NO157982B - Fremgangsmaate for rensing av urent aluminium ved fraksjonert krystallisasjon. - Google Patents

Description

Fremgangsmåte for biosyntetisk fremstilling

av prostaglandiner og beslektede hydroksy-karboksylsyrer.

Forelkggende oppfinnelse vedrører en biosyntetisk fremgangsmåte for fremstilling av prostaglandiner og beslektede tera-peutisk virkende hydroksy-karboksylsyrer.

I den seminale væske fra mennesker og mange dyr er hydroksykarboksylsyrer med farmakodynamiske effekter, som f.eks. hypertensiv eller hypotensiv aktivitet, og en mild muskelstimule-rende aktivitet blitt påvist. Det aktive prinsipp - kalt prostaglandin - viste seg å være tilstede i et antall genitale organer, særlig i prostatakjertler (glandulae vesicalis og ampuILae ductus), men også i andre organer, som f.eks. thymus, iris og lunger. Vesikulære kjertler fra får viste seg å være særlig ri-ke på prostaglandin, men også kjertler fra andre pattedyr viste seg å inneholde vesentlige mengder av prostaglandin.

Det aktive prinsipp, prostaglandinet, har vist seg å inneholde et antall av umettede ikke-aromatiske hydroksykarboksylsyrer som alle er beslektet med den følgende moder-karboksylsyre, 7-(2-oktylcyklopentyl)-heptansyre, som kalles prostansyre: De følgende prostaglandiner er blitt identifisert: Prostaglandin (PGE1)

lia,15-dihydroksy-9-keto-prost-13-ensyre.

Prostaglandin E2 (PGE2)

lia,15-dihydroksy-9-keto-prosta-5,13-diensyre.

Prostaglandin E3 (PGE3)

H<3,15-dihydroksy-9-keto-prosta-5,13#17-triensyre.

Prostaglandin F, (PGD-^)

9a,lla-15-trihydroksy-prost-13-ensyre.

Prostaglandin F2a (<P>GF2a)

9a, Ila,15-trihydroksy-prosta-5,13-diensyre.

PGE-^, PGE2' PGE3°9 PGEia v^Ger en sammentrekkende virkning i glatte muskler og en hypotensiv aktivitet, men i alminne-lighet har PGE2 vist seg å være den mest aktive forbindelse.

Prostaglandiner er blitt isolert ved å ekstrahere patte-dyrs kjertelvev, særlig genitale kjertelvev, som f.eks. fra vesikulære kjertler. DBt har vist seg at utbyttet av prostaglandin fra disse kilder kunne økes ved tilsetning av små mengder rensemidler eller spesifikke enzymer, særlig slike med esterase-aktivitet. De økede utbytter ansees å frembringes ved desintegrering av cellemembraner eller ved å frigjøre prostaglandiner som er tilgjengelige i bundet form i vevet.

Denne tilsetning av rensemidler eller spesifikke enzymer som forårsaker et forbedret ekstraksjonsutbytte, represente-rer imidlertid bare en forbedring ved gjenvinningen eller utvin-ningen av det tilstedeværende aktive prinsipp.

Ved foreliggende oppfinnelse fremstilles prostaglandiner og beslektede hydroksy-karboksylsyrer ved hjelp av biosynte-tiske fremgangsmåter som er basert på tilsetningen av forløpere til animalsk vev eller aktive fraksjoner herav som er i stand til å syntetisere prostaglandiner eller beslektede hydroksykarboksylsyrer fra disse forløpere.

Foreliggende oppfinnelse går således ut på en fremgangsmåte for biosyntetisk fremstilling av prostaglandiner og beslektede hydroksykarboksylsyrer, og fremgangsmåten er karakterisert ved at fettsyrer med tilstedeværende dobbeltbindinger i cis-konfigurasjon, såkalte alle cis-fettsyrer, og deres salter som har den generelle formel CH, - (CH„) - (CH=CH-CH_) - (CH„) - COOM, som inneholder 18 til 22, fortrinnsvis 20 karbonatomer i molekylet, og hvor M betyr hydrogen eller et alkalimetall, n betyr et helt tall fra 0 til 5, p betyr et helt tall fra 3 til 5 og q fra 0 til 8, inkuberes under aerobe forhold med et prostaglandin-syntetiserende enzymsystem fremstilt fra animalsk vev.

Oppfinnelsen omfatter således fremstillingen av prostaglandiner og beslektede hydroksykarboksylsyrer ved omdannelse av visse fettsyrer, eller deres salter som er for-løperforbindelsene ved tilsetning av et prostaglandin-syntetiserende enzym fra ani-malske organer som f.eks. genitale kjertler, thymus, iris og lunger, innvoller eller tarmer, bukspyttkjertler, adrenaler og hjer-ne eller aktive fraksjoner herav, som f.eks» væskeandelen av et vannholdig homogenisat og cellefraksjoner. Omdannelsen bevirkes ved hjelp av de enzymsystemer som er tilgjengelige fra disse organer.

Et formål for foreliggende oppfinnelse er således omdannelsen av nevnte fettsyrer til prostaglandiner ved behandling av disse fettsyrer eller deres salter med homogenisater eller skiver av de ovennevnte organer, som f.eks. genitale kjønnsorga-ner og mere spesielt vesikulære kjertler fra. får under fysiolo-giske eller subfysiologiske forhold.

Fettsyrene og deres salter som er nevnt ovenfor, omfatter en gruppe som er kjent som essentielle fettsyrer, da disse er nødvendige for mennesker og forskjellige dyr i disses diet, fordi de ikke kan syntetiseres i organismen og mangelsymptomer vil utvikles ved fravær av disse stoffer» Med hensyn til den kjemiske struktur av disse fettsyrer er det blitt påvist at de

er i besittelse av et såkalt "oversprunget dobbeltbindingssystem", hvor i det minste to cis-etyleniske dobbeltbindinger er tilstede, og i de for-løpere med hvilke det er oppnådd de beste resultater, har alle etyleniske dobbeltbindinger cis-konfigurasjon. Ved ut-trykket oversprunget dobbeltbindingssystem forståes et system av etyleniske dobbeltbindinger som er gjensidig adskilt fra hverand-re med en metylengruppe.

Viktige syrer og deres derivater som kan anvendes for biosyntesen som utføres på den nevnte måte, og som skal beskrives nærmere i det følgende, omfatter essentielle fettsyrer somt

Homo-^-linolensyre (all-cis-eicosa-8,11-14-triensyre)

Arachidonsyre (all-cis-eicosa-5,8,11,14-tetraensyre) såvel som såkalte all-cis-syrer av lignende sammensetning, så som: All-cis-eicosa-5,8,11,14-17-pentaensyre All-cis-nonadeca-7,10,13-triensyre

All-cis-nonadeca-4,7,10,13-tetraensyre.

Skjønt forskjellige essentielle fettsyrer er blitt kjent,og de mangelsykdommer som forårsakes ved deres fravær er

o

blitt beskrevet i utstrakt grad, så kjenner man ikke deres nøy-aktige funksjon. I betraktning av de forsøk som er beskrevet nedenfor, kan det antas at en av funksjonene av de essentielle fettsyrer er deres virkning som for-løpere for den hormonlignen-de substans PGE» Således virker homo-^-1 i no lens yre som en for-lø-per for PGE2 og PGF^, og arachidonsyren virker som en for-løper for PGE2 og PGF2a/ mens eicosa-5,8,11,14-17-pentaensyre (en ikke-essentiell fettsyre) virker som en for-løper for PGE3 og PGF^ • Den kjensgjerning at PGE2 er langt mer biologisk aktiv enn PGE3 tyder på at i organismen virker de essentielle fettsyrer som en for-løperkilde av vesentlig betydning for prostaglandinene.

Det har vist seg fordelaktig å utføre omdannelsen av fettsyrene eller deres derivater ved en temperatur som fortrinnsvis ligger mellom 10 og 60°C,i en pufferoppløsning med en pH-verdi fra 4 til 10, fortrinnsvis fra 7 til 9, og det har også vist seg at utbyttet kan økes ytterligere ved tilsetning av forskjellige salter, sukkerarter (f.eks. glukose), proteiner (f.

eks. albumin), aminosyrer, vitaminer, ko-enzymer, visse kofakto-rer som glutathion (gamma-L-glutamyl-L-cysteinylglycin) og antioksydanter slik som propylgallat. Generelt lar man for-løper-materialet og de friske organer eller preparater herav få anled-ning til å reagere i tidsperioder mellom flere minutter og flere timer, og fortrinnsvis i en periode fra 15 til 180 minutter. Som foran nevnt arbeides det under aerobe betingelser, og fortrinnsvis ledes gjennom reaksjonsblandingen en oksygeninneholden-de gass. Ved omdannelse av store mengder av substrater, som f. eks. de nevnte essentielle fettsyrer, anvendes forsøket som er beskrevet i nedenstående eksempel 1, for å bestemme den optimale mengde av for-løpersubstrat som skal tilsettes pr. enhet av massen av friske organer. For dette formål tilsettes forskjellige konsentrasjoner av substrat til en bestemt mengde av friske

organer eller preparater herav, og prøver tappes av ved forskjellige tidspunkter. Det er å foretrekke å anvende de hele homogeni-serte organer, selv om aktive fraksjoner kan oppnås ved differen-tiell sentrifugering. Separering ved sentrifugering av homogeni-serte organer i en væskedel og en utfelling gir ikke alltid ønskede aktive fraksjoner. Fra de erholdte data vedrørende omdannel-sesutbyttet kan de optimale reaksjonsforhold fastslås, som da anvendes ved fremstillingene med ikke-radioaktive materialer. Ved disse forsøk kan de kjente fremgangsmåter (såsom bestemmelsen av det ultrafiolette absorpsjonsspektrum ved 278 eller 280 millimikron før og efter tilsetningen av natriumhydroksyd) anvendes for bestemmelsen av mengden av dannete prostaglandiner.

Det har også vist seg at det oppnås særlig gode utbytter hvis det anvendes et vektforhold av polyen-fettsyre til friske organer av fra 1:1000 til 1:4000, og fortrinnsvis fra 1:2000 til 1:3000.

Sammenlignet med utbyttene som oppnås fra kjertelvev fra pattedyr uten forhåndstilsetning av for-løperne, er utbyttene som oppnås ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen opp til 20 ganger så høye. Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen gjør det derfor mulig å fremstille prostaglandiner i en målestokk som er nødvendig for deres utnyttelse som terapeutiske midler.

Biosyntesen i henhold til foreliggende oppfinnelse skal klargjøres ved de følgende eksempler.

Eksempel I

A. Fremstilling av utgangsmateriale.

Metylesteren av all-cis-eicosa-5,8,11,14-tetraynsyre ble redusert med tritiuminneholdende hydrogengass over Lindlars katalysator. Efter rensing med tynt-lag-kromatografi (i det • følgende betegnet som TLK) og forsåpning på vanlig måte, fikk man tritiuminneholdende arachidonsyre med en spesifikk radioak-_2

tivitet av 0,91 x 10 milli-Curie (mC) pr. mg. Prøven ble utsatt for gasskromatografisk analyse og viste seg å være 95,6% ren. Det infrarøde absorpsjonsspektrum viste at det ikke var tilstede mer enn 3% trans-figurasjon, og ved hjelp av ultrafiolett absorpsjonsspektrum kunne det ikke oppdages noen konjugering.

B. 1 mg av tritiuminneholdende arachidonsyre med en aktivitet av 4,1 x 10 tellinger pr. minutt (tpm)(tellingseffektivitet 20,7%) i 20 ml 0,15 molar kaliumfosfatpuffer med en pH = 7,5, ble inkubert i forskjellige perioder ved 37°C med 20 g vesikulære kjertler fra får, som var oppsamlet like efter slaktingen, lag-ret i 1 uke på tørr is og malt i frossen tilstand.

I dette og de følgende eksempler ble inkuberingen ut-ført ved den vanlige fremgangsmåte med langsom rysting av reaksjonsblandingen i et kar som var åpent like overfor luften i et apparat som termostatisk ble holdt ved den ønskede inkubasjons-temperatur.

Efter inkuberingen ble det tilsatt 160 ml 96% vandig etanol som inneholdt 15 ml normal saltsyre pr. liter, og prostaglandiner ble isolert ved følgende fremgangsmåte: Efter tilsetningen av den ansyrede etanol lot man opp-usningen stå over natten. Derefter ble oppløsningen filtrert, hvorved man fikk et filtrat og et residuum. Filtreringsresten ble vasket to ganger med ansyret etanol. Filtratet og vaskevæs-ken ble forenet og konsentrert i vakuum under 40°C til omtrent 1/5 av det opprinnelige volum. Det rå-konsentrat som man fikk, ble ansyret med 6-normalsaltsyre til en pH = 3, og derefter ekstrahert tre ganger med ren eter. Eterekstraktene ble forenet og vasket med vann inntil nøytral reaksjon. Ekstraktene som var behandlet på denne måte, ble tørket med natriumsulfat og inndampet til tørrhet i vakuum. Resten ble utsatt for en tretrinns motstrømsfordeling mellom like volumer 66% metanol og lettbensin. 1/20 av materialet (A) som man fikk i den vandige fase efter tretrinns-fordelingen mellom 66% etanol og lettbensin, ble utsatt for (TLK) (tynnskiktkromatografi) på kiselsyregel (G; ex Merck) med oppløsningsmiddelsystemet benzentdioksameddiksyre (20:20:1). Flekker ble gjort synlige ved jodreaksjon, særskilt skrapt av platen efter avdampning av jod og fortynnet med metanol. Metanolen ble inndampet og radioaktiviteten målt med et Packard "Tricarb"-spektrometer. Tabell I viser fordelingen av radioaktiviteten over kromatogrammene efter 5, 15 og 30 minutters inkubering. Fra denne tabell vil det sees at radioaktiviteten efter 30 minutter er blitt utviklet nesten fullstendig innenfor området av RF-verdier mellom 0,50 og 0,62, hvilket område omfatter en saiti-menligningsprøve av ren PGE.

En annen 1/20 mengde av materialet A ble utsatt for TLK slik som beskrevet ovenfor. Efter fordampning av metanol ble det tilsatt 2 ml vann, oppløsningen ble ansyret med normal saltsyre,

og ekstrahert med to deler 2 ml eter. Eteren ble fjernet og resten oppløst i 5 ml av en vandig oppløsning som inneholdt 0,9 g/100 ml natriumklorid; 0,02 g/100 ml kaliumklorid; 0,02 g/100 ml kal-siumklorid; 0,01 g/100 ml magnesiumklorid; 0,1 g/100 ml glukose; 0,1 g/100 ml natriumhydrogenkarbbnat og 0,005 g/100 ml natriumdi-hydrogenfosfat. Den biologiske aktivitet ble undersøkt på marsvin-ileum og flekken med Rf 0,60, svarende til PGE, viste sterk aktivitet.

Fra en annen 1/20 av materialet A ble PGE isolert og påny utsatt for TLK, idet det nu ble anvendt kiselsyregel (G; ex Merck) impregnert med 10% sølvnitrat og under anvendelse av opp-løsningsmiddelsysternet etylacetat:eddiksyre:metanol:2,2,4-tri-metylpentan:vann (110:30:35:10:100). Efter fremkalling ble platen skåret opp i forskjellige soner som ble skrapt av, eluert med metanol og radioaktiviteten av disse ble målt. Resultatene av dette forsøk er oppført i tabell 2.

Den høyeste aktivitet ble funnet ved Rf 0,63, som sva-rer til PGE2-

Disse resultater viser klart at arachidonsyre omdannes til PGE2/ som representeres av følgende reaksjonsskjerna:

En løselig beregning beregnet bare på den radioaktivitet som fin-nes i PGE2/ viser at arachidonsyren er omdannet i det minste med 16% til PGE2-

Tar man i betraktning tap av materiale under isolerings-prosessen og det faktum at tritium bundet til karbonnummer 9 i arachidonsyren ganske sikkert fjernes fra molekylet, kan det slut-tes at den virkelige omdannelse her er ennu betydelig høyere.

Eksempel 2

0,5 g kaliumarachidonat, oppløst i 2 liter 0,1 mol kaliumfosfatpuffer (pH = 7,5), som inneholdt 5 g kvegserum-albumin, ble inkubert i 2 timer ved 37°C med væskeandelen av et homogenat som man fikk fra 1250 g friske vesikulære kjertler fra får. Denne væskeandel fikk man på følgende måte: De friske kjertler ble malt med 2,5 liter 0,1 mol kaliumfosfatpuffer (pH = 7,5), og det

erholdte slam ble behandlet i en ultra-sentrifuge i 10 minutter ved 4000 x g ved 2°C. Væskeandelen ble avsifonert og residuet suspendert i 300 ml av den samme puffer og sentrifugert påny. Den resulterende væskeandel ble siffonert av og forenet med den annen del. Den totale opaliserende oppløsning inneholdt 50 g protein-materiale i hvilket det aktive enzymsystem var tilstede. Den totale mengde av prostaglandin E som var tilstede i dette preparat, var mindre enn 50 mg.

Efter inkuberingen ble tilsatt 15 liter 96% vandig etanol, ansyret med normal saltsyre til pH 4, og utfellingen ble filtrert fra. Oppløsningen ble konsentrert til ca. 1 liter ved destillasjon i vakuum ved en temperatur under 30°C.

Residuet ble ekstrahert tre ganger med 500 ml ren eter.

Efter tørkingen over natriumsulfat ble det eteriske ekstrakt inndampet til tørrhet og residuet på ca. 15 g ble fordelt mellom 750 ml vandig metanol og 750 ml lettbensin.

Den vandige fase ble inndampet til tørrhet i vakuum, og man fikk ca. 3 g av materialet. Dette materiale inneholdt ca. 340 mg prostaglandin

Materialet ble renset ved kolonnekromatografi på kiselsyre som var aktivisert ved 115°C før bruken. Substansen ble opp-løst i etylacetat:benzen (30:70) og bragt på en kiselsyrekolonne (30 x 2 cm). Kolonnen ble vasket med etylacetattbenzen (30:70), hvorefter prostaglandin E ble eluert med etylacetat:benzen (60:40). PGE ble bestemt ved behandling av alikvot-deler av fraksjonene

ved 0,5 normal natriumhydroksydoppløsning i 50% vandig etanol, hvorefter absorpsjonen ble målt ved 278 millimikron. Efter 30 minutter ble , fraksjonene som inneholdt PGE forenet og inndampet i vakuum. Residuet ble renset ved kromatografi i deler av 1 g på en omvendt fasekolonne (bærerÆsilan-behandlet "HYFLO" supercel - /""HYFLO" supercel" er en diatomé-kiselsyre, som angitt i "Handbook of Material Trade Names" av Zimmerman og Lavine, supplement II, 1957, side II2.7, stasjonær fase: iso-oktanol-kloroform (:1), forholdet mellom den stasjonære fase og den bevegede fase 1:10). Pakkingen av kolonnen bestod av 22,5 g Support med 20 ml stasjonær fase. Utbyttet av praktisk talt rent prostaglandin erholdt

. på denne måte var 250 mg.

Eksempel 3

Eksempel 2 ble gjentatt, men nu anvendte man aom for-løpermateriale 0,5 g kaliumaalt av homo-y<*->linolensyre (all-cis-eicose-8,11-14-triensyre), som ble omdannet til prostaglandin E^. Det totale utbytte av prostaglandin E^ som man fikk, var 190 mg.

Eksempel 4

36 kg vesikulære kjertler av får ble homogenisert i små andeler med et totalvolum på 36 liter 0,1 M fosfatpuffer (pH = 7,5) i en hurtigløpende avkjølt homogenisator ved 0°C. 12 g homo-^-linolensyre ble oppløst i 12 liter 0,15 M glycinepuffer (pH = 9,0) . 3 literdeler av homogenisatet ble tilsatt til 25 liter glycinpuffer, som var blitt bragt til en temperatur av 75°C, i et rustfritt stålkar, og det ble tilsatt 0,5 liter av homo- ^-linolensyre-oppløsningen. Blandingen ble inkubert i 2^ time ved 37°C under omrøring og kontinuerlig gjennomføring av en strøm av oksygen. Reaksjonen ble stoppet ved tilsetning av 8 N I^SO^ inntil pH var lavere enn 3. På denne måte ble 24 satser inkubert.

Til reaksjonsblandingen ble tilsatt 240 liter 96% vandig etanol, og man lot den stå natten over» Væskeandelen ble de-kantert fra så godt som mulig og residuet ekstrahert to ganger påny med 120 liter 96% etanol.

De forenede alkoholekstrakter ble filtrert og konsentrert ved inndampning under vakuum ved 35°C. Til residuet ble tilsatt en lik volummengde vann og derefter ekstrahert tre ganger med dietyleter.

Eterekstraktene ble forenet, vasket med destillert vann inntil vaskevannets pH-verdi var nesten nøytral og tørket med vannfast natriumsulfat. Hovedmengden av eteren, ble avdampet i vakuum. Residuet, som inneholdt ca. 7 g rå PGE^ i ca. 800 g lipid-materiale, ble kromatografert i andeler av 15-20 g på kolonner (diameter 5 cm) pakket med 150 g kiselsyre (Mallinckrodt 100 mesh analytisk reagent).

Fraksjonene som inneholdt prostaglandin E, ble eluert med kloroform som inneholdt 2-5% metanol, de ble forenet og re-kromatografert på samme måte. Derefter ble det på denne måte erholdte, fremdeles urene prostaglandin E renset ved kromatografi under anvendelse av det omvendte fasesystem som er beskrevet i eksempel 2. De PGE^-inneholdende fraksjoner ble forenet og opp-løsningene lot man fordampe i vakuum ved en temperatur under 35°C. Det gjenværende materiale ble omkrystallisert fra vandig metanol, og man fikk et utbytte av 4 g ren PGEj_, smeltepunkt 114°C.

Eksempel 5

Vesikulære fårekjertler (250 g) ble homogenisert med 600 ml 0,1 M trikaliumfosfat (pH =7,1) i en hurtigløpende avkjølt homogenisator i løpet av 30 sekunder ved 0°C. Hompgenisatet ble derefter sentrifugert i 10 minutter ved 4000 x g, og væskeandelen ble påny utsatt for en sentrifugering under de samme betingelser. Den grumsete oppløsning man fikk, ble nu sentrifugert i 60 min. ved ca. 100 000 x g.

Utfelningen ble omrørt med 200 ml puffer pH = 8,0, som inneholdt 0,01 M trikaliumfosfat, 0,001 M dinatriumdihydrogen-etylendiamintetraacetat og 0,001 M cystein, og påny utfelt i 60 minutter ved 100 000 x g. Den vaskede, partikkelformede fraksjon inneholdt ca. 1,9 g protein og bare 1,6 mg prostaglandin E. Den ble suspendert i 100 ml 0,1 M trikaliumfosfat pH = 8,0, og derefter inkubert i 5 minutter ved 30°C med en 0,2 M tris-(hydroksyme-tyl)-aminometan.HCl-puffer (pH = 8,0)-oppløsning som inneholdt 200 mg homo- A-linolensyre, 500 mg redusert glutathion og 75 mg propylgallat. Inkuberingen ble avbrutt ved tilsetning av 0,2 M sitronsyreoppløsning inntil en pH av 3,5 var nådd (ca. 150 ml). Den ansyrede blanding ble ekstrahert to ganger med en lik volummengde dietyleter. I det eteriske ekstrakt var det tilstede 158 mg (67%) prostaglandin E^.

Uten tilsetning av propylgallat til inkuberingsblandin-gen fikk man 54 mg (23%) PGE, mens sløyfing av glutathion resul-terte i et utbytte av bare 19 mg (8%).

Eksempel 6

400 g vesikulære kjertler fra får ble homogenisert med 400 ml vann i en hurtigløpende avkjølt homogenisator og videre fortynnet med 800 ml equa dest. Alle prosesser ble utført ved 0°C. I små andeler ble tilsatt 200 ml (våtvolum) "DOWEX" anionutvekslingsharpiks A.G. 1-X2, 50-100 mesh (nevnte harpiks er i BIORAD-laboratorielisten av 1. mai 1965 på sidene 4 og 5 identifisert som en sterkt basisk anionutvekslingsharpiks, sammensatt

av en styren-divinylbenzenpolymerlateks, inneholdende 2% divinyl-benzen og som oppviser kvartære ammoniumutvekslingsgrupper), i 0H~ formen mettet med C02 under omrøring og under gjennomføring av en hurtig C02-strøm. Blandingen ble filtrert gjennom et osteklede for å fjerne vedhengende vev og ioneutveksleren. Den grumsete oppløsning som man fikk på denne måte (1,2 liter; pH = 8,2),

inneholdt bare noen få mg av endogenøse prostaglandiner. Opp-løsingen ble inkubert aerobisk med 175 mg arachidonsyre oppløst i 400 ml oppløsning, inneholdende 0,05 M trikaliumfosfat, pH =

7,5 og 0,2 M tris(hydroksymetyl)-aminometan.HCl-puffer; pH

9,0 (i et volumforhold lik 1:1) i 30 minutter ved 30°c<.

Efter reaksjonen ble blandingen ansyret med 4N svovel-syre inntil pH var lavere enn 3,5, og 250 ml alkohol ble tilsatt, efterfulgt av 2 ekstraheringer med 1 liter eter. Det eteriske ekstrakt inneholdt 65 mg prostaglandin E2 og 14 mg prostaglandin <F>2a'

Eksempel 7

Idet man gikk ut fra 400 g kjertler og 20 mg all-cis-7,10,13-nonadecatriensyre og under anvendelse av samme fremgangsmåte som i eksempel 6, fikk man 27 mg Nor-PGE-^ og ca. 5 mg Nor-_GF^a i den eteriske ekstrakt. (Ved Nor-prostaglandiner forståes prostaglandiner i hvilke det er 5 metylengrupper mellom karboksyl-gruppen og cyklopentylgruppen).

Efter kromatografisk rensing og omkrystallisering av Nor-PGE^ fra vandig metanol, fikk man 9,6 mg nålformede kryst-aller» Dette materiale ble identifisert ved massespektroskopi som Nor-prostaglandin E^ (molekylvekt 540).

Ved gasskromatografi kunne man ikke oppdage noen foru-rensning med PGE, eller PGE_.

Smeltepunktet var 89 C.

Eksempel 8

Et stykke duodenum (65 g våtvekt) av hanfår ble opp-skåret i stykker og homogenisert i en hurtigløpende homogenisator med 200 ml 0,01 M fosfatpuffer (pH=8,0).

Homogenisatet ble sentrifugert i 10 minutter ved 4000

x g„ Den grumsete væske ble sentrifugert i 50 minutter ved 100 000 x g. Kaken som man fikk fra den annen sentrifugering, ble suspendert i 12 ml 0,1 M fosfat (pH=8,0). Dette preparat ble anvendt ved de følgende inkuberingerj det inneholdt 30 mg protein pr. ml. En del av enzymoppløsningen (1,5 ml) ble inkubert med 95 mikrogram (1-14 C)-homo-gamma-linolensyre (95 000 tpm) i 1 ml 0,2 M tris(hydroksymetyl)-aminometan.HCl (pH=8,0) i 10 minutter ved 30°C (a). I en annen inkubering (b) ble tilsatt 1 mikromol (0,3 mg) glutation, og den tredje inkubering (c) ble utført i nærvær av 1 mikromol glutathion og 0,5 mikromol (0,1 mg) propylgallat.

Efter inkuberingen ble blandingene ansyret og ekstrahert med eter. Etter tilsetning av 182 mikrogram PGE^ og 100 mikrogram PGF^, ble de eteriske ekstrakter overført til tørket tilstand. Materialet ble kromatografert på et tynt skikt av kiselsyregel (G; ex Merck) med oppløsningsmiddelsystemet kloroform-metanol,eådiksyre-vann (90:6:1:1 volum) som elueringsmiddel.

PGE^ ble eluert fra kiselsyregelen med metanol og behandlet med 0,5M metanolisk KOH i 10 minutter ved 20°C. Det de-hydratiseringsprodukt som ble dannet på denne måte, ble isolert ved TLK på kiselsyregel (G; ex Merck) med oppløsningsmidlet eter-eddiksyre (100:2). En del av det ble undersøkt med hensyn til radioaktivitet, og i en annen del ble bestemt ekstruksjonen ved 280 millimikron. Det kunne beregnes at det opprinnelige PGE^ hadde den følgende radioaktivitet:

TLK på kiselsyregel (G; ex Merck) impregnert med sølv-nitrat forårsaket ingen ytterligere senkning i den spesifikke radioaktivitet av det dehydratiserte PGE-^. Ved inkubering med glutathion var således 2,8% av homo-gamma-linolensyren omdannet til prostaglandin E^.

De steder hvor prostaglandiner befant seg, ble bestemt ved å utsette for joddamp, hvoretter man lot joden fordampe, og de soner som inneholdt prostaglandin E og F, ble skrapt av.

Eksempel 9

Partikkelformede fraksjoner av forskjellige organer ble fremstilt ved homogenisering i en 0,05 M kaliumfosfatpuffer, pH 8, ved 0-5°C. Homogenisatet ble sentrifugert to ganger ved 4000 x g og den overliggende væske i 1 time ved 100 000 x g. Sedimentet ble anvendt for inkubasjonene som ble utført ved 30°C i. 15 minutter. Ved disse forsøk ble det tilsatt pr. milligram protein (biuret-reaksjon) 1-2,5 mikrogram (1- 14C)-bis-homo-gamma-linolensyre og 15 mikrogram glutathion. Etter reaksjonen ble inkuberings-blandingen ansyret med 0,2 M sitronsyre, og 500 mikrogram PGE^ ble tilsatt som bærer. PGE^ ble ekstrahert med eter og renset ved

tynnskiktkromatografi, og radioaktiviteten ble bestemt.

De følgende resultater ble oppnådd:

Lignende resultater fikk man ved å anvende organer

fra marsvin og rotter.

Eksempel 10

Dette eksempel vedrører omdannelse av en rekke forskjellige karboksylsyrer til prostaglandiner.

Vesikulære kjertler fra får (350 g) ble findelt i en

0,1 m fosfatpuffer ved pH 8. Blandingen ble sentrifugert (4000

x g), filtrert og sentrifugert påny (55 000 x g). Utfelningen ble lyofilisert etter vaskning og tørket. Utbytte 7 g. Den partikkelformede enzymfraksjon som man fikk på denne måte, ble anvendt ved forskjellige forsøk som vist nedenfors

100 mikrogram fettsyre, 0,65 mikromol glutathion og

0,55 mikromol hydrokinon ble oppløst i et prøverør som inneholdt 1 ml 0,2 mol tris-HCl-puffer, pH 8. Røret ble anbragt i et vann-bad ved 37°C og det ble tilsatt 6 mg av den partikkelformede enzymfraksjon (2 mg protein suspendert i 1 ml 0,2 M tris-HCl-puffer). Reaksjonsblandingen ble ansyret etter en inkuberingstid av 30 minutter, ekstrahert med eter og inndampet til tørrhet. Residuet ble oppløst i metanol (1 ml) og i 0,2 ml av oppløsningen ble prostaglandininnholdet bestemt ut fra økningen i absorpsjon ved 278 nanometer efter tilsetning av alkali. Under de beskrevne betingelser hadde alle reaksjonene nådd optimal omdannelse etter en inkuberingstid av 30 minutter.

Resultatene er oppført i tabellform nedenfor:

På lignende måte ble all-cis-nonadeca-4,7,10,13,16-pentaensyre også omdannet til prostaglandiner med små utbytter.

Claims (3)

1. Fremgangsmåte for biosyntetisk fremstilling av prostaglandiner og beslektede hydroksykarboksylsyrer, karakterisert ved at fettsyrer med tilstedeværende dobbeltbindinger i cis-konfigurasjon, og deres salter, som har den generelle formel CH0-(CH_) -(CH=CH-CH0) -(CH„) -COOM, som innehol-3 2 n 2 p 1 2 q der 18 til 22, fortrinnsvis 20 karbonatomer i molekylet og hvor M betyr hydrogen eller et alkalimetall, n betyr et helt tall 0 til 5, p betyr et helt tall fra 3 til 5 og q fra 0 til 8, inkuberes under aerobe forhold med et prostaglandin-syntetiserende enzymsystem fremstilt fra animalsk vev.

2. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at biosyntesen utføres under aerobe forhold ved at oksygen-inneholdende gasser ledes gjennom reaksjonsblandingen.

3. Fremgangsmåte som angitt i krav 1 og 2, karakterisert ved at biosyntesen utføres under tilsetning av co-faktoren glutathion.