tørket. Det ble således erholdt 0,48 g fritt octapeptid-methylester (82 % av teoretisk). Dette urene produkt ble deretter renset etter den tidligere beskrevne generelle metode, det rene produkt utviste følgende karakteristiske egenskaper: R^<7>) = 0,29; R^<8>) = 0,72; R^<9>) = 0,60; aminosyre-analyse: Pro 1,0 (1), Val 1,0 (1), Ile 1,7 (2), Tyr 0,88 (1), His 1,02 (1), Arg 0,96 (1). ;Eksempel 3 ;Fremstilling av ( L- a- aminooxypropionsyre1, Isoleucin-methylester Q)- Angiotensin- II ;Trinn 1 ;Boc-Arg(Tos)-Val-Tyr(Bzl)-Ile-His(Dnp)-Pro-OBzl ;2,9 g (12 mmol) Pro-OBzl.HC1 ble løst i 50 ml kloroform og tilsatt 1,68 ml triethylamin og 5,87 g (10 mmol) Boc-His-(Dnp)-OPfp. Løsningen ble omrørt i 1 time under konstant holdt pH-verdi, ble deretter utrystet med 25 ml 10 %-ig vandig sitronsyreløsning, n saltsyreløsning, 5 %-ig vandig natriumhydrogencarbonatløsning og vann i den angitte rekke-følge, ble tørket med vannfritt natriumsulfat og inndampet. Residuet ble triturert med n-hexan og filtrert. Det erholdt-€ beskyttede dipeptid, R^ (3) = 0,80, ble løst i 13 ml saltsyre-løsning i dioxan og etter 15 minutters henstand ble produktet utfelt under tilsetning av vannfri ether, filtrert og vasket med ether. Det således erholdte dipeptid-hydroklorid, R^ (4)= 0,24) ble umiddelbart løst i 30 ml dimethylformamid, pH på løsningen ble innstilt på 8 med triethylamin, og det ble tilsatt 4,7 g (12 mmol) Boc-Ile-OPfp. Løsningen fikk stå i 1 time ved konstant holdt pH-verdi, deretter ble løsnings-midlet fordampet, residuet ble løst i kloroform, løsningen ble utrystet med 10 %-ig vandig sitronsyreløsning, n salt-syreløsning, 5 %-ig vandig natriumhydrogencarbonatløsning og med vann i den angitte rekkefølge, tørket med vannfritt natriumsulfat og inndampet. Residuet ble triturert med en 1:2 blanding av ether og n-hexan og filtrert. Det erholdte ;(3) ;beskyttede tripeptid, R^ = 0,82, ble løst i 15 ml 8 n saltsyreløsning i dioxan og etter 15 minutters henstand ble produktet utfelt ved tilsetning av vannfri ether, filtrert og vasket med ether. Det erholdte fri tripeptid-hydroklorid, ;(5) ;Rf =0,38, ble umiddelbart løst i 50 ml dimethylformamid, pH på løsningen ble innstilt på 8 med triethylamin, og 5,9 g (11 mmol) Boc-Tyr(Bzl)-OPfp ble tilsatt. Løsningen fikk stå i 3 0 minutter ved konstant holdt pH-verdi, deretter ble løs-ningsmidlet fordampet, residuet ble løst i ethylacetat, tilsatt 0,22 ml N,N-dimethylamino-ethylamin, og fikk.stå i 15 minutter. Reaksjonsblandingen ble deretter utrystet med ;10 %-ig vandig sitronsyreløsning, n saltsyreløsning og til ;sist med vann, tørket med vannfritt natriumsulfat og inndampet. Residuet ble triturert med ether og filtrert. Det således erholdte beskyttede tetrapeptid, R^ (3)=0,73, ble umiddelbart løst i 20 ml saltsyreløsning i dioxan, og etter 15 minutters henstand ble produktet utfelt ved tilsetning ;av vannfri ether, filtrert og vasket. Det erholdte fri tetrapeptid-hydroklorid, R^ = 0,69, ble umiddelbart løst i 50 ml dimethylformamid, pH-verdien på løsningen ble innstilt på 8 med triethylamin, og 4,2 g (11 mmol) Boc-Val-OPfp ble tilsatt. Løsningen fikk stå i 1 time under konstant holdt pH-verdi, deretter ble løsningsmidlet fordampet, residuet ble løst i ethylacetat', løsningen ble utristet på vanlig måte, tørket og inndampet. Residuet ble behandlet med n-hexan og deretter med vannfri ether og filtrert. Det erholdte ;(3) ;beskyttede pentapeptid, R^ = 0,65, ble løst i 20 ml 8 n saltsyreløsning i dioxan, løsningen fikk stå i 15 minutter og ble deretter tilsatt vannfri ether og det utfelte produkt ble filtrert og vasket. Det således erholdte fri pentapeptid-hydroklorid, R^ (5) = 0,57, ble umiddelbart løst i 60 ml imethylformamid, pH-verdien på løsningen ble innstilt på 8 med triethylamin, og 5,94 g (10 mmol) Boc-Arg(Tos)-OPfp ble tilsatt. Løsningen fikk stå i 1 time ved konstant holdt pH-verdi, deretter ble løsningsmidlet fordampet, residuet ble løst i kloroform, løsningen ble utristet med 10 %-ig vandig sitronsyreløsning, n saltsyreløsning, 5 %-ig vandig natrium-hydrogencarbonatløsning og med vann i den angitte rekkefølge, tørket med vannfritt natriumsulfat og inndampet. Residuet ble triturert med vannfri ether og filtrert. Det ble således erholdt 5,8 g Boc-Arg(Tos)-Val-Tyr(Bzl)-Ile-His(Dnp)-Pro-OBzl, Rf (3) = 0,63, (42 % teoretisk utbytte beregnet på His, hvilket svarer til et trinnvist gjennomsnittsutbytte på 84 %), sm.p. 167 - 174° C. ;Trinn 2 ;Boc-Arg(Tos)-Val-Tyr(Bzl)-Ile-His-Pro-OH ;2,8 g (2,1 mmol) av det ovenfor erholdte beskyttede hexapeptid Bos-Arg(Tos)-Val-Tyr(Bzl)-Ile-His(Dnp)-Pro-OBzl ble løst i 8 ml dimethylformamid, ble tilsat 2,9 ml 2- ;mercaptoethanol og ble omrørt i 1 time. Deretter ble pro-(4) ;duktet, befridd for dinitrofenyl-beskyttelsesgruppen, R^ ( 4 )= 0,17, utfelt under tilsetning av vannfri ether, suspendert i 30 ml dioxan og tilsatt 12 ml natriumhydroxydløsning. Blandingen fikk stå i 1 time, deretter ble pH-verdien på den erholdte klare løsning innstilt på 7 med n-saltsyre og dioxanet ble avdestillert. pH-verdien på den gjenværende vandige løsning ble innstilt på 3 med saltsyre, det erholdte bunnfall ble fraskilt og løst i 60 ml av 2:3 blanding av dimethylformamid og kloroform. Den organiske fase av den erholdte løsning ble fraskilt, og det organiske løsningsmid-del ble avdestillert. Det ble erholdt 2,3 g Boc-Arg(Tos)-Val-Tyr(Bzl)-Ile-His-Pro-OH (96 % av teoretisk), R^<5>) = 0,37, sm.p. 160 - 164° C (spaltning). ;Trinn 3 ;Boc-Arg(Tos)-Val-Tyr(Bzl)-Ile-His-Pro-Ile-OMe ;1,25 g (1,1 mmol) av det i trinn 2 erholdte produkt ble løst i 15 ml dimethylformamid, og løsningen ble tilsatt 0,5 ml (3,6 mmol) triethylamin, 0,65 g (3,6 mmol) Ile-OMe-hydroklorid og 1,35 g (2 mmol) av det krystallinske kompleks av dicyclohexylcarbodiimid og pentafluorfenol (molforhold mellom komponentene 1:3). Blandingen ble holdt ved konstant pH-verdi, og etter 24 timer ble denne tilsatt en lik mengde av det ovenfor angitte kompleks og ytterligere 0,65 g (3,6 mmol) Ile-OMe-hydroklorid. Etter ytterligere 24 timer ble reaksjonsblandingen fortynnet med 45 ml kloroform og utristet to ganger med 20 ml 10 %-ig vandig sitronsyreløsning hver gang, deretter med 5 %-ig vandig natriumhydrogencarbonatløs-ning og til sist med vann, tørket med vannfritt natriumsulfat oginndampet. Residuet ble behandlet med vannfri ether og filtrert. Det således erholdte beskyttede heptapeptidester, R^"*"0^ = 0,26, ble løst i 20 ml varm ethanol, og etter avkjø-ling ble produktet filtrert. Det ble erholdt 0,95 g Boc-Arg (Tos ) -Val-Tyr (Bzl) -Ile-His-Pro-Ile-OMe (65% av teoretisk).

Trinn 4

Boc-L-Ola-Arg(Tos)-Val-Tyr(Bzl)-Ile-His-Pro-Ile-OMe

0,95 g Boc-Arg(Tos)-Val-Tyr(Bzl)-Ile-His-Pro-Ile-OMe ble løst 3 ml 8 n saltsyreløsning i dioxan, løsningen

fikk stå i 15 minutter og det fri heptapeptidester-hydro-

(5)

klorid, = 0,24, ble utfelt under tilsetning av vannfri ether, ble vasket med ether og umiddelbart løst i 10 ml dimethylformamid. pH-verdien på løsningen ble innstilt på 8 med triethylamin, og 0,5 g (1,1 mmol) Boc-OAla-OPfp ble tilsatt. Løsningen fikk stå i 1 time ved konstant holdt pH-verdi, ble deretter fortynnet med 30 ml kloroform, utristet med 10 %-ig vandig sitronsyreløsning og vann, tørket med vannfritt natriumsulfat og inndampet.

Den erholdte beskyttede octapeptidester ble triturert med ether og filtrert fra. Det ble således erholdt 0,83 g Boc-L-OAle-Arg(Tos)-Val-Tyr(Bzl)-Ile-His-Pro-Ile-OMe (87 % teoretisk): R^<4>^ = 0,34, sm.p. 143 - 146° C (spaltning).

Trinn 5

Fjerning av beskyttelsesgruppene

0,75 g (0,57 mmol) av det ovenfor erholdte beskyttede octapeptid ble løst i en blanding av 0,5 ml thioanisol og 2 ml flytende hydrogenfluorid. Blandingen ble holdt i 1,5 time ved 0° C, deretter ble den fri octapeptidester utfelt under tilsetning av vannfri ether. Dette produkt ble løst i 30 ml methanol og utfelt på nytt ved tilsetning av vannfri ether. Det ble således erholdt 0,5 g uren octapeptidester (89 % av teoretisk). Dette urene produkt ble deretter renset etter den tidligere beskrevne generelle rensemetode. Det erholdte rene (L-a-aminooxypropionsyre-'-, Isoleucin-methylester Q)-Angiotensin-II utviste følgende karakteristiske egenskaper:

R^<7>) = 0,30, R^<8>) = 0,68, R^<9>) = 0,46. Aminosyreanalyse:

Pro 1,0 (1), Val 1,05 (1), Ile 2,0 (2), Tyr 0,73 (1), His 0,85 (1), Arg 0,97 (1).

Eksempel 4

(Sarcosin 1 , Threonin(Me)-methylester 8)-Angiotensin-II

Trinn 1

Z-Sar-Arg(N02)-Val-Tyr(Bzl)-Ile-His(Dnp)-Pro-Thr(Me)-OMe

0,68 g (4,5 mmol) Thr(Me)-OMe ble løst i 10 ml kloroform, og tilsatt 2,28 g (6 mmol) Boc-Pro-OPfp. Løsnin-gen fikk stå 1/2 time ved konstant holdt pH-verdi på 8, og løsningsmidlet ble deretter avdestillert, residuet ble løst

i ethylacetat og tilsatt 0,22 ml N,N-dimethylaminoethylamin. Etter 15 minutters henstand ble reaksjonsblandingen først utristet med en 10 %-ig sitronsyreløsning mettet med natriumklorid, deretter med n- saltsyreløsning og til sist med vann, tørket med vannfritt natriumsulfat og inndampet.

(2)

Det som residuum erholdte beskyttede dipeptid, =0,76, ble uten rensing løst i 3 ml 8 n saltsyreløsning i dioxan, løsningen fikk stå i 15 minutter og ble deretter fortynnet med vannfri ether og inndampet. Det som residuum erholdte

(4)

fri dipeptid-hydroklorid, R^ = 0,18, ble umiddelbart løst i 10 ml dimethylformamid, pH-verdien på løsningen ble innstilt på 8 med triethylamin, og 2,95 g (5 mmol) Boc-His(Dnp)-OPfp ble tilsatt.

Løsningen fikk stå i 1/2 time ved konstant holdt pH-verdi lik 8, deretter ble løsningsmidlet avdestillert og residuet ble løst i ethylacetat. Løsningen ble tilsatt 0,11 ml N,N-dimethylamino-ethylamin, fikk stå i 10 minutter og ble deretter utristet med en 10 %-ig vandig sitronsyreløsning mettet med natriumklorid, og deretter med vann, ble tørket med vannfritt natriumsulfat og inndampet. Det som residuum

(2)

erholdte beskyttede tripeptid, R^ = 0,47, ble umiddelbart løst i 5 ml dimethylformamid, og etter 15 minutters henstand ble reaksjonsproduktet utfelt under tilsetning av vannfri ether, filtrert og vasket med ether. Det således erholdte fri tripeptid-hydroklorid, R^ (4) = 0,3, ble umiddelbart løst i 10 ml dimethylformamid, pH-verdien på løsningen ble innstilt på 8 med triethylamin, og 2,0 g (5 mmol) Boc-Ile-OPfp ble tilsatt. Løsningen fikk stå i 1/2 time ved konstant holdt pH-verdi lik 8, og løsningsmidlet ble deretter destillert, residuet ble løst i ethylacetat og løsningen ble utrystet på vanlig måte, tørket og inndampet. Residuet ble triturert med en blanding av ether og n-hexan i et volumforhold på 3:7, og filtrert. Det således erholdte beskyttede tetrapeptid, R^ (2) = 0,28, ble umiddelbart løst i 7 ml 8 n salt-syreløsning, løsningen fikk stå i 15 minutter og deretter ble det fri tetrapeptid-hydroklorid utfelt under tilsetning av vannfri ether, filtrert og vasket med ether. Dette produkt, Rf<5>^ = 0,27, ble løst i 10 dimethylformamid, pH-verdien på

løsningen ble innstilt på 8 med triethylamin, og 2,7 g (5 mmol) Boc-Tyr(Bzl)-OPfp ble tilsatt. Løsningen fikk stå i 1/2 time ved konstant holdt pH-verdi lik 8, og deretter ble løsningsmidlet avdestillert, residuet ble løst i ethylacetat, løsningen ble tilsatt 0,11 ml N,N-dimethylamino-ethylamin, og etter 15 minutters henstand ble denne utrystet med en vandig 10 %-ig sitronsyreløsning mettet med natriumklorid, og deretter med vann, tørket med vannfritt natriumsulfat og inndampet. Det som residuum erholdte beskyt-(2)

tede pentapeptid, R^ =0,51) ble triturert med vandig ether, filtrert og umiddelbart løst i 5 ml 8 n saltsyreløsning i dioxan. Etter 15 minutters henstand ble det fri pentapeptid-hydroklorid, Rf & 0,48, utfelt under tilsetning av vannfri ether, filtrert, vasket med ether og løst i 20 ml dimethylformamid. pH-verdien for løsningen ble innstilt på 8 med triethylamin, og 1,9 g (9 mmol) Boc-Val-OPfp ble tilsatt.

Løsningen fikk stå i 1/2 time ved konstant holdt pH-verdi lik 8, og løsningsmidlet ble deretter filtrert, residuet ble løst i kloroform, løsningen ble utrystet på vanlig måte, tørket og inndampet. Residuet ble triturert med vannfri ether og fil-(2)

trert. Det erholdte beskyttede hexapeptid, R^ = 0,44, ble løst i 10 ml 8 n saltsyreløsning i dioxan, og etter 15 minutters henstand ble produktet utfelt under tilsetning av vannfri ether, filtrert og vasket. Det erholdte fri hexapeptid-(4)

hydroklorid, R^ = 0,36, ble umiddelbart løst i 15 ml dimethylformamid, pH-verdien på løsningen ble innstilt på 8 med triethylamin, og 2,25 g (5 mmol) Boc-Arg(N02)-OPfp ble tilsatt. Løsningen fikk stå i 1 time ved konstant holdt pH-verdi lik 8, ble deretter fortynnet med 45 ml kloroform og utrystet på vanlig måte, tørket og inndampet. Residuet ble triturert med ethanol og filtrert. Det ble således erholdt 3,3 g beskyttet heptapeptidester Boc-Arg(NO^)-Val-Tyr(Bzl)-Ile-His (Dnp)-Pro-Thr (Me)-OMe (.56 % teoretisk utbytte beregnet på Thr, hvilket svarer til et trinnvist gjennomsnittlig utbytte på 91 %), sm.p. 188 - 193° C, R^<3>) = 0,38, R^<4>) = 0,87.

1,95 g (1,5 mmol) av den ovenfor beskyttede heptapeptidester ble løst i 10 ml 8 n saltsyreløsning i dioxan,

og etter 20 minutters henstand ble produktet utfelt under tilsetning av vannfri ether, filtrert og vasket. Det er-(4)

holdte fri heptapeptidester-hydroklorid, R^ = 0,20, ble løst i 15 ml dimethylformamid, pH-verdien på løsningen ble innstilt på 8 med triethylamin, og 0,87 g (2,25 mmol) Z-Sar-OPfp ble tilsatt. Løsningen fikk stå i 1 time under konstant holdt pH-verdi lik 8, ble deretter fortynnet med 45 ml kloroform, utrystet med 10 %-ig vandig sitronsyreløsning, deretter med n saltsyreløsning og til sist med vann, tørket med vannfritt natriumsulfat og inndampet. Residuet ble triturert med ethanol, filtrert og vasket med ethanol. Det ble således erholdt 1,85 g beskyttet octapeptidseter Z-Sar-Arg(N02)-Val-Tyr (Bzl) -Ile-His (Dnp) -Pro-Thr (Me) -OMe (87 % av teoretisk), sm.p. 202 - 208° C, R^<3>) = 0,20, R^<4>) = 0,86.

Trinn 2

Fjerning av beskyttelsesgruppene

1,85 g (1,4 mmol) beskyttet octapeptidester Z-Sar-Arg-(N02)-Val-Tyr(Bzl)-Ile-His(Dnp)-Pro-Thr(Me)-OMe ble løst i 8 ml dimethylformamid og tilsatt 2,6 ml 2-mercaptoethanol. Blandingen ble omrørt i 1 time og ved tilsetning av vannfri ether ble den beskyttede octapeptidester (1,6 g, R^ (4) = 0,52), som var befridd for dinitrofenylgruppen, utfelt, ble filtrert og vasket. Detté produkt ble løst i 30 ml av en 5:1:1 blanding av methanol, eddiksyre og vann, og 1,0 g 10 %-ig palladium-aktivt carbonkatalysator ble tilsatt. Hydrogengass ble under kraftig omrøring innledet i løsningen i løpet av 30 timer, deretter ble katalysatoren filtrert fra, vasket med den samme løsningsmiddelblanding og filtratet kombinert med vaskevæsken ble inndampet til tørrhet. Residuet ble triturert med en 2:1 blanding av ether og ethanol og filtrert. Det ble således erholdt 0,98 g fri octapeptidester (83 % av teoretisk). Dette urene produkt ble renset etter den tidligere beskrevne generelle rensemetode. Det erholdte rene (Sarcosin1, Threonin(Me)-methylester<8>)-Angiotensin-II utviste følgende karakteristiske e jer.skaper: R^<o>) 0,29, R^<8>^ = 0,55, R^<9>) = C,27; EGlu(pH = 1,9)j Aminosyre-analyse: His 1,03 (1), Arg 0,95 (1), Thr 0,93 (1), Pro 1,03 (1), Val 1,15 (1), Ile 1,03 (1), Tyr 0,90. (1),

Sar 1,0(1).

Eksempel 5

(Hydroxyeddiksyre 1 ,Threonin(Me)-methylester 8)-Angiotensin-II Trinn 1

Z-OGly-Arg(N02)-Val-Tyr(Bzl)-Ile-His(Dnp)-Pro-Thr(Me)-OMe

0,62 g (0,47 mmol) Boc-Arg(N02)-Val-Tyr(Bzl)-Ile-His- (Dnp) -Pro-Thr (Me) -OMe (fremstilt som beskrevet i eksempel 4, trinn 1) ble løst i 4 ml 8 n saltsyreløsning i dioxan,

og etter 15 minutters henstand ble den frie heptapeptidester-hydroklorid utfelt ved tilsetning av vannfri ether, ble filtrert og vasket med ether. Dette produkt, R^5^ = 0,35, ble umiddelbart løst i 10 ml dimethylformamid, pH-verdien på løsningen ble innstilt på 8 med triethylamin, og det ble tilsatt 0,8 g (2 mmol) Z-OGly-OPfp. Løsningen fikk stå i 1 time ved konstant pH-verdi lik 8, ble deretter fortynnet med 30 ml kloroform, utristet med 10 %-ig vandig sitronsyre-løsning, deretter med n saltsyreløsning og til sist med vann, tørket med vannfritt natriumsulfat og inndampet. Residuet ble triturert med en 9:1 blanding av ether og ethanol og filtrert. Det ble således erholdt 0,60 g beskyttet octapeptidester Z-OGly-Arg(N02)-Val-Tyr(Bzl)-Ile-His(Dnp)-Pro-Thr(Me) - OMe (90 % av teoretisk), sm.p. 158 - 162° C, R^<3>^ = 0,44.

Trinn 2

Fjerning av beskyttelsesgruppene

0,6 g (0,42 mmol) beskyttet octapeptidester ble løst i 2 ml dimethylformamid, tilsatt 1,2 ml 2-mercaptoethanol og etter 1 times henstand ble den beskyttede octapeptidester fri for dinitrofenylgruppen utfelt under tilsetning av vannfri ether. Dette produkt ble løst i methanol, løsningen ble klar-gjort med aktivt carbon, filtrert og inndampet til tørrhet. Residuet ble triturert med ether og filtrert. Utbytte: 0,46 g, R^<4>) = 0,16, R^<5>) = 0,52.

Produktet ble løst i en 5:1:1 blanding av ethanol, eddiksyre og vann, tilsatt 0,3 g 10 %-ig palladium-aktivt carbonkatalysator og hydrogengass ble under kraftig omrøring innledet i blandingen i 17 timerø Etter endt reaksjon ble katalysatoren filtrert fra, vasket med den samme løsnings-middelblanding, hvoretter vaskevæsken ble forenet med fil tratet og inndampet til tørrhet. Residuet ble flere ganger tilsatt en blanding av vann og ethanol og inndampet til tørr-het, ble deretter triturert med ether og filtrert. Det ble erholdt 0,32 g fri octapeptidester (91 % utbytte av teoretisk). Dette urene produkt ble renset etter den tidligere beskrevne generelle rensingsmetode, og det således erholdte rene (hydroxyeddiksyre 1 ,Threonin(Me)-methylester 8)-Angiotensin-II utviste følgende karakteristiske egenskaper: R^ (7) = 0,22,

Rf<8>) = 0,73, R^<9>) = 0,56. Aminosyre-analyse: Thr 0,92 (1), Pro 1,03 (1), Val 1,0 (1), Tyr 0,7 (1), His 1,0 (1), Arg 1,0 (1).

Eksempel 6

Hydroxyeddiksyre 1 ,Threonin-methylester 8)-Angiotensin-II

Trinn 1

Boc-Arg(N02)-Val-Tyr(Bzl)-Ile-His(Dnp)-Pro-Thr-OMe

3,8 g (20 mmol) Thr-OMe.HCl ble løst i 50 ml kloroform og 2,8 ml (20 mmol) triethylamin og 3,9 g (10 mmol) Boc-Pro-OPfp ble tilsatt. Løsningen fikk stå i 1 time ved konstant holdt pH-verdi, ble deretter utristet med 10 %-ig vandig sitronsyreløsning, deretter med n- saltsyre og til slutt med vann, ble tørket med vannfritt natriumsulfat og inndampet. Den erholdte beskyttede dipeptidester, R^(<3>) 0,77, ble løst i 20 ml 8 n saltsyreløsning i dioxan, og etter 15 minutters henstand ble den fri dipeptidester-hydroklorid utfelt under tilsetning av vannfri ether, filtrert og vasket. Dette produkt, R^ (5) = 0,2, ble umiddelbart løst i 30 ml kloroform, pH-verdien for løsningen ble innstilt på 8 med triethylamin, og 4,7 g (8 mmol) Boc-His(Dnp)-OPfp ble tilsatt. Løsningen fikk stå i 1 time ved konstant holdt pH-verdi 8,

ble deretter utristet med 10 %-ig vandig sitronsyreløsning, med n saltsyreløsning, med 5 %-ig vandig natriumhydrogen-carbonatløsning og med vann i den angitte rekkefølge, ble tørket over vannfritt natriumsulfat og inndampet. Den som residuum erholdte beskyttede tripeptidester, R^ (3) = 0,47,

ble løst i 20 ml 8 n saltsyreløsning i dioxan, og etter 15 minutters henstand ble den fri tripeptidester-hydroklorid,

(5)

Rf =0,23, utfelt under tilsetning av vannfri ether. Dette produkt ble løst i 20 ml av en 5:1 blanding av kloroform og dimethylformamid, pH-verdien på løsningen ble innstilt på 8 med triethylamin, og 4,0 g (10 mmol) Boc-Ile-OPfp ble tilsatt. Løsningen fikk stå i 1/2 time ved konstant pH-verdi lik 8, ble deretter utristet med 10 % vandig sitronsyreløs-ning, 5 %-ig vandig natriumhydrogencarbonatløsning og til slutt med vann, ble tørket med vannfritt natriumsulfat og inndampet. Residuet ble triturert flere ganger med n-hexan og filtrert. Den således erholdte beskyttede tetrapeptidester, R^ (3)' = 0,45, ble løst i 15 ml 8 n saltsyreløsning i dioxan, og etter 15 minutters henstand ble den fri tetrapeptidester-hydroklorid utfelt under tilsetning av vannfri ether. Dette produkt, R^ (5) = 0,25, ble umiddelbart løst i 30 ml dimethylformamid, pH-verdien på løsningen ble innstilt på 8 med triethylamin, og 2,05 g (3,8 mmol) Boc-Tyr(Bzl)-OPfp ble tilsatt. Løsningen fikk stå 1/2 time ved konstant pH-verdi lik 8, ble deretter inndampet og residuet ble løst i ethylacetat og tilsatt 0,11 ml N,N-dimethylamino-ethylamin. Etter 15 minutters henstand ble løsningen utristet på vanlig måte, tørket og inndampet. Den som residuum erholdte beskyt-(3)

tede peptapeptidester, R^ =0,57, ble triturert med vannfri ether og filtrert, ble deretter løst i 10 ml 8 n saltsyre-løsning i dioxan. Etter 15 minutters henstand ble det fri pentapeptidester-hydroklorid utfelt under tilsetning av vannfri ether, filtrert og vasket med ether. Dette produkt, R^^ = 0,27, ble umiddelbart løst i 20 ml dimethylformamid, pH

på løsningen ble innstilt på 8 med triethylamin, og 1,75 g (4,5 mmol) Boc-Val-OPfp ble tilsatt. Løsningen, fikk stå i 1 time ved konstant pH-verdi lik 8, løsningsmidlet ble deretter fordampet, residuet ble løst i kloroform og løsningen ble utristet på vanlig måte, tørket og inndampet. Det olje-aktige residuum ble triturert med ether, filtrert og vasket. Den således erholdte beskyttede hexapeptidester, R^ (3) = 0,55, ble løst i 8 ml 8 n saltsyreløsning i dioxan, og etter 15 minutters henstand ble det fri hexapeptidester-hydroklorid utfelt under tilsetning av vannfri ether, filtrert og vasket med ether. Dette produkt, R^<5>^ =0,23, ble umiddelbart løst

i 20 ml dimethylformamid, pH-verdien på løsningen ble innstilt på 8 med triethylamin, og 1,8 g (4 mmol) Boc-Arg(N02)-

OPfp ble tilsatt. Løsningen fikk stå i 1 time ved konstant pH-verdi lik 8, løsningsmidlet ble deretter fordampet, residuet ble løst i kloroform og løsningen ble utristet på vanlig måte, tørket og inndampet. Residuet ble triturert med en 9:1 blanding av ether og ethanol, filtrert og vasket. Det ble erholdt 2,7 g beskyttet heptapeptidester Boc-Arg-(N02)-Val-Tyr(Bzl)-Ile-His(Dnp)-Pro-Thr-OMe (26 % av det på His beregnede teoretiske utbytte, hvilket tilsvarer et gjen-nomsnitlig trinnvis utbytte på 80 %), Sm.p. 190 - 195° C (spaltning), R^<4>) = 0,47.

Trinn 2

1,7 g (1,4 mmol) av den ovenfor beskyttede heptapeptidester ble løst i 10 ml 8 n saltsyreløsning i dioxan,

og etter 15 minutters henstand ble det fri heptapeptidester-(5)

hydroklorid, Rf =0,21, utfelt ved tilsetning av vannfri ether og umiddelbart løst i 20 ml dimethylformamid. pH-verdien på løsningen ble innstilt på 8 med triethylamin, og 0,82 g (2,1 mmol) Z-OGly-OPfp ble tilsatt. Løsningen fikk stå 1/2 time ved konstant pH-verdi lik 8, ble deretter fortynnet med 4 0 ml kloroform, utrystet med n-saltsyreløsning og vann, tørket og inndampet. Residuet ble triturert med vannfri ether og filtrert. Det ble erholdt 1,6 g beskyttet octapeptidester (87 % av teoretisk), Sm.p. 188 - 194° C,

R^<4>) = 0,48.

Trinn 3

Fjerning av beskyttelsesgruopene

1,6 g (1,2 mmol) beskyttet octapeptidester Z-OGly-Arg (N02)-Val-Tyr(Bzl)-Ile-His(Dnp)-Pro-Thr-OMe ble løst i 5 ml dimethylformamid og tilsatt 3,8 ml 2-mercaptoethanol. Blandingen fikk stå i 1 time, hvoretter octapeptidesteren befridd for dinitrofenylgruppen ble utfelt under tilsetning av vannfri ether, filtrert, løst i methanol og på nytt utfelt under tilsetning av ether. Utbytte: 1,3 g (94 % av teoretisk); R^<4>) = 0,35, R^<5>) = 0,72.

Dette produkt ble løst i en 5:1:1 blanding av methanol, eddiksyre og vann, 0,6 g 10 %-ig palladium-aktivt carbonkatalysator ble tilsatt og hydrogengass ble under kraftig omrøring innledet i blandingen i 17 timer. Etter endt reaksjon ble katalysatoren destillert fra, og vasket med samme løsningsmiddelblanding, vaskevæskene ble.forenet med filtratet og inndampet til tørrhet. Residuet ble flere ganger inndampet med en blanding av ethanol og vann, og det sluttelig erholdte residuum ble triturert med ether, filtrert og vasket med ether. Det ble erholdt 0,64 g fri octapeptidester (92 % av teoretisk). Dette urene produkt ble deretter renset etter den tidligere beskrevne generelle rensemetode, og densåledes erholdte rene octapeptidester (hydroxyeddiksyre 1 ,Threonin-methylester 8)-Angiotensin-II utviste følgende karakteristiske egenskaper: R^ (7) = 0,22, Rf<8>^ = 0,73, R^<9>^ = 0,56. Aminosyreanalyse: Thr 0,92 (1), Pro 1,03 (1), Val 1,0 (1), Ile 1,05 (1), Tyr 0,7 (1), His 1,0 (1), Arg 1,0 (1).

Eksempel 7

(Sarcosin 1 ,Alanin-methylester 8)-Angiotensin-II

Trinn 1

0,7 g (5 mmol) Ala-OMe.Hcl ble løst 20 ml kloroform, tilsatt 0,7 ml triethylamin og 1,14 g (3 mmol) Boc-Pro-OPfp og fikk stå i 1/2 time ved konstant pH-verdi. Løsningen ble utristet med 10 %-ig vandig sitronsyreløsning, deretter med n saltsyreløsning og til slutt med vann, ble vasket med vannfritt natriumsulfat og inndampet, \ 2)Den som residuum erholdte beskyttede dipeptidester, R^ = 0^61, ble løst i 5 ml 8 n saltsyreløsning i dioxan, og etter 10 minutters henstand ble løsningen fortynnet med vannfri ether og inndampet. Det som residuum erholdte fri dipeptidester-hydroklorid,

R^ (5) = 0/32, ble løst i 20 ml kloroform, pH-verdien på løs-ningen ble innstilt på 8 med triethylamin, og 2,7 g (4,5 mmol) Boc-His(Dnp)-OPfp ble tilsatt. Løsningen fikk stå i 1 time ved konstant pH-verdi lik 8, ble deretter tilsatt 0,33 ml dimethylamino-ethylamin, og etter 15 minutters henstand ble blandingen utrystet med 10 %-ig vandig sitronsyre-løsning, med n saltsyreløsning, med 5 %-ig vandig natrium-hydrogencarbonatløsning og med vann i den angitte rekkefølge, tørket med vannfritt natriumsulfat og inndampet. Den som

residuum erholdte beskyttede tripeptidester,

= 0, 21, ble løst i 10 ml 8 n saltsyreløsning i dioxan, og etter 15 minutters henstand ble det fri tripeptidester-hydroklorid, Rf<5>^ = 0,48, utfelt ved tilsetning av vannfri ether, filtrert og vasket med ether. Dette produkt ble umiddelbart løst i 30 ml av en 2:1 blanding av kloroform og dimethylformamid, pH på løsningen ble innstilt på 8 med triethylamin, og 2,4 g (6 mmol) Boc-Ile-OPfp ble tilsatt. Løs-ningen fikk stå i 1/2 time ved konstant pH lik 8, hvoretter løsningsmidlet ble fordampet, residuet ble løst i ethylacetat og løsningen ble utristet på vanlig måte, tørket og inndampet. Residuet ble triturert med en 1:9 blanding av ether og n-hexan og filtrert. Den således erholdte beskyttede tetra-(2)

peptidester, R^ = 0,29, ble løst i 10 ml 8 n saltsyreløs-ning i dioxan, og etter 10 minutters henstand ble det fri

(5)

tetrapeptidester-hydroklorid, R^ = 0,67, utfelt under tilsetning av vannfri ether, filtrert, vasket og umiddelbart løst i en 2:1 blanding av kloroform og dimethylformamid. pH-verdien på løsningen ble innstilt på 8 med triethylamin, og 1,78 g (3,3 mmol) Boc-Tyr(Bzl)-OPfp ble tilsatt. Løsnin-gen fikk stå i 15 minutter ved konstant pH-verdi, løsnings-midlet ble deretter fordampet, residuet ble løst i ethylacetat og løsningen ble utristet på vanlig måte, tørket og inndampet. Residuet ble triturert med vannfri ether og filtrert,

(2)

det erholdte beskyttede pentapeptid, R^ = 0,33, ble løst i

10 ml 8 n saltsyreløsning i dioxan, og etter 10 minutters henstand ble det fri pentapeptidester-hydroklorid, R^ (4)= 0,35, utfelt under tilsetning av vannfri ether, filtrert og umiddelbart løst i 20 ml dimethylformamid. pH-verdien på løsningen ble innstilt på 8 med triethylamin, og 1,55 g

(4 mmol) Boc-Val-OPfp ble tilsatt. Løsningen fikk stå i 1/2 time under konstant pH-verdi, deretter ble løsningsmidlet fordampet, residuet ble løst i kloroform og løsningen ble utristet på vanlig måte, tørket og inndampet. Residuet ble triturert med vannfri ether og filtrert. Det erholdte beskyttede hexapeptidester, R^ ( 2); = 0,35, ble løst i 8 ml 8 n saltsyreløsning i dioxan, og etter 2 0 minutters henstand ble det fri hexapeptidester-hydroklorid, Rf^ = 0,75, utfelt

under tilsetning av vannfri ether, filtrert og vasket med ether. Dette produkt ble umiddelbart løst i 20 ml dimethylformamid, pH-verdien på løsningen ble innstilt på 8 med triethylamin og 2,64 g (6 mmol) Boc-Arg(N02)-OPfp ble tilsatt. Løsningen fikk stå i 1 time ved konstant pH-verdi og ble deretter fortynnet med 60 ml kloroform, utrystet med n saltsyreløsning og vann, tørket og inndampet. Residuet ble triturert i en 1:3 blanding av ethanol og ether, filtrert og vasket.

Den erholdte beskyttede heptapeptidester, R^ (4) 0,85, ble løst i 10 ml 8 n saltsyreløsning i dioxan, og etter 15 minutters henstand ble det fri heptapeptidesterhydroklorid, R^4^ = 0,15, utfelt ved tilsetning av vannfri ether, filtrert, vasket og umiddelbart løst i 20 ml dimethylformamid. pH-verdien på løsningen ble innstilt på 8 med triethylamin, og 1,27 g (3,3 mmol) Z-Sar-OPfp ble tilsatt. Løsningen fikk stå

i 15 minutter ved konstant pH-verdi, ble deretter fortynnet med 60 ml kloroform og utristet på vanlig måte, tørket og inndampet. Den som residuum erholdte beskyttede octapeptidester ble filtrert med 25 ml ethanol, filtrert og vasket.

Det ble således erholdt 1,37 g Z-Sar-Arg(N02)-Val-Tyr(Bzl)-Ile-His(Dnp)-Pro-Ala-OMe (33 % av det på Pro beregnede teoretiske utbytte, hvilket tilsvarer et gjennomsnittlig trinnvist utbytte på 86 %), sm.p. 19.2 - 196° C, Rf4^ = 0,70..

Trinn 2

Fjerning av beskyttelsesgruppene

1,37 g (1 mmol) av den ovenfor erholdte beskyttede octapeptidester ble løst i 3 ml dimethylformamid, tilsatt 1,9 ml 2-mercaptoethanol, og etter 1 times henstand ble octapeptidesteren befridd for dinitrofenylgruppen utfelt under tilsetning av vannfri ether (1,2 g, 99 % av teoretisk, R^ (4) = 0,20), filtrert og vasket. Dette produkt ble løst i

20 ml av en 5:1:1 blanding av methanol, eddiksyre og vann, løsningen ble tilsatt 0,6 g 10 %-ig palladium-aktivt carbon-katalysator og under kraftig omrøring ble hydrogengass innledet i blandingen i 20 timer. Etter endt reaksjon ble katalysatoren fjernet ved filtrering og vasket med den samme løsningsmiddelblanding, hvorpå vaskevæsken ble forenet med filtratet og inndampet til tørrhet og tilsatt flere ganger en blanding av ethanol og vann og på nytt inndampet til tørr-het. Endelig ble residuet triturert med en 1:1 blanding av ethanol og ether og filtrert. Det ble således erholdt 0,7 g fri octapeptidester (75 % av teoretisk), som ble renset etter den tidligere beskrevne generelle rensemetode. Det rene (Sarcosin 1 ,Alanin-methylester 8)-Angiotensin-II utviste følgende karakteristiske egenskaper: Rf (7) = 0,23, R, (8) =0,54, Rf = 0,27, Aminosyreanalyse: His 0,97 (1), Arg 1,03 (1),

Pro 1,06 (1), Val 1,03 (1), Ile 0,98 (1), Tyr 0,6 (1), Sar

1,0 (1).

Claims

Analogifremgangsmåte for fremstilling av terapeutisk aktive octapeptidestere av generell formel I

hvori X betegner en acylgruppe av en cx-N-methylaminoalkansyre med .1-4 C-atomer, i særdeleshet sarcosylgruppen, eller av en alifatisk carboxylsyre med 1-4 C-atomer inneholdende i a-stilling en aminooxy- eller hydroxylgruppe, Y betegner resten av aminosyrene isoleucin, alanin og eventuelt methylsubstituert threonin, A betegner en alkylgruppe med 1-5 carbonatomer, såvel som syreaddisjonssalter og farmasøytisk anvendbare komplekser av disse peptidestere,karakterisert vedat man fra et beskyttet octapeptidesterderivat av generell formel II hvori B er en gruppe som er fjernbar ved acidolyse eller katalytisk hydrogenolyse, i særdeleshet en benzyloxycarbonyl-eller tertiær butyloxycarbonylgruppe, C er en egnet beskyttelsesgruppe for temporær beskyttelse av guanidinogruppen av Arg-delen, i særdeleshet en nitro- eller tosylgruppe, D er en egnet beskyttelsesgruppe for temporær beskyttelse av den aromatiske hydroxylgruppe av Tyr-delen, i særdeleshet en benzylgruppe eller en substituert benzylgruppe, E er en egnét beskyttelsesgruppe for temporær beskyttelse av imidazolgruppen av His-delen, spesielt en dinitrofenylgruppe, og A, X og Y er de i generell formel I angitte betydninger, selektivt trinnvis eller i et enkelttrinn fjerner beskyttelsesgruppene, og om ønsket at de erholdte forbindelser av generell formel I overføres i deres addisjonssalter eller i et farmasøytisk anvendbart kompleksderivat.